CN100441682C - 获得活的人肝细胞,包括肝干/祖细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从全肝或其切片中获得含有活的功能性肝细胞的细胞群落的方法、其组合物和用途，该群落富集有肝实质细胞和肝干/祖细胞。组合物包括富集有肝实质细胞和肝干/祖细胞的肝细胞的组合物和其药物组合物。用途包括肝疾病治疗、肝再生、毒性测试和肝辅助装置。

Description

获得活的人肝细胞，包括肝干/祖细胞的方法
背景技术
正常的肝通过修复或替换受伤组织而使自身具有再生的能力。尽管有这种保护，但是一旦关键的肝细胞块由于疾病或损伤死亡，该肝就会衰竭，从而导致疾病或死亡。肝衰竭是严重的健康问题，在美国每年大约有300,000人因为慢性肝疾病而住院治疗，且30,000人死亡。现在，治疗许多肝病的唯一方法是肝移植，但是，在美国每年只有约5,000个捐赠肝可以使用。到2002年5月，大约有18,000个患者在等待肝移植，比过去四年增加了100％，而十年前为1,700个。另外，在美国大约有100,000个成年人正患有严重的肝硬化和其它形式的慢性肝衰竭，这些人都会成为肝移植的候选人。
由于捐赠器官的短缺，因此等待可利用的捐赠肝的需要肝移植的患者经常不得不等待数年。现今，全器官肝移植步骤需要捐赠者的大脑已经死亡而心脏仍然在跳动。这种情况的发生率只占医院死亡的约1-2％。很显然，大部分的肝疾病患者不能依靠器官移植作为解决方法，迫切需要新的技术来满足肝损伤的患者。
肝的再生能力表明肝细胞移植可能可以有效地改变全肝的同位移植。将捐赠的肝细胞注入到肝病患者体内，其可能会重建该受体的肝(和/或脾，只要注入到该器官中)并恢复功能。但是成熟肝细胞移植后的成活期限和扩增数量并不确定。
传统理论认为所有成熟的成人肝细胞都能够分化很多次，而使器官在损伤后再生。然而，对来源于肝的器质性细胞的再生潜力的范围有越来越多的关注。在研究啮齿动物的肝细胞时，发现周边区的成熟肝细胞在任何情况下都能完成有限次数的细胞分化。门静脉周围的成人肝细胞，有时也称“小肝细胞”具有更强的再生能力，但也只能完成有限次数的细胞分化。最强的再生能力存在于一小群具有干或祖样属性的二倍体***中，其能广泛增殖并产生成熟肝细胞。[Kubota H和Reid LM.2000.Clonogenic hepatoblasts，common precursors forhepatocytic and biliary lineages，are lacking classical majorhistocompatiblity complex class I antigen.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences(USA)97：12132-12137]
肝干/祖细胞是属于干细胞系的不成熟细胞群落，但其不具有成熟干细胞的大部分功能。然而，它们既能广泛地增生，还能产生完全分化的不具有肝功能的子代细胞。对啮齿动物模型进行研究表明，存在于胎儿和成人肝中的干/祖细胞至少具有两种潜能，即它们的后代包括两种细胞型，命名为肝实质细胞和胆管细胞。[Kubota H和Reid LM.2000.Clonogenic hepatoblasts，common precursors for hepatocytic andbiliary lineages，are lacking classical major Histocompatiblity complexclass I antigen.Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)97：12132-12137.]在成人肝中，该干/祖细表明参予肝的再生，并在某种类型的肝损伤使受体的成熟肝细胞遭破坏或增生能力下降时广泛地再建宿主肝。
从成人肝中分离肝实质细胞，然后灌输到宿主组织中。在过去的30年中，积累了大量的科技文献，这些文献验证了这些灌输的肝实质细胞存活、增生、发挥功能和参予再生过程的能力。已经表明将肝实质细胞移植到脾或肝中，能纠正许多动物模型在新陈代谢方面的遗传性缺陷，能在宿主的肝细胞受损或寿命减少时完全地重建宿主肝(如在FAH缺陷的鼠模型中)，能在不同的伤害导致急性肝衰竭过程中发挥肝功能，能改善肝功能并能延长CCl4诱导的硬化模型动物的存活时间。
文献中的病例研究和病例报告描述了向患者用肝细胞给药的研究，其中的患者患有不同急性和慢性、遗传性和获得性肝病，年龄40岁以上。[Strom SC，Chowdhury JR，和Fox IJ.1999.Hepatocytetransplantation for the treatment of human disease(Review).Seminars inLiver Disease 19：39-48.]大量这些报告的数据表明上述细胞确实能移植、存活并发挥作用几个月。在一研究中，清蛋白水平和凝血时间得到提高，这表明了移植后四到六个月肝的综合能力得到提高。表明移植的肝细胞的嫁接和功能的最佳公开报道涉及一10岁女孩，该女孩患有克果纳杰氏症(Crigler Najjar syndrome)，一种遗传性疾病，患该疾病的个体缺乏与胆红素鳌合的UDP葡萄糖醛酸转移酶，于是导致严重的黄疸。Fox等.，″Treatment of the Crigler-Najjar Syndrome.Type I withhepatocyte transplantation，″New England Journal Of Medicine，(1998)338：1422-1426。在移植后18个月内，该个体胆汁中的鳌合胆红素的分泌明显增加，她的肝组织切片中的酶活性提高，对紫外线光线治疗的需求减小。然而，这些使用肝细胞移植的在先实验都只产生短时间的效果，成熟肝细胞有限的增生能力必然地限制了单独用肝细胞治疗的有效时间。
已经发现使用本发明的细胞群可以克服治疗肝病的在先尝试所存在的上述问题，本发明的细胞群富集活的功能性肝细胞。本发明的这些细胞具有广泛的增生能力，从而使组织再生最大化和使进行成功移植所需细胞的剂量降低。干/祖细胞的存在也提高了肝细胞治疗的有效时间，因为相对于成熟肝细胞，它们存活、增生、发挥功能和参予再生过程的能力得到了提高。
如果肝细胞疗法在商业上变为现实，并成为大量患者可行的治疗选择，那么必须足量提供肝组织。已经发现用本发明的方法获得的细胞可以来源于某个器官捐赠者的肝，由于时间/运输的限制，该肝不适于全器官移植或不能及时使用。用本发明的方法可以从肝中分离得到活的功能性肝细胞，该肝根据常规的教导并不适于同位移植或制备大量的用于细胞移植的成熟肝细胞。更重要的是，用本发明的方法纯化人肝细胞，包括干/祖细胞能显著地扩增捐赠池(donor pool)而用于肝细胞治疗。而且，由于干/祖细胞对缺血性损伤具有明显的相对抗性，因此用本发明可以从许多心博停止(如无心跳)的捐赠者中得到这些细胞。
本发明的分离方法确保了低温保存的细胞混合物中含有来源于捐赠肝的活的功能性肝细胞。该方法从捐赠的全人肝中或其切片中(与天然肝制剂相比)分离出含有更高比例活肝细胞的悬液，并去除了死细胞和没有完全衰竭的碎片，保留了小的肝干/祖细胞群落。获得的这些细胞群落在冷冻保存前可以含有高于80％的活细胞，在融化后含有高于70％的活细胞，且有75％以上的细胞是肝细胞。
相反，已知的肝细胞分离方法使用低速离心，在许多情况下通过含有Percoll的介质来富集肝细胞(离心后的团粒)。虽然用该方法来分离大的活肝细胞，特别是较大肝细胞是非常有效的，但是其使肝干/祖细胞大量衰竭，而且大量的较小成人肝细胞丢失。
本发明提供了药物学质量的肝细胞移植或细胞治疗的产品和获得大量活的功能性肝细胞群，包括肝干/祖细胞的方法，以前该肝细胞群是通过常规方法获得的，因此，本发明满足了上文所述的需要，推动了肝细胞移植或细胞治疗方面的研究。本发明的肝细胞移植或细胞治疗产品包括品质优良的含有肝干/祖细胞及其它在肝中可以发现的细胞类型的肝细胞混合物。
发明的简要描述
本发明涉及获得富集有活的人肝细胞的细胞群落的方法，该方法包括：用蛋白水解酶制剂消化整个人肝或其切片以得到消化了的整个人肝或其切片；离解消化了的整个人肝或其切片以得到细胞悬液；调整该细胞悬浮介质的密度以在离心时在密度屏障的作用下产生至少两条分离的细胞带，该至少两条带中至少有一条的密度低于该至少两条带中的另一条带的密度；收集该至少一条较低密度带以获得富集有活的人肝细胞，包括肝干/祖细胞的细胞群落。
在本发明的另一具体实施方案中，提供了获得富集有活的人肝细胞，包括肝干/祖细胞的细胞群落的方法，该方法包括：用蛋白水解酶制剂消化整个人肝或其切片以得到消化了的整个人肝或其切片；分离消化了的整个人肝或其切片以得到细胞的悬液；调整该细胞悬浮介质的密度以在离心时产生至少一条细胞带，该至少一条细胞带的密度比细胞或细胞碎片的团粒的密度低；和收集该至少一条较低密度带以获得富集有活的人肝细胞，包括肝干/祖细胞的细胞群落。本发明其它的具体实施方案包括但不限于还含有功能性肝细胞、功能性胆管细胞、功能性造血细胞或其组合的细胞群落。
在本发明的其它具体实施方案中，上述肝或其切片可以从心脏跳动的或心博停止的初生儿、幼年、少年或成年捐赠者中获得。具体地，通过本发明的方法获得的细胞可以来源于经历过一段时间的温缺血或从心博停止的捐赠者中获得的捐赠肝。
本发明还涉及组合物，该组合物含有富集有活的功能性肝细胞的肝细胞群落，该细胞群落含有功能性肝细胞和肝干/祖细胞。在本发明的特定具体实施方案中，该富集的细胞群落富集有直径约为9-13微米，阳性表达EP-CAM(也称作GA733-2、C017-1A、EGP40、KS1-4、KSA)、CD133或两者的肝干/祖细胞。
在其它具体实施方案中，本发明涉及到含有肝细胞群落的组合物，与从肝中获得的天然细胞悬液相对应，该肝细胞群落富集有活的功能性肝实质细胞和肝干/祖细胞。在又一具体实施方案中，该组合物还含有胆管细胞。已发现本发明的细胞群落的胆管细胞阳性表达细胞角质蛋白-19(CK-19)，阴性表达请蛋白。
本发明还涉及到治疗肝病的方法，该方法包括用有效量的富集有活的功能性肝细胞，包括肝干/祖细胞的细胞群给药。本发明包括各种给药方式，包括但不限于通过脾动脉或门静脉注入，直接注入到肝髓中，通过肝被膜注入或直接注入到脾中。
在另一具体实施方案中，本发明涉及到药物组合物，该组合物含有富集有活的功能性肝细胞，包括肝干/祖细胞的肝细胞群和药物学上可接受的载体。在另一具体实施方案中，该药物学上可接受的载体可以包括防腐剂，如HYPOTHERMOSOLTM。
在又一具体实施方案中，本发明涉及到在体外进行毒性测试的方法，该方法包括将富集有活的功能性肝细胞，包括肝干/祖细胞的肝细胞群暴露于测试试剂，然后观察该测试试剂对肝细胞群可能产生的至少一种效果(如细胞生存能力，细胞功能或两者)。本发明还涉及在体外进行药物代谢研究的方法，该方法包括将富集有活的功能性肝细胞，包括肝干/祖细胞的肝细胞群暴露于测试试剂，并在预定的测试时间后观察该测试试剂有关的可能产生的至少一种改变。该至少一种改变包括但不限于该测试试剂的结构、浓度或两者发生变化。
本发明的另一具体实施方案涉及肝辅助装置，该装置包括装有富集有活的功能性肝细胞，包括肝干/祖细胞的肝细胞群落的小室。该肝细胞可以包括人肝细胞或猪肝细胞。
本发明还涉及治疗基因表达错误的方法，该方法包括将功能性基因拷贝导入到包含有活的功能性肝干/祖细胞的人肝细胞群中以产生转化群落，将该转化群落的至少一部分导入到需要该功能性基因拷贝的患者的肝中。本发明上述方法所使用的组合物是本发明的另一具体实施方案。
本发明提供的其它方法包括促进受伤或疾病肝的再生的方法，治疗肝感染的有效试剂的测试方法，制备有益蛋白的方法和制备有益疫苗的方法。
在测试治疗肝感染的有效试剂的方法中，用目标感染试剂感染人肝细胞群落，然后，将该受感染的群落暴露于预定量的测试试剂，观察该暴露对受感染的群落可能产生的影响。在制备有益蛋白的方法中，将编码该有益蛋白的功能性基因导入到含有肝干/祖细胞的肝细胞群落中，然后将产生的细胞群落在合适条件下培养以使有效地产生转录、翻译和任选的翻译后修饰，接着收集该目的蛋白。还可以制备疫苗产品，将重组病毒或病毒粒子导入到含有肝干/祖细胞的细胞群落中，该病毒或病毒粒子至少能感染该细胞群落的一些成员而使该受感染的成员表达抗原，于是在向个体导入该群落的受感染成员时产生免疫反应，其中的个体需要免疫来对抗向与该抗原有关的感染性试剂的进一步暴露。
除非另有说明，实施本发明将会使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学方面的常规技术，这些技术是本领域公知的。描述这些技术的文献见，如MolecularCloning A Laboratory Manual，第二版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，卷I和II(D.N.Glover编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Mullis等，美国专利No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins编.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；论文Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vol.154和155(Wu等编)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编，Academic Press，London，1987)；Handbook of ExperimentalImmunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)；Applications and Products 2001：Density Gradient Media(Axis-Shield PoC AS，Oslo，Norway，2001)。
通过结合附图对本发明进行如下详细描述，本发明的其它特点和优点将会更清楚，该附图以举例的方式阐述了本发明的原理。
附图的简要说明
图1显示了对新的OptiPrepTM分离方法用粒子计数器测得的大小曲线，其显示了两个细胞波峰：我们指定为相对“小”(一般为9-13uM)和相对大(一般为18-22uM)的细胞。该“小”细胞群含有干/祖细胞，这些细胞大小大约为10uM；
图2显示了对标准(常规)的Percoll方法用粒子计数器测得的大小曲线，其显示了在Percoll团粒(100×g)中较大细胞(直径为18-22uM)的相关量比相应的上清(300×g)中要多；
图3显示了用FACS分析和接下来的人EP-CAM抗体特异性免疫着色的结果，该结果表明Percoll团粒(100×g)含有的EP-CAM阳性着色细胞(左图，0.12％的EP-CAM群(+))比起始材料(右图，0.76％的EP-CAM群(+))少6倍；
图4显示了用FACS分析和接下来的人EP-CAM抗体特异性免疫着色的结果，该结果表明OptiPrepTM组分对EP-CAM阳性着色细胞群的总数没有明显的影响(在分离的和未分离的样品中分别含有3.07％和3.06％的EP-CAM阳性着色细胞群)；
图5显示了与常规方法的上清(中图)及常规方法的团粒(右图)相比较的本发明的细胞分离物中的EP-CAM阳性细胞的相关群落(左图)图，结果来自九月龄捐赠者；
图6显示了与常规方法的上清(中图)及常规方法的团粒(右图)相比较的本发明的细胞分离物中的EP-CAM阳性细胞的相关群落(左图)图，结果来自三岁龄捐赠者；
图7显示的图证实了在免疫选择后富含EP-CAM阳性细胞；
图8显示的图证实了在免疫选择后富含EP-CAM阳性细胞；
图9显示了在不同着色条件下由单细胞生长形成的克隆的显微照片，证实了本发明的方法分离的细胞是肝干/祖细胞；
图10显示了在不同着色条件下由单细胞生长形成的克隆的显微照片，证实了本发明的方法分离的细胞是肝干/祖细胞；
图11显示了在NOD-SCID鼠中微载体珠上的人肝细胞的显微照片；
图12显示了在比图11的显微照片功率低的情况下拍得的显微照片，从中可以看到大的已被宿主脉管化的肝细胞所形成的岛，如红血细胞所证实的那样；
图13证明了本发明的肝干/祖细胞能熟化为肝细胞并表现成熟的表型，显示了它们的细胞质对肝糖阳性着色。要注意的是细胞出现了明显的组织化形成髓；
图14显示了本发明获得的与注射到宿主中的微载体结合的三种肝细胞。黑框画于两种相邻细胞的交界处。区域放大图显示了结构、微绒毛、胆小管和另一种成熟细胞标记。
图15是显微照片，证实了本发明冷藏的人肝细胞嫁接到NOD-SCID鼠的肝中。在移植后两小时，通过原位杂交在门静脉和窦状腺中可清楚地看见人细胞，但是它们仍然没有通过脉管间隙进入到肝实质组织中。
图16是显微照片，证实了本发明冷藏的人肝细胞嫁接到NOD-SCID鼠的肝中。在移植后40天，人肝细胞不仅驻留在肝中，还嫁接到肝细胞板中并完全整合到肝实质组织中。
本发明的详细描述
部分地，本发明涉及获得富集有活的功能性肝实质细胞和肝干/祖细胞的细胞群落的方法。本发明的另一方面涉及鉴定肝干/祖细胞的方法。本发明下文所述的的具体实施方案将揭露从成人肝中鉴定和分离肝干/祖细胞的重要优点。
鉴定从人胎儿肝中分离的肝干/祖细胞所表达的几种细胞表面蛋白，发现在幼年、少年和成年人肝中只有小百分比的细胞表达同样的抗原。利用磁性细胞分选技术大量地富集表达一种表面抗原的细胞，用这种方法分离细胞的平均大小比成熟肝细胞要小得多，相反，以前研究的啮齿动物肝干/祖细胞是大的(比成熟实质细胞大的)、嗜酸的肝细胞和肝储存细胞(美国专利No.5,559,022)。另外，大部分的这种细胞还表达具有肝干/祖细胞特性的另一种抗原。当在啮齿动物肝干/祖细胞能生长，而较成熟肝细胞限制生长的严格选择条件下培养时，该分选的成人细胞表现出生长潜能增强。更明显地，对该分选群落的单细胞生长克隆进行分析证实表达的蛋白具有肝和胆管细胞系特性，如同双潜能肝干/祖细胞。
在本发明中，突出的特点是在肝(来自无心跳的捐赠者)中保留有表达特征表面抗原的细胞，该肝在收集前已经受了几小时的严重缺氧。事实上，该肝干/祖细胞比天然肝细胞对缺血具有强得多的抗性。另外，虽然来自心博停止的全肝细胞制品一般含有大量的与细胞损伤和炎性反应有关的细胞，但是仍然可以用本发明的方法高度富集活的功能性肝细胞，包括肝干/祖细胞。在本发明的优选具体实施方案中，利用免疫选择和磁性分选技术更进一步地从肝中分离或除去选定的细胞类型。
本发明用来富集活的功能性人肝细胞的方法可以直接用于全肝细胞制品或由肝切片制备的制品。该方法迅速且具有合适的细胞产量和存活率，可以用来制备上千万的细胞。该分离的细胞可以容易地冷藏且在解冻时仍然存活。
本发明证实，活的肝细胞可以从不同的肝来源中得到，包括从其肝不能用于全器官移植的无心跳的捐赠者中死后分离得到。由于本发明的肝细胞群落可以从心博停止的捐赠者中获得，因此本发明显著地扩展了适于进行肝细胞移植或细胞治疗的捐赠器官的来源。表1列出了从心跳的和心博停止的捐赠者中分离的产量。
表1
有心跳的捐赠者
                       消化后产量
            细胞总数(109)        存活率
范围：      7.7-81.7             25-74
平均值：    32.7                 57
                       处理后产量
            细胞总数(109)        存活率
范围：      1.2-30.7             76-99
平均值：    15.0                 86
心博停止的捐赠者
                       消化后产量
            细胞总数(109)        存活率
范围：      01-26.2              11-51
平均值：    10.7                 34
                       处理后产量
            细胞总数(109)        存活率
范围：      0.01-11.0            64-99
平均值：    5.0                  86
本发明的分离方法及与标准(常规)方法的比较
通过用LiberaseTM，胶原酶的一种纯化形式灌注组织而从全捐赠肝或其切片中分离得到细胞，收集得到的细胞悬液。使用两种方法检测以将活细胞与死细胞分开。在本发明的新方法中，将等份的细胞悬液与等体积的碘克沙醇(OptiPrepTM，60％碘克沙醇水溶液，Axis-Shield，Noway)混合，在Cobe 2991TM细胞洗涤器(可从Blood ComponentTechnology，Lakewood，Co得到)中室温下2000rpm离心(大约500×g)15分钟，如下所述。
向500ml无菌瓶中加入208.5ml OptiPrepTM、291.5ml无酚红RPMI-1640，得到25％的密度为1.12的碘克沙醇溶液。根据重量计算得出细胞体积，向细胞中加入足量的无酚红RPMI-1640使最终体积为250ml，总细胞数为10×109(40×106细胞/ml)。加入250ml 25％的碘克沙醇，轻轻摇匀。通过自流将得到的碘克沙醇细胞溶液加到COBE2991TM cell waher-处理包中，在该处理包旋转时，用蠕动泵以20ml/min的速率将100ml的无酚红RPMI-1640层泵到碘克沙醇细胞溶液的上部，2000rpm(大约500×g)离心15分钟。得到位于碘克沙醇细胞溶液和无酚红RPMI-1640界面间的肝细胞带，分别从团粒材料中分离回收该细胞带。
在如上所述的条件下进行的单个试验中，测定起始材料的密度和选定离心带的密度，所述选定离心带包括“Umix”带、“梯度内容物”带和团粒，发现目标“Umix”带的密度为1.0607，该密度值小于起始材料(1.0792)、“梯度内容物”带(1.0792)和团粒(1.1061)的密度值。然后测定得到11.59％的碘克沙醇溶液是使目标细胞离心后发生直接分离所需要的梯度。
在制备肝细胞的一常规方法中，是将等份的肝细胞悬液与等份的Percoll(Sigma，MO)混合得到最终浓度为22.5％的Percoll。接着在Sorvall RC3B离心机中4℃下100×g离心5分钟，回收团粒。应该注意的是根据该常规方法的教导，上清夜被丢弃，因为一般认为该上清液含有的细胞具有较低活性且其一般含有较多的细胞碎片。为了进行比较，回收该上清夜，稀释5倍，4℃下300×g离心5分钟。另一种制备肝细胞的常规方法是通过酶消化肝，然后低速离心细胞，一般大约是50×g离心来分离该肝细胞悬液，保留团粒细胞，丢弃上清液中的细胞。
台盼蓝染色排除法(Trypan blue exclusion)显示100×g团粒中富含有70-90％的活细胞，而Percoll上清中含40-60％。相反，在本发明的OptiPrepTM梯度中，最上层的细胞带含有80-90％的活细胞，而团粒材料一般少于20％。用粒子计数器分析大小显示在Percoll团粒中具有较大细胞(直径为18-22uM)，而在Percoll上清中含有的直径为9-13uM的细胞比团粒中多。OptiPrepTM梯度最上面的带含有直径为18-22uM和9-13uM的细胞，对该OptiPrepTM团粒进行的大小分布测试表明该团粒含有大量的碎片。对这些细胞进行荧光活性细胞分选(FACS)分析，接着进行EP-CAM免疫着色，结果表明通过Percoll沉降会去除EP-CAM阳性着色细胞，这些阳性细胞位于在Percoll上清的下面。OptiPrepTM梯度的最上层带含有与Percoll上清相似的EP-CAM阳性细胞群。克隆形成分析表明，Percoll团粒中的细胞完全不形成任何克隆，而Percoll上清具有相当水平的克隆形成能力，同该OptiPrepTM梯度的最上层带一样。该克隆形成能力与EP-CAM阳性着色有关，因为富集EP-CAM阳性细胞也富集了该细胞制剂的克隆形成能力。
如图1所示，对新的OptiPrepTM分离法用粒子计数器测定得到的大小曲线图显示了2个细胞波峰：相对小的(直径一般为9-13uM)和相对大的(直径一般为18-22uM)细胞。该小细胞群含有干/祖细胞，这些细胞的大小约为10uM。这两个细胞群的相关量根据捐赠肝的不同而变化，该波峰群落在微米级的平均大小也一样变化。
图2显示了使用标准的Percoll方法在Percoll团粒(100×g)中较大细胞(直径为18-22uM)的相关量比相应的上清(300×g)中要多。
图3显示了用FACS分析和接下来的人EP-CAM抗体特异性免疫着色的结果，表明Percoll团粒(100×g)含有的EP-CAM阳性着色细胞(左图，0.12％的EP-CAM群(+))比起始材料(右图，0.76％的EP-CAM群(+))少5倍。
相反，如图4所示，OptiPrepTM组分对EP-CAM阳性着色细胞群的总数没有明显的影响(在分离的和未分离的样品中分别含有3.07％和3.06％的EP-CAM阳性着色细胞群)。
用OptiPrepTM分离的细胞(最上层带)作为起始原料，在试验中使用两种不同的捐赠肝，我们同样证明了用常规Percoll方法得到的EP-CAM阳性免疫着色细胞保留在上清中。如图5和6所示，在上述OptiPrepTM分离的细胞起始原料中和Percoll上清中该EP-CAM阳性细胞群落数量相当，而Percoll团粒中的这些阳性细胞减少了2-5倍。
在OptiPrepTM分离和Percoll密度梯度离心后通过如下步骤对这些细胞制品进行生物学测试以检测是否存在干/祖细胞：将20,000个细胞/井涂布在STO饲养层上，在激素已知的培养基中培养，2周后计算克隆形成的数目。为了证实我们的观点，即EP-CAM免疫反应与干/祖细胞的存在相对应，我们认为如果增加EP-CAM细胞群落，那么我们就会增加群落中克隆形成的数目。为了实现这个目标，我们通过免疫选择来富集这些细胞并将它们用于我们的测试中。如图7和8所示，我们富集了40倍的EP-CAM阳性细胞(0.59％的起始群落是EP-CAM群落，但在免疫选择后，24.7％的起始群落是该标记阳性)。
表2显示了我们在富集EP-CAM阳性细胞时所真正富集的克隆形成。另外，OptiPrepTM分离的细胞和Percoll上清都含有克隆形成细胞，而Percoll团粒不含这种细胞。
表2
组分         总克    平均克    井1    井2    井3    井4    井5    井6
             隆数    隆/井
OptiPrepTM   9       1.5       1      0      2      2      2      2
组分
EP-CAM+      43      7.2       7      7      11     12     5      1
富集
Percoll团    1       0.2       0      0      1      0      0      0
粒
Percoll上    20      0.3       3      1      2      2      7      5
清
为了确保这些克隆是来源于单个细胞，对EP-CAM阳性富集的细胞进行有限稀释，用显示实质细胞的人清蛋白的抗体和与胆管细胞反应的CK19的抗体对平均含1个细胞的这些井进行免疫着色。如图9和10所示，在单个克隆中这两种细胞型都存在，这证实了该细胞具有产生该克隆的双潜能，这种双潜能操作性地定义为干/祖细胞。
这些数据清楚地表明本发明新的OptiPrepTM分离方法能将活细胞与死细胞分开，同时将活的肝干/祖细胞保留在该活的组分中。相反，在本领域的常规方法中，通过Percoll密度梯度离心除去了团粒中的这些细胞。虽然在使用上述Percoll密度梯度的条件下可以作一些改进，包括缩短离心时间(分钟)和降低g力(50、70、88×g)，但是很显然该常规方法的目标是富集较大的、成熟的活肝细胞。由于是将Percoll团粒用于接下来的所有试验(上清遭丢弃)，因此本领域一直使用的是去除了这种能增生的干/祖细胞的细胞制剂。我们发现的新方法将必然地大大改变试验进行的方式、数据产生的方式，从而推进该领域的研究。特别是在细胞移植领域，为了使肝功能最高可能性地重建，使移植的细胞具有最高的增生能力十分重要。
免疫富集(免疫选择)仅是富集本发明的肝干/祖细胞群落的一种方法。特定地使用单克隆抗体来鉴定与特定细胞系和/或分化阶段有关的标记(表面膜蛋白，如受体)。分离目标干/祖细胞的方法可以包括利用磁珠包被的抗体的磁分离法、亲和层析和利用与固体基质，如平板结合的抗体的“洗脱法”及其它常规技术。提供精确分离的技术包括荧光活性细胞分选***，该***可以包括各种不同的组分，如多个有色通道，小角度和钝角的光散射检测通道，阻抗通道等。
还可以从本发明的活人肝细胞中除去不需要的细胞群落。除了肝细胞和其直接的祖细胞外，肝还还有许多其它的细胞型，包括胆管细胞、内皮细胞，组织巨噬细胞(Kupffer细胞)，星状细胞和淋巴细胞。用灌注的肝制备的细胞悬液还可能含有一些来自循环***的残留血液细胞。在本发明的活人肝细胞制品中，大部分细胞表达细胞内清蛋白，因此是产生肝实质细胞的肝实质细胞或干/祖细胞。在该制剂的不表达细胞内清蛋白的剩余细胞中，大部分对表面标记CD45着色，CD45又称白细胞共同抗原(Leukocyte Common Antigen)，已知在大部分或所有的淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞和粒细胞系上呈递。成人肝中可能表达CD45的重要细胞包括T淋巴细胞、Kupffer细胞(其构成80％的体组织巨噬细胞)和可能的一些粒细胞。
用本领域公知的免疫耗竭法可以将CD45阳性细胞从本发明的活人肝细胞中除去。例如，可以将CD45特异性单克隆抗体与磁性微球结合，然后将该微球与活的人肝细胞接触。该CD45阳性细胞与该微球结合并通过应用磁场而除去。适于除去CD45阳性细胞的一***可以从Miltenyi Biotec(Miltenyi Biotec GmbH，Fredrich-Ebert-Straβe 68，D-51429Bergisch Gladbach，Germany)买到。在该Miltenyi***中，CD45微珠用于与磁性柱(在装置，如AutoMACS或CliniMACS中)结合并除去CD45阳性细胞。使用这种或等同***，在一轮去除操作中至少能除去约90-95％的CD45阳性细胞。该CD45去除的细胞群还基本上保留有该肝制品的所有细胞，这些细胞能在适于上皮细胞，包括肝细胞的条件下在培养基中附着和生长。许多这种细胞能附着在装有无血清培养基的胶原蛋白涂布的培养皿中，并且一些展示出肝细胞形态。与之相对应，用免疫耗竭的方法从本发明的或肝细胞中除去的所述磁分选的CD45细胞群很少有细胞能附着并展示出肝实质细胞的形态。
可以用本领域公知的方法迅速地挑选其它单克隆抗体以特异性地除去特定的不需要的细胞群。例如，用细胞表面标记CD3的抗体可以除去T淋巴细胞。相似地，用细胞表面标记CD14可以除去巨噬细胞/单核细胞系，如Kupffer细胞。
通常地，可以将抗体制成结合的形式以利于细胞分离。用于结合的材料包括但不限于：磁珠，其可以进行直接分离；生物素，其能通过与结合在支持物上的亲和素或抗生素蛋白(streptavidin)结合来进进行间接分离；荧光染料，其能用于荧光活性细胞分选***。任何对所述细胞的生存没有过度危害的方法都可以使用。
本发明的细胞可以用任何冷冻保藏的方法保藏。通常地，用HypothermosolTM的水溶液(Biolife Solutions，NY)将分离的细胞(如上所述)稀释到理想浓度，并可控地冷冻到理想的保藏温度。可以将本发明的冰冻细胞保藏在液态氮中。
本发明的细胞的功能
一旦本发明的肝细胞群，包括肝干/祖细胞得到分离和冷冻保藏，通过流式细胞计数技术用细胞特异性单克隆抗体或多克隆抗体和与荧光染料结合的二级抗体对其进行测定以定量检测存在的细胞型。另外，用一系列的体内和体外终点事件来检测冰冻细胞的功能。
例如，将本发明的肝干/祖细胞在冰上与100uL人EP-CAM抗原的与荧光素异硫氰酸酯(FITC)(Serotec Inc，UK)结合的鼠单克隆IgG多态抗体反应，对照细胞单独与鼠IgG-FITC反应。用EPICS C流式细胞仪(Coulter Electronics，HIALEAH，Fla)分析样品，波长488nm，并校正荧光获得值以排除98％的对照细胞。利用前散射光(FLS)与侧散射光(SS)两组参数柱状图在不同细胞群周围建立窗口，测定阳性荧光事件的百分率。
体外终点时间包括：7-乙氧香豆素代谢，其表示微粒体细胞色素P-450依赖型I阶段氧化和紧接的II阶段结合反应；脲生成，其表示细胞将氨转化为脲的能力(在干衰竭过程中丧失的一个重要参数)和增生潜能。
在体内，我们检测细胞延长时间生存的能力，建立和维持成熟肝细胞表型的能力，嫁接到肝实质组织中的能力。
在下面的研究中使用NOD-SCID鼠，其患有严重的混合性免疫缺乏症，不能排斥移植的人细胞。在一研究中，将细胞解冻并在体外与其结合的微载体一起培养，然后将该微载体注射到鼠的腹膜腔中。一星期后，从腹膜腔收集聚集的微载体细胞，切片并着色以进行光学显微观察。还使用电子显微镜。
图11显示了在NOD-SCID鼠中微载体珠上的人肝细胞的显微照片，其中一个清楚地显示肝细胞附着在微载体上。可以看到它们的圆形核及大量的透明细胞质。右箭头显示了双核细胞，最右边的是宿主基质细胞，可能是纤维原细胞，来自受体鼠的腹膜衬里。
图12显示了在低功率下拍得的显微照片，从中可以看到大的已被宿主脉管化的肝细胞所形成的岛，如红血细胞所证实的那样。特别值得注意的是细胞出现明显的组织化形成髓或肝细胞排列。在肝组织的横切面上可以容易地观察到结构性组织化。
图13证明了本发明的肝干/祖细胞确实能熟化为肝细胞并表现成熟的表型，显示了它们的细胞质对肝糖阳性着色。另外，要注意的是细胞出现了明显的组织化形成髓。
在电子显微水平，图14显示了三种与这种微载体结合的肝细胞。黑框画于两种相邻细胞的交界处。区域放大图显示结构、微绒毛、胆小管和另一种成熟细胞标记。
图15和16显示了两个显微照片，证实了本发明的人肝细胞在NOD-SCID鼠肝中的嫁接。在该研究中，将1,000,000个冷冻的细胞注入到该鼠的脾中。在移植后的不同时间点，对动物实施安乐死，用针对人着丝点的DNA探针原位杂交和PCR分析来测定人细胞的存在。在移植后两小时(图15)，通过原位杂交在门静脉和窦状腺中可清楚地看见人细胞，但是它们仍然没有通过脉管间隙进入到肝实质组织中。
在移植后40天(图16)，人肝细胞不仅驻留在肝中，还嫁接到肝细胞板中并完全整合到肝实质组织中。
肝细胞移植
适于用本发明的细胞和方法治疗的目标人群是由于不同原因而患有硬化和晚期肝病(ESLD)的不同患者。不进行肝移植的患者的剩余寿命大于六个月但小于两年，因此，大多数患者考虑等候同位肝移植(如移植完整的捐赠器官)。这些患者已发生了一种或多种其疾病的并发症，如腹水、出血、紊乱(肝脑病)、感染和其它问题。为了防止其对移植的肝细胞发生与移植完整肝一样的排斥，预期对所有的目标患者进行免疫移植处理。本治疗的目标是延迟或消除全肝移植的需要，以减少肝病并发症的住院治疗并改善病人的生活质量。
为了除去毒素、新陈代谢药物和合成蛋白，基础的和随后的测试包括常规的实验室和临床肝功能测试及特定的肝功能损伤的定量生化测试。因为希望移植的肝细胞在肝和脾中都能生长，所以周期性地对脾进行肝细胞特异性检查以监测移植的肝细胞的嫁接和增生情况。移植的细胞释放赠体细胞特异性的可溶性抗原，这些可溶性抗原能在血液中检测到，监测这些抗原以进一步测定移植细胞的存活和功能。
在入院进行细胞移植前两个星期，由调查者看护临床患者。该调查者获得明确的同意并开始进行基本检测，包括ABO血型检测。在固定肝或肝细胞移植中，患者的血型与捐赠者的血液细胞必须相容。在入院前两天，开始进行免疫抑制，将冷冻细胞运到医院，保持冷冻状态直到移植前。
在细胞移植前夜，患者入院。在第二天早晨，将患者转到介入性放射间，进行清醒镇定。将导管放入到患者的股动脉(在腹股沟处)处，并深入到脾动脉中。解冻捐赠的肝细胞，稀释并运输，优选通过注射器注入到该脾动脉导管中。根据剂量，给药的时间从约5到30分钟。移开该导管，将患者移回到他的/她的护理房间。在该过程后8小时，该患者出院。
可以将本发明的肝细胞和肝干/祖细胞移植用来实现肝功能的恢复。将一定量活的功能性肝细胞，包括肝实质细胞和/或肝干/祖细胞(包含在移植介质，如生理盐水中)注入到合适的解剖学位点，在该位点该肝细胞，包括肝实质细胞和/或肝干/祖细胞能植入到靶位点，如肝实质组织和/或脾中并表现出不同的肝功能，包括肝细胞功能。根据移植的肝细胞，包括肝实质细胞和/或肝干/祖细胞的数量，肝功能缺陷通过利用细胞移植恢复肝功能而能得到不同程度的校正。然而，在治疗由于遗传缺陷导致单个酶或其它蛋白产品的功能降低或缺乏所产生的肝疾病方面，肝实质细胞和/或肝干/祖细胞的细胞移植最为有利。这种疾病的例子包括：高血脂和α-抗胰蛋白酶缺乏症。可以用本发明治疗的其它肝疾病包括肝炎、肝硬化、先天的代谢错误、急性肝衰竭、急性肝感染、急性化学毒性、慢性肝衰竭、cholangiocitis、胆管硬化、Alagille综合症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、自免疫性肝炎、胆管闭锁、肝癌、肝被膜疾病、脂肪肝、半乳糖血症、胆石、吉尔伯特氏症候群(Gilbert′sSyndrome)、血色沉着病、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、poryphyria、原发性硬化性胆管炎、雷伊氏综合症(Reye′s Syndrome)、肉状瘤病、酪氨酸血症、I型糖原过多症、威尔森氏症(Wilson′s disease)。
为了实施移植步骤，选择一个注射位点来将肝细胞移植到肝实质组织中。在实施该步骤的一技术中，该注射位点是患者的脾。在计算好脾的位置坐标后，放置注射器以将含有肝细胞，包括肝实质细胞和/或肝干/祖细胞的移植介质注射到脾中。然后该移植的细胞通过脾静脉转移到肝实质组织中(见Gupta等，Seminars in Liver Disease 12，321(1992)]。在另一技术中，在注入放射不透过性造影剂后用如CAT扫描腹部，对门静脉的支线照相。然后利用向肝的单个突起提供养料的门静脉支线的位置坐标来将移植介质注入到门静脉支线中，于是将肝细胞灌输到了特定的肝突起。这种选择性灌输可以使门静脉血液不断地流过其它的肝。
可选择地，本发明的肝细胞，包括肝实质细胞、胆管细胞和/或肝干/祖细胞可以通过脾静脉或门静脉或肝包膜的下面直接注射或灌输到肝髓中。
将本发明的细胞给药到个体，特别是人个体的合适方法在此处将作详细的说明。这些方法包括将细胞注射或植入到个体的靶位点或将细胞***到有利于将细胞注射或植入到个体中的运输装置中。这种运输装置包括管子，如导管，用于将本发明的细胞和液体注射到受体中。在优选具体实施方案中，该管子还额外地含有针，如注射器，通过其可以将本发明的细胞导入到个体的目的位点。本发明的这些肝细胞，包括肝干/祖细胞可以以不同形式附着在这种运输***，如注射器中，例如，当细胞装在该运输***中时，可以将这些细胞悬浮在溶液中或植入到支持基质中。如本发明所述，术语“溶液”包括药物学上可接受的载体或稀释剂，在其中本发明的细胞能存活。药学上可接受的载体和稀释剂包括生理盐水、水缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。这些载体和稀释剂的使用是本领域公知的。该溶液优选具有一定程度的惰性和流动性而使其能容易地以注射液的形式存在。优选地，该溶液在制备和贮藏条件下保持稳定，并在通过苯甲酸酯类(parabens)、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(Thimerosal)等使用时保留有对微生物，如细菌、真菌的抗污染作用。可以将本发明所述的活的功能性肝细胞与药学上可接受的载体或稀释剂及在需要时与上述列举的其它成分混合，然后在无菌条件下进行过滤来制备本发明的溶液。
能结合或植入上述活的功能性细胞的支持基质包括受体相容的且其降解产品对该受体无害的基质。这种基质的例子如天然的和/或合成的生物可降解基质。天然的生物可降解基质包括血液凝块，如来源于哺乳动物的血液凝块和胶原质基质。合成的生物可降解基质包括合成的聚合物，如聚酐、聚原磷酯和聚乳酸。合成的聚合物和用于将细胞结合或植入到这些基质中的方法的其它例子是本领域公知的，参见如美国专利No.4,298,002和No.5,308,701。这些基质为体内的肝细胞提供支持和保护，因此其是将该肝细胞导入到受体中的优选形式。
本发明的基因疗法
由于靶基因经常不能进行持续的基因表达，因此基因疗法的临床试验一般都令医生和病人失望。由于具有广泛的扩增潜能，因此肝细胞群落，如本发明的包括干/祖细胞的肝细胞群落，代表了有希望在其中获得并维持有效基因表达的细胞群。在一具体实施方案中，本发明的基因治疗通过如下方式来实现：将外源基因***到该细胞中，并将这些细胞移植到患者中。通常的靶失调是因为患者的肝不能正确产生重要蛋白，如在血胆脂醇过多症中缺乏LDL受体，在血友病中缺乏凝血因子。
在上述尝试中，为了将外源基因稳定整合到真核宿主的不同器官的细胞中，最大的困难是大多数这些细胞不能在体外扩增，特别是在将外源基因***到肝细胞中时，因为成熟的肝细胞在体外并不能发生完全的细胞***，或者最好的情况仅1-2次***。最近，利用肝细胞进行了基因转化研究，该肝细胞从Watanabe遗传性高脂血症兔，一种广泛地用来研究人家族性血胆脂醇过多症的动物模型中分离得到。如它们在人中的副本相似，该Watanabe兔细胞遗传缺乏低密度脂蛋白(LDL)受体，在循环***中导致产生高水平的胆固醇，从而增加了早期冠心病的发生率(Wilson等，1990，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 87：8437)。用携带有功能性LDL受体基因的重组病毒感染兔肝细胞，在移植后，遗传缺陷兔表现出高血脂的短时间改善。如果目的基因能更稳定地整合到稳定***的受体细胞群中，相信这种疗法的成功率会进一步提高。因为本发明的肝干/祖细胞能在体外扩增，特别是能在共培养了实质细胞与胚基质细胞的本发明所述***中长时间扩增，因此这些细胞是在培养基中导入外源基因的理想受体候选。
肝细胞的遗传性基因缺陷导致各种先天性代谢错误，这些疾病可以通过移植携带有正确基因的功能性拷贝的本发明的肝细胞来治疗。简要地，该方法包括从具有特定缺陷的患者中分离本发明的肝细胞，包括肝干/祖细胞，通过常规的基因转化技术将功能性基因转化到这些细胞中以纠正该基因缺陷，确认目的基因产品的稳定整合和表达，和将该细胞移植到同一或其它患者肝中进行重建。该方法特别适于疾病是由单个基因缺陷所导致，且该缺陷基因已经得到鉴定和分子克隆的情形，但是，并不仅限于这些情形。除了能在自体同源个体中进行基因治疗外，本发明的携带有功能基因的肝干/祖细胞还可以移植到异源的HLA匹配个体中。适于这种形式的基因治疗的靶基因及其相关肝疾病的例子包括但不限于：家族性血胆脂醇过多症中的LDL受体基因，血友病中的凝血因子VIII和IX的基因，肺气肿中的α1-抗胰岛素基因，苯丙酮尿症中的苯丙氨酸羟化酶基因，高血氨症中的鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因和不同形式的互补性缺陷中的互补蛋白基因。
肝是产生许多分泌蛋白的中心，其将各种蛋白有效释放到血液中，从而通过这种方式在解剖学上与循环***相联系。因此，可以将编码具有***效果蛋白的基因***到本发明的肝细胞中，而不是***到正常表达该蛋白的特定细胞型中，特别是在将基因整合到这些细胞中是很困难的情况下。例如，可以将各种激素基因或特定的抗原基因***到本发明的肝细胞中从而使它们的基因产物分泌的到循环***中。
为了实施本发明，将用如上所述的方法分离得到的本发明的肝细胞用作基因转化试验的受体。在导入外源基因之前、过程中或之后在培养基中培养该细胞。通过加入细胞因子使这些细胞的体外分化最小化，加入的方式如同在造血干细胞培养基中使用白血病抑制因子一样。
为了将外源基因导入到本发明的培养细胞中，可以用常规技术，包括但不限于微注射、转染和转导来转化任何克隆基因。另外，如果该肝细胞表达去唾液酸糖蛋白受体，那么就可以将含有目标基因的质粒与去唾液酸糖蛋白结合并加入到细胞中以诱导吸收和表达(Wu等，1991，Journal of Biological Chemistry 266：14338)。这种方法对于受体细胞来说更温和。
基因转化的优选方法是使用重组病毒，如逆转录病毒和腺病毒。例如当使用腺病毒表达载体时，可以将克隆序列与腺病毒转录/翻译控制复合体，如后期启动子和三连体引导序列连接。然后通过体外或体内重组将这种嵌合基因***到腺病毒基因组中。在该病毒基因组的非必需区域(如E1或E3区)进行***会产生活的且能在感染肝的储备细胞中表达基因产物的重组病毒(例如，见Logan&Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3655-3659)。可选择地，可以使用牛痘病毒7.5K启动子(如见Mackett等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：7415-7419；Mackett等，1984，J.Virol.49：857-864；Panicali等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：4927-4931)。基于牛***状瘤病毒的载体是特别有利的，其作为染色体外元件具有复制的能力(Sarver等，1981，Mol.Cell.BIOL.1：486)。在这种DNA进入细胞后不久，在每个细胞中该质粒复制约100到200个拷贝。所述***cDNA的转录不需要该质粒整合到宿主的染色体上，因此高水平表达。在质粒中包括一选择性标记，如neo基因，可以稳定表达这些载体。可选择地，可以修饰逆转录病毒基因组以用作可导入或指导任何目标基因在本发明的肝干/组细胞中表达的载体(Cone&Mulligan，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6349-6353)。使用可诱导型启动子还可以实现高水平表达，这些启动子包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)ILA启动子和热休克启动子。
为了长期高产地生产重组蛋白，稳定表达是优选的。与使用含有病毒复制起点的表达载体相比，最好使用在合适表达调控元件(如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸位点等)调控下的cDNA和选择性标记转化本发明活的功能性肝细胞，包括肝干/祖细胞。重组质粒中的该选择性标记对该选择具有抗性，允许细胞将该质粒稳定整合到其染色体中，并生长形成集落，接着该集落能克隆和扩增形成细胞系。例如，在导入外源DNA后，将构建的肝细胞在富集培养基中培养1-2天，然后转到选择性培养基中。可以使用许多选择***，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell 11：223)，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，1980，Cell 22：817)的基因。另外，可以用抗代谢物抗性来选择dhfr，对氨甲蝶呤具有抗性(Wigler等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567；O′Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；gpt，对霉酚酸具有抗性(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo，对氨基糖苷G-418具有抗性(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.150：1)和hygro，对潮霉素具有抗性(Santene等，1984，Gene 30：147)的基因的基础。最近，公开了其它的可选择性基因，名为TRPB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；HISD，其允许细胞利用组氨醇(Histinol)代替组氨酸(Hartman&Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8047)和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其对鸟氨酸脱羧酶抑制剂、2-二氟甲基-DL-鸟氨酸、DFMO具有抗性(McConlogue L.，1987，Current Communications inMolecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory编)。
如上所述，可以将整合了特定基因的本发明的肝细胞移植到细胞最初来源的患者中或整合到HLA匹配的个体中，该整合可以用Northern印迹和ELISA等技术测定该基因的表达来证实。对于HLA匹配的异源移植，肝储备细胞在移植前可以不需要基因转化。例如，通过移植可以将从拥有凝血因子VIII功能性编码基因的捐赠者中获得的肝细胞直接用于HLA匹配的血友病患者中。该移植的细胞将可能会增殖并产生成熟PC以执行正常的肝功能，包括产生凝血因子VIII。
除了使用本发明的肝细胞来纠正肝基因缺陷外，这些细胞还可以用来补充肝硬化中的肝实质组织，如上文所述，或将它们设计来对抗肝特异性传染病。例如，可以从早期肝炎患者中获得未经感染的肝干/祖细胞并用作反义RNA编码基因的受体，该反义RNA与关键的肝炎病毒复制相关基因元件互补。然后可以将这些细胞移植到患者中来控制病毒的扩散并恢复正常的肝功能。
基因组和研究性应用
本发明的肝细胞技术可以用作鉴定新药的工具和药物研究与试验工艺中的工具，该肝干/祖细胞可以制备来生长和分化成成熟肝细胞。检测该肝细胞系不同阶段的基因的表达方式，提供了发现药物的基因组信息。例如，可以将该信息用于鉴定发现药物计划的新靶，以鉴定具有可应用于治疗的生物学功能的蛋白。
作为药物试验和研究工艺的工具，可以用上述肝细胞和其后代来检测由需研究药物导致的基因表达方式的改变。将潜在药物导致的基因表达方式的改变与对肝有影响的已知药物导致的改变相比较，这就使制药公司能在研究工艺的早期阶段对化合物对肝所产生的影响进行监测，节省时间和金钱。肝细胞的所有细胞系，从祖细胞到成熟细胞还可以用来测试药物对肝的毒性和研究该药物怎样代谢。如今，制药公司很难获得稳定供给的肝细胞来进行毒性测试。本发明的方法满足了这一需要。
肝辅助装置
本发明的肝干/组细胞技术可以用于制备肝辅助装置(“LAD”)，LAD是设计来短时间(7到30天)维持肝功能以使患者自己的肝具有足够的时间从衰竭中恢复或提供移植的桥梁，从而治疗患有急性肝衰竭的患者。
在临床有用的LAD中，有人尝试将猪肝细胞或来自于人肿瘤的弱分化肝细胞广泛用于各种生物反应器类型。已经表明这些装置是有作用的，但是它们都使用有局限的细胞，这些局限用本发明的细胞都可以克服。猪肝细胞虽然容易获得，但是具有几个缺陷，如对分泌的猪蛋白产生免疫反应，这些缺陷对寿命和非人病毒产生限制。虽然该肝细胞容易培养，但是它们只保留有正常肝细胞的部分功能且还有安全性问题。由于缺乏捐赠肝，因此不再选择使用来源于捐赠者器官的功能性人肝细胞。使用本发明人肝祖细胞的LAD克服了目前的这些问题。因为这些细胞分泌的蛋白是人源的，因此免疫反应会最小化。在培养基中该祖细胞广泛地***，于是来源于捐赠肝的细胞可以产生许多LAD。更重要的是，这些肝细胞表现出临床应用所需的各种肝功能。
适于本发明的细胞的LAD的例子在国际专利PCT/US00/15524中有描述。
本发明的疫苗制备
本发明的肝细胞还可以用来制备疫苗。例如，可以用复制缺陷病毒(如慢病毒(lentivirus)，参见Naldini等.Science 272：263-267，1996)来感染人肝细胞，其中该病毒已经作了进一步修饰而含有一个或多个特定蛋白抗原的编码基因。根据需要的免疫反应的类型来选择该特定蛋白抗原。基本上，本发明的肝细胞是用重组病毒感染，然后该感染细胞表达蛋白抗原从而引起对抗该抗原的免疫反应。可以指导该免疫反应来对抗传染病，如C型肝炎，然后暴露于该传染病的个体得到保护而对抗该传染病。使用编码C型肝炎非结构性蛋白的塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)来诱导产生细胞性免疫反应的描述可参考Blister等(见J.Gen.Virol.83(Pt.2)：369-381，2002)。
实施例
工艺概述
所述肝的所有工艺都在放置于Class 10,000房间中的Class 100排风罩中进行，接着进行消毒并进行优良的制造工艺。所有与该肝接触的组分都是以无菌形式买得或组合后经过气体灭菌或高压灭菌。
初期工艺
将肝浸在VIASPANTM(见http://www.viaspan.com/viaspan/pdf)中，三个一组地放置在冷却器中的冰水上。在生物学安全室(BSC)中称量该肝并记录其毛重。吸取VIASPANTM样品进行无菌测试(VIASPANTM用作器官冲洗和保存的低体温溶液)。将该肝移到无菌箱并浸泡在抗生素洗液(0.1mg/mL庆大霉素和5mg/mL Cefazolin)中。在该过程中从顶部到底部翻转该肝，确保其两边都得到浸泡。
拿出上述肝，在一箱中用2L无菌生理盐水漂洗两次，然后将该肝转到另一无菌箱中。用两个无菌的、方便使用的塑料脐带夹夹住腔静脉，将已灭菌的由不同大小的塑料渐缩管/连接器组成的导管***到门静脉和/或肝动脉中。制备小的组织切片(从肝叶的边缘)用于组织学观察。将该肝转移到灌输罐中，用温的(≤37℃)鳌合缓冲液灌输15分钟，其速率使该肝最大化膨胀(一般120-240mL/min)。在灌输最后，通过位于该灌输罐底部的排出口将该缓冲液排出。
灌输和消化
然后在28℃-37℃下用含有LIBERASETMCI(一种含有胶原酶和弹性蛋白酶的酶制剂)的灌输液消化肝30分钟，在消化的最后，将含有LIBERASETM的该缓冲液排出，然后用冷的含有血清的收集缓冲液灌输该肝来阻断所述酶的消化。在最后的灌输之后，将缓冲液排出到废水容器中，向上述罐中补充新的含有血清的收集缓冲液。用不锈钢外科手术刀将该肝被膜切开，对该组织进行按摩(超过20分钟)以使细胞分离。当该消化组织中的所有细胞都分离到上述缓冲液中时，使得到的细胞缓冲液通过预过滤器，1000、500、250和150um的一系列消毒过的不锈钢筛，然后收集到4升的血液包中置于冰上冷却。对该粗细胞悬液取样进行存活率、浓度、总细胞数、每克组织的产量和无菌性的工艺测试。
下游工艺
将上述粗细胞悬液无菌地转移到合适数量的600mL血液包中，800×g离心。将等体积的细胞浓缩液与OPTIPREPTM溶液(25％碘克沙醇)混合，然后用COBE2991 cell washer离心以而使该浓缩的细胞悬液富含活细胞。2000rmp离心15分钟后，目标细胞群转移到上部并形成带。无菌条件下收集该带并分配到合适数量的600mL血液包中，体积优选不超过200mL/包。用RPMI 1640将该包中的体积稀释到500mL。800×g离心该包10分钟并除去上清。称量得到的团粒，加入足量的RPMI 1640使最后体积为500mL，800×g离心10分钟。除去上清后，称量冲洗过的团粒，取样进行细胞级数和存活率测试，在HTS中重悬浮使其浓度为6×107个细胞/mL。如果由于细胞的数量很大而具有多个COBE转子，就汇集从各个转子中收集的带。
注入和保存
将上述细胞人工注入(以1.5mL的注入体积)到贴有标签的、33mL氟塑料冷藏包中，然后与等体积的冷冻缓冲液(HTS∶DMSO∶人血清为60∶20∶20)混合使其最终浓度为3×107个细胞/mL，10％DMSO和10％人血清。用低温可设计冷冻装置冷冻该包并在液氮中保存该冷冻的细胞。在冷冻后至少24小时，从冷冻装置中取出样品并放置到指定的测试仪器中进行释放测试。
工艺流程
下文描述了所用制备工艺的流程。
临床位点的管理
用温度维持在-120℃或以下的合格液态氮运载器将临床供体运输到临床位点，将包含有上述细胞悬液的冷藏包留在运载器中直到患者准备就绪。在使用之前，将所述产品从该运载器中移出并在37℃下迅速解冻，并放在冰上。然后除去外包装，利用标准的无菌医疗方法用冷的
Figure C0382117400491
将细胞悬液稀释10倍，然后向患者给药。这个程序避免了在灌输之前清洗细胞的需要并使染菌的危险最小化。本发明的给予患者的一个具体实施方案中，包含3×106个细胞/mL，含包含DMSO(1％)、人血清AB(1％)、(4％-8％)和不含酚红的RPMI(0％-4％)，这些物质都溶解在
Figure C0382117400493
中。
猪肝细胞的分离
对猪的肝样品进行如上所述的细胞悬液过滤和收集步骤。
测试样品的存活率、密度和产量。在进行计算之后，移出10,000,000个细胞。如果密度低于25,000,000个细胞/mL，那么就用Sorval RC3B离心机、Sorval centritech或COBE 2991细胞处理器对细胞进行浓缩。将团粒重悬浮在250mL不含酚红的RPMI 1640培养基中。将该细胞悬液转移到600mL血液包中，加入用RPMI 1640w/o酚红稀释的25％的碘克沙醇(Opti-prepTM，见http://www.nycomed-diagnostics.com/gradmed/optiprep/optil.html)，完全混合这两种溶液并低温保存。
用单一处理组合(set)设置上述COBE 2991细胞处理器，用该组合的红色管道使该细胞悬液自流。一旦环形室充满，就以2000rpm开始离心15分钟。在离心开始时，用蠕动泵以20mL/min的速度在所述梯度的顶部加入100mL的RPMI 1640培养基层作为缓冲液来混合带。15分钟后，将该顶部缓冲液以100mL/min的速度轻倒入到沸水包中，并将顶部细胞带收集到收集包中。如果需要也收集团粒用于进一步的分析。将该顶部细胞带放置在冰上，取样用于检测存活率和产量。重复该过程直到所有的未分离的猪肝细胞都得到处理。一旦收集了所有的带并将其汇集到一起，然后就用收集缓冲液稀释来清洗该混合的收集细胞带，并用SorvalRC3B 3000rpm离心10分钟。将得到的团粒重悬浮在冷冻保存缓冲液中，密度为3×107/mL。如果需要，等份置于包和/或瓶中。最终得到的猪细胞制剂贮存于液态环境下的速率可控的冷冻装置中。
本发明的实施例仅用来阐述本发明的单个方面，并不对限定本发明的范围。事实上，根据前述说明和附图，除了本说明书的公开和描述外，对本发明所进行的不同改进对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。这些改进均在本发明的保护范围之内。
药物产品制备流程图
Figure C0382117400511
Figure C0382117400521
药物产品制备流程图(继续)
Figure C0382117400531
Figure C0382117400541

Claims (54)

1、获得富集有活的人肝细胞，包括肝干/祖细胞的细胞群落的方法，该方法包括：
(a)用含有蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶或上述酶混合物的蛋白水解酶制剂离解整个人肝或其切片，得到细胞悬液；
(b)用碘克沙醇溶液对部分细胞悬液进行混合；
(c)离心得到的混合物，其中离心时在密度屏障的作用下产生至少两条分离的细胞带，该至少两条带中至少有一条带的密度低于另一条带的密度；和
(d)收集该至少一条较低密度带以获得富集有活的人肝细胞，包括肝干/祖细胞的细胞群落。
2、如权利要求1所述的方法，其中所述的碘克沙醇溶液在水中含有25％(w/v)的碘克沙醇。
3、如权利要求1所述的方法，其中所述的碘克沙醇溶液不含酚红。
4、如权利要求1所述的方法，其中在离心步骤前，用设定量的不含酚红的介质对得到的肝细胞混合物和碘克沙醇溶液进行覆盖。
5、如权利要求1所述的方法，其中所述的富集有活的人肝细胞的细胞群落还含有功能性肝实质细胞。
6、如权利要求1所述的方法，其中所述的富集有活的人肝细胞的细胞群落还含有功能性胆管细胞。
7、如权利要求1所述的方法，其中所述的富集有活的人肝细胞的细胞群落还含有功能性造血细胞。
8、如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括：
用鳌合缓冲液灌输整个人肝或其切片；和/或
温度为4-15℃的收集缓冲液。
9、如权利要求1所述的方法，其中所述的离解包括机械离解。
10、如权利要求9所述的方法，其中所述的机械离解包括通过切、筛、梳或摩擦肝而进行的离解。
11、如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括：
过滤细胞悬液以除去碎片和细胞凝聚体；
将得到的过滤过的细胞悬液收集到第一包中；
测定过滤过的细胞悬液中的细胞浓度；和/或
校正细胞的浓度以提供起始细胞悬液。
12、如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括：
(e)收集至少一条较低密度的带到置于冰上的容器中；
(f)任选地测定细胞的存活率和浓度；
(g)通过离心和在冷冻缓冲液中重悬浮来清洗该细胞以得到最终细胞悬液；
(h)将该最终细胞悬液进行可控速率的冷冻，得到冰冻的细胞悬液；和/或
(i)将该冰冻的细胞悬液贮藏在液氮冷冻装置中。
13、如权利要求8所述的方法，其中所述的收集缓冲液含有RPMI1640培养基，该培养基含10％人或牛血清。
14、如权利要求11所述的方法，其中所述的过滤步骤包括使所述的细胞缓冲液通过过滤芯。
15、如权利要求1所述的方法，其中的悬液中包括不含酚红的RPMI1640培养基。
16、如权利要求1所述的方法，其中的离心以约500×g进行约15分钟。
17、如权利要求12所述的方法，其中所述的容器包括收集袋。
18、如权利要求12所述的方法，其中所述的冷冻缓冲液包括含有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、H2PO4 -、HCO3 -、HEPES、乳糖酸盐、蔗糖、甘露糖、葡萄糖、右旋糖酐-40、腺苷、谷胱苷肽或其组合的混合物。
19、如权利要求18所述的方法，其中所述的冷冻缓冲液还包括血清和二甲亚砜。
20、如权利要求19所述的方法，其中的肝细胞悬液、血清和二甲亚砜存在的体积比例约为80∶10∶10。
21、如权利要求19所述的方法，其中所述的血清包括人血清、牛血清或其组合。
22、如权利要求1所述的方法，其中的肝细胞悬液和碘克沙醇或碘海醇的水溶液混合。
23、如权利要求22所述的方法，其中所述的碘克沙醇水溶液含有无菌的60％(w/v)的溶于水的碘克沙醇。
24、如权利要求1所述的方法，其中所述的富集的细胞群包括直径为9-13微米并阳性表达EP-CAM、CD13或两者的肝祖/干细胞。
25、获得富集有活的人肝细胞的群落的方法，该细胞群落包括功能性肝实质细胞和肝干/祖细胞，该方法包括：
(a)从新生儿、幼年、少年、成年或死人捐赠者中得到整个人肝或其切片；
(b)用鳌合缓冲液灌输该整个人肝或其切片；
(c)用含有胶原酶、弹性蛋白酶、蛋白酶或上述酶混合物的酶制剂消化该整个人肝或其切片，得到细胞悬液；
(d)可选择的，机械离散整个肝或其切片，得到细胞悬液；
(e)可选择的，除去碎片和细胞凝聚体；
(f)将细胞悬液与等体积的碘克沙醇溶液混合；
(g)将得到的混合物与铺于其上的预定体积的培养基进行离心，在密度屏障的作用下分离得到至少两条细胞带，该至少两条带中至少有一条带的密度低于另一条带的密度；以及
(h)收集至少一条密度较低的带。
26、如权利要求25所述的方法，其中所述的富集的细胞群富集有直径为9-13微米并阳性表达EP-CAM、CD13或两者的肝祖/干细胞。
27、一种通过权利要求1-26中任一权利要求所述的方法获得的组合物，该组合物含有富集有活的功能性人肝细胞，包括肝干/祖细胞的细胞群。
28、如权利要求27所述的组合物，该组合物还包括肝实质细胞、胆管细胞、造血细胞或其组合。
29、如权利要求27所述的组合物，其中所述的肝细胞包括阳性表达EP-CAM、CD13或两者的细胞。
30、如权利要求27所述的组合物，其中所述的肝细胞包括直径约为9-13微米的干/祖细胞。
31、一种通过权利要求1-26中任一权利要求所述的方法获得的组合物，该组合物含有肝细胞群落，相对于从肝中获得的粗细胞悬浮物，该肝细胞群落富集有活的功能性人肝实质细胞和肝干/祖细胞。
32、如权利要求31所述的组合物，其中所述的肝细胞群落还包括阳性表达细胞角蛋白19并阴性表达清蛋白的胆管细胞。
33、如权利要求31所述的组合物，其中所述的干/祖细胞阳性表达EP-CAM、CD13或两者。
34、如权利要求32所述的组合物，其中所述的群落还包括单核细胞/巨噬细胞系细胞、淋巴细胞、内皮细胞或其组合。
35、如权利要求31所述的组合物，其中所述的肝细胞群落去除了免疫***的细胞。
36、如权利要求35所述的组合物，其中所述的肝细胞群落是用阴性免疫筛选来去除免疫***的细胞。
37、如权利要求36所述的组合物，其中所述的阴性免疫筛选是使用CD45、CD3、CD11b的抗体、或CD14损耗、或其组合来除去造血细胞。
38、如权利要求35所述的组合物，其中所述的被除去的免疫***细胞包括单核细胞/巨噬细胞系细胞、淋巴细胞或两者。
39、如权利要求31所述的组合物，其中所述的捐赠肝经历过一段时间的热缺血。
40、如权利要求31所述的组合物，其中所述的肝细胞从心博停止的捐赠者中获得。
41、如权利要求31所述的组合物，其中至少75％的所述肝细胞群落是肝实质细胞和肝祖/干细胞。
42、一种组合物，该组合物含有通过权利要求1-26中任一权利要求所述的方法获得的富集有活的功能性胆管细胞和肝干/祖细胞的人肝细胞群落。
43、如权利要求42所述的组合物，其中所述的肝细胞获自心博停止的捐赠者或经历过一段时间的温缺血。
44、如权利要求42所述的组合物，其中所述的胆管细胞阳性表达CK19并阴性表达清蛋白。
45、药物组合物，该药物组合物含有通过权利要求1-26中任一权利要求所述的方法获得的富集有活的功能性人肝细胞，包括肝干/祖细胞的肝细胞群和药学上可接受的载体。
46、如权利要求45所述的组合物，其中所述的肝细胞获自心博停止的捐赠者或经历过一段时间的温缺血。
47、如权利要求45所述的组合物，其中所述的干/祖细胞阳性表达EP-CAM、CD133或两者。
48、如权利要求45所述的组合物，其中所述的干/祖细胞直径大约为9-13微米。
49、如权利要求45所述的组合物，其中所述的药学上可接受的载体包括HYPOTHERMOSOLTM。
50、如权利要求45所述的组合物，其中所述的药学上可接受的载体还包括人血清和二甲亚砜。
51、治疗基因表达错误的组合物，该组合物包括转化了的人肝细胞群落，所述群落含有其中导入了功能性基因拷贝的、通过权利要求1-26中任一权利要求所述的方法获得的活的功能性肝干/祖细胞。
52、治疗基因表达错误的药物组合物，该组合物包括人肝细胞群落和药学上可接受的载体，所述的群落包括其中导入了功能性基因拷贝的、通过权利要求1-26中任一权利要求所述的方法获得的活的功能性肝干/祖细胞。
53、如权利要求52所述的组合物，其中所述的药物学上可接受的载体包括含有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、H2PO4 -、HCO3 -、HEPES、乳糖酸盐、蔗糖、甘露糖、葡萄糖、右旋糖酐-40、腺苷、谷胱苷肽或其组合的混合物。
54.如权利要求1或25所述的方法，其中的离心是在COBETM 2991细胞处理器上进行。
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