CN1004172B - 自动检测凝集反应的方法及其装置 - Google Patents
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Abstract
一检测验样中某种抗原或抗体的方法及实现该方法的装置能客观而又迅速地测定凝集物的量值,该方法通过将含有抗原或抗体的验样与凝集反应载体相接触并测定所产生的凝集沉淀物的量值来完成检测,所用的这种凝集反应载体已分别被与上述验样中的抗原或抗体相对应的抗体或抗原致敏。测定凝集沉淀物的量值包括借助一个一维图象探测器测量凝集沉淀物的直径。该探测器能在一条穿过上述凝集沉淀物中心的直线上探测自光源发出的光透过凝集沉淀物之后的强度。
Description
本发明涉及的是一种检测方法及实现该方法的装置,这种方法能够明确地检测出存在于验样中的免疫物质。
利用凝集反应检测抗原或抗体的技术,特别是利用单宁酸处理过的红血细胞检测抗原或抗体的技术,广泛应用于临床检验领域,因为它的检测灵敏度比诸如一维免疫扩散、二维免疫扩散或交叉免疫电泳动等技术的灵敏度要高出100~1000倍。
因此,利用凝集反应检测抗原或抗体的技术被广泛地应用于各种化验检测中,例如,用HBs抗原致敏的红血细胞测定抗HBs抗体〔Nagase等人:“医学研究者(Medical Postgraduates),16(4),13(1974);Tateda等人:Kiso to Rinsho(“临床医学导报”),11(7),2091(1977)〕,用抗HBs抗体致敏的红血细胞检测HBs抗原〔Taguchi等人:Rinsho Kensa(“医学技术杂志”),22(4),437(1978)〕,还有用破伤风毒素致敏的红血细胞去致敏破伤风抗毒素血清跟着用破伤风毒素致敏的红血细胞去普检抗破伤风的抗毒抗体〔A、Barr等人:“临床病理学杂志”(Journal of Clinical Pathology),28,699(1975)〕。
然而,虽然这样一些基于凝集反应的抗原或抗体检测方法因它们高度的检测灵敏度而获得广泛的应用,但这些方法也存在着一个严重的缺陷,那就是它们的判定差错不容忽视,这是因为,在显微照片上,阴性对照标准的凝集图样与验样的凝集图样之间是否有差别,是由人眼来作出判定的。
本发明的目的之一,是提出一种检测凝集反应的方法,这种方法的判定差错极小。
本发明的另一个目的,是提出一种检验装置,这种装置可以自动并定量地明确分析出存在于验样中的免疫物质。
为此,本发明提出一种测定验样中抗原或抗体的方法,它先使含有抗原或抗体的验样与用于凝集反应的载体相接触,该载体已被分别相应于上述验样中抗原或抗体的抗体或抗原致敏,然后,判定所产生的凝集沉淀物的量值,这个过程包括用一维图象探测器测量沉淀物的直径,该探测器能够测定(在一条穿过上述凝集沉淀物中心的直线上)由光源发出的光穿过该沉淀物之后的强度。本发明还为此提出一种测定验样中抗原或抗体的装置,该装置使含有抗原或抗体的验样与凝集反应载体相接触,该载体已被与上述验样中抗原或抗体相应的抗体或抗原所致敏,然后该装置通过测量凝集沉淀物的直径来判定所产生的凝集沉淀物的量值。上述装置至少包括:
(a)一个光源;
(b)一个使光源发出的光穿过装有上述凝集沉淀物的验样容器的装置;
(c)一个用一维图象探测器测量所述凝集沉淀物直径的装置,上述探测器能够在一条穿过验样容器中凝集沉淀物中心的直线上连续地测定来自上述光源的光强度。
(d)一个用于计算上述凝集沉淀物大小的装置,该装置对装置(c)测得的数值进行计算处理以完成鉴定和判别。
在附图中:
图1显示了一个一维图象探测器所获得的输出波形的典型示例;
图2是关于一个阳性对照物的输出波形;
图3中分别是两输出波形的某一部分的放大图,波形(a)是探测器关于一个阴性对照物的输出波形,波形(b)是探测器关于一个阳性验样物的输出波形;
图4用图表和图解的方式表明了沉淀物直径与所采用的五段分级之间的相互关系;
图5是本发明的一个实施例装置的示意图。
在附图中,各数码分别表示以下内容:
(1)……探测器仅对于缓冲剂的输出波形
(2)……探测器对于阴性对照的输出波形
(3)……探测器对于阳性验样的输出波形
(F)……图样(凝集沉淀物的)
1……反光镜
2……卤素灯
3……平面镜
4……用来产生均匀光的散光片
5……容器平板支撑和传送框架
6……验样承载平板
7……平面镜
8……光学透镜
9……CCD线性图象探测器
10……A/D转换单元
11……探测器波形信号缓冲存储器
12……操作控制板单元
13……波形处理计算机单元
14……打印机
(a)光源和验样容器
自然光或单色光最适合用作本发明的光源,其应用波长最好是300~800毫微米。来自光源的光既可以由底部也可以由顶部进入验样容器。在采用卤素灯时,为了得到效果良好的光照度,所消耗的电能总量从1瓦到1千瓦。验样容器底部的形状并无特别限定,但最好是球面形或圆锥形的。验样容器的横截面一段为圆形、方形、三角形或多边形的。为了便于操作和测量,容器的内径一般是3~20毫米。
任何导光的不起化学作用的材料都可用来构制反应容器,但丙烯酸有机玻璃树脂、氯乙烯树脂和苯乙烯树脂更佳。特别是,若着眼于凝集图样的稳定性,则苯乙烯树脂是最好的。然而,由于图样稳定性可以通过采用合适的容器底部形状来得到提高,例如球面形或斜面形,或是适合于所用材料的其它形状,因此构制反应容器的材料并非限定为苯乙烯树脂不可。
(b)凝集反应
用于本发明实施中的凝集反应载体包括目前已知的胶乳、经***变性处理过的动物红血细胞(例如羊、豚鼠、鸡、或O型血型的人的红血细胞)、戊二醛、以及单宁酸等等。最好是经变性处理过的动物红血细胞。
这种凝集反应载体一般用某种抗体或抗原致敏并且最好是以混悬状态存在于一种溶剂中,该溶剂是,例如水、生理盐水、某种缓冲剂(磷酸盐缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、硼酸盐缓冲剂等等),或者诸如此类的溶剂。
通常,凝集反应载体以大约0.1%-10%(按体积)的浓度混悬弥散于溶剂中,该混悬液的PH值一般调为大约7.0~8.9之间比较合适,最好是7.2-8.0。凝集反应载体的致敏可以按本身已知的方法〔Igaka no ayumi,78,759-760(1970)〕去完成。致敏过程最好是在上文提及的那些溶剂中进行,这个过程可以通过将抗原或抗体混悬液与凝集反应载体相混合来完成。敏化反应一般在PH值为4.5~8.6并且温度大约15~37℃的条件下完成,所需时间大约为15-60分钟。
参与反应的抗原或抗体混悬液与用于凝集反应的载体之间的比例关系以及它们的浓度必须选择在最佳状态,这取决于抗原或抗体的类型和凝集反应载体的类型。例如,若采用浓度为5%的经戊二醛处理过的羊红血细胞混悬液和HBs抗原混悬液,最好是把HBs抗原的浓度调为吸光度读数0.015-0.15(EZ80值),再加入1-11倍的经戊二醛处理过的羊红血细胞(5%的混悬液)。
以上述方式完成致敏过程之后,致敏的凝集反应载体经清洗并被制成适当浓度的混悬液,然后分成适当的部份进行低压冻干。为了用作凝集反应分析试剂,用合适的溶剂将这些经过低压冻干的物质在上文提及的反应容器中稀释。
在本文特别描述过的这种反应容器中,致敏的凝集反应载体与参与凝集反应的验样之间的比例关系,可按常规化验中运用凝集反应试剂的实践进行选择以供进行定性判定之用。例如,若采用致敏的红血细胞,则应采用浓度为0.5±0.1%的致敏红血细胞混悬液与相同体积的验样相混合,混合时要晃动容器。虽然,对验样和致敏红血细胞混悬液的体积没有特定的限制和苛求,但将它们各以0.1-0.5毫升的相同体积相混合是经济的。
从在上文提及的反应容器中将致敏的红血细胞与验样相混合,到形成凝集图样,这个过程所需的时间可能因所用红血细胞类型的不同而在一定的程度上有所不同。然而,在室温条件下使反应容器保持直立状态,一般需要1-2小时才能出现清晰的凝集图样,而判定结果则可在随后的24小时内得到。这个规律同样也适用于另一种情况,此时,通常用于凝集反应的常规凝集反应载体,例如乳胶,被用来代替红血细胞作为致敏过程中的载体。
(c)凝集沉淀物的测量
当反应容器中形成的凝集物沉积到容器底部之后,通过测量所得凝集沉淀物的直径,就能定量地测定验样中的抗原或抗体。对凝集沉淀物直径的测量,是由一维图象探测器来完成的,该探测器能够在穿过上述凝集沉淀物中心的直线上测定自光源发出的光在穿过凝集沉淀物之后的强度。
图1显示了一种可由一维图象探测器得到的关于凝集沉淀物的典型输出波形。在该图中,波形(1)仅仅是关于缓冲剂的输出波形,波形(2)是关于阴性对照的输出波形,波形(3)是关于阳性验样的输出波形。
图2显示了一种阳性验样的波形。该波形的(a)部分代表两相邻容器之间的间隙的特征,该波形的(b)部分表示验样容器的边缘,波形的(c)部分中的凹陷处是由于凝集沉淀物存在的结果,其波形宽度和电位差视验样的阴、阳性以及其它方面的不同而有所不同。
验样的阳性越强,则波形的宽度就越宽并且电位差也越大。对于阴性的情况则反之。
图3分别显示了两个波形的部分放大图。在该图3中,波形(a)是探测器对于阴性对照的输出波形,其中VN.MAx是两个容器边缘处的电压值。而波形(b)则是线性探测器对于阳性验样的输出波形,其中Vs.L是供测量沉淀物直径的参考电压,Vs.MIN是波形的最低电压,输出波形随电压对于验样、阳性和阴性对照的变动情况而有所不同,因此,为了测量条件的标准化,就要确定一个电压值Vs,L它的取值是这样确定的。它是关于一容器中缓冲剂的参考电压(即容器两边缘上的电压VN.MAx)和关于各验样的波形中的最小电压Vs.MIN二者的中间值,上述关于缓冲剂的参考电压值可在探测器关于阴性对照的输出波形中找出。例如,若上述两个电压值之差的1/2被取为中间值,则该中间电压值可由下式计算:
Vs.L=(VN.MAX-Vs.MIN)×1/2+Vs.MIN
按这个直径测量标准电压值所取定的波形宽度L,就定为所分析的验样中凝集沉淀物的直径。这个方法使得消除由不同的大量凝集沉淀物而引起的偏差成为可能,并使测量条件得以标准化。
(d)以凝集沉淀物直径作为依据作出鉴定
由上述(c)所得的直径数值(L),可以通过绘制标定曲线或计算曲线对它作出定量的鉴定和分级,曲线是通过对照着阴性对照标准增加阳性验样中抗原之剂量来完成的。通常采用的方法有两种,一种是根据L增加的比率作出鉴定,另一种是根据与经验数据相比较的结果作出鉴定。
(ⅰ)根据L增加的比率作出鉴定的方法
阳性对照直径定级为“4”,阴性对照直径定级为“0”,而处在“0”和“4”这个范围内的验样直径,则根据验样直径与阴性对照直径的差值和阳性对照直径与阴性对照直径的差值之间的比值来分级的。阳性对照直径与阴性对照直径的差值定为1。
dl=l-l0/l4-l0
式中,l是验样波形宽度,
l0是阴性对照波形宽度,
l4是阳性对照波形宽度。
此关系示于图4或表1中。
表1
判定凝集图样直径增长的准则 分级
0≤dl≤3/32 0
3/32≤dl≤9/32 1
9/32≤dl≤17/32 2
17/32≤dl≤26/32 3
26/32≤dl≤1 4
(ⅱ)根据与已知数据相比较的结果作出鉴定的方法
根据从事鉴定凝集反应检验结果的人士所提供的经验数值,与各种凝集物直径的数值范围相对应的鉴定结果分级由下面表2给出。
表2
判定凝集图样直径的准则 分级
1.4毫米至1.9毫米 0
2.0毫米至2.4毫米 1
2.5毫米至3.0毫米 2
3.1毫米至3.7毫米 3
3.8毫米或更大 4
上述(a)和(b)中所提供的鉴定数值都是经验数值,然而,必要时可对它们加以变更。
上述标定曲线或分级的内容都编入计算机程序,以此去控制鉴定装置。以下列出供鉴定用的构成程序框图的基本算法。
例1
浓度为0.5%的抗HBs抗体致敏的羊红血细胞混悬液〔ANTIHEBSCELL(可从绿十字公司(The Green Corp.)购买)〕,按0.25毫升的份几分别注入几个聚苯乙烯试管(容量为14毫升;其底部内表面的半径大致为试管内直径的一半)。将一个HBs抗原阳性的患者的血清用含有基质的磷酸盐缓冲剂稀释4至64倍,将该稀释血清取出0.25毫升注入一个盛有上述抗HBs抗体致敏的羊红血细胞混悬液的试管中。摇动之后,使该试管处在室温中静止3小时。然后,取纯净HBs抗原含量为1微克/毫升的制剂,稀释320倍作为标准HBs抗原,再次重复上述过程。保持各试管直立3小时之后,用根据本发明构成的装置测量出现在各试管底部之凝集物的直径。探测器关于阴性对照之输出波形的电压值VN.MAx与探测器关于验样之输出波形的电压值Vs.MIN二者之差值的一半加上电压值Vs.MIN就是电压值Vs.L,在这个电压值Vs.L下所测得的波形宽度L即代表测得的直径。
患者血清之凝集图样的直径在8至32倍的稀释范围内呈线性关系。
例2
图5所示的装置已被制造出来,它包括一个反光镜1、一个卤素灯2、一个平面镜3、一个用来产生均匀的光的散光片4、一个容器平板支撑和传送框架5、一个验样承载平板6、另一个平面镜7、一个光学透镜8、一个CCD线性图象探测器9、一个A/D转换器10、一个探测器波形信号缓冲存储器11、一个操纵板单元12、一个波形处理计算机单元13和一个打印机14。工作过程按图5中箭头的指向逐步完成。
按照本发明,凝集反应产生的凝集物的分级和鉴定能自动地完成。因此,凝集物直径可作为一个与该凝集物横截面有关的量来直接测量,这个量值是分级的基础。于是,可以定量地测定存在于验样中特殊的免疫物质。本方法和装置使得客观而又迅速地测量凝集物的量值成为可能,这在诊断仪器领域中的自动检测凝集反应方面是非常有用的。
Claims (19)
1、一种定量检测验样中抗原或抗体的方法,该方法通过将含有抗原或抗体的验样与凝集反应载体相接触并测定所产生的凝集沉淀物的量值来完成检测,所述载体已分别被与上述验样中的抗原或抗体相对应的抗体或抗原致敏,上述检测方法的特征在于包括以下步骤:
①使光源发光;
②使所述光穿过一凝集沉淀物;
③借助位于所述凝集沉淀物中心线上的一个一维图象检测器连续检测透过所述凝集沉淀物的所述光的强度;
④将该光强转换成一种电信号;
⑤由该电信号得到一种检测器输出波形;
⑥确定该检测器输出波形的电压(值);
⑦确定基于电压(值)的凝集沉淀物的直径。
2、根据权利要求1所述的方法,其特征在于凝集沉淀物的直径是按照在这样一个电压值下探测器输出波形的宽度来测量的,该电压值处在用一个阴性对照取定的标准电压值和用该验样取定的电压值之间的中间值,该中间电压值是在比较上述后两个电压值之后选定的。
3、一种为实现权利要求1方法所用的检测装置,该装置的特征在于主要由以下部分组成:
(a)一个光源,
(b)一个使光源发出的光穿过装有所述凝集沉淀物的验样容器的装置,所述光在验样容器长度中心线附近的方向上,穿过平面镜用于使光线均匀分布的漫射板,容器平板支撑和传送框架以及验样承载板;
(c)用于测量所述凝集沉淀物直径的装置,该装置包括平面镜、光学透镜和一维(CCD线性)图象探测器,借助于该探测器在一条穿过所述验样容器中所述凝集沉淀物中心的直线上,连续地检测由光源发出的光透过凝集沉淀物之后的强度;
(d)一个对装置(c)所测得的供计算和鉴定的数值计算所述凝集沉淀物尺寸的装置,该装置包括A/D转换单元,探测器波形信号缓冲存储器,操作控制单元,和波形处理计算机单元。
4、为实现权利要求2所述方法的检测装置,其特征在于包括以下组成部分:
(a)一个光源,
(b)一个使光源发出的光穿过装有所述凝集沉淀物的验样容器的装置,所述光在验样容器长度中心线附近的方向上,穿过平面镜用于使光线均匀分布的漫射板,容器平板支撑和传送框架以及验样承载板;
(c)用于测量所述凝集沉淀物直径的装置,该装置包括平面镜、光学透镜和一维(CCD线性)图象探测器,借助于该探测器在一条穿过所述验样容器中所述凝集沉淀物中心的直线上,连续地检测由光源发出的光透过凝集沉淀物之后的强度;
(d)一个对装置(c)所测得的供计算和鉴定的数值计算所述凝集沉淀物尺寸的装置,该装置包括A/D转换单元,探测器波形信号缓冲存储器,操作控制单元,和波形处理计算机单元。
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