CN100515416C - 能作为抗白血病药物的草药分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从萎叶叶提取物中或从任何其它来源分离到的化合物绿原酸在治疗急性和慢性髓细胞性白血病和淋巴细胞性白血病中新的用途，并且本发明也提供含有绿原酸和可药用添加剂的用于治疗急性和慢性髓细胞性白血病和淋巴细胞性白血病的药物组合物。

Description

能作为抗白血病药物的草药分子
技术领域
本发明涉及利用从萎叶(Piper betel)叶子提取物中分离到的绿原酸(CA)来治疗急性和慢性髓细胞性白血病(AML和CML)和淋巴细胞性白血病(lymphoid leukemia)。急性髓细胞性白血病(AML)和慢性髓细胞性白血病(CML)，和淋巴细胞性白血病都是致命的，尚无任何破坏白血病细胞的药物，并且这些细胞对化学疗法的反应差，所述化学疗法总是非特异性的并因此对正常细胞产生不良影响。用萎叶成分(绿原酸)治疗的独特性是杀伤髓细胞性癌细胞(myeloid cancercells)和淋巴细胞性癌细胞，而不影响其它正常细胞。
背景和已有技术参考：
髓细胞性白血病通常再分成两种：急性髓细胞性白血病(AML)和慢性髓细胞性白血病(CML)。AML的特征是骨髓中骨髓细胞数量的增加和骨髓细胞的成熟被抑制。在美国，每年AML的发病率大约为每100,000人中有2.4人发病并且随着年龄逐渐增长，对于65岁或更大年龄的成人来说，AML的发生率最高达到每100,000人中有12.6人发病。CML是恶性造血干细胞克隆病症。发病的中值年龄为53岁，但在所有年龄组包括儿童都可发生。CML的自然进程是在3-5年或更短的时间内从良性慢性阶段发展到迅速爆发的致命性危象。尽管临床医学有了巨大进展，但CML的预后较差(1).CD33表示骨髓细胞分化进程中特定的和有用的标志(2)。近期的报告提示CD33与单克隆抗体的衔接诱导细胞凋亡导致体外AML和CML细胞增殖的生长抑制(2，3)。利用CD33的骨髓特异性表达，与抗癌药物结合的人源化抗-CD33单克隆抗体已在AML病人中试验获得巨大成功(4)。类似地，淋巴细胞性白血病也再分成两种：急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。淋巴细胞性白血病可侵袭T和B细胞谱系并且流行于儿童。萎叶叶提取物的抗-髓细胞性活性已经被要求保护(专利申请号PCT/INOO/00118，2000年12月12日)并且3-o-p-香豆酰奎尼酸(Coumaryl quinic acid，一种治疗AML和CML的活性因子)在2002年5月30日美国临时专利申请号60/384,163(299/NF/2002.)中也要求了保护。
因此，申请人的早期发现与本专利关于从萎叶叶提取物中分离到的用于治疗急性和慢性髓细胞性白血病和淋巴细胞性白血病的绿原酸(CA)是一致的。已知绿原酸具有抗-过敏活性(5)。CA也抑制肝和肾葡萄糖-6-磷酸酶***(6)。CA是表皮lypoxygenase活性和TPA-诱导的耳炎症抑制剂(7)。CA也对TPA-诱导的小鼠皮肤肿瘤助长提供抑制作用(7)。CA的抗-HIV活性也已报道过(8)。尽管对肿瘤助长的抑制作用归功于CA，但尚未报道CA具有对已确定肿瘤的抗-肿瘤活性包括抗-白血病活性。在本专利申请中，首次提出要求保护CA的抗-白血病活性和抗-肿瘤活性。
萎叶叶具有很浓的刺激性芳香气味并且在印度广泛地咀嚼使用。通常停止生长但尚未变脆的成熟或成熟过后的叶子用于咀嚼。咀嚼用的基本制剂由涂上熟石灰的萎叶叶子和加入了刮削下的槟榔果碎屑的儿茶组成；按照个人的口味使用调味剂如椰丝、丁香、小豆蔻、茴香、甘草粉、肉豆蔻和烟草。在某些地方，精制的萎叶叶制剂用银质或金质薄膜包裹。作为咀嚼剂，它具有很多特性：它是芳香的、有助消化的刺激物和驱风剂。在医学上，它用于卡他性感染和肺部感染；也适用于膏状药。含有槟榔果和其它添加剂的萎叶叶子咀嚼作用是刺激唾腺和刺激口腔粘膜。所产生的红颜色是由于槟榔果中含有色素，它是槟榔果本身在石灰和儿茶中碱的作用下出现的。除了散发出令人愉快的气味外，还产生轻度刺激，因而给人以温暖感和舒服感。决定叶子芳香值的最重要的因素是含有的精油的量，特别是含有的精油的性质。不同区域的萎叶气味和味道不同。最刺激性的是Sanchi型，最淡和最芳香的来自Varanasi。
萎叶叶子含有精油，根据叶子的不同品种，油的含量在0.7-2.6％之间变化。油由酚和萜组成。酚油的比例越高，质量越好。认为称作佳味备酚(萎叶酚；4-烷基-2-羟基-1甲氧基苯)的丁子香酚异构体是萎叶油的特征性成分。印度型萎叶油含有大量酚性成分并以局部给药或通过漱口剂形式用于治疗各种呼吸问题。它具有驱风剂的性质。它对哺乳动物的中枢神经***显示不同的作用。叶子的精油和提取物具有抗几种革兰氏-阳性菌和革兰氏-阴性菌活性，所述革兰氏-阳性菌和革兰氏-阴性菌如化脓微球菌白色变种(Micrococcus pyogenes var.Albus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢杆菌(B.Megaterium)、肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhosa)、逗号弧菌(Vibrio comma)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、茄伯克霍尔德氏菌(Pdseudomonas solanacaerum)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotorora)。精油和叶子提取物也显示抗黑曲霉(Asperigillus niger)和米曲霉(A.Oryzae)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)和尖镰孢(Fusariumoxysporum)的抗-真菌活性。所述精油被发现在约5分钟内使原生动物，Paramaeceum caudatum死亡(5)。所述叶子的蒸馏物显示抗结核分枝杆菌(Mycobacterium tyberculosis)活性。
参考文献
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发明目的
本发明的主要目的是提供从萎叶叶提取物中或从任何其它原料中分离到的化合物绿原酸在治疗急性和慢性髓细胞性白血病和淋巴细胞性白血病中的新的用途。
本发明的另一目的是提供一种新的治疗急性和慢性髓细胞性白血病和淋巴细胞性白血病的包含载体和化合物绿原酸的药物组合物。
本发明的另一目的是提供从萎叶的叶或任何其它植物部分分离用于治疗AML、CML和淋巴细胞性白血病的活性级分的方法。
本发明的另一目的是提供一种简单的、从具有与治疗AML、CML和淋巴细胞性白血病有关的生物活性的萎叶所有植物部分分离活性组分的方法。
本发明的另一目的是提供来自萎叶的叶或任何其它植物部分、用于治疗AML、CML和淋巴细胞性白血病的草药产品。
本发明的另一目的是提供从萎叶的叶中提纯的、用于治疗AML、CML和淋巴细胞性白血病的草药绿原酸。
本发明的另一目的是提供由萎叶的叶或任何其它植物部分制备用于治疗AML、CML和淋巴细胞性白血病的提取物的方法。
本发明的另一目的是提供一种简单的、由萎叶的叶或任何其它植物部分制备用于治疗AML、CML和淋巴细胞性白血病的提取物的方法。
本发明的另一目的是提供由萎叶叶制备用于治疗AML、CML和淋巴细胞性白血病的绿原酸的方法。
本发明的另一目的是提供从萎叶的叶或任何其它植物部分中提纯的、用于治疗实体瘤包括淋巴瘤的草药绿原酸。
本发明的另一目的是提供绿原酸(由任何来源分离到的或通过合成方法制备的)在治疗急性和慢性髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病和实体瘤包括淋巴瘤中新的用途。
发明概述
因此，本发明提供从萎叶叶提取物或从任何其它来源分离到的化合物绿原酸在治疗急性和慢性髓细胞性白血病和淋巴细胞性白血病中的新的用途。另外，本发明提供用于治疗动物和人急性和慢性髓细胞性白血病的药物组合物，所述组合物包含有效量的从萎叶的任何植物部分或任何其它天然或合成来源分离到的绿原酸(CA)和/或3-o-p-香豆酰奎尼酸(PCQ)和可药用添加剂。
发明详述
因此，本发明提供用于治疗动物和人急性和慢性髓细胞性白血病的药物组合物，所述组合物包含有效量的从萎叶的任何植物部分或任何其它天然或合成来源分离到的绿原酸(CA)和/或3-o-p-香豆酰奎尼酸(PCQ)和可药用添加剂。
在本发明的一个实施方案中，所述添加剂选自营养物如蛋白质、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶糊和/或可药用载体、赋形剂、稀释剂或溶剂。
在另一实施方案中，所述组合物中存在的CA和PCQ之比在1∶0-1∶10范围，它可有效地用于治疗实体瘤包括淋巴瘤。
在另一实施方案中，所述组合物通过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。
在另一实施方案中，所述组合物以1-50mg/kg体重/天的剂量水平给药至少4周。
在另一实施方案中，所述组合物给药期为4-12周。
在另一实施方案中，在25μg/ml CA的剂量水平下，白血病细胞系2×106/ml/孔细胞型K562的生长抑制作用达到2 0％。
在另一实施方案中，在25μg/ml PCQ剂量水平下，白血病细胞系2×106/ml/孔细胞型K562生长抑制作用达到4％。
在另一实施方案中，在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的剂量水平下，白血病细胞系2×106/ml/孔细胞型K562的生长抑制作用达到44％。
在另一实施方案中，在25μg/ml CA剂量水平下，白血病细胞系2×106/ml/孔细胞型U937的生长抑制作用达到16.67。
在另一实施方案中，在25μg/ml PCQ剂量水平下，白血病细胞系2×106/ml/孔细胞型U937的生长抑制作用达到2.08％。
在另一实施方案中，在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的剂量水平下，白血病细胞系2×106/ml/孔细胞型U937的生长抑制作用达到50％。
在另一实施方案中，在25μg/ml CA剂量水平下，白血病细胞系2×106/ml/孔细胞CML白血病细胞的生长抑制作用达到2.38。
在另一实施方案中，在25μg/ml PCQ剂量水平下，白血病细胞系2×106/ml/孔CML白血病细胞的生长抑制作用达到2.38％。
在另一实施方案中，在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的剂量水平下，白血病细胞系2×106/ml/孔CML白血病细胞的生长抑制作用达到20.3％。
再一个实施方案提供组合物在治疗急性和慢性髓细胞性白血病(AML和CML)和淋巴细胞性白血病中的用途，它是通过给予包含有效量的、从萎叶的任何植物部分或任何其它来源分离到的绿原酸(CA)和/或3-o-p-香豆酰奎尼酸(PCQ)，和/或与可药用添加剂组合的药物组合物进行的。
下面本文参考实施例描述本发明，该描述仅仅是说明性的并不应该解释为以任何方式限制本发明范围。
附图简述
图1表示级分E的HPLC，它显示分为三个区ZA、ZB和Zc的不同峰的保留时间(RE)。
图1a.所述峰已编号(ZA含有4个主要峰，而ZB含有10个非常小-中等的峰并且Zc含有2个截然不同的峰)。
图3表示绿原酸(CA)或3-咖啡酰奎尼酸的结构。
图4表示用CA治疗后白血病细胞系、CML病人和正常供体PBMC的显微照片。
实施例-1：植物原料的采集
登山者从不同地区和印度的孟加拉邦采集萎叶的叶和所有其它植物部分。凭证标本存放在印度化学生物学研究所的药物化学部，4 RajaS.C.Mullick Road，Kolkata-700 032。
实施例2：化合物绿原酸的分离：
将4.7Kg新采集的萎叶叶用蒸馏水洗涤，然后切成小碎片。将小碎片的叶子收集在一起，与1.0升蒸馏水混合，并在混合物搅拌器中充分匀浆。将匀浆物通过致密的粗棉布滤出大的碎片并收集滤液。该过程重复2-3次以获得最大收率。然后离心合并的滤液，收集等分试样的澄清溶液并冻干得到大约110gm的半固体物料。
检查所收集物料的生物活性，即白血病细胞的破坏作用。在观察到其阳性活性时，开始进行提纯。将10gm上述物料装填到SephadexLH-20柱上并用水、水-甲醇(1∶1)和甲醇作为洗脱剂进行层析。分别检查三种不同溶剂***获得的三种不同级分的生物活性。该活性仅定位于级分2，即甲醇-水(1∶1)洗脱下来的级分并称作级分E。然后级分E利用Intersil ODS-3分析柱进行HPLC分析。该分析柱用甲醇-水-乙酸(23∶76∶1)平衡，流速保持在1.0ml/分钟并且在280nm鉴定峰。根据保留时间(RE)，不同的峰可能分成三个区，ZA、ZB和Zc(图1)。ZA含有4个主要峰，而ZB含有10个非常小-中等的峰并且Zc含有2个截然不同的峰。观察AA、ZB和Zc三个区生物活性是适宜的，分别测试三个区对白血病细胞的破坏活性。三个区都显示具有生物活性。
可以注意到Zc含有保留时间(Rt)分别为17.77和26.66分钟的2个截然不同的峰。已证明Rt为17.77分钟的峰有相当大的活性并因此测定其结构和提出专利申请(299/NF/2002；申请日期为2002年5月30日)。后者，即Rt为26.66分钟的峰不显示任何活性。
ZB区含有10个不同大小的峰(1-10)。已证明合并的1-10峰级分具有白血病细胞杀伤活性。为此，分别检测所有不同峰的生物活性。其中主要的峰分别相当于Rt为6.58、7.14、7.56和11.97的2、3、4和8并且它们中无一显示具有活性。因此通过重复收集各峰的级分以便增加其中所存在的活性分子的量来分别检测较小的峰。搜索这些峰，即分别相当于Rt为5.16、8.34、9.16、9.86、13.94和14.68的1、5、6、7、9和10峰的活性。除峰6(Rt为9.16分钟)外，其它峰均未显示可检测到的活性。将合并的峰6(Rt为9.16分钟)级分冻干并重新进行HPLC分析，尖的单峰指示其纯度(图2)。然后进行IR、NMR和质谱分析以测定其结构。
KBr
IR γmax cm-1：3355(OH)，1689(CO)，1637，16041522，1443，1286，1189，1121，10821039，975和854
1H-NMR(CD3OD)：7.57(1H)，7.06(1H)，6.96(1H)，6.7 9(1H)6.27(1H)，5.34(1H)，4.17(1H)，3.73(1H)和2.13(4H)
13C NMR(CD3OD)：176.00，167.65，148.56，146.08，145.79，126.78，121.98，115.46，114.24，75.11，72.45，70.96，70.26，37.75和37.19
FABMS m/Z：355(M++H)和377(M++Na)
由此测定的结构显示为绿原酸或3-咖啡酰奎尼酸，m.p.205°-206℃[a]D-33.25(H2O)(图3)。市场上可获得绿原酸的纯品。购买并与萎叶叶中分离到的绿原酸比较，因此明确地证实所获得的物质为绿原酸。
早期申请专利的结构是3-p-香豆酰奎尼酸，它显示具有对CD33+骨髓细胞的破坏作用，但对CD33-细胞没有，并且这一点与绿原酸非常类似。除了在绿原酸芳香环C-3位的额外羟基外，其它结构非常类似。因此提示绿原酸优于3-p-香豆酰奎尼酸的活性可能是由于芳香环C-3位存在羟基。已指出该特定差别在于绿原酸破坏CD33-和CD33+细胞以及淋巴细胞性白血病细胞的活性更广泛和更强。
ZA区证明具有生物活性。它含有4个峰，分别相当于Rt为0.65、1.32、1.8和2.55的1、2、3和4峰。由于ZA区各峰的分离困难，不能测定活性峰的确切位置。
实施例3：制备髓细胞性白血病病人的外周血单核细胞(PBMC)
采集先前诊断为髓细胞性白血病病人的全血(各10ml)，其中一个病人诊断为AML并且另一病人诊断为CML。通过Ficoll/hypaque密度梯度离心分离单核细胞。
实施例4：
红白血病细胞系K562的培养物。该细胞系采自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，VA，美国。该细胞系是CD33-。K562细胞在含有10％加热灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中体外生长。
实施例5：
幼单核细胞细胞系U937的培养物。该细胞系得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，VA，美国，并且如细胞系K562所述体外生长。该细胞系是CD33+。
实施例6
含有绿原酸(CA)的髓细胞性白血病病人PBMC的体外培养。
将髓细胞性白血病病人的PBMC(1×105-2×106/ml)与各种浓度的CA一起在37℃和5％CO2中培养48小时。然后洗涤细胞并计数存活率(viability)。
实施例7
CD33+细胞系U937与CA一起培养。将U937细胞(1×105-2×106/ml)与各种浓度的CA一起在37℃和5％CO2中培养48小时。然后洗涤细胞并计数存活率。
实施例8
CD33-细胞系K562与CA一起培养。将K562细胞(1×105-2×106/ml)与各种浓度的CA一起在37℃和5％CO2中培养4 8小时。然后洗涤细胞并计数存活率。
实施例9
T-淋巴细胞系Molt-4的培养物。该细胞系得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，VA，美国，并且如细胞系K562所述体外生长。
实施例10
制备正常个体的外周血单核细胞(PBMC)。采集全血并通过Ficoll/Hypaque密度梯度离心分离单核细胞。
实施例11
通过流式细胞仪分析细胞周期进展和细胞凋亡。CML病人的PBMC在含有或不含CA(100.0μg/ml)并且补充有10％加热灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃和5％CO2下培养48hr。细胞用40％经500μg/ml Rnase A处理过的乙醇固定，然后如上所速通过流式细胞仪用69μM碘化丙锭(propidium iodide)分析DNA含量(Mitra等人，Molecular Medicine，6：527-541，2000)。
实施例6、7和8的结果：
如表1所示，髓细胞性白血病病人的PBMC、CD33+幼单核细胞细胞系U937和CD33-红白血病细胞系K562被绿原酸破坏。
实施例9和10的结果：
如表2所示，红白血病细胞系K562、幼单核细胞细胞系U937和CML病人的白血病细胞被绿原酸破坏，T-淋巴细胞系Molt-4需要较高的剂量。相反，正常供体的PBMC实际上不受CA影响。在含有或不含CA下培养48小时后U937、K562、CML病人的PBMC、Molt-4和正常PBMC的显微照片显示于图4。我们早期请求保护的3-o-p-香豆酰奎尼酸(PCQ)具有抗髓细胞性白血病活性(299/NF/2002；2000年5月30日)。在此，我们显示绿原酸(CA)和3-o-p-香豆酰奎尼酸以1∶1比例的组合体系比单一的CA或PCQ在破坏白血病细胞系或髓细胞性白血病病人的白血病细胞方面更有效，但对正常供体的PBMC无作用(表3)。
实施例11的结果
细胞-周期分析证明培养2天后，浓度为100.0μg/ml的绿原酸引起体外CML病人白血病细胞的凋亡，因为与单独在培养基中培养的细胞相比，它们在S、G2或M期蓄积(表4)。
表-1：绿原酸体外对病人白血病细胞和白血病细胞系的破坏
注释：1.PBMC*，外周血单核细胞
2.所使用细胞的数量为1×105/ml/孔
表2：CA体外对白血病细胞系和CML病人白血病细胞的生长抑制
Figure C0282940400131
注释：所使用的细胞数为1×105/ml/孔
表3.绿原酸(CA)和3-o-p-香豆酰奎尼酸(PCQ)的组合体系体外破坏白血病细胞系及AML和CML病人的白血病细胞是更有效的
Figure C0282940400141
所使用的细胞数为2×105/ml/孔。这些化合物杀伤细胞的百分数依赖于每ml含有的细胞数。
表4用CA处理2天后细胞周期不同阶段的细胞百分数
Figure C0282940400142

Claims (11)

1、一种治疗动物和人急性和慢性髓细胞性白血病的协同药物组合物，所述组合物包含有效量的、从萎叶的任何植物部分中或任何其它天然或合成来源分离到的绿原酸(CA)和3-o-p-香豆酰奎尼酸(PCQ)和可药用添加剂；其中所述组合物中存在的CA和PCQ之比，按重量计，在1∶1-1∶10范围。
2、权利要求1的组合物，其中添加剂选自营养物、滑石、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶糊和/或可药用载体、赋形剂、稀释剂或溶剂。
3、权利要求2的组合物，其中所述营养物选自蛋白质和碳水化合物。
4、权利要求1的组合物，所述组合物通过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。
5、权利要求1的组合物在制备用于治疗急性和慢性髓细胞性白血病的药物方面的用途。
6、权利要求5的用途，其中CA和PCQ都是从萎叶的任何植物部分中分离到的或通过合成方法制备的。
7、权利要求5的用途，其中受试者选自哺乳动物。
8、权利要求5的用途，其中受试者是人。
9.权利要求5的用途，其中添加剂选自营养物、滑石、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶糊和/或可药用载体、赋形剂、稀释剂或溶剂。
10、权利要求9的用途，其中所述营养物选自蛋白质和碳水化合物。
11、权利要求5的用途，其中所述组合物通过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。
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