DE602004006599T2 - Verbindungen zur Hydrolyse von Ribonukleinsäuren (RNS) - Google Patents

Verbindungen zur Hydrolyse von Ribonukleinsäuren (RNS) Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Verbindungen zum Hydrolysieren von Nukleinsäuren. Sie betrifft insbesondere Verbindungen, die für die bevorzugte Spaltung einer Phosphodiesterbindung an einer spezifischen Position in der RNA verwendet werden können. Die Erfindung liefert somit ein brauchbares Werkzeug für Studien auf dem Gebiet der molekularbiologischen Wissenschaft, auf dem Sektor des Protein-Engineering und auf medizinischem Gebiet, insbesondere in Hinblick auf Antisense-Strategien.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Antisense-Technologie basiert auf dem Fund, dass DNA- und/oder RNA-Transkription oder -Translation unter Verwendung eines Oligonukleotids moduliert werden können, das an die Ziel-Nukleinsäure bindet. Diese Antisense-Oligonukleotide sind als Nukleotide bekannt, die zu der tatsächlichen DNA- oder RNA-Zielnukleinsäure komplementär sind und eine in Gegenrichtung orientierte Sequenz aufweisen. Wenn in einer Antisense-Strategie natürliche Oligonukleotide verwendet werden, d. h. Oligonukleotide mit natürlichen Standard-Basen und Standard-Grundgerüst, sollten diese im Allgemeinen mindestens 17 Basen enthalten, um die RNaseH-Aktivität effektiv zu aktivieren und dadurch eine abwärtsregulierende Wirkung auf die Gen-Expression zu zeigen.
  • Im Verlauf der Entwicklungen auf diesem Sektor sind verschiedene Modifikationen der Oligonukleotide vorgeschlagen worden, wodurch sie unter den Bedingungen, unter denen sie verwendet werden, stabiler gemacht werden. Wenn Antisense-Oligonukleotide in intakte Zellen eingeführt werden, sind sie insbesondere Angriffen von RNA- und DNA-spezifischen Nukleasen ausgesetzt, die zu einem Aktivitätsverlust führen. Modifikationen zur Inhibierung des Abbaus durch Nukleasen, die beschrieben worden sind, sind 2'-O-Alkyl- oder -Alkenyl- (Allyl) oder Alkinyl-Nukleotide, Locked-Nukleinsäuren ("verschlossene" Nukleinsäuren, LNAs), Peptid-Nukleinsäuren (PNAs), Phosphorthioate, Morpholinverbindungen, usw.
  • In einer anderen Richtung haben künstliche Ribonukleasen wegen ihrer möglichen Verwendung für die Genmanipulation die Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Insbesondere RNA spaltende Moleküle sind an die terminalen Enden von Oligonukleotiden (DNAs) gebunden worden. Die Oligonukleotide hybridisieren an eine spezifische Sequenz in einer Ziel-RNA, gefolgt von Spaltung der RNA an einer spezifischen Stelle. In dieser Hinsicht ist insbesondere die Anfälligkeit der Phosphodiesterbindung zwischen einem Cytosin und Adenosin (CA) gegenüber Hydrolyse mittels intramolekularer Säure-Base-Kooperation untersucht worden. Die Hydrolyse erfolgt an der 3'-Stelle des Cytosin-Nukleotids.
  • Komiyama et al. berichteten in J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1995, 77-78, dass ein Hybrid von Diethylentriamin (DETA), das mittels einer Carbamat-Bindung an dem 5'-Ende eines DNA 19-mers verankert war, lineare RNA selektiv am 3'-Ende von Cytosin hydrolysierte, um ein 22-mer-RNA-Fragment mit einem 3'-Phosphatterminus zu ergeben. Die selektive Spaltung wurde der intramolekularen Säure-Base-Kooperation eines Ammoniumkations und eines neutralen Amins in der Ethylendiamin-[-N(CH2)2NH2]-Einheit des DNA-DETA-Addukts zugeschrieben. Bei pH 8 für 4 Stunden wurden bei 50°C nur 10 Mol.% RNA hydrolysiert.
  • Die JP 10 191970 offenbart auch eine künstliche Ribonuklease, wobei der Polyethylendiaminrest (= Cutter; Abschneider) an eine mittlere Stelle des Oligomers gebunden wird und direkt neben der Position positioniert wird, die in der Ziel-DNA gespalten werden soll.
  • In einem Versuch, dies zu verbessern, beschrieb Verheijen ein Addukt von DETA mit einer 10-mer PNA (Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 369-372). PNA wurde als Oligonukleotid gewählt, weil es Bioabbau widersteht und, da PNAs stärker an RNA (oder DNA) als natürliche Oligonukleotide binden, ein Oligomer aus 10 PNA-Monomeren eine ausreichende Länge für die Hybridisierung hat. Die DETA-Spaltungseinheit wurde über eine Harnstoffbindung an die PNA gekoppelt. In der Ziel-RNA wurde eine weitere Spaltungsstelle eingeführt, indem ein Guanosin durch ein Cytosin ersetzt wurde. In der Tat wurde die Ziel-RNA an zwei Positionen hydrolysiert, und die Gesamtumwandlung für die RNA-Hydrolyse betrug nach Inkubation bei pH 7 für 4 Stunden bei 40°C ungefähr 29% (es sei darauf hingewiesen, dass diese Bedingungen sich den physiologischen Bedingungen besser annähern als diejenigen, die von Komiyama verwendet wurden).
  • Das Folgende ist eine schematische Darstellung dieser beiden Dokumente des Standes der Technik. Zuerst ist der Komplex von RNA (30-mer) mit DNA-DETA abgebildet, wie er von Komiyama et al. verwendet wurde, gefolgt von dem Komplex von RNA (25-mer) mit PNA-DETA von Verheijen. DETA steht für NH(CH2)2NH(CH2)2NH2. Nukleotideinheiten sind in Großbuchstaben geschrieben, PNA-Einheiten in Kleinbuchstaben. Der Pfeil zeigt auf die Spaltungsposition von RNA für die Hydrolyse durch DNA-DETA oder PNA-DETA. Es sei darauf hingewiesen, dass das Guanosin in der Komiyama-RNA an Position 19 durch Cytosin in der Verheijen-RNA ersetzt worden ist.
    Figure 00040001
  • Wie bereits erwähnt wird die Verheijen-RNA an zwei Positionen hydrolysiert, nämlich an der 3'-Seite von C17 und C19. Nach 7 Stunden Inkubation betrug das Verhältnis von RNA:PNA-DETA 1:33, ungefähr 50% der RNA wurden hydrolysiert: ungefähr 15% an der 3'-Seite von C17 und ungefähr 35% an der 3'-Seite von C19. Verheijen bemerkte zudem ein geringfügiges Abbauprodukt, das aus der Spaltung an der 3'-Stelle von U6 resultierte. Diese Spaltung wird der Tatsache zugeschrieben, dass ein 10-mer-PNA-Oligomer einer Helixumdrehung entspricht, die in einem RNA·PNA-DETA-Komplex den Ethylendiaminrest in enger Nähe zu der Phosphodiesterbindung zwischen U6 und G7 positioniert.
  • Anderer relevanter Stand der Technik auf diesem Gebiet, der betrachtet werden soll, ist Komiyama et. al.: "Molecular design of artificial hydrolytic nucleases and ribonucleases" in Nucleic Acids Symposium Series Nr. 29, 1993, 197-198. Dieses Dokument zeigt, dass von zwei möglichen hydrolysierbaren Phosphodiesterbindungen in einer Ziel-tRNA die weiter entfernte Bindung, die sich drei Nukleotide von dem terminalen Hybridisierungsnukleotid entfernt befindet, leichter hydrolysiert wird als die Bindung, die ein Nukleotid von dem terminalen Hybrodisierungsnukleotid entfernt ist. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass die künstlichen hydrolysierenden Nukleasen von Komiyama et al. das Ergebnis von Molecular-Modelling-Studien sind. Dies lehrt den versierten Leser, dass diese Nukleasen bereits das Ergebnis von Optimierung der Hybridisierungsposition und der Position sind, an der Hydrolyse stattfindet.
  • Die Nukleasen von Komiyama waren der Ausgangspunkt für Verheijen et al. (siehe oben) und für Vlassov et al., siehe Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 1997, Band 7, 39-42. Sowohl Verheijen et al. als auch Vlassov et al. kommen zu dem gleichen Schluss wie Komiyama, dass die weiter entfernte hydrolysierbare Phosphodiesterbindung leichter hydrolysiert wird. Vlassov et al. schlagen vor, dass es Raum für Verbesserung der Hydrolyse- oder Spaltungseffizienz gibt, indem die Länge und Rigidität der Verknüpferstruktur (Linkerstruktur) optimiert werden, welche eine Abspaltungsgruppe auf Polyaminbasis mit einem Oligonukleotid verknüpft und die Befestigungsstelle des Verknüpfers an dem Oligonukleotid optimiert. Es wird nicht vorgeschlagen, zusätzlich die Hybridisierungsposition des Oligonukleotids an eine Ziel-RNA zu variieren.
  • Die vorliegende Erfindung strebt die Verbesserung von Verbindungen des Standes der Technik zum Hydrolysieren von Nukleinsäuren durch Polyamin-vermittelte Spaltung an, indem Verbindungen mit verbesserter Hydrolyseeffizienz bereitgestellt werden, wodurch insbesondere die Hydrolysegeschwindigkeit erhöht wird.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist gefunden worden, dass es eine Beziehung zwischen dem Abstand einer Polyamineinheit, die für die Hydrolyse einer Nukleinsäure zu dem Oligonukleotid verantwortlich ist, an das das Polyamin gebunden ist, und der Position gibt, an der die Nukleinsäure optimalerweise hydrolysiert wird. Im Folgenden wird die Polyamineinheit, die für die Hydrolyse verantwortlich ist, auch als Abschneider ("Cutter") bezeichnet. Das Oligonukleotid, an das der Abschneider gebunden ist, wird nachfolgend auch mit Oligo abgekürzt. Der Abstand zwischen dem Abschneider und dem Oligo wird durch ein Strukturelement festgelegt, wel ches die beiden kovalent verknüpft und hier im Folgenden als Abstandshalter ("Spacer") bezeichnet wird. Der Abstand, den der Abstandshalter festlegt, wird zweckmäßig als Zahl der Atome von Oligo zum Abschneider beschrieben. Die Atome, die gezählt werden, sind jene, die eine gerade Kette von Oligo bis zum Abschneider bilden. Mögliche Substituenten oder Verzweigung einer derartigen Kette tragen nicht zu der Zahl der Atome bei, die durch den Abstandshalter definiert wird.
  • Die Hydrolyse einer Substrat-RNA an dem 3'-Ende eines Cytosins in einer Cytosin-Adenosin-Sequenz wurde überraschenderweise verglichen mit Verbindungen des Standes der Technik verdoppelt, wenn die Komplexierung des Oligonukleotids, bezogen auf die für die Hydrolyse vorgesehene Position, mindestens 4 Nukleotide entfernt endet und der Abstand zwischen einer Polyamineinheit, die für die Hydrolyse verantwortlich ist, und dem Oligonukleotid mindestens 2 Atome in einer geraden Kette beträgt.
  • Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Hydrolyse von Ribonukleinsäure, bei dem ein Oligo oder Imitator (Mimetikum) desselben, das an einen Abschneider konjugiert ist, der mindestens 2 Stickstoffatome umfasst, wobei die beiden Stickstoffatome an der Hydrolyse der Ribonukleinsäure beteiligt sind, und wobei es einen Abstandhalter gibt, der mindestens 2 Atome in einer geraden Kette umfasst, die ein endständiges (terminales) Nukleotid oder Imitator desselben von dem Oligo und den Abschneider verknüpft, mindestens 4 und höchstes 8 Nukleotide von der vorgesehenen Position, die hydrolysiert werden soll, hybridisiert.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Verbindung für eine Nukleinsäurehydrolyse, wobei die Verbindung eine Struktur
    Oligo-Abstandshalter-Abschneider
    aufweist, wobei
    Oligo eine Ribonukleinsäure mit mindestens 8 Nukleotiden oder ein Imitator dafür ist, der in der Lage ist, an eine Zielnukleinsäure auf eine solche Weise zu hybridisieren, dass ein endständiges Nukleotid oder ein Imitator dafür an ein Nukleotid mit mindestens 4 Nukleotiden und höchstens 8 Nukleotiden entfernt von der zu hydrolysierenden Position hybridisiert,
    Abstandshalter den Abschneider kovalent mit dem endständigen Nukleotid von Oligo verbindet und mindestens zwei Atome in einer geraden Kette von Oligo zum Abschneider umfasst,
    Abschneider ein Polyamin mit mindestens zwei Stickstoffatomen ist.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Bei der Suche nach Verfahren, um die Genexpression effizient und zuverlässig zu modulieren, haben die Erfinder der vorliegenden Erfinder die Möglichkeit untersucht, Zielribonukleinsäuren selektiv zu hydrolysieren. In dieser Hinsicht haben sie sich mit künstlichen Nukleasen befasst, die durch Polyamin-vermittelte Spaltung der Phosphodiesterbindungen wirken.
  • Obwohl das System des Standes der Technik, von dem Verheijen (bereits zitiert) berichtet, nach 7 Stunden Inkubation eine nennenswerte Menge von ungefähr 50% Zielnukleinsäure hydrolysierte, waren nach 24 Stunden Inkubation nur 85% Zielnukleinsäure hydrolysiert. Es sei zudem darauf hingewiesen, dass die Zielnukleinsäure zwei vorgesehene Hydrolysestellen enthielt und ferner eine dritte, eher versehentliche Hydrolysestelle vorhanden war. Die Hydrolyseeffizienz dieser künstli chen Nuklease des Standes der Technik lässt somit noch Wünsche offen, insbesondere in Bezug auf Zielnukleinsäuren mit nicht drei oder zwei, sondern nur einer optionalen Stelle für die Hydrolyse.
  • Bezogen auf die oben erwähnten angestrebten Nukleinsäuren des Standes der Technik wurde die folgende synthetische RNA-Sequenz verwendet:
    Figure 00080001
  • Die vorgesehene Hydrolyseposition ist unterstrichen. Die Hydrolyse erfolgt am 3'-Ende des unterstrichenen Cytosins. Wenn man die Zahl der Nukleotide ausgehend von der zu hydrolysierenden Position zählt, ist entweder das Cytosin oder Adenosin eingeschlossen, was davon abhängt, in welcher Richtung, entweder zu dem 5'-Ende oder 3'-Ende, ein Oligo hybridisiert. Im Beispiel der oben gegebenen RNA-Sequenz hybridisiert ein Oligo, an das ein endständiges Nukleotid oder Imitator davon hybridisiert, mindestens 4 Nukleotide von der zu hydrolysierenden Position entfernt, wobei dieses endständige Nukleotid an das erste Uracil (U13) in Richtung des 5'-Endes hybridisiert. In Richtung des 3'-Endes ist die Position, die 4 Nukleotide von der zu hydrolysierenden Position entfernt ist, das Uracil in Position 22 (U22).
  • Zur Hydrolyse der vorgesehenen Position in der oben wiedergegebenen Zielnukleinsäure wurde Ethylendiamin als Abschneider verwendet. Zum Variieren der Abstandshalterlänge wurden zwischen Oligo und Abschneider Glycinreste eingefügt.
  • Oligos, die zwei oder drei Positionen von der zu hydrolysierenden Position entfernt hybridisierten, zeigten unabhängig davon, ob null, ein oder zwei Glycinreste in dem Abstandshalter vorhanden waren, ähnliche Hydrolysegeschwindigkeiten. Inkubation für 7 Stunden bei pH 7 bei 40°C mit einem Verhältnis von RNA:Oligo-Abstandshalter-Abschneider von 1:33 ergab bescheidene Hydrolyse, 10-20%. Nach 24 Stunden Inkubation variierte die Hydrolyse zwischen 25 und 30%.
  • Ein Oligo, das vier Positionen von der zu hydrolysierenden Position entfernt hybridisiert, zeigte jedoch eine bemerkenswerte Verbesserung der Menge an Zielribonukleinsäure, die hydrolysiert wurde. Bei einer Verbindung, in der der Abstandshalter 5 Atome umfasste, betrug die Hydrolyse nach Inkubation bei pH 7 für 7 Stunden bei 40°C mit einem Verhältnis von RNA:Oligo-Abstandshalter-Abschneider von 1:33 insbesondere mehr als 50% und nach 24 Stunden mehr als 95%.
  • Der hier verwendete Begriff "Oligo" bezieht sich auf eine Ribonukleinsäure oder einen Imitator davon. Hierzu gehören Derivate von Ribonukleinsäuren, um das Oligo unter physiologischen Bedingungen stabiler zu machen. Beispiele für geeignete Derivate sind 2'-O-Alkyl-, -Alkenyl- (Allyl) oder -Alkinylnukleoide, 2'-Deoxynukleotid (DNA) und/oder 2'-Deoxy-2'-fluornukleotide. Bevorzugt sind 2'-O-Methyl- und 2'-O-Allylnukleotide. Die Phosphodiesterbindung kann optional ebenfalls oder alternativ derivatisiert sein, beispielsweise als O-alkylierter Phosphodiester oder vorzugsweise ein Phosphorthioat. Ein Oligo, das Imitatoren von Nukleotiden umfasst, bezieht sich auf ein Nukleotid, das Locked-Nukleinsäuren (LNAs), Peptidnukleinsäuren (PNAs), Morpholinverbindungen usw. umfasst.
  • Zu geeigneten Basen in dem Oligo gehören Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Inosin, 2,6-Diaminopurin, Xanthin, Hypoxanthin und weitere Derivate dieser Basen, wie alkyl-, amino-, aza- und/oder halogensubstituierte Basen oder Deazabasen. Es können auch weitere Modifikationen der Basen geeignet sein und sind Fachleuten bekannt.
  • Das erfindungsgemäße Oligo hat eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden oder Imitatoren davon. Für eine ausreichende Hybridisierung ist üblicherweise keine Länge von mehr als 25 Nu kleotiden (oder Imitatoren) erforderlich. Bevorzugt ist eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden (oder Imitatoren).
  • Ein Oligo hat zwei Positionen, an denen sich der Abstandshalter anbringen lässt. Der Abstandshalter ist entweder an dem 5'-O- oder dem 3'-O-Atom angebracht. Wenn das Oligo einen Imitator eines Nukleotids an irgendeinem Ende umfasst, ist der Abstandshalter an dem Atom in dem Imitator des Nukleotids angebracht, welches dem 5'-O- oder 3'-O-Atom entspricht.
  • Der Begriff "Abstandshalter" soll hier einen Abstand zwischen Oligo und Abschneider in Form der Zahl der Atome definieren. Die Zahl der Atome wird in einer geraden Kette von dem ersten Atom, das an das 5'-O- oder 3'-O-Atom eines endständigen Nukleotids oder Imitators davon gebunden ist, in dem Oligo bis zu dem letzten Atom gezählt, an das der Abschneider gekoppelt ist. Der Abstandshalter endet an dem ersten Stickstoffatom in dem Abschneider, der an der Spaltung einer Phosphodiesterbindung in der Ziel-RNA beteiligt ist. Die Atome in dem Abstandshalter können jedes geeignete Atom sein, vorzugsweise die Atome in dem Abstandshalter, die gleich oder unterschiedlich sein können, und sind ausgewählt aus C, O, S, N und P.
  • Der Abstandshalter kann verzweigt sein, und/oder die Atome in dem Abstandshalter können mit Gruppen mit einer Funktionalität substituiert sein. Diese Substituenten können eine Funktionalität haben, um die Detektierung der erfindungsgemäßen Verbindung zu ermöglichen, beispielsweise kann der Abstandshalter mit einer Fluoreszenzmarkierung substituiert sein. Derartige Markierungen ("Label") sind gut bekannt. Alternativ oder zusätzlich kann der Abstandshalter mit einer Gruppe substituiert sein, die den Durchgang durch die Zellmembran erleichtert. Solche Gruppen können hydrophobe Gruppen sein, die leicht mit der Lipid-Doppelschicht einer Zellmembran in Wechselwirkung treten können, und/oder Gruppen sein können, die mit Rezeptoren oder Enzymen in Wechselwirkung treten, die an Transport über Zellmembranen beteiligt sind.
  • Es sei darauf hingewiesen, dass die Abstandshalter-Abschneider-Einheit beispielsweise aus Polyethylenamin bestehen kann. Da die ersten beiden Atome, die an dem endständigen Nukleotid oder Imitator davon in einem Oligo angebracht sind, als nicht an der Hydrolyse der Phosphodiesterbindung beteiligt angesehen werden, sind daher nicht Teil des Abschneiders.
  • Der Begriff "Abschneider" bezieht sich hier auf ein Polyamin mit mindestens zwei Stickstoffatomen. Der Abschneider umfasst mindestens ein sekundäres Stickstoffatom oder tertiäres Stickstoffatom, wobei der Abschneider auch gegebenenfalls mindestens ein weiteres sekundäres oder tertiäres Stickstoffatom umfasst, vorzugsweise umfasst der Abschneider mindestens ein weiteres primäres Stickstoffatom. Polyamin-vermittelte Spaltung der Phosphodiesterbindung ist ein wohlbekanntes technisches Phänomen, und der Fachmann ist in der Lage, geeignete Abschneidereinheiten zu verwenden. Beispiele für geeignete Abschneider sind Ethylendiamin, Diethylentriamin, Tris(2-aminoethyl)amin, Dendrimere auf Ethylenaminbasis, Pentaerythrityltetraamin, Spermin, Spermidin, Diaza-, Triaza- oder Tetraazacycloalkylverbindungen, wie beispielsweise Piperazin, Cyclen, Tetraazacyclopentadecan, Tetraazacyclotetradecan, Tetraazaundecan, Triazacyclononan, Triazacyclododecan usw. und Derivate davon.
  • Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Oligo in der erfindungsgemäßen Verbindung PNA als Nukleotidimitatoren.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Oligo in der erfindungsgemäßen Verbindung 2'-O-Alkyl-, vorzugsweise -Methyl- oder -Allyl-, -Phosphorthioat als Nukleotidimitatoren.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist erfindungsgemäßen Verbindung derart, dass das endständige Nukleotid oder der Imitator davon des Oligos 4 Positionen von der zu hydrolysierenden Position entfernt hybridisiert, und die Anzahl der Atome in ei ner geraden Kette von Oligo zu Abschneider beträgt 4 bis 6, vorzugsweise 5.
  • Wenn das Oligo weiter als 4 Positionen entfernt von der für die Hydrolyse vorgesehenen Position einer Ribonukleinsäure hybridisiert, ist es bevorzugt, dass die Länge des Abstandshalters zunimmt. Gemäß einer Ausführungsform wird für jede Position, die mehr als 4 Positionen von der für die Hydrolyse vorgesehenen Position in dem Oligo entfernt hydrolysiert wird, der Abstandshalter um mindestens 6 Atome in der Länge verlängert. Für einen Oligo-Abstandshalter-Abschneider, der 5 Atome von der für die Hydrolyse vorgesehenen Position entfernt hybridisiert, umfasst der Abstandshalter somit vorzugsweise mindestens 8 Atome, und für einen Oligo-Abstandshalter-Abschneider, der 6 Atome von der für die Hydrolyse vorgesehenen Position entfernt hybridisiert, umfasst der Abstandshalter vorzugsweise mindestens 14 Atome, und für einen Oligo-Abstandshalter-Abschneider, der 7 Atome von der für die Hydrolyse vorgesehenen Position entfernt hybridisiert, umfasst der Abstandshalter vorzugsweise mindestens 20 Atome, und für einen Oligo-Abstandshalter-Abschneider, der 8 Atome von der für die Hydrolyse vorgesehenen Position entfernt hybridisiert, umfasst der Abstandshalter vorzugsweise mindestens 26 Atome, usw.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäßen Verbindung derart, dass das endständige Nukleotid oder der Imitator davon 5 Positionen von der zu hydrolysierenden Position entfernt hybridisiert, und die Anzahl der Atome in einer geraden Kette von Oligo zu Abschneider beträgt 10 bis 12, vorzugsweise 11.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäßen Verbindung derart, dass das endständige Nukleotid oder der Imitator davon 6 Positionen von der zu hydrolysierenden Position entfernt hybridisiert, und die Anzahl der Atome in einer geraden Kette von Oligo zu Abschneider beträgt 16 bis 18, vorzugsweise 17.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäßen Verbindung derart, dass das endständige Nukleotid oder der Imitator davon 7 Positionen von der zu hydrolysierenden Position entfernt hybridisiert, und die Anzahl der Atome in einer geraden Kette von Oligo zu Abschneider beträgt 22 bis 24, vorzugsweise 23.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäßen Verbindung derart, dass das endständige Nukleotid oder der Imitator davon 6 Positionen von der zu hydrolysierenden Position entfernt hybridisiert, und die Anzahl der Atome in einer geraden Kette von Oligo zu Abschneider beträgt 28 bis 30, vorzugsweise 29.
  • Die obere Grenze der Entfernung der Hybridisierungsposition eines endständigen Nukleotids oder Imitators davon von der vorgesehenen Hydrolyseposition ist 8, vorzugsweise 7, insbesondere 6. Die maximale Länge des Abstandshalters beträgt 30 Atome.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren synthetisiert werden. Die Verbindungen werden vorzugsweise unter Verwendung von automatisierten Verfahren synthetisiert. Ein Oligo mit der gewünschten Länge und Zusammensetzung kann beispielsweise routinemäßig in einem DNA/RNA-Synthetisierer hergestellt werden. Für den Fachmann ist die Herstellung eines Abstandshalter-Abschneider-Teils Routinearbeit, welcher einen Abstandshalter mit einer gewünschten Länge umfasst, an den ein gewünschter Abschneider gekoppelt ist. Für ein Beispiel siehe beispielsweise Verheijen et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 369-372). Ein derartiges Abstandshalter-Abschneider-Teil hat eine geeignete Funktionalität zur Kopplung an ein 3'-O oder 5'-O (bevorzugt) eines endständigen Nukleotids oder Nukleosids. Es ist alternativ für den Fachmann eine übliche Praxis, ein 5'-O durch ein 5'-N zu ersetzen und ein Abstandshalter-Abschneider-Teil mit geeig neter Funktionalität zur Kopplung an einen Stickstoff anzubringen, beispielsweise gemäß dem bereits erörterten Verfahren, das von Komiyama beschrieben wurde. Siehe für geeignete Verfahren J. Org. Chem. 2000, 65, 4900-4907, Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40, 2004-2021 und spezieller J. Org. Chem., 2003, 68, 609-612, Bioconjug. Chem., 2003, 14, 276-281. Alternativ kann ein Disulfidbrücken-Scan verwendet werden, der die Einführung einer 5'-S erfordert, oder mittels konventioneller Maleimid-Kopplung. Alternativ kann ein geeignetes Verfahren die Standard-Phosphoramiditchemie verwenden, um den Abstandshalter-Abschneider-Teil an ein Nukleosid zu koppeln. Dies ermöglicht die Einbringung eines beliebigen Ribonukleotidtyps (Analogon) oder Imitators davon in die erfindungsgemäße Verbindung, siehe beispielsweise Bioconjugate Chem. 2002, 13(5), 1071.
  • Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung, die PNA als Nukleotidbausteine umfasst, ist von Verheijen beschrieben worden, das bereits erörtert wurde.
  • Die vorliegende Erfindung liefert brauchbare Verbindungen und Verfahren für eine Vielfalt von Therapeutika, Diagnostika, für die Landwirtschaft, Ziel-Validierung, Genomauffindung, Gentechnik und pharmakogenomische Anwendungen.
  • Die Erfindung betrifft gemäß einem Aspekt ein Verfahren zum Hydrolysieren von Ribonukleinsäure an einer festgelegten Position, bei dem eine Zielnukleinsäure mit einer erfindungsgemäßen Verbindung in Kontakt gebracht wird.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können so entworfen werden, dass sie durch Zielen auf eine Varietät von RNA-Molekülen die Genexpression inhibieren. Gemäß einer Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zum Zielen auf verschiedene RNAs verwendet, die einem Zielgen entsprechen. Zu nichteinschränkenden Beispielen für derartige RNAs gehören Messenger-RNA (mRNA), alternierende RNA-Splice-Varianten von einem oder mehreren Zielgenen, nach der Transkription modifizierte RNA von einem oder mehreren Zielgenen, Prä-mRNA von einem oder mehreren Zielgenen. Wenn alternierendes Spleißen ("Splicing") eine Familie von Transkripten erzeugt, die durch Gebrauch geeigneter Exons unterscheidbar sind, kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um durch die passenden Exons die Genexpression zu inhibieren, um die Funktionen von Genfamilienmitgliedern spezifisch zu inhibieren oder zwischen ihnen zu unterscheiden.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Diagnostika, Therapeutika und als Forschungsreagenzien und Kits verwendet werden. Sie können in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, indem eine effektive Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung zu einem geeigneten, pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger gegeben wird. Sie können ferner zur Behandlung von Organismen mit einer Erkrankung verwendet werden, die durch die unerwünschte Produktion eines Proteins gekennzeichnet ist. Der Organismus kann mit einer erfindungsgemäßen Verbindung in Kontakt gebracht werden, die eine Sequenz aufweist, die an einen Strang einer Zielnukleinsäure spezifisch hybridisieren kann, welcher das unerwünschte Protein kodiert. Zur Modulierung der Genexpression ist somit bevorzugt, dass der RNA-Abschnitt, welcher moduliert werden soll, vorab ausgewählt wird, damit er jenen Abschnitt der RNA umfasst, welcher das Protein kodiert, dessen Bildung moduliert werden soll. Das zu verwendende Oligo wird daher so entworfen, dass es mit dem vorab gewählten Abschnitt der Ziel-RNA spezifisch hybridisierbar ist. Das Oligo ist gemäß einer Ausführungsform ein solches, das zur spezifischen Bindung mit mRNA entworfen worden ist, die das Protein kodiert, dessen Produktion moduliert werden soll.
  • Die Formulierung von therapeutischen Zusammensetzungen und ihre anschließende Verabreichung wird als innerhalb des Wissens von Fachleuten angesehen. Bei Therapeutika wird einem Pa tienten, der dieser Therapie bedarf, im Allgemeinen im Abhängigkeit von dem Alter des Patienten und dem Schweregrad der behandelten Erkrankung eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, in Dosen im Bereich von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht verabreicht. Die Behandlung kann ferner in einer Einzeldosis erfolgen oder ein Schema sein, das über einen Zeitraum anhalten kann, der in Abhängigkeit von der Natur der speziellen Erkrankung, ihrem Schweregrad und dem Gesamtzustand des Patienten variiert und durch einen behandelnden Therapeuten festgelegt wird. Es mag in einigen Fällen effektiver sein, einen Patienten mit einer erfindungsgemäßen Verbindung zusammen mit anderen traditionellen therapeutischen Mitteln zu behandeln.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Abhängigkeit davon, ob lokale oder systemische Behandlung erforderlich ist, und in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Bereich auf zahlreichen Wegen verabreicht werden. Die Verabreichung kann topisch (einschließlich ophthalmisch, vaginal, rektal, intranasal, transdermal), oral oder parenteral sein. Die parenterale Verabreichung schließt den intravenösen Tropf, subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion oder intrathekale oder intraventrikulare Verabreichung ein.
  • Formulierungen für die topische Verabreichung können Transdermalpflaster, Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Tropfen, Zäpfchen, Sprays, Flüssigkeiten und Pulver einschließen. Konventionelle pharmazeutische Träger, wässrige, Pulver- und ölige Basismaterialien, Verdicker und dergleichen können erforderlich oder wünschenswert sein. Beschichtete Kondome, Handschuhe und dergleichen können auch brauchbar sein.
  • Zu Zusammensetzungen für die orale Verabreichung gehören Pulver oder Körner, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder nichtwässrigen Medien, Kapseln, Säckchen (Sachets) oder Tabletten. Verdickungsmittel, Aromatisierungsmittel, Verdün nungsmittel, Emulgatoren, Dispergierhilfsmittel oder Bindemittel sind möglicherweise erwünscht.
  • Zusammensetzungen für die intrathekale oder intraventrikulare Verabreichung können sterile wässrige Lösungen einschließen, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Additive einschließen können.
  • Formulierungen für die parentherale Verabreichung können sterile wässrige Lösungen einschließen, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Additive enthalten können.
  • Die vorliegende Erfindung kann mit einer Vielfalt von Organismen durchgeführt werden, die im Bereich von einzelligen prokariotischen und eukariotischen Organismen bis zu mehrzelligen eukariotischen Organismen reichen. Jeder Organismus, der DNA-RNA-Transkription oder RNA-Protein-Translation als fundamentalen Teil seines Erbmaterials, seines metabolischen oder zellulären Apparats verwendet, ist dieser therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung zugänglich. Daher können verschiedene Organismen, wie Bakterien, Hefe, Protozoen, Algen, Pflanzen und höhere tierische Formen einschließlich warmblütiger Tiere auf diese Weise behandelt werden. Da jede der Zellen von mehrzelligen Eukaryonten ferner auch sowohl DNA-RNA-Transkription als auch RNA-Protein-Translation als integralen Teil ihrer zellulären Aktivität einschließen, können diese Therapeutika und/oder Diagnostika auch mit derartigen Zellpopulationen durchgeführt werden. Viele der Organellen, z. B. Mitochondrien und Chloroplasten, von eukariotischen Zellen schließen ferner auch Transkriptions- und Translationsmechanismen ein. Als solche können einzelne Zellen, Zellpopulationen oder Organellen auch in die Definition von Organismen eingeschlossen werden, die mit den erfindungsgemäßen therapeutischen oder diagnostischen Verbindungen behandelt werden können. Therapeutika soll hier sowohl die Behebung eines Erkrankungszustands, das Abtöten eines Organismus, z. B. bakterieller, Protozoen- oder anderer Infektion, oder Bekämp fung von irrtümlichem oder unerwünschtem Zellwachstum oder irrtümlicher oder unerwünschter zellulärer Expression einschließen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Als geeigneter Baustein zur Verwendung in einem automatisierten Standard-DNA/RNA-Synthetisierer wird das nachfolgend abgebildete Phosphoramidit verwendet. In der folgenden Struktur auf der linken Seite ist der Verknüpfer ein Teil des Abstandhalters wie oben beschrieben und kann daher aus der nachfolgend gezeigten allgemeinen Struktur auch weggelassen werden. PG steht für eine Schutzgruppe, die vorzugsweise basenlabil ist. Der Verknüpfer kann eine Glycineinheit sein, und PG kann Fmoc sein, wie in der folgenden Struktur gezeigt ist. Dieses Phosphoramidit kann in jeden Typ von RNA (Oligo) oder Imidat davon eingebaut werden.
    Figure 00180001
  • Nach dem Einbau des oben gezeigten Phosphoamidits, wobei der Abstandshalter 10 Atome Einbau in ein Oligo hat, wird die im Folgenden auf der linken Seite gezeigte Struktur erhalten. In diesem Beispiel hat der Abstandshalter 10 Atome.
  • Zur Veranschaulichung sind die Oligo-Imitatoren 2'-O-Methylphosphorthioat-RNA und -PNA in der Mitte beziehungsweise auf der rechten Seite gezeigt.
    Figure 00190001
  • Als Alternative wird eine Abstandshalter-Abschneider-Einheit verwendet, die mit dem 5'-Terminus verknüpft sein kann. Die Abstandshalterlänge ist in dieser Abstandshalter-Abschneider-Einheit variabel. In dem im Folgenden detailliert erläuterten Beispiel ist der Abstandshalter 4 und 10 Atome. Es ist ersichtlich, dass die Abstandshalterlänge leicht variiert werden kann.
    Figure 00190002
  • Beispiel 2
  • Synthetische RNA (ein Teil der tRNAPhe hat eine Punktmutation: C-16 ist durch G-16 ersetzt), die für Spaltungsexperimente verwendet wurde (unterstrichen: die Spaltungsstelle):
    5'-UCC UGU GUU CGA UCC GCA GAA UUC G-3'
  • Die folgenden PNA-Abschneider-Sequenzen wurden synthetisiert, wobei Gly für Glycin steht, n = 0 bis 2, und der Abschneider wie folgt ist:
    Figure 00200001
    3'-H2NCO- ca caa get agg (Gly)n-COCH2-Abschneider (2)
    3'-H2NCO- aca caa get ag (Gly)n-COCH2-Abschneider (3)
    3'-H2NCO- g aca caa get a (Gly)n-COCH2-Abschneider (4)
    3'-H2NCO- gg aca caa get (Gly)n-COCH2-Abschneider (5)
    3'-H2NCO- gg aca caa get (Gly)3-COCH2-Abschneider (5)
  • Die Zahlen (2), (3), (4) und (5) beziehen sich auf die Zahl der Positionen, die Hybridisierungsposition des Oligos von der für die Hydrolyse vorgesehenen Position entfernt ist. Jedes von (2), (3), (4) und (5) wurden in der Abstandshalterlänge durch Einbau von 0, 1 oder 2 Gly-Resten variiert.
  • PNA-Synthese
  • Die in dieser Untersuchung verwendeten PNAs wurden durch Festphasensynthese unter Verwendung eines PNA-Synthetisierers hergestellt (Perseptive Biosystem, ExpediteTM Nucleic Acid Synthesis System). Alle Lösungsmittel (Biosolve) wurden wie erhalten verwendet. Die Festphasensynthesen wurden mit PEG-PS-Perlen als fester Träger mit rink-Amid als Verknüpfer durchgeführt (Beladung: 0,17 μmol-mg-1). Die Assemblierung der PNAs wurde unter Verwendung des Standardprotokolls, die im Handbuch des Synthetisierers beschrieben ist, im 2 μmol-Maßstab unter Verwendung von Fmoc-Chemie und Monomeren bewirkt, bei denen die exocyclischen Amine Bhoc-geschützt waren (Perseptive Biosystems). Die ersten Kopplungen erfolgten doppelt. Fmoc-Glycin und der di-Boc-geschützete Abschneiderbaustein wurden am N-Terminus (5') des PNA-Oligomers gekoppelt, während sie sich noch auf dem Harz befanden, wobei die verfügbaren Positionen in dem Synthetisierer und das Standardprotokoll für eine doppelte Kopplung verwendet wurden. Der di-Boc-geschützte Abschneiderbaustein (HO2CCH2NBocCH2CH2NHBoc) wurde durch direkte organische Chemie in der Lösungsphase synthetisiert und durch sein Massenspektrum und die 1H- und 13C-NMR-Spektren vollständig charakterisiert.
  • Das Oligomer wurde von dem Harz gespalten und unter sauren Bedingungen vollständig entschützt (TFA/TIS/H2O, 9/1/1, Vol/Vol/Vol). RP-HPLC-Reinigung und Analyse wurde mit einem JASCO HPLC-System durchgeführt, das mit einer Altima C18-Säule (10 × 250 mm) ausgestattet war. Die Gradienteneluierung wurde bei 40°C durchgeführt, indem ausgehend von Puffer A (0,1% TFA in Wasser) und durch Zuführung von Puffer B (0,1% TFA in Acetonitril/Wasser, 3/1, Vol/Vol) mit einer Durchflussrate von 4 ml/Min ein Gradient aufgebaut wurde. Die erhaltenen PNAs wurden lyophilisiert und durch matrixunterstützte Laserdesorptions-/Ionisierungsflugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) und RP-HPLC charakterisiert.
  • Spaltungssexperimente:
  • 32P-5'-markiertes RNA-25-mer wurde mit PNA-Abschneider in TRIS-Puffer (10 mM, pH 7) behandelt, der NaCl (100 mM) und EDTA (0,1 mM) enthielt, um die folgenden Konzentrationen zu ergeben: [RNA] = 60 nM, [PNA-Abschneider] = 2 μM. Die Proben (70 μl) wurden 7 oder 24 Stunden bei 40°C inkubiert. Nach dieser Zeit wurde die RNA unmittelbar durch Zugabe von NaOAc (3 M, pH 5, 7 μl), EtOH (225 μl) und 10 μg/μl tRNA (1 μl) ausgefällt. Die ausgefällte RNA wurde durch Zentrifugieren gewonnen, getrocknet und wieder in Wasser (5 μl) und Beladungspuffer (5 μl) gelöst. Die Lösungen wurden eine Minute auf 90°C erwärmt, zentrifugiert und an einem denaturierenden 20% Polyacrylamid-Elektrophoresegel, das 8 M Harnstoff enthielt, analysiert. Die verwendeten Kontrollen waren: RNA, RNA Baseleiter und T1 Verdauung der RNA.
  • Ergebnisse
  • Kontroll-RNA war nach 7 und nach 24 Stunden Inkubation ungefähr 10% hydrolysiert. Bei den Verbindungsreihen (2) und (3) war die RNA nach 7 Stunden Inkubation ungefähr 20% oder weniger und nach 24 Stunden Inkubation ungefähr 40% oder weniger hydrolysiert.
  • Nur aus der Verbindungsreihe (4) war die RNA mit einer vernünftigen Geschwindigkeit hydrolysiert, die RNA war nämlich für N = 0, 1 und 2 nach 7 Stunden Inkubation mindestens ungefähr 30% hydrolysiert. Bei Verbindung (4), n = 1, war nach 24 Stunden Inkubation nahezu quantitative Hydrolyse erhalten worden.
  • Die Optimierung mit Verbindung (4), n = 1, zeigte, dass nach 2 Stunden Inkubation bereits ungefähr 50% RNA mit einem Verhältnis RNA/erfindungsgemäße Verbindung von 1:10 hydrolysiert worden waren. Bei einem Verhältnis von 1:40 waren nach 2 Stunden bereits ungefähr 75% hydrolysiert Bei Verhältnissen von 1:10 und 1:20 waren nach 8 Stunden beziehungsweise 6 Stunden 75% oder mehr RNA hydrolysiert. Bei dem letzteren Verhältnis wurde nach 24 Stunden Inkubation nahezu quantitative Hydrolyse erhalten.
  • Die optimale Hydrolyse für die Verbindungen der (5)-Reihe beginnt bei n = 2.
  • Beispiel 3
  • Synthetische RNA (Teil von E. Coli AcpP mRNA), die für die Spaltungsexperimente verwendet wurde (unterstrichen: die Spaltungsstelle):
    5'-A UUU AAG AGU AUG AGC ACU AUC GAA-3'
  • Die folgenden PNA-Abschneider-Sequenzen wurden synthetisiert, wobei Gly für Glycin steht, und der Abschneider wie folgt ist:
    Figure 00230001
    3-H2NCO- aaa ttc tca t -Cys(NHR)S-CH2CO-Gly-NHCH2CH2-Abschneider
    wobei R = Ac oder (A)
    CH2NHCO(CH2)4NH-Lys(PhePheLys)3-NH2 oder (B)
    CH2(OCH2CH2)2NH-Lys(PhePheLys)3-NH2 (C)
  • Es sei darauf hingewiesen, dass Verbindungen B und C das Peptid (Lys(PhePheLys)3 in dem Abstandshalter umfassen, um zu unterstützen, dass die Verbindung die Zellmembran passiert.
  • In vitro-RNA-Degradationsuntersuchungen
  • Alle Puffer wurden aus hochgereinigtem Milli Q-Wasser hergestellt und vor Gebrauch sterilisiert. Das radioaktiv markierte RNA-25-mer und das zu testende Konjugat (A, B, C, als Kontrolle RNA ans C ohne Abschneider) wurden in einen Tris·HCl-Puffer (10 mM, pH 7) gemischt, der NaCl (100 mM) und EDTA (0,1 mM) enthielt, um die folgenden Konzentrationen zu ergeben: [RNA] = 60 nM, [Konjugat] = 2 μM, bestimmt mittels A260-Einheiten. Die Proben (70 μl) wurden 16 Stunden bei 40°C inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die RNA sofort durch Zugabe von 3 M NaOAc (pH 5, 7 μl), EtOH (225 ml) und 10 μgl-1 tRNA (1 μl) ausgefällt Die ausgefällte RNA wurde durch Zentrifugieren gewonnen, getrocknet und danach in 5 μl H2O und 5 μl Beladungspuffer erneut gelöst. Die Lösungen wurden 1 Minute auf 80°C erwärmt, zentrifugiert und auf einem 20% denaturierenden Elektrophoresegel analysiert. Das Gel wurde mit einem Phosphorschirm (Molecular Dynamics) belichtet, und die Intensität der RNA-Fragmente wurde durch Scannen des belichteten Schirms mit dem Personal Molecular Imager FX System (Bio-Rad) und anschließende Computeranalyse mit Quantity One Software (Bio-Rad) quantifiziert.
  • Ergebnisse
  • Verbindungen A, B und C und die negativen Kontrollen wurden mit der 25-mer 32P-markierten RNA mit einer Sequenz, die teilweise an E.ColiAcpP mRNA erinnerte, inkubiert. Nach 16 Stunden bei 40°C und pH 7 wurden die RNA-Fragmente ausgefällt, auf ein 20% denaturierendes Elektrophoresegel gegeben und quantifiziert.
  • Erfreulicherweise führte die Inkubation der RNA mit den Konjugaten B und C sowie dem PNA-DETA A ohne Peptid zur Bildung von zwei Haupt-RNA-Abbauprodukten, die aus Spaltung an den markierten CA- und UA-Stellen stammten. Die Spaltungsstellen wurden durch Vergleich der Mobilität der Banden mit jenen eines T1-Verdaus der RNA und einer basischen Hydrolyseleiter bestimmt. Die Intensität der Fragentflecken zeigte, dass Inkubation der RNA mit PNA-DETA A zu signifikanter Spaltung (20%) der RNA führte, verglichen mit den Negativkontrollen (d. h. PNA-Peptidkonjugat ohne Abschneider und RNA ohne irgendwelches zugefügtes Konjugat), die nur Hintergrundspaltung von ungefähr 3,5 zeigten. Es wurde ein unerwarteter Unterschied zwischen der Hydrolyseeffizienz der Konjugate B und C beobachtet. Konjugat B zeigte eine noch bessere Spaltungseffizienz (30%), verglichen mit der Positivkontrolle 18 (20%), während Konjugat C 10% der Ziel-RNA spaltete.
  • Beispiel 4
  • Oligo, das Abstandshalter-Abschneider am 3'-Terminus umfasst
  • Im Handel erhältliches Harz, das Dde-Verknüpfer umfasst, wird für die PNA-Synthese verwendet.
    Figure 00240001
  • Ausgehend von diesem Harz führt eine nachfolgende PNA-Synthese zu dem folgenden Oligo:
    3'-Abschneider-CH2CH2NH-(Gly)n-CO-PNA-Sequenz-NHAc-5'
  • Der Abschneider ist hier definiert als:
    Figure 00250001
  • Das "CO" ist der 3'-Terminus des PNA-Oligo, und NHAc ist der 5'-Terminus.
  • Für Abstandshalter-Abschneider am 3'-Terminus der Oligos auf DNA/RNA-Basis wird die in Beispiel 1 beschriebene Strategie verwendet.

Claims (13)

  1. Verbindung für eine Nukleinsäurehydrolyse, wobei die Verbindung eine Struktur Oligo-Abstandshalter-Abschneider aufweist, in der Oligo eine Ribonukleinsäure mit mindestens 8 Nukleotiden oder ein Imitator dafür ist, der in der Lage ist, die Zielnukleinsäure auf eine solche Weise zu hybridisieren, dass ein endständiges Nukleotid oder ein Imitator dafür zu einem Nukleotid mit mindestens 4 Nukleotiden und höchstens 8 entfernt von der zu hydrolysierenden Position hybridisiert, Abstandshalter den Abschneider kovalent mit dem endständigen Nukleotid von Oligo verbindet und mindestens zwei Atome in einer geraden Kette von Oligo zum Abschneider umfasst, Abschneider ein Polyamin mit mindestens zwei Stickstoffatomen ist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, bei der Oligo PNA als Nukleotidimitatoren umfasst.
  3. Verbindung nach Anspruch 1, bei der Oligo 2'-O-Alkyl-, vorzugsweise -Methyl-, -phosphorthioat als Nukleotidimitatoren umfasst.
  4. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der Abstandshalter ein oder mehrere Aminosäuren umfasst, insbesondere Glycin.
  5. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der Abstandshalter über eine Amidbindung an Oligo gekoppelt ist.
  6. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der Abschneider Ethylendiamin ist.
  7. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das endständige Nukleotid oder der Imitator dafür von Oligo 4 Positionen entfernt von der zu hydrolysierenden Position ist und die Zahl der Atome in einer geraden Kette von Oligo zum Abschneider 4 bis 6, vorzugsweise 5 beträgt.
  8. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das endständige Nukleotid oder der Imitator dafür von Oligo 5 Positionen entfernt von der zu hydrolysierenden Position ist und die Zahl der Atome in einer gerade Kette von Oligo zum Abschneider 10 bis 12, vorzugsweise 11 beträgt.
  9. Verfahren zum in vitro-Hydrolysieren von Ribonukleinsäure an einer vorgegebenen Position, bei dem eine Zielribonukleinsäure mit einer Verbindung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche in Kontakt gebracht wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Ribonukleinsäure RNA, insbesondere mRNA ist.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel enthält.
  12. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung als Medikament.
  13. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung als diagnostisches Werkzeug.
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