RU2477752C1 - Способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени in vitro в тканеспецифичном направлении - Google Patents
Способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени in vitro в тканеспецифичном направлении Download PDFInfo
- Publication number
- RU2477752C1 RU2477752C1 RU2012105738/10A RU2012105738A RU2477752C1 RU 2477752 C1 RU2477752 C1 RU 2477752C1 RU 2012105738/10 A RU2012105738/10 A RU 2012105738/10A RU 2012105738 A RU2012105738 A RU 2012105738A RU 2477752 C1 RU2477752 C1 RU 2477752C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tissue
- liver
- specific direction
- vitro
- cells
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биологии и клеточных технологий. Предложен способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени в тканеспецифичном направлении, который достигается тем, что клетки печени в условиях in vitro подвергают в течение 10 минут воздействию питательной среды, содержащей 2 ЕД/мл иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы. Способ позволяет в условиях in vitro эффективно стимулировать дифференцировку стволовых клеток печени в тканеспецифичном направлении, что может быть использовано в медицине для целей транспланталогии. 1 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени в тканеспецифичном направлении.
Известно большое количество способов стимуляции in vitro клеток-предшественников различных классов [1-4].
Наиболее близким по техническому результату прототипом является способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток в печеночном направлении с помощью фактора роста гепатоцитов, получаемого генно-инженерным методом [5].
Недостатком данного способа является его недоступность для широкого использования, связанная с высокой стоимостью фактора роста гепатоцитов [6], а также недостаточная эффективность способа.
Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа и доступности его использования.
Поставленная задача решается тем, что клетки печени в условиях in vitro подвергают в течение 10 минут воздействию питательной среды, содержащей 2 ЕД/мл иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.
Новым в предлагаемом изобретении является применение для стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.
Многие заболевания печени зачастую не поддаются лечению существующими медикаментозными средствами. Данное обстоятельство указывает на актуальность разработки новых гепатопротекторов. При этом наиболее перспективным является создание препаратов, способных оказывать влияние на стволовые клетки (СК) [7, 8].
Для изучения закономерностей функционирования клеток-предшественников печени и исследования механизмов их регуляции с целью создания патогенетически обоснованных методов лечения заболеваний печени используют различные экспериментальные способы культивирования клеточного материала in vitro. Для эффективного культивирования и стимуляции пролиферативно-дифференцировочных потенций СК необходимым условием является добавление в питательную среду факторов роста, которые значительно повышают эффективность клонирования клеток-предшественников [1-4]. При этом СК печени представляют собой гетерогенную популяцию элементов, которые способны давать начало не только тканеспецифичным, но и другим клеточным типам [8]. Данное обстоятельство с целью адекватной трактовки получаемых в экспериментах in vitro результатов требует использования специализированных ростовых факторов, позволяющих регистрировать образование лишь паренхиматозных СК печени. Кроме того, стимуляция развития СК в тканеспецифическом направлении является важным фактором, облегчающим изучение процессов их жизнедеятельности. На сегодняшний день в экспериментах in vitro наиболее часто для стимуляции дифференцировки СК печени в тканеспецифичном направлении используют дорогостоящий генно-инженерный фактор роста гепатоцитов [5], который, несмотря на свое название, является плейотропным фактором, действующим в отношении прогениторных клеток различных классов.
Вместе с тем известна возможность стимуляции стволовых клеток костного мозга с помощью иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы (гиалуронидазы) [9] за счет образования под ее влиянием in situ низко- и среднемолекулярных форм гиалуроновой кислоты, повышающих интенсивность процессов клеточного деления [9, 10].
Однако способность гиалуронидазы оказывать прямое влияние на стволовые клетки печени, заключающееся в стимуляции их дифференцировки в тканеспецифичном направлении, не известна.
Факт применения иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции in vitro дифференцировки стволовых клеток печени в тканеспецифичном направлении, для специалиста не является очевидным.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом.
Взвесь клеток печени лабораторных животных (мышей) помещают на 10 минут в питательную среду, содержащую 2 ЕД/мл иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 26 шт. массой 18-20 г, которые получены из питомника экспериментально-биологической клиники лабораторных животных НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).
Пример 1
У мыши линии CBA/CaLac массой 20 г, умерщвленной с помощью дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом, в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) извлекали печень. Печень отмывали от эритроцитов в физиологическом растворе. Затем ее помещали в гомогенизатор с питательной средой DMEM и гомогенизировали до получения однородной клеточной взвеси. После этого клеточный материал фильтровали через капроновую сеточку для удаления крупных агрегатов, дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5-10 мин и подсчитывали общее количество нуклеаров, определяя их жизнеспособность с помощью трипанового синего. Затем клеточный материал поместили на 10 минут в среду DMEM (“Serva”, ФРГ), содержащую 2 ЕД/мл иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы (ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г.Новосибирск).
Для регистрации процессов дифференцировки СК использовали культуральные методы. Для этого клетки, обработанные веществом, дважды отмыли центрифугированием и помещали их в концентрации 105/мл в среду следующего состава: 90% среды DMEM (“Serva”, ФРГ), 10% ЭТС («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), 5000 МЕ/л гепарина (“Biochemie“, Австрия), 5 мг/л свиного многокомпонентного инсулина (“Novo Nordisk“, Дания). По 0,5 мл приготовленной клеточной взвеси помещали в 24-луночные планшеты («Corning», США) в CO2-инкубаторе при 37°C, 5% CO2 и 100% влажности воздуха и инкубировали 20 сут. После этого в 20-ти суточных культурах регистрировали рост паренхиматозных колониеобразующих единиц (КОЕ-Печ) [4] и фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф) [1]. Подсчет проводили под инвертированным микроскопом «Axio Observer A.1» (Carl Zeiss, Германия). Под КОЕ-Печ подразумевали круглое либо неправильной формы неприлипающее образование, содержащее более 30 клеток, под КОЕ-Ф - прилипшее образование из 30 и более фибробластоподобных клеток. Морфологический контроль проводили путем изучения под иммерсией препаратов, окрашенных азур II-эозином в течение 30-40 мин.
Для сравнения эффективности заявляемого способа со способом-прототипом дополнительно использовали культуру клеток печени (не обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой) в среде того же состава, но с добавлением 20 нг/мг фактора роста гепатоцитов («Sigma», США).
В ходе эксперимента наблюдалась значительная стимуляция роста КОЕ-Печ при добавлении в культуру клеток, не обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой, фактора роста гепатоцитов (табл.). При этом значение показателя составляло 255,6% от контроля. Полученные результаты свидетельствовали об активации процессов дифференцировки СК под влиянием данного фактора в тканеспецифичном направлении [5].
Изучение изменения роста КОЕ-Печ из клеток, обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой, также выявило существенное возрастание их количества (таблица). Причем величина исследуемого параметра достоверно превышала таковую в случае стимуляции процессов дифференцировки СК по способу-прототипу.
Более того, при изучении культур ткани печени было обнаружено, что внесение в питательную среду фактора роста гепатоцитов в меньшей степени, чем преинкубация клеток в растворе иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы снижает рост стромальных колоний (КОЕ-Ф). Данный феномен в совокупности с вышеприведенными результатами (падение выхода КОЕ-Ф на фоне резкого увеличения образования КОЕ-Печ) подтверждает тот факт, что использование предлагаемого изобретения приводит к стимуляции дифференцировки мультипотентных стволовых клеток печени [11, 12] в паренхиматозном направлении.
Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать дифференцировку стволовых клеток печени в тканеспецифичном направлении в условиях in vitro.
Цитируемая литература
1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.
2. Патент (RU) на изобретение №2308280 «Способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца», 2007 г. (опубл. 20.10.2007., Бюл. №.29). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.
3. Патент (RU) на изобретение №2308281 «Способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы», 2007 г. (опубл. 20.10.2007. Бюл. №29). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.
4. Патент (RU) на изобретение №2295971 «Способ терапии экспериментального хронического токсического гепатита», 2007 г. (опубл. 27.03.2007 г., Бюл. №9). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др.
5. Liu WH, Tao KS, You N, Liu ZC, Zhang HT, Dou KF. Differences in the properties and mirna expression profiles between side populations from hepatic cancer cells and normal liver cells // PLoS One. 2011; 6 (8):e23311.
6. Каталог SIGMA-ALDRICH 2004/2005.
7. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы. // Наука в России. - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - №1. С.4-8.
8. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.
9. Патент (RU) на изобретение №2405822 «Средство, увеличивающее резерв стволовых клеток в организме» (опубл. 10.12.2010, Бюл. №34). Авторы: Артамонов А.В., Бекарев А.А., Верещагин Е.И. и др.
10. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы. // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.6-9.
11. Fausto N. Oval cells and liver carcinogenesis: an analysis of cell lineages in hepatic tumors using oncogene transfection techniques. Prog. Clin. Biol. Res.1990; 331:325-34.
12. Dabeva M.D., Shafritz D.A. Activation, proliferation and differentiation of progenitor cells into hepatocytes in the D-galactosamine model of liver regeneration. Am. J. Pathol. 1993; 143(6):1606-20.
| Рост КОЕ-Печ и КОЕ-Ф в культуре клеток печени, не обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой (1), в культуре клеток печени, не обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой, при добавлении фактора роста гепатоцитов (2) и в культуре клеток печени, подвергшихся воздействию иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы (3) (X±m) | ||
| Группы | КОЕ-Печ, на 100 тыс. нуклеаров | КОЕ-Ф, на 100 тыс. нуклеаров |
| 1 | 7,63±0,38 | 3,47±0,15 |
| 2 | 19,5±0,94* | 1,98±0,06* |
| 3 | 23,27±1,1* | 1,23±0,07* |
| # | # | |
| * - отмечена достоверность различий с показателями в 1 группе при p<0,05. | ||
| # - отмечена достоверность различий с показателями между 2 и 3 группами при p<0,05. | ||
Claims (1)
- Способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени in vitro в тканеспецифичном направлении, заключающийся в воздействии на клетки печени веществом, отличающийся тем, что в качестве воздействия вещества используют их 10-минутную инкубацию в питательной среде, содержащей 2 ЕД/мл иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012105738/10A RU2477752C1 (ru) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | Способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени in vitro в тканеспецифичном направлении |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012105738/10A RU2477752C1 (ru) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | Способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени in vitro в тканеспецифичном направлении |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2477752C1 true RU2477752C1 (ru) | 2013-03-20 |
Family
ID=49124401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012105738/10A RU2477752C1 (ru) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | Способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени in vitro в тканеспецифичном направлении |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2477752C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2686718C1 (ru) * | 2018-03-12 | 2019-04-30 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Средство, стимулирующее функции мезенхимальных клеток-предшественников in vitro |
| RU2713122C1 (ru) * | 2019-02-19 | 2020-02-03 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Способ стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0168803A2 (en) * | 1984-07-14 | 1986-01-22 | Nippon Petrochemicals Company, Limited | Method for producing p-Isobutylstyrene |
| RU2346981C2 (ru) * | 2002-07-19 | 2009-02-20 | Веста Терапьютикс, Инк. | Способ получения жизнеспособных клеток печени человека, в том числе печеночных стволовых клеток/клеток-предшественников |
-
2012
- 2012-02-17 RU RU2012105738/10A patent/RU2477752C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0168803A2 (en) * | 1984-07-14 | 1986-01-22 | Nippon Petrochemicals Company, Limited | Method for producing p-Isobutylstyrene |
| RU2346981C2 (ru) * | 2002-07-19 | 2009-02-20 | Веста Терапьютикс, Инк. | Способ получения жизнеспособных клеток печени человека, в том числе печеночных стволовых клеток/клеток-предшественников |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2686718C1 (ru) * | 2018-03-12 | 2019-04-30 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Средство, стимулирующее функции мезенхимальных клеток-предшественников in vitro |
| RU2713122C1 (ru) * | 2019-02-19 | 2020-02-03 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Способ стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ho et al. | Improving effects of chitosan nanofiber scaffolds on osteoblast proliferation and maturation | |
| Gu et al. | Control of in vitro neural differentiation of mesenchymal stem cells in 3D macroporous, cellulosic hydrogels | |
| Monje | Schwann cell cultures: biology, technology and therapeutics | |
| KR102320800B1 (ko) | 효능이 증진된 줄기세포 유래 미세소포, 이의 용도 및 효능강화 방법 | |
| Abdullah et al. | Induction of mice adult bone marrow mesenchymal stem cells into functional motor neuron-like cells | |
| Jankowski et al. | In vitro cultures of adipose-derived stem cells: An overview of methods, molecular analyses, and clinical applications | |
| Takahashi et al. | Methods for generating vascularized islet‐like organoids via self‐condensation | |
| JP7116501B2 (ja) | 幹細胞材料およびその製造方法 | |
| KR20190112185A (ko) | 3ｄ 세포 배양을 위한 방법과 시스템 및 이의 용도 | |
| Lichtenberg et al. | A multifunctional bioreactor for three-dimensional cell (co)-culture | |
| Gaggi et al. | Chemical and biological molecules involved in differentiation, maturation, and survival of dopaminergic neurons in health and Parkinson’s disease: physiological aspects and clinical implications | |
| Strobel et al. | Methods for vascularization and perfusion of tissue organoids | |
| RU2477752C1 (ru) | Способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени in vitro в тканеспецифичном направлении | |
| CN105861425A (zh) | 透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法及其应用 | |
| Scala et al. | Myogenic commitment of human stem cells by myoblasts Co-culture: A static vs. a dynamic approach | |
| RU2665818C1 (ru) | Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro | |
| Lai | Influence of pre-freezing temperature on the corneal endothelial cytocompatibility and cell delivery performance of porous hyaluronic acid hydrogel carriers | |
| RU2439147C1 (ru) | Способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток | |
| Grossemy et al. | Stimulation of cell growth and neurogenesis using protein-functionalized microfibrous scaffolds and fluid flow in bioreactors | |
| Voloshin et al. | Practical use of immortalized cells in medicine: Current advances and future perspectives | |
| Koskinen Holm et al. | Engineering a 3D in vitro model of human gingival tissue equivalent with genipin/cytochalasin D | |
| Huang et al. | A study of the differentiation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth on 3D silk fibroin scaffolds using static and dynamic culture paradigms | |
| Gharravi et al. | Status of tissue engineering and regenerative medicine in Iran and related advanced tools: Bioreactors and scaffolds | |
| Fuku et al. | Evaluation of the usefulness of human adipose-derived stem cell spheroids formed using SphereRing® and the lethal damage sensitivity to synovial fluid in vitro | |
| Rimann et al. | Acrylonitrile and Pullulan based nanofiber mats as easily accessible scaffolds for 3d skin cell models containing primary cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140218 |