CN100580087C - 肽的缀合 - Google Patents

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Abstract

用于肽的选择性缀合的方法，其包含在肽的C-末端酶促地整合官能团，然后与包含要缀合到肽上的基团的第二种化合物反应，其中所述的第二种化合物包含能与整合的官能团选择性地反应的官能团。

Description

肽的缀合
发明领域
本发明涉及肽的翻译后缀合的新方法。所述的缀合的肽具有改变的特征，因而可以用于治疗用途，或者它们可以简化所述肽的分析或分离和纯化。
发明背景
众所周知，通过将能适当地改变肽的性质的基团缀合到肽上，可以改变肽的性质和特征。这样的缀合一般需要肽中的一些官能团与缀合基团中的另一种官能团反应。典型地，已经将氨基(例如赖氨酸中的N-末端氨基或ε-氨基)与合适的酰化剂组合使用。经常需要或要求能控制缀合反应，即控制缀合化合物的缀合位置和控制缀合多少缀合基团。这经常称作特异性。
本发明的一个目的是，提供可以以高度的特异性缀合肽的方法。概括地，该方法采用能将包含合适的官能团的化合物整合进肽的C-末端的酶，其中所述的官能团随后用作缀合位点。
以前已经描述了羧肽酶修饰肽的C-末端的应用。WO 92/05271公开了羧肽酶和亲核化合物酰胺化C-末端羧基的应用，WO 98/38285公开了特别适用于该目的的羧肽酶Y的变体。
在文献中，已经充分地描述了PEG或基于PEG的链的接枝。作为实例，US 5,739,208公开了具有可以与存在于肽中的硫羟基反应的砜基的PEG的应用。
EP 605 963公开了可以与蛋白上的醛基形成肟连接的水性聚合物的接枝。天然的氨基酸都不包含醛，因而羟基必需被氧化，作为缀合过程的第一步。
EP 243 929公开了羧肽酶将多肽、报告基团或细胞毒性试剂整合进蛋白或多肽的C-末端的应用。
发明简述
本发明人已经意外地发现，酶(例如羧肽酶)可以用于在肽的C-末端中整合进包含一个或多个在肽中不可接近的官能团的第一种化合物，形成转酰化的化合物，且该转酰化的化合物随后可以与包含一个或多个能与第一种化合物的官能团反应、但是不能与肽中可接近的其它官能团反应的官能团的另一种化合物反应。这样的方法能提供高度的特异性，因为选择的该酶仅仅催化在C-末端的整合，且选择的2种官能团仅仅彼此反应，而不与肽中可接近的其它官能团反应。这样，缀合基团仅仅缀合在一个位置，且通过选择官能团，可以控制缀合的基团的数量。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了缀合肽的方法，所述的方法包含下述步骤：
i)在一个或多个步骤中，使肽与携带一个或多个在任何构成所述肽的氨基酸中不可接近的官能团的第一种化合物反应，该反应在有能催化将所述的第一种化合物整合进所述肽的C-末端、形成转酰化的肽的酶存在的情况下进行，和
ii)在一个或多个步骤中，使所述的转酰化的肽与包含一个或多个官能团的第二种化合物反应，其中所述的官能团不能与在构成所述肽的氨基酸残基中的可接近的官能团反应，且其中所述的第二种化合物中的所述官能团能与所述的第一种化合物中的所述官能团反应，从而形成所述的转酰化的肽和所述的第二种化合物之间的共价键。
本发明的另一个目的是，提供通过本发明的方法缀合的肽。
本发明的另一个目的是，提供以使它们更好地适用于本发明的方法的方式修饰的肽。
本发明的另一个目的是，提供适用于本发明的方法中的试剂和酶。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法缀合的肽在治疗中的用途。
本发明的另一个目的是，提供包含通过本发明的方法缀合的肽的组合物，例如药物组合物。
本发明的另一个目的是，提供治疗疾病的治疗方法，包含施用根据本发明的方法制备的缀合的肽。
本发明的另一个目的是，提供根据本发明的方法制备的缀合的肽在生产药物中的用途。
本发明的另一个目的是，提供通过根据本发明的方法缀合肽，而改善所述肽的性质的方法。
定义
在本文中，术语“转酰化”意在表示这样的反应，其中离去基团被交换为亲核体，其中亲核体应当理解为多电子的试剂，其倾向于攻击碳的核。转肽作用是转酰化的一个实例。
在本文中，术语“不可接近的”意在表示某物不存在或事实上不存在，含义是不能达到它。当声称官能团在要缀合的肽中不可接近时，意在表示所述的官能团在该肽中不存在，或者如果存在，其被以某些方式阻止参与反应。作为实例，所述的官能团可以深埋在肽的结构中，从而它被屏蔽而不能参与反应。已经认可，官能团是否可接近，取决于反应条件。可以预见，在有变性剂存在的情况下或在升高的温度下，肽会解折叠，从而暴露出否则会不可接近的官能团。应当理解，“不可接近的”是指“在为特定的目标反应选择的反应条件下不可接近的”。
在本文中，术语“肟键”意在表示式-C＝N-O-的部分。
在本文中，术语“腙键”意在表示式-C＝N-N-的部分。
在本文中，术语“苯腙键”意在表示下式的部分
Figure C20048002959200101
在本文中，术语“缩氨基脲键”意在表示式-C＝N-N-C(O)-N-的部分。
术语“烷烃”意在表示饱和的、线性的、分支的和/或环状的烃。除非用其它的碳原子数目说明，该术语意在表示具有1-30个(包含两个端点)碳原子的烃，例如1-20(包含两个端点)，例如1-10(包含两个端点)，例如1-5(包含两个端点)。术语烷基和亚烷基分别指对应的基团和双基。
术语“烯烃”意在表示线性的、分支的和/或环状的包含至少一个碳-碳双键的烃。除非用其它的碳原子数目说明，该术语意在表示具有2-30个(包含两个端点)碳原子的烃，例如2-20(包含两个端点)，例如2-10(包含两个端点)，例如2-5(包含两个端点)。术语烯基和亚烯基分别指对应的基团和双基。
术语“炔烃”意在表示线性的、分支的和/或环状的包含至少一个碳-碳三键的烃，且其可以任选地包含一个或多个碳-碳双键。除非用其它的碳原子数目说明，该术语意在表示具有2-30个(包含两个端点)碳原子的烃，例如2-20(包含两个端点)，例如2-10(包含两个端点)，例如2-5(包含两个端点)。术语炔基和亚炔基分别指对应的基团和双基。
术语“同素环芳族化合物”意在表示芳香烃，例如苯和萘。
术语“杂环化合物”意在表示包含5，6或7个环原子的环状化合物，其中的1，2，3或4个环原子是选自N，O和/或S的杂原子。实例包括杂环芳族化合物，例如噻吩，呋喃，吡喃，吡咯，咪唑，吡唑，异噻唑，异噁唑，吡啶，吡嗪，嘧啶，哒嗪，以及它们的部分或完全氢化的等同物，例如哌啶，吡唑烷(pirazolidine)，吡咯烷，吡咯啉(pyroline)，咪唑烷，咪唑啉，哌嗪和吗啉。
术语“杂烷烃”、“杂烯烃”和“杂炔烃”意在表示如上定义的烷烃、烯烃和炔烃，其中所述部分的结构中已经***了一个或多个杂原子或基团。杂基团和原子的实例包括-O-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-C(O)-，-C(S)-和-N(R*)-，其中R*代表着氢或C1-C6-烷基。杂烷烃的实例包括
Figure C20048002959200121
术语“基团”或“双基”意在表示这样的化合物，其中已经分别去除了1个或2个氢原子。当特别说明时，基团也可以表示通过从化合物中形式上去除更大的原子基团(例如羟基)而形成的部分。
术语“卤素”意在表示元素周期表的第7主族中的成员，即F，Cl，Br和I。
术语“PEG”意在表示分子量为500至150,000Da的聚乙二醇，包括其类似物，其中例如末端OH-基团已经被替换为甲氧基(称作mPEG)。
在本文中，词“肽”和“蛋白”可互换地使用，意在表示相同的内容。术语“肽”意在表示具有2个或更多个通过肽键连接的氨基酸残基的化合物。氨基酸可以是天然的或非天然的。该术语也意在包括被其它的肽、糖类、脂类或其它有机化合物取代的所述化合物，以及其中已经化学地修饰了一个或多个氨基酸残基的化合物和包含辅基的肽。
在本文中，术语“芳基”意在表示碳环的芳香环基团或稠合的芳香环***基团，其中至少一个环是芳族的。典型的芳基包括苯基，联苯基，萘基，等。
如本文使用的，单独地或组合地使用，术语“杂芳基”指具有例如5-7个主原子的芳香环基团，或具有例如7-18个主原子的稠合的芳香环***基团，其中至少一个环是芳族的，其含有一个或多个选自氮、氧或硫杂原子的杂原子作为环原子，其中N-氧化物和一氧化硫和二氧化硫是允许的杂芳族取代。实例包括呋喃基，噻吩基，苯硫基(thiophenyl)，吡咯基，咪唑基，吡唑基，***基，四唑基，噻唑基，噁唑基，异噁唑基，噁二唑基，噻二唑基，异噻唑基，吡啶基，哒嗪基，吡嗪基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基，苯并呋喃基，苯并苯硫基(benzothiophenyl)，吲哚基，和吲唑基，等。
术语“缀合物”意在表示修饰的肽，即具有结合于其上以用于修饰所述肽的性质的部分的肽。术语“缀合”意在表示将部分结合到肽上以修饰所述肽的性质的过程。
如本文使用的，术语“前药”表示可生物水解的酰胺和可生物水解的酯，也包括a)化合物，其中将这样的前药中的可生物水解的官能度包含在根据本发明的化合物中，和b)化合物，其可以在给定的官能团处被生物地氧化或还原，生成根据本发明的药物。这些官能团的实例包括1，4-二氢吡啶，N-烷基羰基-1，4-二氢吡啶，1，4-环己二烯，叔丁基，等。
如本文使用的，术语“可生物水解的酯”是药物(in casu，根据本发明的化合物)的酯，其a)不会妨碍亲本物质的生物学活性，但是能赋予该物质有利的体内性质，例如作用的持续时间，作用的开始等，或b)是生物学上无活性的，但是能被受试者在体内容易地转化成生物学上有活性的要素。优点是，例如提高的溶解度，或者可以从肠经口地吸收可生物水解的酯，并在血浆中转化成根据本发明的化合物。许多这样的实例是本领域已知的，包括作为实例的低级烷基酯(例如，C1-C4)，低级酰氧基烷基酯，低级烷氧基酰氧基烷基酯，烷氧基酰氧基酯，烷基酰氨基烷基酯，和胆碱酯。
如本文使用的，术语“可生物水解的酰胺”是药物(in casu，根据本发明的化合物)的酰胺，其a)不会妨碍亲本物质的生物学活性，但是能赋予该物质有利的体内性质，例如作用的持续时间，作用的开始等，或b)是生物学上无活性的，但是能被受试者在体内容易地转化成生物学上有活性的要素。优点是，例如提高的溶解度，或者可以从肠经口地吸收可生物水解的酰胺，并在血浆中转化成根据本发明的化合物。许多这样的实例是本领域已知的，包括作为实例的低级烷基酰胺，α-氨基酸酰胺，烷氧基酰基酰胺，和烷基氨基烷基羰基酰胺。
在本文中，术语“药学上可接受的盐”意在表示对患者无害的盐。这样的盐包括药学上可接受的酸加成盐，药学上可接受的金属盐，铵盐和烷基化的铵盐。酸加成盐包括无机酸和有机酸的盐。合适的无机酸的代表性的实例包括盐酸，氢溴酸，氢碘酸，磷酸，硫酸，硝酸等。合适的有机酸的代表性的实例包括甲酸，醋酸，三氯乙酸，三氟乙酸，丙酸，安息香酸，肉桂酸，柠檬酸，富马酸，乙醇酸，乳酸，马来酸，苹果酸，丙二酸，扁桃酸，草酸，苦味酸，丙酮酸，水杨酸，琥珀酸，甲磺酸，乙磺酸，酒石酸，抗坏血酸，pamoic acid，二亚甲基水杨酸，乙二磺酸，葡糖酸，柠康酸，天冬氨酸，硬脂酸，棕榈酸，EDTA，乙醇酸，对氨基苯甲酸，谷氨酸，苯磺酸，对甲苯磺酸等。药学上可接受的无机或有机酸加成盐的其它实例包括J.Pharm.Sci.1977，66，2中列出的药学上可接受的盐，该文献在这里引作参考。金属盐的实例包括锂、钠、钾、镁盐等。铵盐和烷基化的铵盐的实例包括铵，甲基铵，二甲基铵，三甲基铵，乙基铵，羟乙基铵，二乙基铵，丁基铵，四甲基铵盐等。
如本文所使用的，化合物的″治疗有效量″是指足以治愈、减轻或部分地阻止指定疾病及其并发症的临床表现的量。将足以实现该目的的量定义为″治疗有效量″。对于每个目的的有效量，取决于疾病或损伤的严重性以及受试者的重量和一般状况。应当理解，使用常规实验，通过构建数值的矩阵和测试矩阵中的不同点，可以确定适当的剂量，这都在受过训练的医生或兽医的普通技能范围内。
如本文所使用的，术语“治疗”是指为了抵抗状况(例如疾病或障碍)而处理和护理患者。该术语意在包括患者患有的指定状况的全部治疗，例如施用有活性的化合物来减轻症状或并发症，延迟疾病、障碍或状况的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或状况以及预防状况，其中预防应当理解成，为了抵抗疾病、状况或障碍而处理和护理患者，且包括施用有活性的化合物，以预防症状或并发症的发作。待治疗的患者优选地是哺乳动物，尤其是人类，但是它也可以包括动物，例如狗、猫、奶牛、绵羊和猪。
发明详述
原则上，能催化化合物向肽中的整合的任何酶都可以用于本发明的方法中。作为实例，有用的酶包括羧肽酶，其构成一组属于分类组E.C.3.4.16，3.4.17和3.4.18的肽水解酶。由所述的酶催化的体内反应是C-末端氨基酸残基的水解。已知了各种不同的羧肽酶，它们在能剪切的末端氨基酸残基方面有所不同。在催化周期的过程中，会形成酶-底物复合物，其在正常的体内条件下，会受到水分子的亲核攻击，这最终导致肽键的水解。但是，在本发明的方法中，加入了亲核试剂，其可以与作为亲核体的水竞争。而且，通过在溶剂或水性溶剂中进行反应，可以减少水活度。在本发明的方法中，所述的亲核体能攻击酶-底物复合物，最终形成转酰化的化合物。除了是亲核体以外，所述的试剂还必须包含一个或多个在要缀合的肽中不可接近的官能团。
可以应用在本发明的方法中的其它酶包括胰蛋白酶。
肽和亲核体的反应，能提供转酰化的肽，其中C-末端氨基酸残基已经与亲核化合物互换，后者包含一个或多个在要缀合的肽中不可接近的官能团。该反应(或这系列反应)的总结果是，一个或多个官能团向肽中的整合，其仅仅存在于肽中的一个位置。该转酰化的肽与包含要缀合到肽上的部分和一个或多个官能团(其仅仅与在转酰化反应中添加到肽上的官能团反应)的化合物的随后的反应(或系列反应)，能实现要缀合的肽的选择性缀合。
与利用已经存在于肽中的官能团(例如赖氨酸的N-末端氨基或ε-氨基)的其它缀合方法相比，本发明的方法能提供提高的选择性的优点。一个或多个在肽中不可接近的官能团的整合，能确保缀合仅仅发生在特定的位置。
如以前提到的，在本发明的方法中可以使用能催化化合物向肽中的整合的任何酶，尤其羧肽酶是有用的。特别有用的羧肽酶的实例是丝氨酸-类型羧肽酶，例如溶酶体的Pro-X羧肽酶(也称作脯氨酸羧肽酶，血管紧张素酶C，溶酶体的羧肽酶C和脯氨酰基羧肽酶)，丝氨酸-类型D-Ala-D-Ala羧肽酶(也称作D-丙氨酰基-D-丙氨酸羧肽酶，DD-肽酶和DD-转肽酶)，羧肽酶C(也称作丝氨酸-类型羧肽酶I，组织蛋白酶A，羧肽酶Y和溶酶体的保护蛋白)和羧肽酶D(也称作羧肽酶KEX1和羧肽酶S1)；金属羧肽酶，例如羧肽酶A，羧肽酶B(也称作鱼精蛋白酶)，赖氨酸(精氨酸)羧肽酶(也称作羧肽酶N)，和Gly-X羧肽酶(也称作羧肽酶S)；和半胱氨酸-类型羧肽酶(也称作溶酶体的羧肽酶B，组织蛋白酶B2，组织蛋白酶Iv和酸羧肽酶)。还众所周知，可以在羧肽酶的序列中改变、添加或删除氨基酸残基，以修饰酶的催化性质。这样的修饰的羧肽酶记载在，例如WO 98/38285中，其在这里引作参考。特别提及的是作为有用的酶的羧肽酶Y。
已知许多亲核化合物，其可以根据本发明的方法整合进肽中，α-氨基酸是一类这样的亲核化合物。但是，为了本发明的目的，优选地选择亲核化合物，以使形成的转酰化的化合物自身不是所应用的酶的底物。换句话说，优选地应用能有效地阻止该酶的任何进一步反应的亲核化合物。这样的化合物的一个实例是α-氨基酸的酰胺，因为羧基酰胺化的肽不是羧肽酶的底物。
已经认可，化合物是否是给定的酶的底物原则上取决于进行反应的条件，例如时间范围。给定足够的时间，许多化合物实际上是酶的底物，尽管它们在正常的条件下不是视作这样。当在上面声称转酰化的化合物自身不应当是酶的底物时，意在表示转酰化的化合物自身不是酶的底物，达到不会干扰本发明的方法中的后继反应的程度。如果转酰化的化合物实际上是酶的底物，可以在转酰化反应后将酶去除或通过例如酶抑制剂失活。
在一个实施方案中，本发明涉及缀合肽的方法，其中在一个或多个步骤中，在有羧肽酶存在的情况下，使肽P与第一种化合物反应，后者是由下式代表的α-氨基酸酰胺：
Figure C20048002959200161
形成下式的转酰化的肽：
Figure C20048002959200171
在一个或多个步骤中，使所述的转酰化的肽进一步与下式的第二种化合物反应：
Y-E-Z
形成下式的缀合的肽：
Figure C20048002959200172
其中R代表着连接物或键；
其中P’代表着当从肽P去除C-末端氨基酸时得到的肽；
X代表着包含在构成肽P’的氨基酸残基中不可接近的官能团的基团；
Y代表着包含一个或多个官能团的基团，该官能团能与存在于X中的官能团反应，且该官能团不与在肽P’中可接近的官能团反应；
E代表着连接物或键；
A代表着由包含在X和Y中的官能团之间的反应形成的部分；且
Z是要缀合到肽上的部分，其中所述的部分能减少式[a]化合物的清除，与P的清除相比。
在另一个实施方案中，本发明涉及如上所述的缀合肽的方法，其还包含将得到的缀合的肽配制到药物组合物中的步骤。
缀合后，通过本领域众所周知的技术，可以分离和纯化缀合的肽。如果有关，也可以将缀合的肽转化成药学上可接受的盐或前药。
在X和Y的官能团之间的反应中形成的部分A，原则上可以是任意的类型，这取决于需要最终的缀合的肽的哪种性质。在一些情况下，可以希望它具有不稳定的键，后者可以在某一后期阶段中剪切掉，例如通过一些酶促反应或通过光解。在其它的情况下，可以希望它具有稳定的键，以便得到稳定的缀合的肽。特别提及的是，由胺衍生物和羰基之间的反应形成的部分的类型，例如肟，腙，苯腙和缩氨基脲部分。
在一个实施方案中，X和Y的官能团选自羰基，例如酮基和醛基，和氨基衍生物，例如
肼衍生物            -NH-NH2，
肼羧酸酯衍生物      -O-C(O)-NH-NH2，
氨基脲衍生物        -NH-C(O)-NH-NH2，
氨基硫脲衍生物      -NH-C(S)-NH-NH2，
碳酸二酰肼衍生物    -NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2，
卡巴肼衍生物        -NH-NH-C(O)-NH-NH2，
硫代卡巴肼衍生物    -NH-NH-C(S)-NH-NH2，
芳基肼衍生物        -NH-C(O)-C6H4-NH-NH2，和
酰肼衍生物          -C(O)-NH-NH2；
oxylamine衍生物，例如-O-NH2，-C(O)-O-NH2，-NH-C(O)-O-NH2和-NH-C(S)-O-NH2。
应当理解，如果包含在X中的官能团是羰基，则包含在Y中的官能团是胺衍生物，反之亦然。由于-NH2基团存在于大多数的肽中，因而认为如果X具有酮-或醛-官能度，则可以得到更好的选择性。
合适的X和Y对的另一个实例是叠氮化物衍生物(-N3)和炔烃，其能反应形成***部分。
合适的X和Y对的另一个实例是炔烃和腈-氧化物，其能反应形成异噁唑烷部分。
具体地，要转酰化的基团
Figure C20048002959200181
可以选自2-氨基-3-氧代-丁酰胺，2-氨基-6-(4-氧代-戊酰基氨基)-己酸酰胺，2-氨基-3-(2-氧代-2-苯基-乙基硫烷基)-丙酰胺，2-氨基-5-氧代-己酸酰胺，2-氨基-3-氧代-丙酰胺，2-氨基-6-(4-乙酰基苯甲酰基氨基)己酸酰胺，2-氨基-3-氧代丙酸酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丁氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(4-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)己酸酰胺，4-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺，(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-(4-氯苯基丁酰基氨基)己酸酰胺，3-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺，2-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺，(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺，(S)-2-氨基戊-4-炔酸酰胺和S-苯基酰基半胱氨酸酰胺。
要转酰化的化合物和要与转酰化的肽反应的化合物分别包含连接物R和E。这些连接物彼此独立，可以不存在，或选自烷烃、烯烃或炔烃双基和杂烷烃、杂烯烃和杂炔烃双基，其中一个或多个任选地取代的芳族同素环双基或杂环化合物的双基(例如亚苯基或哌啶双基)可以***前述的双基中。应当理解，所述的连接物也可以包含选自下述基团的取代：羟基，卤素，硝基，氰基，羧基，芳基，烷基和杂芳基。
E和R都代表着键或连接物，且在本文中，术语“连接物”意在表示分别起着将Y与Z分开和将X与NH2-C(O)-C(NH2)-分开的手段的作用的部分。连接物E和R的一个功能是，在肽和缀合的部分Z之间的连接处提供适当的柔韧性。E和R的典型实例包括直链的、分支的和/或环状的C1-10烷烃、C2-10烯烃、C2-10炔烃、C1-10杂烷烃、C2-10杂烯烃、C2-10杂炔烃的双基，其中可以***一个或多个同素环芳族化合物双基或杂环化合物双基。E和R的具体实例包括
Figure C20048002959200191
Figure C20048002959200201
Figure C20048002959200211
对修饰肽的需要可以源自许多原因，这也反映在可以根据本发明的方法缀合到肽上的化合物的种类中。可以希望缀合肽，以改变该肽的物理-化学性质，例如提高(或降低)溶解度，以改变治疗性肽的生物利用度。在另一个实施方案中，可以希望改变在体内的清除速率，例如通过将化合物缀合到肽上，所述的肽能缀合血浆蛋白例如白蛋白，或能增加肽的大小，以阻止或延迟从肾脏中***。在另一个实施方案中，可以希望缀合标记物，以促进肽的分析。这样的标记物的实例包括放射性同位素，荧光标记和酶底物。在另一个实施方案中，将化合物缀合到肽上，以促进肽的分离。例如，可以将对特定的柱材料具有特异的亲合力的化合物缀合到肽上。还可以希望改变肽的免疫原性，例如通过缀合肽，从而隐藏、遮蔽或掩蔽肽上的1个或多个免疫原性的表位。
具体地，本发明的方法可以用于降低清除，以便与对应的未修饰的肽相比，增加修饰的肽的血浆半衰期。术语“血浆半衰期”以它的普通含义使用，即在清除之前在血浆中存在肽的50％生物学活性的时间。替代性的术语包括血清半衰期，循环半衰期，循环的半衰期，血清清除率，血浆清除率，和清除半衰期。
与血浆半衰期一起使用的术语“增加”用于表示，与对应的未修饰的肽的半衰期相比，缀合的肽的半衰期显著增加。例如，半衰期可以增加了至少25％，至少50％，至少100％，至少150％，至少200％或甚至至少500％。
在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的缀合肽的方法，其还包含测量是否已经实现了血浆半衰期的增加的步骤。
与P的清除相比，能导致式[a]化合物的清除降低的Z的具体实例包括有机部分，例如PEG或mPEG基团和其氨基衍生物；直链的、分支的和/或环状的C1-22烷基，C2-22烯基，C2-22炔基，C1-22杂烷基，C2-22杂烯基，C2-22杂炔基，其中可以***一个或多个同素环芳族化合物双基或杂环化合物双基，且其中所述的C1-C22或C2-C22基团可以任选地被一个或多个选自下述的取代基取代：羟基，卤素，羧基，杂芳基和芳基，其中所述的芳基或杂芳基可以任选地被一个或多个选自下述的取代基进一步取代：羟基，卤素，和羧基；甾族化合物基团；脂类基团；多糖基团，例如葡聚糖；聚酰胺基团例如聚氨基酸基团；PVP基团；PVA基团；聚(1-3-dioxalane)；聚(1，3，6-三噁烷)；乙烯/马来酸酐聚合物；汽巴克隆染料，例如汽巴克隆蓝3GA，和特定长度的聚酰胺链，如WO 00/12587所述，其在这里引作参考。
特别提及的是，C10-20烷基，例如C15和C17，和下式的二苯甲酮衍生物
缀合到根据本发明的肽上的PEG可以具有任意的分子量。具体地，分子量可以是500至100,000Da，例如500至60,000Da，例如1000至40,000Da，例如5000至40,000Da。具体地，在本发明中可以使用分子量为10000Da，20000Da，30000Da或40000Da的PEG。
在一个实施方案中，Z包含一个或多个已知能结合血浆蛋白(例如白蛋白)的部分。如在这里引作参考的J.Med.Chem，43，2000，1986-1992所述，可以确定化合物的结合白蛋白的能力。在本文中，如果Ru/Da大于0.05，例如大于0.10，例如大于0.12或甚至大于0.15，则将化合物定义为能结合白蛋白。
在本发明的另一个实施方案中，结合白蛋白的部分是肽，例如包含小于40个氨基酸残基的肽。在这里引作参考的J.Biol Chem.277，38(2002)35035-35043中，公开了许多作为结合白蛋白的部分的小肽。
Z可以是分支的，以便Z包含超过一个上述的标记物或基团。
式Y-E-Z的化合物的具体实例包括
其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200243
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200251
其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200253
其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200255
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200261
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200262
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200263
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200264
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200265
其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200271
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200272
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200273
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200274
其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200276
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200281
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200282
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200283
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200284
其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200286
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200291
其中mPEG具有10kDa的分子量，
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200293
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200301
其中mPEG具有10kDa的分子量，
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200303
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200304
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200305
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200311
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200312
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200313
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200314
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200315
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200316
其中mPEG具有10kDa的分子量，
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200322
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200323
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200324
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200325
其中mPEG具有10kDa的分子量，
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200331
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200332
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200333
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200334
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200335
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200341
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200342
其中mPEG具有10kDa的分子量，
Figure C20048002959200343
Figure C20048002959200351
Figure C20048002959200361
Figure C20048002959200371
Figure C20048002959200381
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200382
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200383
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200384
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200385
其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200393
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200394
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200395
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200396
其中mPEG具有30kDa的分子量，
Figure C20048002959200401
其中mPEG具有30kDa的分子量，
Figure C20048002959200402
其中mPEG具有30kDa的分子量，
Figure C20048002959200403
其中mPEG具有30kDa的分子量，
Figure C20048002959200404
其中mPEG具有30kDa的分子量，
Figure C20048002959200405
其中mPEG具有30kDa的分子量，
Figure C20048002959200406
其中mPEG具有30kDa的分子量，
其中mPEG具有30kDa的分子量，
Figure C20048002959200412
其中mPEG具有30kDa的分子量，
Figure C20048002959200413
其中mPEG具有30kDa的分子量，
Figure C20048002959200414
Figure C20048002959200421
其中mPEG具有20kDa的分子量，
Figure C20048002959200422
其中mPEG具有20kDa的分子量，和
Figure C20048002959200423
其中mPEG具有20kDa的分子量。
如上所述，羧肽酶的催化作用能造成C-末端氨基酸残基与例如下式的化合物互换：
Figure C20048002959200431
如果需要维持要缀合的肽的完整序列，因而必需用一个氨基酸残基来延长肽序列。这样做的手段是本领域的技术人员众所周知的，例如通过重组技术或通过蛋白合成方法。希望延长肽序列的另一个原因是，使肽成为现有的特定羧肽酶的底物。如前所述，羧肽酶之间的差异主要在于它们能剪切的氨基酸残基的种类。因而，可能必需添加一个或多个氨基酸残基，以使给定的肽成为给定的羧肽酶的底物。添加的氨基酸残基可以是天然的或非天然的。
已经认可，一些肽，例如胰岛素和因子VII，包含超过一个链，这又意味着它们具有超过一个C-末端。在一些情况下，通过合适地选择使用的羧肽酶，可能可以区分C-末端。在其它情况下，可能必需导入C-末端之间的差异，例如通过从一个C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基，以实现在存在的仅仅有限数量的C-末端处的缀合。在其它情况下，在所有的C-末端缀合肽可能是有用的。
通过本发明的方法可以缀合任意的肽，例如酶，肽激素，生长因子，抗体，细胞因子，受体，淋巴因子和疫苗抗原，特别提及的是治疗性肽，例如胰岛素，胰高血糖素样-肽1(GLP-1)，胰高血糖素样-肽2(GLP-2)，生长激素，细胞因子，三叶因子肽(trefoil factorpeptide)(TFF)，肽黑皮质素受体修饰剂和因子VII化合物。
特别适用的胰岛素是人胰岛素。在本文中，术语“人胰岛素”指天然产生的胰岛素或重组产生的胰岛素。在任何合适的宿主细胞中，可以生产重组的人胰岛素，例如宿主细胞可以是细菌、真菌(包括酵母)、昆虫、动物或植物细胞。文献中已经公开了许多胰岛素化合物，它们也特别可用于本发明的方法中。“胰岛素化合物”(和有关的表述)是指其中已经删除了和/或用其它的氨基酸(包括非可编码的氨基酸)替换了一个或多个氨基酸的人胰岛素，和/或包含额外的氨基酸(即超过51个氨基酸)的人胰岛素，和/或其中至少一个有机取代基结合到一个或多个氨基酸上的人胰岛素。
提及了下面的专利文件，作为特别适用于本发明提供的方法的胰岛素化合物的公开内容。
WO 97/31022(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了具有延长的活性特性的胰岛素化合物，其中B-链的N-末端氨基酸的氨基和/或LysB29的ε-氨基具有包含亲脂取代基的羧酸。特别提及的是，NεB29-(CO-(CH2)14-COOH)人胰岛素；NεB29-(CO-(CH2)16-COOH)人胰岛素；NεB29-(CO-(CH2)18-COOH)人胰岛素；NεB29-(CO-(CH2)20-COOH)；NεB29-(CO-(CH2)22-COOH)人胰岛素；NεB29-(CO-(CH2)14-COOH)AspB28-人胰岛素；NεB29-(CO-(CH2)16-COOH)AspB28-人胰岛素；NεB29-(CO-(CH2)18-COOH)AspB28-人胰岛素；NεB29-(CO-(CH2)20-COOH)AspB28-人胰岛素；NεB29-(CO-(CH2)22-COOH)AspB28-人胰岛素；NεB30-(CO-(CH2)14-COOH)ThrB29LysB30-人胰岛素；NεB30-(CO-(CH2)16-COOH)ThrB29LysB30-人胰岛素；NεB30-(CO-(CH2)18-COOH)ThrB29LysB30-人胰岛素；NεB30-(CO-(CH2)20-COOH)ThrB29LysB30-人胰岛素；NεB30-(CO-(CH2)22-COOH)ThrB29LysB30-人胰岛素；NεB28-(CO-(CH2)14-COOH)LysB28ProB29-人胰岛素；NεB28-(CO-(CH2)16-COOH)LysB28ProB29-人胰岛素；NεB28-(CO-(CH2)18-COOH)LysB28ProB29-人胰岛素；NεB28-(CO-(CH2)20-COOH)LysB28ProB29-人胰岛素；NεB28-(CO-(CH2)22-COOH)LysB28ProB29-人胰岛素；NεB29(CO-(CH2)14-COOH)desB30人胰岛素；NεB29-(CO-(CH2)16-COOH)desB30人胰岛素；NεB29-(CO-(CH2)18-COOH)desB30人胰岛素；NεB29-(CO-(CH2)20-COOH)desB30人胰岛素；和NεB29-(CO-(CH2)22COOH)desB30人胰岛素。
WO 96/29344(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了具有延长的活性特性的胰岛素化合物，其中B-链的N-末端氨基酸的氨基具有附着的包含12-40个碳原子的亲脂取代基，或其中B-链的C-末端氨基酸的羧酸基团具有附着的包含12-40个碳原子的亲脂取代基。
WO 95/07931(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了具有延长的活性特性的胰岛素化合物，其中LysB29的ε-氨基具有亲脂取代基。特别提及的是，NεB29-十三烷酰基des(B30)人胰岛素，NεB29-十四烷酰基des(B30)人胰岛素，NεB29-癸酰基des(B30)人胰岛素，NεB29-十二烷酰基des(B30)人胰岛素，NεB29-十三烷酰基GlyA21des(B30)人胰岛素，NεB29-十四烷酰基GlyA21des(B30)人胰岛素，NεB29-癸酰基GlyA21des(B30)人胰岛素，NεB29-十二烷酰基GlyA21des(B30)人胰岛素，NεB29-十三烷酰基GlyA21 GlnB3 des(B30)人胰岛素，NεB29-十四烷酰基GlyA21 GlnB3des(B30)人胰岛素，NεB29-癸酰基GlyA21 GlnB3 des(B30)人胰岛素，NεB29-十二烷酰基GlyA21 GlnB3 des(B30)人胰岛素，NεB29-十三烷酰基AlaA21des(B30)人胰岛素，NεB29-十四烷酰基AlaA21 des(B30)人胰岛素，NεB29-癸酰基AlaA21 des(B30)人胰岛素，NεB29-十二烷酰基AlaA21 des(B30)人胰岛素，NεB29-十三烷酰基AlaA21 GlnB3 des(B30)人胰岛素，NεB29-十四烷酰基AlaA21 GlnB3 des(B30)人胰岛素，NεB29-癸酰基AlaA21 GlnB3des(B30)人胰岛素，NεB29-十二烷酰基AlaA21 GlnB3 des(B30)人胰岛素，NεB29-十三烷酰基GlnB3 des(B30)人胰岛素，NεB29-十四烷酰基GlnB3des(B30)人胰岛素，NεB29-癸酰基GlnB3 des(B30)人胰岛素，NεB29-十二烷酰基GlnB3 des(B30)人胰岛素，NεB29-十三烷酰基GlyA21人胰岛素，NεB29-十四烷酰基GlyA21人胰岛素，NεB29-癸酰基GlyA21人胰岛素，NεB29-十二烷酰基GlyA21人胰岛素，NεB29-十三烷酰基GlyA21 GlnB3人胰岛素，NεB29-十四烷酰基GlyA21 GlnB3人胰岛素，NεB29-癸酰基GlyA21 GlnB3人胰岛素，NεB29-十二烷酰基GlyA21 GlnB3人胰岛素，NεB29-十三烷酰基AlaA21人胰岛素，NεB29-十四烷酰基AlaA21人胰岛素，NεB29-癸酰基AlaA21人胰岛素，NεB29-十二烷酰基AlaA21人胰岛素，NεB29-十三烷酰基AlaA21 GlnB3人胰岛素，NεB29-十四烷酰基AlaA21 GlnB3人胰岛素，NεB29-癸酰基AlaA21 GlnB3人胰岛素，NεB29-十二烷酰基AlaA21 GlnB3人胰岛素，NεB29-十三烷酰基GlnB3人胰岛素，NεB29-十四烷酰基GlnB3人胰岛素，NεB29-癸酰基GlnB3人胰岛素，NεB29-十二烷酰基GlnB3人胰岛素，NεB29-十三烷酰基GluB30人胰岛素，NεB29-十四烷酰基GluB30人胰岛素，NεB29-癸酰基GluB30人胰岛素，NεB29-十二烷酰基GluB30人胰岛素，NεB29-十三烷酰基GlyA21 GluB30人胰岛素，NεB29-十四烷酰基GlyA21 GluB30人胰岛素，NεB29-癸酰基GlyA21 GluB30人胰岛素，NεB29-十二烷酰基GlyA21 GluB30人胰岛素，NεB29-十三烷酰基GlyA21 GlnB3 GluB30人胰岛素，NεB29-十四烷酰基GlyA21 GlnB3 GluB30人胰岛素，NεB29-癸酰基GlyA21 GlnB3 GluB30人胰岛素，NεB29-十二烷酰基GlyA21GlnB3 GluB30人胰岛素，NεB29-十三烷酰基AlaA21 GluB30人胰岛素，NεB29-十四烷酰基AlaA21 GluB30人胰岛素，NεB29-癸酰基AlaA21 GluB30人胰岛素，NεB29-十二烷酰基AlaA21 GluB30人胰岛素，NεB29-十三烷酰基AlaA21 GlnB3GluB30人胰岛素，NεB29-十四烷酰基AlaA21 GlnB3 GluB30人胰岛素，NεB29-癸酰基AlaA21 GlnB3 GluB30人胰岛素，NεB29-十二烷酰基AlaA21 GlnB3 GluB30人胰岛素，NεB29-十三烷酰基GlnB3 GluB30人胰岛素，NεB29-十四烷酰基GlnB3 GluB30人胰岛素，NεB29-癸酰基GlnB3 GluB30人胰岛素和NεB29-十二烷酰基GlnB3 GluB30人胰岛素。
WO 97/02043(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了无激素活性的可以用于胰岛素预防的胰岛素化合物，具体地，这样的人胰岛素类似物选自desA1人胰岛素；des(A1-A2)人胰岛素；des(A1-A3)人胰岛素；desA21人胰岛素；des(B1-B5)人胰岛素；des(B1-B6)人胰岛素；des(B23-B30)人胰岛素；des(B24-B30)人胰岛素；des(B25-B30)人胰岛素；GlyA2人胰岛素；AlaA2人胰岛素；NleA2人胰岛素；ThrA2人胰岛素；ProA2人胰岛素；D-allo IleA2人胰岛素；NvaA3人胰岛素；NleA3人胰岛素；LeuA3人胰岛素；ValA2，IleA3人胰岛素；AbuA2，AbuA3人胰岛素；GlyA2，GlyA3人胰岛素；D-CysA6人胰岛素；D-CysA6，D-CysA11人胰岛素；SerA6，SerA11，des(A8-A10)人胰岛素；D-CysA7人胰岛素；D-CysA11人胰岛素；LeuA19人胰岛素；GlyB6人胰岛素；GluB12人胰岛素；AsnB12人胰岛素；PheB12人胰岛素；D-AlaB12人胰岛素；和AspB25人胰岛素，它们可以用在本发明的方法中。
WO 92/15611(Novo nordisk)，其在这里引作参考，公开了在胰岛素受体结合过程中具有快的缔合速率常数的人胰岛素类似物，其特征在于，包含在位置A13处的酪氨酸和/或在位置B17处的苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。具体地，这样的类似物选自TyrA13人胰岛素，PheB17人胰岛素，TrpB17人胰岛素，TyrB17人胰岛素，TyrA13，PheB17人胰岛素，TyrA13，TrpB17人胰岛素，TyrA13，TyrB17人胰岛素，PheA13，PheB17人胰岛素，PheA13，TrpB17人胰岛素，PheA13，TyrB17人胰岛素，TrpA13，PheB17人胰岛素，TrpA13，TrpB17人胰岛素和TrpA13，TyrB17人胰岛素。
WO 92/00322(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了能靶向特定的组织的人胰岛素类似物，其特征在于，在胰岛素分子的A13位置和/或B17位置具有不同于亮氨酸的天然产生的氨基酸残基，和/或在胰岛素分子的B18位置具有不同于缬氨酸的天然产生的氨基酸残基。具体地，这样的类似物选自AlaB17人胰岛素，AlaB18人胰岛素，AsnA13人胰岛素，AsnA13，AlaB17人胰岛素，AsnA13，AspB17人胰岛素，AsnA13，GluB17人胰岛素，AsnB18人胰岛素，AspA13人胰岛素，AspA13，AlaB17人胰岛素，AspA13，AspB17人胰岛素，AspA13，GluB17人胰岛素，AspB18人胰岛素，GlnA13人胰岛素，GlnA13，AlaB17人胰岛素，GlnA13，AspB17人胰岛素，GlnB18人胰岛素，GluA13人胰岛素，GluA13，AlaB17人胰岛素，GluA13，AspB17人胰岛素，GluA13，GluB17人胰岛素，GluB18人胰岛素，GlyA13人胰岛素，GlyA13，AlaB17人胰岛素，GlyA13，AsnB17人胰岛素，GlyA13，AspB17人胰岛素，GlyA13，GluB17人胰岛素，GlyB18人胰岛素，SerA13人胰岛素，SerA13，GlnA17，GluB10，GlnB17-des(ThrB30)人胰岛素，SerA13，AlaB17人胰岛素，SerA13，AsnB17人胰岛素，SerA13，AspB17人胰岛素，SerA13，GlnB17人胰岛素，SerA13，GluB17人胰岛素，SerA13，ThrB17人胰岛素，SerB14，AspB17人胰岛素，SerB18人胰岛素，ThrA13人胰岛素或ThrB18人胰岛素。
WO 90/01038(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了具有高生物活性的人胰岛素类似物，其特征在于，具有被His或Tyr取代的PheB25，在下述的一个或多个位置具有取代：A4，A8，A17，A21，B9，B10，B12，B13，B21，B26，B27，B28和B30，和在任选地缺少的位置B30处具有氨基酸残基。具体地，这样的类似物选自TyrB25人胰岛素，TyrB25，AspB28人胰岛素，HisB25人胰岛素，HisB25，AspB28人胰岛素，TyrB25人胰岛素-B30-酰胺和HisB25人胰岛素-B30-酰胺。
WO 86/05496(Nordisk Gentofte)公开了具有延长的作用的人胰岛素类似物，其特征在于，具有封闭的B30羧基，和在位置A4，A17，A21，B13和B21处的氨基酸残基中具有1-4个封闭的羧基。具体地，这样的类似物选自胰岛素-B30-辛基酯，胰岛素-B30-十二烷基酰胺，胰岛素-B30-十六烷基酰胺，胰岛素-(B21，B30)-二甲基酯，胰岛素-(B17，B30)-二甲基酯，胰岛素-(A4，B30)二酰胺，胰岛素-A17酰胺-B30-辛基酯，胰岛素-(A4，B13)-二酰胺-B30-己基酰胺，胰岛素-(A4，A17，B21，B30)-四酰胺，胰岛素-(A17，B30)-二酰胺，A4-Ala-胰岛素-B30-酰胺和B30-Leu-胰岛素-(A4，B30)-二酰胺。
WO 86/05497(Nordisk Gentofte)，其在这里引作参考，公开了胰岛素化合物，其中在位置A4，A17，B13和B21处的4个氨基酸残基中的一个或多个包含不带电荷的侧链。特别提及的是，人胰岛素A17-Gln，人胰岛素A4-Gln，猪胰岛素B21-Gln，人胰岛素B13-Gln，人胰岛素(A17，B21)-Gln，人胰岛素A4-Ala，人胰岛素B21-Thr，人胰岛素B13-Val，人胰岛素-Thr-A17-Gln，人胰岛素B21-甲基酯和人胰岛素A17-甲基酯。
WO 92/00321(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了具有延长的活性的胰岛素化合物，其中已经在B-链的N-末端导入了正电荷。特别提及的是，ArgB5，SerA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB5，ProB6，SerA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB5，GlyA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB5，ProB6，GlyA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB2，SerA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB2，ProB3，SerA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB2，GlyA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB2，ProB3，GlyA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB2，ArgB3，SerA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB2，ArgB3，SerA21人胰岛素，ArgB4，ProB5，SerA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB4，ArgB5，ProB6，GlyA21，ThrB30人胰岛素，ArgB3，GlyA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB3，SerA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB4，GlyA21，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB4，SerA21，ThrB30-NH2人胰岛素和ArgB1，ProB2，GlyA21，ThrB30-NH2人胰岛素。
WO 90/07522(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了能在溶液中表现出低缔合能力的胰岛素化合物，其中存在带正电荷的氨基酸残基，即在位置B28处的Lys或Arg。特别提及的是，des[PheB25]-人胰岛素，des[TyrB26]-人胰岛素，des[ThrB27]-人胰岛素，des[ProB28]-人胰岛素，des[PheB25]-猪胰岛素，des[ProB28]-猪胰岛素，des[ProB28]-兔胰岛素，des[PheB25]，des[ThrB30]-人胰岛素，des[TyrB26]，des[ThrB30]-人胰岛素，[SerA21]-des[ProB28]-人胰岛素，[GlyA21]-des[ProB28]-人胰岛素，[GlyA21]-des[PheB25]-人胰岛素，[AspA21]-des[PheB25]-人胰岛素，[HisB25]-des[TyrB26]，des[ThrB30]-人胰岛素，[AsnB25]-des[TyrB26]，des[ThrB30]-人胰岛素，[AspA21]-des[PheB25]，des[ThrB30]-人胰岛素，[AspB28]-des[PheB25]-人胰岛素，[AspB3]-des[PheB25]-人胰岛素，[LysB28]-人胰岛素，[LysB28，ThrB29]-人胰岛素和[ArgB28]-des[LysB29]-人胰岛素。
WO 90/11290(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了具有延长的活性的胰岛素化合物。特别提及的是，[ArgA0]-人胰岛素-(B30-酰胺)，[ArgA0，GlnB13]-人胰岛素-(B30-酰胺)，[ArgA0，GlnA4，AspA21]-人胰岛素-(B30-酰胺)，[ArgA0，SerA21]-人胰岛素-(B30-酰胺)和[ArgA0，ArgB27]-des[ThrB30]-人胰岛素。
WO 90/10645(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了糖基化的胰岛素。特别提及的是，Phe(B1)葡萄糖人胰岛素，Phe(B1)甘露糖人胰岛素，Gly(A1)甘露糖人胰岛素，Lys(B29)甘露糖人胰岛素，Phe(B1)半乳糖人胰岛素，Gly(A1)半乳糖人胰岛素，Lys(B29)半乳糖人胰岛素，Phe(B1)麦芽糖人胰岛素，Phe(B1)乳糖人胰岛素，Gly(A1)葡萄糖人胰岛素，Gly(A1)麦芽糖人胰岛素，Gly(A1)乳糖人胰岛素，Lys(B29)葡萄糖人胰岛素，Lys(B29)麦芽糖人胰岛素，Lys(B29)乳糖人胰岛素，Gly(A1)，Phe(B1)二葡萄糖人胰岛素，Gly(A1)，Lys(B29)二葡萄糖人胰岛素，Phe(B1)，Lys(B29)二葡萄糖人胰岛素，Phe(B1)异麦芽糖人胰岛素，Gly(A1)异麦芽糖人胰岛素，Lys(B29)异麦芽糖人胰岛素，Phe(B1)麦芽三糖人胰岛素，Gly(A1)麦芽三糖人胰岛素，Lys(B29)麦芽三糖人胰岛素，Gly(A1)，Phe(B1)二麦芽糖人胰岛素，Gly(A1)，Lys(B29)二麦芽糖人胰岛素，Phe(B1)，Lys(B29)二麦芽糖人胰岛素，Gly(A1)，Phe(B1)二乳糖人胰岛素，Gly(A1)，Lys(B29)二乳糖人胰岛素，Phe(B1)，Lys(B29)二乳糖人胰岛素，Gly(A1)，Phe(B1)二麦芽三糖人胰岛素，Gly(A1)，Lys(B29)二麦芽三糖人胰岛素，Phe(B1)，Lys(B29)二麦芽三糖人胰岛素，Phe(B1)，Gly(A1)二甘露糖人胰岛素，Phe(B1)，Lys(B29)二甘露糖人胰岛素，Gly(A1)，Lys(B29)二甘露糖人胰岛素，Phe(B1)，Gly(A1)二半乳糖人胰岛素，Phe(B1)，Lys(B29)二半乳糖人胰岛素，Gly(A1)，Lys(B29)二半乳糖人胰岛素，Phe(B1)，Gly(A1)二异麦芽糖人胰岛素，Phe(B1)，Lys(B29)二异麦芽糖人胰岛素，Gly(A1)，Lys(B29)二异麦芽糖人胰岛素，Phe(B1)葡萄糖[AspB10]人胰岛素和Gly(A1)，Phe(B1)二葡萄糖[AspB10]人胰岛素。
WO 88/065999(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了稳定化的胰岛素化合物，其中Ans21A已经被其它的氨基酸残基取代。特别提及的是，GlyA21人胰岛素，AlaA21人胰岛素，SerA21人胰岛素，ThrA21人胰岛素和hSerA21人胰岛素。
EP 254516(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了具有延长的作用的胰岛素化合物，其中碱性氨基酸残基已经被中性的氨基酸残基取代。特别提及的是GlyA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，SerA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，ThrA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，AlaB21，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，HisA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，AspB21，LysB27，ThrB30-NN2人胰岛素，GlyA21，ArgB21，ThrB30-NH2人胰岛素，SerA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，ThrA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，AlaB21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，HisA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，AspB21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，GlyA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，SerA21，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，SerA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，ThrA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，AlaA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，HisA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，AspA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，GlyA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，SerA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，ThrA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，AlaA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，HisA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，AspA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，AsnA21，LysB27人胰岛素，SerA21，LysB27人胰岛素，ThrA21，LysB27人胰岛素，AlaA21，LysB27人胰岛素，HisA21，LysB27人胰岛素，AspA21，LysB27人胰岛素，GlyA21，LysB27人胰岛素，AsnA21，ArgB27人胰岛素，SerA21，ArgB27人胰岛素，ThrA21，ArgB27人胰岛素，AlaA21，ArgB27人胰岛素，HisA21，ArgB27人胰岛素，AspA21，ArgB27人胰岛素，GlyA21，ArgB27人胰岛素，GlnA17，AsnA21，ArgB27人胰岛素，GlnA17，SerA21，ArgB27人胰岛素，GlnA17，ThrA21，ArgB27人胰岛素，GlnA17，AlaA21，ArgB27人胰岛素，GlnA17，HisA21，ArgB27人胰岛素，GlnA17，AspA21，ArgB27人胰岛素，GlnA17，GlyA21，ArgB27人胰岛素，GlnA17，AsnA21，GlnB13人胰岛素，GlnA17，SerA21，GlnB13人胰岛素，GlnA17，ThrA21，GlnB13人胰岛素，GlnA17，AlaA21，GlnB13人胰岛素，GlnA17，HisA21，GlnB13人胰岛素，GlnA17，AspA21，GlnB13人胰岛素，GlnA17，GlyA21，GlnB13人胰岛素，ArgA27，AsnA21，GlnB13人胰岛素，ArgA27，SerA21，GlnB13人胰岛素，ArgA27，ThrA21，GlnB13人胰岛素，ArgA27，AlaA21，GlnB13人胰岛素，ArgA27，HisA21，GlnB13人胰岛素，ArgA27，AspA21，GlnB13人胰岛素，ArgA27，GlyA21，GlnB13人胰岛素，GlnA17，AsnA21，LysB27人胰岛素，GlnA17，SerA21，LysB27人胰岛素，GlnA17，ThrA21，LysB27人胰岛素，GlnA17，AlaA21，LysB27人胰岛素，GlnA17，HisA21，LysB27人胰岛素，GlnA17，AspA21，LysB27人胰岛素，GlnA17，GlyA21，LysB27人胰岛素，GlnB13，AsnA21，LysB27人胰岛素，GlnB13，SerA21，LysB27人胰岛素，GlnB13，ThrA21，LysB27人胰岛素，GlnB13，AlaA21，LysB27人胰岛素，GlnB13，HisA21，LysB27人胰岛素，GlnB13，AspA21，LysB27人胰岛素，和GlnB13，GlyA21，LysB27人胰岛素。
EP 214826(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了迅速开始的胰岛素化合物。
EP 194864(Novo Nordisk)，其在这里引作参考，公开了具有延长的作用的胰岛素化合物，其中碱性氨基酸残基已经被中性氨基酸残基取代。特别提及的是，GlnA17，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnA17，GlnB13，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnA17，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnA17，LysB27-NH2人胰岛素，GlnA17，GlnA17，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，GlnB13，LysB30-NH2人胰岛素，GlnB13，ThrB30-NH2人胰岛素，ArgB27，ArgB30-NH2人胰岛素，ArgB27，LysB30-NH2人胰岛素，ArgB27，ThrB30-NH2人胰岛素，LysB27，ArgB30-NH2人胰岛素，LysB27，LysB30-NH2人胰岛素，LysB27，ThrB30-NH2人胰岛素，LysB29-NH2，des-(B30)人胰岛素，ThrB30-NH2人胰岛素，LysB30-NH2人胰岛素，LysB30(Lau)-NH2人胰岛素，LysB30，ArgB31-NH2人胰岛素，LysB30，LysB31-NH2人胰岛素，ArgB30-NH2人胰岛素，ArgB30，ArgB31-NH2人胰岛素，和ArgB30，LysB31-NH2人胰岛素。
美国专利号3,528,960(Eli Lilly)，其在这里引作参考，公开了N-羧基芳酰基胰岛素化合物，其中胰岛素分子的1、2或3个伯(primary)氨基具有羧基芳酰基。
英国专利号1.492.997(Nat.Res.Dev.Corp.)，其在这里引作参考，公开了在NεB29处具有氨甲酰基取代的胰岛素化合物，其具有提高的低血糖作用特征。
日本公开未决专利申请号1-254699(Kodama Co.，Ltd.)，其在这里引作参考，公开了胰岛素化合物，其中烷酰基结合到PheB1的氨基或LysB29的ε-氨基或它们二者上。
日本公开未决专利申请号57-067548(Shionogi)，其在这里引作参考，公开了胰岛素化合物，其中B30位置具有包含至少5个碳原子的氨基酸，其不是必须由核苷酸的三联体编码。
WO 03/053339(Eli Lilly)，其在这里引作参考，公开了胰岛素化合物，其中已经用2个氨基酸残基A-1和A0在N-末端延伸了A-链，其中已经用2个氨基酸残基B-l和B0在N-末端延伸了B-链，其中可以取代在位置B28，B29和B39处的氨基酸残基，和其中在位置B28或B29处的Lys的ε-氨基共价地结合到带正电荷的氨基酸的α-羧基上，形成Lys-Nε-氨基酸衍生物。特别提及的是，所述的类似物，其中A-1和B-1都不存在，和其中A0代表着Arg，B0代表着Arg或不存在。
选自下述的胰岛素化合物
i.类似物，其中位置B28是Asp，Lys，Leu，Val或Ala，和位置B29是Lys或Pro；和
ii.des(B28-B30)，des(B27)或des(B30)人胰岛素，
也可以适用于本发明的方法，尤其是其中位置B28是Asp或Lys，和位置B29是Lys或Pro的胰岛素化合物。
des(B30)人胰岛素也适用于本发明的方法中。
其它适用的胰岛素化合物选自：B29-Nε-肉豆蔻酰基-des(B30)人胰岛素，B29-Nε-棕榈酰基-des(B30)人胰岛素，B29-Nε-肉豆蔻酰基人胰岛素，B29-Nε-棕榈酰基人胰岛素，B28-Nε-肉豆蔻酰基LysB28ProB29人胰岛素，B28-Nε-棕榈酰基LysB28ProB29人胰岛素，B30-Nε-肉豆蔻酰基-ThrB29LysB30人胰岛素，B30-Nε-棕榈酰基-ThrB29LysB30人胰岛素，B29-Nε-(N-棕榈酰基-γ-谷氨酰基)-des(B30)人胰岛素，B29-Nε-(N-石胆酰基(lithocholyl)-γ-谷氨酰基)-des(B30)人胰岛素，B29-Nε-(ω-羧基十七酰基)-des(B30)人胰岛素，B29-Nε-(ω-羧基十七酰基)人胰岛素和B29-Nε-肉豆蔻酰基-des(B30)人胰岛素。
在本发明的方法中适用的GLP-1的实例包括人GLP-1和GLP-1化合物。人GLP-1是37个氨基酸残基的肽，它源自前高血糖素原，后者在回肠远端、胰腺和脑中的L-细胞中i.a.地合成。GLP-1是重要的消化道激素，在葡萄糖代谢和胃肠分泌和代谢中具有调节功能。能产生GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)和GLP-2的前高血糖素原的加工主要发生在L-细胞中。片段GLP-1(7-36)-酰胺和GLP-1(7-37)都是葡萄糖依赖性的促胰岛素试剂。在过去的数十年中，从毒蜥(Gila monsterlizard)(钝尾毒蜥(Heloderma suspectum)和珠毒蜥(Helodermahorridum))的毒液中，分离了GLP-1的许多结构类似物。Exendin-4是从珠毒蜥的毒液分离的39个氨基酸残基的肽，且该肽与GLP-1具有52％同源性。Exendin-4是有效的GLP-1受体激动剂，当注射进狗中时，已经证实它能刺激胰岛素释放和确保降低血糖水平。GLP-1(1-37)和exendin-4(1-39)和其某些片段、类似物和衍生物这一组物质(在本文中称作GLP-1化合物)是有效的促胰岛素试剂，它们都适用于本发明的方法中。GLP-1(1-37)的促胰岛素片段是促胰岛素肽，其完整序列可以在GLP-1(1-37)的序列中发现，且其中已经删除了至少1个末端氨基酸。GLP-1(1-37)的促胰岛素片段的实例是：GLP-1(7-37)，其中已经删除了在GLP-1(1-37)的位置1-6处的氨基酸残基，和GLP-1(7-36)，其中已经删除了在GLP-1(1-37)的位置1-6和37处的氨基酸残基。
exendin-4(1-39)的促胰岛素片段的实例是exendin-4(1-38)和exendin-4(1-31)。通过本领域众所周知的体内或体外测定，可以测定化合物的促胰岛素性质。例如，可以将化合物施用给动物，并监测胰岛素浓度随时间的变化。GLP-1(1-37)和exendin-4(1-39)的促胰岛素类似物是指各自的分子，其中一个或多个氨基酸残基已经被替换成其它的氨基酸残基，和/或已经从中删除了一个或多个氨基酸残基，和/或已经从中添加了一个或多个氨基酸残基，条件是，所述的类似物是促胰岛素的或是促胰岛素的化合物的前药。GLP-1(1-37)的促胰岛素的类似物的实例是例如：Met8-GLP-1(7-37)，其中在位置8处的丙氨酸已经替换为甲硫氨酸，且已经删除了在位置1-6处的氨基酸残基，和Arg34-GLP-1(7-37)，其中在位置34处的缬氨酸已经被替换为精氨酸，且已经删除了在位置1-6处的氨基酸残基。exendin-4(1-39)的促胰岛素的类似物的实例是Ser2Asp3-exendin-4(1-39)，其中在位置2和3处的氨基酸残基已经分别被替换为丝氨酸和天冬氨酸(在本领域，该特殊的类似物也称作exendin-3)。GLP-1(1-37)、exendin-4(1-39)和其类似物的促胰岛素的衍生物是被本领域技术人员视作这些肽的衍生物的那些，即具有至少1个在亲本肽分子中不存在的取代基，条件是，所述的衍生物是促胰岛素的或是促胰岛素的化合物的前药。取代基的实例是酰胺，碳水化合物，烷基和亲脂取代基。GLP-1(1-37)、exendin-4(1-39)和其类似物的促胰岛素的衍生物的实例是GLP-1(7-36)-酰胺，Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六酰基)))-GLP-1(7-37)和Tyr31-exendin-4(1-31)-酰胺。GLP-1(1-37)、exendin-4(1-39)、其促胰岛素片段、其促胰岛素的类似物和其促胰岛素的衍生物的其它实例记载在WO 98/08871，WO 99/43706，US 5424286和WO 00/09666中，它们都在这里引作参考。
通过本发明提供的方法，也可以修饰GLP-2和GLP-2化合物。在本文中，GLP-2化合物能结合GLP-2受体，优选地具有小于1μM、例如小于100nM的亲合常数(KD)或潜能(EC50)。术语“GLP-2化合物”意在表示其中一个或多个氨基酸残基已经被删除和/或被另一种天然的或非天然的氨基酸残基替代的人GLP-2，和/或包含额外的氨基酸残基的人GLP-2，和/或其中至少1个有机取代基结合到一个或多个氨基酸残基上的人GLP-2。具体地，考虑这些肽，其氨基酸序列能在33个连续氨基酸的任意序列处展现出超过60％的人GLP-2的氨基酸序列。还考虑这些肽，当从氨基酸序列删除了至多4个氨基酸时，其氨基酸序列能在37个连续氨基酸的任意序列处展现出超过60％的人GLP-2的氨基酸序列。还考虑这些肽，当向它们的氨基酸序列中添加了至多2个氨基酸时，其氨基酸序列能在31个连续氨基酸的任意序列处展现出超过60％的GLP-2的氨基酸序列。术语“GLP化合物”也包括天然的等位基因变体，它们可以在个体之间存在和发生。另外，糖基化作用或其它的翻译后修饰的程度和位置，可以随选择的宿主细胞和宿主细胞环境的性质而异。
可以根据本发明使用的候选GLP-2化合物包括WO 96/32414，WO97/39031，WO 98/03547，WO 96/29342，WO 97/31943，WO 98/08872所述的GLP-2化合物，它们都在这里引作参考。
具体地，下面的GLP-2化合物适用于本发明的方法：
 A2G-GLP-2(1-33)；K30R-GLP-2(1-33)；S5K-GLP-2(1-33)；S7K-GLP-2(1-33)；D8K-GLP-2(1-33)；E9K-GLP-2(1-33)；M10K-GLP-2(1-33)；N11K-GLP-2(1-33)；T12K-GLP-2(1-33)；I13K-GLP-2(1-33)；L14K-GLP-2(1-33)；D15K-GLP-2(1-33)；N16K-GLP-2(1-33)；L17K-GLP-2(1-33)；A18K-GLP-2(1-33)；D21K-GLP-2(1-33)；N24K-GLP-2(1-33)；Q28K-GLP-2(1-33)；S5K/K30R-GLP-2(1-33)；S7K/K30R-GLP-2(1-33)；D8K/K30R-GLP-2(1-33)；E9K/K30R-GLP-2(1-33)；M10K/K30R-GLP-2(1-33)；N11K/K30R-GLP-2(1-33)；T12K/K30R-GLP-2(1-33)；I13K/K30R-GLP-2(1-33)；L14K/K30R-GLP-2(1-33)；D15K/K30R-GLP-2(1-33)；N16K/K30R-GLP-2(1-33)；L17K/K30R-GLP-2(1-33)；A18K/K30R-GLP-2(1-33)；D21K/K30R-GLP-2(1-33)；N24K/K30R-GLP-2(1-33)；Q28K/K30R-GLP-2(1-33)；K30R/D33K-GLP-2(1-33)；D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；和D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。在本发明的一个实施方案中，GLP-2化合物选自：GLP-2(1-33)，34R-GLP-2(1-34)，A2G-GLP-2(1-33)，A2G/34R-GLP-2(1-34)，K30R-GLP-2(1-33)；S5K-GLP-2(1-33)；S7K-GLP-2(1-33)；D8K-GLP-2(1-33)；E9K-GLP-2(1-33)；M10K-GLP-2(1-33)；N11K-GLP-2(1-33)；T12K-GLP-2(1-33)；I13K-GLP-2(1-33)；L14K-GLP-2(1-33)；D15K-GLP-2(1-33)；N16K-GLP-2(1-33)；L17K-GLP-2(1-33)；A18K-GLP-2(1-33)；D21K-GLP-2(1-33)；N24K-GLP-2(1-33)；Q28K-GLP-2(1-33)；S5K/K30R-GLP-2(1-33)；S7K/K30R-GLP-2(1-33)；D8K/K30R-GLP-2(1-33)；E9K/K30R-GLP-2(1-33)；M10K/K30R-GLP-2(1-33)；N11K/K30R-GLP-2(1-33)；T12K/K30R-GLP-2(1-33)；I13K/K30R-GLP-2(1-33)；L14K/K30R-GLP-2(1-33)；D15K/K30R-GLP-2(1-33)；N16K/K30R-GLP-2(1-33)；L17K/K30R-GLP-2(1-33)；A18K/K30R-GLP-2(1-33)；D21K/K30R-GLP-2(1-33)；N24K/K30R-GLP-2(1-33)；Q28K/K30R-GLP-2(1-33)；K30R/D33K-GLP-2(1-33)；D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。
仅仅具有1个附着到GLP-2肽上的亲脂取代基的GLP-2衍生物也适用于本发明的方法，例如GLP-2衍生物，其中亲脂取代基包含4-40个碳原子，例如8-25个碳原子，例如12-20个碳原子。
亲脂取代基可以以亲脂取代基的羧基与氨基酸残基的氨基形成酰胺键的方式，附着到氨基酸残基上。
作为实例，亲脂取代基附着到Lys残基上。
亲脂取代基可以以亲脂取代基的氨基与氨基酸残基的羧基形成酰胺键的方式，附着到氨基酸残基上。
亲脂取代基也可以借助于隔离物附着到GLP-2肽上，且所述的隔离物可以选自β-丙氨酸，γ-氨基丁酸(GABA)，γ-谷氨酸，Lys，Asp，Glu，含有Asp的二肽，含有Glu的二肽，或含有Lys的二肽。在本发明的一个实施方案中，隔离物是β-丙氨酸。亲本GLP-2肽的羧基也可以与隔离物的氨基形成酰胺键，且氨基酸或二肽隔离物的羧基可以与亲脂取代基的氨基形成酰胺键。
亲本GLP-2肽的氨基也可以与隔离物的羧基形成酰胺键，且隔离物的氨基可以与亲脂取代基的羧基形成酰胺键。
在本发明的一个实施方案中，亲脂取代基是直链的或分支的烷基。在本发明的一个实施方案中，亲脂取代基是直链的或分支的脂肪酸的酰基。
在本发明的一个实施方案中，亲脂取代基是直链的或分支的烷烃α，ω-二羧酸的酰基。
在本发明的一个实施方案中，GLP-2衍生物具有1个亲脂取代基。在本发明的一个实施方案中，GLP-2衍生物具有2个亲脂取代基。在本发明的一个实施方案中，GLP-2衍生物具有3个亲脂取代基。在本发明的一个实施方案中，GLP-2衍生物具有4个亲脂取代基。下表含有特别适用于本发明的方法中的GLP-2衍生物。
S5K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
S7K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
D8K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
E9K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
M10K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
N11K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
T12K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
I13K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L14K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
D15K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
N16K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(辛酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(壬酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(癸酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十一酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十二酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十三酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十四酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十五酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十七酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十八酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十九酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(二十酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(辛酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(壬酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(癸酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十一酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十二酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十三酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十四酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十五酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十六酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十七酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十八酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十九酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(二十酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(辛酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(壬酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(癸酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十一酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十二酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十三酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十四酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十五酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十六酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十七酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十八酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十九酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(二十酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
A18K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
D21K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
N24K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
Q28K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
S5K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
S7K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D8K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
E9K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
M10K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
N11K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
T12K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K 30R-GLP-2(1-33)；
I13K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L14K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D15K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
N16K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(辛酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(壬酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(癸酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十一酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十二酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十三酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十四酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十五酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十七酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十八酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十九酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(二十酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(辛酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(壬酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(癸酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十一酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十二酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十三酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十四酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十五酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十六酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十七酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十八酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十九酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(二十酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(辛酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(壬酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(癸酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十一酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十二酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十三酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十四酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十五酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十六酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十七酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十八酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十九酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(二十酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
A18K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D21K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
N24K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
Q28K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D3E/S5K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/S7K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D8K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/E9K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/M10K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N11K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/T12K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/I13K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L14K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D15K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N16K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(辛酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(壬酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(癸酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十一酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十二酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十三酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十四酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十五酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十七酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十八酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十九酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(二十酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(辛酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(壬酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(癸酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十一酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十二酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十三酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十四酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十五酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十六酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十七酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十八酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十九酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(二十酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(辛酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(壬酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(癸酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十一酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十二酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十三酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十四酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十五酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十六酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十七酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十八酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十九酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(二十酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/A18K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D21K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N24K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；和
D3E/Q28K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。
适用于本发明的方法中的因子VII化合物包括：野生型因子VII(即，具有美国专利号4,784,950公开的氨基酸序列的多肽)，以及与野生型因子VII相比能表现出基本上相同的或提高的生物学活性的因子VII的变体，因子VII-有关的多肽，以及因子VII衍生物和因子VII缀合物。术语“因子VII化合物”意在包括：处于它们的未剪切(酶原)形式的因子VII多肽，似及已经经过蛋白水解加工而生成它们各自的生物活性形式的那些，其可以称作因子VIIa。典型地，在残基152和153之间剪切因子VII，生成因子VIIa。这样的因子VII的变体可以表现出与人因子VII不同的性质，包括稳定性、磷脂结合、改变的比活等。
如本文使用的，“因子VII-有关的多肽”包括多肽，包括变体，其中与野生型因子VIIa的活性相比，已经基本上修饰或减少了因子VIIa生物活性。这些多肽包括但不限于因子VII或因子VIIa，其中已经导入了特定的氨基酸序列改变，其能修饰或破坏多肽的生物活性。
如本文使用的，术语“因子VII衍生物”意指野生型因子VII，与野生型因子VII相比能表现出基本上相同的或提高的生物学活性的因子VII的变体，和因子VII-有关的多肽，其中已经化学修饰了亲本肽的一个或多个氨基酸，例如通过烷基化，PEG化，酰基化，酯形成或酰胺形成等。这包括但不限于PEG化的人因子VIIa，半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa和其变体。
术语″PEG化的人因子VIIa″指具有与人因子VIIa多肽缀合的PEG分子的人因子VIIa。应当理解，PEG分子可以附着到因子VIIa多肽的任何部分，包括因子VIIa多肽的任何氨基酸残基或碳水化合物部分。术语″半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa″指具有缀合到导入人因子VIIa的半胱氨酸的巯基上的PEG分子的因子VIIa。
因子VIIa在血液凝固中的生物学活性源自它的下述能力：(i)结合组织因子(TF)，和(ii)催化因子IX或因子X的蛋白水解剪切，生成活化的因子IX或X(分别是因子IXa或Xa)。为了本发明的目的，通过使用因子VII-缺陷型血浆和促凝血酶原激酶，测量制品的促进血液凝固的能力，可以定量因子VIIa生物学活性，如例如美国专利号5,997,864所述。在该测定中，将生物学活性表达为，与对照样品相比，凝固时间的减少，并通过与合并的含有1单位/ml因子VII活性的人血清标准品的对比，转化成“因子VII单位”。或者，通过下述方式可以定量因子VIIa生物学活性：(i)测量因子VIIa在包含嵌入脂膜的TF和因子X的***中生成因子Xa的能力(Persson等人，J.Biol.Chem.272：19919-19924，1997)；(ii)测量在水性***中的因子X水解；(iii)使用基于表面等离子体振子共振(surface plasmonresonance)的装置，测量它与TF的物理结合(Persson，FEBS Letts.413：359-363，1997)；和(iv)测量合成的底物的水解。
与野生型因子VIIa相比，具有基本上相同的或提高的生物学活性的因子VII变体包括，当在一个或多个如上所述的凝固测定、蛋白水解测定或TF结合测定中测试时，能表现出已经在相同细胞类型中产生的因子VIIa的比活的至少约25％、优选地至少约50％、更优选地至少约75％和最优选地至少约90％的那些。与野生型因子VIIa相比，具有基本上减少的生物学活性的因子VII变体是，当在一个或多个如上所述的凝固测定、蛋白水解测定或TF结合测定中测试时，能表现出已经在相同细胞类型中产生的野生型因子VIIa的比活的小于约25％、优选地小于约10％、更优选地小于约5％和最优选地小于约1％的那些。与野生型因子VII相比，具有基本上修饰的生物学活性的因子VII变体包括但不限于，能表现出TF非依赖性因子X蛋白水解活性的因子VII变体，和能结合TF、但是不能剪切因子X的那些。
表现出与野生型因子VII基本上相同的或更好的生物活性，或者表现出与野生型因子VII相比基本上修饰或减少的生物活性的因子VII的变体，包括但不限于，具有通过***、删除或取代一个或多个氨基酸而不同于野生型因子VII的序列的氨基酸序列的多肽。
如本文使用的，术语“变体”意指具有野生型因子VII的序列的因子VII，其中亲本蛋白的一个或多个氨基酸已经被取代为另一种氨基酸，和/或其中已经删除了亲本蛋白的一个或多个氨基酸，和/或其中已经将一个或多个氨基酸***蛋白，和/或其中已经将一个或多个氨基酸添加到亲本蛋白上。这样的添加可以发生在亲本蛋白的N-末端或C-末端或二者。在该定义范围内，“变体”仍具有它的活化形式的FVII活性。在一个实施方案中，变体与野生型因子VII的序列具有70％一致性。在一个实施方案中，变体与野生型因子VII的序列具有80％一致性。在另一个实施方案中，变体与野生型因子VII的序列具有90％一致性。在另一个实施方案中，变体与野生型因子VII的序列具有95％一致性。
具有与野生型因子VII基本上相同的生物学活性的因子VII变体的非限制性实例包括：S52A-FVIIa，S60A-FVIIa(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352：182-192，1998)；表现出提高的蛋白水解稳定性的FVIIa变体，由美国专利号5,580,560所公开；已经在残基290和291之间或残基315和316之间经蛋白水解剪切的因子VIIa(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48：501-505，1995)；因子VIIa的氧化形式(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.363：43-54，1999)；由PCT/DK02/00189公开的FVII变体；和表现出提高的蛋白水解稳定性的FVII变体，由WO 02/38162所公开(ScrippsResearch Institute)；具有修饰的Gla-结构域且能表现出增强的膜结合的FVII变体，由WO 99/20767(University of Minnesota)和WO00/66753(University of Minnesota)所公开；和由WO 01/58935(Maxygen ApS)，WO 03/93465(Maxygen ApS)和WO 04/029091(MaxygenApS)所公开的FVII变体，它们都在这里引作参考。
特别提及的是，与野生型FVIIa相比，具有提高的生物学活性的FVII变体包括由WO 01/83725，WO 02/22776，WO 02/077218，PCT/DK02/00635，WO 2004/029090，WO 2003/037932；WO 02/38162(Scripps Research Institute)所公开的FVII变体；和由JP2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)所公开的具有增强的活性的FVIIa变体，它们都在这里引作参考。
与野生型因子VII相比，具有基本上减少的或修饰的生物学活性的因子VII变体的实例包括R152E-FVIIa(Wildgoose等人，Biochem29：3413-3420，1990)，S344A-FVIIa(Kazama等人，J.Biol.Chem.270：66-72，1995)，FFR-FVIIa(Holst等人，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.15：515-520，1998)，和缺少Gla结构域的因子VIIa(Nicolaisen等人，FEBS Letts.317：245-249，1993)，它们都在这里引作参考。
因子VII的变体、因子VII或因子VII-有关的多肽的实例包括野生型因子VII，L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，和S336G-FVII，L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，S314E/V158D-FVII，S314E/E296V-FVII，S314E/M298Q-FVII，S314E/V158T-FVII，K316H/L305V-FVII，K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII，K316H/E296V-FVII，K316H/M298Q-FVII，K316H/V158T-FVII，K316Q/L305V-FVII，K316Q/K337A-FVII，K316Q/V158D-FVII，K316Q/E296V-FVII，K316Q/M298Q-FVII，K316Q/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/K337A/E296V-FVII，S314E/L305V/K337A/V158D-FVII，S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII，S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V-FVII，S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/K337NM298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D-FVII，K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII，K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/K337A-FVII，F374Y/V158D-FVII，F374Y/E296V-FVII，F374Y/M298Q-FVII，F374Y/V158T-FVII，F374Y/S314E-FVII，F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374Y/V158D/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，F374Y/V158T/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-因子VII，S60A-因子VII；R152E-因子VII，S344A-因子VII，缺少Gla结构域的因子VIIa；和P11Q/K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；和在233Thr至240Asn的氨基酸序列中具有取代、添加或缺失的FVII，在304Arg至329Cys的氨基酸序列中具有取代、添加或缺失的FVII。
适用于本发明的方法中的生长激素包括其序列和特征记载在例如Hormone Drugs，Gueriguian，U.S.P.Covention，Rockvill，1982中的人生长激素(hGH)和生长激素化合物。术语“生长激素化合物”意在表示其中一个或多个氨基酸残基已经被删除，和/或被其它天然的或非天然的氨基酸残基替代的人生长激素(hGH)，和/或包含额外的天然的或非天然的氨基酸残基的hGH，和/或其中至少1个有机取代基结合到一个或多个有机取代基上的hGH。特别提及的是，191个天然的氨基酸的序列(生长激素)和192个氨基酸的N-末端甲硫氨酸的种类(人蛋氨生长素)。
适用于本发明的生长激素化合物的其它实例包括，其中氨基酸NO.172，174，176和178作为一组被一个下面的氨基酸组取代：(R，S，F，R)；(R，A，Y，R)，(K，T，Y，K)；(R，S，Y，R)；(K，A，Y，R)；(R，F，F，R)；(K，Q，Y，R)；(R，T，Y，H)；(Q，R，Y，R)；(K，K，Y，K)；(R，S，F，S)或(K，S，N，R)，如WO 92/09690(Genentech)所述，其在这里引作参考。
适用于本发明的生长激素化合物的其它实例包括，具有下述取代的hGH：G120R，G120K，G120Y，G120F和G120E，如US 6,004,931(Genentech)所述，其在这里引作参考。
适用于本发明的生长激素化合物的其它实例包括，具有下述的一套取代的hGH：R167N，D171S，E174S，F176Y和I179T；R176E，D171S，E174S和F176Y；F10A，M14W，H18D和H21N；F10A，M14W，H18D，H21N，R167N，D171S，E174S，F176Y，I179T；F10A，M14W，H18D，H21N，R167N，D171A，E174S，F176Y，I179T；F10H，M14G，H18N和H21N；F10A，M14W，H18D，H21N，R167N，D171A，T175T和I179T；和F10I，M14Q，H18E，R167N，D171S和I179T，如US 6,143,523(Genentech)所述，其在这里引作参考。
适用于本发明的生长激素化合物的其它实例包括，具有下述的一套取代的hGH：H18A，Q22A，F25A，D26A，Q29A，E65A，K168A，E174A和G120K，如US 6,136,536(Genentech)所述，其在这里引作参考。
适用于本发明的生长激素化合物的其它实例包括，具有下述的一套取代：H18D，H21N，R167N，K168A，D171S，K172R，E174S，I179T，和其中G120还被R，K，W，Y，F或E取代的hGH，如US6,057,292(Genentech)所述，其在这里引作参考。
适用于本发明的生长激素化合物的其它实例包括，具有下述的一套取代的hGH：H18D，H21N，R167N，K168A，D171S，K172R，E174S和I179T，如US 5,849,535(Genentech)所述，其在这里引作参考。
适用于本发明的生长激素化合物的其它实例包括，具有下述的一套取代的hGH：H18D，H21D，R167N，K168A，D171S，K172R，E174S和I179T；和H18A，Q22A，F25A，D26A，Q29A，E65A，K168A和E174A，如WO 97/11178(Genentech)所述，其在这里引作参考。
适用于本发明的生长激素化合物的其它实例包括，具有下述的一套取代的hGH：K168A和E174A；R178N和I179M；K172A和F176A；和H54F，S56E，L58I，E62S，D63N和Q66E如WO 90/04788(Genentech)所述，其在这里引作参考。
使用本发明的方法可以修饰的细胞因子的实例包括***(EPO)，血小板生成素，INF-α，IFN-β，IFN-γ，TNF-α，白介素-1β(IL-1-β)，IL-3，IL-4，IL-5，IL-10，IL-12，IL-15，IL-18，IL-19，IL-20，IL-21IL-24，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，GM-CSF，和趋化因子例如巨噬细胞(machrophage)炎性蛋白-1(MIP-1)γ干扰素诱导型蛋白和IFNγ诱导的单核因子(MIG)。
适用于本发明的方法中的IL-19的具体实例包括WO 98/08870(Human Genome Science)公开的那些，其在这里引作参考。特别提及的是，由WO 98/08870的SEQ ID NO：2公开的肽。
适用的IL-20的具体实例包括WO 99/27103(Zymogenetics)公开的那些，其在这里引作参考。在本文中，IL-20意在表示IL-20自身和其片段，以及与IL-20或其片段具有至少90％一致性的多肽。在本发明的方法中特别适用的蛋白包括，在WO 99/27103中公开为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ I D NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ IDNO：34和SEQ ID NO：35的那些。
适用于本发明的方法中的IL-21的实例包括，在WO 00/53761(Zymogenetics)中公开的那些，其在这里引作参考。特别提及的是，在WO 00/53761的SEQ ID NO：2中公开的肽。
TTF适用于本发明的方法中。TTF肽是主要与胃肠道相关地发现的肽家族。特别提及的是，从人、小鼠和大鼠获知的乳腺癌相关的pS2肽(TFF-1)，从人、猪、大鼠和小鼠获知的解痉的多肽(TFF-2)，和从人、大鼠和小鼠获知的肠三叶因子(TFF-3)。
适用于本发明的方法中的来自TFF家族的其它肽包括，在WO02/46226(Novo Nordisk)中公开的那些，其在这里引作参考。特别提及的是TFF-2肽，其中TFF2肽具有如WO 02/46226的SEQ ID NO：1所述的氨基酸，其包含在Cys6-Cys104，Cys8-Cys35，Cys19-Cys34，Cys29-Cys46，Cys58-Cys84，Cys68-Cys83，和Cys78-Cys95之间的二硫键，且其中独立地选自糖残基和寡糖的部分X共价地附着到Asn15上。
TFF家族的其它肽包括TFF-1和TFF-3二聚体，如在WO 96/06861(Novo Nordisk)中公开的那些，其在这里引作参考。
已知了几种黑皮质素受体，特别提及的适用于本发明的方法的肽是肽黑皮质素-4受体激动剂，已知其具有抑制食欲的作用。特别提及的是，在下面的专利文件中公开的肽或蛋白，它们都在这里引作参考：US 6,054,556(Hruby)，WO 00/05263(William Harvey Research)，WO 00/35952(Melacure)，WO 00/35952(Melacure)，WO 00/58361(Procter & Gamble)，WO 01/52880(Merck)，WO 02/26774(Procter& Gamble)，WO 03/06620(Palatin)，WO 98/27113(Rudolf MagnusInstitute)和WO 99/21571(Trega)。
适用于本发明的方法中的其它类型的肽或蛋白包括酶。许多酶用于各种不同的工业目的，特别提及的是，水解酶(蛋白酶，脂肪酶，纤维素酶，酯酶)，氧化还原酶(漆酶，过氧化物酶，过氧化氢酶，超氧化物歧化酶，脂肪氧化酶)，转移酶和异构酶。
适用于本发明的方法中的其它的肽或蛋白包括，ACTH，促肾上腺皮质激素释放因子，血管紧张素，降钙素，胰岛素及其片段和类似物，胰高血糖素，IGF-1，IGF-2，肠胃泌素，胃泌素，四肽胃泌素，五肽胃泌素，尿胃泌素，表皮生长因子，胰泌素，神经生长因子，促甲状腺素释放激素，促生长素抑制素，生长激素释放激素，促生长因子，甲状旁腺激素，血小板生成素，***，下丘脑释放因子，催乳素，促甲状腺激素，内啡肽，脑啡肽，加压素，催产素，opiods和其类似物，天冬酰胺酶，精氨酸酶，精氨酸脱氨酶，腺苷脱氨酶和核糖核酸酶。
可以从天然来源(例如植物、动物或微生物，例如酵母、细菌、真菌或病毒)分离要根据本发明的方法进行修饰的肽，或者可以合成它们。来自天然来源的肽也包括来自转基因来源(例如已经经遗传修饰而表达肽或增强肽的表达的来源)的肽，其中所述肽可以是“天然的”，其含义是它天然存在，或者是“非天然的”，其含义是它仅仅由于人类干涉而存在。在本发明的缀合之前，也可以对从天然来源分离的肽进行合成修饰，
在一个实施方案中，本发明涉及可以根据本发明的方法得到的缀合的肽。如果通过本发明的方法得到的缀合的肽是治疗性肽，则本发明也提供了这样的化合物在治疗中的用途，和包含这样的化合物的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了下式的缀合的肽
Figure C20048002959200741
其中P’，R，A，E和Z定义如上，且其中基团
Figure C20048002959200742
通过肽键结合到P’的C-末端。
这样的化合物的具体实例包括：
Lysε(4-((2-(1-(mPEG羰基)哌啶-4-基)乙氧基)亚氨基)戊酰基)192)hGH(1-192)酰胺，其中mPEG具有20kDa的分子量；
(Lysε(4-((3-(棕榈酰基氨基)丙氧基)亚氨基)戊酰基)192)hGH(1-192)酰胺；
(Lysε(4-((3-((2S)-2，6-mPEG羰基氨基)己酰基氨基)丙氧基)亚氨基)戊酰基)34)GLP-2(1-34)酰胺，其中mPEG具有20kDa的分子量；
(Lysε(4-(1-(2-(3-(mPEG)丙酰基氨基)肼基)乙基)苯甲酰基)192)hGH(1-92)酰胺，其中mPEG具有10kDa的分子量；
(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)丙酰胺；
(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基)丙酰胺；
3-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲酰基-3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基)甲基)异噁唑-3-基)苄基氨甲酰基)丙酸；
11-(4-(4-((2S)-2-氨甲酰基-2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-***基)十一酸；
11-(5-(4-((2S)-2-氨甲酰基-2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-***基)十一酸11-(4-(4-((S)-2-氨甲酰基-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基))苯氧基甲基)-1H-1，2，3-***-1-基)十一酸；
11-(5-(4-((S)-2-氨甲酰基-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基))苯氧基甲基)-1H-1，2，3-***-1-基)十一酸；
2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲酰基)癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-4-基)甲氧基)苯基)丙酰胺；和
2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲酰基)癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-5-基)甲氧基)苯基)丙酰胺。
胰岛素可以用于治疗或预防糖尿病，在一个实施方案中，本发明从而提供了治疗1型或2型糖尿病的方法，该方法包含给需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的胰岛素或胰岛素化合物缀合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的胰岛素或胰岛素化合物缀合物在生产用于治疗1型或2型糖尿病的药物中的用途。
GLP-1可以用于治疗高血糖症，2型糖尿病，葡萄糖耐受不良，1型糖尿病，肥胖，高血压，综合征X，异常脂血症(dyslipidemia)，β-细胞凋亡，β-细胞缺乏症，炎性肠综合征，消化不良，认知障碍例如认知增强，神经保护，动脉粥样硬化，冠心病和其它的心血管障碍。在一个实施方案中，本发明从而提供了治疗所述疾病的方法，该方法包含给需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的GLP-1或GLP-1化合物缀合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的GLP-1或GLP-1化合物缀合物在生产用于治疗上述疾病的药物中的用途。
GLP-2可以用于治疗会导致营养物在肠中的吸收障碍的肠故障，具体地，GLP-2可以用于治疗小肠综合征，炎性肠综合征，克罗恩病，结肠炎包括胶原性结肠炎、放射性结肠炎，辐射后的萎缩，非热带性(谷蛋白耐受不良)和热带性口炎性腹泻、血管阻塞或创伤后受损的组织，旅行者腹泻，脱水，菌血症，败血症，神经性厌食症，化疗后受损的组织，早产儿，schleroderma，胃炎包括萎缩性胃炎、窦切除术后的萎缩性胃炎和幽门螺杆菌胃炎，溃疡，肠炎，陷凹(cul-de-sac)，***阻塞，脉管病和移植物抗宿主病，手术过程后的愈合，辐射后的萎缩和化疗，和骨质疏松症。因此，本发明的一个目的是，提供治疗上述疾病的方法，该方法包含给需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的GLP-2或GLP-2化合物缀合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的GLP-2或GLP-2化合物缀合物在生产用于治疗上述疾病的药物中的用途。
生长激素已经涉入治疗能从生长激素的血浆水平的提高获益的疾病。在一个实施方案中，本发明提供了治疗下述疾病的方法：生长激素缺乏(GHD)；特纳综合征；普-韦综合征(PWS)；努南综合征；唐氏综合征；慢性肾脏疾病，青少年类风湿关节炎；囊性纤维化，接受HAART治疗的儿童(HIV/HALS儿童)的HIV-感染；短孕龄(SGA)出生的矮小儿童；出生时体重非常低(VLBW)但是SGA的儿童的身材矮小症；骨骼发肩异常；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成年人的GHD；长骨的骨折，例如胫骨，腓骨，股骨，肱骨，桡骨，尺骨，锁骨，matacarpea，matatarsea，和趾(指)；松质骨的骨折，例如颅骨(scull)，手基底，和脚基底；腱或韧带手术(例如，在手、膝或肩中)后的患者；接受或经历分散骨发生(distractionoteogenesis)的患者；髋关节或板(discus)置换、半月板修复、脊柱融合或假肢固定(例如，在膝、髋、肩、肘、腕或颚中)后的患者；其中已经固定了骨接合材料(例如钉子，螺丝钉和板材)的患者；骨折未连接或连接不正的患者；osteatomia(例如，从胫骨或
Figure C20048002959200771
趾)后的患者；移植物植入后的患者；外伤或关节炎造成的膝盖中的关节软骨变性；特纳综合征患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD)；APCD中的营养不良有关的心血管疾病；APCD中的恶病质的逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性abstractive肺病；APCD中的HIV；为APCD的老年人；APCD中的慢性肝病，APCD中的疲劳综合征；克罗恩病；肝功能不良；HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV-有关的脂肪营养不良综合征(HALS)；男性不育；大选择性外科手术、醇/药物解毒或神经创伤后的患者；老化；虚弱的老年人；骨关节炎；外伤损伤的软骨；***功能障碍；纤维肌痛(fibromyalgia)；记忆障碍；抑郁；外伤性脑损伤；蛛网膜下出血；出生时体重非常低；代谢综合征；糖皮质激素肌病；或由于儿童中的糖皮质激素治疗而引起的身材矮小症，该方法包含给需要的患者施用有效量的根据本发明的生长激素化合物缀合物。
在一方面，本发明提供了加速肌肉组织、神经组织或伤口的愈合的方法；加速或提高向受损组织的血流的方法；或降低受损组织的感染速度的方法，该方法包含给需要的患者施用有效量的根据本发明的生长激素化合物缀合物。
在一方面，本发明提供了根据本发明的生长激素化合物缀合物在生产用于治疗上述疾病的药物中的用途。
细胞因子涉入与免疫***有关的大量疾病的病因学。具体地，提及IL-20可能涉及银屑病和它的治疗，且认为I-21涉及癌症，和可以用于治疗该疾病。在一个实施方案中，本发明提供了治疗银屑病的方法，包含施用根据本发明的IL-20缀合物。在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的IL-20缀合物在生产用于治疗银屑病的药物中的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包含施用本发明的IL-21缀合物给需要的受试者。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的IL-21缀合物在生产用于治疗癌症的药物中的用途。
TTF肽可以用于增加受试者的粘膜层的粘度；减少唾液的分泌，例如当唾液分泌增加是由辐照治疗、用抗胆碱能药治疗或斯耶格伦综合征造成的时候；治疗过敏性鼻炎，创伤、休克、大手术、肾或肝病、使用NSAID(例如阿司匹林、类固醇或醇)的治疗后的应力诱发的胃溃疡。TTF肽也可以用于治疗克罗恩病，溃疡性结肠炎，角膜结膜炎，慢性膀胱感染，肠膀胱炎，***状瘤和膀胱癌。在一个实施方案中，本发明因而涉及治疗上述疾病或状态的方法，该方法包含向需要的受试患者施用治疗有效量的根据本发明的TTF缀合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的TTF缀合物在生产用于治疗上述疾病或状态的药物中的用途。
黑皮质素受体修饰剂(具体地，黑皮质素4受体激动剂)已经涉入肥胖和有关疾病的治疗和预防。在一个实施方案中，本发明提供了预防或延迟葡萄糖耐受不良(IGT)向非胰岛素需要性2型糖尿病的进展，预防或延迟非胰岛素需要性2型糖尿病向胰岛素需要性糖尿病的进展，治疗肥胖和调节食欲。黑皮质素4受体激动剂还已经涉入治疗选自下述的疾病：动脉粥样硬化，高血压，糖尿病，2型糖尿病，葡萄糖耐受不良(IGT)，脂血症，冠心病，胆囊病，胆石，骨关节炎，癌症，性功能障碍和早产儿死亡的危险。在一个实施方案中，本发明因而提供了治疗上述疾病或状态的方法，该方法包含给需要的受试者施用治疗有效量的本发明的黑皮质素4受体激动剂缀合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的黑皮质素4受体激动剂缀合物在生产用于治疗上述疾病或状态的药物中的用途。
因子VII化合物已经涉入治疗与凝结有关的疾病，具体地，生物活性的因子VII化合物已经涉入治疗血友病(hemophiliacs)，具有因子VIII和IX的抑制剂的血友病(hemophiliacs)，血小板减少症的患者，血小板病(例如格兰兹曼血小板机能不全、血小板释放缺陷和储存库缺陷(storage pool defect)的患者，维勒布兰德病的患者，肝病的患者，和与创伤或手术有关的出血问题。生物上无活性的因子VII化合物已经涉入治疗处于凝固性过高状态的患者，例如败血病、深静脉血栓形成的患者，处于心肌感染或血栓形成性中风、肺栓塞的危险中的患者，急性冠状综合征的患者，接受冠状强心剂(coronarycardiac)的患者，接受血管成形术的患者的心脏事件和再狭窄的预防，外周血管疾病的患者，和急性呼吸窘迫综合征。在一个实施方案中，本发明因而提供了治疗上述疾病或状态的方法，该方法包含给需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的因子VII化合物缀合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的因子VII化合物缀合物在生产用于治疗上述疾病或状态的药物中的用途。
在治疗中使用超过一种药物(伴随地施用或依次地施用)可以治疗许多疾病。因此，在治疗一种上述疾病的方法中，与一种或多种常用于治疗所述疾病的其它治疗活性的化合物相组合来使用本发明的肽缀合物，在本发明的范围内。类似地，在生产用于所述疾病的药物中，与常用于治疗一种上述疾病的其它治疗活性的化合物相组合来使用本发明的肽缀合物，也在本发明的范围内。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的缀合的肽在诊断中的用途。
如前所述，α-氨基酸酰胺特别适合用作在本发明的方法中的亲核体。在一个实施方案中，本发明因而提供了根据式(I)的化合物
Figure C20048002959200801
其中A和E独立地代表C1-6亚烷基，C2-6亚烯基，C2-6亚炔基或亚芳基，它们都可以任选地被一个或多个选自下述的取代基取代：卤素，氨基，氰基和硝基；
B和D代表着-C(O)-或-NH-，条件是，当B代表着-C(O)-时，则D必然代表着-NH-，且当B代表着-NH-时，则D必然代表着-C(O)-；
且G代表着氢或C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基或芳基，它们都可以任选地被一个或多个选自下述的取代基取代：卤素，氨基，氰基和硝基。
在一个实施方案中，A和E独立地代表C1-6亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基，或亚芳基，例如亚苯基。
在一个实施方案中，G代表着氢或甲基，乙基，丙基或丁基。
式I化合物的具体实例包括
(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)己酸酰胺，
4-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺，
(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-(4-氯苯基丁酰基氨基)己酸酰胺，
3-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺，和
2-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据式II的化合物
Figure C20048002959200802
其中J和L独立地代表C1-6亚烷基，C2-6亚烯基，C2-6亚炔基或亚芳基，它们都可以任选地被一个或多个选自下述的取代基取代：卤素，氨基，氰基和硝基；
且M代表着氢或C1-6烷基。
在一个实施方案中，J和L独立地代表C1-6亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基，或亚芳基，例如亚苯基。
在一个实施方案中，M代表着氢或甲基，乙基，丙基或丁基。
在一个实施方案中，式II的化合物选自
(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺，
(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丁氧基)苯基]丙酰胺，
(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺，和
(2S)-氨基-3-[4-(4-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据式III的化合物
Figure C20048002959200811
其中Q代表着C1-6亚烷基，C2-6亚烯基，C2-6亚炔基或亚芳基，它们都可以任选地被一个或多个选自下述的取代基取代：卤素，氨基，氰基和硝基；
且T代表着氢或C1-6烷基。
在一个实施方案中，Q代表着C1-6亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基，或亚芳基，例如亚苯基。
在一个实施方案中，T代表着氢或甲基，乙基，丙基或丁基。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据式IV的化合物
Figure C20048002959200821
其中J”和L”独立地代表着C1-6亚烷基或亚芳基，它们都可以任选地被一个或多个选自下述的取代基取代：卤素，氨基，氰基和硝基。
在一个实施方案中，J和L独立地代表亚甲基或亚乙基。
在一个实施方案中，式IV的化合物选自
(S)-2-氨基-3-(4-(炔丙基氧基)苯基)丙酰基酰胺。
药物组合物
本发明的另一个目的是提供药物组合物，其包含式[a]的化合物，后者以10-12mg/ml至200mg/ml，例如10-10mg/ml至5mg/ml的浓度存在，且其中所述的组合物具有2.0至10.0的pH。组合物还可以包含缓冲***，防腐剂，张力剂(tonicity agent)，螯合剂，稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，药物组合物是水性组合物，即包含水的组合物。这样的组合物典型地是溶液或悬浮液。在本发明的另一个实施方案中，药物组合物是水溶液。术语“水性组合物”被定义为包含至少50％w/w水的组合物。类似地，术语“水溶液”被定义为包含至少50％w/w水的溶液，和术语“水性悬浮液”被定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。
在另一个实施方案中，药物组合物是冷冻干燥的组合物，在使用之前，医生或患者向其中加入溶剂和/或稀释剂。
在另一个实施方案中，药物组合物是无需任何事先溶解即可使用的干燥的组合物(例如冷冻干燥的或喷雾干燥的)。
在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含式[a]的化合物的水溶液以及缓冲剂，其中所述的式[a]化合物以0.1-100mg/ml或更大的浓度存在，且其中所述的组合物具有约2.0至约10.0的pH。
在本发明的另一个实施方案中，组合物的pH选自下表：2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9.0，9.1，9.2，9.3，9.4，9.5，9.6，9.7，9.8，9.9，和10.0。
在本发明的另一个实施方案中，缓冲剂选自：醋酸钠，碳酸钠，柠檬酸盐，甘氨酰甘氨酸，组氨酸，甘氨酸，赖氨酸，精氨酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸钠，和三(羟甲基)-氨基甲烷，N-二(羟乙基)甘氨酸，N-(羟甲基)甲基甘氨酸，苹果酸，琥珀酸盐，马来酸，延胡索酸，酒石酸，天冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲剂中的每一种构成了本发明的可替换的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的防腐剂。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂选自：苯酚，邻甲酚，间甲酚，对甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，2-苯氧基乙醇，对羟基苯甲酸丁酯，2-苯基乙醇，苄醇，氯代丁醇，和硫柳汞，溴硝丙二醇，苯甲酸，咪脲，Chlorohexidine，脱氢醋酸钠，氯甲酚，对羟基苯甲酸乙酯，苄索氯铵，氯苯甘醚(3对氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以0.1mg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以0.1mg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些具体防腐剂中的每一种构成本发明的可替代的实施方案。防腐剂在药物组合物中的应用，是技术人员众所周知的。为了方便可参见Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第20版，2000。
在本发明的另一个实施方案中，组合物还包含等渗试剂。在本发明的另一个实施方案中，等渗试剂选自：盐(例如氯化钠)，糖或糖醇，氨基酸(例如L-甘氨酸，L-组氨酸，精氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，苏氨酸)，糖醇(例如甘油(丙三醇)，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，1，3-丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)，或其混合物。可以使用所有糖，例如单糖，二糖，或多糖，或水溶性的葡聚糖，包括例如果糖，葡萄糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，葡聚糖，支链淀粉，糊精，环糊精，可溶淀粉，羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一个实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇被定义为具有至少1个-OH基团的C4-C8烃，包括例如甘露醇，山梨糖醇，肌醇，半乳糖醇，卫矛醇，木糖醇，和***糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂是甘露醇。可以单独地或组合地使用上面提及的糖或糖醇。对使用的量没有固定的限制，只要糖或糖醇可溶于液体制剂中，且不能不利地影响使用本发明的方法得到的稳定作用。在一个实施方案中，糖或糖醇浓度是在约1mg/ml至约150mg/ml之间。在本发明的另一个实施方案中，等渗试剂以1mg/ml至50mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，等渗试剂以1mg/ml至7mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，等渗试剂以8mg/ml至24mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，等渗试剂以25mg/ml至50mg/ml的浓度存在。这些具体等渗试剂中的每一种构成本发明的可替代的实施方案。等渗试剂在药物组合物中的应用，是技术人员众所周知的。为了方便可参见Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第20版，2000。
在本发明的另一个实施方案中，组合物另外包含螯合剂。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐，和其混合物。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂以0.1mg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂以0.1mg/ml至2mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂以2mg/ml至5mg/ml的浓度存在。这些具体螯合剂中的每一种构成本发明的可替代的实施方案。螯合剂在药物组合物中的应用，是技术人员众所周知的。为了方便可参见Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第20版，2000。
在本发明的另一个实施方案中，组合物另外包含稳定剂。稳定剂在药物组合物中的应用，是技术人员众所周知的。为了方便可参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2000。
更具体地，本发明的组合物是稳定化的液体药物组合物，其治疗活性组分包括蛋白，后者可能在液体药物组合物储存过程中表现出聚集体形成。″聚集体形成″意指能导致寡聚体(其可以保持可溶的)或大的可见聚集体(其可以从溶液中沉淀)形成的蛋白分子之间的物理相互作用。″储存过程中″意指一旦制备出、并不立即施用给受试者的液体药物组合物或组合物。而是，在制备后，将其以液体形式、冷冻状态或干燥形式包装储存，用于以后重配成适于施用给受试者的液体形式或其它形式。″干燥形式″意指液体药物组合物或组合物，通过冷冻干燥(即，冻干；见，例如，Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38：48-59)，喷雾干燥(见Masters(1991)，Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific andTechnical，Essez，U.K.)，第491-676页；Broadhead等人(1992)Drug Devel.Ind.Pha rm.18：1169-1206；和Mumenthaler等人(1994)Pharm.Res.11：12-20)，或空气干燥(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25：459-470；和Roser(1991)Biopharm.4：47-53)进行干燥。在液体药物组合物储存过程中，蛋白的聚集体形成可以负面地影响蛋白的生物学活性，导致药物组合物的治疗效能的减少。另外，聚集体形成可能造成其它的问题，例如当施用输注***施用含有蛋白的药物组合物时，管道、膜或泵的堵塞。
本发明的药物组合物另外可以包含足以减少组合物储存过程中蛋白的聚集体形成的量的氨基酸碱。″氨基酸碱″意指氨基酸或氨基酸的组合，其中任何给定的氨基酸都以它的游离碱形式或它的盐形式存在。当使用氨基酸的组合时，所有的氨基酸都可以以它们的游离碱形式存在，都可以以它们的盐形式存在，或者一些以它们的游离碱形式存在，而另一些以它们的盐形式存在。在一个实施方案中，在本发明的组合物的制备中，使用的氨基酸是具有带电荷的侧链的那些，例如精氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸。特定氨基酸(甲硫氨酸，组氨酸，精氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，苏氨酸和其混合物)的任何立体异构体(即，L或D异构体，或其混合物)或这些立体异构体的组合或甘氨酸或有机碱(例如但不限于咪唑)可以存在于本发明的药物组合物中，只要特定氨基酸或有机碱以它的游离碱形式或它的盐形式存在。在一个实施方案中，使用了氨基酸的L-立体异构体。在一个实施方案中，使用了D-立体异构体。本发明的组合物也可以与这些氨基酸的类似物一起配制。″氨基酸类似物″意指天然产生的氨基酸的衍生物，其能实现所需的减少本发明的液体药物组合物储存过程中蛋白的聚集体形成的作用。合适的精氨酸类似物包括，例如，氨基胍，鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸，合适的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和buthionine，和合适的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如同其它的氨基酸一样，将氨基酸类似物以它们的游离碱形式或它们的盐形式整合入组合物中。在本发明的另一个实施方案中，以足以预防或延迟蛋白的聚集的浓度，使用氨基酸或氨基酸类似物。
在本发明的另一个实施方案中，当起治疗剂作用的蛋白是包含至少1个易于氧化的甲硫氨酸残基时，可以加入甲硫氨酸(或其它含硫的氨基酸或氨基酸类似物)，以抑制甲硫氨酸残基向甲硫氨酸亚砜的氧化。“抑制”意指甲硫氨酸氧化的物质种类随时间的最小积累。抑制甲硫氨酸氧化导致适当的分子形式的蛋白的更大保留。可以使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L或D异构体)或其任意组合。要加入的量应当是，足以抑制甲硫氨酸残基的氧化的量，使甲硫氨酸亚砜的量能被管理当局接受。典型地，这意味着，组合物含有不超过约10％至约30％甲硫氨酸亚砜。通常，这可以通过添加甲硫氨酸，从而使添加的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基的比例是约1∶1-约1000∶1，例如10∶1-约100∶1，而得到。
在本发明的另一个实施方案中，组合物另外还包含选自高分子量聚合物或低分子化合物的稳定剂。在本发明的另一个实施方案中，稳定剂选自聚乙二醇(例如PEG 3350)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮，羧基/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC，HPC-SL，HPC-L和HPMC)，环糊精，含硫的物质例如一硫代甘油、巯基乙酸和2-甲基硫代乙醇，和不同的盐(例如氯化钠)。这些具体稳定剂中的每一种构成本发明的可替代的实施方案。
药物组合物也可以包含附加的稳定剂，其进一步增强其中的治疗活性蛋白的稳定性。本发明特别感兴趣的稳定剂包括但不限于甲硫氨酸和EDTA，其能保护蛋白抗甲硫氨酸氧化；和非离子性表面活性剂，其能保护蛋白抗与冷冻-融化或机械剪切有关的聚集。
在本发明的另一个实施方案中，组合物另外还包含表面活性剂。在本发明的另一个实施方案中，表面活性剂选自：去污剂，乙氧基化的蓖麻油，聚乙二醇化的(polyglycolyzed)甘油酯，乙酰基化的甘油单酯，山梨聚糖脂肪酸酯，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆，例如
Figure C20048002959200871
F68，泊洛沙姆188和407，Triton X-100)，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化的和烷氧基化的衍生物(吐温，例如吐温-20，吐温-40，吐温-80和Brij-35)，甘油单酯或其乙氧基化的衍生物，甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物，醇，甘油，凝集素和磷脂(例如磷脂酰丝氨酸，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，二磷脂酰甘油和鞘磷脂)，磷脂的衍生物(例如二棕榈酰基磷脂酸)和溶血磷脂的衍生物(例如棕榈酰基溶血磷脂酰-L-丝氨酸和乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯)和溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)-衍生物，例如溶血磷脂酰胆碱的月桂酰基和肉豆蔻酰基衍生物，二棕榈酰基磷脂酰胆碱，和极性头基团的修饰，其是胆碱，乙醇胺，磷脂酸，丝氨酸，苏氨酸，甘油，肌醇，和带正电荷的DODAC，DOTMA，DCP，BISHOP，溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸，和甘油基磷脂(例如脑磷脂)，甘油基糖脂(例如吡喃型半乳糖苷)，鞘糖脂(例如神经酰胺，神经节苷脂)，十二烷基磷酸胆碱，鸡蛋溶血卵磷脂，梭链孢酸衍生物-(例如tauro-二氢梭链孢酸钠等)，长链脂肪酸和其盐C6-C12(例如油酸和辛酸)，酰基肉碱和衍生物，赖氨酸、精氨酸或组氨酸的Nα-酰基化的衍生物，或赖氨酸或精氨酸的侧链酰基化的衍生物，包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸的任意组合的二肽的Nα-酰基化的衍生物，包含中性氨基酸和2个带电荷的氨基酸的任意组合的三肽的Nα-酰基化的衍生物，DSS(多库酯钠，CAS登记号[577-11-7])，多库酯钙(CAS登记号[128-49-4])，多库酯钾(CAS登记号[7491-09-0])，SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)，辛酸钠，胆酸或其衍生物，胆汁酸和其盐和甘氨酸或牛磺酸缀合物，熊去氧胆酸，胆酸钠，脱氧胆酸钠，牛磺胆酸钠，甘氨胆酸钠，N-十六烷基-N，N-二甲基-3-ammonio-1-丙烷磺酸盐，阴离子的(烷基-芳基-磺酸盐)单价表面活性剂，两性离子的表面活性剂(例如N-烷基-N，N-二甲基ammonio-1-丙烷磺酸盐，3-cholamido-1-丙基二甲基ammonio-1-丙烷磺酸盐，阳离子的表面活性剂(季铵碱)(例如溴化鲸蜡基-三甲基铵，氯化鲸蜡基吡啶鎓)，非离子的表面活性剂(例如十二烷基β-D-吡喃型葡萄糖苷)，poloxamines(例如Tetronic’s)，它们是由向1，2-乙二胺依次添加环氧丙烷和环氧乙烷而衍生的四官能的嵌段共聚物，或者表面活性剂可以选自咪唑啉衍生物，或其混合物。这些具体表面活性剂中的每一种，构成本发明的可替代的实施方案。
表面活性剂在药物组合物中的应用，是技术人员众所周知的。为了方便可参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2000。
在本发明的药物组合物中，可以存在其它的成分。这样的附加成分可以包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油质载体，蛋白(例如，人血清白蛋白，明胶或蛋白)和两性离子(例如，氨基酸例如甜菜碱，牛磺酸，精氨酸，甘氨酸，赖氨酸和组氨酸)。这样的附加成分，当然不应当负面地影响本发明的药物组合物的总体稳定性。
可以将含有根据本发明的式[a]化合物的药物组合物在几个位点施用给需要这样的治疗的患者，例如在局部位点，例如，皮肤和粘膜位点，在能绕过吸收的位点，例如在动脉、静脉、心脏中施用，和在包含吸收的位点，例如在皮肤中、皮肤下、肌肉中或腹部中施用。
根据本发明的药物组合物的施用，可以通过几种施用途径，例如舌的，舌下，口腔的，嘴中，经口的，胃和肠内，鼻的，肺的(例如，通过细支气管和槽或其组合)，表皮的，皮肤的，透皮的，***的，直肠的，眼睛的(例如通过结膜)，输尿管的和肠胃外的，施用给需要这样的治疗的患者。
本发明的组合物可以以几种剂型施用，例如，作为溶液，悬浮液，乳状液，微乳剂，复合型乳剂，泡沫，药膏，糊剂，硬膏剂，软膏，片剂，包衣片剂，冲洗剂，胶囊(例如硬明胶胶囊和软明胶胶囊)，栓剂，直肠胶囊，滴剂，凝胶，喷雾剂，粉末，气雾剂，吸入剂，滴眼剂，眼用软膏，眼用冲洗剂，***栓剂，***环，***软膏，注射溶液，原位转化(例如原位凝胶化，原位定位(setting)，原位沉淀，原位结晶)溶液，输注溶液，和植入物。
还可以例如通过共价的、疏水的和静电的相互作用，将本发明的组合物复合入或附着至药物载体、药物递送***和高级的药物递送***，以进一步增强式[a]化合物的稳定性，提高生物利用度，提高溶解度，降低不利作用，实现本领域的技术人员众所周知的长期治疗，并提高患者顺从性，或其任意组合。载体、药物递送***和高级药物递送***的实例包括但不限于聚合物，例如纤维素和衍生物，多糖，例如葡聚糖和衍生物，淀粉和衍生物，聚乙烯醇，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物，聚乳酸和聚乙醇酸和其嵌段共聚物，聚乙二醇，载体蛋白，例如白蛋白，凝胶，例如热胶凝***，例如本领域的技术人员众所周知的嵌段共聚物***，胶束，脂质体，微球，纳米颗粒，液晶和其分散体，L2相和其分散体，这是脂-水***中的相行为领域的技术人员众所周知的，聚合的胶束，复合型乳剂，自乳化剂，自微乳化剂，环糊精和其衍生物，和树枝状聚合物(dendrimer)。
使用例如计量剂量的吸入器，干粉吸入器和喷雾器(它们都是本领域的技术人员众所周知的装置)可以将本发明的组合物用于对于肺部施用式[a]化合物的固体、半固体、粉末和溶液的组合物中。
本发明的组合物特别可用于受控的、持续的、延长的、延迟的和缓慢的释放药物递送***。更具体地，但不限于，组合物可以用于本领域的技术人员众所周知的肠胃外的受控释放和持续释放***(两种***都会导致施用次数的许多倍减少)的组合物中。更优选地，受控释放和持续释放***经皮下施用。不限制本发明的范围，有用的受控释放***和组合物的实例是水凝胶，油质凝胶，液晶，聚合的胶束，微球，纳米颗粒。
生产用于本发明的组合物的受控释放***的方法，包括但不限于结晶、冷凝，共结晶，沉淀，共沉淀，乳化，分散，高压均化，包胶，喷雾干燥，微胶囊化，凝聚，相分离，溶剂蒸发以产生微球，挤出，和超临界流体过程。一般参考见Handbook of PharmaceuticalControlled Release(Wise，D.L.，编，Marcel Dekker，New York，2000)和Drug and the Pharmaceutical Sciences vol.99：ProteinComposition and Delivery(MacNally，E.J.，编，Marcel Dekker，New York，2000)。
借助于注射器，任选地钢笔状注射器，可以通过皮下的、肌肉内的、腹膜内的或静脉内的注射进行肠胃外的施用。或者，借助于输注泵，可以进行肠胃外的施用。另一个选择是组合物，它可以是用于以鼻的或肺的喷雾形式施用式[a]化合物的溶液或悬浮液。作为另一个选择，本发明的含有式[a]化合物的药物组合物也可以适用于透皮的施用，例如通过无针头的注射或从贴剂(任选地离子导入贴剂(iontophoretic patch)，或者透粘膜的(例如口腔的)施用。
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实施例
为化学基团使用了下面的缩写：
Fmoc：
Figure C20048002959200911
Boc：
Figure C20048002959200912
Pmc：
Figure C20048002959200921
Trt：
tBu：
OtBu：
使用了下面的其它缩写：
DMSO：二甲亚砜
CHCA：4-羟基-α-氰基肉桂酸
HEPES
Figure C20048002959200931
EDTA：
Figure C20048002959200932
CPY：羧肽酶Y。
HPLC-方法：
方法02-B4-4：
使用装配了Waters 2487双段检测器的Alliance Waters 2695***，进行了RP-分析。使用Symmetry300 C18，5um，3.9mmx150mm柱(42℃)收集了在214nm和254nm的UV检测物。在用0.05％三氟乙酸缓冲的水中的5-95％乙腈的线性梯度，以1.0分钟/分钟的流速，经15分钟，洗脱了化合物。
方法03-B1-1：
使用装配了Waters 996二极管阵列探测器的Waters 2690***，进行了RP-分析。在218TP54 4.6mmx250mm 5μC-18二氧化硅柱(The Seperations Group，Hesperia)(其在42℃、1ml/分钟洗脱)上，在214，254，276，和301nm收集了UV检测物。使用用0.1％三氟乙酸缓冲的5％乙腈(在三氟乙酸的0.1％水溶液中)平衡柱。注射后，经50分钟，通过0.1％三氟乙酸缓冲的0％至90％乙腈(在三氟乙酸的0.1％水溶液中)的梯度洗脱样品。
在500-1800Da范围的Agilent 1100 Series上，或在500-2000Da范围的Perkin Elmer PE API 100上，得到了肽的质谱。典型地，发现的m/z信号与一系列的z＝1，2，3，4，5，或6中的任一个相对应。
在Bruker Daltonix autoflex上，得到了MALDI-TOF图谱。
转酰基化化合物，例如下式的化合物
Figure C20048002959200941
和缀合部分Y-E-Z，可以商购获得或者根据下面的一般方法的指导进行合成。
一般方法(A)：
可以从在α-氨基处被保护的合适的氨基酸甲基酯
Figure C20048002959200942
制备下述通式的化合物
Figure C20048002959200943
其中R’和R”独立地代表着C1-15亚烷基，C2-15亚烯基，C2-15亚炔基，C1-15杂亚烷基，C2-15杂亚烯基，C2-15杂亚炔基，其中可以***一个或多个同素环芳族化合物双基或杂环化合物双基，所述的合适的保护基团PG记载在文献中(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版.，1991 JohnWiley & Sons，Inc.New York)，
其制备方法为在有或没有合适的碱例如三乙胺或乙基二异丙基胺存在下，通过酰基化方法，例如使用合适的酸，其中X可受到或未受到如文献(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organicsynthesis，第2版，1991 John Wiley &Sons，Inc.New York)所述的合适的保护基团PG的保护，
Figure C20048002959200951
和偶联试剂，例如1-羟基苯并***、3，4-二氢-3-羟基苯并三嗪-4-酮或7-氮杂苯并***，与例如碳二亚胺例如二异丙基碳二亚胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物相组合，形成下述类型的酯
Figure C20048002959200952
通过在合适的溶剂或溶剂的混合物例如水或N，N-二甲基甲酰胺中，与例如氨反应，可以将该酯转化成相应的酰胺，
通过文献(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groupsin organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.NewYork)所述的方法，可以在一个或几个步骤中，进行所有保护基团的去除，
Figure C20048002959200962
如在一般方法(A)中所定义，
Figure C20048002959200963
一般可商购得到氨基酸甲基酯，或者可以通过众所周知的方法合成它们。
一般方法(B)：
可以从在α-氨基处被如文献(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley& Sons，Inc.New York)所述的合适的保护基团PG保护的合适的氨基酸甲基酯
Figure C20048002959200971
使用合适的醇，其中X被或未被如文献(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 JohnWiley & Sons，Inc.New York)所述的合适的保护基团保护，
Figure C20048002959200972
在如文献所述的能实现烷基化的条件下，例如Mitsunobu条件，例如三苯膦和偶氮二羧酸乙酯，通过芳族羟基的烷基化，形成下述类型的酯
从而制备出下述通式的化合物
其中R’和R”如上所定义。
通过在合适的溶剂或溶剂的混合物例如水或N，N-二甲基甲酰胺中，与例如氨反应，可以将该酯转化成相应的酰胺，
Figure C20048002959200981
通过文献(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groupsin organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.NewYork)所述的方法，可以在一个或几个步骤中，进行所有保护基团的去除，
Figure C20048002959200982
如一般方法(B)中定义的，
Figure C20048002959200983
一般方法(C)：
可以从在α-氨基处被如文献(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley& Sons，Inc.New York)所述的合适的保护基团PG保护的合适的氨基酸甲基酯
Figure C20048002959200984
使用合适的烷基化试剂
Figure C20048002959200991
其中LG’的阴离子是合适的离去基团例如卤化物或磺酸酯，且X可被或未被如文献(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groupsin organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.NewYork)所述的合适的保护基团保护，通过芳族羟基的烷基化，制备下述通式的化合物
Figure C20048002959200992
其中R’和R”如上所定义。
反应可以在碱性条件下进行，使用碱例如碳酸钾，二氮杂双环[5，4，0]十一碳-5-烯，或叔丁基四甲基胍，并在合适的温度，通常为-78℃至200℃下，
Figure C20048002959200993
通过在合适的溶剂或溶剂的混合物例如水或N，N-二甲基甲酰胺中，与例如氨反应，可以将该酯转化成相应的酰胺，
Figure C20048002959201001
通过如文献，例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protectivegroups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.New York中所述的方法，可以在一个或几个步骤中进行所有保护基团的去除，
Figure C20048002959201002
如一般方法(C)中定义的，
Figure C20048002959201003
一般方法(D)：
可以从在α-氨基处被如文献例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley& Sons，Inc.New York所述的合适的保护基团PG保护的合适的酸
Figure C20048002959201004
通过使用本领域技术人员已知的酰基化条件，例如偶联试剂例如1-羟基苯并***、3，4-二氢-3-羟基苯并三嗪-4-酮或7-氮杂苯并***，与例如碳二亚胺例如二异丙基碳二亚胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物相组合，在有或没有合适的碱(例如三乙胺或乙二异丙基胺)存在下，与其中X可被或未被合适的保护基团保护的合适的伯胺或仲胺反应，形成酰胺
Figure C20048002959201011
，从而制备下述通式的化合物
其中R’和R”如上所定义。
如文献，T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups inorganic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.New York中所述，可以在一个或几个步骤中进行所有保护基团的去除，
Figure C20048002959201013
如一般方法(D)所定义的，
Figure C20048002959201014
一般方法(E)：从半胱氨酸合成含有酮基的氨基酸酰胺
在合适的反应条件下，用含有羰基的烷基化试剂(R50CO(CH2)nLG”处理方便地N-保护的半胱氨酸衍生物(例如酯，N-(2，4-二甲氧基苄基)酰胺或N-二(环丙基)甲基酰胺)或方便地N-保护的半胱氨酸酰胺，其中LG”＝选自下述的用于亲核置换的离去基团：卤素、磺酸酯(-O-SO2-R51)、二烷基锍、苯基碘鎓或羟基，其中R51代表着C1-6烷基、部分地或完全地氟化的C1-6烷基或芳基，其任选地被下述基团取代：烷基、卤素、硝基、氰基或乙酰氨基，且R50代表着氢、烷基、芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选地被下述基团取代一次或多次：C1-6烷氧基、羟基、卤素、氰基、酰基、烷基或硝基，产生S-烷基化的半胱氨酸衍生物。通过将该酸衍生物转化成酰胺和α-氨基的去保护，将该衍生物转化成氨基酸酰胺。合适的N-保护基团是例如三苯甲基，邻苯二甲酰基，或烷氧基羰基，例如叔丁氧基羰基，
Figure C20048002959201021
其中n代表着1-10的整数。
一般方法(F)：从天冬氨酸或谷氨酸合成含有酮基的氨基酸酰胺
通过用甲醛处理N-烷氧基羰基衍生物而生成如下所示的环状酯，可以选择性地保护天冬氨酸或谷氨酸：
Figure C20048002959201022
通过激活羧酸(LvG代表着卤素，芳氧基，或杂芳氧基)和与碳亲核体R80-M1的反应，其中R80代表着烷基、芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选地被下述基团取代一次或几次：C1-6烷氧基、羟基、卤素、氰基、酰基、烷基或硝基，且其中M1代表着碱金属，Mg、Zn、Ti、Zr、Mn、Cu、Ce或Ca，任选地在合适的催化剂存在下，这些衍生物，其中R60代表着叔丁基、苄基、2-氯苄基、烯丙基，2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2，2，2-三氯乙基或二苯甲基，可以转化成受保护的、含酮的氨基酸衍生物。产物与氨的反应和去保护，会生成需要的氨基酸酰胺，
Figure C20048002959201031
同样地，N-烷氧基羰基焦谷氨酸酯，其中R70代表着叔丁基，苄基，2-氯苄基，烯丙基，2-(三甲基甲硅烷基)乙基，2，2，2-三氯乙基，或二苯甲基，和R80代表着低级烷基，与亲核碳试剂的反应，可以生成受保护的、含有酮基团的氨基酸衍生物。产物与氨的反应和去保护，会生成需要的氨基酸酰胺：
Figure C20048002959201032
同样地，可以在碳上选择性地酰基化如下所示的合适地N-保护的谷氨酸二酯，其中R90代表着低级烷基，以在水解和脱羧基后，生成含有酮基的氨基酸的受保护的衍生物，其可以通过标准方法转化成氨基酸酰胺，
Figure C20048002959201033
一般方法(G)
从合适的受保护的伯胺或仲胺
Figure C20048002959201034
其中PG可以是合适的保护基团，如文献，例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 JohnWiley & Sons，Inc.New York中所述，且其中LG’”的阴离子是离去基团，例如卤化物或磺酸酯，可以制备出下述通式的化合物
Figure C20048002959201041
其中R’”代表着C1-15亚烷基，C2-15亚烯基，C2-15亚炔基，C1-15杂亚烷基，C2-15杂亚烯基，C2-15杂亚炔基，其中可以***一个或多个同素环芳族化合物双基或杂环化合物双基。
该胺与合适的受保护的羟基胺反应，
Figure C20048002959201042
其中PG’是以下述方式选择的保护基团，即可以从胺去除PG，而不从羟基胺去除PG’。可以在文献中找到它的实例，例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991John Wiley & Sons，Inc.New York。
在碱性条件下，例如氢化钠，在合适的温度例如-78℃至200℃，使2种组分反应，
Figure C20048002959201043
利用文献所述的方法，可以选择性地去除胺的保护基团，
Figure C20048002959201044
在有或没有合适的碱例如三乙胺或乙基二异丙基胺存在下，用合适的酸和偶联试剂例如1-羟基苯并***、3，4-二氢-3-羟基苯并三嗪-4-酮或7-氮杂苯并***，与例如碳二亚胺例如二异丙基碳二亚胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物相组合，可以酰基化该胺，生成酰胺，
Figure C20048002959201051
最后，通过文献，例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protectivegroups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.New York中所述的方法，可以去除羟基胺的保护基团，
Figure C20048002959201052
一般方法(H)
下述通式的化合物
Figure C20048002959201053
可以通过加入水合肼，在合适的溶剂(例如乙醇)中，从合适的酯，其中RIV是C1-10烷基，而制备得到，
Figure C20048002959201054
一般方法(J)转酰化反应
在合适的温度，例如5-50℃或室温，将所讨论的肽(终浓度1-10mM)和所讨论的亲核试剂(终浓度10mM-2M)的溶液溶解或悬浮在含有低浓度的EDTA的水中。
可以加入有机溶剂，以提高反应物的溶解度。利用合适的缓冲剂例如磷酸盐缓冲剂或HEPES，可以将混合物缓冲至合适的pH-值，例如pH 1至pH 14，例如pH 3.5至pH 9，pH 6至pH 8.5，或者可以通过加入碱或酸来维持pH。将合适的酶例如羧肽酶Y加入肽和亲核试剂的所述混合物中。经过合适的时间后，例如5分钟至10天，可以通过改变温度或pH-值，通过加入有机溶剂，和通过渗析和凝胶过滤，终止反应。
Figure C20048002959201061
例如通过要缀合的肽的溶解度和要使用的酶的活性，可以确定pH的选择。肽的溶解度很大程度上由肽的pKa决定。一般地，当pH等于肽的pKa时，给定的肽的溶解度是在它的最小值。仔细考虑了上述因素而选择进行反应的pH，在技术人员的能力范围之内。
一般方法(K)肟形成
通过将所讨论的转酰化的肽，其中RV可以是取代的或未取代的芳族环、取代的或未取代的杂芳族环、氢或C1-10烷基，溶解到水中，可以形成肟部分。可以加入有机溶剂，以提高溶解度。将溶液缓冲至合适的pH-值，例如pH 0至pH 14，pH 3至pH 6，或pH 5，并保持在合适的温度例如0-60℃。加入所讨论的羟基胺，根据下面的反应流程，形成肟部分。
Figure C20048002959201062
例如通过要缀合的肽的溶解度，可以确定pH的选择。肽的溶解度很大程度上由肽的pKa决定。一般地，当pH等于肽的pKa时，给定的肽的溶解度是在它的最小值。仔细考虑了上述因素而选择进行反应的pH，在技术人员的能力范围之内。
一般方法(L)腙形成
腙形成(I)
通过将所讨论的转酰化的肽，其中RVI可以是取代的或未取代的芳族环、取代的或未取代的杂芳族环、氢或C1-10烷基，溶解在水中，可以形成腙部分。将溶液缓冲至合适的pH-值，例如pH 2至pH 14或pH0至pH 4，并保持在合适的温度，例如0-60℃。加入所讨论的酰肼，从而形成腙，
腙形成(II)
通过将所讨论的转酰化的肽，其中RVII可以是取代的或未取代的芳族环、取代的或未取代的杂芳族环、氢或C1-10烷基，溶解在水中，可以形成腙。将溶液缓冲至合适的pH-值，例如pH 2至pH 14或pH 0至pH 4，并保持在合适的温度，例如0-60℃。加入所讨论的肼，从而形成腙，
Figure C20048002959201072
一般方法(M)异噁唑形成
通过腈-氧化物和炔烃之间的反应，可以形成异噁唑。通过向过量的合适的肟中加入合适的氧化剂(例如漂白剂)，可以形成腈-氧化物。可以将过量的新形成的腈-氧化物的溶液加入所讨论的肽中。
Figure C20048002959201081
一般方法(N)***形成
当在合适的溶剂例如水或水和有机溶剂(例如乙腈)的混合物中有Cu(I)-离子存在的情况下，通过附着在基团Z上的叠氮化物和附着在所讨论的肽上的炔烃之间的反应，可以形成***。可以以2种可能的区域异构体(regioisomer)形成***。
一般方法(O)***形成
当在合适的溶剂例如水或水和有机溶剂(例如乙腈)的混合物中有Cu(I)-离子存在的情况下，通过附着在基团Z上的炔烃和附着在所讨论的肽上的叠氮化物之间的反应，可以形成***。可以以2种可能的区域异构体形成***。
Figure C20048002959201101
一般方法(P)酰胺形成
通过共价地附着到肽上的叠氮化物和含有三苯膦-部分的酯之间的反应，可以区域选择性地形成酰胺，如例如Tetrahedron Lett.2003，44，4515-4518所述。
Figure C20048002959201102
一般方法(Q)酰胺形成
通过共价地附着到肽上的叠氮化物和含有二苯膦-部分的硫代酸酯之间的反应，可以区域选择性地形成酰胺，如例如J.Org.Chem.2002，67，4993-4996所述。
一般方法(R)芳基炔烃形成
在有水可溶性的钯催化剂存在下，通过共价地附着到肽上的炔烃和卤代芳基化合物之间的反应，可以形成芳基炔烃，如例如Bioconjugate Chemistry，2004，15，231-234所述。卤代芳基化合物可以与对应的芳基三氟磺酸酯互换。
Figure C20048002959201112
一般方法(S)芳基炔烃形成
在有水可溶性的钯催化剂存在下，通过共价地附着到肽上的卤代芳基-部分和炔烃之间的反应，可以形成芳基炔烃，如例如Bioconjugate Chemistry，2004，15，231-234所述。也可以使用缀合到肽上的三氟磺酰氧基芳基-部分替代卤代芳基-部分。
一般方法(T)
从在α-氨基处被酸-不稳定的保护基团PG1(例如BOC或三苯甲基)保护、且在ω-氨基处被碱-不稳定的保护基团PG2(例如Fmoc)保护的合适的氨基酸，可以制备出下述通式的化合物
Figure C20048002959201122
其中R’和R”定义如上。使用本领域技术人员已知的标准偶联条件，例如使用碳二亚胺例如二异丙基碳二亚胺，在有或没有试剂例如1-羟基苯并***、1-羟基-7-氮杂苯并***或3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪存在下，和在有或没有碱例如三乙胺或乙基二异丙基胺存在下，可以将酸附着到Rink-酰胺树脂上。于在文献例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.New York中对于特定保护基团所述的碱性条件下，可以去除ω-胺处的保护基团PG2。
Figure C20048002959201131
使用标准偶联条件，例如使用碳二亚胺例如二异丙基碳二亚胺，在有或没有试剂例如1-羟基苯并***，1-羟基-7-氮杂苯并***或3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪存在下，和在有或没有碱例如三乙胺或乙基二异丙基胺存在下，可以将酸连接到ω-氨基部分上。在酸性条件下，例如三氟乙酸或三氟乙酸在二氯甲烷中的20-70％溶液，可以从固体支持物上裂解下中间体，生成需要的aminamide。
Figure C20048002959201132
一般方法(U)
下述通式的化合物
Figure C20048002959201141
其中R’和R”如上所定义，可以从被酸不稳定的保护基团PG1(例如Boc或三苯甲基)保护的合适的氨基酸制备，其在有偶联剂例如碳二亚胺例如二异丙基碳二亚胺存在下，在有或没有试剂例如1-羟基苯并***、1-羟基-7-氮杂苯并***或3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪存在下，与过量的氨反应，
Figure C20048002959201142
用合适的卤化物或磺酸酯，其中Ra是任何合适的取代的烷基或芳基，在有合适的碱例如碳酸钾或四甲基胍存在下，可以烷基化酚羟基。在酸性条件下，如在文献例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley& Sons，Inc.New York中对于选择的特定保护基团所述，可以从α氨基酸去除保护基团PG1，生成需要的氨基酰胺。
Figure C20048002959201151
一般方法(V)PEG-试剂
从合适的酸，其可以在合适的溶剂例如N，N-二甲基甲酰胺存在下，通过与合适的试剂或试剂组合例如2-琥珀酰亚胺基-1，1，3，3，-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)的反应而被活化，可以制备出下述通式的试剂
Figure C20048002959201152
其中
Figure C20048002959201153
是E，如上所定义。
活化的酸(例如得到的所述酸的2，5-二氧代pyrrodin-1基酯)可以与商购可得的用伯胺官能化的PEG-试剂反应，任选地在合适的碱例如乙基二异丙基胺或三乙胺存在下。
Figure C20048002959201161
实施例1
(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)己酸酰胺
Figure C20048002959201162
Step A：
(2S)-2-叔-(丁氧基羰基氨基)-6-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)己酸甲酯
Figure C20048002959201163
将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物(3.23g，16.8mmol)加入苯甲酰基丙酸(3.00g，16.8mmol)和3，4-二氢-3-羟基苯并三嗪-4-酮(2.75g，16.8mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)和二氯甲烷(20ml)的混合物中的溶液中。在室温搅拌反应混合物20分钟。相继加入BOC-Lys-OMe的盐酸盐(5.00g，16.8mmol)和乙基二异丙基胺(8.65ml，50.5mmol)。将反应混合物搅拌16小时。用乙酸乙酯(300ml)稀释，并用半浓缩的碳酸氢钠溶液洗涤(2x300ml)。经硫酸镁干燥有机层。真空去除溶剂。通过使用乙酸乙酯/庚烷2∶1作为洗脱剂的二氧化硅(90g)上的快速色谱法纯化粗产物，生成2.41g(2S)-2-叔-(丁氧基羰基氨基)-6-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)己酸甲酯。
1H-NMR(CDCl3)：δ1.30-1.90(m，6H)；1.44(s，9H)；2.61(t，2H)；3.20(q，2H)；3.37(t，2H)；4.25(m，1H)；5.20(br，1H)；5.90(br，1H)；7.46(m，2H)；7.50(m，1H)；8.00(d，2H)。
步骤B：
[(1S)-1-氨甲酰基-5-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)戊基]氨基甲酸叔丁酯
将氨在水中的25％溶液(25ml)加入(2S)-2-叔-(丁氧基羰基氨基)-6-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)己酸甲酯(0.70g，1.67mmol)中。在室温搅拌反应混合物2天。真空去除溶剂，生成0.56g[(1S)-1-氨甲酰基-5-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)戊基]氨基甲酸叔丁酯。
1H-NMR(CDCl3)：δ0.90(m，6H)；2.75(t，2H)；3.20-3.50(m，4H)；4.15(m，1H)；7.35-7.60(m，3H)；8.00(d，2H)。
步骤C：
将三氟乙酸(25ml)加入[(1S)-1-氨甲酰基-5-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)戊基]氨基甲酸叔丁酯(0.56g，1.38mmol)在二氯甲烷(25ml)中的溶液中。在室温搅拌反应混合物1小时。去除溶剂。通过在RP-18柱上的HPLC(使用20-45％乙腈在水中的梯度，其含有0.1％三氟乙酸作为缓冲剂)，纯化粗产物，生成92mg纯度为约85％的标题化合物，将其用于进一步的实验。
1H-NMR(CDCl3)：δ1.40(m，4H)；1.70(m，2H)；2.46(t，2H)；3.00(q，2H)；3.23(t，2H)；3.70(m，1H)；7.53(m，3H)；7.65(t，1H)；7.83(br，1H)；7.90(t，1H)；8.00(d，2H)；8.05(br，3H)。MS：m/z＝306[M+1]+
4-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺
Figure C20048002959201181
步骤A：
使用4-乙酰基苯甲酸代替苯甲酰基丙酸，如关于(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)己酸酰胺所述，制备了1.65g标题化合物。
1H-NMR(CDCl3)：1.40(m，2H)；1.60(m，2H)；1.80(m，2H)；2.62(s，3H)；3.30(q，2H)；3.75(q，1H)；7.55(br，1H)；7.85(br，1H)；7.97(d，2H)；8.05(d，2H)；8.10(br，3H)；8.65(t，1H)。
S-苯甲酰甲基半胱氨酸酰胺氢氯化物
步骤A：S-苯甲酰甲基-N-Boc-半胱氨酸甲酯
Figure C20048002959201191
在0℃，向N-Boc半胱氨酸甲酯(2.05ml，9.93mmol)在MeCN(20ml)中的溶液中，加入DIPEA(3.55ml，20.1mmol)、NaI(0.48g，3.20mmol)，然后加入苯甲酰甲基溴(2.41g，12.1mmol)在MeCN(4ml)中的溶液。在室温搅拌混合物19小时。加入水(100ml)和1N含水HCl(30ml)，然后萃取产物(3xAcOEt)。用盐水洗涤合并的萃取物，干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩，生成4.37g油。在-20℃，从AcOEt(约10ml)和庚烷(约40ml)中结晶过夜，生成3.49g(99％)标题甲基酯，呈棕色固体。
1H NMR(DMSO-d6)：δ1.37(s，9H)，2.74(dd，J＝9Hz，13Hz，1H)，2.89(dd，J＝5.5Hz，13Hz，1H)，3.62(s，3H)，4.03(d，J＝15Hz，1H)，4.14(d，J＝15Hz，1H)，4.22(m，1H)，7.33(brd，J＝8Hz，1H)，7.52(m，2H)，7.64(m，1H)，7.99(m，2H)。
步骤B：S-苯甲酰甲基-N-Boc半胱氨酸酰胺
Figure C20048002959201192
向S-苯甲酰甲基-N-Boc-半胱氨酸甲酯(1.77g，5.01mmol)在MeCN(30ml)中的溶液中，加入氨水(50ml，25％；12.5g NH3)。在室温搅拌71小时后，通过TLC不能再检测到起始材料。在减压下浓缩混合物，将残余物重新悬浮到甲苯和乙醇中，再次浓缩。用PhMe+EtOH反萃取。从冷的甲醇中结晶，生成0.86g(50％)标题酰胺。
1H NMR(DMSO-d6)：δ1.37(s，9H)，2.66(dd，J＝9Hz，13Hz，1H)，2.83(dd，J＝5.5Hz，13Hz，1H)，4.07(d，J＝15Hz，1H)，4.10(m，1H)，4.12(d，J＝15Hz，1H)，6.88(br d，J＝8Hz，7.12(br s，1H)，7.35(br s，1H)，7.52(t，J＝8Hz，2H)，7.64(m，1H)，7.96(m，2H)。
步骤C：S-苯甲酰甲基半胱氨酸酰胺氢氯化物
Figure C20048002959201201
将S-苯甲酰甲基-N-Boc半胱氨酸酰胺(0.70g，2.07mmol)与DCM(10ml)和TFA(20ml)混合。30分钟后，浓缩混合物，将残余物与甲苯和MeCN混合，并再次浓缩。将残余物与1N HCl(1.5ml)、乙醇、MeCN和甲苯混合，并再次浓缩。将残余物悬浮在沸腾的EtOH(约5ml)中。过滤并干燥，生成0.18g(32％)标题氢氯化物，呈浅棕色固体。LCMS：只有一种产物(HPLC，210nm)，MH+＝221(产物-水)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ2.93(dd，J＝7Hz，13Hz，1H)，3.06(dd，J＝6Hz，13Hz，1H)，3.97(m，1H)，4.33(br s，2H)，7.58(m，2H)，7.68(m，1H)，8.02(m，2H)，8.32(br s，3H)。
实施例4
4-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺
Figure C20048002959201211
用二氯甲烷(50ml)溶涨Rink-酰胺-树脂(装载：0.43mmol/g，6.66g，2.86mmol)。去除溶剂。加入哌啶在N-甲基吡咯烷酮中的20％溶液(50ml)。将反应器摇动20分钟。去除液体。用N-甲基吡咯烷酮(3x50ml)和二氯甲烷(5x50ml)洗涤树脂。相继加入BOC-Lys(FMOC)-OH(5.37g，11.5mmol)在N-甲基吡咯烷酮(50ml)中的溶液和1-羟基苯并***(1.75g，11.5mmol)在N-甲基吡咯烷酮(20ml)中的溶液。加入二异丙基碳二亚胺(1.79ml，11.5mmol)和乙基二异丙基胺(1.96ml，11.5mmol)。将反应器在室温摇动16小时。去除液体。用N-甲基吡咯烷酮(3x50ml)和二氯甲烷(3x50ml)洗涤树脂。相继加入4-乙酰基苯甲酸(2.82g，11.5mmol)在N-甲基吡咯烷酮(50ml)中的溶液和1-羟基苯并***(1.75g，11.5mmol)在N-甲基吡咯烷酮(20ml)中的溶液。加入二异丙基碳二亚胺(1.79ml，11.5mmol)和乙基二异丙基胺(1.96ml，11.5mmol)。将反应器在室温摇动16小时。用N-甲基吡咯烷酮(3x50ml)和二氯甲烷(3x50ml)洗涤树脂。将50％三氟乙酸和10％三异丙基硅烷在二氯甲烷(50ml)中的溶液加入树脂。将反应容器在室温摇动1小时。收集液体。真空去除溶剂。将残余物重新溶解到甲苯(50ml)中。真空去除溶剂。
合并6轮上述过程的粗产物。通过在C18-反相柱上的HPLC-色谱法(使用3-23％乙腈在水中的梯度，在0.1％三氟乙酸缓冲液中)纯化它们，得到1.07g 4-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺的三氟乙酸盐。
实施例5
1-[4-(2-(氨基氧基)乙基)哌啶-1-基]十六烷-1-酮
Figure C20048002959201221
步骤1：
4-[2-(甲苯-4-磺酰氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯
Figure C20048002959201222
将甲苯磺酰氯(4.16g，21.8mmol)加入商购可得的4-(2-羟乙基)哌啶-1-碳环酯叔丁基酯(例如Aldrich 54，724-7，5.0g，21.8mmol)和三乙胺(4.25ml，30.5mmol)在二氯甲烷(100ml)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌16小时。用乙酸乙酯(300ml)稀释，并用硫酸氢钠的10％水溶液(200ml)洗涤。用乙酸乙酯(150ml)萃取水相。用碳酸氢钠的饱和水溶液(250ml)洗涤合并的有机层，并经硫酸镁干燥。真空去除溶剂。通过在二氧化硅(80g)上的快速色谱法(使用乙酸乙酯/庚烷，首先1∶2然后1∶1，作为洗脱剂)，纯化粗产物，生成6.04g 4-[2-(甲苯-4-磺酰氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯。
1H-NMR(CDCl3)：δ1.05(m，2H)；1.45(s，9H)；1.55(m，5H)；2.50(s，3H)；2.65(t，2H)；4.05(m，4H)；7.35(d，2H)；7.80(d，2H)。
步骤2：
4-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯
Figure C20048002959201231
在0℃，将氢化钠(0.69g，17.2mmol)在矿物油中的60％悬浮液加入N-羟基邻苯二甲酰亚胺(2.80g，17.2mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)中的溶液中。在0℃，搅拌反应混合物45分钟。相继加入4-[2-(甲苯-4-磺酰氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(5.99g，15.6mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(15ml)中的溶液和四丁基铵碘化物(0.17g，0.47mmol)。将反应混合物加热至60℃2天，并冷却至室温。小心地加入水(5ml)。用乙酸乙酯(250ml)稀释反应混合物，并用硫酸氢钠的10％水溶液(200ml)洗涤。用乙酸乙酯(200ml)萃取水相。用碳酸氢钠的饱和水溶液(150ml)洗涤合并的有机层，并经硫酸镁干燥。真空去除溶剂。通过在二氧化硅(80g)上的快速色谱法(使用乙酸乙酯/庚烷1∶1作为洗脱剂)，纯化粗产物，生成4.36g 4-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯。
1H-NMR(CDCl3)：δ1.15(m，2H)；1.50(s，9H)；1.75(m，5H)；2.75(m，2H)；4.10(m，2H)；4.30(t，2H)；7.80(m，4H)。
步骤3：
2-(2-(哌啶-4-基)乙氧基)异吲哚-1，3-二酮
Figure C20048002959201241
将三氟乙酸(20ml)加入4-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(4.26g，11.4mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中。在室温搅拌反应混合物50分钟。真空去除溶剂。将残余物溶于二氯甲烷(50ml)，真空去除溶剂。将后一步骤重复2次，生成6.46g粗制的2-(2-(哌啶-4-基)乙氧基)异吲哚-1，3-二酮的三氟乙酸盐。
MS：m/z＝275[M+1+]
1H-NMR(DMSO-d6)：δ1.30(m，2H)；1.65(m，2H)；1.90(m，3H)；2.90(q，2H)；3.30(d，2H)；4.20(t，2H)；7.90(s，4H)；8.30(br，1H)；8.65(br，1H)。
步骤4：
2-[2-(1-(十六酰基)哌啶-4-基)乙氧基]异吲哚-1，3-二酮
Figure C20048002959201242
在0℃，将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物(1.04g，5.44mmol)加入棕榈酸(1.40g，5.44mmol)和3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并***(0.89g，5.44mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)和二氯甲烷(20ml)中的溶液中。在0℃，搅拌反应混合物20分钟。相继加入2-(2-(哌啶-4-基)乙氧基)异吲哚-1，3-二酮的三氟乙酸盐(2.11g，5.44mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中的溶液和乙基二异丙基胺(6.19ml，38.1mmol)。将反应混合物搅拌16小时，同时升温至室温。用乙酸乙酯(150ml)稀释，并用硫酸氢钠的10％水溶液(150ml)洗涤。用乙酸乙酯萃取水相。用水(50ml)和碳酸氢钠的饱和水溶液(50ml)的混合物洗涤合并的有机层，并经硫酸镁干燥。通过在二氧化硅(40g)上的快速色谱法(使用乙酸乙酯/庚烷1∶1作为洗脱剂)，纯化粗产物，生成1.52g 2-[2-(1-(十六酰基)哌啶-4-基)乙氧基]异吲哚-1，3-二酮。
MS：m/z＝513[M+1+]
1H-NMR(DMSO-d6)：δ0.90(t，3H)；1.10(m，2H)；1.25(m，26H)；1.45(m，2H)；1.65(m，1H)；1.80(m，2H)；2.30(t，2H)；2.95(t，1H)；3.85(m，3H)；4.20(t，2H)；4.40(d，1H)；7.90(s，4H)。
步骤5：
将水合肼(0.14ml，2.96mmol)加入2-[2-(1-(十六酰基)哌啶-4-基)乙氧基]异吲哚-1，3-二酮(1.52g，2.96mmol)在乙醇(30ml)中的溶液中。将反应混合物加热回流75分钟，并冷却至室温。通过过滤去除形成的沉淀。真空去除滤液的溶剂。通过在二氧化硅(30g)上的快速色谱法(使用二氯甲烷/甲醇/25％氨水(100∶10∶1)的混合物作为洗脱剂)，纯化粗产物，生成800mg 1-[4-(2-(氨基氧基)乙基)哌啶-1-基]十六烷-1-酮。
MS：m/z＝383[M+1+]
1H-NMR(CDCl3)：δ0.80(t，3H)；1.25(m，2H)；1.60(m，26H)；1.70(m，4H)；1.65(m，3H)；2.708t，2H)；2.60(t，1H)；3.05(t，1H)；3.80(m，3H)；4.60(d，1H)。
实施例6
(S)-2-氨基戊-4-炔酸酰胺
步骤1：
((S)-1-氨甲酰基丁-3-炔基)氨基甲酸叔丁酯
在0℃，将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物(563mg，2.94mmol)加入商购可得的(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基戊-4-炔酸(例如Acros，626mg，2.94mmol)和1-羟基苯并***(397mg，2.94mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)中的溶液中。在0℃，将反应混合物搅拌20分钟。加入25％的氨水(2.38ml)。将反应混合物搅拌16小时，同时升温至室温。用乙酸乙酯(150ml)稀释，并用硫酸氢钠的10％水溶液(150ml)洗涤。用乙酸乙酯萃取水相(2x100ml)。用盐水(250ml)洗涤合并的有机层，并经硫酸镁干燥。真空去除溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯(100ml)，并用盐水(75ml)和水(75ml)的混合物洗涤。用乙酸乙酯萃取水相(2x50ml)。合并的有机层经硫酸镁干燥。真空去除溶剂。通过在二氧化硅(50g)上的快速色谱法(使用二氯甲烷/甲醇(10∶1)作为洗脱剂)，纯化粗产物，生成138mg((S)-1-氨甲酰基丁-3-炔基)氨基甲酸叔丁酯。
1H-NMR(CDCl3)：δ1.40(s，9H)；2.15(t，1H)；2.70(m，1H)；2.90(m，1H)；4.40(m，1H)；5.70(d，1H)；6.50(br，1H)；6.90(br，1H)。
步骤2：
将三氟乙酸(3ml)加入((S)-1-氨甲酰基丁-3-炔基)氨基甲酸叔丁酯(138mg，0.65mmol)在二氯甲烷(3ml)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌1.25小时。真空去除溶剂。将残余物溶于二氯甲烷(40ml)，并真空去除溶剂。将后一步骤重复2次，生成粗制的(S)-2-氨基戊-4-炔酸酰胺的三氟乙酸盐，其用于下面的实验。
MS：m/z＝113[M+1+]
1H-NMR(DMSO-d6)：δ2.70(m，2H)；3.15(t，1H)；3.85(m，1H)；7.65(s，1H)；7.85(s，1H)；8.20(br，3H)。
实施例7
(S)-2-(([Leu37]GLP-1-(7-37)基)氨基)戊-4-炔酸酰胺
Figure C20048002959201271
制备了[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸(0.348mg，100nmol)、(S)-2-氨基戊-4-炔酸酰胺(2.26mg，10000nmol)的三氟乙酸盐和羟丙基-β-环糊精(4mg)在250mM HEPES和5mM EDTA的缓冲液(0.085ml)(该缓冲液在使用前已经调节至pH 7.5)、25％氨水和1N盐酸(共0.011ml)中的溶液，其具有pH 7.96。加入CPY(1.0u)在水(0.005ml)中的溶液。将反应混合物置于室温。40分钟后，除了与[Leu37]GLP-1-(7-37)基丙氨酸、[Leu37]GLP-1-(7-37)肽和(S)-2-{(S)-2-(([Leu37]GLP-1-(7-37)基)氨基)戊-4-炔酰基氨基}戊-4-炔酰基酰胺相对应的质量之外，可以在MALDI-TOF中发现与(S)-2-(([Leu37]GLP-1-(7-37)基)氨基)戊-4-炔酸酰胺相对应的质量。
MALDI-TOF(CHCA)：m/z＝3508，3485，3604，3413。
实施例8
(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺
Figure C20048002959201281
步骤1：
[(S)-1-氨甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯
Figure C20048002959201282
将二碳酸二叔丁酯(15g，69mmol)加入酪氨酸酰胺的盐酸盐(15g，69mmol)在二噁烷(140ml)中的溶液和1N氢氧化钠水溶液(140ml)中。将反应混合物在室温搅拌16小时。用10％硫酸氢钠水溶液(200ml)稀释，并用乙酸乙酯(3x200ml)萃取。用碳酸氢钠的饱和水溶液(100ml)洗涤合并的有机层，并经硫酸镁干燥。真空去除溶剂。通过在二氧化硅(400g)上的快速色谱法(使用二氯甲烷/甲醇(10∶1)的混合物)，纯化粗产物，生成8.17g[(S)-1-氨甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯。
MS：m/z＝303(M+Na)+。
1H-NMR(DMSO-d6)：δ1.31(s 9H)；2.80(dd，1H)；2.83(dd，1H)；4.00(m，1H)；6.62(d，2H)；6.70(d，1H)；6.97(br，1H)；7.03(d，2H)；7.31(br，1H)；9.14(s，1H)。
步骤2：
[(S)-1-氨甲酰基-2-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)乙基]氨基甲酸叔丁酯
Figure C20048002959201291
将[(S)-1-氨甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯(1.0g，3.57mmol)、四丁基铵碘化物(65mg，0.17mmol)、碳酸钾(3.94g，29mmol)、炔丙基溴(0.38ml，4.28mmol)和N，N-二甲基甲酰胺(15ml)的混合物加热至60℃16小时。冷却至室温，用水(30ml)稀释，并用10％硫酸氢钠水溶液酸化。用乙酸乙酯(2x100ml)萃取混合物。用碳酸氢钠的饱和水溶液(200ml)洗涤合并的有机层，并经硫酸镁干燥。真空去除溶剂。通过在二氧化硅(100g)上的快速色谱法(使用二氯甲烷/甲醇(10∶1)的混合物作为洗脱剂)，纯化粗产物，生成998mg[(S)-1-氨甲酰基-2-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)乙基]氨基甲酸叔丁酯。
MS：m/z＝341(M+Na)+。
1H-NMR(DMSO-d6)δ1.31(s，9H)；2.50(s，1H)；2.67(dd，1H)；2.91(dd，1H)；4.03(m，1H)；4.74(s，2H)；6.77(d，1H)；6.86(d，2H)；6.99(s，1H)，7.17(d，2H)；7.35(s，1H)。
将三氟乙酸(10ml)加入[(S)-1-氨甲酰基-2-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(998mg，3.13mmol)在二氯甲烷(10ml)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌1.5小时。去除溶剂。将残余物溶于二氯甲烷(30ml)。去除溶剂。将后一步骤重复2次，生成1.53g(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺的三氟乙酸盐。
HPLC(方法02-B4-4)：Rf＝5.62分钟。
MS：m/z＝219(M+1)+。
1H-NMR(CDCl3)δ2.51(s，1H)；3.02(m，2H)；3.90(m，1H)；4.78(s，2H)；6.95(d，2H)；7.20(d，2H)；7.56(s，1H)；7.87(s，1H)；8.10(br，3H)。
实施例9
(S)-2-([Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)3-(4-(丙-2-炔基)苯基)丙酰胺
步骤1：
[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸
通过标准的Fmoc-策略，从商购可得的Fmoc-Ala-Wang树脂开始，在Applied Biosystems 433A肽合成仪上，制备了[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸。使用了下面的氨基酸衍生物：
Figure C20048002959201311
将三氟乙酸(10ml)、水(0.265ml)和三异丙基硅烷(0.265ml)的混合物加入树脂。摇动1.5小时。收集液体。用三氟乙酸(1ml)洗涤树脂。合并液体。在氮气流下浓缩溶液。加入醚(40ml)。离心分离沉淀。使用在0.1％三氟乙酸缓冲液中的37-65％乙腈在水中的梯度作为洗脱剂，在反相C18-柱上通过HPLC，纯化粗产物。
步骤2：
(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺与[Leu37]GLP-1(7-37)丙氨酸的CPY-反应
使用1N氢氧化钠水溶液，将[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸(1mM终浓度)和(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺的三氟乙酸盐(100mM终浓度)和羟丙基-β-环糊精(4mg)在由250mMHEPES和5mM EDTA组成的缓冲液中的混合物(0.100ml终体积)调节至pH 8。加入羧肽酶Y的溶液(CPY，200U/ml，0.005ml，1U)，得到需要的终体积和浓度。将混合物在室温放置3小时。
MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)：m/z＝3612((S)-2-([Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)3-(4-(丙-2-炔基)苯基)丙酰胺)，连同3412([Leu37]GLP-1肽)。
MS(电雾化)：1205(M)3+。
实施例10
(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺
Figure C20048002959201321
步骤1：
[Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基(leucinyl)丙氨酸
通过标准的Fmoc-策略，从商购可得的Fmoc-Ala-Wang树脂开始，在Applied Biosystems 433A肽合成仪上，制备了[Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基丙氨酸。使用了下面的氨基酸衍生物：
Figure C20048002959201331
将三氟乙酸(10ml)、水(0.265ml)和三异丙基硅烷(0.265ml)的混合物加入树脂。摇动1.5小时。收集液体。用三氟乙酸(1ml)洗涤树脂。合并液体。在氮气流下浓缩溶液。加入醚(40ml)。离心分离沉淀。使用在0.1％三氟乙酸缓冲液中的37-65％乙腈在水中的梯度作为洗脱剂，在反相C18-柱上通过HPLC，纯化粗产物。
HPLC：8.81分钟(方法02-B4-4)。
MALDI-TOF：m/z＝3946
MS：m/z＝1317.988，790。
步骤2：
(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺与(([Glu3，Leu10]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸的CPY-反应
使用1N氢氧化钠水溶液，将(([Glu3，Leu10]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸(1mM终浓度)和(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺的三氟乙酸盐(6mg，150mM终浓度)和羟丙基-β-环糊精(61mg)在由250mM HEPES和5mM EDTA组成的缓冲液中的混合物(1.5ml终体积)调节至pH 8。加入羧肽酶Y的溶液(CPY，800U/ml，0.019ml，15U)，得到需要的终体积和浓度。将混合物在室温放置3.5小时。用水将混合物稀释至10ml的体积。使用C18-柱和39-67％乙腈在用0.1％三氟乙酸酸化的水中的梯度，通过HPLC-纯化，分离产物，生成(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺。在214nm使用1500000的吸收系数，检测到2.5mg的产量。
MALDI-TOF：4073。
HPLC(***02-b4-4)：9.14分钟。
MS(电雾化)：m/z＝815，1120，1359。
实施例11
(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)丙酰胺
Figure C20048002959201341
步骤1：
3-氯苯甲醛肟
Figure C20048002959201351
将羟基胺氢氯化物(3.68g，53mmol)在水(5ml)中的溶液加入3-氯苯甲醛(5.00ml，44mmol)在乙醇(20ml)中的溶液中。加入氢氧化钠(2.64g，66mmol)在水(5ml)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌48小时。将反应混合物置于水/冰(150ml)上。过滤分离出形成的沉淀，并溶于二氯甲烷(200ml)。该溶液经硫酸镁干燥。去除溶剂，生成3.88g 3-氯苯甲醛肟，其不经进一步纯化地使用。
步骤2：
将10％次氯酸钠溶液(0.008ml)加入3-氯苯甲醛肟(4.2mg，0.027mmol)在水(0.5ml)中的悬浮液中。将溶液在室温放置10分钟。加入(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺(1.1mg，0.00027mmol)和三乙胺(0.003ml)在水(0.5ml)中的溶液。将反应混合物在室温放置16小时。在反相C18-HPLC上，使用在0.1％TFA缓冲液中的43-75％乙腈在水中的梯度，纯化粗产物。
HPLC(方法02-b4-4)：9.56分钟。
MS(EI)：m/z＝1410(M3+)，1054(M4+)和844(M5+)
实施例12
(S)-2-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺
步骤1：
[(S)-1-氨甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯
Figure C20048002959201362
将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物(6.82g，35.5mmol)加入BOC-保护的酪氨酸(10.0g，35，5mmol)和1-羟基苯并***(5.44g，35.5mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(10ml)和二氯甲烷(10ml)的混合物中的溶液中。将反应混合物搅拌20分钟。加入25％氨水。将反应混合物在室温搅拌16小时。用乙酸乙酯(100ml)稀释，并用水洗涤(3x100ml)，随后用碳酸氢钠的饱和水溶液(100ml)洗涤。经硫酸镁干燥。真空去除溶剂，生成4.24g[(S)-1-氨甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯。
1H-NMR(DMSO-d6)：δ1.31(s 9H)；2.80(dd，1H)；2.83(dd，1H)；4.00(m，1H)；6.62(d，2H)；6.70(d，1H)；6.97(br，1H)；7.03(d，2H)；7.31(br，1H)；9.14(s，1H)。
步骤2：
{(S)-1-氨甲酰基-2-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]乙基}氨基甲酸叔丁酯
Figure C20048002959201371
随后向[(S)-1-氨甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯(3.00g，10.7mmol)和碳酸钾(7.40g，53.5mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(50ml)的混合物中，加入氯丙酮(1.02ml，12.8mmol)和四丁基铵碘化物(197mg，0.54mmol)。将反应混合物加热至90℃16小时，并冷却至室温。用水(100ml)稀释，并用10％硫酸氢钠溶液酸化至pH 2。加入乙酸乙酯(300ml)。分离相。用水(3x150ml)洗涤有机层，并经硫酸镁干燥。真空去除溶剂，生成2.65g{(S)-1-氨甲酰基-2-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。
MS：m/z＝359(M+Na+)
1H-NMR(DMSO-d6)δ1.30(s，9H)；2.10(s，3H)；2.70(dd，1H)；2.90(dd，1H)；3.95(br，1H)；4.00(m，1H)；4.75(s，2H)；6.80(d，2H)；7.00(br，1H)；7.20(d，2H)；7.35(br，1H)。
步骤3：
将三氟乙酸(50ml)加入{(S)-1-氨甲酰基-2-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(2.65g，7.88mmol)在二氯甲烷(50ml)中的溶液中。在室温搅拌反应混合物1小时。真空去除溶剂。将残余物溶于二氯甲烷(50ml)，并真空去除溶剂。重复后一步骤一次。通过在HPLC上的C-18反相色谱法(使用在三氟乙酸缓冲液(0.1％)中的13-33％乙腈在水中的梯度)，纯化粗产物，生成460mg(S)-2-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺。
MS：m/z＝237(M+)
1H-NMR(DMSO-d6，TFA-盐)δ2.20(s，3H)；2.80-3.10(m，2H)；3.90(m，1H)；4.80(s，2H)；6.90(d，2H)；7.20(d，2H)；7.55(br，1H)；7.90(br，1H)；8.10+(br，3H)。
实施例13
(S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(2-氧代丙氧基)苯基)丙酰胺
Figure C20048002959201381
将(([Glu3，Leu10]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸(0.50mg，127pmol)在水(0.040ml)和1N氢氧化钠水溶液(0.003ml)中的溶液，加入(S)-2-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺的三氟乙酸盐(13.3mg，0.038mmol)在含有250mM HEPES和5mM EDTA的水性缓冲液中的溶液中，该缓冲液已经用氢氧化钠调节至pH 8。用1N氢氧化钠水溶液，将溶液调节至pH 8。用含有250mM HEPES和5mM EDTA的水性缓冲液将溶液稀释至0.127ml的终体积，该缓冲液已经用氢氧化钠调节至pH 8。加入CPY在水中的溶液(0.005ml，1U)。将反应混合物在室温放置16小时。MS分析表明，生成了具有所需质量的产物。
MALDI-TOF：m/z＝4090.321
MS：m/z＝1365，1024
HPLC(方法03-b6-1)：30.69分钟。
实施例14
(2S)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺
Figure C20048002959201391
步骤1：
(([Glu3]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸
从商购可得的Fmoc-Ala-Wang树脂开始，如关于(([Glu3，Leu10]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸所述，制备了(([Glu3]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸。使用了下面的氨基酸衍生物：
Figure C20048002959201401
HPLC：8.60分钟(方法02-B4-4)。
MALDI-TOF：m/z＝3964.17。
步骤2：
(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺与(([Glu3]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸的CPY-反应：
如本领域技术人员已知的，使用FMOC-策略，在ABI-433A肽合成仪上，通过标准的固相肽合成，制备了(([Glu3]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸。使用1N氢氧化钠水溶液，将(([Glu3]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸(1mM终浓度)和(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺的三氟乙酸盐(28mg，150mM终浓度)和羟丙基-β-环糊精(284mg)在由250mM HEPES和5mM EDTA组成的缓冲液中的混合物(7ml终体积)调节至pH 8。加入羧肽酶Y的溶液(CPY，800U/ml，0.088ml，70U)，得到需要的终体积和浓度。将混合物在室温放置100分钟。用水将混合物稀释至10ml的体积。通过HPLC-纯化(使用C18-柱和36-75％乙腈在用0.1％三氟乙酸酸化的水中的梯度)，分离产物，生成(2S)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺。在214nm使用1500000的吸收系数，检测到了9.9mg的产量。
MALDI-TOF：4096(M+)
HPLC(***02-b4-4)：8.97分钟
MS(电雾化)：m/z＝1366(M3+)，1024(M4+)，和819(M5+)。
实施例15
(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基)丙酰胺
Figure C20048002959201411
将10％次氯酸钠溶液(0.062ml)加入3-氯苯甲醛肟(32mg，0.205mmo l)在水(4.2ml)中的悬浮液中。将混合物在室温放置10分钟，并加入(2S)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺(8.4mg，0.0021mmol)和三乙胺(0.025ml)在水(4.7ml)中的溶液之中。将反应混合物在室温放置16小时。在反相C18-HPLC上，使用在0.1％TFA缓冲液中的40-80％乙腈在水中的梯度，纯化粗产物。在214nm使用1500000的吸收系数，检测到了0.132mg的产量。
MALDI-TOF：4244(M+)和4228(M-O+)
HPLC(方法02-b4-4)：9.41分钟。
MS(EI)：m/z＝1417(M3+)和1062(M4+)。
实施例16
3-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲酰基-3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基)甲基)异噁唑-3-基)苄基氨甲酰基)丙酸
Figure C20048002959201421
步骤1：
(3-羟甲基苄基)氨基甲酸叔丁酯
Figure C20048002959201422
在0℃，将氯甲酸乙酯(1.93ml，20mmol)加入3-(叔丁氧基羰基氨基甲基)苯甲酸(5.0g，20mmol)和三乙胺(3.33ml，24mmol)在四氢呋喃(30ml)中的溶液中。将反应混合物在0℃搅拌40分钟，并滤出形成的沉淀。将滤液冷却至0℃。加入2.0M硼氢化锂在THF(25ml，50mmol)中的溶液。将反应混合物搅拌16小时，同时升温至室温。小心地加入水，直到没有气体形成。加入10％硫酸氢钠溶液(10ml)。加入饱和的碳酸氢钠溶液(200ml)。用乙酸乙酯(200和100ml)萃取混合物。合并的有机层经硫酸镁干燥。真空去除溶剂。通过在二氧化硅(80g)上的快速色谱法(使用乙酸乙酯/庚烷1∶1作为洗脱剂)，纯化粗产物，生成3.73g(3-羟甲基苄基)氨基甲酸叔丁酯。
MS：m/z＝260(M+23+)
1H-NMR(CDCl3)：δ1.48(s，9H)；4.30(br，2H)；4.70(s，2H)；4.85(br，1H)；7.15-7.35(m，5H)。
步骤2：
(3-(氨基甲基)苯基)甲醇
Figure C20048002959201431
将三氟乙酸(5ml)加入(3-羟甲基苄基)氨基甲酸叔丁酯(1.70g，7.17mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中。将反应混合物搅拌40分钟。真空去除溶剂。将残余物溶于二氯甲烷(40ml)。真空去除溶剂。将后一步骤重复2次。将残余物溶于水(50ml)和1N氢氧化钠水溶液(100ml)。用叔丁基甲基醚洗涤(3x100ml)。用氯化钠饱和，并用二氯甲烷萃取(3x75ml)。合并的二氯甲烷-相经硫酸镁干燥。真空去除溶剂，生成328mg粗制的(3-(氨基甲基)苯基)甲醇，其不经纯化地用于进一步的步骤。
1H-NMR(DMSO-d6)：δ3.30(br，2H)；3.70(s，2H)；4.45(s，2H)；5.15(br，1H)；7.10-7.30(m，4H)。
步骤3：
N-(3-(羟甲基)苄基)琥珀酰胺酸叔丁酯
Figure C20048002959201441
在0℃，将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物(451mg，2.35mmol)加入琥珀酸一丁酯(410mg，2.35mmol)和3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(384mg，2.35mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(5ml)和二氯甲烷(5ml)的混合物中的溶液中。将反应混合物在0℃搅拌25分钟。相继加入粗制的(3-(氨基甲基)苯基)甲醇(340mg，2.48mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中的溶液和乙基二异丙基胺(0.40ml，2.48mmol)。将反应混合物搅拌16小时，同时缓慢地升温至室温。用乙酸乙酯(150ml)稀释，并用10％硫酸氢钠水溶液(100ml)洗涤。用乙酸乙酯(50ml)萃取水相。用碳酸氢钠的饱和水溶液(150ml)洗涤合并的有机层，并经硫酸镁干燥。真空去除溶剂。通过在二氧化硅(60g)上的快速色谱法(使用乙酸乙酯和庚烷(2∶1)的混合物作为洗脱剂)，纯化粗产物，生成372mg N-(3-(羟甲基)苄基)琥珀酰胺酸叔丁酯。
MS：m/z＝316(M+23+)
1H-NMR(CDCl3)：δ1.45(s，9H)；2.45(t，2H)；2.60(t，2H)；4.45(d，2H)；4.70(s，2H)；6.15(br，1H)；7.15-7.35(m，5H)。
步骤4：
N-(3-甲酰基苄基)琥珀酰胺酸叔丁酯
Figure C20048002959201451
在-78℃，将草酰氯(0.142ml，1.63mmol)逐滴加入二甲亚砜(0.232ml。3.26mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中。将反应混合物在-78℃搅拌10分钟。加入N-(3-(羟甲基)苄基)琥珀酰胺酸叔丁酯(372mg，1.55mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液。将反应混合物在-78℃搅拌10分钟。加入三乙胺(1.08ml，7.77mmol)。将反应混合物在-78℃搅拌5分钟，然后加热至室温。在室温搅拌40分钟，并用乙酸乙酯(100ml)稀释。用10％硫酸氢钠水溶液(100ml)洗涤。用乙酸乙酯(2x50ml)萃取水相。用碳酸氢钠的饱和水溶液(150ml)洗涤合并的有机层，并经硫酸镁干燥。去除溶剂，生成312mg粗制的N-(3-甲酰基苄基)琥珀酰胺酸叔丁酯，其不经进一步纯化地用于下一步骤。
MS：m/z＝314(M+23+)
1H-NMR(CDCl3)：δ1.35(s，9H)；2.45(t，2H)；2.55(t，2H)；4.45(d，2H)；6.20(br，1H)；7.44(t，1H)；7.50(d，1H)；7.75(m，2H)；9.95(s，1H)。
步骤5：
N-[3-((羟基亚氨基)甲基)苄基]琥珀酰胺酸叔丁酯
将3.2M氢氧化钠水溶液(0.5ml，1.60mmol)加入N-(3-甲酰基苄基)琥珀酰胺酸叔丁酯(312mg，1.07mmol)和羟基胺氢氯化物(89mg，1.29mmol)在乙醇(2.5ml)和水(0.5ml)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌3天。加入10％硫酸氢钠水溶液(20ml)和水(50ml)。用乙酸乙酯(3x50ml)萃取混合物。合并的有机层经硫酸镁干燥。真空去除溶剂，生成249mg粗制的N-[3-((羟基亚氨基)甲基)苄基]琥珀酰胺酸叔丁酯，其不经进一步纯化地用于下一步骤。
MS：m/z＝329(M+23+)，307(M+1+)
1H-NMR(DMSO-d6)：δ1.35(s，9H)；2.40(m，4H)；4.30(d，2H)；7.25(d，1H)；7.35(t，1H)；7.50(m，2H)；8.10(s，1H)；8.40(t，1H)；11.20(s，1H)。
步骤6：
N-[3-(羟基亚氨基甲基)苄基]琥珀酰胺酸
Figure C20048002959201461
将三氟乙酸(7ml)加入粗制的N-[3-((羟基亚氨基)甲基)苄基]琥珀酰胺酸叔丁酯(249mg，0.81mmol)在二氯甲烷(7ml)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌55分钟。真空去除溶剂。将残余物重新溶于二氯甲烷(50ml)。真空去除溶剂。将后一步骤重复2次，生成294mg粗制的N-[3-(羟基亚氨基甲基)苄基]琥珀酰胺酸，其不经进一步纯化地用于下一步骤。
MS：m/z＝273(M+23+)，251(M+1+)
1H-NMR(DMSO-d6)：δ2.45(A2B2，4H)；4.30(d，2H)；7.20-7.50(m，4H)；8.10(s，1H)；8.40(t，1H)；11.20(br，1H)。
步骤7：
将10％次氯酸钠水溶液(0.0015ml，2600pmol)加入粗制的N-[3-(羟基亚氨基甲基)苄基]琥珀酰胺酸(1.29mg，5150pmol)在水(0.11ml)和碳酸氢钠的饱和水溶液(0.01ml)的混合物中的溶液中。将反应混合物在室温放置10分钟。加入(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺(0.210mg，51pmol)和三乙胺(0.0006ml)在水(0.11ml)中的溶液。在室温摇动反应混合物。1小时后，MALDI-TOF表现出少量的m/z＝4323，这与3-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲酰基-3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基)甲基)异噁唑-3-基)苄基氨甲酰基)丙酸的质量相对应，以及大量的m/z＝4076，这与(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺的质量相对应。2小时后，LC-MS电雾化表现出m/z＝1442，1082，和866的质量，它们分别与3-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲酰基-3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基)甲基)异噁唑-3-基)苄基氨甲酰基)丙酸的(M3+)，(M4+)和(M5+)相对应，以及m/z＝1359，1020，和816的质量，它们分别与(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺的(M3+)，(M4+)和(M5+)相对应。8小时后，LC-MS电雾化表现出少量的m/z ＝1442和1082的质量，它们分别与3-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲酰基-3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基)甲基)异噁唑-3-基)苄基氨甲酰基)丙酸的(M3+)和(M4+)相对应，以及大量的m/z＝1360和1020的质量，它们分别与(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺的(M3+)和(M4+)相对应。
实施例17
11-(4-(4-((2S)-2-氨甲酰基-2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-***基)十一酸和11-(5-(4-((2S)-2-氨甲酰基-2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-***基)十一酸
Figure C20048002959201481
步骤1：
11-叠氮基十一酸甲酯
Figure C20048002959201482
将叠氮化钠(4.66g，72mmol)和四丁基铵碘化物(66mg，0.18mmol)相继加入11-溴十一酸甲酯(在Aldrich商购可得，5.00g，17.9mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液中。将反应混合物加热至60℃16小时，并冷却至室温。用水(200ml)稀释，并用乙酸乙酯(200ml)萃取。用水(2x200ml)洗涤水相。有机相经硫酸镁干燥。真空去除溶剂，生成4.28g 11-叠氮基十一酸甲酯。
MS：m/z＝264(M+23+)，214(M-N2 +)
步骤2：
11-叠氮基十一酸
Figure C20048002959201491
将压碎的氢氧化钠(709mg，17.7mmol)加入11-叠氮基十一酸甲酯(4.03g，17.7mmol)在甲醇(75ml)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌16小时。加入水(50ml)。通过加入10％硫酸氢钠水溶液，将混合物酸化至pH 2，并用乙酸乙酯(3x50ml)萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥。真空去除溶剂。将残余物溶于甲醇(50ml)。加入压碎的氢氧化钠(1.42g，35.4mmol)。将反应混合物在室温搅拌16小时。加入水(50ml)。通过加入10％硫酸氢钠水溶液，将混合物酸化至pH 2，并用乙酸乙酯(3x50ml)萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥。真空去除溶剂，生成3.13g 11-叠氮基十一酸。
MS：m/z＝250(M+23+)，200(M-N2 +)。
1H-NMR(CDCl3)：δ1.30(m，12H)；1.65(m，4H)；2.40(t，2H)；3.20(t，2H)；9.00-10.80(br，1H)。
步骤3
将11-叠氮基十一酸(0.116mg，510nmol)在乙腈(0.055ml)中的溶液，加入(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺(0.210mg，51nmol)和2，6-二甲基吡啶(0.0012ml，10200nmol)在水(0.105ml)中的溶液中。加入碘化铜(I)(0.001mg，5nmol)在乙腈(0.050ml)中的溶液。将反应混合物保持在室温。4小时后，加入碘化铜(I)(0.098mg，500nmol)在乙腈中的溶液。将反应混合物在室温保持16小时。加入2.5％氨水(0.200ml)。将反应混合物在室温和室气压保持4小时。通过MS和MALDI-TOF发现的质量与关于就11-(4-(4-((2S)-2-氨甲酰基-2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-***基)十一酸和11-(5-(4-((2S)-2-氨甲酰基-2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-***基)十一酸发现的质量所作的预期一致。
HPLC：9.43分钟(方法02-B4-4)。
MS：m/z＝1435，1077。
MALDI-TOF：4303。
实施例18
11-(4-(4-((S)-2-氨甲酰基-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基))苯氧基甲基)-1H-1，2，3-***-1-基)十一酸和11-(5-(4-((S)-2-氨甲酰基-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基))苯氧基甲基)-1H-1，2，3-***-1-基)十一酸
Figure C20048002959201511
将2，6-二甲基吡啶加入(2S)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺(1.0mg，244pmol)在水(0.5ml)中的混合物中，生成澄清的溶液。相继加入11-叠氮基十一酸(0.554mg，0.0025mmol)在乙腈(0.25ml)中的溶液和碘化铜(I)(0.467mg，0.0025mmol)在乙腈(0.25ml)中的溶液。将反应混合物在室温放置16小时。在反相C18柱上，通过HPLC(使用在0.1％三氟乙酸缓冲液中的35-75％乙腈在水中的梯度)进行分级，生成约0.3mg11-(4-(4-((S)-2-氨甲酰基-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基))苯氧基甲基)-1，2，3-***基)十一酸或11-(5-(4-((S)-2-氨甲酰基-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基))苯氧基甲基)-1H-1，2，3-***-1-基)十一酸或其混合物。
HPLC：9.27分钟(方法02-B4-4)。
MS：m/z＝1441.8，1081.3，865.2，721.2，618.9。
MALDI-TOF：m/z＝4317
实施例19
2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲酰基)癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-4-基)甲氧基)苯基)丙酰胺和2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲酰基)癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-5-基)甲氧基)苯基)丙酰胺
Figure C20048002959201521
步骤1：
11-叠氮基十一酸2，5-二氧代pyrroldin-1-基酯
Figure C20048002959201531
将M，N，N’，N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚氨基)铀四氟硼酸盐(1.32g，4.40mmol)加入11-叠氮基十一酸(1.00g，4.40mmol)和三乙胺(0.61ml，4.40mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌2小时。用乙酸乙酯(50ml)稀释，并用水(3x50ml)洗涤。有机相经硫酸镁干燥。真空去除溶剂，生成1.40g粗制的11-叠氮基十一酸2，5-二氧代pyrroldin-1-基酯，其不经进一步纯化地用于接下来的步骤。
MS：m/z＝347[M+Na+]
1H-NMR(CDCl3)：δ1.35(m，12H)；1.60(quintett，2H)；1.75(quintett，2H)；2.60(t，2H)；1.85(m，4H)；3.25(t，2H)。
步骤2：
11-叠氮基十一酰基氨基mPEG20kDa
Figure C20048002959201532
将11-叠氮基十一酸2，5-二氧代pyrroldin-1-基酯(227mg，0.7mmol)的溶液加入商购可得的mPEG20000DA-胺(Nektar 2M2U0P01，5.00g，0.25mmol)和三乙胺(0.174ml，1.25mmol)在二氯甲烷(50ml)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌16小时。加入醚(800ml)。过滤分离形成的沉淀，并用醚(2x100ml)洗涤。真空干燥，生成4.58g11-叠氮基十一酰基氨基mPEG20kDa。
步骤3：
将抗坏血酸(1.72mg，9766nmol)和2，6-二甲基吡啶(0.0024ml)在水(0.10ml)中的溶液，加入硫酸铜(II)五水合物(0.49mg，1954nmol)在水(0.1ml)中的溶液中。将该溶液在室温保持5分钟。将一部分得到的混合物(0.025ml)加入(S)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-炔丙基氧基苯基)丙酰胺(0.1mg，24nmol)、2，6-二甲基吡啶(0.0012ml)和11-叠氮基十一酰基氨基mPEG20kDa(0.049mg，240nmol)在水(0.075ml)中的溶液中。将反应混合物保持在室温。24小时后，使用NuPAGE(Invitrogen)的10％ Bis-Tirs凝胶的SDS-凝胶电泳和
Figure C20048002959201541
银染色方法，证实了高分子肽的形成，这与关于2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲酰基)癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-4-基)甲氧基)苯基)丙酰胺和2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲酰基)癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-5-基)甲氧基)苯基)丙酰胺所作的预期一致。
实施例20：
N-((S)-5-([Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)-5-氨甲酰基戊基)-4-乙酰基苯甲酰胺：
Figure C20048002959201542
步骤1：
如实施例9所述，制备了[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸。
步骤2：
CPY-催化的4-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺与[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸的转肽作用：
向在含有5mM EDTA的HEPES缓冲液250mM pH8的溶液中的4-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺(终浓度100mM)和羟丙基-β-环糊精(4％w/v终浓度)的混合物中，加入在含有5mMEDTA的HEPES缓冲液250mM pH8的溶液中的[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸(1mM终浓度)。通过加入二异丙基乙基胺，将pH调节至8.1。通过加入在水溶液中的酶(10U/ml终浓度)，开始反应。
通过HPLC监测反应。
HPLC方法：
柱：Vydac C18(218TP53)250x4.6
A：(NH4)2SO4 50mM，0.5％CH3CN，pH2.5 B：CH3CN/TFA 0.1％
1.5ml/分钟
5-45％B，经20分钟
在214nm检测
40C
在30℃6小时30分钟后，反应混合物的成分是约22％的剩余的起始化合物[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸(保留时间：18.1分钟)、70％的转肽作用产物(保留时间：18.3分钟)和8％的水解产物[Leu37]GLP-1(7-37)(保留时间：18.4分钟)。
MALDI-TOF：m/z＝3684((S)-5-[Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)5-氨甲酰基戊基)4-乙酰基苯甲酰胺)，3482([Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸)，3411([Leu37]GLP-1(7-37))，和1162和1742([Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸)。
MS(电雾化)：m/z＝1844和1229((S)-5-[Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)5-氨甲酰基戊基)4-乙酰基苯甲酰胺)，1139和1702([Leu37]GLP-1(7-37))，和1162和1742([Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸)。
实施例21：
N-((S)-5-([Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)-5-氨甲酰基戊基)-4-[1-[2-(1-(十六酰基)哌啶-4-基))乙氧基亚氨基]乙基]苯甲酰胺：
Figure C20048002959201561
向N-((S)-5-([Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)-5-氨甲酰基戊基)-4-乙酰基苯甲酰胺在醋酸盐缓冲液50mM pH4中的溶液(终浓度0.3mM)中，加入在乙腈溶液中的1-[4-(2-(氨基氧基)乙基)哌啶-1-基]十六烷-1-酮(终浓度3mM)(最终乙腈浓度：18％v/v)。在30℃进行反应，随后HPLC。
HPLC方法：
柱：Vydac C18(218TP53)250x4.6
A：H2O/TFA 0.1％
B：CH3CN/TFA 0.1％
10％B进行5分钟，然后10-91％B进行27分钟
1ml/分钟
40C
在214和280nm检测
N-((S)-5-([Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)5-氨甲酰基戊基)-4-乙酰基苯甲酰胺的保留时间：18.4分钟，产物的保留时间：26.5和27.1分钟。
4小时反应时间后，得到了超过90％的收率。
MS(电雾化)：m/z＝1351.4(calc：1350.9)
MALDI-TOF：m/z＝4048(calc：4049.8)。
本文引用的所有文献，包括出版物、专利申请和专利，都整体引作参考，其程度为似乎单独地和具体地指出将每一篇引作参考，且在本文中整体提及(至法律允许的最大程度)。
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本发明包括适用法律允许的所附权利要求中所陈述的主题的所有改进和等同方案。

Claims (16)

1.制备缀合的肽的方法，所述的方法包含下述步骤：
i)在一个或多个步骤中，使肽与携带一个或多个在任何构成所述肽的氨基酸残基中不可接近的官能团的第一种化合物反应，该反应在有能催化将所述的第一种化合物整合进所述肽的C-末端、形成转酰化的肽的酶存在的情况下进行，和
ii)在一个或多个步骤中，使所述的转酰化的肽与包含一个或多个官能团的第二种化合物反应，其中所述的官能团不能与在构成所述肽的氨基酸残基中的可接近的官能团反应，且其中所述的第二种化合物中的所述官能团能与所述的第一种化合物中的所述官能团反应，从而形成所述的转酰化的肽和所述的第二种化合物之间的一个或多个共价键，
其中在一个或多个步骤中，在有羧肽酶存在的情况下，使肽P与第一种化合物反应，后者是下式代表的α-氨基酸酰胺
Figure C2004800295920002C1
，形成下式的转酰化的肽：
Figure C2004800295920002C2
所述的转酰化的肽在一个或多个步骤中进一步与下式的第二种化合物反应
Y-E-Z
形成下式的缀合的肽
其中R代表着连接物或键；
P’代表着从肽P去除C-末端氨基酸后得到的肽；
X代表着包含一个或多个在构成肽P’的氨基酸残基中不可接近的官能团的基团；
Y代表着包含一个或多个官能团的基团，该官能团不与在构成肽P’的氨基酸残基中可接近的官能团反应，且该基团能与存在于X中的所述官能团反应；
E代表着连接物或键；
其中A代表着由包含在X和Y中的官能团之间的反应形成的部分；且
Z包含要缀合到肽上的部分，其中与P的清除相比，所述的部分能减少式[a]化合物的清除，
并且，
A代表着肟，腙，苯腙，缩氨基脲或***部分；
存在于X中的官能团选自：酮-，醛-，-NH-NH2，-O-C(O)-NH-NH2，-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-C(S)-NH-NH2，-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(S)-NH-NH2，-NH-C(O)-C6H4-NH-NH2，-C(O)-NH-NH2，-O-NH2，-C(O)-O-NH2，-NH-C(O)-O-NH2，-NH-C(S)-O-NH2，炔烃，腈-氧化物和叠氮化物；
存在于Y中的官能团选自：酮-，醛-，-NH-NH2，-O-C(O)-NH-NH2，-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-C(S)-NH-NH2，-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(S)-NH-NH2，-NH-C(O)-C6H4-NH-NH2，-C(O)-NH-NH2，-O-NH2，-C(O)-O-NH2，-NH-C(O)-O-NH2，-NH-C(S)-O-NH2，炔烃、腈-氧化物和叠氮化物；和
R和E独立地代表着键或直链的、分支的和/或环状的C1-10烷烃、C2-10烯烃、C2-10炔烃、C1-10杂烷烃、C2-10杂烯烃、C2-10杂炔烃的双基，其中可以***一个或多个同素环芳族化合物双基或杂环化合物双基。
2.根据权利要求1的方法，其中X选自：酮-和醛-衍生物，且Y选自：-NH-NH2，-O-C(O)-NH-NH2，-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-C(S)-NH-NH2，-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(S)-NH-NH2，-NH-C(O)-C6H4-NH-NH2，-C(O)-NH-NH2，-O-NH2，-C(O)-O-NH2，-NH-C(O)-O-NH2，-NH-C(S)-O-NH2。
3.根据权利要求1的方法，其中X代表着炔烃，且Y代表着叠氮化物或腈-氧化物。
4.根据权利要求1的方法，其中X代表着叠氮化物或腈-氧化物，且Y代表着叠氮化物。
5.根据权利要求1的方法，其中所述的α-氨基酸酰胺代表着选自下述的化合物：2-氨基-3-氧代-丁酰胺，2-氨基-6-(4-氧代-戊酰基氨基)-己酸酰胺，2-氨基-3-(2-氧代-2-苯基-乙基硫烷基)-丙酰胺，2-氨基-5-氧代-己酸酰胺，2-氨基-3-氧代-丙酰胺，2-氨基-6-(4-乙酰基苯甲酰基氨基)己酸酰胺，2-氨基-3-氧代丙酸酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丁氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(4-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)己酸酰胺，4-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺，(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-(4-氯苯基丁酰基氨基)己酸酰胺，3-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺，2-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺，(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺，(S)-2-氨基戊-4-炔酸酰胺和S-苯基酰基半胱氨酸酰胺。
6.根据权利要求1的方法，其中Z包含一个或多个聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇基团和其氨基衍生物；直链的、分支的和/或环状的C1-22烷基，C2-22烯基，C2-22炔基，C1-22杂烷基，C2-22杂烯基，C2-22杂炔基，其中可以***一个或多个同素环芳族化合物双基或杂环化合物双基，且其中所述的C1-C22或C2-C22基团可以任选地被一个或多个选自下述的取代基取代：羟基，卤素，羧基和芳基，其中所述的芳基可以任选地被一个或多个选自下述的取代基进一步取代：羟基，卤素，和羧基；甾族化合物基团；脂类基团；多糖基团；葡聚糖基团；聚酰胺基团；聚氨基酸基团；PVP基团；PVA基团；聚(1-3-dioxalane)基团；聚(1，3，6-三噁烷)基团；乙烯/马来酸酐聚合物基团；汽巴克隆染料基团；和汽巴克隆蓝3GA基团。
7.根据权利要求6的方法，其中Z包含一个或多个分子量10，20，30或40kDa的聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇基团。
8.根据权利要求6的方法，其中Z包含一个或多个C10-20烷基，其任选地被羧基取代。
9.根据权利要求6的方法，其中Z代表着十一酸基团。
10.根据权利要求6的方法，其中Z包含一个或多个C15烷基，C17烷基，汽巴克隆蓝3GA或下式的基团
Figure C2004800295920005C1
11.根据权利要求6的方法，其中Z包含一个或多个能结合白蛋白的部分。
12.根据权利要求1的方法，其中酶是羧肽酶Y。
13.根据权利要求1的方法，其中P代表着选自下述的肽：胰岛素化合物，GLP-1化合物，GLP-2化合物，生长激素化合物，细胞因子，TFF，黑皮质素受体修饰剂和因子VII化合物。
14.根据权利要求1的方法，该方法另外包含将所述的缀合的肽配制进药物组合物的步骤。
15.根据下式的缀合的肽
Figure C2004800295920006C1
其中P’，R，A，E和Z如权利要求3、4、5、6、7、8、9或10所定义，且其中
通过肽键在P’的C-末端附着到P’，
其中所述的肽选自：
Lysε(4-((2-(1-(mPEG羰基)哌啶-4-基)乙氧基)亚氨基)戊酰基)192)hGH(1-192)酰胺，其中mPEG具有20kDa的分子量；
(Lysε(4-((3-(棕榈酰基氨基)丙氧基)亚氨基)戊酰基)192)hGH(1-192)酰胺；
(Lysε(4-((3-((2S)-2，6-mPEG羰基氨基)己酰基氨基)丙氧基)亚氨基)戊酰基)34)GLP-2(1-34)酰胺，其中mPEG具有20kDa的分子量；
(Lysε(4-(1-(2-(3-(mPEG)丙酰基氨基)肼基)乙基)苯甲酰基)192)hGH(1-92)酰胺，其中mPEG具有10kDa的分子量；
(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)丙酰胺；
(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基)丙酰胺；
3-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲酰基-3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基)甲基)异噁唑-3-基)苄基氨甲酰基)丙酸；
11-(4-(4-((2S)-2-氨甲酰基-2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-***基)十一酸；
11-(5-(4-((2S)-2-氨甲酰基-2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-***基)十一酸11-(4-(4-((S)-2-氨甲酰基-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基))苯氧基甲基)-1H-1，2，3-***-1-基)十一酸；
11-(5-(4-((S)-2-氨甲酰基-2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基))苯氧基甲基)-1H-1，2，3-***-1-基)十一酸；
2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲酰基)癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-4-基)甲氧基)苯基)丙酰胺；和
2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲酰基)癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-5-基)甲氧基)苯基)丙酰胺。
16.药物组合物，其包含一种或多种根据权利要求15的肽。
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