CN100547003C - 人IL-1β的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供IL-1β结合分子，具体地人IL-1β的抗体，尤其是人IL-1β的人抗体，其中抗体的重链和轻链的CDR具有所定义的氨基酸序列，该分子可以用于治疗IL-1介导的疾病或病症，如骨关节炎、骨质疏松和其它炎症性关节炎。

Description

人IL-1β的抗体
本发明涉及人白介素1β(IL-1β)的抗体和该抗体在治疗IL-1介导的疾病和紊乱中的用途。
白介素1(IL-1)是免疫***的细胞产生的活性，其是急性期炎症应答的介体。IL-1，尤其是IL-1β的不适当或过度产生与多种疾病和病症的病理有关，所述疾病和病症的例子有败血病、败血症性或内毒素性休克、过敏、哮喘、骨丧失、局部缺血、中风、类风湿性关节炎和其它炎症性疾病。IL-1β的抗体已被提议用于治疗IL-1介导的疾病和病症；见例如，WO 95/01997和其绪论中的讨论。
目前我们已制备了人IL-1β的改良抗体，该抗体可以用于治疗IL-1介导的疾病和紊乱。
因此，本发明提供包含抗原结合位点的IL-1β结合分子，所述抗原结合位点包含至少一个顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列Val-Tyr-Gly-Met-Asn，所述CDR2具有氨基酸序列Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro；以及其直接等价物。
因此，本发明还提供包含至少一个顺次含有高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’的免疫球蛋白轻链可变区(VL)的IL-1β结合分子，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Ser-Ser-Leu-His，所述CDR2’具有氨基酸序列Ala-Ser-Gln-Ser-Phe-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro；以及其直接等价物。
第一方面，本发明提供单结构域的IL-1β结合分子，该分子中包括含有以上定义的重链可变区(VH)的分离的免疫球蛋白重链。
第二方面，本发明还提供包含重链(VH)和轻链(VL)可变区的IL-1β结合分子及其直接等价物，其中所述IL-1β结合分子含有至少一个抗原结合位点，而所述抗原结合位点包含：
a)顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列Val-Tyr-Gly-Met-Asn，所述CDR2具有氨基酸序列Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro，和
b)顺次含有高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’的免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Ser-Ser-Leu-His，所述CDR2’具有氨基酸序列Ala-Ser-Gln-Ser-Phe-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro。
除非另行指明，否则本文中所有的多肽链均以具有起始于N末端并终止于C末端的氨基酸序列来描述。当抗原结合位点包含VH和VL域时，这些域可以定位在相同的多肽分子上，或者优选地，每个域可以定位在不同的链上，即VH域是免疫球蛋白重链或其片段的一部分，而VL是免疫球蛋白轻链或其片段的一部分。
“IL-1β结合分子”是指能够与单独的或连接其它分子的IL-1β抗原结合的任何分子。通过标准方法(定性测定)可以反映结合反应，包括例如参照阴性对照试验(其中使用具有无关特异性但具有相同的同种型的抗体，例如抗CD25抗体)用于确定对IL-1β和其受体结合的抑制作用的生物测定方法，或任何类型的结合试验。有利的是，可以在竞争结合试验中证实本发明的IL-1β结合分子与IL-1β的结合。
抗原结合分子的实例包括B细胞或杂交瘤产生的抗体以及嵌合的、CDR嫁接的或人的抗体，或其任何片段如F(ab’)2和Fab片段，以及单链或单结构域抗体。
单链抗体由抗体的重链和轻链的可变区组成，这些可变区通过常常由10至30个氨基酸，优选15至25个氨基酸组成的肽接头共价结合在一起。因此，该结构不包括重链和轻链的恒定部分，而且小的间隔肽的抗原性被认为应比整个恒定部分的抗原性小。“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链恒定区或轻链恒定区或两者来源于人，而重链和轻链的可变区均是非人(如鼠)来源的或来源人但来自不同人的抗体。“CDR嫁接的抗体”是指这样的抗体，其中高变区(CDR)来自供体抗体，如非人(如鼠源)抗体或不同人的抗体，而免疫球蛋白的所有的或基本上所有的其它部分，例如恒定区和可变区的高度保守部分(即构架区)均来自受体抗体，如人源抗体。然而，CDR嫁接的抗体可以在构架区中，例如在与高变区相邻的构架区部分含有少许供体序列的氨基酸。“人抗体”是指这样的抗体，其中重链和轻链的恒定区和可变区均来源于人，或与来源于人的序列基本上一致，但不一定来自相同抗体，这样的抗体包括其中鼠源的免疫球蛋白可变部分和恒定部分的基因已被其人来源的对等物替代的小鼠所产生的抗体，见例如EP0546073 B1，USP 5545806，USP 5569825，USP 5625126，USP 5633425，USP5661016，USP 5770429，EP 0 438474 B1和EP 0 463151 B1中一般术语的描述。
尤其优选的本发明IL-1β结合分子是人抗体，尤其是ACZ 885抗体，描述于下文的实施例中。
因此，在优选的嵌合抗体中，重链和轻链的可变区均来源于人，例如Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.2中显示的ACZ 885抗体的可变区。恒定区结构域优选也包含适宜的人恒定区结构域，参见例如“具有免疫学意义的蛋白质的序列”，Kabat，E.A.等，US Department of Health and HumanServices，Public Health Service，National Institute of Health。
可以使高变区与任何类型的构架区连接，但优选构架区来源于人。适宜的构架区描述在Kabat E.A.等，同上。优选的重链构架是人的重链构架，例如Seq.Id.No.1中显示的ACZ 885抗体的重链构架。它由FR1、FR2、FR3和FR4区顺次组成。以相似方式，Seq.Id.No.2显示了顺次由FR1’、FR2’、FR3’和FR4’区组成的优选的ACZ 885轻链构架。
因此，本发明还提供包含至少一个抗原结合位点的IL-1β结合分子，所述抗原结合位点包含具有与Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸并终止于第118位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的第一域或上述第一域和具有与Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸并终止于第107位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的第二域。
针对天然存在于所有人体中的蛋白质的单克隆抗体典型地是在非人***如小鼠中产生的，因而典型地是非人蛋白质。这直接导致，当将杂交瘤产生的异种抗体施用于人时引起主要由异种免疫球蛋白的恒定区介导的不良免疫应答。由于不能长期施用这类抗体，因此这显然限制了这类抗体的用途。因此，尤其优选使用在给予人后不可能引起实质性同种异型应答的单链的、单结构域的、嵌合的、CDR嫁接的抗体，或特别是人抗体。
鉴于前述，更优选的本发明IL-1β结合分子选自如下人抗IL-1β抗体和其直接等价物，其中所述人抗IL-1β抗体包含至少
a)包含(i)顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的可变区和(ii)人重链的恒定部分或其片段的免疫球蛋白重链或其片段；所述CDR1具有氨基酸序列Val-Tyr-Gly-Met-Asn，所述CDR2具有氨基酸序列Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro，和
b)包含(i)顺次含有高变区及任选地还含有CDR1’、CDR2’和CDR3’高变区的可变区和(ii)人轻链的恒定部分或其片段的免疫球蛋白轻链或其片段，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Ser-Ser-Leu-His，所述CDR2’具有氨基酸序列Ala-Ser-Gln-Ser-Phe-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro。
或者，本发明IL-1β结合分子可以选自包含抗原结合位点的单链结合分子和其直接等价物，其中所述抗原结合位点包含
a)顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一域，所述高变区具有Seq.Id.No.1所示氨基酸序列，
b)含有高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’的第二域，所述高变区具有Seq.Id.No.2所示氨基酸序列，和
c)与所述第一域的N末端及所述第二域的C末端或者与所述第一域的C末端及所述第二域的N末端结合的肽接头。
正如熟知的，氨基酸序列中的微小变化，如缺失、***或替代一个、几个或甚至多个氨基酸可以导致具有实质上相同性质的原蛋白质的等位形式。
因此，术语“其直接等价物”是指任何如下单结构域的IL-1β结合分子(分子X)，
(i)其中高变区CDR1、CDR2和CDR3作为整体与Seq.Id.No.1所示高变区至少80％同源、优选至少90％同源、更优选至少95％同源，且
(ii)其能够和参考分子基本上以相同的程度抑制IL-1β与其受体的结合，所述参考分子具有和分子X相同的构架区但具有和Seq.Id.No.1所示相同的高变区CDR1、CDR2和CDR3；
或指每个结合位点具有至少两个域的任何如下IL-1β结合分子(分子X’)，
(i)其中高变区CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’作为整体与Seq.Id.No.1和2所示高变区至少80％同源、优选至少90％同源、更优选至少95％同源，且
(ii)其能够和参考分子基本上以相同的程度抑制IL-1β与其受体的结合，所述参考分子具有和分子X’相同的构架区和恒定部分但具有和Seq.Id.No.1和2所示相同的高变区CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’。
在本发明说明书中，如果两个氨基酸序列在最佳比对时在同样的位置上具有至少80％相同的氨基酸残基(氨基酸序列中的缺口或***被计为不相同的残基)，则它们相互有至少80％同源性。
对IL-1β与其受体结合的抑制可以方便地在多种试验中进行测试，这些试验包括下文中描述的那些试验。术语“以相同的程度”是指在上述一个试验中参考分子和等价分子在统计学基础上表现出基本上一致的IL-1β结合抑制曲线。例如，当按上述进行测定时，对IL-1β和其受体结合的抑制，典型地本发明的IL-1β结合分子具有的IC50s在相应参考分子的IC50的+/-×5范围内，优选与之基本相同。
例如，所用试验可以是通过可溶性IL-1受体和本发明IL-1β结合分子进行的IL-1β结合竞争抑制试验。
最优选地，人IL-1β抗体包含至少
a)一条含有如下可变区和人重链恒定部分的重链，所述可变区具有与Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸终止于第118位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列；和
b)一条含有如下可变区和人轻链恒定部分的轻链，所述可变区具有与Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸终止于第107位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列。
人重链恒定部分可以是γ1、γ2、γ3、γ4、μ、α1、α2、δ或ε型，优选γ型，更优选γ1型，而人轻链恒定部分可以是κ或λ型(其包括λ1、λ2和λ3亚型)但优选是κ型。所有这些恒定部分的氨基酸序列均可参见Kabat等，同上。
本发明IL-1β结合分子可以通过重组DNA技术制备。鉴于此，必须构建编码该结合分子的一个或多个DNA分子、将其置于适当的控制序列之下并转移至适宜的宿主生物中用于表达。
因此，在非常一般的意义上本发明提供
(i)编码本发明的单结构域的IL-1β结合分子、本发明的单链IL-1β结合分子、本发明的IL-1β结合分子的重链或轻链或其片段的DNA分子，和
(ii)本发明DNA分子在通过重组方式制备本发明IL-1β结合分子中的用途。
本领域现状是本领域技术人员能够根据本文提供的信息，即高变区的氨基酸序列和编码它们的DNA序列，合成本发明DNA分子。构建可变区基因的方法描述在例如EPA 239 400中，并可以简单地总结如下：克隆编码具有任何特异性的MAb的可变区的基因。确定编码构架区和高变区的DNA区段，并将编码高变区的DNA区段从中除去以便编码构架区的DNA区段与接点处的适宜限制性位点融合在一起。可以通过标准方法诱变DNA分子的方式在适当的位置产生这些限制性位点。根据Seq.Id.No.1或2所示序列通过DNA合成制备合成的双链CDR盒。使这些盒具有粘性末端，以便可以将它们连接在构架的接点处。
而且，为了获得编码本发明IL-1β结合分子的DNA构建体，并不需要从生产杂交瘤细胞系获取mRNA。因此，对于在仅有关于抗体基因的核苷酸序列的书面信息时如何通过重组DNA技术制备抗体，PCT申请WO90/07861给出了完全的教导。该方法包括合成大量的寡核苷酸、通过PCR方法对其进行扩增、和将它们拼接成期望的DNA序列。
包含适宜启动子或编码重链和轻链恒定部分的基因的表达载体可通过公共渠道获得。因此，一旦制备了本发明的DNA分子，就可以方便地将其转移至适当的表达载体中。编码单链抗体的DNA分子也可以通过标准方法，如WO 88/1649中的描述来制备。
鉴于上面的描述，对于本申请来讲，不必为满足说明书充分公开的要求而进行杂交瘤或细胞系的保藏。
在一个具体实施方案中，本发明包括如下描述的用于制备IL-1β结合分子的第一和第二DNA构建体：
第一DNA构建体编码重链或其片段并包含
a)编码交替地包含高变区和构架区的可变区的第一部分，所述高变区顺次是氨基酸序列显示在Seq.Id.No.1中的CDR1、CDR2和CDR3；该第一部分起始于编码可变区的第一个氨基酸的密码子并终止于编码可变区的最后一个氨基酸的密码子，和
b)编码重链恒定部分或其片段的第二部分，其起始于编码重链恒定部分的第一个氨基酸的密码子并终止于编码该恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子，
之后接终止密码子。
优选地，该第一部分编码具有与Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸并终止于第118位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的可变区。更优选，该第一部分具有Seq.Id.No.1所示起始于第1位核苷酸并终止于第354位核苷酸的核苷酸序列。而且优选地，该第二部分编码人重链的恒定部分，更优选人γ1链的恒定部分。该第二部分可以是基因组来源的DNA片段(包含内含子)或cDNA片段(无内含子)。
第二DNA构建体编码轻链或其片段并包含
a)编码交替地包含高变区和构架区的可变区的第一部分；所述高变区是CDR3’及任选地CDR1’和CDR2’，它们的氨基酸序列显示在Seq.Id.No.2中；该第一部分起始于编码可变区的第一个氨基酸的密码子并终止于编码可变区的最后一个氨基酸的密码子，和
b)编码轻链恒定部分或其片段的第二部分，其起始于编码轻链恒定部分的第一个氨基酸的密码子并终止于编码该恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子，
之后接终止密码子。
优选地，该第一部分编码具有与Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸并终止于第107位氨基酸的氨基酸序列基本一致的氨基酸序列的可变区。更优选，该第一部分具有Seq.Id.No.2所示起始于第1位核苷酸并终止于第321位核苷酸的核苷酸序列。而且优选地，该第二部分编码人轻链的恒定部分，更优选人κ链的恒定部分。
本发明还包括这样的IL-1β结合分子，在该分子中CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’或CDR3’或构架的一个或多个残基，典型地仅少许(例如1-4个)残基与Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.2所示残基相比发生了改变；例如可以通过突变，如定点诱变相应的DNA序列来实现此改变。本发明包括编码此改变的IL-1β结合分子的DNA序列。尤其是，本发明包括其中CDR1’或CDR2’的一个或多个残基与Seq.Id.No.2所示残基相比发生了改变的IL-1β结合分子。
在第一和第二DNA构建体中，第一和第二部分可以通过内含子分隔开，并且可以方便地将增强子放置在第一和第二部分之间的内含子中。该增强子转录但不翻译，其存在可以帮助转录的有效进行。在特定实施方案中，第一和第二DNA构建体包含有利地来源于人的重链基因的增强子。
将各DNA构建体置于适宜的控制序列的控制下，尤其是适宜的启动子的控制下。任何类型的启动子均可以使用，只要它适合DNA构建体将要转移至其中进行表达的宿主生物即可。然而，如果表达发生在哺乳动物细胞中，则尤其优选使用免疫球蛋白基因的启动子。
可以在细胞培养物或在转基因动物中制备期望的抗体。适宜的转基因动物可以根据标准方法得到，所述方法包括将置于适宜的控制序列之下的第一和第二DNA构建体显微注射至卵中、将如此制备的卵转移至适宜的假孕雌性个体中并选择表达期望抗体的后代。
当在细胞培养物中制备抗体链时，必须首先将这些DNA构建体***一个单一表达载体中，或***两个分离的但相容的表达载体中，后一种可能性是优选的。
因此，本发明还提供能够在原核或真核细胞系中复制并包含至少一个上述DNA构建体的表达载体。
然后将含有DNA构建体的各表达载体转移至适宜的宿主生物中。当DNA构建体被分别地插在两个表达载体上时，可以将它们单独地转移，即每个细胞一种类型的载体，或共转移，此后一种可能性是优选的。适宜的宿主生物可以是细菌、酵母或哺乳动物细胞系，后者是优选的。更优选地，该哺乳动物细胞系是淋巴来源的，例如骨髓瘤、杂交瘤或正常的永生化B细胞，它有利地不表达任何内源性抗体重链或轻链。
为了在哺乳动物细胞中表达，优选将IL-1β结合分子的编码序列整合在宿主细胞DNA中允许或利于该IL-1β结合分子高水平表达的座位上。可以基于表达的IL-1β结合分子的水平，鉴定和选择其中IL-1β结合分子的编码序列整合在此类有利的座位上的细胞。任何适宜的选择标记均可以用于制备含有IL-1β结合分子编码序列的宿主细胞；例如，可以使用dhfr基因/氨甲蝶呤或等价选择***。用于本发明IL-1β结合分子表达的其它可选择***包括基于GS的扩增/选择***，如EP 0256055 B，EP 0323997 B和欧洲专利申请89303964.4中描述的那些。
在本发明的再一方面，提供制备IL-1β结合分子的方法，包括(i)培养用上述表达载体转化的生物和(ii)从培养物中回收IL-1β结合分子。
根据本发明，已发现ACZ 885抗体表现出对包括含有成熟人IL-1β的Glu 64残基的环的人IL-1β抗原性表位具有结合特异性。(成熟人IL-1β的Glu 64残基相应于人IL-1β前体的第180位残基。)该表位出现在IL-1受体的识别位点外，因此最令人惊奇的是针对该表位的抗体，例如ACZ885抗体能够抑制IL-1β与其受体的结合。对包括含有残基Glu 64的环的成熟人IL-1β抗原表位具有结合特异性且能够抑制IL-1β与其受体结合的抗体，尤其是嵌合的和CDR嫁接的抗体且特别是人抗体；以及这些抗体在治疗IL-1介导的疾病和病症中的用途是新的并包括在本发明的范围内。
因此，再一方面，本发明包括如下抗IL-1β抗体，该抗体对包括含有成熟人IL-1β的残基Glu 64的环的人IL-1β抗原表位具有抗原结合特异性且能够抑制IL-1β与其受体的结合。
其它方面，本发明包括：
i)抗IL-1β抗体在治疗IL-1介导的疾病或病症中的用途，其中所述抗体对包括含有残基Glu 64的环的成熟人IL-1β抗原表位具有抗原结合特异性且能够抑制IL-1β与其受体的结合；
ii)给患者治疗IL-1介导的疾病或病症的方法，所述方法包括给患者施用有效量的抗IL-1β抗体，其中所述抗体对包括含有残基Glu 64的环的成熟人IL-1β抗原表位具有抗原结合特异性且能够抑制IL-1β与其受体的结合；
iii)包含抗IL-1β抗体、以及可药用赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物，其中所述抗体对包括含有残基Glu 64的环的成熟人IL-1β抗原表位具有抗原结合特异性且能够抑制IL-1β与其受体的结合；和
iv)抗IL-1β抗体在制备用于治疗IL-1介导的疾病或病症的药物中的用途，其中所述抗体对包括含有残基Glu 64的环的成熟人IL-1β抗原表位具有抗原结合特异性且能够抑制IL-1β与其受体的结合。
为了本说明书的目的，如果一个抗体与ACZ 885抗体相比能够基本上以相同的程度抑制IL-1β与其受体结合，则该抗体“能够抑制IL-1β的结合”，其中“以相同程度”具有以上定义的含义。
ACZ 885抗体对IL-1的结合亲和力比以前报道的抗IL-1β抗体，如抗人IL-1β抗体对IL-1β的结合亲和力高。因此，ACZ 885与IL-1β结合的解离平衡常数KD小于约50pM，例如约35pM。此高结合亲和力使得ACZ抗体尤其适用于治疗性应用。
因此，再一方面，本发明提供与IL-1β结合的KD为约50pM或更少的抗IL-1β抗体。如上面就对包括含有Glu 64的环的成熟人IL-1β抗原决定簇有结合特异性的抗IL-1β抗体所描述的用途、方法和组合物一样，本发明此方面也包括涉及这些高亲和抗体的用途、方法和组合物。
在本说明书中，术语“IL-1介导的疾病”包括IL-1在其中对疾病或病况(包括疾病或病况的引起、发展、进程、持续或病理)直接地或间接地起作用的所有疾病和病况。
在本说明书中，术语“治疗”是指预防性或防止性治疗以及治愈性或疾病改善性治疗，包括对易于感染疾病或被怀疑已感染疾病的患者、以及患病的或已被诊断患有疾病或病况的患者的治疗，并包括对临床复发的抑制。
上述IL-1β结合分子，尤其是对包括含有Glu 64的环的成熟人IL-1β抗原表位具有结合特异性的根据本发明第一和第二方面的IL-1β结合分子，尤其是能够抑制IL-1β与它的受体结合的抗体；以及对于与IL-1β的结合而言具有约50pM或更少的KD的抗IL-1β抗体在这里均称作本发明的抗体。
优选地，本发明抗体是根据本发明第一和第二方面的IL-1β结合分子。有利地，本发明抗体是人抗体，最优选ACZ 885抗体或其直接等价物。
本发明抗体可以阻断IL-1β对其靶细胞的作用，因此适用于治疗IL-1介导的疾病和病症。本发明抗体的这些和其它药理学活性可以在标准试验方法，例如下述方法中得以证实：
对原代人成纤维细胞的IL-1β依赖性PGE2和白介素-6产生的中和作用
在原代人皮肤成纤维细胞中PGE2和IL-6的产生依赖于IL-1β。TNF-α单独不能有效地诱导这些炎症介质，但可以和IL-1协同起作用。原代皮肤成纤维细胞可以用作IL-1诱导的细胞激活的替代模型。
在存在各种浓度的本发明抗体或IL-1 RA(6-18,000pM)时，用重组IL-1β或从LPS刺激的人PBMC获得的条件培养基刺激原代人成纤维细胞。使用嵌合抗CD25抗体
Figure C0181451400151
(basiliximab)作为同种型匹配的对照。刺激16个小时后取上清液，并通过ELISA分析其中的IL-6。就抑制IL-6产生而言，当按上述测试时，本发明抗体典型地具有约1nM或更少(例如约0.1至约1nM)的IC50S。
正如上述试验中指出的，本发明抗体可以有力地阻断IL-1β的作用。因此，本发明抗体具有如下药物用途：
本发明抗体可以用于预防和治疗IL-1介导的疾病或病况，例如炎症、过敏反应和过敏性疾病、超敏反应、自身免疫病、严重感染和器官或组织移植排斥。
例如，本发明抗体可以用于治疗心脏、肺、心肺联合、肝脏、肾脏、胰脏、皮肤或角膜移植的受体，包括同种异体移植排斥或异种移植排斥，以及用于预防移植物抗宿主疾病(例如骨髓移植后的该疾病)和与动脉粥样硬化有关的器官移植。
本发明抗体尤其可以用于治疗、预防或改善自身免疫病和炎症，尤其是病因包括自身免疫成分在内的炎症，如关节炎(例如类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎和变形性关节炎)和风湿性疾病，包括涉及骨丧失、炎性疼痛、超敏反应(包括呼吸道超敏反应和皮肤超敏反应)和过敏的炎症和风湿性疾病。可以应用本发明抗体的具体自身免疫病包括自身免疫性血液病(包括如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少)、***性红斑狼疮、多发性软骨病、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肤癣菌病、慢性活动性肝炎、重症肌无力、银屑病、斯-约综合征、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎症性肠病(包括例如溃疡性结肠炎、局限性回肠病和肠易激惹综合征)、内分泌性眼病、格雷夫斯病、肉样瘤病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、幼年型糖尿病(I型糖尿病)、眼色素层炎(前和后色素层炎)、干燥性角结膜炎和春季性角结膜炎、间质性肺纤维化、银屑病关节炎和肾小球性肾炎(伴有或不伴有肾病综合征，例如包括特发性肾病综合征或微小病变肾病)。
本发明抗体还可以用于治疗、预防或改善哮喘、支气管炎、肺尘埃沉着病、肺气肿和其它阻塞性或炎症性呼吸道疾病。
本发明抗体可以用于治疗IL-1介导的或涉及IL-1(尤其是IL-1β)产生或IL-1促进的TNF释放的不良急性和超急性炎症反应，例如急性感染，如败血症性休克(如内毒素性休克和成人型呼吸道窘迫综合征)、软膜蛛网膜炎、肺炎；和严重烧伤；还可以用于治疗与病态TNF释放有关的、由感染、癌症或器官功能障碍导致的恶病质或消瘦综合征，尤其是AIDS相关性恶病质，如与HIV感染相关的或由其导致的恶病质。
对于治疗骨代谢疾病，包括骨关节炎、骨质疏松和其它炎症性关节炎，以及一般性骨丧失，包括老化相关的骨丧失，尤其是牙周病，本发明抗体尤其有用。
对于这些适应症，当然，适当的剂量将随例如待施用的具体的本发明抗体、宿主、给药模式和所治疗疾病的性质及严重性而改变。然而，在预防应用中，一般，在每千克体重约0.05mg至约10mg、更通常在每千克体重约0.1mg至约5mg的剂量下，显示出可获得满意的结果。对于预防性应用，给药频率正常为约每周一次至不超过约每3个月一次，更通常是约每2周一次至不超过约每10周1次，例如每4至8周一次。本发明抗体可以方便地通过肠胃外、静脉内(例如进入肘前或其它外周静脉内)、肌内或皮下途径给药。预防性治疗典型地包括每月一次至每2至3个月一次，或频率更低地施用本发明抗体。
本发明药物组合物可以按常规方式制备。优选提供冻干形式的本发明组合物。对于直接给药，可以将其溶解在适宜的含水载体，如注射用无菌水或无菌缓冲生理盐水中。如果期望配制成大体积溶液用于灌注，更确切地用于快速注射给药时，则有利的是在配制时将人血清白蛋白或患者自身的肝素化血液加入此盐水中。存在过量的此类生理惰性蛋白质可以防止由于灌注溶液使用的容器和管子的壁的吸附而引起的抗体丢失。如果使用白蛋白，则适宜的浓度为0.5至4.5％重量盐溶液。
在如下实施例中参照附图通过举例说明的方式对本发明作进一步描述，所述附图显示了可溶性IL-1受体I和II型对IL-1β结合的抑制作用的剂量反应曲线。
实施例
我们用构建的转基因小鼠(表达人IgG/κ的所有组成成份而非鼠免疫球的所有组成成份)(Fishwild等，1996，Nat Biotechnol.，第14卷，第845-851页)制备抗人IL-1β的抗体。通过标准杂交瘤技术使这些小鼠的B细胞永生化，并得到分泌人IgG1/κ抗体ACZ 885的鼠杂交瘤细胞。
实施例1：杂交瘤的产生和抗体的纯化
用佐剂中与KLH偶联的重组人IL-1β(50μg)通过皮下方式在几个位置免疫遗传改造的小鼠18077(Medarex Inc.Annadale，NJ)。给小鼠再进行5次加强免疫，其中最后一次注射在融合前3天进行。在融合当天，用CO2吸入法处死小鼠18077，用PEG 4000通过常规方法使脾细胞(4.1x107个)与等数量的小鼠骨髓瘤细胞系PAI-O细胞融合。在含有一层小鼠腹膜细胞(Balb C小鼠)饲养层的624个孔中接种融合细胞(1ml/孔)，所述孔中有补加了HAT的RPMI 1640、10％热灭活的胎牛血清、5x10-5 M β-巯基乙醇。收集上清液，用酶联免疫吸附测定方法(ELISA)检测并筛选IL-1β反应性单克隆抗体。鉴定出5个IgG/κ亚型的单克隆抗体。用4x96孔微量滴定板，按每个孔接种0.5个细胞进行克隆。两周后使用倒置显微镜观察这些孔。从生长阳性的孔中收集上清液，并通过ELISA评价抗IL-1β单克隆抗体的产生。从最初鉴定的杂交瘤#657的4个亚克隆制备1-2L条件上清液，并在A蛋白柱上通过亲和层析纯化抗体。
重链及轻链的纯化和部分氨基酸序列
氨基酸测序
用SDS-PAGE分离已经纯化的抗体ACZ 885的轻链和重链，并用Edman降解法测出氨基端的氨基酸。通过测序，这些研究中使用的抗体的纯度为≥90％。从克隆的杂交瘤细胞中得到mRNA，进而得到cDNA，用PCR扩增此cDNA得到编码重链可变区和轻链可变区的cDNA序列，对其进行全测序。在以下的Seq.Id No.1和Seq Id No.2中给出了重链可变区和轻链可变区的氨基端序列及相应的DNA序列，其中粗体显示了CDR。
ACZ885重链可变区Seq.Id.No.1
      ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAG
-19   M  E  F  G  L  S  W  V  F  L  V  A  L  L  R  G  V  Q  C  Q    -1
      GTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCC
      V  Q  L  V  E  S  G  G  G  V  V  Q  P  G  R  S  L  R  L  S    -21
      TGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTGTTTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCA
      C  A  A  S  G  F  T  F  S
Figure C0181451400181
W  V  R  Q  A  P    -41
      GGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATTTGGTATGATGGAGATAATCAATACTATGCA
      G  K  G  L  E  W  V  A
Figure C0181451400182
-61
      GACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTG
Figure C0181451400183
R  F  T  I  S  R  D  N  S  K  N  T  L  Y  L    -81
      CAAATGAACGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTATTGTGCGAGAGATCTTAGG
      Q  M  N  G  L  R  A  E  D  T  A  V  Y  Y  C  A  R
Figure C0181451400184
-101
      ACTGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTC
Figure C0181451400185
F  D  Y  W  G  Q  G  T  L  V  T  V  S  S    -118
ACZ885轻链可变区Seq.Id.No.2
      ATGTTGCCATCACAACTCATTGGGTTTCTGCTGCTCTGGGTTCCAGCCTCCAGGGGTGAA
-19   M  L  P  S  Q  L  I  G  F  L  L  L  W  V  P  A  S  R  G  E    -1
      ATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAGAAAGTCACCATC
      I  V  L  T  Q  S  P  D  F  Q  S  V  T  P  K  E  K  V  T  I    -21
      ACCTGCCGGGCCAGTCAGAGCATTGGTAGTAGCTTACACTGGTACCAGCAGAAACCAGAT
      T  C
Figure C0181451400191
W  Y  Q  Q  K  P  D    -41
      CAGTCTCCAAAGCTCCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCTTCTCAGGGGTCCCCTCGAGG
      Q  S  P  K  L  L  I  K  Y
Figure C0181451400192
G  V  P  S  R    -61
      TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACCCTCACCATCAATAGCCTGGAAGCTGAA
      F  S  G  S  G  S  G  T  D  F  T  L  T  I  N  S  L  E  A  E    -81
      GATGCTGCAGCGTATTACTGTCATCAGAGTAGTAGTTTACCATTCACTTTCGGCCCTGGG
      D  A  A  A  Y  Y  C
Figure C0181451400193
F  T  F  G  P  G    -101
      ACCAAAGTGGATATCAAA                                           -107
      T  K  V  D  I  K
斜体：前导序列(不在成熟抗体中)
粗体：CDR
重链和轻链表达载体的构建
使用基于GS的扩增/筛选***，如EP 0256055 B、EP 0323997 B或欧洲专利申请89303964.4中描述的那些，其中使用的选择标记是GS编码序列。
实施例2：生物化学和生物学数据
人单克隆抗体ACZ 885被发现可以在体外中和白介素-1β的活性。该单克隆抗体与重组人IL-1β的结合进一步通过Biacore分析来表征。使用可溶性IL-1受体通过竞争结合研究评价中和作用的方式。在响应IL-1β刺激的原代人细胞中测定抗体ACZ 885对重组和天然产生的IL-1β的生物学活性(实施例3)。
解离平衡常数的确定
用BIAcore分析测定重组人IL-1β与ACZ 885结合的结合与解离速率常数。固定ACZ 885，并通过表面等离子体共振(Surface plasmonresonance)测量它与浓度范围在1至4nM的重组IL-1β的结合。所选形式为单价相互作用，由此允许根据1∶1的化学计算处理IL-1β与ACZ885的结合事件。数据分析使用BIA评价软件进行。
  K<sub>结合</sub>[10<sup>5</sup>/Ms]   K<sub>解离</sub>[10<sup>-5</sup>/s]   K<sub>D</sub>[pM]
  人IL-1β   11.0+/-0.23   3.3+/-0.27   30.5+/-2.6   n＝22
结论：ACZ 885以很高的亲和力与重组人IL-1β结合。
使用可溶性I和II型IL-1受体进行的结合竞争研究
通过Biacore测量ACZ885与可溶性人I和II型IL-1受体间的竞争。将ACZ885固定在芯片表面，并在有或无递增浓度的重组人可溶性I型受体或II型受体(0-12nM；每个独立进行4次实验)时，注射重组人IL-β(1nM)以和ACZ885结合。所获结果见附图。
在存在重组人可溶性I型或II型IL-1受体时，测定NVP-ACZ885与人IL-1β的结合。使用Origin 6.0软件绘图确定最大值的一半(IC50)。给出平均值±SEM(n＝4)。
结论：ACZ885与I型和II型IL-1受体竞争和IL-1β结合。
与人IL-1α、人IL-1RA和来自其它物种的IL-1β的反应性情况
ACZ885与人IL-1α、人IL-1RA和食蟹猴、兔、小鼠及大鼠的IL-1β的反应性情况使用Biacore分析进行确定。固定ACZ885，以8nM浓度应用测试的细胞因子(独立运作6次)。
表3：NVP-ACZ885与IL-1β、IL-1α和IL-1Ra的交叉反应性
  结合％(平均值±SEM)
  重组人IL-1β(n＝6)   100
  重组食蟹猴IL-β(n＝11)   7.8+/-1.0
  重组兔IL-1β(n＝6)   -0.5+/-0.2
  重组小鼠IL-1β(n＝6)   -2.6+/-0.6
  重组大鼠IL-1β(n＝6)   -6.2+/-1.0
  重组人IL-1α(n＝6)   8.4+/-2.4
  重组人IL-1Ra(n＝6)   -3.7+/-1.7
注射开始后以1000s读取共振单位；从所有的传感图(sensorgram)中扣除实验运行缓冲液的注射，并在固定抗Fcγ后将基线设定为零。结合以人IL-1β的累积共振单位的百分数表示。
结论：ACZ885不与人IL-1α、人IL-1RA和食蟹猴、兔、小鼠及大鼠的IL-1β发生显著交叉反应。
实施例3
ACZ885对人皮肤成纤维细胞的IL-6释放的中和作用
使用如下方法学评价ACZ885中和人IL-1β的作用的生物学活性：
1.制备含有IL-1β的条件培养基
按如下方式从人外周血单核细胞制备条件培养基：根据Hansel的方法[Hansel，T.T.等(1991)，用于分离高纯度的人血嗜酸性细胞的改良免疫磁方法，J.Imm.Methods 145：105-110]，使用Ficoll-Hypaque密度分离从猴的外周血中制备单核的细胞；以105个细胞/孔的浓度在RPMI/10％ FCS中使用这些细胞。加入IFNβ(100U/ml)和LPS(5μg/ml)，随后孵育细胞6小时。1200RPM离心10分钟终止孵育。使用ELISA定量上清液中的IL-1β。
2.中和试验
从Clonetics获得人***的皮肤成纤维细胞(CC-2509)，培养在包括bFGF(1ng/ml，CC-4065)、胰岛素(5βg/ml，CC-4021)和2％FCS(CC-4101)的FBM(Clonetics，CC-3131)中。
为了诱导IL-6，将细胞接种在48孔的Tissue Cluster中，密度为每孔104个细胞。第二天，在含有2％FCS的FBM中使细胞饥饿6-7小时，之后加入细胞因子。为了进行刺激，将培养基替换为含有适当量的条件培养基的FBM+2％ FCS，以便达到约50pg/ml IL1β。或者，以终浓度50pg/ml使用重组人IL-1β。
在加入细胞前，在该稀释的条件培养基中滴定抗IL-1β中和抗体。使用重组IL-1Ra(R&D Systems#280-RA-010)作为阳性对照。
刺激后16至17小时取细胞上清液，在夹心ELISA中测定释放的IL-6的量。
3.IL-6 ELISA
用PBS 0.02％ NaN3中的小鼠抗人IL-6 MAb(314-14(NovartisPharma；批号EN23,961，5.5mg/ml)；100μl，3μg/ml)包被ELISA微量滴定板，+4℃孵育过夜。第二天，用PBS/0.05％ Tween/0.02％ NaN3洗涤微量滴定板4次，然后用300μl的PBS/3％牛血清白蛋白(BSA)/0.02％ NaN3封闭3小时。再洗涤微量滴定板(4次)，一式两份加入100μl上清液(1∶20的最终稀释物)或100μl重组人IL-6标准品((Novartis Pharma #91902)，滴定曲线按2倍稀释步骤从1至0.0156ng/ml)。RT过夜孵育后，洗涤板子(4次)，加入不同的小鼠抗人IL-6 MAb(110-14，Novartis Pharma；6.3mg/ml)；100μl，1μg/ml；室温3小时)。再洗涤4次后，以终浓度1/10000加入生物素标记的山羊抗小鼠IgG2b抗血清(Southern Biotechnology；#1090-08)(100μl/孔；室温3小时)。孵育后，洗涤板子4次，以终浓度1/3000加入链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶(Jackson Immuoresearch，#016-050-084)(100μl/孔；室温30分钟)。洗涤(4次)后，加入底物(二乙醇胺缓冲液中的对硝基苯磷酸；100μl)30分钟。每孔加入50μl 1.5M NaOH阻断反应。使用405和490nm的滤光器在微量滴定读数仪(Bio-Rad)上对板子进行读数。
培养基上清液中的IL-6水平参考标准曲线使用三次曲线拟合进行计算。基于S形曲线拟合进行统计学评价和IC50确定。
结果：
表：对IL-1β诱导的IL-6分泌的抑制
  NVP-ACZ885批次1IC<sub>50</sub>[pM]±SEM   NVP-ACZ885批次2IC<sub>50</sub>[pM]±SEM   IL-1raIC<sub>50</sub>[pM]±SEM
IL-6分泌条件培养基   54±6.1(9.1±1.0ng/ml)(n＝6)   44.6±3.6(7.4±0.6ng/ml)(n＝6)   30±3.1(0.51±0.05ng/ml)(n＝5)
IL-6分泌重组人IL-1β   42±3.4(7.1±0.56ng/ml)(n＝4)   63±2.8(10.5±0.5)(n＝6)   nd
对IL-1β诱导的人皮肤成纤维细胞的IL-6分泌的抑制的IC50值。
成纤维细胞用重组人IL-1β或含有50-100pg/ml IL-1β的条件培养基进行刺激。
实施例4
针对ACZ885的表位的确定
ACZ885以高亲和性与人IL-1β结合，但不能识别来源于恒河候的高度同源IL-1β。恒河候IL-1β和人IL-1β在氨基酸序列上的一个最突出区别在于成熟IL-1β的第64位。在该位置上人IL-1β具有谷氨酸，而恒河候IL-1β具有丙氨酸。具有Glu64Ala相应替换的突变人IL-1β丧失其以可检测的亲和性与ACZ885结合的能力。我们得出结论：人IL-1β中的Glu64是抗体ACZ885进行识别所必需的。Glu64位于IL-1β的一个环上，该环并不是与IL-1βI型受体结合的表面的一部分，也不与该结合表面紧邻。由此，抗含有Glu64的结合表位的抗体具有中和人IL-1β生物学活性的潜力。

Claims (9)

1.包含重链可变区VH和轻链可变区VL的IL-1β抗体，其中重链可变区VH的氨基酸序列为Seq.Id.No.1的1-118位，轻链可变区VL的氨基酸序列为Seq.Id.No.2的1-107位，并且在VH中的CDR1的氨基酸序列为Val-Tyr-Gly-Met-Asn，CDR2的氨基酸序列为Ile-Ile-Trp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，CDR3的氨基酸序列为Asp-Leu-Arg-Thr-Gly-Pro，和在VL中的CDR1’的氨基酸序列为Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Ser-Ser-Leu-His，CDR2’的氨基酸序列为Ala-Ser-Gln-Ser-Phe-Ser，CDR3’的氨基酸序列为His-Gln-Ser-Ser-Ser-Leu-Pro。
2.根据权利要求1的IL-1β抗体，其是人抗体。
3.包含抗原结合位点的IL-1β抗体，其中所述抗原结合位点具有与Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸并终止于第118位氨基酸的序列一致的氨基酸序列的第一域和具有与Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸并终止于第107位氨基酸的序列一致的氨基酸序列的第二域。
4.用于制备IL-1β抗体的DNA组合构建体，由编码重链或其片段的第一DNA构建体和编码轻链或其片段的第二DNA构建体组成，其中第一DNA构建体包含a)编码交替地包含高变区和构架区的可变区的第一部分，所述高变区顺次是氨基酸序列显示在Seq.Id.No.1中的CDR1、CDR2和CDR3；该第一部分起始于编码可变区的第一个氨基酸的密码子并终止于编码可变区的最后一个氨基酸的密码子，和b)编码重链恒定部分或其片段的第二部分，其起始于编码重链恒定部分的第一个氨基酸的密码子并终止于编码该恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子，之后接终止密码子；第二DNA构建体包含a)编码交替地包含高变区和构架区的可变区的第一部分；所述高变区顺次是氨基酸序列显示在Seq.Id.No.2中的CDR1’、CDR2’和CDR3’；该第一部分起始于编码可变区的第一个氨基酸的密码子并终止于编码可变区的最后一个氨基酸的密码子，和b)编码轻链恒定部分或其片段的第二部分，其起始于编码轻链恒定部分的第一个氨基酸的密码子并终止于编码该恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子，之后接终止密码子。
5.能够在原核或真核细胞系中复制的单一表达载体，其中在所述单一表达载体中包含根据权利要求4的DNA组合构建体。
6.制备IL-1β抗体的方法，其包括(i)培养用根据权利要求5的表达载体转化的生物和(ii)从该培养物中回收IL-1β抗体。
7.根据权利要求1的IL-1β抗体，所述IL-1β抗体对包括含有Glu64残基的环的成熟人IL-1β抗原表位具有抗原结合特异性且能够抑制IL-1β与其受体的结合。
8.含有权利要求1-3和7之任一项的IL-1β抗体以及可药用赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物。
9.权利要求1-3和7之任一项的IL-1β抗体在制备用于治疗IL-1β介导的疾病或病症的药物中的用途。
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