CN100540047C - Trap蛋白在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的药品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TRAP蛋白在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的药品中的用途。外源使用TRAP蛋白(指天然的TRAP蛋白或基因工程重组TRAP蛋白)对金黄色葡萄球菌外毒素的产生具有很好的抑制作用，降低了金黄色葡萄球菌致病性；此外应用TRAP蛋白药物治疗金黄色葡萄球菌感染时必定引起人机体产生针对TRAP的抗体，这种抗体又能进一步发挥抑制金黄色葡萄球菌外毒素产生的作用，这种双重作用提高了药物的作用效果，而且提供了一种全新的药物作用模式；此外，TRAP蛋白的作用只是针对细菌的毒性，而不影响细菌的生长，因而不易使细菌产生耐药性，所以TRAP蛋白对已耐药的金黄色葡萄球菌也同样有效；由于在人类基因组中未发现同源序列，所以使用TRAP蛋白药物也不会引起人类免疫性疾病。

Description

TRAP蛋白在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的药品中的应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体地说涉及TRAP蛋白在制药中的应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌，Staphylococcus aureus)属葡萄球菌属，是人类的一种重要病原菌，能够引起肺炎、心内膜炎、烧伤及战伤感染、败血症、中毒性休克等多种严重感染。金葡菌也是引起食物中毒的一种细菌。金葡菌广泛分布于空气、土壤、水及食具中。人和动物具有较高的带菌率。金葡菌能够在人群密集的区域通过唾沫，接触进行大规模传播。每年仅医院内感染金葡菌的人数就超过数百万。它是革兰阳性菌脓毒症的主要致病菌，也是烧伤创面感染、急性肝衰竭的重要病原菌。

金葡菌的主要致病物质是外毒素，包括溶血毒素、杀白细胞素、肠毒素等。最新研究表明，金葡菌这些毒力因子的合成是受一种可调节RNA分子，即RNAIII控制的。RNAIII激活毒力因子的基因转录，通过碱基互补调节毒力因子的翻译。在细菌生长的对数早期其RNAIII水平低，但到对数晚期RNAIII水平会增加40倍，而RNAIII的水平是由金葡菌自身分泌的RNAIII激活蛋白(RNA IIIactivating protein，以下简称RAP)调节的，故因子RAP又称为金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持续分泌RAP，在RAP达到一定浓度后才有激活毒力因子产生的作用。没有RAP产生的金葡菌本身并不致病(Balaban，N.et al.Science 1995，280，438-440)。研究发现，RAP激活RNAIII的转录是通过一个21kD的RNAIII激活蛋白的靶蛋白(Target of RNAIII activating protein，以下简称TRAP)介导的，当TRAP蛋白的编码基因被突变失活后，RAP不能够激活RNAIII的转录。TRAP由167个氨基酸组成，具有His激酶活性。TRAP蛋白在金葡菌生长的早期开始磷酸化，在对数生长中期达到最大水平。在RAP作用后，通过自身磷酸化来进行信号传导，从而介导细胞内RNAIII水平上升，加速金葡菌外毒素的分泌(Naomi B，et al，J.Biol.Chem 2001，276：2658-2667)。TRAP蛋白是金葡菌表面蛋白，在葡萄球菌属中高度保守。TRAP蛋白主要生物学功能是参与金葡菌毒素调控，随着TRAP蛋白磷酸化水平的升高，金葡菌的外毒素水平上调(Gov Y，et al.J Biol Chem 2004，279：14665-72)。

研究发现通过抑制上述金葡菌毒素产生的RAP和TRAP通路，可以有效的降低金葡菌的致病作用。RAP和TRAP的抑制剂如小分子抑制肽(RNAIII inhibitingpeptide，简称RIP)、抗体都可以有效的降低金葡菌外毒素的分泌。TRAP蛋白的C末端可以成为有效的肽疫苗来保护机体抵抗金葡菌引起的感染(Oleny V，etal.Peptides 2001，22：1621-1627；Yang，G.，et al.Peptides 2003，24，1823-1828；Yang，G，et al.J Biol Chem 2005，280：27431-27435)。

目前解决金匍菌感染的问题的主要方法是抑制上述金匍菌毒素产生的通路从而减少金匍菌毒素的产生，如通过RIP、RAP抗体等，从而降低金匍菌的致病作用。一个美国专利《RNAIII激活蛋白的靶蛋白(TRAP)》(专利申请号：953780)以一种金黄色葡萄球菌为例说明TRAP蛋白的DNA序列和氨基酸序列，并对含有TRAP蛋白的核苷酸序列、氨基酸序列、多肽，以及核苷酸序列的启动子、重组载体、试剂盒、寄主细胞以及产生相应产物的方法申请了专利。其已放弃的前一专利《RNAIII激活蛋白的靶蛋白(TRAP)》(专利申请号：393862)将TRAP蛋白和作为诱导产生抗体和作为药物的成分申请了专利保护，并提出了通过单克隆或者多克隆抗体抑制TRAP蛋白从而抑制金黄色葡萄球菌感染的产生的方法。

但是，抗生素的滥用导致金葡菌耐药性不断增强，目前已经出现的耐药菌株包括对β-内酰胺类抗生素耐药的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐糖肽类抗生素的耐糖肽金葡菌(GISA)、耐万古霉素的金葡菌(VRSA)等。由于金葡菌极易产生耐药性且无好的解决方法，常用的许多抗生素对之无效，因此找到一种既能有效控制控制金葡菌感染又不易产生抗药性的药物是临床医学殛待解决的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种能有效抑制和治疗金黄色葡萄球菌感染、又不易产生抗药性和耐药性的药物。

本发明通过以下方式实现：

TRAP蛋白在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的药品中的应用。

上述应用中所述的TRAP蛋白包括天然的TRAP蛋白、重组TRAP蛋白、完整的TRAP蛋白或者是生物学上有活性的片段。

上述应用中所述的TRAP蛋白来自于葡萄球菌。

上述应用中所述的TRAP蛋白来自于金黄色葡萄球菌。

上述中应用中所述的TRAP蛋白可以是通过基因工程重组得到。

上述中应用中所述的药品可以是TRAP蛋白与其他蛋白构成的融合蛋白。

上述中应用中所述的药品可以是TRAP蛋白的化学修饰物。

上述中应用中所述的药品可以是包含TRAP蛋白的组合物。

上述应用中所述的药品按照通常的方式可以制备成各种剂型。

上述应用中所述的药品可以口服或者注射或者局部应用。

本发明发现，在细胞模型和金葡菌感染的动物模型上，外源性TRAP蛋白(指加入天然纯化的TRAP蛋白或表达纯化的基因工程重组TRAP)本身就对金葡菌外毒素的产生具有很好的抑制作用，降低金葡菌致病性，其效果与TRAP蛋白的多克隆抗体类似。

本发明发现，TRAP蛋白在抗金葡菌感染方面有着双重作用，即蛋白本身和其抑制剂或抗体会达到同样效果，它将代表一类全新的药物作用方式。

本发明还发现，应用TRAP治疗金葡菌感染时，必定会引起人机体产生针对TRAP的抗体(因为TRAP是细菌来源的外源蛋白)。对传统药物来说，抗体的产生意味着对药物作用的抑制，但是对TRAP来说，产生的抗体恰恰有用。

本发明发现，多种不同金葡菌菌株来源的TRAP蛋白具有相同的抑制金葡菌外毒素的产生、降低金葡菌致病性的作用。

本发明的优点在于：

(1)、本发明发掘了TRAP蛋白在制备药品中的新用途，开辟了将细菌细胞膜相关蛋白用于制备治疗药物的新领域，它代表了一种全新的药物模式。

(2)、本发明的TRAP蛋白在人类基因组中未发现同源序列，所以不会引起人类免疫性疾病。

(3)、TRAP蛋白在抑制金黄色葡萄球菌产生毒素的同时，也刺激机体本身产生相应的抗体，而产生的抗体又能进一步发挥抑制金葡菌外毒素产生的作用，这种TRAP蛋白先起作用，因该蛋白而产生的抗体又继续发挥同样作用的模式提供了一种全新的药物作用模式。

(4)、应用TRAP蛋白药物治疗金黄色葡萄球菌感染，由于它主要是抑制毒素产生，降低金葡菌致病性，对细菌本身的生存没有影响，所以不易导致抗药性或者耐药性的产生，这种药物对于已经产生耐药性的葡萄球菌也同样能发挥作用。

附图说明

图1：不同来源的外源TRAP蛋白对金葡菌外毒素产生的影响的柱状图。(注：其中的数字代表TRAP的来源：1.GenBank^TM接受号：AF202641蛋白组；2.GenBank^TM接受号：AY248703；3.从金葡菌中纯化的天然TRAP蛋白组；4.TRAP蛋白与12个氨基酸的多肽构成的融合蛋白；5.为正常细胞对照；6.生理盐水对照组)。

图2：外源TRAP蛋白对小鼠体内TRAP抗体产生的影响的柱状图。(注：1.TRAP处理组2.盐水对照组3.阴性对照)。

具体实施方式

下面以几个实施例来具体说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

制备实施例1

两个金葡菌家族(TRAP蛋白(GenBank^TM接受号：AF202641/AY248703))的TRAP蛋白的获得。按照Yang，G，et al.(2005)的方法，根据GenBank的碱基序列，设计引物，通过PCR的方法分别从RN6390B和04018两种菌株的基因组扩增TRAP基因，克隆入pET-28a载体，转化大肠杆菌，通过IPTG诱导表达，利用Ni²⁺亲和树脂纯化，获得两种相应的TRAP蛋白。

制备实施例2

天然TRAP蛋白的制备利用重组的TRAP蛋白制备多抗，将重组的TRAP蛋白偶联CNBr活化的Sepherose4B制备亲和株纯化抗体，将纯化的抗体偶联CNBr活化的Sepherose4B，通过亲和纯化的方法从金葡菌RN6390B超声上清中纯化TRAP蛋白，通过HPLC进一步纯化，获得天然纯化的TRAP蛋白，纯度都大于95％。

制备实施例3

TRAP蛋白与12个氨基酸的多肽构成的融合蛋白的制备：选择无关肽序列(TPSIPSLWWTTP-沈彤等，细胞与分子免疫学2002，18：623-626)，设计引物，通过PCR的方法获得表达TRAP-无关肽融合蛋白的基因序列，克隆入pET-28a载体，通过IPTG诱导表达，转化大肠杆菌，利用Ni²⁺亲和树脂纯化，获得TRAP蛋白与12个氨基酸的多肽构成的融合蛋白。

实施例1

利用MTT法在MDBK细胞模型上检测多种来源的TRAP蛋白对金葡菌外毒素的影响

(1)、37℃过夜培养金葡菌；将制备实施例1、制备实施例2和制备实施例3制备和纯化的各种TRAP蛋白分别溶解于生理盐水，终浓度为2μg/μl；

(2)、将过夜菌离心(5,000rpm/5min)收集菌体，用培养基重旋稀释至OD_600nm＝8，1∶100转接于0.9ml培养基中；

(3)、同时加入步骤(1)的100μlTRAP蛋白，以100μl生理盐水为对照，培养6小时；

(4)、离心(10,000rpm/5min)收集上清，煮沸10分钟，再次离心(10,000rpm/5min)收集上清；

(5)、接种MDBK细胞，1×10⁴/孔，在CO₂孵箱中，37℃培养4小时贴壁；

(6)、将细菌培养上清加入MDBK细胞培养液中(10μl/孔)，CO₂孵箱中37℃培养24小时；

(7)、MTT测定细胞的存活情况。

(8)、图1纵坐标反映细胞存活情况，OD值越高，结果表明细胞存活越多，金葡菌外毒素产生越少。从图1可以看出外源加入TRAP蛋白的各组细胞存活情况良好，而没有加入外源TRAP蛋白的细胞存活情况不好，说明外源加入TRAP蛋白能够降低金葡菌外毒素的产生，此外，不同来源的TRAP蛋白抑制金葡菌外毒素产生的效果无显著性差别。

实施例2

腹腔感染动物模型上检测TRAP蛋白对金葡菌感染的治疗作用

(1)、材料准备

BALB/c小鼠购自军事医学科学院动物中心，其余材料同制备实施例1和制备实施例3。

(2)、37℃过夜培养金葡菌；将制备实施例1中获得和纯化的两种基因工程重组TRAP蛋白和制备实施例3中获得和纯化的TRAP融合蛋白分别溶解于生理盐水，终浓度为2μg/μl；

(3)、将过夜菌离心(5,000rpm/5min)收集菌体，用培养基重悬稀释至OD_600nm＝8。1∶100转接于1ml培养基中，37℃培养至OD_600nm＝5，离心收集菌体，用等体积的生理盐水重悬；

(4)、BALB/c小鼠(20-25g，雄性)，每组20只，共4组；

(5)、腹腔注射金葡菌100μl，5小时后腹腔注射各种TRAP蛋白，以生理盐水为对照；

(6)、记录各组小鼠的存活时间和存活状态，结果TRAP蛋白可以有效地降低金葡菌对小鼠的感染，增加感染小鼠存活率(见表1)。

表1TRAP蛋白对金葡菌感染的治疗作用

注：组1为TRAP(GenBank^TM接受号：AF202641)蛋白处理组；组2为TRAP(GenBank^TM接受号：AY248703)蛋白处理组；组3为TRAP蛋白与12个氨基酸的多肽构成的融合蛋白处理组；组4为生理盐水对照组。

实施例3

多次注射TRAP蛋白对小鼠体内抗体产生的影响

(1)、材料方法同制备实施例1和制备实施例2，不同的是腹腔注射TRAP(GenBank^TM接受号：AF202641)共3次，每7天一次。一个月后收集小鼠血清，ELISA测定小鼠体内TRAP抗体产生情况；

(2)结果：多次注射TRAP在小鼠体内能够产生TRAP抗体，而没有注射的则基本没有抗体，说明外源TRAP能够诱导动物体内产生TRAP抗体(见图2)

参考文献

1、Balaban et al.Science 1998，vol.280：438-440.

2、Naomi B，et al，J.Biol.Chem 2001，276：2658-2667.

3、Yang，G，et al.J Biol Chem 2005，280：27431-27435.

4、沈彤等，细胞与分子免疫学2002，18：623-626

Claims (7)

1、TRAP蛋白在制备体外直接抑制金黄色葡萄球菌外毒素产生的产品中的应用，所述的应用不依赖机体产生的TRAP蛋白特异性抗体。

2、按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述的TRAP蛋白是天然的TRAP蛋白或重组TRAP蛋白。

3、按照权利要求2所述的应用，其特征在于所述的TRAP蛋白来自于葡萄球菌。

4、按照权利要求3所述的应用，其特征在于所述的TRAP蛋白来自于金黄色葡萄球菌。

5、按照权利要求2所述的应用，其特征在于所述的TRAP蛋白来自于基因重组。

6、按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的产品是含有TRAP蛋白与12个氨基酸的多肽TPSIPSLWWTTP构成的融合蛋白。

7、按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的产品是含有TRAP蛋白的组合物。

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