CN100436586C

CN100436586C - 内切葡聚糖酶nce5及其含有内切葡聚糖酶nce5的纤维素酶制剂

Info

Publication number: CN100436586C
Application number: CNB018112846A
Authority: CN
Inventors: 村岛弘一郎; 中根公隆; 西村智子; 古贺仁一郎; 河野敏明; 隅田奈绪美; 矢内耕二; 村上健
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Priority date: 2000-05-22
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2008-11-26
Anticipated expiration: 2021-05-22
Also published as: EP1291431A1; DK1291431T3; CN1436243A; EP1291431A4; EP1291431B1; ES2278743T3; ATE349516T1; US7138263B2; AU2001258799A1; DE60125534D1; WO2001090375A1; US20050143275A1; JP4230149B2; DE60125534T2

Abstract

本发明提供了一种内切葡聚糖酶，该酶可用于减少含纤维素纤维的绒毛、改善其手感和外观、使颜色澄明、局部改变颜色、降低硬挺度并可用于洗涤剂组合物中，还可用于使废纸脱墨和提高纸浆的打浆度等。从Humicola insolens中克隆了一种编码内切葡聚糖酶NCE5的cDNA并测定了其DNA序列和由该DNA序列推导出的氨基酸序列。

Description

内切葡聚糖酶NCE5及其含有内切葡聚糖酶NCE5的纤维素酶制剂

技术领域

本发明涉及一种内切葡聚糖酶，一种含有该内切葡聚糖酶的纤维素酶制剂和一种利用该纤维素酶制剂处理含纤维素织物的方法。

技术背景

为了赋予含纤维素织物以所需的特性，用纤维素酶处理含纤维素织物。例如，在纺织业领域为了改善含纤维素织物的手感和外观或赋予

“磨洗”外观而利用纤维素酶进行处理，其中所述“磨洗”外观使有色的含纤维素织物发生了颜色的局部改变(欧洲专利307，564)。

目前，来源于木腐真菌木霉属和腐质霉属的纤维素酶制剂被用于赋予被染色的粗斜纹布含纤维素织物以磨洗的外观和改善其手感。这些纤维素酶制剂是多种纤维素酶组分的混合物。为了对所述含纤维素织物发挥所需的作用必须使用大量的纤维素酶制剂，由此造成的困难阻碍了纤维素酶制剂的实际应用。

纤维素酶制剂的这种缺点有待通过使用含有一种大量的内切葡聚糖酶的制剂而得到克服。例如，国际公布WO 89/09259，WO 91/17243，WO 98/03640和WO 94/21801公开了具有很高内切葡聚糖酶活性的纤维素酶制剂。具体地是，WO 91/17243公开了一种来源于腐质霉属的纯化的43kD内切葡聚糖酶组分(EGV)的牛仔裤磨蚀活性比常规已知的由多种纤维素酶组分组成的混合物形式的纤维素酶制剂的牛仔裤磨蚀活性高约100倍。还有，WO 98/03640公开了一种来源于腐质霉属的内切葡聚糖酶组分NCE4的牛仔裤磨蚀活性和lyocell绒毛去除活性比常规已知的由多种纤维素酶组分组成的混合物形式的纤维素酶制剂的牛仔裤磨蚀活性和lyocell绒毛去除活性分别高25倍和100倍。

为了赋予被染色的粗斜纹布含纤维素织物以磨洗的外观并改善其手感利用纤维素酶进行了这种处理，但是在这种情况下，在处理过程中往往出现一些问题如部分靛蓝染料在衣服上再沉积或再染色，即逆染色。

有一种试图降低逆染色程度的方法，其中通过添加一种试剂如表面活性剂而将靛蓝染料分散在纤维素酶处理溶液中。然而，这种方法存在的问题是需要投入添加化学品的成本并且也给环境增加了排放废水的负担。

因此，人们已经把注意力集中在提供一种活性高而逆染色程度低的纤维素酶上，该纤维素酶将被用于处理被染色的粗斜纹布含纤维素织物。

本发明的公开

目前，本发明人已经分离出一种新型的分解纤维素织物活性高的来源于霉菌Humicola insolens的内切葡聚糖酶NCE5和它的基因并且证实了这种酶具有一个对来源于腐质霉属的酶来说没有先例的结构并且能够水解纤维素织物，也就是说这种酶具有约25kDa的小分子量而且其结构中不存在纤维素结合域(CBD)。

还证实了，在采用通过利用Humicola insolens作为宿主表达酶NCE5所获得的制剂处理被染色的粗斜纹布含纤维素织物时，所述酶具有类似于NCE4的高活性，而令人惊奇的是所述酶的逆染色程度低于NCE4。

因此，本发明打算提供一种在处理被染色的粗斜纹布含纤维素织物的过程中逆染色程度低的纤维素酶及其基因。

本发明还打算提供一种具有优良特性的纤维素酶制剂。

另外，本发明打算提供一种利用所述酶处理含纤维素织物的有效和成本低的方法。

本申请包括申请号为2000-150463的日本专利申请的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，该日本专利申请是本申请的优先权文件。

实施本发明的最佳实施方案

以下详细描述本发明。

纤维素酶

本发明提供的内切葡聚糖酶NCE5的有利特性在于在处理被染色的粗斜纹布含纤维素织物的过程中逆染色的程度低于NCE4。因此，本发明的酶，可以降低处理被染色的粗斜纹布含纤维素织物的过程中化学品如表面活性剂的添加量，结果可以降低成本并且能够减轻给环境造成的负担。

该酶是一种新型蛋白质，其与由S.Takashima等报道的灰色腐质霉的eg14序列(S.Takashima等，生物技术杂志(Journal ofBiotechnology)，67，85-97(1999))具有同源性。该酶的特征在于具有约25kDa的小分子量而且其结构中不存在纤维素结合域(CBD)。在原始状态下，从腐质霉属中分离出的具有高的纤维素织物分解活性的所有的酶都含有纤维素结合域(CDB)(例如，WO 91/17243已经公开了一种来源于腐质霉属的纯化的43kD内切葡聚糖酶成分(EGV)，以及WO98/03640已经公开了一种腐质霉属来源的内切葡聚糖酶成分(NCE4))。然而，不含CBD而纤维素分解活性高的腐质霉属来源的酶还不为自然界所知。

作为一种来源于腐质霉属以外的其它霉菌的酶中不含CBD的内切葡聚糖酶，JP-W-8-507695(本文中使用的术语“JP-W”是指一种“已经公开的未审日本国际专利申请”)公开了从Trichodermalongibrachiatum中分离的EGIII具有一个从5.5至6.0的最适pH作为其CMC酶活性(Remazol亮蓝羰甲基纤维素分析试验)以及甚至在中性至碱性范围内的活性也比通常已知的木霉属来源的纤维素酶的活性高。另一方面，本发明的酶的CMC酶活性具有一个从5.0至9.0的最适pH并且在更强的碱性范围内的活性比EGIII的活性高。

该酶是一种含有部分SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或从第19位至第223位的序列的蛋白质。根据本发明，术语“部分SEQ ID NO：1所示序列”是指，例如一段可以作为探针的长度，更明确地说仍然保留了纤维素酶活性，具体地是内切葡聚糖酶活性的部分序列。

一种在上述蛋白质的N-端侧还含有部分或全部的SEQ ID NO：1所示的第1位至第18位的氨基酸序列的蛋白质也被包括在本发明中。在这一点上，由于SEQ ID NO：1所示序列中的第1位至第18位的氨基酸序列被认为是信号肽，所以部分序列是指除了其保持信号肽活性的部分序列外，由于在被所述类型的表达宿主加工的位点上发生变化而仍然保留在N-端的一段序列。

上述蛋白质的一种修饰蛋白质也被包括在本发明中。根据本发明，所述修饰蛋白质是指一种上述蛋白质的氨基酸序列中发生了至少一个，优选地1至几个氨基酸的修饰如添加、***、删除、缺失或取代的、而仍然保留了纤维素酶活性，尤其是内切葡聚糖酶活性的蛋白质。

可以从霉菌，明确地说从一种属于腐质霉属的微生物(例如Humicola insolens)中获得。

根据本发明，提供了一种编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或其一种修饰蛋白质的核苷酸序列。一旦给出了一种蛋白质的氨基酸序列，就很容易确定出编码该蛋白质的DNA序列，因而可以选择出编码SEQ IDNO：1所示氨基酸序列或其一种修饰蛋白质的不同核苷酸序列。

本发明的核苷酸序列既可以是天然来源的也可以是一种完全合成的产物，或者也可以是一种通过利用部分天然来源而合成的产物。获得本发明核苷酸序列的方法的典型例子包括一种这样的方法，在该方法中，通过采用一种遗传工程领域中通常使用的技术，例如采用一种基于部分氨基酸序列的信息制备的一种合适的DNA探针从Humicolainsolens的cDNA文库中筛选所述核苷酸序列。

编码本发明的内切葡聚糖酶NCE5的氨基酸序列的典型序列具有部分或全部的SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有一个起始于第一位至第3位的ATG和终止于第670位至第672位的TAA的可读框。并且，第55位至第57位的核苷酸序列对应于由205个残基组成的成熟蛋白质的N-端氨基酸。

内切葡聚糖酶的活性

内切葡聚糖酶活性是指“CMC酶活性”，也就是一种通常水解羧甲基纤维素的活性。一个单位的“CMC酶活性”被定义为形成相当于1μmol葡萄糖的还原糖所需要的酶量，该酶量是通过包括以下步骤的方法测定的：将待测蛋白质与CMC溶液一起温育一段固定的时间，然后测定被释放出的还原糖。另外，“CMC酶活性”也可以通过一种以其中加入了待测蛋白质的CMC溶液的粘度变化作为标准的方法来测定。

在本发明中，按照Neena Din等的方法(Neena Din等，生物技术(Biotechnology)，9(1991)，1096-1099)，以脱脂棉原纤维-释放活性作为标准来测定内切葡聚糖酶活性。也就是说，当待测蛋白质、不锈钢珠和脱脂棉被加到50mM的磷酸盐缓冲液(pH7)中时，从脱脂棉中释放出来的原纤维在Launder Meter(L-12，Daiei Kagaku Seiki MFG.，日本)中于55℃下反应120分钟，然后在600nm的吸光度下测定从脱脂棉中释放出来的原纤维的量。

表达载体和被转化的微生物

本发明还提供了一种能够在一种宿主微生物中复制编码SEQ IDNO：1所示氨基酸序列或其一种修饰蛋白质的核苷酸序列(以下只描述为“本发明的DNA序列”)并且含有一种由此所编码的蛋白质能够被表达的DNA序列的表达载体。本发明的表达载体能够在一种自我复制载体如质粒的基础上进行构建，所述质粒以一种独立的形式存在于染色体外并且其复制不依赖于染色体的复制。而且，本发明的表达载体可以是一种当被引入宿主微生物时被整合进宿主微生物的基因组中并且与被整合在其中的染色体一起进行复制的载体。关于构建本发明的载体的过程和方法，可以采用遗传工程领域中通常使用的方法。

为了通过将本发明的表达载体实际引进一种宿主微生物中来表达具有所需活性的蛋白质，理想的是所述载体不仅含有本发明的DNA序列而且还含有其它元件如一种控制表达的DNA序列和一种用于筛选微生物的基因标记。作为控制表达的DNA序列，其中包括一个启动子、一个终止子和一个编码一种信号肽的DNA序列。对所述的启动子没有特别的限制，条件只是该启动子在一种宿主微生物中具有转录活性，并且可以用来作为控制编码一种与宿主微生物的蛋白质相同或不同的蛋白质的基因表达的DNA序列。并且，对所述信号肽也没有特别的限制，条件只是该信号肽能够有助于宿主微生物中的蛋白质分泌，而且可以从一种DNA序列中得到。该DNA序列来源于编码一种与宿主微生物的蛋白质相同或不同的蛋白质的基因。另外，本发明的基因标记可按照转化体的筛选方法任意地进行选择，例如可以使用一种编码药物抗性的基因或一种补充辅源营养的基因。

另外，根据本发明，提供了一种被所述表达载体转化的微生物。对该宿主载体***没有特别的限制，例如，可以使用一种利用了大肠杆菌、一种放线菌、一种酵母菌或一种霉菌的***和一种利用了大肠杆菌、一种放线菌、一种酵母菌或一种霉菌的与其它蛋白质融合的蛋白质表达***。

而且，可以采用本领域中通常使用的技术来实现用这种表达载体对一种微生物的转化。

另外，利用合适的培养基对所得到的转化体进行培养，然后可以通过从该培养混合物中分离来获得本发明的蛋白质。因此，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种制备本发明新型蛋白质的方法。转化体的培养及培养条件基本上与所使用的微生物的培养及培养条件相同。转化体培养结束后，利用本领域中通常使用的方法回收目的蛋白质。

并且，根据本发明的一个优选的实施方案，提供了一种能够表达由本发明的DNA序列编码的内切葡聚糖酶的酵母细胞。本发明酵母细胞的实例包括属于糖酵母属、汉逊氏酵母属或毕赤氏酵母属的微生物，例如啤酒糖酵母。

本发明的宿主霉菌可以是一种属于腐质霉属、曲霉属、木霉属、镰孢属或支顶孢属的霉菌。其优选的实例包括Humicola insolens、黑曲霉或米曲霉、绿色木霉、尖孢镰孢和纤维素溶解支顶孢(Acremoniumcellulolyticus)。

微生物的保藏

Humicola insolens MN200-1已被保藏在国家先进工业科学技术研究所，一个经济、贸易和工业部下属的独立管理机构，AIST TsukubaCentral 6，Higashi 1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，日本，保藏号为FERMBP-5977(原始保藏物：FERM P-15736，原始保藏日期：1996年7月15日)。被含有本发明的纤维素酶基因的质粒pNCE5Bam转化的大肠杆菌菌株JM109(参照实施例4)已于2000年4月18日被保藏在国家先进工业科学技术研究所，一个经济、贸易和工业部下属的独立管理机构，AISTTsukuba Central 6，Higashi 1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，日本，保藏号为FERM BP-7138。

被质粒pEGD01转化的一株大肠杆菌菌株(大肠杆菌/pEGD01)已被保藏在国家先进工业科学技术研究所，一个经济、贸易和工业部下属的独立管理机构，AIST Tsukuba Central 6，Higashi 1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，日本，保藏号为FERM BP-5973(原始保藏物：FERM P-15729，原始保藏日期：1996年7月12日)。

纤维素酶/纤维素酶制剂的用途

本发明的另一个实施方案还提供了一种含有一种本发明的内切葡聚糖酶及其修饰肽的纤维素酶制剂。本发明的纤维素酶制剂除了含有本发明的内切葡聚糖酶及其修饰肽外，还可以含有其它类型的纤维素酶如纤维素生物水解酶、β-葡糖苷酶和除本发明的内切葡聚糖酶以外的内切葡聚糖酶，并且可以通过进一步将所述的纤维素酶制剂与通常使用的组分如一种填料(例如乳糖、氯化钠和山梨醇)、表面活性剂和防腐剂进行混合来制备。还可以将本发明的纤维素酶制剂制成任何适宜的形状如粉末或液体形式。

本发明还提供了一种使有色的含纤维素织物的颜色澄明的方法，该方法包括一个采用一种内切葡聚糖酶或一种纤维素酶制剂处理有色的含纤维素织物的步骤，以及一种使有色的含纤维素织物发生局部颜色改变的方法，即一种为有色的含纤维素织物提供磨洗外观的方法，该方法包括一个采用本发明的内切葡聚糖酶或纤维素酶制剂处理有色的含纤维素织物的步骤。

本发明的这类方法可以通过在洗涤过程中处理含纤维素织物来实施。然而，在某些情况下，织物的处理可以通过在浸泡或漂洗过程中向浸泡了或要浸泡的所述织物的水中添加本发明的内切葡聚糖酶或纤维素酶制剂来实施。

本发明进一步提供了一种降低含纤维素织物的起毛率或减少这种织物中的绒毛的方法；或者一种降低含纤维素织物变得硬挺的速率或降低这种织物硬挺度的方法。这些方法中的每一种方法都包括一个采用本发明的内切葡聚糖酶或纤维素酶制剂处理含纤维素织物的步骤。

考虑其它各种条件的同时可以适当地决定诸如接触温度或内切葡聚糖酶的使用量这样的条件。例如，对于为了改善其手感和外观而对含纤维素织物进行失重处理的情况来说，所述织物可以在约50至60℃的温度下利用蛋白浓度为1至100mg/L的内切葡聚糖酶进行处理。并且，当有色的含纤维素织物需要进行局部颜色改变时，所述织物可以在约50至60℃的温度下利用蛋白浓度为2至50mg/L的内切葡聚糖酶进行处理。

还有，当降低含纤维素织物的起毛率或减少这种织物中的绒毛时，所述织物可以在约50至60℃的温度下利用蛋白浓度为0.05至10mg/L的内切葡聚糖酶进行处理。

并且，通过在洗涤剂组合物中使用本发明的内切葡聚糖酶或纤维素酶制剂，可以提高颗粒状污垢的去除、使颜色澄明、去毛、消除起球和降低硬挺度的性能。本发明所指的洗涤剂组合物可含有一种表面活性剂(一种阴离子、非离子、阳离子、两性或兼性离子剂或其一种混合物)。

本发明的洗涤剂组合物还可含有本领域中已知的其它洗涤剂组分，如助洗剂、漂白剂、漂白活性剂、缓蚀剂、螯合剂、污斑离解聚合物、香料、其它的酶(如蛋白酶、脂酶或淀粉酶)、酶稳定剂、配方助剂、光学增艳剂和泡沫促进剂。阴离子表面活性剂的典型实例包括线性烷基苯磺酸盐(LAS)、烷基硫酸盐(AS)、α-烯属磺酸盐(AOS)、脂肪醇乙氧基硫酸盐(AES)和天然脂肪酸的碱金属盐。非离子表面活性剂的实例包括聚氧乙烯烷基醚(AE)、烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚乙二醇醚、蔗糖和葡萄糖的脂肪酸酯以及聚乙氧基化烷基葡糖苷的酯。

已经发现脱墨可以通过使本发明的内切葡聚糖酶或纤维素酶制剂与废纸反应来进行。因此，由废纸制造循环利用纸的方法可以通过采用本发明的内切葡聚糖酶进行处理得到明显的改进。一般称为废纸的所有纸都可以被用作将被本发明利用的废纸，而且它们的实例包括通过混合机械浆和化学浆生产的报纸，杂志和一级至二级的印刷纸、由化学浆组成的不含木质的废纸和废印刷纸如涂布纸。

还有，本文使用的术语“脱墨剂”是指一种通常用于使废纸脱墨的试剂，其实例包括一种碱性化合物如NaOH和Na₂CO₃，硅酸钠、过氧化氢和磷酸盐，以及阴离子和非离子表面活性剂、净化剂如油酸和辅助剂如pH稳定剂、螯合剂和分散剂。

并且，根据本发明，可以认为采用本发明的内切葡聚糖酶处理纸浆使其打浆度得到可能的明显改善而不会大大降低纸的强度。因此，本发明提供了一种改善纸浆的打浆度的方法，该方法包括一个采用本发明的内切葡聚糖酶或纤维素酶制剂处理纸浆的步骤。可以通过本发明处理的纸浆的实例包括废纸浆、循环利用纸板浆、牛皮纸浆、亚硫酸盐浆和热洗机械浆和其它高得率浆。

另外，消化动物饲料中的葡聚糖的能力可以通过向该饲料中添加本发明的内切葡聚糖酶来提高。因此，本发明提供了一种改善对动物饲料的消化能力的方法，该方法包括一个采用本发明的内切葡聚糖酶或纤维素酶制剂处理动物饲料的步骤。

附图的简要说明

图1表示质粒pNCE5Bam的构建。

图2表示pJND-c5的构建。

实施例

参照实施例使得本发明得到更清楚的描述，但是本发明不局限于下列实施例，这些实施例并不覆盖本发明的范围。

实施例1从Humicola insolens中分离和纯化具有脱脂棉原纤维-释放活性的组分

将Humicola insolens MN200-1(FERMBP-5977)接种到一种(N)培养基(5.0％Avicel，2.0％酵母提取物，0.1％蛋白胨，0.03％氯化钙，0.03％氯化镁，pH6.8)中并在37℃下在摇床上进行培养。培养7天后，将如此获得的培养液在7000rmp下离心20分钟从而除去细胞，将得到的培养物滤液作为一种粗纤维素酶制剂溶液。

将200ml所述粗纤维素酶制剂溶液加到硫酸铵终浓度为1M的溶液中，然后以20ml/分钟的流速上样到Source PHE柱子上(凝胶体积150ml，由Amersham Pharmacia Biotech制造)，该柱子预先用1M硫酸铵溶液进行了平衡。接下来，采用硫酸铵浓度为1.0M至0M的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)以20ml/分钟的流速进行线性梯度洗脱并分步收集级分。在这些级分当中，发现当采用硫酸铵浓度为0.3M时得到的部分级分中的棉花原纤维-释放活性很强。因此，收集200ml的该级分。该步骤进行两次。

将400ml如此得到的活性级分加到硫酸铵浓度为1.5M的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，然后以20ml/分钟的流速上样到Source ISO柱子上(凝胶体积125ml，由Amersham Pharmacia Biotech制造)，该柱子预先用1.5M硫酸铵的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)进行了平衡。接下来，采用从硫酸铵浓度为1.5M的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)至超纯水以20ml/分钟的流速进行线性梯度洗脱并分步收集级分。在这些级分当中，发现当采用硫酸铵浓度为1.05M时得到的部分级分的脱脂棉原纤维-释放活性很强。因此，收集200ml的该级分。

然后，将硫酸铵加到200ml如此获得的活性级分中从而达到65％饱和度的水平，在4℃下将所述混合物搅拌60分钟，然后以15000rpm离心从而回收沉淀。将该沉淀溶解在20ml的蒸馏水中并利用Ultrafree/Biomax-5K(Millipore)进行脱盐从而回收到40ml的溶液。

将30ml如此得到的活性级分加到50mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)中，然后以5ml/分钟的流速上样到SP Sepharose FF柱子上(凝胶体积16ml，由Amersham Pharmacia Biotech制造)，该柱子预先用50mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)进行了平衡。接下来，采用从50mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)至1M NaCl的50mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)以4ml/分钟的流速进行线性梯度洗脱并分步收集级分。在这些级分当中，发现当氯化钠浓度约为0.12M时得到的部分级分的脱脂棉原纤维-释放活性很强。因此，收集12ml的该级分。

此后，将6ml如此得到的活性级分加到50mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)中，然后以1ml/分钟的流速上样到Mono S 5/5HR柱子上(由AmershamPharmacia Biotech制造)，该柱子预先用50mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)进行了平衡。接下来，采用从50mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)至1M NaCl的50mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)以1ml/分钟的流速进行线性梯度洗脱并分步收集级分。在这些级分当中，发现当氯化钠浓度约为0.1M时得到的部分级分的脱脂棉原纤维-释放活性很强。因此，收集1至3ml的该级分。该级分被分离成NCE5。通过SDS-PAGE分析，该NCE5具有一条25kD的带。将上述纯化NCE5的纯化步骤重复50次，获得了大量的纯化样品。

所述SDS-PAGE分析是利用Tefco提供的***来进行的。即，使用了一个电泳槽(No.03-101)，一个电源(3540型)，一种8％的凝胶(01-075)和一个用于SDS-PAGE的缓冲液试剂盒(06-0301)。所述电泳条件是18mA/10分钟，然后是20mA/90分钟。为了电泳后进行蛋白质的测定，利用电泳用2D-银染色剂II“Daiichi”(由Daiichi Pure Chemicals制造)进行银染。利用由Bio-Red制造的SDS-PAGE分子量标准蛋白LowRange(161-0304)作为蛋白标准品。

通过Neen Din等的方法(Neen Din等，生物技术(Biotechnology)，9(1991)，1096-1099)的改进方法测定脱脂棉原纤维-释放活性。即，当在下述条件下利用耐洗牢度试验仪进行反应时，以600nm的吸光度测定从脱脂棉中释放的原纤维量。

测量仪器：耐洗牢度试验仪L-12(Daiei Kagaku Seiki MFG.，日本)

温度：55℃

时间：120分钟

反应pH：pH7(50mM磷酸盐缓冲液)

向所述处理溶液中加入适当量的不锈钢珠和脱脂棉以及内切葡聚糖酶溶液。

实施例2纤维素酶NCE5的部分氨基酸序列

(1)N-端氨基酸序列的鉴定

为了测定实施例1中纯化的蛋白质的N-端氨基酸序列，所述NCE5级分通过采用SDS-PAGE mini(由Tefco制造)来处理，通过电子印迹转移到PVDF膜上，采用考马斯亮蓝R250(由Nakalai Tesque制造)染色，脱色，用水冲洗，然后风干。当从其中切下印迹了25kD蛋白质的部分后，上样到492型蛋白质测序仪(由PE Applied Biosystems制造)以便分析N-端氨基酸序列，没有获得通过Edman降解的信号，因此，表明所述N-端氨基酸得到了修饰和保护。因此，将所述膜浸泡在0.5％的聚乙烯吡咯烷酮(分子量40000，由Sigma制造)/100mM醋酸溶液中于37℃下保持30分钟从而封闭所述膜上蛋白质未结合部分，通过采用Pfu焦谷氨酸氨基肽酶(由Kakara Shuzo制造)在50℃下处理5小时来除去所述被修饰的N-端残基，然后再次进行序列测定。如此获得的序列如下所示。

NCE5的N-端氨基酸序列

Ser-Gly-Ser-Gly-Arg-Thr-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-Pro-Ser-(Cys)-Ala-Trp-Pro (20个残基)(SEQ IDNO：3)

(2)肽作图

为了测定实施例1中纯化的蛋白质的内部氨基酸序列，对所述蛋白质进行还原烷基化，然后绘制其肽图谱。

也就是，将300μg的纯化蛋白质溶解在被装在一支试管中的500μl还原烷基化缓冲液(0.5M tris，7M盐酸胍，10mM EDTA·2Na₂)中，然后向其中加入1mg的DTT。用氮气置换所述试管中的空气，将所述内容物在室温下保持5小时从而进行所述蛋白质的还原反应。还原反应后，向其中加入2.5mg的一碘代乙酸从而在室温下进行30分钟的烷基化暗反应。反应结束后，用蒸馏水对所述反应混合物进行透析以便脱盐，然后进行冻干，将如此获得的粉末用作一种还原性烷基化NCE5。

将该粉末溶解在0.1M的碳酸氢铵缓冲液(pH8.0)中。将该溶液与基于蛋白质的约1/50摩尔量的胰蛋白酶(由Promega制造)混合并在37℃下反应过夜。通过利用172μ型的制备型HPLC***(由PE AppliedBiosystems制造)对所述的消化产物进行柱层析(柱子：C18220×2.1mm，0.1％TFA的5％乙腈至0.085％TFA的35％乙腈梯度)，分离出5种肽。每一种如此获得的肽片段的氨基酸序列通过492型的蛋白质测序仪(由PE Applied Biosystems制造)来进行测定。测得的结果如下所示：

T-28.8：Leu-Lys-Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg

(8个残基)(SEQ ID NO：4)

T-32.6：Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys

(6个残基)(SEQ ID NO：5)

T-35.9：Trp-Asp-Asn-Pro-Leu-Phe-Asp-Gly-Gly-Asn-Thr-Arg

(12个残基)(SEQ ID NO：6)

T-35.9：Glu-Trp-Cys-Cys-Ala-Cys-Tyr-Glu-Leu-Thr-Phe-Thr

(12个残基)(SEQ ID NO：7)

T-43.0：

Phe-ASp-Trp-Phe-Leu-Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Ser-Val-Asn-Trp-Arg

* * * * * * * (15个残基)(SEQ ID NO：8)

在通过肽作图获得的N-端氨基酸序列和氨基酸序列中，4种肽与由S.Takashima等(S.Takashima等，生物技术杂志，67，85-97(1999))报道的灰色腐质霉eg14序列相同。然而，在T-43.0中没有发现相同的序列。因此表明尽管所述序列具有同源性，但是它是不同的因而是一种新型蛋白质。

实施例3纤维素酶NCE5cDNA的克隆

(1)cDNA的分离和文库的制备

为了筛选纤维素酶组分NCE5的基因，从Humicola insolensMN200-1中制备mRNA并且通过利用反转录酶合成cDNA来制备一个文库。

(i)总RNA的制备

在纤维素酶诱导培养基，优选地是实施例1中记载的(N)培养基中将Humicola insolens MN200-1培养2天，然后通过离心(3500rpm，10分钟)回收细胞。用无菌水冲洗3g细胞，用液氮冷冻，然后在液氮中用研钵和研棒磨成粉状。利用ISOGEN(由Nippon Gene制造)以及按照其中所附的使用手册从如此粉碎的细胞中分离总RNA，通过甲醛琼脂糖凝胶电泳的着色图象来证实总RNA。

(ii)聚(腺苷酸)尾+RNA(＝mRNA)的制备

利用mRNA纯化试剂盒(由Amersham Pharmacia Biotech制造)并按照其中所附的使用手册将1mg步骤(i)中制备的总RNA上样到寡聚(dT)纤维素柱上，洗脱并分离mRNA。通过甲醛琼脂糖凝胶电泳的成片条带着色图象来证实mRNA。

(iii)cDNA的合成

利用Time Saver cDNA合成试剂盒(由Amersham Pharmacia Biotech制造)以及按照其所附的使用手册由5μg步骤(ii)中制备的mRNA合成cDNA。

(iv)cDNA文库的制备

将上述Time Saver cDNA合成试剂盒中含有的一个EcoRI-NotI连接物按照其中所附的使用手册连接到如此合成的总cDNA的平端。利用版本2DNA连接试剂盒(由Takara Shuzo制造)将全部所述的DNA片段连接到一种噬菌体载体λZAP II克隆试剂盒(由Stratagene制造)的EcoRI臂上，进行乙醇沉淀，然后溶解到TE缓冲液(10mM Tris-HClpH8.0，0，1mM EDTA)中。利用Gigapack III与包装提取物(由Stratagene制造)并且按照其中所附的使用手册对如此获得的重组噬菌体载体进行体外包装。然后，将大肠杆菌XL1-Blue MRF′用该重组噬菌体感染后在平板培养基上进行培养，将如此形成的噬菌斑用作噬菌体文库。利用该文库，克隆目的基因。

(2)通过PCR扩增DNA及其分析

以在步骤(1)-(iii)中制备的cDNA作为模板并基于实施例2的部分氨基酸序列的信息，通过PCR扩增DNA。

制备下列与由*所示肽T-43.0的N-端和部分氨基酸序列对应的合成寡核苷酸作为引物。

N-端：5′-TAY TGG GAY TGY TGY AAR CC-3′

(20聚体)(SEQ ID NO：9)

T-43.0：5′-TCI GCR TTI ARR AAC CAR TC-3′

(20聚体)(SEQ ID NO：10)

以1μg的cDNA作为模板，在下列条件下于含1.25个单位的LA TaqDNA聚合酶(由Takra Shuzo制造)和其中所附的缓冲液、0.2mM dNTP、10％DMSO和1μM的各种引物的50μl反应溶液中进行PCR。在94℃下保持1分钟，(94℃，30秒钟，55.0℃，30秒钟，72.0℃，1分钟)x 25次，然后在72.0℃下保持5分钟。

通过该反应扩增了一个约500bp的DNA片段，利用DYEnamic ET终止子循环测序预混试剂盒(由Amersham Pharmacia Biotech制造)和ABI PRISM 310基因分析仪(由PE Applied Biosysytems制造)并按照其中所附的使用说明书进行序列测定。结果，由如此测定的核苷酸序列推导出的氨基酸序列含有所有实施例2中获得的部分氨基酸序列。因此，将该序列作为以下筛选实验中的一个探针。

(3)纤维素酶组分NCE5基因的克隆

(i)通过噬菌斑杂交的筛选

将通过PCR扩增的100ng的500bp DNA片段预先用ECL直接DNA/RNA标记检测***(由Amersham Pharmacia Biotech制造)进行标记。

将在(1)-(iv)中制备的噬菌斑转移到Hybond-N+尼龙转移膜(由Amersham Pharmacia Biotech制造)上，采用0.4N氢氧化钠进行碱处理从而使膜上的重组噬菌体DNA变性为单链DNA，用5x SSC(1x SSC：15mM柠檬酸三钠，150mM氯化钠)冲洗，然后风干固定所述的DNA。接下来，按照试剂盒中的使用手册进行杂交和检测反应，然后对富士医用X光胶片(FUJI MEDICAL X-RAY FILM)(由Fuji Photo Film制造)进行感光处理从而得到6个阳性克隆。

(ii)噬菌体DNA的制备

按照试剂盒所附的使用手册由阳性克隆制备作为质粒DNA的DNA。

由氨苄青霉素抗性大肠杆菌菌株SOLR^TM制备一种其中所述DNA片段被克隆到pBluescript SK(-)中的质粒，在与上述相同的条件下以所述质粒为模板并利用步骤(2)中使用的N-端和T-43.0引物进行PCR.结果，从一个质粒中得到一个500bp的扩增产物。由于据推定所述目的DNA被克隆到了该质粒中，所以采用EcoRI进行消化并进行琼脂糖凝胶电泳。

结果表明，所述质粒含有一个大约1kbp的EcoRI片段。

(4)cDNA核苷酸序列的测定

***到步骤(3)-(ii)中获得的阳性重组pBluescript SK(-)质粒中的大约1kbp的EcoRI片段的核苷酸序列通过利用T3和T7引物的相同方法来测定。结果，该核苷酸序列含有一个672bp可读框，由该可读框分别推导出的核苷酸序列和氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1表示。

而且，由于从所推导出的这种蛋白质的N-端数第18位氨基酸以后的序列与实施例2的步骤(1)中测定的25kDa蛋白质的N-端序列相同，所以表明该基因编码25kDa蛋白质。

另外，还认为所述可读框的第1个至第18个氨基酸的序列是一个用于将所述蛋白质分泌到胞外部分的信号序列。

实施例4NCE5基因在Humicola insolens中的表达

按照下述方式利用按照国际公布WO 00/24879中记载的方法获得的质粒pJD01构建一种在Humicola insolens MN200-1中使用的表达载体。

(1)NCE5表达质粒pJND-c5的构建

(i)向NCE5基因中引进定点突变

通过PCR扩增所述NCE5基因，该PCR中使用的引物是按照下述方式进行设计的：正好处于起始密码子上游以及正好处于终止密码子下游的序列预先含有BamHI，因此它们可以连接到质粒pJD01的BamHI位点上。用于诱变的引物设计如下。

NCE5-N-BamHI

5’-GGGGATCCTGGGACAAGATGCAGCTCCCCCTGACCACG-3’

(38聚体)(SEQ ID NO：11)

NCE5-C-BamHI

5’-GGGGATCCTGCATTTAACGCGAGCAGCCGCTCTTGGCC-3’

(38聚体)(SEQ ID NO：12)

在相同的条件下以实施例3中获得的阳性重组pBluescript SK(-)质粒作为模板进行PCR反应。结果，通过1.0％的琼脂糖凝胶电泳证实获得了一个约670bp的DNA片段扩增产物。然后，通过Micro Spin S-400HR柱(由Amersham Pharmacia Biotech制造)除去未反应的物质，所述产物用乙醇进行沉淀并用BamHI进行消化。接下来，对全部产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳，利用Sephaglas BandPrep试剂盒(由AmershamPharmacia Biotech制造)并按照所附的使用手册回收该670bp的DNA片段，并将它的BamHI片段亚克隆到质粒pUC118的BamHI位点，从而获得一个如图1所示的质粒pNCE5Bam。然后通过上述方法测定和证实***片段的核苷酸序列。

(ii)质粒pJND-c5的制备

国际公布WO 00/24879中记载的质粒pJD01被BamHI所消化并通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，利用Sephaglas BandPrep试剂盒回收约8.0Kbp的DNA片段并利用一种大肠杆菌碱性磷酸酶(由TakaraShuzo制造)和按照所附的使用手册进行脱磷酸化。并且，以相同的方式采用BamHI消化上述步骤(i)中获得的质粒pNCE5Bam，回收到一个670bp DNA片段并利用版本2的DNA连接试剂盒进行连接从而获得一个如图2所示的表达质粒pJND-c5。

(2)用质粒pJND-c5转化Humicola insolens

于37℃下在一种(S)培养基中将Humicola insolens MN200-1培养24小时，然后通过以3000rpm离心10分钟收集细胞。所述(S)培养基具有一种以葡萄糖(3.0％)取代了实施例1中所述的(N)培养基中的Avicel的组成。如此获得的细胞用0.5M的蔗糖进行冲洗然后被悬浮在10ml的形成原生质体的酶溶液(3mg/ml β-葡萄糖醛酸酶，1mg/ml壳多糖酶，1mg/ml酶解酶，0.5M蔗糖)中，该酶溶液已通过0.45μm滤器进行了过滤。通过于30℃下振荡60至90分钟，将所述菌丝制备成原生质体。将该悬浮液进行过滤，然后以2500rpm离心10分钟从而回收到原生质体，然后用SUTC缓冲液(0.5M蔗糖，10mM氯化钙，10mM Tris-HCl(pH 7.5))进行冲洗。

将如此制备的原生质体悬浮在1ml的SUTC缓冲液中，将100μl的该悬浮液与10μg的DNA(TE)溶液(10μl)进行混合后在冰浴中保持5分钟。接下来，与400μl的PEG溶液(60％PEG4000，10Mm氯化钙，10mM Tris-HCl(pH 7.5))混合，将该混合物在冰浴中保持20分钟，与10ml的SUTC缓冲液混合，然后以2500rpm离心10分钟。将如此收集的原生质体悬浮在1ml的SUTC缓冲液中，以4000rpm离心5分钟并最终悬浮在100μl的SUTC缓冲液中。

将如此处理的原生质体与YMG软琼脂一起铺在一种含潮霉素(200μg/ml)的YMG培养基(1％葡萄糖、0.4％酵母提取物、0.2％麦芽提取物、1％琼脂(pH6.8))上并在37℃下培养5天，将如此形成的菌落用作转化体。

实施例5pJND-c5转化体的培养和鉴定

(1)通过SDS-PAGE进行评价

将质粒pJND-c5引进上述的Humicola insolens MN200-1中并筛选出40个具有潮霉素抗性的菌株。利用(N)培养基将这些菌株在37℃下培养5天，通过12％-SDS-PAGE mini(由Tefco制造)电泳分析如此获得的培养物上清液，结果发现12个克隆中的一种被认为是NCE5的25kDa蛋白质的含量增加得尤其明显。

(2)重组NCE5的N-端氨基酸残基的鉴定

为了证实在上述步骤(1)中大量表达的所述蛋白质是由NCE5基因编码的，对该蛋白质的N-端氨基酸序列进行了测定。首先，通过12％-SDS-PAGE mini电泳对所述培养物上清液进行分离，按照实施例2中的方法将得到的蛋白质电转移到一种PVDF膜上，分子量为25kDa的蛋白质经过处理除去了其被修饰的N-端氨基酸残基后进行蛋白质序列的测定。结果，其序列与由质粒pJND-c5的核苷酸序列推导出的纤维素酶NCE5的N-端氨基酸序列一致。

实施例6评价由Humicola insolens表达的NCE5磨蚀被染色的粗斜纹布含纤维素织物的活性

在下述条件下，利用实施例5中获得的表达NCE5基因的Humicolainsolens的培养液以及Humicola insolens的培养液，对一条退浆12盎司的蓝色牛仔裤进行磨蚀处理。按照国际公布WO 98/03640的说明书通过对将表达质粒pEGD01引进Humicola insolens MN200-1后得到的转化体进行振荡培养来得到表达NCE4基因的Humicola insolens的培养液。在37℃下利用(N)培养基将所述转化体振荡培养5天。所述Humicola insolens的培养液通过在37℃下将Humicola insolensMN200-1振荡培养5天来得到。

试验机器：20kg涤衣机

(由Sanyo Electric制造的全自动洗衣机SCW 5101)

温度：65℃

时间：60分钟

pH：6.2(6.7mM磷酸盐缓冲液)

向处理溶液中加入适量的橡胶球和每种纤维素酶制剂的溶液。

利用分光光度计(由Minolta制造，CM-525i)测定一种实验室显示***L值(亮度)来作为磨蚀度。通过计算相对对照(未处理的织物)增加的L值(增加的亮度)，即ΔL值，来评估磨蚀度，也就是说，对每种测试的粗斜纹布测定10个点的ΔL值(n＝10)，然后计算出它们的平均值。在此基础上，计算出作为获得ΔL值约为6所必需的蛋白质的内切葡聚糖酶的浓度。

通过利用蛋白质测定试剂盒(由Bio-Rad实验室制造)制作牛血清白蛋白的标准曲线来测定所述蛋白质的浓度。

结果见表1。

表1

实施例7评价由Humicola insolens表达的NCE5在磨蚀被染色的粗斜纹布含纤维素织物的过程中的逆染色

在各种温度下利用实施例5中获得的表达NCE5基因的Humicolainsolens的培养液和表达NCE4基因的Humicola insolens的培养液对被染色的粗斜纹布含纤维素织物进行磨蚀。需要加入的酶浓度被定义为在65℃下获得ΔL值大约为6所必需的量。

试验结束后，为了评估逆染色，利用分光光度计(由Minolta制造，CM-525i)以实验室显示***L值(亮度)的形式测定缝在所述被染色的粗斜纹布含纤维素织物组织上的一块白棉布的白度。L值较高意味着白布较白且逆染色度较低。

所述结果见表2。与NCE4相比，在每一反应温度下，NCE5都具有较高的磨蚀度和较低的逆染色度，因此该结果表明NCE5的逆染色度较低。

表2

实施例8利用耐洗牢度试验仪评价由Humicola insolens表达的NCE5去除再生纤维素织物上的绒毛的作用

按照下述方式评价实施例5中获得的由Humicola insolens表达的NCE5从再生纤维素织物的一个典型例子，lyocell进行上去除绒毛的活性。

在一个大洗衣机中与一种表面活性剂和橡胶球一起进行洗涤，使得一块被预先染色的lyocell针织布(由日本Toyoshima制造)的表面起毛。然后在下列条件下对这种起毛的lyocell针织布(由日本Toyoshima制造，10cm x 10cm)进行去除lyocell绒毛的处理从而计算出完全去除所形成的绒毛所需要的由Humicola insolens表达的NCE5的蛋白质浓度。

试验机器：涤衣机L-12

(日本Daiei Kagaku Seiki MFG。)

温度：55℃

时间：60分钟

反应溶液：40ml

反应pH：pH 5(10mM醋酸盐缓冲液)

向处理溶液中加入适量的橡胶球和所述的内切葡聚糖酶溶液。

结果表明通过加入蛋白质浓度为6mg/L的酶完全去除了所述的绒毛。

实施例9评价由Humicola insolens表达的NCE5当被配制成洗涤剂时去除棉织品上的绒毛的作用

按照下述方式评价实施例5中获得的由Humicola insolens表达的NCE5去除棉织品上的绒毛的活性。即在一个大洗衣机中利用实施例5中制备的表达NCE5的Humicola insolens培养物上清液与一种表面活性剂和橡胶球一起进行洗涤，使得一块针织棉布(2cm x 15cm)的表面起毛。然后在下列条件下进行去除绒毛的处理。计算出完全去除所形成的绒毛所需要的蛋白质浓度。

试验机器：涤衣机L-12

(日本Daiei Kagaku Seiki MFG.)

温度：40℃

时间：120分钟

反应溶液：40ml

反应pH：pH9.3

(5mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)

(非离子表面活性剂)

Persoft NK-100(由Nippon Oil&Fats制造)0.20g/L

(阴离子表面活性剂)

LAS(由Wako Pure Chemical Industries制造)0.10g/L

结果表明通过加入蛋白质浓度为45mg/L的酶完全去除了所述的绒毛并使得布的颜色能够变得澄明。

另外，还按照JIS L1096的45°悬臂式方法测定了棉针织物的抗弯曲性。结果表明如果不加入所述的酶处理，被测试的针织棉布片的迁移长度为127mm，如果加入15mg/L(蛋白质浓度)的NCE5进行处理，被测试的针织棉布片的迁移长度为81mm，显然它被软化了。

实施例10评价由Humicola insolens表达的NCE5提高纸浆的打浆度的效果

将蛋白质量为60μg的表达NCE5的Humicola insolens培养液加到6g干重的来源于宽叶树的未漂白牛皮纸浆中，然后在50℃下于270ml的50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中反应1小时。通过将所述混合物煮沸10分钟使得所述酶失活，然后按照JIS P-8121测定打浆度(CSF)。

结果见表3。

表3

本文引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容被引入本申请的说明书中作为参考。

工业实用性

本发明的内切葡聚糖酶NCE5可被用于洗涤剂组合物中而且还可用于使废纸脱墨、提高纸浆的打浆度和改善含纤维素织物的性能，如绒毛的去除、手感及外观的改善、使颜色澄明、颜色的局部改变和硬挺度的降低。

<110>Meiji Seika Kaisha，Ltd.

<120>含内切葡聚糖酶NCE5的纤维素酶制剂

<130>PH-1228-PCT

<160>12

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>223

<212>PRT

<213>Humicola insolens

<400>1

Met Gln Leu Pro Leu Thr Thr Leu Leu Thr Leu Leu Pro Ala Leu Ala

1 5 10 15

Ala Ala Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys

20 25 30

Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr

35 40 45

Cys Asp Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser

50 55 60

Gly Cys Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro

65 70 75 80

Trp Ala Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Ash Ile

85 90 95

Ala Gly Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr

100 105 110

Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser

115 120 125

Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro

130 135 140

Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala

145 150 155 160

Pro Pro Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His

165 170 175

Glu Cys Asp Ala Phe Pro Glu Lys Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg

180 185 190

Phe Asp Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln

195 200 205

Val Ser Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg

210 215 220

<210>2

<211>672

<212>DNA

<213>Humicola insolens

<400>2

atgcagctcc ccctgaccac gctcctcacc ctcctccccg ccctcgcggc ggcccagtcc 60

ggcagcggcc gcaccacgcg ctactgggac tgctgcaagc cgtcgtgcgc gtggcccggc 120

aagggcccgg cgcccgtgcg gacgtgcgac cggtgggaca acccgctgtt cgacggcggc 180

aacacgcgca gcgggtgcga cgcgggcggc ggcgcctaca tgtgctcgga ccagagcccg 240

tgggcggtca gcgacgacct ggcgtacggc tgggcggccg tcaacattgc cggctccaac 300

gagaggcagt ggtgctgcgc ctgctacgag ctgaccttca ccagcgggcc ggtggcgggc 360

aagaggatga ttgtgcaggc gagcaacacg ggaggcgatt tggggaacaa ccactttgat 420

attgctatgc ccggcggtgg cgtcggtatc ttcaacgcct gcaccgacca gtacggcgcg 480

ccccccaacg gctggggcca gcgctacggc ggcatcagcc aacgccacga gtgcgacgcc 540

ttccccgaga agctcaagcc cggctgctac tggcgctttg actggttcct caacgccgac 600

aacccgagcg tcaactggcg gcaggtcagc tgcccggccg agattgtggc caagagcggc 660

tgctcgcgtt aa 672

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>Humicola insolens

<400>3

Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser

1 5 10 15

Cys Ala Trp Pro

20

<210>4

<211>8

<212>PRT

<213>Humicola insolens

<400>4

Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg

1 5

<210>5

<211>6

<212>PRT

<213>Humicola insolens

<400>5

Tyr Trp Asp Cys Cys Lys

1 5

<210>6

<211>12

<212>PRT

<213>Humicola insolens

<400>6

Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg

1 5 10

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>Humicola insolens

<400>7

Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr

1 5 10

<210>8

<211>15

<212>PRT

<213>Humicola insolens

<400>8

Phe Asp Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg

1 5 10 15

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<223>合成序列的描述：合成DNA

<400>9

taytgggayt gytgyaarcc 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<223>合成序列的描述：合成DNA

<220>

<221>n

<222>3

<223>肌苷

<220>

<221>n

<222>9

<223>肌苷

<400>10

tcngcrttna rraaccartc 20

<210>11

<211>38

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<223>合成序列的描述：合成DNA

<400>11

ggggatcctg ggacaagatg cagctccccc tgaccacg 38

<210>12

<211>38

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<223>合成序列的描述：合成DNA

<400>12

ggggatcctg catttaacgc gagcagccgc tcttggcc 38

Claims

1.一种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，该蛋白质由SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列第19位至第223位的序列组成。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述的蛋白质在N-端侧还含有SEQ ID NO：1所示的从第1位至第18位的氨基酸序列的一部分序列或全部序列。

3.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中该蛋白质来源于霉菌。

4.如权利要求3所述的蛋白质，其中所述霉菌属于腐质霉属。

5.如权利要求4所述的蛋白质，其中所述霉菌属于Humicolainsolens。

6.一种DNA，由编码权利要求1至5中任一项权利要求所述的蛋白质的DNA序列组成。

7.一种DNA，由SEQ ID NO：2所DNA序列组成。

8.一种含有如权利要求6或7所述的DNA序列的表达载体。

9.一种被权利要求8所述的表达载体转化的宿主细胞。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种酵母菌或霉菌。

11.如权利要求10所述的宿主细胞，其中所述酵母菌属于糖酵母属、汉逊氏酵母属或毕赤氏酵母属。

12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述酵母菌是啤酒糖酵母。

13.如权利要求10所述的宿主细胞，其中所述霉菌属于腐质霉属、曲霉属、木霉属、镰孢属或支顶孢属。

14.如权利要求10所述的宿主细胞，其中所述霉菌是Humicolainsolens、黑曲霉或米曲霉、绿色木霉、尖孢镰孢或纤维素溶解支顶孢。

15.一种制备如权利要求1至5中任一项权利要求所述的蛋白质的方法，包括以下步骤：培养权利要求9至14中任一项权利要求所述的宿主细胞，然后从所述宿主细胞和/或其培养混合物中收集如权利要求1至5中任一项权利要求所述的蛋白质。

16.一种通过权利要求15所述方法制备的内切葡聚糖酶。

17.一种纤维素酶制剂，其含有如权利要求1至5和权利要求16中任一项权利要求所述的蛋白质。

18.一种处理含纤维素织物的方法，其包括一个使得所述含纤维素织物与权利要求1至5和权利要求16中任一项权利要求所述的蛋白质接触或与权利要求17所述的纤维素酶制剂接触的步骤。

19.一种降低含纤维素织物的起毛率或减少含纤维素织物中产生绒毛的方法，其包括一个使得所述含纤维素织物与权利要求1至5和权利要求16中任一项权利要求所述的蛋白质接触或与权利要求17所述的纤维素酶制剂接触的步骤。

20.一种对含纤维素织物进行失重处理从而改进其手感和外观的方法，其包括一个使得所述含纤维素织物与权利要求1至5和权利要求16中任一项权利要求所述的蛋白质接触或与权利要求17所述的纤维素酶制剂接触的步骤。

21.一种使有色的含纤维素织物的颜色澄明的方法，其包括一个采用权利要求1至5中任一项权利要求和权利要求16所述的蛋白质或权利要求17所述的纤维素酶制剂对有色的含纤维素织物进行处理的步骤。

22.一种使有色的含纤维素织物发生局部颜色改变的方法，其包括一个采用权利要求1至5和权利要求16中任一项权利要求所述的蛋白质或权利要求17所述的纤维素酶制剂对有色的含纤维素织物进行处理的步骤。

23.一种降低含纤维素织物变得硬挺的速率或降低含纤维素织物硬挺度的方法，其包括一个采用权利要求1至5和权利要求16中任一项权利要求所述的蛋白质或权利要求17所述的纤维素酶制剂对含纤维素织物进行处理的步骤。

24.如权利要求18至23中任一项权利要求所述的方法，其中通过浸泡、洗涤和漂洗织物来对织物进行处理。

25.一种洗涤剂添加剂，其含有以一种非散射颗粒形式或一种稳定化液体形式存在的权利要求1至5和权利要求16中任一项权利要求所述的蛋白质或权利要求17所述的纤维素酶制剂。

26.一种洗涤剂组合物，其含有权利要求1至5和权利要求16中任一项权利要求所述的蛋白质或权利要求17所述的纤维素酶制剂。

27.一种用于废纸脱墨的方法，该方法包括在一个通过采用脱墨剂处理废纸来进行脱墨的步骤中使用权利要求1至5和权利要求16中任一项权利要求所述的蛋白质或权利要求17所述的纤维素酶制剂。

28.一种提高纸浆的打浆度的方法，该方法包括一个采用权利要求1至5和权利要求16中任一项权利要求所述的蛋白质或权利要求17所述的纤维素酶制剂处理纸浆的步骤。

29.一种改善对动物饲料的消化能力的方法，该方法包括一个采用权利要求1至5和权利要求16中任一项权利要求所述的蛋白质或权利要求17所述的纤维素酶制剂对含纤维素纤维进行处理的步骤。