CN101175507A - Rip在治疗金黄色葡萄球菌感染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的组合物将RNAIII－抑制肽(RIP)与能够结合并中和细菌胞外被膜的脂质和聚阴离子组分的抗微生物肽，如cathelicidin，组合在一起。在另一个实施方式中，RIP与抗生素组合在一起，存在或不存在抗微生物肽。本发明的组合物有利地用于治疗细菌性脓毒症的方法。

Description

RIP在治疗金黄色葡萄球菌感染中的应用
相关申请的交叉参考
本申请要求于2005年4月4日提交的美国临时专利申请第60/668,132号的优先权，在此将其全部内容并入作为参考。
技术领域
本中请主要涉及治疗细菌感染或降低其风险的药理组合物和方法，具体地，涉及包括RNAIII-抑制肽和抗微生物肽和/或抗生素的组合物，上述抗生素为氨基糖苷、β-内酰胺、头孢菌素(caphalosoprin)或万古霉素(vancomycin)。
背景技术
脓毒症
尽管有抗微生物药物的改进和更好的支持治疗，脓毒症仍然是最主要的死亡原因。脓毒症与全身炎症、循环衰竭和多器官功能障碍综合征(MODS)有关。如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的革兰氏阳性微生物、和革兰氏阴性细菌均可以导致脓毒症。脓毒症的发病率目前正在升高。Angus等人，Crit.Care Med.29：1303-10(2001)。革兰氏阴性细菌从其外膜上释放出脂多糖(LPS)或内毒素，引起脓毒性休克。相反，一些***通过释放肠毒素和外毒素引起脓毒性休克，肠毒素是细菌超抗原蛋白家族中的23至29kDa的多肽，如中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)，外毒素是例如致热外毒素A。外毒素是对宿主有有害作用的改变宿主细胞正常代谢的可溶性物质，而肠毒素是对肠细胞有特异性的外毒素。参见De Kimpe等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 92：10359-63(1995)；Kengatharan等人，J.Exp.Med.188：305-15(1998)；Llewelyn等人，Lancet Infect.Dis.2：56-162(2002)；Van Amersfoort等人，Clin.Microbiol.Rev.16：379-414(2003)。
已经显示***的细胞壁组分肽葡聚糖(peptidoglygan，PG)和脂磷壁质酸也会产生炎症反应。PG具有刚性结构，由与N-乙酰基胞壁酸(β1-4)-连接的N-乙酰基葡糖胺重复单元组成。LTA分子包括重复的聚(polyolphosphate)单元，对于存在的用glycosil残基或D-丙氨酸修饰的醛醇基团是高度可变的。LTA通过与同样介导响应脂多糖的表面受体CD 14结合来激活巨噬细胞和多形核白细胞。LTA与PG协同作用，释放出TNF-α和IL-6，并诱导氧化一氮合成酶(NOS)等，导致循环衰竭、MODS和死亡。参见De Kimpe(1995)；Kengatharan(1998)；Heumann等人，Infect.Immunol.62：2715-21(1994)；Scott等人，Infect.Immunol.69：875-88(2001)。
群体感应和RNAIII-抑制肽
最近的研究已经证实了群体感应(quorum-sensing)在细菌物种病理学中的重要性，上述细菌物种包括霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌。群体感应是细菌种群通过其从相邻细胞接收输入并发出适当响应以使自身能够在宿主内存活的机制。参见Balaban等人，Science 280：438-40(1998)；Miller等人，Cell 110：303-14(2002)；Hentzer等人，EMBO J.22：3803-15(2003)；Korem等人，FEMS Microbiol Lett.223：167-75(2003)。在葡萄球菌属中，群体感应控制着细菌毒力中牵涉的蛋白的表达，包括集群、侵染和涉及引起疾病的多种毒素的产生。这些毒性因子中的一些是肠毒素和中毒性休克综合征毒素-1(TSST-I)，其充当着导致宿主免疫***过激的超抗原，导致细胞因子的过度释放，诱发T细胞的过度增殖。
在金黄色葡萄球菌的群体感应体系中，效应器群体感应分子RNAIII-活化肽(RAP)使“RNAIII-活化蛋白靶”(TRAP)磷酸化，TRAP是一种在葡萄球菌中高度保守的21kDa蛋白。TRAP磷酸化促使细菌的粘附、以及调节RNA分子命名的RNAIII(其造成毒素合成)的下游生成。Balaban(1998)；Balaban等人，J.Biol.Chem.276：2658-67(2001)。一种称为RNAIII-抑制肽(RIP)的RAP拮抗剂抑制TRAP的磷酸化，从而有力地抑制毒性因子的下游生成、细菌粘附、生物膜形成和体内感染。RIP的作用机制与通常的抗生素不同：RIP并不杀死细菌，而是抑制细菌的细胞-细胞通讯，使得宿主防御机制更容易收到细菌的攻击。参见Balaban(1998)；Balaban等人，Peptides 21：1301-11(2000)；Gov等人，Peptides 22：1609-20(2001)；Balaban等人，J.Infect.Dis.187：625-30(2003)；Cirioni等人，Circulation 108：767-71(2003)；Ribeiro等人，Peptides 24：1829-36(2003)；Giacometti等人，Antimicrob.Agents Chemother.47：1979-83(2003)；Balaban等人，Kidney Int.23：340-45(2003)；Balaban等人，Antimicrob.Agents Chemother.48：2544-50(2004)；Dell′Acqua等人，J.Infect.Dis.190：318-20(2004)。
抗微生物肽
遗传编码的抗微生物肽是大多数多细胞生物体中自身免疫反应的重要组成部分，代表着宿主防御微生物群的第一道防线。抗微生物肽具有多效免疫调节功能，并且被赋予直接抗微生物活性和LTA/LPS-结合能力。循环吞噬细胞中的抗微生物肽有助于杀灭吞没的微生物，它们在上皮表面起到局部防御机制的作用，保护解剖学壳板(compartment)免受微生物侵入。参见Cannon，Nature 328：478(1987)；Scott(1999)；Hancock等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 97：856-61(2000)；Giacometti等人，Gut 52：874-78(2003)；Gough等人，Infect.Immun.64：4922-27(1996)。
Cathelicidin是一族若干哺乳动物物种在上皮表面上以及在吞噬细胞微粒内作为非活性前体产生的相关的抗微生物肽。Cathelicidin针对革兰氏阴性细菌、***和真菌均发挥广谱的抗微生物活性，其在特异性方面与抗微生物肽物种具有宽的重叠，但在效力方面具有显著的差异。与其它抗微生物肽类似，cathelicidin与LPS结合，并中和其促炎作用。参见Zanetti等人，FEBS Lett.374：1-5(1995)；Zanetti等人，Curr.Pharm.Des.8：779-93(2002)；Zanetti等人，J.Leuk.Biol.75：39-48(2004)；Giacometti等人，Amer.J.Resp.Crit.Care Med.169：187-94(2004)。
Cathelicidin包括BMAP-28，一种长度为27个氨基酸的肽，其一级氨基酸序列为GGLRSLGRKILRAWKKYGPIIVPIIRI-NH2，且C-端被酰胺化。BAMP-28在亚微摩尔浓度下在体外杀灭对抗生素有耐受性的临床分离物，并且它在生理盐水浓度中保持很强很宽的活性谱。BMAP-28在极性腹膜炎模型中在体内有效保护小鼠免受致死的腹膜内感染。参见Skerlavaj等人，J.Biol.Chem.71：28375-81(1996)；Benincasa等人，Peptides 24：1723-31(2003)。
传统抗生素在应对隐伏的(underlying)脓毒症和其它严重疾病的病理学时效果越来越差。例如，目前葡萄球菌由于其获取抗生素耐受性的能力被视为“超级缺陷”。因此，持续需要有治疗细菌感染，特别是***如金黄色葡萄球菌的更好的组合物和方法。
发明内容
本发明提供一种包括RIP和抗微生物肽的治疗组合物，以满足对治疗细菌感染相关疾病，特别是葡萄球菌脓毒症的持续需求。RIP自身抑制LTA-诱导的TNF-α和NO的产生，并且RIP和cathelicidin抗微生物肽协同抑制LTA-诱导的TNF-α和NO的产生。当体内给药时，RIP自身降低死亡率和菌血症，并且RIP和cathelicidin抗微生物肽在体内协同作用，降低死亡率和菌血症。尽管本发明的组合物可以与传统的抗生素化学疗法结合使用，但本发明的组合物有利地对抗抗生素耐受性细菌有效，可以用作传统化学疗法的替换品。
根据本发明的第一个方面，组合物包括RIP和聚阳离子抗微生物肽，所述聚阳离子抗微生物肽能够结合并中和细菌胞外被膜(cellenvelope)的脂质的和聚阴离子的组分，如LTA或LPS。本发明的组合物可以使用的抗微生物肽包括cathelicidin，例如人cathelicidin或BMAP-28。
组合物可以进一步包括传统的抗生素或其它药物可接受药剂，例如辅助或延缓组合物被宿主吸收的药剂。可以包括药物剂，例如，脂质体或纳米颗粒，以辅助组合物向所需部位或细胞类型的传递和靶向。组合物可以配制为用于通过任何可接受的方法给药，例如局部涂敷、摄入或肠胃外给药、或者作为医疗装置的涂层。
RIP可以包括序列YX2PX1TNF的五个邻接的氨基酸，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，X2是K或S；或者氨基酸的序列因两个取代或缺失而与序列YX2PX1TNF不同，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，X2是K或S。在一个实施方式中，RIP并非由序列YSPX1TNF组成，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸。另外可选地，RIP可以包括序列因一个取代或缺失而与序列YX2PX1TNF不同的氨基酸，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，X2是K或S。在其它的不同实施方式中，RIP包括氨基酸序列YKPX1TNF，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸；氨基酸序列IKKYX2PX1TNF，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，X2是K或S；或者序列PCTNF、YKPITNF或YKPWTNF之一。RIP的长度可以是10个氨基酸，其可以占组合物的大约0.1wt％至50wt％，或者组合物的大约2wt％至20wt％。
根据本发明的第二个方面，治疗细菌感染相关疾病的方法包括给予哺乳动物个体如下组合物，其包括RIP、和能够结合并中和细菌胞外被膜的脂质和聚阴离子组分(如LTA或LPS)的抗微生物肽。本发明的方法在治疗细菌感染或降低其风险方面特别有利，上述细菌感染包括细菌胞外被膜的脂质和聚阴离子组分导致的炎症反应，例如细菌脓毒症。该方法可以用于治疗全身细菌感染，或者位于特定组织、皮肤或身体部位的感染。感染也可以与其它疾病相关，例如蜂窝织炎、角膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎或乳腺炎。给药可以通过局部、口服、静脉内、腹膜内、肌内、经皮、经鼻或离子导入(iontophoretic)途径，例如通过depot型***、胶囊形式、或植入。
本发明还可以用于治疗生物膜相关的细菌感染，或者降低生物膜相关疾病的风险，特别是那些病理学涉及由细菌胞外被膜的脂质和聚阴离子组分引起的炎症反应的疾病。例如，本发明的组合物可以用于涂覆***到个体中的装置，以降低植入的装置产生生物膜的风险。
该方法还可以实施于具有患有或疑似患有由细菌导致的感染的风险的个体，例如受到烧伤、外伤等的个体。另外可选地，可以给予组合物，以治疗持续的感染、延缓细菌感染症状的发作、或者降低感染发生的风险。
在一个实施方式中，接受组合物的个体被***或其抗生素耐受性菌株感染或有被其感染的风险，***是例如链球菌属(Streptococcus ssp)，包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。在其它实施方式中，病原可以是李斯特氏菌属(Listeriaspp)，包括无害李斯特氏菌(L.innocua)和单核增生李斯特氏菌(L.monoctogenes)，乳球菌属(Lactococcus spp)，肠球菌属(Enterococcusspp)，大肠杆菌(Escherichia coli)，Clostridium acetobtylicum，和芽孢杆菌属(Bacillus spp)，包括枯草杆菌(B.subtilus)、炭疽杆菌(B.anthracis)和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)，或其抗生素耐受性菌株。该方法可以包括通过任何药理学可接受的方式给予组合物，例如局部涂敷、摄入、肠胃外给药、或者作为医疗装置的涂层。
根据本发明的第三个方面，治疗细菌感染相关疾病的方法包括给予接收如下组合物的哺乳动物个体(例如人)治疗细菌感染或降低其风险有效量的组合物，该组合物包括RIP和抗生素，上述抗生素是氨基糖苷、β-内酰胺、caphalosoprin或万古霉素。具体地，抗生素可以是亚胺培南(imipenem)或万古霉素。组合物可以进一步包括抗微生物肽。在本发明的第四个方面，治疗哺乳动物隔离(例如人)的细菌感染或降低其风险的方法包括给予个体该相同组合物。
附图说明
图1说明了培养的RAW264.7细胞中RIP和牛抗微生物肽BMAP-28对LTA-刺激的TNF-α生成的作用，其表示成对照水平的百分比。在存在字符框中所示试剂的条件下，在LTA刺激24小时之后，测量培养物上清液中的FNF-α水平。
图2说明了培养的RAW264.7细胞中RIP和BMAP-28对LTA-刺激的NO生成的作用，其表示成对照水平的百分比。在存在字符框中所示试剂的条件下，在LTA刺激24小时之后，测量培养物上清液中的NO水平。
图3A显示了在细菌激发后的0分钟给予不同药物对TNF-α血浆水平(ng/mL)的影响，其表示成小鼠模型中时间(小时)的函数。RNAIII-抑制肽缩写成“RIP”；BMAP-28是牛抗微生物肽；亚胺培南缩写成“IMP”；万古霉素缩写成“VAN”。
图3B显示了在细菌激发后的360分钟(6小时)给予不同药物对TNF-α血浆水平(ng/mL)的影响，其表示成小鼠模型中时间(小时)的函数。
图4A显示了在细菌激发后的0分钟给予不同药物对IL-6血浆水平(pg/mL)的影响，其表示成小鼠模型中时间(小时)的函数。
图4B显示了在细菌激发后的360分钟(6小时)给予不同药物对IL-6血浆水平(pg/mL)的影响，其表示成小鼠模型中时间(小时)的函数。
具体实施方式
本发明的组合物将RNAIII-抑制肽与聚阳离子抗微生物肽结合，该聚阳离子抗微生物肽能够结合并中和细菌胞外被膜的脂质的和聚阴离子的组分，如LTA或LPS。抗微生物肽可以是cathelicidin。本发明的RNAIII-抑制肽通常是能够抑制RNAIII活性、降低TRAP磷酸化、在体外模型中抑制细胞因子或NO生成、或表现出相关活性的肽。认识到细胞壁组分和外毒素生成在细菌脓毒症病理学中的重要性，本发明的组合物有利地用于治疗细菌脓毒症或类似病症的方法，其中细菌病理学与细菌胞外被膜的脂质和聚阴离子组分，如LTA或LPS有关。
本发明的组合物另外可选地或额外地将RIP与传统抗生素结合，例如β-内酰胺、氨基糖苷、头孢菌素或万古霉素。这种组合物在感染患者被抗生素耐受性细菌感染或有被感染风险时特别有利，因为RIP通过与该传统抗生素独立的机制发挥其抗菌作用。例如，这种组合物可以具体地用于治疗生物膜相关感染或降低其风险，生物膜相关感染倾向于对传统抗生素的化学疗法有抵抗力。这种抵抗使得必须延长感染个体中抗生素的使用，这促进了耐受性细菌的增加。对一些抗生素的耐受性，如青霉素家族的抗生素和更新的万古霉素，已经普遍到这些抗生素的使用受到了严格限制。但是，由于RIP能够消除或减少生物膜，我们认识到包括RIP的本发明组合物的使用使得这些抗生素的使用得以复苏，从而减少了长期抗生素疗法的障碍，克服了这些抗生素已经产生的一些耐受性。
在一个实施方式中，该方法可以用于治疗***感染或降低其风险。本发明的方法还可用于治疗像蜂窝织炎、角膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎或乳腺炎这样的疾病。本发明的组合物可以以治疗宿主个体中葡萄球菌感染有效的量给药，但是该组合物还可以用于治疗李斯特氏菌属(包括无害李斯特氏菌和单核增生李斯特氏菌)、乳球菌属、肠球菌属、大肠杆菌、Clostridium acetobtylicum、和芽孢杆菌属(包括枯草杆菌、炭疽杆菌和蜡状芽孢杆菌)、或其抗生素耐受性菌株引起的感染。
本发明的RNAIII-抑制肽
群体感应抑制剂RIP不影响细菌生长，而是通过干扰导致产生外毒素的信号转导来降低细菌的致病潜力。RIP通过抑制其目标分子TRAP的磷酸化来阻断毒素的产生，TRAP是agr基因座(locus)的上游激活剂。相反，抗微生物肽的作用机制包括破坏细菌的外膜屏障，并扰乱细胞质膜。此外，聚阳离子的抗微生物肽结合并中和细菌胞外被膜的脂质和聚阴离子组分，如LPS和LTA。由于RIP和抗微生物肽通过不同的机制发挥作用，二者可以协同作用以治疗细菌感染。
RIP包括通式YX2PX1TNF，其中X1是C、W、I或修饰氨基酸，X2是K或S。美国专利第6,291,431号、和Gov等人，Peptides 22：1609-20(2001)中公开了具体的RIP序列，在此将其并入作为参考。RIP序列包括：包括氨基酸序列KKYX2PX1TN的多肽，其中X1是C、W、I或修饰氨基酸，X2是K或S。RIP序列还包括：包括YSPX1TNF的多肽，其中X1是C或W，以及YKPITN。在一个实施方式中，包括上述通式YX2PX1TNF的RIP进一步被一个或两个氨基酸取代、缺失或其它修饰手段修饰，其条件是RIP表现出活性。
用于测定RIP和RIP制剂活性的检验***
如上文所述，RIP抑制群体感应机制的机制，包括抑制TRAP的磷酸化。有证据表明表皮葡萄球菌中存在有TRAP和TRAP磷酸化，说明在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中有着相似的群体感应机制，并说明了RIP在两种物种中干扰生物膜形成和感染的潜力。此外，有证据表明TRAP保存于所有葡萄球菌菌株和物种中；因此，RIP应当针对任何类型的葡萄球菌均有效。而且，其它导致感染的细菌似乎具有序列与TRAP相似的蛋白，包括枯草杆菌、炭疽杆菌、蜡状芽孢杆菌、无害李斯特氏菌和单核增生李斯特氏菌。而且，RAP是由rplB基因编码的核糖体蛋白L2的直向同源物(ortholog)。参见Korem等人，FEMSMicrobiol.Lett.223：167-75(2003)，在此将其对rplB基因编码的RAP直向同源物的描述内容引入作为参考。L2在细菌当中高度保守，包括链球菌属、李斯特氏菌属、乳球菌属、肠球菌属、大肠杆菌、Clostridiumacetobtylicum和芽孢杆菌属。这一发现说明，致力于扰乱金黄色葡萄球菌中RAP功能的治疗，对于治疗合成L2的细菌也同样有效。
根据本发明的RNAIII-抑制肽表现出活性，这可以使用若干途径筛选进行检验。例如，使用Balaban等人，Peptides 21：1301-11(2000)中描述的检验方法，RIP能够在体外抑制RNAIII的产生或TRAP磷酸化，在此将该文献并入作为参考。RIP活性包括抑制葡萄球菌感染。RIP通过干扰已知的葡萄球菌群体感应***而抑制葡萄球菌粘附并产生毒素。RIP与TRAP磷酸化的RAP诱导竞争，从而导致TRAP的磷酸化受到抑制。参见Balaban等人，J.Biol.Chem.276：2658-67(2001)。这导致细胞粘附和生物膜形成的减少，并导致RNAIII合成的抑制，导致毒性表形的抑制。参见Balaban等人，Science 280：438-40(1998)。酰胺形式的合成RIP类似物YSPWTNF(-NH2)有效地在体外抑制RNAIII，在体内抑制金黄色葡萄球菌感染，包括蜂窝织炎(在小鼠体内针对金黄色葡萄球菌Smith Diffuse测试)、脓毒性关节炎(在小鼠体内针对金黄色葡萄球菌LS-1测试)、角膜炎(在家兔体内针对金黄色葡萄球菌8325-4测试)、骨髓炎(在家兔体内针对金黄色葡萄球菌MS测试)和乳腺炎(在牛体内针对金黄色葡萄球菌Newbould 305、AE-I和环境感染测试)。参见Balaban等人，Peptides 21：1301-11(2000)和表1。这些结果表明了RIP活性的范围和可用于检验RIP活性的筛选，并进一步说明RIP可以用作有用的治疗分子，以防止和抑制葡萄球菌感染。
表1
感染 模型   金黄色葡萄球菌菌株       被测动物(n)     ％无疾病动物 P
    -RIP     +RIP
  骨髓炎 家兔   MS     7     8     58   0.02
  脓毒症 小鼠   LS-1     10     11     44   0.04
  关节炎 小鼠   LS-1     10     10     60   0.006
  角膜炎 家兔   8325-4     8     8     40   0.015
  乳腺炎 牛   Newbould/AE-1     6     7     70-100   ＜0.05
  蜂窝织炎/脓毒症 小鼠   Smith diffuse     22     20     多达100   0.02
移植物注入 大鼠   MRSA，MRSE，VISA，VISE，GISA，GISE，MSSA，MSSE ＞1000 ＞1000 多达100 ＜0.05
筛选检验可以是结合检验，其中一种或多种分子可以连接有提供可监测信号的标记物。提纯的RIP可以进一步用于测定三维晶体结构，这可以用于对分子相互作用进行模拟。另外可选地，筛选检验可以测定候选RIP对RNAIII产生和/或毒性因子产生的作用。例如，可以测量候选肽对葡萄球菌中rnaiii转录的作用。根据本领域的公知方法，这些筛选检验可以采用含有报道基因***的重组体宿主细胞，例如CAT(氯霉素乙酰转移酶)、β-半乳糖苷酶和类似物。另外可选地，筛选检验可以使用本领域同样公知的杂交技术检测rnaiii或毒性因子的转录。
RIP制剂的高通量体外分析
以下的RIP组合物筛选检验举例说明了可以用于测定具体的RIP或RIP组合物或制剂是否表现出所需的生物活性水平的检验类型。在该检验***中，在高通量检验中使用RNAIII报道基因检验对agr表达进行测试，其通过RNA印迹法确认。在37℃下在96孔板中用浓度渐增的测试RIP制剂培养含有rnaiii::blaZ融合构造的处于早期指数生长(2×107集落形成单位(CFU))的金黄色葡萄球菌细胞，振摇2.5-5小时。在该检验中，β-半乳糖苷酶用作RNAIII的报道基因。细菌生存力通过测定O.D.650nm并进一步平板培养以测定CFU来测试。β-半乳糖苷酶的活性通过加入β-半乳糖苷酶的底物头胞硝噻吩(nitrocefin)来测量。头胞硝噻吩被β-半乳糖苷酶的水解，由490nm和650nm处的相对吸收的变化来指示，其中黄色表示没有RNAIII合成，粉红色表示RNAIII合成。
在高通量检验中表现出效力的制剂进一步通过RNA印迹法确认。类似地用候选RIP制剂对细菌进行培养。然后通过离心收集细胞，提取总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离，并进行RNA印迹。例如，通过与PCR产生的、放射性同位素标记的RNAIII-特异性DNA杂交，对RNAIII进行检测。对含有例如随机肽的对照制剂在0-10μg/107细菌下进行测试。
RIP制剂的体内分析
候选的肽还可以进行体内活性检验，例如，通过在非人动物模型中筛选对葡萄球菌毒性因子的产生的作用。将候选的药剂给予已经被葡萄球菌感染或者已经接受感染剂量的葡萄球菌结合候选药剂的动物。为实现理想结果，候选的药剂可以通过任何方式给药。例如，候选的药剂可以通过静脉内注射、肌内注射、皮下注射给药，或者直接给予希望达到所需效果的组织中，或者候选物可以局部、口服等方式递送。药剂可以用于涂覆将要随后植入动物体内的装置。药剂的作用可以通过任何合适的方法监视，例如，评价葡萄球菌相关病变的数目和大小、感染的微生物证据、整体健康等。
所选的动物模型将随着本领域若干已知因素变化，包括具体的葡萄球菌致病菌株、或者针对将要筛选的候选药剂的目标疾病。例如，当评价RIP制剂抑制与毒素产生有关的感染的能力时，小鼠脓毒症/蜂窝织炎模型特别有用。Balaban等人，Science 280：438-40(1998)。例如，当制剂包括RIP和能够结合并中和细菌外毒素和毒性细胞壁组分的聚阳离子抗微生物肽时，这可以另外诱发炎症反应和中毒性休克综合征，该模型尤其优选。
在小鼠脓毒性蜂窝织炎模型中，典型地，将无毛的免疫活性小鼠(n＝10)通过皮下注射100uL含有5×108CFU金黄色葡萄球菌菌株Smith diffuse以及cytodex小珠的盐水进行激发。将配制的RIP通过静脉内给药，或者以10倍静脉内剂量通过管饲法口服给药。典型的静脉内剂量为＜10mg RIP/kg宿主体重。对动物观察5天，测量病变。预计一些动物将会在前48小时内由于感染而死于脓毒症，其它动物将会发生不同大小的病变。
尤其可以使用大鼠移植模型，因为其可以用于评价制剂抑制生物膜形成相关感染的能力。Giacometti等人，Antimicrob.Agents Chemother.47：1979-83(2003)；Cirioni等人，Circulation 108：767-71(2003)；Balaban等人，J.Infect.Dis.187：625-30(2003)。这一模型与临床设定(clinicalsetting)高度相关，因为它提供了细菌免疫激发和生物膜感染之间的时间间隔，通常在72小时之内，使得可以进行最优给药途径和RIP制剂剂量的试验。这一模型提供了更有挑战性的活性测试，因为已知生物膜对抗生素的耐受性极强。
使用大鼠移植模型，表明当移植物用20μg/mL RIP浸泡20分钟，或者通过腹膜内途径以10mg RIP/kg体重注射RIP时，RIP将感染降低了4个数量级。用上述体外检验确定的最有希望的RIP制剂来重复这些大鼠移植模型结果，使用比以RIP单独使用更高或更低的RIP浓度。即，制剂的效力可以与已知有效剂量的腹膜内RIP给药进行比较。在该模型***中，在手术时局部和肠胃外给予RIP对于预防感染100％有效。Dell′Acqua等人，J.Infect.Dis.190：318-20(2004)。因此优选在相同或相似的条件下进行本发明的RIP制剂。可以在细菌激发之后在生物膜形成之前和/或之后每日给予RIP制剂0-6天。
在典型的实验中，将雄性的成年Wistar大鼠(n＝10)麻醉，在中线每侧做成1.5cm切口的皮下口袋。将用1-cm2无菌胶原密封的双层丝绒针织的聚对苯二甲酸乙二醇酯(Dacron)移植物(AlbograftTM，Italy)用盐水、RIP、或RIP制剂浸泡，并植入到口袋中。将口袋用皮肤钳封闭，使用结核菌素注射器在移植物表面上接种2×107CFU/mL细菌，产生充有皮下流体的口袋。将动物放回到单独的笼中并每日检测。移植感染之后的0-6天，动物接受RIP或RIP制剂的静脉内或口服给药。经由腹膜内途径给予游离RIP作为正对照。植入7天之后将移植物植出，根据已知方法测量CFU，如Giacometti等人(2003)。将植出的移植物置于无菌试管中，用无菌盐水溶液洗涤，置于含有10mL磷酸盐缓冲盐水溶液的试管中，超声5分钟，以从移植物上除去粘附的细菌。超声之后，在显微镜下检查移植物，以确认所有细菌都被除去。通过在血液琼脂板上培养细菌悬液的连续稀释液(0.1mL)，对存活的细菌进行定量。将所有的板在37℃下培养48小时，对每板的CFU数进行评价。注意，在测试超声多达10分钟对抗生素敏感性或抗生素耐受性细菌的作用时，细菌存活力(CFU/mL)方面不存在显著差异。该方法的检出限为大约10CFU/mL。
本发明的抗微生物肽
本发明可以使用的抗微生物肽能够结合并中和细菌胞外被膜的脂质的和聚阴离子的组分，如LPS和LTA。脂质的和聚阴离子的组分可以嵌入细菌胞外被膜，或者以可溶的形式存在。在任一情况下，抗微生物肽与组分结合，防止或抑制其在宿主体内引起炎症反应的能力。对于革兰氏阴性有机体来说，阳离子抗微生物肽可以结合LPS，从而使其内毒素活性解毒。参见Scott等人，Infect.Immun.67：2005-09(1999)。类似地，对于***来说，阳性抗微生物肽可以结合并中和LTA。参见Scott(2001)。在本发明的一个实施方式中，抗微生物肽结合***的LTA或磷壁酸。
抗微生物肽具有广谱的杀灭或中和革兰氏阴性和***的能力，包括抗生素耐受性菌株。参见Hancock，Lancet Infect.Dis.1：156-64(2001)。Wang，University of Nebraska Medical Center，http:∥aps.unmc.edu/AP/main.php(最后于2005年3月5日修改)的抗微生物肽数据库(Antimicrobial Peptide Database)提供了约500种具有抗菌活性的潜在可用于本发明的抗微生物肽的数据库，在此将其全部并入作为参考。抗微生物肽通常由12至50个氨基酸残基构成，并且是聚阳离子性的。通常它们的氨基酸中大约50％是疏水的，并且它们通常是两性的，其中其一级氨基酸序列包括交替的疏水和极性残基。抗微生物肽符合四种结构分类之一：(i)通过多个二硫键稳定的β-折叠结构(例如人defensin-1)；(ii)共价稳定的环(loop)结构(例如bactenecin)；(iii)富色氨酸(Trp)的延伸的螺旋肽(例如indolicidin)；和(iv)两性α-螺旋(例如magainin和cecropin)。参见Hwang等人，Biochem.Cell Biol.76：235-46(1998)；Stark等人，Antimicrob.AgentsChemother 46：3585-90(2002)。
cathelicidin是最近描述的一类至少存在于人、牛、绵羊、兔、大鼠、小鼠和猪体内的抗微生物肽，其采用了所有的这些结构基序。参见Ganz等人，Curr.Opinion Hematol.4：53-58(1997)。cathelicidin共享高度保守的约100个氨基酸的N-端前肽(propeptide)片断，以及编码抗微生物肽基序的C-端结构域。参见Hwang等人，Biochem.Cell Biol.76：235-46(1998)。在人体内，嗜中性白细胞的激活导致弹性蛋白酶介导的内切蛋白水解断裂，产生C-端抗微生物肽。人cathelicidin另外称为FALL-39、hCAP18、LL-37或CAMP，其活性处理形式为37个氨基酸的两性α-螺旋阳离子肽。参见Zanetti等人，FEBS Lett.374：1-5(1995)。感染部位的人嗜中性白细胞、睾丸细胞、呼吸道上皮细胞和角质化细胞中均检测到LL-37的表达。
α-螺旋类的两性阳离子肽通常表现出μg/mL范围内的最小杀菌浓度，其与其它抗微生物剂相当。两性阳离子肽能够杀灭广范的革兰氏阴性和革兰氏阳性病原，包括对多种抗生素有高耐受性的那些病原。参见Hancock，Drugs 57：469-73(1999)。这些肽首先通过与带负电荷的细菌表面结合，然后***到细菌膜中，打乱其结构完整性，从而杀灭细菌。两性阳离子α-螺旋抗微生物肽的特点是它们能够折叠成呈现出具有至少+2个净正电荷的亲水表面的两性二级结构。多种不同的氨基酸序列组合使得肽获得这种特征性结构。因此，迄今已经描述有数百种源于宿主的两性阳离子α-螺旋肽，其在一级序列对比的水平上均表现出有限的序列同源性。参见Hwang等人，Biochem.Cell Biol.76：235-46(1998)。上述的RIP筛选检验也可以用于筛选抗微生物肽的活性，特别是包括RIP和抗微生物肽的组合物的形式。
本文所用的关于RIP和抗微生物肽的术语“蛋白”、“多肽”或“肽”包括修饰的序列(例如，糖基化、PEG-基化、含有保守氨基酸取代基、含有保护基、包括5-氧代脯氨酰、酰胺化、D-氨基酸等)。氨基酸取代基包括保守取代基，其典型地在以下组别以内：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。技术人员认识到抗微生物肽不包括传统抗生素。
本发明的蛋白、多肽和肽可以是天然的，或者通过本领域公知的方法重组产生或通过化学合成产生。本领域技术人员知晓各种在细菌宿主中重组产生抗微生物的方法，尽管天然肽对细菌有毒性。美国专利第5,589,364号和第5,789,377号在其公开内容中提供了两个合适的重组产生两性肽的方法的例子，其中所述肽具有显著的生物和治疗活性，在此结合上述专利的全部内容作为参考。例如，将缺乏大肠杆菌蛋白酶的K-12细胞用表达可断裂融合蛋白的载体转染，该融合蛋白包括至少部分的碳水化合物结合蛋白和两性抗微生物肽。融合蛋白在细胞中表达，碳水化合物结合部分促进了表达的融合蛋白的提纯，然后对融合蛋白进行切割，得到基本不含碳水化合物结合蛋白残基的两性肽。这样产生的生物活性的两性肽可以进一步进行化学或酶促处理，得到具有所需生物和治疗性质的化学上不同的两性抗微生物肽。在一个实施方式中，编码RIP的DNA可以与编码抗微生物肽的DNA共表达，使得重组表达产生RIP和抗微生物肽二者。例如，编码DNA可以在可操作控制下在相同的启动子上包含在相同的遗传构造上。在另一个实施方式中，编码DNA的读取框在框内融合，使得该构造体表达含有RIP和抗微生物肽序列的融合蛋白。参见Balaban等人，Antimicrob.Agents Chemother.48：2544-50(2004)。
本发明的蛋白、多肽和肽可以是提纯或分离的。“提纯的”是指化合物基本不含天然状态下发现的通常伴随的成分，例如，约60％不含、约75％不含、或约90％不含上述成分。“分离的”化合物处于不同于天然化合物的环境中。
药物组合物和治疗模式
术语“治疗”或“进行治疗”是指对个体动物，如哺乳动物，优选人的治疗性介入。治疗包括(i)“预防”，导致临床症状不发展，例如，预防感染发生和/或发展到有害状态；(ii)“抑制”，阻止临床症状的发展，例如，停止正在发生的感染，使得感染完全消除或者至不再有害的程度；和(iii)“减轻”，导致临床症状的减退，例如，导致感染造成的发热和/或炎症减轻。治疗可以包括预防、抑制或减轻生物膜的形成。为具有细菌感染“风险”的个体给药是指个体不必已经诊断出细菌感染，但是个体的环境使得该个体感染的风险高于正常水平，例如烧伤受害的个体。为“疑似”细菌感染的个体给药是指个体表现出一些感染的最初征兆，例如高烧，但是诊断尚未做出或确定。
术语“有效量”是指足以提供治疗的剂量。有效治疗所必需的活性成分的量取决于许多不同因素，包括给药方式、目标部位、患者的生理状态、和给予的其它药物；因此，治疗剂量应当滴定(titrate)，以使安全性和有效性最佳。典型地，体外使用的剂量可以为活性成分体内给药的可用量提供有用的指导。治疗特定疾病的有效剂量的动物测试，可以为人的剂量提供进一步预测性指示。药物制剂中活性成分的浓度典型地从低于约0.1wt％、通常是或至少2wt％变化到多达20wt％至50wt％或更高，根据所选的具体给药方式，主要通过流体体积、粘度等选择。例如，Goodman和Gilman’s，“The Pharmacological Basis ofTherapeutics(治疗的药理基础)”，Hardman等人编著，第10版，McGraw-Hill，(2001)，以及“Remington：The Science and Practice ofPharmacy(药剂学科学和实践)”，University of the Sciences inPhiladelphia，第21版，Mack Publishing Co.，Easton PA(2005)中描述了各种适当的考虑因素，在此将这二者全部并入作为参考。在此讨论给药的方法，包括口服、静脉内、腹膜内、肌内、经皮、经鼻、和离子导入(iontophoretic)途径和类似途径给药。
本发明的组合物可以以多种单位剂型给药，其取决于给药的方法。例如，适合于口服给药的单位剂型包括固体剂型，例如粉剂、片剂、丸剂和胶囊；液体剂型，例如酏剂、糖浆剂和悬液。活性成分也可以以无菌液体剂型肠胃外给药。凝胶化胶囊含有活性成分和作为非活性成分的粉末载体，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁和类似物。
可以加入到本发明的组合物中的非活性成分的例子包括提供所需颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散性或其它特性的试剂，例如红色氧化铁、硅胶、月桂基硫酸钠、二氧化钛、可食用白墨水(white ink)和类似物。类似的稀释剂可以用于制造压缩片剂。片剂和胶囊均可以制造成持续释放产品，以在数小时的时间内提供持续的药物释放。压缩片剂可以是包糖衣或包膜衣的，以掩盖任何令人不快的味道，并保护片剂不受大气影响，或者是包肠衣的，以便在胃肠道中被选择性分解。用于口服给药的液体剂型可以含有着色剂或调味剂，以增加患者的接受度。
本发明的组合物还可以经由脂质体给药，包括乳液、泡沫、胶束、不溶单层膜、液晶、磷脂分散体、层状层和类似物。在这些制剂中，本发明的组合物可以作为脂质体的一部分，单独地或者与目标分子如抗体结合，或者与其它治疗或免疫原组合物结合而递送。因此，充填或装饰有本发明所需组合物的脂质体可以全身递送，或者可以导向所关注的组织。
用于本发明的脂质体可以由标准的泡囊形成脂质形成，其通常包括中性和带负电荷的磷脂和甾醇，如胆固醇。脂质的选择通常受所需的脂质体大小、血流中酸不稳定性和稳定性的指导。Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467 (1980)、美国专利第4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369号中描述了多种可用于制备脂质体的方法，在此将其并入作为参考。含有本发明的组合物的脂质体悬液可以静脉内、局部、表面等给药，其剂量根据给药方式、待递送的发明的组合物、和正在治疗的疾病的阶段等而变化。
对于固体组合物，可以使用常规的无毒固体载体，其包括，例如，药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁和类似物。对于口服给药，药物可接受的无毒组合物通过将任何常规采用的赋形剂结合而形成，如以上所列的那些载体和通常10-95wt％、更优选浓度为25-75wt％的活性成分。本发明的构造物可以额外地在存储物(depot)型***、包囊形式或植入物中以本领域公知的技术递送。类似地，构造物可以经由泵，例如渗透泵，递送给所关注的组织。
对于气溶胶给药，本发明的组合物优选地以磨碎的形式与表面活性剂和推进剂一起提供。这些试剂的例子有含有6-22个碳原子的脂肪酸(例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric酸和油酸)与脂肪族多元醇或其环状酐的酯或偏酯。可以使用混合酯，例如混合或天然甘油酯。表面活性剂可以占混合物的0.1-20wt％，优选0.25-5wt％。组合物的余量通常是推进剂。如果需要，还可以包括载体，例如卵磷脂，用于经鼻递送。
为了本发明的目的，“给予组合物”包括在相同或几乎相同的时间给予同一个体RNAIII-抑制肽和抗微生物肽和/或抗生素的独立制剂，使得各个活性成分的治疗浓度在个体中同时达到。该术语还包括给予个体抗生素，该抗生素在包括RIP和抗微生物肽的同一制剂中，或者在给予RIP和抗微生物肽的同时或几乎同时给予抗生素的独立制剂。例如，本发明的方法包括口服同时给予含有RIP、抗微生物肽和抗生素的独立丸剂。可以使用的抗生素包括氨基糖(例如庆大霉素(gentamycin))、β-内酰胺(如青霉素)、头孢菌素(cephalosporin)或万古霉素。RIP和抗微生物肽给药可以在大约48小时内进行，优选在大约2-8小时内进行，最优选与抗生素给药基本同时进行。
具有所需药理活性的化合物可以在生理可接受的载体中给予宿主，以治疗、预防、抑制或减轻致病的细菌感染。治疗剂可以通过多种方式给予，例如口服、局部、肠胃外、腹膜内、血管内、肺内(即吸入)等。取决于引入的方式，化合物可以通过多种方式配制。
治疗活性化合物在制剂中的浓度可以从大约0.1-100wt％变化。给药方案可以调节成提供最优的治疗反应。例如，可以每日给予若干分开的剂量，或者可以根据治疗状况指示按比例减少剂量。人的治疗感染用剂量水平是已知的，通常包括约0.1-500mg/kg体重每天、优选约6-200mg/kg、最优选约12-100mg/kg的日剂量。给予制剂的量当然取决于受试者和病痛的严重程度、给药的方式和时间安排、和处方医师的判断。通常，血清浓度应当维持在足以在少于10天之内治疗感染的水平，尽管本发明提供了如下优势：由于在治疗时细菌对本发明的组合物产生耐受性的可能降低，能够将治疗在相对低的组合物水平下延长到多于10天。
药物组合物可以制备成各种形式，例如颗粒、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬液、油膏剂、洗剂和类似形式。适合于口服和局部使用的药物级有机或无机载体或稀释剂可以用于构成含治疗活性化合物的组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物和动物油和脂肪。可以使用稳定剂、润湿和乳化剂、用于改变渗透压的盐、或用于保证适当pH值的缓冲剂、和皮肤渗透促进剂作为辅助药剂。组合物可以包括其它的药物赋形剂、载体等。合适的赋形剂是，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物。药物组合物的制备方法是本领域技术人员公知的。参见，例如“Remington：The Science and Practice of Pharmacy(药剂学科学和实践)”，University of the Sciences in Philadelphia，第21版，Mack Publishing Co.，Easton PA(2005)。
除细菌性脓毒症之外，本发明的组合物可以用于减轻整体病理学或延缓细菌感染导致的各种疾病中疾病症状的发作，包括细菌导致的全身炎症综合征(SIRS)、蜂窝织炎、角膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、乳腺炎、皮肤感染、肺炎、心内膜炎、脑膜炎、术后创伤感染、装置相关感染和中毒性休克综合征。
生物膜相关感染的治疗
粘附于表面的细菌在它们自己合成的水合聚合基质中聚集，形成生物膜。这些固着群落的形成及其自身的抗微生物剂耐受性是许多持久性和慢性细菌感染的根源。参见Costerton等人，Science 284：1318-22(1999)。生物膜优先在惰性表面或死组织上形成，常常在医疗装置和死组织片断上形成，例如死骨的死骨片；它们还可以在活的组织上形成，例如在心内膜炎的情形中。生物膜在一个或多个位置生长缓慢，并且生物膜感染常常很慢地产生显性症状。固着细菌细胞释放抗原并刺激抗体的产生，但是抗体在生物膜内杀灭细菌是无效的，并可导致周围组织的免疫综合损伤。即使是细胞和体液免疫反应优异的个体，生物膜感染也极少被宿主免疫机制解决。抗生素治疗通常逆转由生物膜释放出的浮游细胞导致的症状，但是不能杀灭生物膜。由于这一原因，生物膜感染通常在数周期抗生物治疗之后表现复发症状，直至通过外科手术将固着种群从身体上去除。因此，优选预防生物膜的形成，而不是在生物膜一旦形成后努力将其根除。
本发明的组合物和方法可以用于治疗生物膜相关的细菌感染，或者降低生物膜相关疾病的风险，特别是其致病性与细菌胞外被膜的脂质和聚阴离子组分有关的细菌造成的生物膜。例如，包括RIP和抗生素(例如氨基糖苷、β-内酰胺、头孢菌素或万古霉素)的组合物可以用于治疗生物膜或降低其风险。在另一实施方式中，除了传统抗生素以外，RIP与抗微生物肽组合，或者由抗微生物肽代替传统抗生素与RIP组合，以治疗生物膜相关的感染或降低其风险。
本发明的组合物可以用于涂覆***个体内的装置，例如手术装置、导管、假体或其它植入物，以降低植入的装置产生生物膜的风险。另外可选地，可以将组合物植入，以在局部感染的治疗中提供局部高浓度的组合物。在该实施方式中，组合物可以以存储物提供，并配制用于持续释放。下表2提供了本发明的组合物和方法预计可以使用的医院感染的部分列表。
表2
医疗装置或装置相关疾病  通常导致相关生物膜的细菌物种
                                                                        
缝合线                  金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌
Exit sites              金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌
动静脉旁路              金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌
Schleral带扣            革兰氏阳性球菌(cocci)
隐形眼镜                绿脓杆菌(P.aeruginosa)和革兰氏阳性球菌
泌尿导管膀胱炎          大肠杆菌和其它革兰氏阴性棒状杆菌
腹膜透析(CAPD)腹膜炎    葡萄球菌；各种细菌和真菌
气官内导管              多种细菌和真菌
Hickman导管             表皮葡萄球菌和白色念珠菌(C.albicans)
ICU肺炎                 革兰氏阴性棒状杆菌
中央静脉导管            表皮葡萄球菌及其它
机械心瓣膜              金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌
血管移植物              革兰氏阳性球菌
矫形装置                金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌
海绵体假体              金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌
1.实施例
将包括RIP和BMAP-28的组合物在体外给予RAW 264.7细胞。发现该组合物抑制LTA诱导的TNF-α的释放和NO的产生，这些是造成各种脓毒性休克动物模型中循环衰竭的有力的血管扩张剂。在独立的研究中，显示包括RIP和BAMP-28的组合物在小鼠脓毒症模型中有效。
1.1材料和方法：
有机体：使用市售的金黄色葡萄球菌ATCC 25923的质量控制菌株。
试剂：将来自金黄色葡萄球菌的LTA(Sigma-Aldrich，Milan，Italy)再悬浮到不含内毒素的水中，等分，并在-20℃下存储一小段时间。LTA制剂的LPS污染量为小于2ng/mL，其通过Bio Whittaker(Walkersville，MD，USA)的Limulus检验测定。
PAL-PEG-PS树脂、用于肽合成的偶联剂、和Fmoc-氨基酸购自Applied Biosystems(Foster City，USA)。肽合成级别的N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、二氯甲烷和HPLC-级乙腈获自Biosolve(Valkenswaard，The Netherlands)。三氟甲酸、N-甲基吗啉和三氟乙醇(TFE)获自Acros Chimica(Beerse，Belgium)。
药剂：酰胺形式的天然RIP(YSPWTNF-NH2)由Neosystem(Strasbourg，France)合成，并通过HPLC提纯至99％。将RIP粉末以20倍于所需最大浓度溶解在蒸馏H2O中。
BMAP-28(GGLRSLGRKILRAWKKYGPIIVPIIRI-NH2)作为C-端酰胺化的肽在Milligen 9050自动合成仪(Applied Biosystems，FosterCity，USA)上使用Fmoc化学通过化学合成。参见Skerlavaj(1996)。通过电喷雾质谱(ES-MS)使用APII仪器(PE SCIEX，Toronto，Canada)测定分子量。将提纯的肽溶解在不含内毒素的水中，等分，并在-20℃下存储。通过在280nm处测量BMAP-28的吸收，并考虑到Trp的摩尔消光系数为5559，Tyr为1280，测定肽的浓度。
取决于检验，制备肽(i)在用于RAW 264.7细胞体外检验的细胞培养基中、(ii)在用于体外易感性试验的在聚丙烯管中的含有0.2％牛血清白蛋白的0.01％乙酸中、和(iii)在用于体内实验的生理盐水中的连续稀释液。将亚胺培南(Merck，Sharp & Dohme，Milan，Italy)和万古霉素(Sigma-Aldrich)粉末根据制造商推荐进行稀释。所有溶液均在检验当天现制。各化合物检验的浓度范围是0.25-256mg/L。RAW264.7细胞产生细胞因子：鼠科巨噬细胞细胞系RAW264.7获自美国典型微生物菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，并将其保持在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI中，在加湿的37℃孵育器中。将上述培养基中的RAW264.7细胞以106细胞/孔种在24-孔皿中，并在5％CO2中在37℃下培养过夜。将RPMI从生长过夜的细胞中抽出，并置换以新的培养基。将细胞在存在或不存在以下浓度的各种肽的条件下，在37℃下在5％CO2中与5μg/mL来自金黄色葡萄球菌的LTA一起培养：2μM BMAP-28；4μM BMAP-28；20μM RIP；20μM RIP结合2μM BMAP-28。将肽与LTA同时加入。培养24小时后，取出上清液，根据制造商的说明书通过酶联免疫吸收检验(ELISA；Euroclone Life Sciences，Milan，Italy)检测TNF-α的产生。所有样品均进行两次。TNF-α的检出限为＜0.025ng/mL。为了证明RIP作用的特异性，以20μg/mL的非活性RIP肽类似物(YKPETNF-NH2，Neosystem，Strasbourg，France)进行补充实验。
一氧化氮(NO)检测：RAW264.7细胞如上述进行培养。24小时内上清液中LTA-刺激产生NO的量，根据制造商的说明书从用Griess试剂(Molecular Probes，Eugene，OR)积累的稳定的NO代谢产物亚硝酸盐推算。
敏感性测试：根据美国临床实验室标准化委员会(NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards)“Methods for dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically(需氧生长的细菌的稀释抗菌敏感性测试的方法)”：Approved standard M7-A6，Villanova，PA(2003)中概述的方法，使用微肉汤(microbroth)稀释法，测定抗生素的敏感性。取MIC作为最低抗生素浓度，在该浓度下可观察到的生长受到抑制。实验进行3遍。
动物：全部实验使用重量为23-30g的BALB/c雄性小鼠。所有动物在恒温(22℃)恒湿条件下安置于具有12小时亮/暗周期的独立的笼中，在整个研究过程中无限制提供食物和水。该项研究通过了I.N.R.C.A.-I.R.R.C.S.，Polytechnic University of Marche，Ancona，Italy的动物研究道德委员会(animal research ethics committee)的批准。
接种物的制备：金黄色葡萄球菌ATCC 25923在脑-心脏浸液肉汤(infusion broth)中在37℃下生长过夜。当细菌处于对数生长期时，将悬液以1000xg离心15分钟，弃去上清液，细菌再悬浮在无菌盐水中，达到约1×107CFU/mL的浓度。
通过将在含有约2.5×109细胞/mL的磷酸盐缓冲盐水中的细胞悬液煮沸10分钟并超声1分钟，制备加热杀灭的金黄色葡萄球菌。通过将细菌培养过夜以保证没有生长，确认热处理的效力。
接种物的植入：通过肌内注射***(30mg/kg体重)将所有动物麻醉。在第0天对小鼠经由尾静脉静脉注射(i.v.)0.2mL上述细菌悬液：(i)2.0×106CFU金黄色葡萄球菌ATCC 25923(模型1)、或(ii)5.0×108加热杀灭的细胞(模型2)，并监控72小时。
抗生素治疗：细菌激发之后立即(模型1a和2a)或者6小时后(模型1b和2b)，随机选择小鼠接收静脉内等渗氯化钠溶液(对照组)、单独的或结合2mg/kg BMAP-28、7mg/kg亚胺培南和7mg/kg万古霉素的10mg/kg RIP。每组包括20只小鼠。动物返回各自的笼中，随后监控72小时。研究的终点为致死率(模型1)、定量血液培养物(菌血症，模型1)、和TNF-α或IL-6血浆浓度(模型2)。在没有免疫激发的辅助RIP和BMAP-28-处理的组中，基于药物相关副作用(局部发炎征兆、体重减少、呕吐、腹泻和发热)的存在评价毒性。
治疗评价：细菌激发24小时后，通过无菌经皮穿刺从尾静脉得到培养的血液样品。该时间之前死亡的动物不测试。为了进行定量细菌培养，将血液样品连续稀释，将0.1mL体积的各稀释液铺展在血液琼脂板上，并在35℃下培养48小时，对集落形成单位(CFU)进行计数。检出限为＜10CFU/mL。
血浆TNF-α和IL-6水平：为了测定血浆中的TNF-α和IL-6(模型2)，在注射后的0、6、12、24和48小时从尾静脉收集血液样品。TNF-α的水平用固相夹心法(sandwich)酶联免疫吸收检验(ELISA)测量。通过读取450nm处的吸收，在MR 700酶标仪(Microplate Reader)(Dynatech Laboratories，Guernsey，United Kingdom)中测量色强度。将样品结果与标准曲线比较，确定TNF-α的存在量。所有的样品进行2次。该检验对TNF-α的灵敏性下限是0.05ng/mL。IL-6的血浆浓度也通过上述ELISA测定。定量基于标准曲线进行。检出限为12pg/mL。检验进行2次。
静态分析：组之间的致死率使用Fisher′s exact test进行比较。定量血液培养物的数据表示成平均值±平均值标准偏差(SD)；组之间的统计学比较通过分析方差进行。通过Bonferroni′s test进行Post hoc比较。通过分析方差比较组之间的血浆IL-6和TNF-α平均值。当p值≤0.05时显著性可接受。
1.2结果：
细胞因子和NO的产生：为了测定RIP和BMAP-28对LTA介导的细胞反应的作用，分析这些肽单独或结合时抑制LTA诱发的由RAW264.7产生TNF-α和NO的能力。
在不存在LTA的情况下培养的细胞上清液中，TNF-α水平的范围是0.068至0.092ng/mL，存在LTA的情况下是34.6至50.6ng/mL。如图1所示，RIP和BMAP-28单独或结合在一起，在每个所测试的浓度下，均降低了LTA刺激的由RAW264.7细胞产生的TNF-α。图1中数据表示成最后三次实验的平均值±S.D.。
具体地，如图1所示，BMAP-28以依赖于剂量的方式降低了LTA诱发的TNF-α的释放，在2μM肽的条件下降低74.5±6％，在4μM肽的条件下几乎完全抑制。显著地，单独的RIP在20μM的浓度下降低了45.6±10％的LTA-诱发的TNF-α释放。结合存在有20μM RIP和2μM BMAP-28产生了85.4±3.1％的抑制(图1)。在所使用的浓度下，在不存在LTA的情况下，这些肽均不导致释放出TNF-α和NO(未显示)。
单独给药时，两种肽均降低了LTA刺激的NO的产生，在2μMBMAP-28和20μM RIP的条件下，分别降低了76±9.8％和53.3±8.1％。当RIP与BMAP-28结合时，NO的水平得到进一步降低(抑制84.7±8.8％)(图2)。由于非活性的RIP肽类似物没有表现出TNF-α和NO的降低(数据未显示)，RIP的抑制作用是特异性的。在不存在或存在LTA的条件下，培养的细胞的上清液中检测到的NO水平的范围分别是5.98至9.17μM和24.39至26.42μM。图2中数据表示成最后三次实验的平均值±S.D.。
显著地，RIP单独降低了LTA刺激的TNF-α和NO的产生，这是RIP第一次被证实这些作用。尽管本发明不受所提出的作用机制所限制，但该结果显示，除RIP通过抑制群体感性对毒素产生的已知抑制作用之外，RIP可以额外地通过单独的机制具有抑制细菌导致的脓毒症的能力。而且，体外数据与BMAP-28在RAW264.7细胞上与LTA或其受体直接结合这一观点相符合。
敏感性测试：葡萄球菌分离物显示对BMAP-28、亚胺培南和万古霉素的敏感性，其分别表现出2.00、0.50和0.25mg/L的MIC。最后，如通过其作用机制所预计，RIP针对两种菌株没有表现出任何体外杀灭活性(MIC＞256mg/L)。
鼠脓毒症模型：为了检验RIP和BMAP-28是否具有治疗脓毒症的潜在治疗价值，应用之前所述的小鼠脓毒症模型。作为脓毒症诱导物，使用活的金黄色葡萄球菌ATCC25923或相同菌株的热杀灭细胞。在两种动物模型中评价致死率、血浆细菌计数、和血浆TNF-α或IL-6。在模型1中，在用高滴度的金黄色葡萄球菌激发之后，立刻或者在6小时后对动物进行处理，记录菌血症和死亡率。在模型2中，在用热杀灭并超声的细菌注射之后，测定细胞因子水平。细菌激发6小时后用药物治疗是模拟临床状况，其中脓毒症发作和开始治疗之间存在时间间隔。将RIP和BMAP-28的作用与通常使用的抗生素进行比较。
模型1a(激发后立即治疗)：如表3A所示，当小鼠用金黄色葡萄球菌ATCC 25923激发并立即用盐水治疗时(对照组C1)，72小时内的致死率为100％。相反，立即用药物治疗表现出显著高于对照的效力(P＜0.05)。具体地，在用亚胺培南、万古霉素、BMAP-28和RIP治疗的组中，观察到致死率分别为30％、20％、30％和70％。RIP与BMAP-28组合表现出的致死率显著更低，为5％；与不使用RIP仅给予抗生素时的致死率相比较，当RIP与亚胺培南或万古霉素结合时也观察到大约低两倍的致死率。
在同样的模型中，对照组中的定量血液培养表现出4.3±1.1×106CFU/mL(表3A)。BMAP-28表现出值为3.7±0.9×103CFU/mL的抗菌活性，而单独的万古霉素表现的计数更低(7.8±1.8×101CFU/mL)。当万古霉素与RIP结合时，两种药物的协同相互作用产生的细菌数最低(2.8±0.6×101CFU/rmL)。最后，当与用亚胺培南和BMAP治疗的组相比时，所有组合治疗的组均具有显著更低的细菌数(P＜0.05)。
模型1b(激发6小时后治疗)：如表3B所示，在细菌激发后360分钟给予药物对致死率和细菌数的作用尽管稍低于立即治疗的组，但与其相当。再次，与单独的抗生素的作用相比，RIP与亚胺培南或万古霉素之间对CFU/mL的协同作用几乎是两倍。
表3A
治疗a   致死率b(死亡/总数％)   定量血液培养(阳性/总数) 定量血液培养(CFU/ml)c
无治疗(对照组C1)   20/20(100)   20/20 9.5±1.7×105
RIP 10mg/Kg   14/20d(70)   14/20d 4.0±0.8×104d
BMAP-282mg/Kg   6/20de(30)   6/20df 3.7±0.9×103de
VAN 7mg/Kg   4/20de(20)   5/20df 7.8±1.8×101deg
IMP 7mg/Kg   6/20de(30)   7/20df 5.8±1.4×102de
RIP 10mg/KgBMAP-282mg/Kg   1/20deh(5)   2/20df 3.7±0.7×102dg
RIP 10mg/KgVAN 7mg/Kg   3/20de(15)   3/20df 2.8±0.6×101dg
RIP 10mg/KgIMP 7mg/Kg   4/20de(20)   4/20df 2.8±1.1×102dg
aVAN，万古霉素；IMP，亚胺培南。
b死亡率在激发之后监控72小时。
c平均值±S.D.
dP＜0.05(Fisher’s test)或P＜0.05(Bonferroni’s test)，相对于对照组C1。
eP＜0.05(Fisher’s test)或P＜0.05(Bonferroni’s test)，相对于RIP治疗组。
fP＜0.05，相对于RIP治疗组。
gP＜0.05，相对于BMAP-28治疗组。
hP＜0.05，相对于VAN-、IMP-、RIP/IMP-治疗组。
表3B
 治疗a     致死率b(死亡/总数％)   定量血液培养(阳性/总数) 定量血液培养(CFU/ml)c
 无治疗(对照纽C1)     20/20(100)   20/20 2.7±0.3×106
 RIP 10mg/Kg     15/20d(70)   15/20d 5.6±1.2×104d
 BMAP-282mg/Kg     6/20de(30)   6/20df 5.7±1.8×103de
 VAN 7mg/Kg     4/20de(20)   5/20df 9.0±2.8×101deg
 IMP 7mg/Kg     7/20de(35)   7/20df 7.1±1.7×102de
 RIP 10mg/KgBMAP-282mg/Kg     1/20deh(5)   3/20df 3.9±0.9×102dg
 RIP 10mg/KgVAN 7mg/Kg     3/20de(15)   3/20df 3.6±1.4×101dg
 RIP 10mg/KgIMP 7mg/Kg     5/20de(20)   5/20df 3.9±1.2×102dg
aVAN，万古霉素；IMP，亚胺培南。
b死亡率在激发之后监控72小时。
c平均值±S.D.
dP＜0.05(Fisher’s test)或P＜0.05(Bonferroni’s test)，相对于对照组C1。
eP＜0.05(Fisher’s test)或P＜0.05(Bonferroni’s test)，相对于RIP治疗组。
fP＜0.05，相对于RIP治疗组。
gP＜0.05，相对于BMAP-28治疗组。
hP＜0.05，相对于VAN-、IMP-、RIP/IMP-治疗组。
模型2a(体内TNF-α和IL-6产生)：静脉内给予0.2mL热杀灭的细胞之后的6小时和12小时，分别观察TNF-α和IL-6的血浆峰值水平。RIP和BMAP-28治疗(单独或组合)导致TNF-α和IL-6的血浆水平相对于对照组、亚胺培南或万古霉素均显著降低(P＜0.05)。经过或未经传统抗生素治疗的组在细胞因子血浆水平方而没有观察到大的差异(图3A和4A)。最后，用RIP和BMAP-28组合治疗的组中观察到的TNF-α和IL-6血浆水平的下降最剧烈，尽管RIP与抗生素亚胺培南或万古霉素组合也降低了TNF-α和IL-6的血浆水平。
模型2b(体内TNF-α和IL-6产生)：热杀灭细菌激发后的360分钟给予药物，对血浆细胞因子水平具有不同的作用。事实上，在对照、亚胺培南和万古霉素治疗的小鼠中观察到血浆TNF-α和IL-6浓度的持续增加，而在细菌激发后360分钟给予RIP和BMAP-28、以及给予其组合，导致持续降低(图3B和4B)。总体上，与对照组和用亚胺培南和万古霉素治疗的组相比，RIP和BMAP-28及其组合使细胞因子水平显著降低。令人感兴趣的是，在亚胺培南和万古霉素之间也观察到显著的差异。与模型2a类似，RIP和BMAP-28间的组合产生的TNF-α和IL-6血浆水平的降低最剧烈。
最后，动物当中无一具有药物相关副作用的临床证据，在没有在先感染的情况下的辅助的RIP和BMAP-28处理组中，没有观察到生理参数的变化。
RIP与BMAP-28组合时得到死亡率和菌血症的最佳数据，这说明它们的作用方式是互补的。RIP和BMAP-28的组合在降低细胞因子水平方面也是最有效的，证实了这两种药物抑制毒素产生和中和作为细胞因子激活诱导物的细胞壁组分的能力。
本文提到的所有出版物和专利均在此引入作为参考，以公开和描述与所引用出版物和专利相关的具体方法和/或材料。本文讨论的出版物和专利的提供仅仅是因其公开在本申请的申清日之前。在此绝非意味着认可本发明由于在先发明而在这些出版物或专利的日期之前未获授权。而且，所提供的公开或发行日可能与实际日期不同，这需要单独加以确认。
尽管上述说明书以用于说明目的的实施例教导了本发明的原理，本领域技术人员阅读本公开内容将会认识到，可以在不偏离本发明真实范围的情况下做出各种形式和细节上的变化。

Claims (64)

1.一种药物组合物，其包括一定量的RNAIII-抑制肽(RIP)和聚阳离子抗微生物肽，所述聚阳离子抗微生物肽能够在接受所述组合物的哺乳动物个体内结合并中和细菌胞外被膜的脂质的和聚阴离子的组分。
2.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述RIP包括：
a.)序列YX2PX1TNF的五个邻接的氨基酸，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，且X2是K或S；或者
b.)其序列因两个取代或缺失而与序列YX2PX1TNF不同的氨基酸，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，且X2是K或S。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述RIP并非由序列YSPX1TNF组成，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸。
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述RIP包括其序列因一个取代或缺失而与序列YX2PX1TNF不同的氨基酸，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，且X2是K或S。
5.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述RIP包括氨基酸序列YKPX1TNF，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸。
6.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述RIP序列中的X2是K。
7.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述RIP包括氨基酸序列IKKYX2PX1TNF，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，且X2是K或S。
8.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述RIP包括序列PCTNF。
9.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述RIP包括序列YKPITNF。
10.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述RIP包括序列YKPWTNF。
11.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述RIP的长度是10个氨基酸。
12.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述RIP占所述组合物的大约0.1wt％至50wt％。
13.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述RIP占所述组合物的大约2wt％至20wt％。
14.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述RIP是提纯的。
15.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗微生物肽结合并中和脂磷壁质酸(LTA)。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述的抗微生物肽是cathelicidin。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述的抗微生物肽是人cathelicidin或BMAP-28。
18.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的药物组合物进一步包括脂质体。
19.根据权利要求1所述的药物组合物，其进一步包括抗生素。
20.一种治疗哺乳动物个体中细菌感染或降低其风险的方法，其包括给予所述个体一种组合物，所述组合物包括一定量的RNAIII-抑制肽(RIP)、和能够结合并中和细菌胞外被膜的脂质和聚阴离子组分的抗微生物肽，其中RIP和抗微生物肽以有效治疗所述个体中细菌感染或降低其风险的量存在。
21.根据权利要求20所述的方法，其中治疗细菌感染或降低其风险包括预防临床症状发生、抑制临床症状发展、或减轻临床症状。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述细菌感染由抗生素耐受性细菌导致。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述细菌感染是细菌性脓毒症。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述细菌感染位于特定组织、皮肤或身体部位。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述感染是蜂窝织炎、角膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎或乳腺炎。
26.根据权利要求20所述的方法，其中所述细菌感染与生物膜相关。
27.根据权利要求20所述的方法，其中所述细菌感染由葡萄球菌属导致。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述细菌感染由金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌导致。
29.根据权利要求20所述的方法，其中所述细菌感染由芽孢杆菌属、枯草杆菌、蜡状芽孢杆菌、炭疽杆菌、李斯特氏菌属、无害李斯特氏菌、单核增生李斯特氏菌、酿脓链球菌、乳酸乳球菌、粪肠球菌、大肠杆菌或Clostridium acetobtylicum导致。
30.根据权利要求20所述的方法，其中给药是通过局部、口服、静脉内、腹膜内、肌内、经皮、经鼻或离子导入途径。
31.根据权利要求30所述的方法，其中给药是通过depot型***、包囊形式、植入物、或医疗装置上的涂层。
32.根据权利要求20所述的方法，其进一步包括给予个体抗生素。
33.根据权利要求20所述的方法，其中所述个体是人。
34.一种药物组合物，其包括其量有效治疗接受所述组合物的哺乳动物个体中细菌感染或降低其风险的RNAIII-抑制肽(RIP)和抗生素，其中所述抗生素是氨基糖苷、β-内酰胺、头孢菌素或万古霉素。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述RIP包括
a.)序列YX2PX1TNF的五个邻接的氨基酸，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，且X2是K或S；或者
b.)其序列因两个取代或缺失而与序列YX2PX1TNF不同的氨基酸，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，且X2是K或S。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述RIP并非由序列YSPX1TNF组成，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸。
37.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述RIP包括序列因一个取代或缺失而与序列YX2PX1TNF不同的氨基酸，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，且X2是K或S。
38.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述RIP包括氨基酸序列YKPX1TNF，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸。
39.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述RIP序列中的X2是K。
40.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述RIP包括氨基酸序列IKKYX2PX1TNF，其中X1是C、W、I、或修饰氨基酸，且X2是K或S。
41.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述RIP包括序列PCTNF。
42.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述RIP包括序列YKPITNF。
43.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述RIP包括序列YKPWTNF。
44.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述RIP的长度是10个氨基酸。
45.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述RIP占所述组合物的大约0.1wt％至50wt％。
46.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述RIP占所述组合物的大约2wt％至20wt％。
47.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述RIP是提纯的。
48.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述的药物组合物进一步包括脂质体。
49.根据权利要求34所述的药物组合物，其进一步包括抗微生物肽。
50.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述抗生素是亚胺培南或万古霉素。
51.一种治疗哺乳动物个体中细菌感染或降低其风险的方法，其包括给予所述个体一种组合物，所述组合物包括其量有效治疗所述个体中细菌感染或降低起风险的RNAIII-抑制肽(RIP)和抗生素，其中所述抗生素是氨基糖苷、β-内酰胺、头孢菌素或万古霉素。
52.根据权利要求51所述的方法，其中治疗细菌感染或降低其风险包括预防临床症状发生、抑制临床症状发展、或减轻临床症状。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述细菌感染由抗生素耐受性细菌导致。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述细菌感染是细菌性脓毒症。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述细菌感染位于特定组织、皮肤或身体部位。
56.根据权利要求51所述的方法，其中所述感染是蜂窝织炎、角膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎或乳腺炎。
57.根据权利要求51所述的方法，其中所述细菌感染与生物膜相关。
58.根据权利要求51所述的方法，其中所述细菌感染由葡萄球菌属导致。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述细菌感染由金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌导致。
60.根据权利要求51所述的方法，其中所述细菌感染由芽孢杆菌属、枯草杆菌、蜡状芽孢杆菌、炭疽杆菌、李斯特氏菌属、无害李斯特氏菌、单核增生李斯特氏菌、酿脓链球菌、乳酸乳球菌、粪肠球菌、大肠杆菌或Clostridium acetobtylicum导致。
61.根据权利要求51所述的方法，其中给药是通过局部、口服、静脉内、腹膜内、肌内、经皮、经鼻或离子导入途径。
62.根据权利要求61所述的方法，其中给药是通过depot型***、包囊形式、植入物、或医疗装置上的涂层。
63.根据权利要求51所述的方法，其进一步包括给予个体抗微生物肽。
64.根据权利要求51所述的方法，其中所述个体是人。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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