JP2690339B2 - 新規プロテアーゼ - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ノカルジオプシス(Nocardiopsis)のプロ
テアーゼ産生菌株、アルカリプロテアーゼの製造方法、
ノカルジオプシス(Nocardiopsis)に由来するアルカリ
プロテアーゼ調製物、洗剤添加剤および酵素洗剤添加剤
に関する。 発明の背景 バシラス(Bacillus)属に属する微生物を適当な栄養
培地中で培養して生産されるタンパク分解酵素は、洗剤
組成物において広く使用されている。かかる商業的に入
手可能なプロテアーゼ生産物の例は、アルカラーゼ(AL
CALASE(商標))、エスペラーゼ(ESPERASE(商
標))、サビナーゼ(SAVINASE(商標))であり、これ
らは全てノボ・インダストリー(NOVO INDUSTRIA/S,Den
mark)から供給される。これらおよび他の供給者に由来
する類似のバシラス(Bacillus)産生酵素生産物は、pH
値8〜11の範囲内で、そして通常の洗剤溶液中に存在す
る金属イオン封鎖剤、界面活性剤および漂白剤の存在す
る洗剤溶液中で酵素活性を有する。 ALCALASE(商標)中のプロテアーゼは、バシラス・リ
ケニフォルミス(Bacillus licheniformis)種の菌株の
培養により生産される。ESPERASE(商標)およびSAVINA
SE(商標)中のプロテアーゼは、好アルカリ性バシラス
種、例えばそれぞれNCIB 10147およびNCIB 10309菌株の
培養により得ることができる。商業的に入手可能なアル
カリプロテアーゼの至適温度は、約60℃である。しかし
ながら、これらの市販の酵素は、室温で相対的により低
い活性を示す。 発明の概要 本発明は、アクチノミセス類の微生物に由来する新規
なアルカリプロテアーゼの生産、単離、特性決定および
使用に関する。本発明のプロテアーゼは、従来アルカリ
プロテアーゼを生産することが知られていないアクチノ
ミセスに属するノカルジオプシス・エスピー(Nocardio
psis sp.)10R株およびノカルジオプシス・ダッソンビ
レイ(Nocardiopsis dassonvillei)M58−1株から単離
される。本発明で開示されるプロテアーゼは洗濯のため
の洗剤添加剤として有用である。東ドイツ特許、No.DD
2,004,328号に記載されるノカルジオプシス・ダッソン
ビレイ(Nocardiopsis dassonvillei)菌株のZIMET4364
7株は、繊維素溶解性および生物学的スラッジの浄化を
目的とするプロテアーゼを生産することが知られてい
る。しかしながら、この菌株は、公衆にとって入手可能
でなく、基準菌株はプロテアーゼを生産せず、そしてこ
の種のいかなる他の菌株もプロテアーゼを生産すること
が知られていない。さらに、前述した特許のプロテアー
ゼは、本発明のプロテアーゼの温度分布および至適pHか
ら非常に相違する性質を有する。 第3図では、本発明のノカルジオプシス・エスピーの
プロテアーゼに対するpH分布が、特許のZIMET43647株に
由来するプロテアーゼについて報告されているものと比
較された。同じ実験条件下で、10R株とM 58−1株は両
方とも至適pH8を有するが、一方ZIMET43647のプロテア
ーゼのそれは、9〜10である。さらに、本発明のプロテ
アーゼは、広範囲の至適pHを有し、pH7〜11の間で極大
活性の少なくとも60%を示している。ZIMET43647のプロ
テアーゼは、pH7において極大活性の50%を有するにす
ぎず、そしてpH11では極大活性の0%である。pH11にお
ける高いタンパク分解活性の発現は、洗剤添加剤にとっ
て特に重要である。 本発明のプロテアーゼに対する温度分布は、ZIMET436
47に由来するプロテアーゼに対して報告されているそれ
と、第4図において比較された。40℃と50℃間では、ZI
MET43647のプロテアーゼは、その至適活性の70〜100%
を示し、本発明のプロテアーゼにより示される値(即
ち、25〜65%)より大きい。 前述した相違の他に、本発明の菌株におけるプロテア
ーゼの生産は、無機塩の添加に対して異なる応答をす
る。本発明の菌株は、無機塩が増殖培地に添加されても
されなくとも同じ程度のプロテアーゼ活性物を生産す
る。ZIMET43647菌株は、増殖培地へ無機塩の添加により
改良された応答を示すことが報告されていて、メタロプ
ロテアーゼの存在の可能性を示している。第2b図に明確
に示されるように、本発明のプロテアーゼは、いかなる
検出可能なメタロプロテアーゼ活性も持たない。 本発明のノカルジオプシス・エスピー10R株およびノ
カルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株のプロテア
ーゼは、商業的に入手可能なバシルスのプロテアーゼに
比し、低い洗濯温度、例えば冷水、いわば15〜25℃にお
ける洗剤添加剤として特に効果的である。さらに、本発
明のノカルジオプシス・エスピー10R株およびノカルジ
オプシス・ダッソンビレイM 58−1株のプロテアーゼ
は、バシラスのプロテアーゼより生ずるタンパク加水分
解パターンから相違するそのパターンを生ずる。 多くの類似点、即ち、至適pHおよび温度、安定性、イ
ンシュリン消化パターンを有するにもかかわらず、ノカ
ルジオプシス・エスピー10R株およびノカルジオプシス
・ダッソンビレイM 58−1株に由来するプロテアーゼ
は、識別することができる。例Vに記載されるように、
両プロテアーゼの分子量は、相違する(10Rについて
は、23,500〜25,000、M 58−1については、20,500)。
その上、2つのプロテアーゼの等電点は、相違する〔10
Rについては、p I9.5、M 58−1については、p I=9.
15および8.2(2個のバンド)〕。さらに、10Rのプロテ
アーゼに対する抗体は、M 58−1のプロテアーゼに対し
てほんの部分的な同一性を示すにすぎず、そしてその逆
も同様である。 発明の検討 現在、プロテアーゼについては、洗剤工業での利用を
含む多くの商業的用途がある。以下の、新規なノカルジ
オプシス・エスピー10R株およびノカルジオプシス・ダ
ッソンビレイM 58−1株のプロテアーゼの詳細な検討
は、洗剤添加剤としての使用法に限定されている。しか
し、さらに本発明者等は、タンパク分解酵素に対する他
の用途も必ず存在することを認識している。 酵素は、pH、温度、および洗剤としての使用ではEDTA
のような金属イオン封鎖剤の存在を含む使用法の条件に
影響されることが認識されなければならない。従って、
高温(60℃)で綿織物を洗濯するために開発されたSAVI
NASE(商標)のようなバシラスのプロテアーゼは、多く
の昨今の織物について勧められる低い洗浄温度(15〜25
℃)において効果的でないかも知れない。 第4表で明らかなように、同じ酵素活性レベルで使用
した場合、ノカルジオプシス・エスピー10R株およびノ
カルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株に由来する
新規なアルカリプロテアーゼを含んでなるプロテアーゼ
配合物は、 SAVINASE(商標)プロテアーゼよりも、15℃における模
擬洗濯条件下で、綿(EMPA 116)上のタンパクに基づく
よごれを白くするための能力が約20〜50%優れることを
示す。 発明の詳細な記載 本発明のさらにそのほかの態様によれば、アルカリプ
ロテアーゼの製造方法が提供され、この方法は、プロテ
アーゼ産生ノカルジオプシス・エスピー(Nocardiopsis
sp.)の菌株を、資化し得る炭素源、窒素源およびリン
源を含有する栄養培地中、好気的条件下で培養し、次い
で発酵ブロスからプロテアーゼ製品を回収することを特
徴とする。 さらに本発明の理解のために、ここで添付した図面に
ついて言及する: 第1図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株に由来
するプロテアーゼ並びにバシラスのプロテアーゼ生産物
ALCALASE(商標)、ESPERASE(商標)およびSAVINASE
(商標)によるインシュリンの酸化型B−鎖処理の15分
および2.5時間後の消化生成物の溶出クロマトグラムを
示す。ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株に
由来するプロテアーゼは、ノカルジオプシス・エスピー
10R株に対する消化生成物と同様なものを与えた(デー
タは示していない)。 第2図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株のカゼ
インに対する活性をpHおよび温度の関数として図示す
る。さらにまた、EDTA(10mM)およびフェニルメチルス
ルホニルフルオライド(PMSF、1mM)の影響を示した。
ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株に由来す
るプロテアーゼは、PMSFについては10R株と類似の挙動
をするが、しかしEDTAは活性を阻害しない。これらの結
果は、10R株およびM 58−1株に由来するプロテアーゼ
は、セリンプロテアーゼであり、メタロプロテアーゼで
ないことを示す。 第3図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株、ノカ
ルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株および特許の
ZIMET43647株間の至適温度の相違を示す。 第4図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株、ノカ
ルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株および特許の
ZIMET43647株間の至適温度の相違を示す。 微生物 本発明の微生物は、ノカルジオプシス(Nocardiopsi
s)の好気性の放射菌に属する。 2つの菌株は、米国のアグリカルチュラル・リサーチ
・コレクション(Agricultural Research Collection)
(NRRL)にブタペスト条約の条件下で次のごとく寄託さ
れている。 寄託者の参照記号 10R M 58−1
寄託番号 NRRL 18262 NRRL18133
寄託日 1987年11月10日 1986年11月13
日 分類名称 Nocardiopsis sp. N.dassonvill
ei 当該技術分野で既知の方法により得られるこれらの菌
株の変異株および変異体もまた、本発明の範囲内にあ
る。 両菌株とも増殖温度は、20℃〜30℃であり、35℃超で
は増殖しない。増殖のための至適pHは、9であり、そし
てpH8未満ではいかなる増殖も生じない。前記の増殖パ
ラメーターは、特許のZIMET43647菌株のものと相違す
る。ZIMET株は、25〜37℃(好ましくは28℃)の温度お
よびpH6.5〜7.2の酸性度で培養される。 ノカルジオプシス・エスピー(Nocardiopsis sp.)株
のツアペック・ドックス(Czapek Dox)寒天スラント上
での成熟コロニーは、黒い分泌を伴う灰−緑の気中菌糸
を示す。ノカルジオプシス・ダッソンビレイ(Nocardio
psis dassonvillei)M 58−1株のツアペック・ドック
ス寒天スラント上での成熟コロニーは、白からクリーム
に着色した気中菌糸を有する。典型的なノカルジオプシ
ス・ダッソンビレイ菌株は、かすかな黄−灰色を伴なう
青白い気中菌糸を有する。 ノカルジオプシス・ダッソンビレイ(Nocardiopsis d
assonvillei)(ATCC 23218)の基準株は、本発明のプ
ロテアーゼを産生しない。基準株(ATCC 23218)および
本発明の分離株ノカルジオプシス・エスピー(Nocardio
psis sp.)は、相違する変異株であると信じられる。さ
らに、10R株およびM 58−1株は、一般的なプロトプラ
スト化試薬、卵白リゾチームおよびノボザイム(NovoZy
m(商標))234に対する応答により相互に他のものから
相違する。10R株は、リゾチームおよび/またはZovoZym
(商標)234により細胞壁が溶解されないが、一方M 58
−1株は、リゾチーム単独でプロトプラスト化すること
ができる。典型的なノカルジオプシス・ダッソンビレイ
株は、リゾチームに感受性である(M.C.Shearer等、In
t.J.Syst.Bacteriol 33:369−374,1983)。これらは、
10R株の細胞壁ペプチドグリカンの結合が、M 58−1株
のそれとおそらく相違することを示している。細胞壁の
分類学的な解析は、10R株が新菌種であるかなりの可能
性を有することを示している。10R株についてのさらに
詳細な分類学的な同定は、実施中である。 タンパク分解活性に対するアッセイ ノカルジオプシス・エスピー培養物中のタンパク分解
活性は、周知のアンソン(Anson)ヘモグロビン法によ
り測定した(Journal of General Physiology, 22,79
−89,1959、参照)。1アンソン単位は、タンパク分解
酵素がpH9.0および温度25℃において、10分の反応時間
中にヘモグロビンを分解し、そこに形成されるトリクロ
ロ酢酸で沈殿され得ない分解生成物が、フェノール試薬
により1分当たりにチロシン1ミリ当量の量と同一の着
色を与える初速度を有するタンパク分解酵素の量であ
る。 また、タンパク分解活性は、カゼインの加水分解、次
いでTCA可溶性タンパクとo−フタールジアルデヒドお
よび2−メルカプトエタノールとの反応により測定し
た。得られる複合体の吸収を、340nmで測定し、セリン
標準と比較した。反応混合物は、2.0%(w/v)のハメル
スタイン(Hammerstein)カゼイン1.0ml及び適当な酵素
希釈液0.5ml〔いずれもBrittonおよびRobinsonユニバー
サル緩衝液(Univarsal Buffer)I(pH 9.5)(J.Che
m.Soc.1931,1451頁)中〕からなる。混合物を25℃で30
分間インキュベートした後、2.5mlの停止剤〔脱イオン
水中、3.6(w/v)%のトリクロロ酢酸、6.0(w/v)%の
酢酸ナトリウムおよび3.78(v/v)%の氷酢酸〕を加え
て反応を停止した。対照の反応物では、酵素を添加する
前に停止剤を添加した。25℃で20分後、反応混合物をワ
ットマン濾紙#42を通して濾過するか、または遠心し
た。 濾液の既知量(200μ)を、0.05Mの四硼酸ナトリウ
ム、1(w/v)%のドデシルスルホン酸ナトリウム、0.8
mg/mlのo−フタルジアルデヒド(OPA)(最初はエタノ
ールの40mg/ml溶液として溶解している)および0.2(v/
v)%の2−メルカプトエタールを含有するOPA試薬3ml
に添加した。2分後に340nmにおける吸収を測定した。
同様に、セリンの標準(0.2mg/ml)200μを、OPA試薬
3mlに添加し、そしてA340を測定した。活性は、CPU(カ
ゼインプロテアーゼ単位)で表示されるが、ここで1 CP
Uとは、標準的な条件下で、セリン1mmolに相当する、1
分当たりのTCAで沈殿しない分解生成物の量を生成する
酵素量として定義される。 プロテアーゼ濃厚物の調製 本発明のノカルジオプシスは、他の微量栄養素と共に
資化し得る炭素および窒素源を含有する栄養培地であっ
て、原則的に公知技術に従って構成されている栄養培地
において、好気条件下で培養することができる。 好ましい炭素源は、グルコースおよびマルトースのよ
うな炭水化物か、または穀類の種子、麦芽、米およびモ
ロコシのような物質を含有する炭水化物である。培地に
取り込まれる炭水化物濃度は、非常に広範囲、グルコー
スと等価のものとして計算されるパーセントで、例えば
1〜15%であってもよいが、通常8〜11%が好ましいで
あろう。 栄養培地中の窒素源は、有機天然物であり得る。有機
窒素源の中で非常に数多くのものが、アクチノミセス類
の培養に関連する発酵工程において通常使用される。例
えば、大豆粉、綿実粕、ピーナッツ粉、カゼイン、コー
ン・スティープ・リカー、酵母エキストラクトおよびア
ルブミンが挙げられる。さらにまた、栄養培地は、通常
の微量物質を含有せしめる。 本発明のノカルジオプシス菌株は、好冷性であるた
め、これらは、35℃以上で増殖することができず、培養
は20℃〜30℃の温度で、かつアルカリのpH値で行うのが
好ましい。アルカリpHは、適当な緩衝剤、例えば炭酸ナ
トリウムまたは炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの
混合物を、添加(増殖培地の滅菌後)することにより得
ることができる。タンク発酵槽における培養では、人工
的な通気を行うことが必要である。通気速度は、通常の
タンク発酵に従うことが可能である。 発酵後、液状の酵素生成物は、ブロスから粗粒状物の
除去、さらに所望により低温での蒸発または逆浸透によ
る濃縮を経て生成することができる。最後に、濃厚物に
防腐剤を添加してもよい。 本発明によれば、また、アルカリプロテアーゼは、本
発明のノカルジオプシス菌株に由来するプロテアーゼお
よびその発現についてコードする遺伝子を含有する微生
物を培養し、次いで培養ブロスからのプロテアーゼの回
収により調製することができる。培養される前記微生物
は、ノカルジオプシス菌株それ自体(変異株および変異
体を含む)であるか、または遺伝子が組換えDNA手段に
より挿入された形質転換宿主生物体のいずれかである。
かかる手段は、当該技術分野て既知であり、そして一般
に次の段階: a)遺伝子の発現を促進する機能をコードするDNA配列
およびノカルジオプシスのプロテアーゼをコードするDN
A配列を含んでなる適当な組換えDNAクローニングベクタ
ーを用意し; b)段階a)に由来するクローニングベクターで適当な
宿主生物体を形質転換し;そして c)前記形質転換宿主を、適当な培地で培養し、そして
場合により培養培地からプロテアーゼを回収する を含んでなる。 好ましい宿主生物体は、ノカルジオプシス(Nocardio
psis)、ストレプトミセス(Streptomyces)、酵母およ
びアスペルギルス(Aspergillus)の菌株である。EP 23
8,023(Novo)における宿主のごとく、A・オリーゼ
(A.Oryzae)を用いることが特に好ましい。 ペプチドのマッピング インシュリンの酸化型B鎖のプロテアーゼによる触媒
的分解により生成されるペプチドを、逆相HPLCで分離し
た。ノカルジオプシス・エスピー10R株のプロテアーゼ
の作用を通して得られ、そして例Vに記載されるように
精製されるペプチド分解生成物のクロマトグラムは、第
1図に示される。また、対照として、既知のアルカリプ
ロテアーゼ、ALCALASE(商標)、ESPERASE(商標)、SA
VINASE(商標)で消化して生じたペプチドも示した。酸
化型B鎖インシュリンの消化パターンに関しては、本発
明のプロテアーゼ(10R)が、バシラスのアルカリプロ
テアーゼのいずれからも明らかに相違することを理解し
得る。さらに、クロマトグラム上の完全なB鎖インシュ
リンに相当するピークは、10R株のプロテアーゼについ
てはバシラスのプロテアーゼを用いたものよりも早い時
点で消失する。ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58
−1株に由来するプロテアーゼは、10R株のそれに非常
に類似する消化パターンを生ずる(データは示していな
い)。 酵素の調製物 固体酵素調製品は、Na2SO4のような塩を用いるか、ま
たはエタノールもしくはアセトンのような水混和性溶媒
を用いる沈殿化により精製および/または濃縮したブロ
スから調製することができる。また、ブロスからの水の
除去には、スプレードライのような適当な乾燥方法を用
いることができる。こうして得られるプロテアーゼ調製
品のタンパク分解活性は、一般に0.2〜1.0AU/g(ほぼ0.
2〜1.0 CPU/g)の範囲にある。 本発明のプロテアーゼ調製品は、洗剤添加剤、具体的
には微粉末のない顆粒、安定化した液状または保護した
酵素のように、使用目的に適する剤型であるのが好まし
い。 微粉末のない顆粒は、例えば、NL 167,993(Novo)、
US 4,106,991(Novo)またはUS 4,661,452(Novo)に従
って調製することができ、そして場合により当該技術分
野で既知の原理に基づき被覆してもよい。 液状のプロテアーゼ調製品は、例えば、ポリプロピレ
ングリコール、他のグリコール類、糖、糖アルコールお
よび硼酸を添加することにより安定化し得る。 保護された酵素は、EP 238,216(Novo,Albright & W
ilson)に準じて調製することができる。 洗剤組成物 本発明の洗剤組成物は、陰イオン性、非−イオン性、
陽イオン性もしくは両性イオン性、またはこれらの混合
物であることができる界面活性剤を含んでなる。陰イオ
ン界面活性剤の具体例は、アルカリ金属の直鎖アルキル
ベンゼンスルホネート(LAS)、α−オレフィンスルホ
ネート(AOS)、アルコールエトキシサルフェート(AE
S)および天然石ケンである。 本発明による洗剤は、当該技術分野で既知のその他の
洗剤成分、例えばビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、抗
腐蝕剤、金属イオン封鎖剤、汚物再付着防止剤、香料、
並びに酵素および漂白剤のための安定剤等を含むことが
できる。 本発明の洗剤組成物は、いずれかの都合のよい剤型、
例えば粉末、液体等に成形することができる。プロテア
ーゼは、酵素安定剤、例えば前述したものを入れること
により液体洗剤中で安定化することができる。 一般に、洗剤は、溶液としてpH7〜12、特に8〜10.5
を有する。本発明のプロテアーゼの広範囲な至適pHのた
め、本発明のプロテアーゼは前記の全範囲で高い活性を
有する。 本発明の洗剤は、本発明のプロテアーゼに加えて、1
以上の別の洗剤酵素を包ませることができる。例えば、
リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼおよびプロテアーゼ
(本発明のプロテアーゼ以外)、例えばアルカリ・バシ
ラス(Bacillus)のプロテアーゼである。2(または2
以上)の酵素を、別々にか、または組み合わせた添加剤
の剤型で加えることができる。 図面の簡単な説明 第1図は、本発明の10Rプロテアーゼによるインシュ
リンの酸化型B鎖の消化生成物の溶出クロマトグラムを
示す。消化していない基質並びにSavinase(商標)およ
びAlcalase(商標)(既知プロテアーゼ)による消化後
についての同様のクロマトグラムも示した。 第2図は、本発明の10Rプロテアーゼに対する温度−
活性およびpH−活性曲線を示す。 第3図および第4図は、本発明の2つのプロテアーゼ
(10RおよびM 58−1)に対するpH−活性および温度−
活性曲線を、ZIMET43647のプロテアーゼについて公表さ
れているデータと比較して示す。 例I ノカルジオプシス・エスピー(Nocardiopsis sp.)10
R株を、下記の組成の培地50mlを含有する250mlの3重の
じゃま板を備えた(triple−baffled)エーレンマイヤ
ーフラスコ中で、回転振盪性の台上、30℃において培養
した。 1当たり培地組成(g): マルトデキストリンM−100 20 大豆粉 20 酵母エキストラクト 2 K2HPO4 9 CaCO3 5 滅菌後、炭酸ナトリウム/炭酸水素ナトリウム 緩衝
剤の1M溶液(pH9.2)5mlの添加により培地のpHを9.0に
調節した。インキュベーションの2ないし5日後、ブロ
スのタンパク分解活性を、前記のAnsonアッセイ法を用
いて測定した。93.5時間インキュベーション後の10Rブ
ロスの酵素活性は、13.3AU/であった。 ノカルジオプシス・ダッソンビレイ(Nocardiopsis d
assonvillei)M 58−1を、インキュベーションが25℃
である以外は、記載されているのと同様に培養した。イ
ンキュベーションの140.5時間後、ブロスは9.6AU/の
酵素活性を有していた。 例II ノカルジオプシス・エスピー10R株を例Iに記載した
のと同様の培地および条件下で培養した。26時間増殖
後、その培養物2を用い発酵槽中の例Iに記載した培
地50(培地のpHは滅菌後調節していない)に接種し
た。 接種後、発酵槽の増殖pHは、2MのNa2CO3および10%の
H3PO4で8.7に調節した。温度を30℃に維持した。90時間
後、プロテアーゼの力価は、Ansonアッセイ法を用いて
測定したところ11.5Anson単位/を示した。 培養ブロスを遠心して細胞を除去した。次に、上澄を
濾過し(0.45μ)そして限外濾過(10,000分子量カット
−オフ)により、以下の例で使用される生成物になるま
で濃縮した。 ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株を、イ
ンキュベーション温度を25℃とした以外は例Iに記載し
たのと同じ培地および同じ条件下で培養した。24時間の
増殖後、培養物2を用いて次の成分(g/)からなる
発酵槽培地50に接種した。 マルトデキストリン 40 セレロース(Cerelose) 40 大豆粉 60 K2HPO4 5.5 MgSO4 0.40 CaCl2 0.30 微量ミネラル溶液 7ml 発酵温度は、30℃に制御した。初発pHは8.6に設定
し、そして8.5以下にならないように2MのNa2CO3を添加
して調節し、またさらに8.8を越えないようにH3PO4の添
加により調節した。グルコースが消費されそしてD.O.の
パーセントが上昇し始めた場合は、グルコースをフィー
ドした。フィード流は、グルコース溶液(水500g中セレ
ロース500g)からなる。グルコースは、20g/のグルコ
ースが加えられるまで(約12時間)、3.5ml//時の一
定速度で供給した。プロテアーゼは、40時間で蓄積し始
め、120時間で最高の力価53AU/を得た。 培養ブロスを遠心して細胞を除去した。次に、上澄液
を濾過(0.45μ)し、そして限外濾過(10,000分子量カ
ット−オフ)により、次の例で使用される生成物になる
まで濃縮した。 例III pHおよび温度の関数としての例II由来の10R株のプロ
テアーゼ活性を、前述のアッセイ方法に従い、基質とし
てカゼインを用いて測定した。さらに、プロテアーゼ活
性に対するEDTA(10mM)およびフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド(PMSF,1mM)の影響を試験した。結果を
第2図にグラフ化した。第2(a)図から理解できるよ
うに、市販のプロテアーゼAlcalaseと同様に、至適温度
は60℃に等しいか、またはそれ以上にある。プロテアー
ゼは、pH8〜9間に極大活性を示し、そしてpH7〜11の範
囲内で極大活性の少くとも85%の活性を示す。EDTAは、
プロテアーゼ活性に何等の影響も及ぼさないが、一方PM
SFの添加は、殆んど完全な阻害をもたらし、本プロテア
ーゼがセリン型であることを示している。 例IV 25℃または40℃において種々の洗剤成分の存在下で、
10R株およびM 58−1株に由来するプロテアーゼの安定
性を次のように測定した。 第I表に示した添加成分の存在下または不存在下で0.
01Mの硼酸緩衝液(pH9.5)中にプロテアーゼを0.5AU/
まで希釈した。 試験したノカルジオプシス・エスピーのプロテアーゼ
の両方とも、25℃かまたは40℃のいずれかにおいてもそ
れらの本来の活性の少くとも83%を維持した。例V 例IIで生産したノカルジオプシス・エスピー10Rに由
来するプロテアーゼを、次のように精製した。 まず最初に、濃厚細胞除去ブロスを、0.05MのHEPES緩
衝液(pH7)で平衡化したセファデックス(Sephadex)
−G25カラム(並のグレード)にかけた。タンパクを、
同じ緩衝液で溶出し、プロテアーゼ活性を含有する画分
を集めた。所望により、集めた酵素溶液を水または緩衝
液を用いて希釈して適当なイオン強度を与えた後、0.05
MのHEPES(pH7)で平衡化したCM−セファロース(Sepha
rose)速流性カラムにかけた。約50%の総プロテアーゼ
活性を樹脂に吸着させ、次いで直線塩グラージェント
(0〜75mMのNaCl)で連続的に溶出した。 このCM−セファロース(Sepharose)精製プロテアー
ゼは、21.0AU/g(15CPU/g)の比活性を有する。 SDS−PAGEに分析した場合、精製プロテアーゼは、そ
れぞれの25,000および23,500の分子量を有する1の主成
分および1の副成分の2つの組成分を含有することがわ
かった。ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株
に由来するプロテアーゼを、同様に精製したところ、分
子量20,500を有するSDS−PAGE上に1のバンドから構成
されていた。 例VI ノカルジオプシス・エスピー由来のプロテアーゼは、
商品プロテアーゼALCALASE(商標),SAVINASE(商
標)、およびESPERASE(商標)から、インシュリンの酸
化型B鎖の消化についてのそれらのパターンにより識別
された。プロテアーゼ(2.7×10-5CPU)を、pH9.0の緩
衝液中のインシュリンの酸化型B鎖〔0.17(w/v)%〕
に加え、そして25℃で15分間または2.5時間インキュベ
ートした。反応を停止するために20分煮沸した後、サン
プルを0.1Mの硫酸アンモニウム(pH3)で平衡化した逆
相HPLCカラム(Bakerbond Widepore C18)に注入した。
ペプチドは、0〜50%のアセトニトリルの直線的グラー
ジェントにより溶出した。 クロマトグラムは第1図に示され、そして本発明のプ
ロテアーゼが、バシラスアルカリプロテアーゼのいずれ
からも、酸化型インシュリンB鎖消化のクロマトグラム
パターンに関して異なることを示す。さらに、10R株の
プロテアーゼでは、クロマトグラム上の完全なインシュ
リンのB鎖に相当するピークが、バシラスのプロテアー
ゼ用いたものよりも早い時点で消失する。 例VII 洗浄試験は、テスト・ファブリックス社(Test Fabri
csInd.,Middlesex NJ.)より供給されるEMPA 116試験布
見本(血液、ミルクおよびカーボンブラックにより染が
つけられている綿)を用い、15℃で10分間Terg−O−To
meter中で実施した。0.025,0.05,0.1CPU/の酵素量を
タイド(Tide )(リン酸塩:<0.5、酵素未含有、pH1
0.4)に添加した。プロテアーゼは、10R株由来のものお
よびSAVINASE(商標)を使用した。 プロテアーゼの清浄性は、反射率の変化(ΔR)、即
ち、酵素洗浄試験見本の反射率値を、酵素用いないで洗
浄した試験見本のそれで差し引いたもの、により測定し
た。反射率値は、ガーディナー・レフレクトメーター
(Gardiner Reflectometer)XL 800(Betheda,MD)を使
用して読み取った。 結果を第III表に表す。これらは、同じ使用量におい
て、10RプロテアーゼはSavinaseを用いるよりも20〜50
%大きい清浄性を得ることができることを示す。 例VIII 洗浄試験は、ノカルジオプシス・エスピー10R株およ
びノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株に由来
するプロテアーゼを用い、市販のプロテアーゼALCALASE
(商標)およびSAVINASE(商標)との比較のために実施
した。EMPA 116試験布見本(血液、ミルクおよびカーボ
ンブラックにより染がつけられている綿)は、テスト・
ファブリックス社(Test Fabrics Ind.,Middlesex,NJ)
から入手し、そしてホウレンソウ見本および血液見本
は、新鮮なホウレンソウ抽出液またはウシの血液を所望
の綿布に付着した後、空気乾燥して自社調製した。洗浄
試験は、次の組成の洗剤において15℃で10分間、Terg−
O−Tometer中で実施した。 組成 g/ LAS(Nansa 80S,80%の活性) 0.4 AE(Berol 065) 0.15 石ケン(Sunlight,80%の活性) 0.15 トリポリリン酸ナトリウム 1.75 ケイ酸ナトリウム 0.4 カルボキシメチルセルロース 0.05 EDTA 0.01 硫酸ナトリウム 2.1 水 (ドイツ硬度9゜dH、pH9.5に調節) 0.05CPU/の酵素量をEMPAおよびホウレンソウの染に
使用し、0.5CPU/の酵素量を血液の染に使用した。 反射率値は、ガーディナー・レフレクトメーターXL 8
00(EMPAおよびホウレンソウ)を用いるか、または460n
m(血液)においてエルレポ(Elrepho)2000を用いて読
み取った。プロテアーゼの清浄性は、反射率変化(Δ
R)、即ち、酵素洗浄試験見本の反射率値から酵素を用
いないで洗浄した見本のそれを差し引いて測定した。結
果を、第IV表にまとめた。 この結果から、ノカルジオプシス・エスピー10R株お
よびノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株のプ
ロテアーゼは、すべてのタイプの染の試験において、等
しい使用量に基づき同等の優れた挙動を示すことが明ら
かである。 特に、M 58−1株由来のプロテアーゼは、EMPA 116に
ついて使用するために好ましく、10R株由来のプロテア
ーゼは、血液の染について使用するために好ましい。
テアーゼ産生菌株、アルカリプロテアーゼの製造方法、
ノカルジオプシス(Nocardiopsis)に由来するアルカリ
プロテアーゼ調製物、洗剤添加剤および酵素洗剤添加剤
に関する。 発明の背景 バシラス(Bacillus)属に属する微生物を適当な栄養
培地中で培養して生産されるタンパク分解酵素は、洗剤
組成物において広く使用されている。かかる商業的に入
手可能なプロテアーゼ生産物の例は、アルカラーゼ(AL
CALASE(商標))、エスペラーゼ(ESPERASE(商
標))、サビナーゼ(SAVINASE(商標))であり、これ
らは全てノボ・インダストリー(NOVO INDUSTRIA/S,Den
mark)から供給される。これらおよび他の供給者に由来
する類似のバシラス(Bacillus)産生酵素生産物は、pH
値8〜11の範囲内で、そして通常の洗剤溶液中に存在す
る金属イオン封鎖剤、界面活性剤および漂白剤の存在す
る洗剤溶液中で酵素活性を有する。 ALCALASE(商標)中のプロテアーゼは、バシラス・リ
ケニフォルミス(Bacillus licheniformis)種の菌株の
培養により生産される。ESPERASE(商標)およびSAVINA
SE(商標)中のプロテアーゼは、好アルカリ性バシラス
種、例えばそれぞれNCIB 10147およびNCIB 10309菌株の
培養により得ることができる。商業的に入手可能なアル
カリプロテアーゼの至適温度は、約60℃である。しかし
ながら、これらの市販の酵素は、室温で相対的により低
い活性を示す。 発明の概要 本発明は、アクチノミセス類の微生物に由来する新規
なアルカリプロテアーゼの生産、単離、特性決定および
使用に関する。本発明のプロテアーゼは、従来アルカリ
プロテアーゼを生産することが知られていないアクチノ
ミセスに属するノカルジオプシス・エスピー(Nocardio
psis sp.)10R株およびノカルジオプシス・ダッソンビ
レイ(Nocardiopsis dassonvillei)M58−1株から単離
される。本発明で開示されるプロテアーゼは洗濯のため
の洗剤添加剤として有用である。東ドイツ特許、No.DD
2,004,328号に記載されるノカルジオプシス・ダッソン
ビレイ(Nocardiopsis dassonvillei)菌株のZIMET4364
7株は、繊維素溶解性および生物学的スラッジの浄化を
目的とするプロテアーゼを生産することが知られてい
る。しかしながら、この菌株は、公衆にとって入手可能
でなく、基準菌株はプロテアーゼを生産せず、そしてこ
の種のいかなる他の菌株もプロテアーゼを生産すること
が知られていない。さらに、前述した特許のプロテアー
ゼは、本発明のプロテアーゼの温度分布および至適pHか
ら非常に相違する性質を有する。 第3図では、本発明のノカルジオプシス・エスピーの
プロテアーゼに対するpH分布が、特許のZIMET43647株に
由来するプロテアーゼについて報告されているものと比
較された。同じ実験条件下で、10R株とM 58−1株は両
方とも至適pH8を有するが、一方ZIMET43647のプロテア
ーゼのそれは、9〜10である。さらに、本発明のプロテ
アーゼは、広範囲の至適pHを有し、pH7〜11の間で極大
活性の少なくとも60%を示している。ZIMET43647のプロ
テアーゼは、pH7において極大活性の50%を有するにす
ぎず、そしてpH11では極大活性の0%である。pH11にお
ける高いタンパク分解活性の発現は、洗剤添加剤にとっ
て特に重要である。 本発明のプロテアーゼに対する温度分布は、ZIMET436
47に由来するプロテアーゼに対して報告されているそれ
と、第4図において比較された。40℃と50℃間では、ZI
MET43647のプロテアーゼは、その至適活性の70〜100%
を示し、本発明のプロテアーゼにより示される値(即
ち、25〜65%)より大きい。 前述した相違の他に、本発明の菌株におけるプロテア
ーゼの生産は、無機塩の添加に対して異なる応答をす
る。本発明の菌株は、無機塩が増殖培地に添加されても
されなくとも同じ程度のプロテアーゼ活性物を生産す
る。ZIMET43647菌株は、増殖培地へ無機塩の添加により
改良された応答を示すことが報告されていて、メタロプ
ロテアーゼの存在の可能性を示している。第2b図に明確
に示されるように、本発明のプロテアーゼは、いかなる
検出可能なメタロプロテアーゼ活性も持たない。 本発明のノカルジオプシス・エスピー10R株およびノ
カルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株のプロテア
ーゼは、商業的に入手可能なバシルスのプロテアーゼに
比し、低い洗濯温度、例えば冷水、いわば15〜25℃にお
ける洗剤添加剤として特に効果的である。さらに、本発
明のノカルジオプシス・エスピー10R株およびノカルジ
オプシス・ダッソンビレイM 58−1株のプロテアーゼ
は、バシラスのプロテアーゼより生ずるタンパク加水分
解パターンから相違するそのパターンを生ずる。 多くの類似点、即ち、至適pHおよび温度、安定性、イ
ンシュリン消化パターンを有するにもかかわらず、ノカ
ルジオプシス・エスピー10R株およびノカルジオプシス
・ダッソンビレイM 58−1株に由来するプロテアーゼ
は、識別することができる。例Vに記載されるように、
両プロテアーゼの分子量は、相違する(10Rについて
は、23,500〜25,000、M 58−1については、20,500)。
その上、2つのプロテアーゼの等電点は、相違する〔10
Rについては、p I9.5、M 58−1については、p I=9.
15および8.2(2個のバンド)〕。さらに、10Rのプロテ
アーゼに対する抗体は、M 58−1のプロテアーゼに対し
てほんの部分的な同一性を示すにすぎず、そしてその逆
も同様である。 発明の検討 現在、プロテアーゼについては、洗剤工業での利用を
含む多くの商業的用途がある。以下の、新規なノカルジ
オプシス・エスピー10R株およびノカルジオプシス・ダ
ッソンビレイM 58−1株のプロテアーゼの詳細な検討
は、洗剤添加剤としての使用法に限定されている。しか
し、さらに本発明者等は、タンパク分解酵素に対する他
の用途も必ず存在することを認識している。 酵素は、pH、温度、および洗剤としての使用ではEDTA
のような金属イオン封鎖剤の存在を含む使用法の条件に
影響されることが認識されなければならない。従って、
高温(60℃)で綿織物を洗濯するために開発されたSAVI
NASE(商標)のようなバシラスのプロテアーゼは、多く
の昨今の織物について勧められる低い洗浄温度(15〜25
℃)において効果的でないかも知れない。 第4表で明らかなように、同じ酵素活性レベルで使用
した場合、ノカルジオプシス・エスピー10R株およびノ
カルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株に由来する
新規なアルカリプロテアーゼを含んでなるプロテアーゼ
配合物は、 SAVINASE(商標)プロテアーゼよりも、15℃における模
擬洗濯条件下で、綿(EMPA 116)上のタンパクに基づく
よごれを白くするための能力が約20〜50%優れることを
示す。 発明の詳細な記載 本発明のさらにそのほかの態様によれば、アルカリプ
ロテアーゼの製造方法が提供され、この方法は、プロテ
アーゼ産生ノカルジオプシス・エスピー(Nocardiopsis
sp.)の菌株を、資化し得る炭素源、窒素源およびリン
源を含有する栄養培地中、好気的条件下で培養し、次い
で発酵ブロスからプロテアーゼ製品を回収することを特
徴とする。 さらに本発明の理解のために、ここで添付した図面に
ついて言及する: 第1図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株に由来
するプロテアーゼ並びにバシラスのプロテアーゼ生産物
ALCALASE(商標)、ESPERASE(商標)およびSAVINASE
(商標)によるインシュリンの酸化型B−鎖処理の15分
および2.5時間後の消化生成物の溶出クロマトグラムを
示す。ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株に
由来するプロテアーゼは、ノカルジオプシス・エスピー
10R株に対する消化生成物と同様なものを与えた(デー
タは示していない)。 第2図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株のカゼ
インに対する活性をpHおよび温度の関数として図示す
る。さらにまた、EDTA(10mM)およびフェニルメチルス
ルホニルフルオライド(PMSF、1mM)の影響を示した。
ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株に由来す
るプロテアーゼは、PMSFについては10R株と類似の挙動
をするが、しかしEDTAは活性を阻害しない。これらの結
果は、10R株およびM 58−1株に由来するプロテアーゼ
は、セリンプロテアーゼであり、メタロプロテアーゼで
ないことを示す。 第3図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株、ノカ
ルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株および特許の
ZIMET43647株間の至適温度の相違を示す。 第4図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株、ノカ
ルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株および特許の
ZIMET43647株間の至適温度の相違を示す。 微生物 本発明の微生物は、ノカルジオプシス(Nocardiopsi
s)の好気性の放射菌に属する。 2つの菌株は、米国のアグリカルチュラル・リサーチ
・コレクション(Agricultural Research Collection)
(NRRL)にブタペスト条約の条件下で次のごとく寄託さ
れている。 寄託者の参照記号 10R M 58−1
寄託番号 NRRL 18262 NRRL18133
寄託日 1987年11月10日 1986年11月13
日 分類名称 Nocardiopsis sp. N.dassonvill
ei 当該技術分野で既知の方法により得られるこれらの菌
株の変異株および変異体もまた、本発明の範囲内にあ
る。 両菌株とも増殖温度は、20℃〜30℃であり、35℃超で
は増殖しない。増殖のための至適pHは、9であり、そし
てpH8未満ではいかなる増殖も生じない。前記の増殖パ
ラメーターは、特許のZIMET43647菌株のものと相違す
る。ZIMET株は、25〜37℃(好ましくは28℃)の温度お
よびpH6.5〜7.2の酸性度で培養される。 ノカルジオプシス・エスピー(Nocardiopsis sp.)株
のツアペック・ドックス(Czapek Dox)寒天スラント上
での成熟コロニーは、黒い分泌を伴う灰−緑の気中菌糸
を示す。ノカルジオプシス・ダッソンビレイ(Nocardio
psis dassonvillei)M 58−1株のツアペック・ドック
ス寒天スラント上での成熟コロニーは、白からクリーム
に着色した気中菌糸を有する。典型的なノカルジオプシ
ス・ダッソンビレイ菌株は、かすかな黄−灰色を伴なう
青白い気中菌糸を有する。 ノカルジオプシス・ダッソンビレイ(Nocardiopsis d
assonvillei)(ATCC 23218)の基準株は、本発明のプ
ロテアーゼを産生しない。基準株(ATCC 23218)および
本発明の分離株ノカルジオプシス・エスピー(Nocardio
psis sp.)は、相違する変異株であると信じられる。さ
らに、10R株およびM 58−1株は、一般的なプロトプラ
スト化試薬、卵白リゾチームおよびノボザイム(NovoZy
m(商標))234に対する応答により相互に他のものから
相違する。10R株は、リゾチームおよび/またはZovoZym
(商標)234により細胞壁が溶解されないが、一方M 58
−1株は、リゾチーム単独でプロトプラスト化すること
ができる。典型的なノカルジオプシス・ダッソンビレイ
株は、リゾチームに感受性である(M.C.Shearer等、In
t.J.Syst.Bacteriol 33:369−374,1983)。これらは、
10R株の細胞壁ペプチドグリカンの結合が、M 58−1株
のそれとおそらく相違することを示している。細胞壁の
分類学的な解析は、10R株が新菌種であるかなりの可能
性を有することを示している。10R株についてのさらに
詳細な分類学的な同定は、実施中である。 タンパク分解活性に対するアッセイ ノカルジオプシス・エスピー培養物中のタンパク分解
活性は、周知のアンソン(Anson)ヘモグロビン法によ
り測定した(Journal of General Physiology, 22,79
−89,1959、参照)。1アンソン単位は、タンパク分解
酵素がpH9.0および温度25℃において、10分の反応時間
中にヘモグロビンを分解し、そこに形成されるトリクロ
ロ酢酸で沈殿され得ない分解生成物が、フェノール試薬
により1分当たりにチロシン1ミリ当量の量と同一の着
色を与える初速度を有するタンパク分解酵素の量であ
る。 また、タンパク分解活性は、カゼインの加水分解、次
いでTCA可溶性タンパクとo−フタールジアルデヒドお
よび2−メルカプトエタノールとの反応により測定し
た。得られる複合体の吸収を、340nmで測定し、セリン
標準と比較した。反応混合物は、2.0%(w/v)のハメル
スタイン(Hammerstein)カゼイン1.0ml及び適当な酵素
希釈液0.5ml〔いずれもBrittonおよびRobinsonユニバー
サル緩衝液(Univarsal Buffer)I(pH 9.5)(J.Che
m.Soc.1931,1451頁)中〕からなる。混合物を25℃で30
分間インキュベートした後、2.5mlの停止剤〔脱イオン
水中、3.6(w/v)%のトリクロロ酢酸、6.0(w/v)%の
酢酸ナトリウムおよび3.78(v/v)%の氷酢酸〕を加え
て反応を停止した。対照の反応物では、酵素を添加する
前に停止剤を添加した。25℃で20分後、反応混合物をワ
ットマン濾紙#42を通して濾過するか、または遠心し
た。 濾液の既知量(200μ)を、0.05Mの四硼酸ナトリウ
ム、1(w/v)%のドデシルスルホン酸ナトリウム、0.8
mg/mlのo−フタルジアルデヒド(OPA)(最初はエタノ
ールの40mg/ml溶液として溶解している)および0.2(v/
v)%の2−メルカプトエタールを含有するOPA試薬3ml
に添加した。2分後に340nmにおける吸収を測定した。
同様に、セリンの標準(0.2mg/ml)200μを、OPA試薬
3mlに添加し、そしてA340を測定した。活性は、CPU(カ
ゼインプロテアーゼ単位)で表示されるが、ここで1 CP
Uとは、標準的な条件下で、セリン1mmolに相当する、1
分当たりのTCAで沈殿しない分解生成物の量を生成する
酵素量として定義される。 プロテアーゼ濃厚物の調製 本発明のノカルジオプシスは、他の微量栄養素と共に
資化し得る炭素および窒素源を含有する栄養培地であっ
て、原則的に公知技術に従って構成されている栄養培地
において、好気条件下で培養することができる。 好ましい炭素源は、グルコースおよびマルトースのよ
うな炭水化物か、または穀類の種子、麦芽、米およびモ
ロコシのような物質を含有する炭水化物である。培地に
取り込まれる炭水化物濃度は、非常に広範囲、グルコー
スと等価のものとして計算されるパーセントで、例えば
1〜15%であってもよいが、通常8〜11%が好ましいで
あろう。 栄養培地中の窒素源は、有機天然物であり得る。有機
窒素源の中で非常に数多くのものが、アクチノミセス類
の培養に関連する発酵工程において通常使用される。例
えば、大豆粉、綿実粕、ピーナッツ粉、カゼイン、コー
ン・スティープ・リカー、酵母エキストラクトおよびア
ルブミンが挙げられる。さらにまた、栄養培地は、通常
の微量物質を含有せしめる。 本発明のノカルジオプシス菌株は、好冷性であるた
め、これらは、35℃以上で増殖することができず、培養
は20℃〜30℃の温度で、かつアルカリのpH値で行うのが
好ましい。アルカリpHは、適当な緩衝剤、例えば炭酸ナ
トリウムまたは炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの
混合物を、添加(増殖培地の滅菌後)することにより得
ることができる。タンク発酵槽における培養では、人工
的な通気を行うことが必要である。通気速度は、通常の
タンク発酵に従うことが可能である。 発酵後、液状の酵素生成物は、ブロスから粗粒状物の
除去、さらに所望により低温での蒸発または逆浸透によ
る濃縮を経て生成することができる。最後に、濃厚物に
防腐剤を添加してもよい。 本発明によれば、また、アルカリプロテアーゼは、本
発明のノカルジオプシス菌株に由来するプロテアーゼお
よびその発現についてコードする遺伝子を含有する微生
物を培養し、次いで培養ブロスからのプロテアーゼの回
収により調製することができる。培養される前記微生物
は、ノカルジオプシス菌株それ自体(変異株および変異
体を含む)であるか、または遺伝子が組換えDNA手段に
より挿入された形質転換宿主生物体のいずれかである。
かかる手段は、当該技術分野て既知であり、そして一般
に次の段階: a)遺伝子の発現を促進する機能をコードするDNA配列
およびノカルジオプシスのプロテアーゼをコードするDN
A配列を含んでなる適当な組換えDNAクローニングベクタ
ーを用意し; b)段階a)に由来するクローニングベクターで適当な
宿主生物体を形質転換し;そして c)前記形質転換宿主を、適当な培地で培養し、そして
場合により培養培地からプロテアーゼを回収する を含んでなる。 好ましい宿主生物体は、ノカルジオプシス(Nocardio
psis)、ストレプトミセス(Streptomyces)、酵母およ
びアスペルギルス(Aspergillus)の菌株である。EP 23
8,023(Novo)における宿主のごとく、A・オリーゼ
(A.Oryzae)を用いることが特に好ましい。 ペプチドのマッピング インシュリンの酸化型B鎖のプロテアーゼによる触媒
的分解により生成されるペプチドを、逆相HPLCで分離し
た。ノカルジオプシス・エスピー10R株のプロテアーゼ
の作用を通して得られ、そして例Vに記載されるように
精製されるペプチド分解生成物のクロマトグラムは、第
1図に示される。また、対照として、既知のアルカリプ
ロテアーゼ、ALCALASE(商標)、ESPERASE(商標)、SA
VINASE(商標)で消化して生じたペプチドも示した。酸
化型B鎖インシュリンの消化パターンに関しては、本発
明のプロテアーゼ(10R)が、バシラスのアルカリプロ
テアーゼのいずれからも明らかに相違することを理解し
得る。さらに、クロマトグラム上の完全なB鎖インシュ
リンに相当するピークは、10R株のプロテアーゼについ
てはバシラスのプロテアーゼを用いたものよりも早い時
点で消失する。ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58
−1株に由来するプロテアーゼは、10R株のそれに非常
に類似する消化パターンを生ずる(データは示していな
い)。 酵素の調製物 固体酵素調製品は、Na2SO4のような塩を用いるか、ま
たはエタノールもしくはアセトンのような水混和性溶媒
を用いる沈殿化により精製および/または濃縮したブロ
スから調製することができる。また、ブロスからの水の
除去には、スプレードライのような適当な乾燥方法を用
いることができる。こうして得られるプロテアーゼ調製
品のタンパク分解活性は、一般に0.2〜1.0AU/g(ほぼ0.
2〜1.0 CPU/g)の範囲にある。 本発明のプロテアーゼ調製品は、洗剤添加剤、具体的
には微粉末のない顆粒、安定化した液状または保護した
酵素のように、使用目的に適する剤型であるのが好まし
い。 微粉末のない顆粒は、例えば、NL 167,993(Novo)、
US 4,106,991(Novo)またはUS 4,661,452(Novo)に従
って調製することができ、そして場合により当該技術分
野で既知の原理に基づき被覆してもよい。 液状のプロテアーゼ調製品は、例えば、ポリプロピレ
ングリコール、他のグリコール類、糖、糖アルコールお
よび硼酸を添加することにより安定化し得る。 保護された酵素は、EP 238,216(Novo,Albright & W
ilson)に準じて調製することができる。 洗剤組成物 本発明の洗剤組成物は、陰イオン性、非−イオン性、
陽イオン性もしくは両性イオン性、またはこれらの混合
物であることができる界面活性剤を含んでなる。陰イオ
ン界面活性剤の具体例は、アルカリ金属の直鎖アルキル
ベンゼンスルホネート(LAS)、α−オレフィンスルホ
ネート(AOS)、アルコールエトキシサルフェート(AE
S)および天然石ケンである。 本発明による洗剤は、当該技術分野で既知のその他の
洗剤成分、例えばビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、抗
腐蝕剤、金属イオン封鎖剤、汚物再付着防止剤、香料、
並びに酵素および漂白剤のための安定剤等を含むことが
できる。 本発明の洗剤組成物は、いずれかの都合のよい剤型、
例えば粉末、液体等に成形することができる。プロテア
ーゼは、酵素安定剤、例えば前述したものを入れること
により液体洗剤中で安定化することができる。 一般に、洗剤は、溶液としてpH7〜12、特に8〜10.5
を有する。本発明のプロテアーゼの広範囲な至適pHのた
め、本発明のプロテアーゼは前記の全範囲で高い活性を
有する。 本発明の洗剤は、本発明のプロテアーゼに加えて、1
以上の別の洗剤酵素を包ませることができる。例えば、
リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼおよびプロテアーゼ
(本発明のプロテアーゼ以外)、例えばアルカリ・バシ
ラス(Bacillus)のプロテアーゼである。2(または2
以上)の酵素を、別々にか、または組み合わせた添加剤
の剤型で加えることができる。 図面の簡単な説明 第1図は、本発明の10Rプロテアーゼによるインシュ
リンの酸化型B鎖の消化生成物の溶出クロマトグラムを
示す。消化していない基質並びにSavinase(商標)およ
びAlcalase(商標)(既知プロテアーゼ)による消化後
についての同様のクロマトグラムも示した。 第2図は、本発明の10Rプロテアーゼに対する温度−
活性およびpH−活性曲線を示す。 第3図および第4図は、本発明の2つのプロテアーゼ
(10RおよびM 58−1)に対するpH−活性および温度−
活性曲線を、ZIMET43647のプロテアーゼについて公表さ
れているデータと比較して示す。 例I ノカルジオプシス・エスピー(Nocardiopsis sp.)10
R株を、下記の組成の培地50mlを含有する250mlの3重の
じゃま板を備えた(triple−baffled)エーレンマイヤ
ーフラスコ中で、回転振盪性の台上、30℃において培養
した。 1当たり培地組成(g): マルトデキストリンM−100 20 大豆粉 20 酵母エキストラクト 2 K2HPO4 9 CaCO3 5 滅菌後、炭酸ナトリウム/炭酸水素ナトリウム 緩衝
剤の1M溶液(pH9.2)5mlの添加により培地のpHを9.0に
調節した。インキュベーションの2ないし5日後、ブロ
スのタンパク分解活性を、前記のAnsonアッセイ法を用
いて測定した。93.5時間インキュベーション後の10Rブ
ロスの酵素活性は、13.3AU/であった。 ノカルジオプシス・ダッソンビレイ(Nocardiopsis d
assonvillei)M 58−1を、インキュベーションが25℃
である以外は、記載されているのと同様に培養した。イ
ンキュベーションの140.5時間後、ブロスは9.6AU/の
酵素活性を有していた。 例II ノカルジオプシス・エスピー10R株を例Iに記載した
のと同様の培地および条件下で培養した。26時間増殖
後、その培養物2を用い発酵槽中の例Iに記載した培
地50(培地のpHは滅菌後調節していない)に接種し
た。 接種後、発酵槽の増殖pHは、2MのNa2CO3および10%の
H3PO4で8.7に調節した。温度を30℃に維持した。90時間
後、プロテアーゼの力価は、Ansonアッセイ法を用いて
測定したところ11.5Anson単位/を示した。 培養ブロスを遠心して細胞を除去した。次に、上澄を
濾過し(0.45μ)そして限外濾過(10,000分子量カット
−オフ)により、以下の例で使用される生成物になるま
で濃縮した。 ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株を、イ
ンキュベーション温度を25℃とした以外は例Iに記載し
たのと同じ培地および同じ条件下で培養した。24時間の
増殖後、培養物2を用いて次の成分(g/)からなる
発酵槽培地50に接種した。 マルトデキストリン 40 セレロース(Cerelose) 40 大豆粉 60 K2HPO4 5.5 MgSO4 0.40 CaCl2 0.30 微量ミネラル溶液 7ml 発酵温度は、30℃に制御した。初発pHは8.6に設定
し、そして8.5以下にならないように2MのNa2CO3を添加
して調節し、またさらに8.8を越えないようにH3PO4の添
加により調節した。グルコースが消費されそしてD.O.の
パーセントが上昇し始めた場合は、グルコースをフィー
ドした。フィード流は、グルコース溶液(水500g中セレ
ロース500g)からなる。グルコースは、20g/のグルコ
ースが加えられるまで(約12時間)、3.5ml//時の一
定速度で供給した。プロテアーゼは、40時間で蓄積し始
め、120時間で最高の力価53AU/を得た。 培養ブロスを遠心して細胞を除去した。次に、上澄液
を濾過(0.45μ)し、そして限外濾過(10,000分子量カ
ット−オフ)により、次の例で使用される生成物になる
まで濃縮した。 例III pHおよび温度の関数としての例II由来の10R株のプロ
テアーゼ活性を、前述のアッセイ方法に従い、基質とし
てカゼインを用いて測定した。さらに、プロテアーゼ活
性に対するEDTA(10mM)およびフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド(PMSF,1mM)の影響を試験した。結果を
第2図にグラフ化した。第2(a)図から理解できるよ
うに、市販のプロテアーゼAlcalaseと同様に、至適温度
は60℃に等しいか、またはそれ以上にある。プロテアー
ゼは、pH8〜9間に極大活性を示し、そしてpH7〜11の範
囲内で極大活性の少くとも85%の活性を示す。EDTAは、
プロテアーゼ活性に何等の影響も及ぼさないが、一方PM
SFの添加は、殆んど完全な阻害をもたらし、本プロテア
ーゼがセリン型であることを示している。 例IV 25℃または40℃において種々の洗剤成分の存在下で、
10R株およびM 58−1株に由来するプロテアーゼの安定
性を次のように測定した。 第I表に示した添加成分の存在下または不存在下で0.
01Mの硼酸緩衝液(pH9.5)中にプロテアーゼを0.5AU/
まで希釈した。 試験したノカルジオプシス・エスピーのプロテアーゼ
の両方とも、25℃かまたは40℃のいずれかにおいてもそ
れらの本来の活性の少くとも83%を維持した。例V 例IIで生産したノカルジオプシス・エスピー10Rに由
来するプロテアーゼを、次のように精製した。 まず最初に、濃厚細胞除去ブロスを、0.05MのHEPES緩
衝液(pH7)で平衡化したセファデックス(Sephadex)
−G25カラム(並のグレード)にかけた。タンパクを、
同じ緩衝液で溶出し、プロテアーゼ活性を含有する画分
を集めた。所望により、集めた酵素溶液を水または緩衝
液を用いて希釈して適当なイオン強度を与えた後、0.05
MのHEPES(pH7)で平衡化したCM−セファロース(Sepha
rose)速流性カラムにかけた。約50%の総プロテアーゼ
活性を樹脂に吸着させ、次いで直線塩グラージェント
(0〜75mMのNaCl)で連続的に溶出した。 このCM−セファロース(Sepharose)精製プロテアー
ゼは、21.0AU/g(15CPU/g)の比活性を有する。 SDS−PAGEに分析した場合、精製プロテアーゼは、そ
れぞれの25,000および23,500の分子量を有する1の主成
分および1の副成分の2つの組成分を含有することがわ
かった。ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株
に由来するプロテアーゼを、同様に精製したところ、分
子量20,500を有するSDS−PAGE上に1のバンドから構成
されていた。 例VI ノカルジオプシス・エスピー由来のプロテアーゼは、
商品プロテアーゼALCALASE(商標),SAVINASE(商
標)、およびESPERASE(商標)から、インシュリンの酸
化型B鎖の消化についてのそれらのパターンにより識別
された。プロテアーゼ(2.7×10-5CPU)を、pH9.0の緩
衝液中のインシュリンの酸化型B鎖〔0.17(w/v)%〕
に加え、そして25℃で15分間または2.5時間インキュベ
ートした。反応を停止するために20分煮沸した後、サン
プルを0.1Mの硫酸アンモニウム(pH3)で平衡化した逆
相HPLCカラム(Bakerbond Widepore C18)に注入した。
ペプチドは、0〜50%のアセトニトリルの直線的グラー
ジェントにより溶出した。 クロマトグラムは第1図に示され、そして本発明のプ
ロテアーゼが、バシラスアルカリプロテアーゼのいずれ
からも、酸化型インシュリンB鎖消化のクロマトグラム
パターンに関して異なることを示す。さらに、10R株の
プロテアーゼでは、クロマトグラム上の完全なインシュ
リンのB鎖に相当するピークが、バシラスのプロテアー
ゼ用いたものよりも早い時点で消失する。 例VII 洗浄試験は、テスト・ファブリックス社(Test Fabri
csInd.,Middlesex NJ.)より供給されるEMPA 116試験布
見本(血液、ミルクおよびカーボンブラックにより染が
つけられている綿)を用い、15℃で10分間Terg−O−To
meter中で実施した。0.025,0.05,0.1CPU/の酵素量を
タイド(Tide )(リン酸塩:<0.5、酵素未含有、pH1
0.4)に添加した。プロテアーゼは、10R株由来のものお
よびSAVINASE(商標)を使用した。 プロテアーゼの清浄性は、反射率の変化(ΔR)、即
ち、酵素洗浄試験見本の反射率値を、酵素用いないで洗
浄した試験見本のそれで差し引いたもの、により測定し
た。反射率値は、ガーディナー・レフレクトメーター
(Gardiner Reflectometer)XL 800(Betheda,MD)を使
用して読み取った。 結果を第III表に表す。これらは、同じ使用量におい
て、10RプロテアーゼはSavinaseを用いるよりも20〜50
%大きい清浄性を得ることができることを示す。 例VIII 洗浄試験は、ノカルジオプシス・エスピー10R株およ
びノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株に由来
するプロテアーゼを用い、市販のプロテアーゼALCALASE
(商標)およびSAVINASE(商標)との比較のために実施
した。EMPA 116試験布見本(血液、ミルクおよびカーボ
ンブラックにより染がつけられている綿)は、テスト・
ファブリックス社(Test Fabrics Ind.,Middlesex,NJ)
から入手し、そしてホウレンソウ見本および血液見本
は、新鮮なホウレンソウ抽出液またはウシの血液を所望
の綿布に付着した後、空気乾燥して自社調製した。洗浄
試験は、次の組成の洗剤において15℃で10分間、Terg−
O−Tometer中で実施した。 組成 g/ LAS(Nansa 80S,80%の活性) 0.4 AE(Berol 065) 0.15 石ケン(Sunlight,80%の活性) 0.15 トリポリリン酸ナトリウム 1.75 ケイ酸ナトリウム 0.4 カルボキシメチルセルロース 0.05 EDTA 0.01 硫酸ナトリウム 2.1 水 (ドイツ硬度9゜dH、pH9.5に調節) 0.05CPU/の酵素量をEMPAおよびホウレンソウの染に
使用し、0.5CPU/の酵素量を血液の染に使用した。 反射率値は、ガーディナー・レフレクトメーターXL 8
00(EMPAおよびホウレンソウ)を用いるか、または460n
m(血液)においてエルレポ(Elrepho)2000を用いて読
み取った。プロテアーゼの清浄性は、反射率変化(Δ
R)、即ち、酵素洗浄試験見本の反射率値から酵素を用
いないで洗浄した見本のそれを差し引いて測定した。結
果を、第IV表にまとめた。 この結果から、ノカルジオプシス・エスピー10R株お
よびノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−1株のプ
ロテアーゼは、すべてのタイプの染の試験において、等
しい使用量に基づき同等の優れた挙動を示すことが明ら
かである。 特に、M 58−1株由来のプロテアーゼは、EMPA 116に
ついて使用するために好ましく、10R株由来のプロテア
ーゼは、血液の染について使用するために好ましい。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所
(C12N 9/52
C12R 1:01)
(72)発明者 ストロベル,ロバート,ジョージフ,ジ
ュニア
アメリカ合衆国,コネチカット 06810,
ダンバリー,オール マスケット レイ
ン 19
(72)発明者 オーバーホルト,ジャネット,エム.
アメリカ合衆国,コネチカット 06811,
ダンバリー,オールド ブロックフィー
ルド ロード 166,ユニット 17―6
(56)参考文献 東独国特許200432(DE,B)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.ノカルジオプシス ダッソンビレイ(Nocardiopsis
dassonvillei)M58−1(NRRL 18133として寄託され
た)又はノカルジオプシス(Nocardiopsis)sp.10R(NR
RL 18262として寄託された)であり、そして20〜30℃に
増殖のための最適温度を有しかつ35℃超では本質的に増
殖しないことを特徴とする、プロテアーゼ生産ノカルジ
オプシス。 2.アルカリプロテアーゼの製造方法であって、菌株ノ
カルジオプシス ダッソンビレイ(Nocardiopsis dasso
nvillei)M58−1(NRRL 18133として寄託された)又は
ノカルジオプシス(Nocardiopsis)sp.10R(NRRL 18262
として寄託された)を、適当な炭素源および窒素源を含
有する培地中、アルカリ性のpHおよび20〜30℃の温度
で、液内培養下で好気的に培養し、次いでしかる後培養
ブロスからプロテアーゼを回収することを含んでなる、
前記製造方法。 3.前記培養を、pH8〜10で行う、請求の範囲第2項記
載の方法。 4.ノカルジオプシス ダッソンビレイ(Nocardiopsis
dassonvillei)M58−1(NRRL 18133として寄託され
た)又はノカルジオプシス(Nocardiopsis)sp.10R(NR
RL 18262として寄託された)から由来するアルカリプロ
テアーゼ調製品であって、基質としてカゼインを用いて
測定した場合に、7〜11のpH範囲内にその最大活性の少
なくとも60%を有することを特徴とする、前記アルカリ
プロテアーゼ調製品。 5.請求の範囲第4項記載の調製品であって、菌株ノカ
ルジオプシス ダッソンビレイ(Nocardiopsis dassonv
illei)M58−1(NRRL 18133として寄託された)又はノ
カルジオプシス(Nocardiopsis)sp.10R(NRRL 18262と
して寄託された)を、適当な炭素源および窒素源を含有
する培地中、アルカリ性のpHおよび20〜30℃の温度で、
液内培養下で好気的に培養し、次いでしかる後培養ブロ
スからプロテアーゼを回収することを含んでなる方法に
より製造された前記調製品。 6.前記培養をpH8〜10で行う、請求の範囲第5項記載
の調製品。 7.洗剤添加剤の形態にある、請求の範囲第4〜6項の
いずれか1項に記載の調製品。 8.無粉塵性粒質物または安定化液体として提供され
る、請求の範囲第7項記載の調製品。 9.0.5〜10 CPU/gのタンパク分解活性を有する、請求
の範囲第7又は8項記載の調製品。 10.アルカリバシラス(Bacillus)プロテアーゼを更
に含有する、請求の範囲第7〜9項のいずれか1項に記
載の調製品。 11.酵素洗剤組成物であって、基質としてカゼインを
用いて測定した場合に、7〜11のpH範囲内にその最大活
性の少なくとも60%を有することを特徴とする、 ノカルジオプシス ダッソンビレイ(Nocardiopsis das
sonvillei)M58−1(NRRL 18133として寄託された)又
はノカルジオプシス(Nocardiopsis)sp.10R(NRRL 182
62として寄託された)から由来するアルカリプロテアー
ゼを含んでなる、前記酵素洗剤組成物。 12.0.001〜0.5CPU/gのタンパク分解活性を有する請
求の範囲第11項記載の組成物。 13.アルカリバシラス(Bacillus)プロテアーゼを更
に含有する、請求の範囲第11又は12項記載の組成物。
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