CN104165909A - 一种富马酸的生物电化学检测方法 - Google Patents
一种富马酸的生物电化学检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104165909A CN104165909A CN201410334224.6A CN201410334224A CN104165909A CN 104165909 A CN104165909 A CN 104165909A CN 201410334224 A CN201410334224 A CN 201410334224A CN 104165909 A CN104165909 A CN 104165909A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fumaric acid
- electrode
- detection
- detection method
- sensor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明涉及一种富马酸的生物电化学检测方法,属于生化检测技术领域。该方法用于对富马酸的专一性检测,将活化培养的希瓦氏菌的菌液和缓冲液混合共同作为生物电化学传感器的反应液,将含富马酸的样品加入生物电化学传感器的反应液中,控制一定的电位,检测输出电流信号的变化,根据电流响应和富马酸浓度变化关系来计算测定样品中的富马酸浓度。该检测方法不依赖大型仪器设备,降低了测定成本和操作难度,不受富马酸结构类似物干扰,专一性强,准确性高,高效快速,测验结果准确可靠,可应用于生化样品的检测、食品药品的检测、肿瘤的筛查和诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种富马酸的生物电化学检测方法,属于生化检测技术领域。
背景技术
富马酸,又称延胡索酸,即反丁烯二酸(IUPAC名为(E)-丁烯二酸),是一种无色、易燃的晶体,由丁烯衍生出的羧酸。它的化学式是C4H4O4。富马酸是重要的四碳平台有机化工原料和精细化工产品,富马酸及其衍生物由于具有无毒、低腐蚀性等特点,被广泛应用于食品、医药、饲料、化工、涂料、树脂、增塑剂等领域。其含量的快速、准确测定在富马酸的合成及衍生物生产中有重要意义。据报道(W. Marston Linehan & Tracey A. Rouault. Molecular Pathways:Fumarate Hydratase-Deficient Kidney Cancer: Targeting the Warburg Effect in Cancer. Clin Cancer Res. 2013, 19:3345-3352. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-13-0304)富马酸还是肾脏癌症 的肿瘤标识物,专一性的对富马酸进行检测还能够应用于辅助肿瘤的诊断及预防。
现有的富马酸检测方法包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法(CE)和酶法。HPLC测定方法是根据样品中各种物质在色谱柱中分离系数的不同,将其分开,根据样品的吸收特性选择对应的检测器进行定性定量检测。富马酸的测定通常采用C18色谱柱,检测波长为紫外210 nm左右。该方法相对简单、快速、重复性好,但是对仪器有较高要求;且样品处理较为繁琐,流动相多使用有机溶剂造成环境污染。
气相色谱法也是一种精密分析物质含量的方法,但对富马酸含量的分析必须经过复杂的衍生化处理(沈能熙,直接气相色谱法测定苹果酸、富马酸中的顺丁烯二酸,精细化工,1991,1: 63-65),样品的前处理麻烦,且气相色谱仪及配套的检测器都属于大型昂贵仪器,测试成本高。
毛细管电泳法由于能够实现痕量检测,是近年应用越来越广泛的分析方法,以毛细管为分离的通道,利用带电化合物在高压直流电场中迁移速度的差异实现分离。唐美华等人在《毛细管电泳法测定葡萄酒中的有机酸含量》一文中(食品科学,2009,30(8):209-211)报道了使用毛细管电泳测定了葡萄酒中的富马酸的方法,该方法设备精密昂贵,对样品的处理有较高要求,局限了其应用发展。
酶法是目前已市场化的专一性检测富马酸含量的方法。利用延胡索酸酶混合物能特异性识别富马酸并以之为底物,成比例地产生颜色反应。故富马酸的含量可以通过测定比色度(λ = 450 nm)来定量。该方法依赖于酶制剂的催化效率,成本昂贵,且酶制剂的质量稳定性和保存效果对测定效果有很大影响,测定结果重复性不高,不适用于大规模的快速测定。
生物电化学传感器是以生物材料作为感受器元件,电极作为转换元件,以电势或电流为特征检测信号的传感器。由于使用生物材料作为传感器的敏感元件,所以生物电化学传感器具有高度选择性、专一性, 能够直接、快速的对复杂体系进行分析。目前,一些研究成果已在生物技术、食品工业、临床检测、医药工业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。(百度百科,“生物电化学”词条)。
三电极***是指由工作电极、参比电极和对电极组成的电极***。其中,三个电极组成两个回路,一个用来测电位,另一个用来测电流,工作电极和参比电极组成的回路,用来测试电极的电位,因为参比电极的电位是已知的,而工作电极和对电极组成另一个回路,用来测试电流,这就是所谓的“三电极两回路”,也就是测试中常用的三电极体系。可以用于生物电化学传感器的转换元件,将生物化学信号转化成利于检测的电信号。
希瓦氏菌具有能够识别富马酸的富马酸还原酶和电子传递***( Selenite reduction by Shewanella oneidensis MR-1 is mediated by fumarate reductase in periplasm,Scientific Reports, 2014, 4:3735. DOI:10.1038/srep03735),经过对现有技术的检索,并未发现有利用生物电化学方法检测富马酸的报道。这种富马酸的生物电化学检测方法的提出,可以高效、快速检测样品中的富马酸并测定其浓度,能够克服酶法的不稳定和易失活的缺点,并且比HPLC法、GC法和CE法的仪器装置更便宜,样品前处理更简单。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的专一性测定富马酸的方法,解决现有技术中存在的检测成本高、检测仪器昂贵、响应时间长、操作过程复杂、重复性差的问题。
本发明的技术方案是:
一种富马酸的生物电化学检测方法,按以下步骤进行:
(1)将低温保存的希瓦氏菌接种至培养基进行培养,获得活化的菌体;
(2)将活化的菌体制备希瓦氏菌菌悬液,加入反应缓冲液;
(3)将工作电极、对电极和参比电极三电极***安装好,加入步骤(2)所得的混合液体中,然后连接信号检测***,组成生物电化学传感器;
(4)在生物电化学传感器的工作电极上施加外电压,待生物电化学传感器的电流输出已达稳定后,向三电极***中加入样品,检测并记录反应器中电流变化曲线,对富马酸进行检测。
其中工作电极为碳毡或碳布;参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极;对电极为铂丝电极。
其中希瓦氏菌(Shewanella oneidensis),购自美国模式菌种保藏中心(ATCC);所述希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)的培养方式为液体培养或固体培养。
其中菌悬液的制备:活化培养为液体培养时,活化好的菌液离心,弃上清后将菌体沉淀重新悬浮于新鲜的液体培养基中;活化培养为固体培养时,刮取菌落,悬浮于新鲜培养基中。反应缓冲液由以下物质组成:M9培养基:Na2HPO4.12H2O 17.8 g L-1、KH2PO4 3g L-1、NaCl 0.5 g L-1、NH4Cl 10.5 g L-1;LB液体培养基:含胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L,pH=7.0;18 mM乳酸钠、0.1 mM的CaCl2和1 mM的MgSO4。
信号检测***由可以控制电位的仪器和可以记录电流输出的仪器组成,如电化学工作站CHI1000B (上海辰华仪器有限公司)。
所述的电化学生物传感器的工作电极加载的外电压为-1.5~1伏特。
本发明还提供一种检测富马酸的生物电化学传感器,所述传感器包括电极***和信号检测***,其特征在于,该传感器还包括富马酸信号发生体系,所述的富马酸信号发生体系由希瓦氏菌菌悬液及反应缓冲液组成。
所述希瓦氏菌菌悬液及反应缓冲液的制备和组成如上所述。
本发明的有益效果:
本发明提供的检测富马酸的电化学生物传感器,是建立在希瓦氏菌含有富马酸还原酶和胞外电子传递***,能够对富马酸的特异识别的基础上的,因此能够提高检测的专一性;由于使用了简单的电化学仪器来实现电压控制和电流信号记录,所以检测的成本低廉;由于富马酸形成的电流响应是和电化学反应传递的电子数直接相关的,因此根据电流响应设备的精确度能够达到高的灵敏度、稳定性和重复性,当同时制备三个及以上的生物电化学传感器时,加入同样浓度的富马酸样品,并使用同样的电流信号记录仪记录电流响应时,检测结果在宽广的浓度范围内都能保持高度一致,变异系数(CV)小于8%。
按照上述实验所使用的装置,测得富马酸检测的浓度线性范围为1 μM到10 mM,定性检测下限为0.05 μM。相比HPLC检测法和酶检测法等具有更宽的测量范围,可用于生化检测、临床检测中富马酸的测定。
附图说明
图1 为本发明的生物电化学传感器示意图;
图 2 为本发明的生物电化学反应原理图;
图3添加不同浓度富马酸标准溶液后的电流输出信号;
图4 为本发明所提供的富马酸检测方法测得的标准曲线;
图5 当富马酸检测浓度为0.05μM, 1μM和10 mM 时的电流输出信号;
图6 以碳毡为阳极材料时的电流输出信号;
图7当检测电压为-0.2伏特、-0.4伏特、-1.5伏特和1伏特时的电流输出信号;
图8 添加多种有机酸时的电流输出信号,仅富马酸产生明显的电流输出信号。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行具体描述或作进一步说明,其目的在于更好的理解本发明的技术内涵,但是本发明的保护范围不限于以下的实施范围。
实施例1:
(1)使用菌种:希瓦氏菌(Shewanella oneidensis),购自ATCC美国模式菌种保藏中心,菌种编号ATCC700550。
(2)工作菌液获得:向45 mL的LB培养基(含胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L和氯化钠5 g/L,pH=7.0)中接入200μL甘油菌(希瓦氏菌与30%甘油水溶液等比例混合保存于-70℃冰箱中),于温度30℃、震荡转数200 rpm培养16 h, 获得菌液。
(3)配制生物电化学传感器的反应液:将95 mL M9培养基(含Na2HPO4.12H2O 17.8 g/L、KH2PO4 3g /L、NaCl 0.5 g/L、NH4Cl 1 g/L)和5mL LB液体培养基(含胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L和氯化钠5 g/L,pH=7.0)充分混合,另外添加乳酸钠、氯化钙、硫酸镁使其终浓度分别达到18 mM、0.1 mM和1 mM。反应液需要121度20 min灭菌锅灭菌后备用。
(4)生物电化学传感器的组装:采用三电极工作方式,以钛丝连接的4×4 cm碳布作为工作电极,以铂丝电极作为对电极,以饱和甘汞电极作为参比电极,并使用电化学工作站CHI1000B (上海辰华仪器有限公司)控制,在工作电极施加-0.6伏特的外电压。
(5)标准曲线绘制:配制富马酸的终浓度为10μM,50μM,200μM,500μM,1 mM的标准溶液。待生物电化学传感器的输出电流达到稳定后(约30min),将不同浓度的富马酸标准溶液依次加入到不同的生物电化学传感器体系中,记录电流的变化曲线(见附图3)。富马酸的浓度与检测所得的电流响应曲线的峰面积成正比(R2为0.9982) (见附图4)。
(6)检测含富马酸的样品:按照上述(2)-(4)的步骤,制备6个生物电化学传感器用于富马酸检测,向这6个传感器中分别加入不同浓度的富马酸样品,记录电流响应图的峰面积结果,并根据标准曲线计算富马酸含量,如表1所示。
表 1. 在不同的传感器中分别测试不同富马酸样品的结果
a CV, 变异系数 (n=3)
(7)检测限测试:使用上述(2)-(4)的步骤,制备生物电化学传感器,配置不同浓度的富马酸样品,记录检测信号,记录结果表明:信号响应为噪声10倍的富马酸浓度0.05 μM为最小定量限,富马酸浓度为10 mM时达到最大定量限,浓度更大时信号输出不再稳定。电流信号如图5所示。
由实例可见,富马酸的全程监测仅需一台电化学工作站以及常见的参比电极、对电极、工作电极即可完成操作,整个操作无需诸如衍生、膜过滤等复杂繁琐的预处理过程,减少操作环节,且定量范围宽广,最大和最小定量限之间相差4个数量级,可完成富马酸液体样品中大部分浓度的直接检测。从添加富马酸到产生电流响应几乎是瞬间的,可以立即进行富马酸的定性判断,定量的完全出峰因富马酸浓度不同和反应液内菌体浓度的不同而需要不同的时间,低浓度时也仅需几秒钟就能完成检测,并且可以实现同一个***的连续进样。操作条件简单,新手也可完成独立操作。
实施例2:
与实施例1基本相同,但有以下改变:工作电极为碳毡。得到的检测图如附图6所示。
实施例3:
与实施例1基本相同,但有以下改变:工作电极的外加电压为-0.4伏特。电流信号如图7所示。
实施例4:
与实施例1基本相同,但有以下改变:工作电极的外加电压为1伏特。电流信号如图7所示。
实施例5:
与实施例1的步骤(1)-(4),不同的是第(5)步骤中,将琥珀酸、马来酸、葡萄糖、柠檬酸和富马酸添加到生物电化学传感器体系中,检测记录电流输出信号,结果仅富马酸产生明显的电流输出信号,如图8所示。
由实例可见,该方法对干扰物无明显信号响应,可实现对富马酸的专一性检测。
Claims (6)
1. 一种富马酸的生物电化学检测方法,其特征在于,按以下步骤进行:
(1)将低温保存的希瓦氏菌接种至培养基进行培养,获得活化的菌体;
(2)将活化的菌体制备希瓦氏菌菌悬液,加入反应缓冲液;
(3)将工作电极、对电极和参比电极三电极***安装好,加入步骤(2)所得的混合液体中,然后连接信号检测***,组成生物电化学传感器;
(4)在生物电化学传感器的工作电极上施加外电压,待生物电化学传感器的电流输出已达稳定后,向三电极***中加入样品,检测并记录反应器中电流变化曲线,对富马酸进行检测。
2. 根据权利要求1所述的一种富马酸的生物电化学检测方法,其特征在于,步骤(2)中所述的反应缓冲液由以下物质组成:M9培养基:Na2HPO4.12H2O 17.8 g L-1、KH2PO4 3g L-1、NaCl 0.5 g L-1、NH4Cl 10.5 g L-1;LB液体培养基:含胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L,pH=7.0;18 mM乳酸钠、0.1 mM的CaCl2和1 mM的MgSO4。
3. 根据权利要求1所述的一种富马酸的生物电化学检测方法,其特征在于,步骤(3)中所述的工作电极为碳毡或碳布;参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极;对电极为铂丝电极。
4. 根据权利要求1所述的一种富马酸的生物电化学检测方法,其特征在于,步骤(4)中所述的信号检测***由控制电位的仪器和记录电流输出的仪器组成。
5. 根据权利要求1所述的一种富马酸的生物电化学检测方法,其特征在于,步骤(4)中所述的电化学生物传感器的工作电极加载的外电压为-1.5~1伏特。
6. 一种如权利要求1中所述的检测富马酸的生物电化学传感器,所述传感器包括电极***和信号检测***,其特征在于,该传感器还包括富马酸信号发生体系,所述的富马酸信号发生体系由希瓦氏菌菌悬液及反应缓冲液组成。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410334224.6A CN104165909B (zh) | 2014-07-14 | 2014-07-14 | 一种富马酸的生物电化学检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410334224.6A CN104165909B (zh) | 2014-07-14 | 2014-07-14 | 一种富马酸的生物电化学检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104165909A true CN104165909A (zh) | 2014-11-26 |
CN104165909B CN104165909B (zh) | 2017-02-01 |
Family
ID=51909820
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410334224.6A Active CN104165909B (zh) | 2014-07-14 | 2014-07-14 | 一种富马酸的生物电化学检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104165909B (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105842322A (zh) * | 2016-03-28 | 2016-08-10 | 西安建筑科技大学 | 基于碳毡电极对蒽醌类物质电化学检测的灵敏度改善方法 |
CN106442664A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-02-22 | 江苏大学 | 一种绿脓菌素的生物电化学检测方法 |
CN107643333A (zh) * | 2017-08-28 | 2018-01-30 | 江苏大学 | 一种检测水体毒性的双信号生物电化学方法 |
CN108362752A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-08-03 | 河南工业大学 | 一种检测氧化三甲胺的全细胞生物电化学传感器 |
WO2020191016A1 (en) * | 2019-03-21 | 2020-09-24 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Flow-through electrochemical detection system |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101324551A (zh) * | 2007-06-12 | 2008-12-17 | 广东康虹医药有限公司 | 富马酸卢帕他定的质量控制方法 |
WO2012019175A2 (en) * | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Mascoma Corporation | Production of malonyl-coa drived products via anaerobic pathways |
US20130075279A1 (en) * | 2009-12-08 | 2013-03-28 | Cambrian Innovation, Inc. | Microbially-based sensors for environmental monitoring |
WO2013090495A1 (en) * | 2011-12-14 | 2013-06-20 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Shewanella enrichment from oil reservoir fluids |
EP2796527A1 (en) * | 2009-05-22 | 2014-10-29 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Altering the interface of hydrocarbon-coated surfaces |
-
2014
- 2014-07-14 CN CN201410334224.6A patent/CN104165909B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101324551A (zh) * | 2007-06-12 | 2008-12-17 | 广东康虹医药有限公司 | 富马酸卢帕他定的质量控制方法 |
EP2796527A1 (en) * | 2009-05-22 | 2014-10-29 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Altering the interface of hydrocarbon-coated surfaces |
US20130075279A1 (en) * | 2009-12-08 | 2013-03-28 | Cambrian Innovation, Inc. | Microbially-based sensors for environmental monitoring |
WO2012019175A2 (en) * | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Mascoma Corporation | Production of malonyl-coa drived products via anaerobic pathways |
WO2013090495A1 (en) * | 2011-12-14 | 2013-06-20 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Shewanella enrichment from oil reservoir fluids |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
DANIEL BARON等: "Electrochemical Measurement of Electron Transfer Kinetics by Shewanella oneidensis MR-1", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
FREDERIK GOLITSCH等: "Proof of principle for an engineered microbial biosensor based on Shewanella oneidensis outer membrane protein complexes", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 * |
YURI A. GORBY 等: "Electrically conductive bacterial nanowires produced by Shewanella oneidensis strain MR-1 and other microorganisms", 《PNAS》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105842322A (zh) * | 2016-03-28 | 2016-08-10 | 西安建筑科技大学 | 基于碳毡电极对蒽醌类物质电化学检测的灵敏度改善方法 |
CN106442664A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-02-22 | 江苏大学 | 一种绿脓菌素的生物电化学检测方法 |
CN106442664B (zh) * | 2016-12-09 | 2019-02-05 | 江苏大学 | 一种绿脓菌素的生物电化学检测方法 |
CN107643333A (zh) * | 2017-08-28 | 2018-01-30 | 江苏大学 | 一种检测水体毒性的双信号生物电化学方法 |
CN108362752A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-08-03 | 河南工业大学 | 一种检测氧化三甲胺的全细胞生物电化学传感器 |
WO2020191016A1 (en) * | 2019-03-21 | 2020-09-24 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Flow-through electrochemical detection system |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104165909B (zh) | 2017-02-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Carelli et al. | An interference free amperometric biosensor for the detection of biogenic amines in food products | |
Van Staden et al. | Flow-injection analysis systems with different detection devices and other related techniques for the in vitro and in vivo determination of dopamine as neurotransmitter. A review | |
Zhu et al. | Label-free ratiometric homogeneous electrochemical aptasensor based on hybridization chain reaction for facile and rapid detection of aflatoxin B1 in cereal crops | |
Cao et al. | Electrochemical sensing of melamine with 3, 4-dihydroxyphenylacetic acid as recognition element | |
Li et al. | A strategy for constructing sensitive and renewable molecularly imprinted electrochemical sensors for melamine detection | |
CN104165909A (zh) | 一种富马酸的生物电化学检测方法 | |
Zhang et al. | Amperometric biosensor for uric acid based on uricase-immobilized silk fibroin membrane | |
CN103424448A (zh) | 一种电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素a的方法 | |
CN108732218B (zh) | 一种测定2,4,6-三氯苯酚的电化学传感器及其制备和应用 | |
Trojanowicz et al. | Electrochemical and piezoelectric enantioselective sensors and biosensors | |
Wen et al. | Detection of ethanol in food: A new biosensor based on bacteria | |
CN105223248A (zh) | 基于苯硼酸印迹聚合物/碳纳米管修饰电极及其制备方法和应用 | |
CN109781815A (zh) | 一种喹乙醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法 | |
CN108776160B (zh) | 一种同时检测双酚a和双酚s的方法 | |
CN105628753A (zh) | 一种维生素b2的生物电化学检测方法 | |
CN106248770A (zh) | 一种快速检测杀螟硫磷农药残留的电化学方法 | |
CN106442664B (zh) | 一种绿脓菌素的生物电化学检测方法 | |
CN102520030B (zh) | 一种检测玉米赤霉醇的无标记型电化学免疫传感器的制备方法 | |
CN105223260B (zh) | 痕量快速检测对羟基苯甲酸丁酯的电化学传感器及其制备方法 | |
Chen et al. | Portable analytical techniques for monitoring volatile organic chemicals in biomanufacturing processes: recent advances and limitations | |
CN107271527A (zh) | 一种电化学检测草甘膦的方法 | |
CN103969319B (zh) | 一种水生生物金属硫蛋白的检测方法 | |
CN105758912A (zh) | 一种纳米TiO2-MoS2光电Saos-2 cell细胞传感器的制备及其应用 | |
CN109142480A (zh) | 一种基于碳纳米管的电化学传感器及其制备方法和应用 | |
CN104965014B (zh) | 用于检测sam的量子点/酶复合碳糊电极的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |