CN100537763C - 水解核糖核酸（RNAs）的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于水解核酸的方法和化合物。特别地，本发明涉及用于优先切割RNA中特定位点的磷酸二酯键的化合物。

Description

水解核糖核酸(RNAs)的化合物
发明领域
本发明涉及水解核酸的方法和化合物。特别地，本发明涉及用于优先切割RNA中特定位点的磷酸二酯键的化合物。因此本发明特别是从反义策略(antisense strategies)的角度为研究与分子生物学有关的蛋白质工程领域和医学领域提供了一个有用工具。
发明背景
反义技术(antisense technology)是在发现DNA和/或RNA的转录或翻译能使用连接到靶核酸上的寡核苷酸进行调控的基础上建立起来的。这样的反义寡核苷酸被认为是与有意义的DNA或RNA靶核酸互补并且具有反向序列的寡核苷酸。当天然寡核苷酸被应用于反义策略时，即具有标准的、天然碱基和主链的寡核苷酸，其一般应该包含至少17个碱基才能有效激活RNaseH活性，从而具有向下调节基因表达的效果。
随着该领域的发展，已提出多种对于寡核苷酸的修饰，以使它们在被使用时更加稳定。特别地，如果将反义寡核苷酸引入到完整细胞中时，它们会暴露在RNA和DNA特异的核酸酶的攻击之下从而失去活性。已描述过的能抑制由核酸酶引起的降解的修饰体有2’-O-烷基或烯基(烯丙基)或炔基(alkynyl)核苷酸，封闭核酸(LNAs)，肽核酸(PNAs)，硫代磷酸酯，***啉寡核苷酸等。
在另一方向上，人工核糖核酸酶因为其在基因操纵上潜在的应用而受到重视。尤其是将RNA-切割分子连接到寡核苷酸(DNAs)的末端。这种寡核苷酸与靶RNA的特异序列杂交后切割RNA上的特定位点。在这方面，特别是使用了通过分子内酸碱的协同作用对水解敏感的胞嘧啶和腺嘌吟(CA)间的磷酸二酯键。水解发生在胞嘧啶核苷酸的3’-端上。
Komiyama等在J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1995，77-78中报道了将二乙烯三胺(DETA)通过氨基甲酸键锚定到19聚DNA的5’-末端的杂交体可以选择性的水解线性RNA胞嘧啶3’-末端，以产生具有3’-磷酸末端的22聚RNA片段。选择性切断是因为DNA-DETA加合物中乙二胺[-N(CH2)2NH2]部分中铵阳离子和中性胺中的分子内酸碱协作造成的。在温度50℃，pH值为8的条件下，孵育4小时后，只有10mol％的RNA被水解。
为了在这方面取得发展，Verheijen描述了一种具有10聚PNA的DETA加合物(Angew.Chem.Int.Ed.2000，39，369-372)。因为PNA能抵抗生物降解，同时由于PNAs和RNA(或DNA)键结合力比天然寡核苷酸更强，10个PNA单体的寡聚物长度足以用来杂交，因此PNA被选为寡核苷酸。DETA切割部分与PNA通过尿素键耦合。在靶RNA中，通过用胞嘧啶取代鸟嘌呤而引入另一个切割位点。实际上，靶RNA会在两个位点发生水解，并且在pH7，40℃孵育4小时后，RNA水解的总转化率大概为29％(需要注意的是这些条件相比komiyama试验中使用的条件能够更好的代表生理条件)。
下面就是两篇现有技术文献的示意性说明。第一个是Komiyama等所用到的RNA(30聚)和DNA-DETA的复合体，接下来的是Verheijen所用到的RNA(25聚)和PNA-DETA的复合体。DETA代表NH(CH2)2NH(CH2)2NH2。核苷酸单元由大写字母写出，PNA单元由小写字母写出。箭头标注了RNA通过DNA-DETA或PNA-DETA发生水解的切割位点。注意KomiyamaRNA中的19位的鸟嘌呤被Verheijen RNA中的胞嘧啶所替代。
Komiyama
                                        ↓
[RNA]         5’-GGAGGUCCUGUGUUCGAUCCACAGAAUUCG-3’
                    ●●●●●●●●●●●●●●●●●●●
[DNA-DETA]        3’-TCCAGGACACAAGCTAGGT-O(C＝O)-DETA
Verheijen：
                               6↓        17↓19↓
[RNA]                 5’-UCCUGUGUUCGAUCCACACAAUUCG-3’
                                ●●●●●●●●●●
[PNA-DETA]                3’-caagctaggt-NH(C＝O)-DETA
前面已经提到，Verheijen RNA在两个位点发生水解，即在C17和C19的3’-端。在孵育7小时后，RNA：PNA-DETA的比例是1：33，大约50％的RNA被水解了：其中大约15％是水解于C17的3’-端，35％水解于C19的3’-端。此外，Verheijen注意到，因U6的3’-端的断裂产生了少量的降解产品。此处断裂是因为10聚PNA寡聚体相当于1个螺旋—转角，位于与U6和G7间的磷酸二酯键相邻的RNA·PNA-DETA复合体的乙二胺残基处。
要考虑的该领域的其他现有技术是Komiyama等发表于Nucleic Acids SymposiumSeries No.29，1993，197-198.的“人工水解核酸酶和核糖核酸酶的分子设计(Moleculardesign of artificial hydrolytic nucleases and ribonucleases)”，该文献表明从靶tRNA中的两个可水解磷酸二酯键来看，距离末端水解核苷酸三个核苷酸的较远的键比距离末端水解核苷酸一个核苷酸的键更容易被水解。然而，需要应当注意的是，Komiyama等得到的人工水解核酸酶是分子建模研究的结果。有经验的读者应该知道，这些核酸酶是对杂交位点和发生水解的位点已进行了优化后得到的结果。
Verheijen等人的研究(前文所述)和Vlassov等人的研究，参见Antisense andNucleic Acid Drug Development，1997，vol.7，39-42，实际都上是建立在Komiyama得到的核酸酶基础上的。Verheijen等人和Vlassov等人都得到了和Komiyama同样地结论，即距离越远的可水解的磷酸二酯键越易被水解。Valssov等指出，可以通过优化将多聚酰胺基切割基团(polyamine-based cleaving group)和寡核苷酸连接起来的连接手臂的结构的长度和硬度，以及优化与寡核苷酸连接的连接手臂的位点来提高水解或者切割效率的机会。不建议进一步改变寡核苷酸和靶RNA杂交的位点。
本发明的目的是通过提供提高水解效率的化合物通过多胺介导的切割而提高现有技术化合物水解核酸的状况，尤其是提高水解的速率。
发明内容
现已发现负责核酸水解的多聚酰胺部分(polyamine moiety)到达连接多聚酰胺的寡核苷酸的距离和优化核酸水解的位点之间存在一种关系。在下文中，负责水解的多聚酰胺部分也被称为切割***(Cutter)。与所述切割***连接的寡核苷酸在下文中也被缩写为寡核酸(Oligo)。切割***和寡核苷酸之间的距离由共价连接二者的结构元素确定，并且在下文中被称为间隔区(Spacer)。更为方便地，由间隔区确定的距离用从寡核苷酸到切割***的原子数目来描述。被计算在内的原子是从寡核苷酸到切割***间构成直链的那些原子。该链上可能的取代基或者直链上的分枝都不能计算到由间隔区定义的原子数目中。
如果相对于将被水解的***位点，寡核苷酸复合体距离至少4个核苷酸远，那么相比现有技术的化合物的状况，令人惊讶地是，底物RNA在胞嘧啶—腺嘌呤序列中胞嘧啶的3’-末端的水解加倍了，负责水解的多聚酰胺部分与寡核苷酸之间的距离至少为在直链上的两个原子。
因此本发明涉及一种核糖核酸水解的方法，其中寡核苷酸或其类似物与包括至少两个氮原子的切割***耦合，所述核糖核酸水解中涉及所述的两个氮原子，且间隔区包括连接所述寡核苷酸的末端核苷酸或其类似物和所述切割***的直链上至少2个原子，在距离将被水解的***位点至少4个或者最多8个核苷酸处进行杂交。
本发明的另一方面涉及一种水解核糖核酸的化合物，所述化合物具有的结构是
寡核苷酸—间隔区—切割***
其中，
寡核苷酸是具有至少8个核苷酸的核糖核酸或其类似物，它能够以这样一种方式与靶核酸杂交以使末端核苷酸或其类似物与距离将被水解的位点至少4个核苷酸处且至多8个核苷酸处的核苷酸杂交，
间隔区将切割***与所述寡核苷酸的所述末端核苷酸共价连接，并且从寡核苷酸到切割***的直链上包括至少2个原子，
切割***是具有至少两个氮原子的多聚酰胺。
发明详述
在寻找有效并可靠操纵基因表达的方法中，本发明人研究了选择性水解靶核糖核酸的可能性。在这方面，关注点针对于通过多聚酰胺介导的切割磷酸二酯键起作用的人工核酸酶。
尽管Verheijen报道的现有技术***(见上文)中，孵育7小时后水解了大约50％的靶核酸，这个量还是令人满意的，但孵育24小时后也只有85％靶核酸被水解。除此之外，我们注意到靶核酸含有两个用于水解的***位点，而且出现了第三个意外的水解位点。因此该现有技术中的人工核酸酶水解的效率距离要求还有差距，尤其对于没有两个或三个而只有一个可选的水解位点的靶核酸。基于上述的现有技术中的靶核酸，我们使用下列合成的RNA序列：
    1    5   10   15   20   25
5’-UCCUGUGUUCGAUCCGCAGAAUUCG-3’
***水解位点由下划线标出。水解发生在下划线标出的胞嘧啶的3’-末端。当计算距离将被水解的位点的核苷酸数目时，胞嘧啶或者腺嘌呤中任意一个都可包括在内，寡核苷酸可以根据方向与5’-末端或3’-末端的任一方向分别进行杂交。因此，在上述给出的RNA序列的例子中，寡核苷酸的末端核苷酸或类似物与距离将被水解的位点至少4个核苷酸处杂交，该末端核苷酸与沿5’-末端方向的第一个尿嘧啶(U13)杂交。沿3’-末端方向，距离将被水解位点4个核苷酸处是位点22的尿嘧啶(U22)。
为了水解上面所述的靶核酸的***位置，使用乙二胺(ethylene diamine)作为切割***。为改变间隔区的长度，将甘氨酸残基***寡核苷酸和切割***之间。
寡核苷酸与距离将被水解的位点两个或三个核苷酸进行杂交，水解速率相似，且与间隔区中有没有、有一个或者两个甘氨酸残基无关。在pH7，温度为40℃，RNA与寡核苷酸—间隔区—切割***比率为1：33孵育7小时，得到10-20％的中度水解。孵育24小时后，水解率在25—30％间变化。
然而，寡核苷酸与将被水解的位点距离四个位置处发生杂交，却出现了明显的靶核糖核酸水解量增加的现象。尤其是对于间隔区包含5个原子的化合物来说，当RNA：寡核苷酸—间隔区—切割***比例为1：33，pH值为7，温度40℃下，孵育7小时后，水解率大于50％，24小时后，水解率超过95％。
此处所使用的术语“寡核苷酸”指核糖核酸或其类似物。这包括使寡核苷酸在生理环境中更为稳定的核糖核酸的衍生物。合适的衍生物的实例是2’-O-烷基，烯烃(烯丙基)或炔基核苷酸，2’-脱氧核糖核酸(DNA)，和/或2’-脱氧-2’-氟代核苷酸.优选的是2’-氧-甲基和2’-氧-烯丙基核苷酸.可供选择地或可替换的是磷酸二酯键的衍生物，如O—烷基化磷酸二酯或优选硫代磷酸酯。包含核苷酸类似物的寡核苷酸是指包括封闭核酸(LNAs)，肽核酸(PNAs)，和***啉核苷酸的寡核苷酸等。
寡核苷酸中合适的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、肌苷、2，6—氨基嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤，以及这些碱基的进一步的衍生物，如烷基、氨基、叠氮和/或卤素取代的碱基或脱氮碱基。本领域的熟练技术人员能够知道的并且对碱基的进一步的修饰体也同样是适合的。
本发明中的寡核苷酸具有至少8个核苷酸或其类似物的长度。一般而言，为了充分杂交，多于25个核苷酸(或其类似物)的长度将没有必要。至少10个核苷酸(或其类似物)的长度是优选的。
寡核苷酸具有两个位点可连接间隔区。该间隔区连接在5’-O或者3’-O的任一原子上。如果寡核苷酸在其任一端包括核苷酸的类似物，则该间隔区则连接到与5’-0或3’-0原子相应的核苷酸类似物内的原子上。
本发明中所使用的术语“间隔区”用于定义寡核苷酸和切割***之间的距离，用原子数目表示。原子数目是计算直链内从与寡核苷酸的末端核苷酸或其类似物上5’-O或3’-O原子相连的第一个原子开始，到与切割***耦合的最后一个原子。间隔区的末端位于切割靶RNA磷酸二酯键中所涉及的切割***的第一个氮原子。间隔区中的原子可以是熟悉本领域技术人员所知的任何合适原子，优选间隔区中的原子选自C，O，S，N和P，可以相同或不同。
间隔区可以是带支链的和/或间隔区中的原子可以被官能团的基团所取代。这些取代基可具有能检测本发明的化合物的官能团，例如间隔区可被荧光标记取代。这类标记众所周知。可供选择地或进一步的，间隔区也可以被能促进细胞膜通透性的基团所取代。这些基团可以是与细胞膜的脂质双分子层易于发生相互作用的疏水基，和/或可以是与穿过细胞膜有关的受体或酶相互作用的的基团。
应当理解间隔区-切割***部分例如可以完全包括聚乙胺(polyetheleneamine)。因为与寡核苷酸中末端核苷酸或其类似物连接的前两个原子被认为与磷酸二酯键的水解无关，所以它们不是切割***的一部分。
本发明中使用的术语“切割***”指含有至少两个氮原子的多聚酰胺。切割***包含至少一个二级氮原子或者三级氮原子，可任选的，切割***也可以再有至少一个二级或三级氮原子，优选的是切割***包含至少另一个一级氮原子。多聚酰胺介导的磷酸二酯的切割在本领域是众所周知的，熟练的技术人员能够运用合适的切割***部分。举例而言，合适的切割***包括乙二胺、二乙烯三胺(diethylenetriamine)，三(2-氨基乙基)胺，乙胺基的树枝状聚合物(ethyleneamine based dendrimers)，季戊四醇胺(pentaerythrityltetraamine)，精胺，亚精胺，二氮-、三氮-、或者四氮环烷(tetraazacycloalkyl)化合物，如对二氮己环，环烯，四氮茂基癸烷(tetraazacyclopentadecane)，四氮环十四碳烷(tetraazacyclotetradecane)，四氮十一碳烷(tetraazaundecane)，三氮环壬烷(triazacyclononane)，三氮环十二烷(triazacyclododecane)等，以及它们的衍生物。
在一个实施例中，本发明化合物中的寡核苷酸包含作为核苷酸类似物的PNA。
在另一个实施例中，本发明化合物中的寡核苷酸是2’-O-烷基，优选甲基或烯丙基，硫代磷酸酯作为核苷酸类似物。
在一个实施例中，本发明化合物是这样一个化合物，其中所述寡核苷酸的所述末端核苷酸或其类似物与距离将被水解的位点的四个核苷酸处发生杂交，直链内从寡核苷酸到达切割***的原子数目为4—6，优选是5。
当寡核苷酸与距离***位置超过4个位置处进行杂交时，优选是增加间隔区的长度，其中所述的***位置是核糖核酸被水解的地方。在一个实施例中，寡核苷酸与距离被水解的***位置超过4个位置每一个位置进行杂交时，间隔区的长度至少增加6个原子。因此对于寡核苷酸-间隔区-切割***与距离将被水解的***位置5个原子处杂交时，间隔区优选含有至少8个原子，对寡核苷酸-间隔区-切割***与距离将被水解的***位置6个原子处杂交时，间隔区优选含有至少14个原子，对寡核苷酸-间隔区-切割***距离将被水解的***位置7个原子处杂交时，间隔区优选含有至少20个原子，对寡核苷酸-间隔区-切割***距离将被水解的***位置8个原子处杂交时，间隔区优选含有至少26个原子，以此类推。
在另一个实施例中，本发明的化合物是这样一个化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其类似物与距离将被水解的位点5个位置处进行杂交时，直链内从寡核苷酸到达切割***的原子数目为10—12，优选是11。
在另一个实施例中，本发明的化合物是这样一个化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其类似物与距离将被水解的位点6个位置处进行杂交时，直链内从寡核苷酸到达切割***的原子数目为16—18，优选是17。
在另一个实施例中，本发明的化合物是这样一个化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其类似物在距离被水解的位点7个位置的地方进行杂交时，直链内从寡核苷酸到达切割***的原子数目为22—24，优选是23。
在另一个实施例中，本发明的化合物是这样一个化合物，其中所述的寡核苷酸的所述末端核苷酸或其类似物在距离被水解的位点6个位置的地方进行杂交时，直链内从寡核苷酸到达切割***的原子数目为28—30，优选是29。
末端核苷酸或其类似物的杂交位点距离将被水解的***位置的上限是8，优选7，更优选6。间隔区最大长度是30个原子。
本发明中的化合物可以通过本领域内已知的工艺合成。优选的是，该化合物通过自动化的程序合成。举例而言，指定长度和组成成分的寡核苷酸可以在DNA/RNA合成器中程序化的生产出来。对于熟练操作员而言，制备间隔区-切割***部分也是日常工作，该部分包括将所需长度的间隔区耦合到所需的切割***上。具体实例可参看Verheijen等(Angew.Chem.Int.Ed.2000，39，369-372)。这样的间隔区-切割***部分具有与末端核苷酸或核苷上的3’-O或5’-O(优选)耦合的合适的官能团。可供选择地，对于熟练的技术人员来说，用5’-N代替5’-O并与具有合适官能团的间隔区-切割***通过氮耦合是一件日常工作，例如参看上文所述Komiyama描述的方法。合适的方法请参看文献J.Org.Chem.2000，65，4900-4907，Angew.Chem.hit.Ed.，2001，40，2004-2021和更详细的介绍参看J.Org.Chem.，2003，68，609-612，Bioconjug.Chem.，2003，14，276-28。可供选择地，可以使用二硫桥跨接(scan)，这需要引入5’-S或通过传统的马来酰亚胺耦合。可供选择地，使用标准的亚磷酰胺(phosphoramidite)化学方法使间隔区-切割***部分与核苷耦合。这使得任意类型的核糖核酸(相似物)或其类似物可结合到本发明中的化合物中，实例参考Bioconjugate Chem.2002，13(5)，1071。
制备包含PNA作为核苷酸结构单元的本发明的化合物的一种合适的方法由Verheijen提出并已在上文中讨论。
本发明提供了能在各种治疗，诊断，农业，靶识别，基因发现，基因工程以及基因药物方面进行应用的有用的化合物和方法。
一方面，本发明涉及一种使核糖核酸在预定的位置进行水解的方法，在该位置处，靶核糖核酸和本发明的化合物相接触。
可以将本发明的化合物设计成通过靶向各种RNA分子以抑制基因表达。在一个实施例中，使用本发明的化合物靶向与靶基因对应的多种RNAs。这种RNAs的不受限的例子包括信使RNA(mRNA)、靶基因的各种选择性RNA剪接变体(alternate RNA splice variants)、靶基因转录后的修饰的RNA、靶基因的mRNA前体。若选择性的剪接产生一组使用合适的外显子可被识别的转录片段，本发明可用于通过适当的外显子特异性的抑制而抑制基因的表达或区别基因家庭成员间的功能。
本发明的化合物可被用作诊断剂，治疗剂并作为研究试剂和试剂盒。通过将有效量的本发明化合物加入到合适的药物上可接受的稀释剂或载体而将它们应用到药物组合物中。进一步地，可以将它们应用于治疗以产生非需要蛋白质为特征的疾病的生物机体中。该机体可以和本发明化合物接触，其中本发明的化合物含有的序列能够与编码非需蛋白质的靶核酸链特异地杂交。因此，为了调控基因表达，优选预先选择将被调控的RNA部分包括编码其形成需要被调控的蛋白质的RNA部分。因此，将所使用的寡核苷酸设计成能与预先选择的靶RNA部分进行特异的杂交。在一个实施例中，将寡核苷酸设计成与mRNA特异连接的化合物，其中所述的mRNA所编码的蛋白质的产生需要调控。
治疗组合物的配方和它们随后的给药属于本领域的范畴。一般而言，对治疗学而言，需要这种治疗的病人服用本发明的化合物，通常是通过药物上可接受的载体，根据病人的年龄、治疗状况的病情严重性，从0.01微克到100克每千克体重来确定具体剂量。进一步地，治疗可以是单一剂量，也可以是需要一段时间的治疗方案，这都需要基于具体的病症，病情严重程度以及病人总体的情况来判断，最终由专业医生来确定。有些情况下将本发明中的化合物和其他传统治疗方法的结合起来能达到更好的治疗效果。
本发明的药物组合物可以通过多种方法给药，这取决于是局部或者***治疗的需要，及治疗的范围决定。给药可以是局部性的(包括眼，***，直肠，鼻内，皮肤)，口服或肠胃外给药，肠胃外给药包括静脉点滴，皮下注射，腹膜注射，肌内注射，或膜内给药或心室内给药。
局部给药配方主要包括皮肤外敷片，油膏，乳液，霜类，凝胶，滴露，栓剂，喷雾剂，液体及粉末。传统药物载体，水，粉，油基，稠化剂等是必需和让人满意的，避孕套、手套等也是可用的。
口服给药组合物主要包括粉和颗粒，水或其他非水介质的悬液或者溶液，胶囊，袋或药片。可使用稠化剂，调味剂，稀释剂，乳化剂，分散剂或粘接剂。
膜内或心室内给药的组合物可以包括无菌水溶液，其中可以含有缓冲剂，稀释剂和其他合适的添加剂。
肠胃外给药配方可以包括无菌水溶液，其中可以含有缓冲剂，稀释剂和其他合适的添加剂。
本发明可以应用于多种生物机体，其范围包括单细胞原核和真核有机体到多细胞真核有机体。任何利用DNA-RNA转录或RNA-蛋白翻译作为其遗传，新陈代谢或细胞机制的基本部分的有机体都可以使用这样的治疗和/或预防方法。看起来形式多样的有机体，如细菌，酵母，原生动物，藻类，植物和高等动物，包括恒温动物，都可以通过该方法来进行治疗。进一步的，因为多细胞真核生物中的每个细胞都包含DNA-RNA转录和RNA蛋白质的翻作为其细胞活动的主要部分，上述治疗和/或诊断方法也能应用于这样的细胞群体上。更进一步的，很多细胞器，如真核细胞中的线粒体和叶绿体，也包含转录和翻译机制。同样地，单细胞，细胞群体，细胞器都可以被涵盖在能够接受本发明中化合物治疗、诊断的有机体定义中。如这里所用的治疗包括对病的根除，杀死某有机体，如细菌，原生动物或其他传染病，或对一些异常或不需要的细胞生长或表达进行调控。
实施例
实施例1
作为在自动化标准DNA/RNA合成器中所使用的合适的结构单元，使用下面所表示的亚磷酰胺。在左下的结构图中，连接手臂为上文所述间隔区的一部分，因此可从下面所示的通式结构图中省略掉。PG代表保护基团，优选不稳定的基团。连接手臂可以是甘氨酸部分，并且PG也可以是如下结构中所示的Fmoc。所述的亚磷酰胺可以结合到任何类型的RNA(寡核苷酸)或其类似物中。
Figure C200580007832D00141
在将上述的间隔区具有10个原子的亚磷酰胺与寡核苷酸结合后，得到了下面左图所表示的结构。这个例子中，间隔区有10个原子。为了说明寡核苷酸类似物2’-O-甲基硫代磷酸酯RNA和PNA分别表示在中间和右边。
Figure C200580007832D00142
作为替代，使用了能够结合到5’—末端的间隔区—切割***部分，如下所示。在该间隔区—切割***部分中间隔区的长度是变化的。在下面详细描述的实施例中间隔区分别含4个和10个原子。可以很清楚的看出，间隔区的长度是很容易改变的。
Figure C200580007832D00151
实施例2
合成的RNA(tRNAPhe部分具有一个点突变：G—16取代了C—16)用于切割实验(下划线：切割位置)：
5’-UCC UGU GUU CGA UCC GCA GAA UUC G-3’
合成了下面的PNA-切割***序列，其中Gly代表甘氨酸，n＝0-2，切割***是：
3’-H2NCO-ca caa gct agg(Gly)n-COCH2-切割***   (2)
3’-H2NCO-aca caa gct ag(Gly)n-COCH2-切割***   (3)
3’-H2NCO-g aca caa gct a(Gly)n-COCH2-切割***  (4)
3’-H2NCO-gg aca caa gct(Gly)n-COCH2-切割***   (5)
3’-H2NCO-gg aca caa gct(Gly)3-COCH2-切割***   (5)
数字(2)、(3)、(4)和(5)指寡核苷酸距离将被水解的***位点进行杂交的位置数目。每个(2)、(3)、(4)和(5)结合0，1或2个甘氨酸残基，间隔区长度变化。
PNA合成
本研究中使用的PNAs由PNA合成器(Perseptive生物***，加速核酸合成***)通过固相合成法生产。所有溶剂(Biosolve)都使用原溶液。固相合成是在作为固支撑的PEG-PS珠上使用rink—amide作为链接剂进行的(上样量：0.17微mol/毫克)。按照合成手册上描述的标准方案实现PNAs的合成，使用Fmoc化学和环外胺受Bhoc保护(Perseptive生物***)的单体，以0.2umol为起始合成量。首先耦合是双倍的。将Fomc—苷氨酸和diBoc保护的切割***结构单元耦合到仍在树脂上的PNA寡聚体的N—末端(5’)上，在遵循标准协议的情况下，通过合成器上的可用位置实现双耦合。diBoc保护的切割***结构单元(HO2CCH2NBocCH2CH2NHBoc)是通过直接液相有机化学方法合成得到的，质谱及1H-和13C核磁共振光谱为其全部特征。
寡聚体从树脂上切割下来，在酸性环境(TFA/TIS/H2O，9/1/1，v/v/v)中被完全去保护。并在装备Altima C18柱(10 x 250mm)的JASCO HPLC***中进行反相高效液体色谱提纯和分析。在40摄氏度条件下进行梯度洗脱，以缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)，并采用缓冲液B(0.1％TFA乙腈/水，3/1，v/v)流速为4毫升/分钟的梯度开始。得到的PNAs被冷冻干燥，并利用矩阵激光解吸附/电离飞行时间质量光谱测定(MALDI-TOF MS)和反相高效液体色谱分析确定特征。
切割实验：
在含有NaCl(100mM)及EDTA(0.1mM)的TRIS缓冲液(10mM，pH7)中用PNA-切割***处理32P 5’-标记的25聚RNA得到以下浓度：
[RNA]＝60nM，[PNA-切割***]＝2μM。于40℃下将样本(70μL)孵育7或24小时。在此之后，添加NaOAc(3M，pH5，7μL)、EtOH(225μL)和10μg/μLtRNA(1μL)，RNA立即发生沉淀。沉淀后的RNA通过离心过滤，干燥和在水(5μL)和上样缓冲液(5μL)中再溶解进行复性。溶液在90摄氏度被加热1分钟，离心，在含有8M尿素的20％变性的聚丙烯酰胺电泳凝胶上进行分析。使用的对照有：RNA，RNA碱基梯和T1消化的RNA。
结果
对照RNA在孵育7小时后和24小时后水解了大约10％。对化合物序列号(2)和(3)，RNA在孵育7小时后水解了20％左右或更少，孵育24小时后为40％或更少。
只有从化合物序列号(4)得到了合理的RNA速率水解，即，对N＝0，1，2，RNA在孵育7小时后至少水解30％。对化合物(4)n＝1，在孵育24小时后获得了几乎可以量化的水解速率。
对化合物(4)，n＝1的优化显示孵育2小时后，在RNA/本发明的化合物比例为1：10大约50％RNA被水解。当比例为1：40，孵育2小时后有75％发生水解。比例为1：10和1：20时，分别孵育8小时和6小时后，75％或更多RNA发生水解。对于后者比例，孵育24小时后水解速率几乎可进行量化。
(5)号化合物最佳水解开始于n＝2。
实施例3
合成RNA(E.Coli AcpP mRNA部分)用于切割实验(下划线：切割位置)：
5’-A UUU AAG AGU AUG AGC ACU AUC GAA-3’
合成下列PNA-切割***序列，其中Gly代表甘氨酸，切割***是：
Figure C200580007832D00171
3’-H2NCO-aaa ttc tca t-Cys(NHR)S-CH2CO-Gly-NHCH2CH2-切割***
其中R＝Ac或                         (A)
CH2NHCO(CH2)4NH-Lys(PhePheLys)3-NH2或(B)
CH2(OCH2CH2)2NH-Lys(PhePheLys)3-NH2  (C)
注意化合物B和C的间隔区中包含能帮助化合物穿过细胞膜的肽Lys(PhePheLys)3。
体外RNA降解的研究
所有缓冲液均由高纯度MilliQ水经消毒在使用前制成。将放射活性标记的25聚RNA和待测的耦合体(A，B，C作为对照RNA并且C中没有切割***)混和于三羟甲基氨基甲烷和盐酸(Tris—HCl)的缓冲液(10mM，pH7)中，其中含有氯化钠(100mM)及乙二胺四乙酸(0.1mM)，得到以下浓度：
[RNA]＝60nM，[耦合体]＝2uM，这由A260值标定。样品(70uL)在40摄氏度孵育16个小时。孵育之后，添加3M NaOAc(pH5，7uL)，EtOH(225uL)和10ug/uL的tRNA(1uL)，RNA立即沉淀。通过离心，干燥，然后重新溶解于5uL水和5uL上样缓冲液使沉淀后的RNA的复性。溶液在80摄氏度被加热1分钟，离心，并在20％变性电泳凝胶上进行分析。将凝胶暴露于磷屏(分子动力学)下，同时RNA碎片的密集度由Personal Molecular Imager FX分子成像***(Bio—Rad)通过扫描所暴露的屏进行量化，然后通过Quangtity One软件(Bio—Rad)进行电脑分析。
结果
化合物A、B和C和阴性对照与25聚32P标记的RNA一起孵育，所述RNA的序列和E.ColiAcpP mRNA的部分序列一样。在40摄氏度，pH7的条件下，孵育16小时后，RNA片段被沉淀，而后施加到20％变性电泳凝胶上并被定量。
令人满意的是，将RNA和耦合体B、C以及不含肽的PNA-DETA A的共同孵育，产生了两种主要的RNA降解产品，由在标记的CA和UA点的切割而产生。切割位点通过将T1消化的RNA带与和基本的水解阶梯的带移动来确定。片段点的密集度揭示了与阴性对照(如，PNA-肽耦合体没有切割***和RNA没有任何附加的耦合)相比，RNA和PNA-DETA A孵育产生了显著的RNA切割(20％)，本底(background)切割只有约3.5％。发现耦合体B、C水解效率之间的显著差异。相比于阳性对照18(20％)，耦合体B表现出切割效率(30％)得到提高，而耦合体C切割了10％的靶RNA。
实施例4
在3’-末端包含间隔区—切割***的寡核苷酸
使用商业上可购的包含Dde链接剂的树脂被进行PNA合成。
Figure C200580007832D00181
从这个树脂开始，后续的PNA合成产生下面的寡核苷酸：
3’—切割***—CH2CH2NH—(Gly)n—CO—PNA序列—NHAc—5’
切割***的定义如下：
Figure C200580007832D00191
“CO”是PNA-寡核苷酸的3’—末端和NHAc是5’-末端。
对间隔区—切割***，基于DNA/RNA的3’—末端的寡核苷酸应用了在实施例1中描述的策略。

Claims (15)

1.用于核酸水解的化合物，所述化合物具有以下结构：
寡核苷酸-间隔区-切割***
其中，
所述寡核苷酸是具有至少8个核苷酸或其类似物的核糖核酸，所述类似物选自2’-O-烷基、烯基或炔基核苷酸、2’-脱氧核糖核酸、2’-脱氧-2’氟核苷酸、含有O-烷基化磷酸二酯的核苷酸、含有硫代磷酸酯的核苷酸、肽核酸和锁核酸，所述寡核苷酸能以这样一种方式与靶核酸杂交，其末端核苷酸或其类似物与距离将被水解的位点至少4个核苷酸和最多8个核苷酸处的核苷酸杂交，
其中所述的间隔区连接在所述的寡核苷酸的5’末端上，所述间隔区将所述的切割***共价连接到所述寡核苷酸的所述末端核苷酸上，并且包括从寡核苷酸到切割***的直链上的至少2个原子，
所述的切割***是含有至少2个氮原子的多聚酰胺。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述的寡核苷酸包括肽核酸作为核苷酸类似物。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述的寡核苷酸包括2’-O-烷基硫代磷酸酯作为核苷酸类似物。
4.如权利要求3所述的化合物，其中所述的寡核苷酸包括2’-O-甲基硫代磷酸酯作为核苷酸类似物。
5.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述间隔区包括一个或者多个氨基酸。
6.如权利要求5所述的化合物，其中所述的间隔区包括甘氨酸。
7.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述间隔区通过酰胺键与所述寡核苷酸耦合。
8.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述切割***是乙二胺。
9.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述寡核苷酸的所述末端核苷酸或其类似物距离将被水解的位点4个位点，并且从寡核苷酸到切割***的直链上原子数目为4-6。
10.如权利要求9所述的化合物，其中从寡核苷酸到切割***的直链上原子数目为5。
11.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述寡核苷酸的所述末端核苷酸或其类似物距离将被水解的位点5个位点，并且从寡核苷酸到切割***的直链上原子数目为10-12。
12.如权利要求11所述的化合物，其中从寡核苷酸到切割***的直链上原子数目为11。
13.在预定位点体外水解核糖核酸的方法，其中靶核糖核酸与前述任一权利要求所述的化合物接触。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述核糖核酸是信使核糖核酸。
15.一种药物组合物，所述的药物组合物包括权利要求1-12中任一权利要求所述的化合物和药学上可接受的载体和稀释剂。
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