CN102154203B - 宫内膜干细胞定向诱导胰岛素分泌细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种宫内膜干细胞定向诱导胰岛素分泌细胞的方法，包括以下步骤：1)宫内膜干细胞的分离培养和扩增；2)体外诱导分化：将上述步骤1)所得的第4～6代生长状况良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度为13～17％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得的细胞沉淀用PBS清洗；在上述PBS清洗后的细胞中加入诱导培养基置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养；培养13～15天，得胰岛素分泌细胞。所得的胰岛素分泌细胞用于治疗糖尿病，从而为干细胞治疗提供新的种子资源。

Description

宫内膜干细胞定向诱导胰岛素分泌细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种宫内膜干细胞定向诱导胰岛素分泌细胞的方法。

背景技术

糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，血糖增高的原因有胰岛素分泌或作用的缺陷，或者两者同时存在。临床上将其分为1型、2型、其他特殊类型和妊娠期糖尿病等。1型糖尿病是一种胰岛素依赖性糖尿病，主要由于胰岛素的细胞特征性被破坏造成自身免疫疾病。发病阶段，胰岛中β胰岛素分泌细胞被自身免疫攻击选择性毁坏，不能产生足够的胰岛素，血糖浓度调节失衡，从而导致高血糖发生。2006年第19界国际糖尿病大会调查结果表明，全球糖尿病的平均发病率大约为5.7％或更多，全球约有2.3亿糖尿病患者，并且以每年700万人的速度增加。目前糖尿病在临床上的常规治疗是应用胰岛素注射，而这种方法并不能有效的控制血糖水平，也不能预防糖尿病肾病、冠心病、糖尿病眼病等并发症的发生和发展。对于丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者来说，移植胰岛β细胞或其替代物是一个很具吸引力的方法。近年来，移植胰岛细胞治疗糖尿病取得了一些进展，病人在接受人胰岛细胞移植后，能脱离胰岛素治疗，血糖得到控制。利用干细胞定向诱导分化为类胰岛细胞并植入糖尿病患者对其进行治疗是一种糖尿病治疗的新方法。

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下它可以分化成多种功能细胞。利用干细胞诱导胰岛细胞然后移植糖尿病病人的治疗方法是一种极具吸引力的新的治疗手段。干细胞可以来自胚胎、胎儿或者成体，根据干细胞的发育阶段不同，将其分为胚胎干细胞(ESC)和成体干细胞(ASC)。根据它们的功能可以分为全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。目前研究的干细胞主要有以下几种：

1.胚胎干细胞(ES)：

胚胎干细胞是全能干细胞(totipotent stem cell)，可以分化为任何类型细胞和组织，其在糖尿病等多种疾病治疗中极具应用价值。来源于囊胚的内细胞团和受精卵发育至桑椹胚之前的胚胎细胞，Lumelsky等用五步法将小鼠的胚胎干细胞诱导分化出分泌胰岛素的类胰岛β细胞，还能受血糖的影响控制分泌的多少，但是其分泌量较少，是正常胰岛素分泌细胞分泌量的1/50。移植到糖尿病小鼠的皮下时，能在12d内分泌胰岛素，维持小鼠的体重不下降，存活时间延长，但是不能纠正高血糖。

Assady等用人的胚胎干细胞(hES)在体外贴壁和悬浮培养，发现hES可以自主分化，其中也包括一群产生胰岛素的类β细胞。免疫组化染色显示有相当高比例的细胞分泌胰岛素。分化后的这些细胞还能表达很多胰岛β细胞的表面标志(如Glut2)。

Soria等从小鼠胚胎干细胞中成功分离到一株可分泌胰岛素的细胞克隆，体外给予不同浓度的促分泌素可以调节胰岛素基因表达，而将该细胞克隆植入脾脏1周即可纠正链脲佐霉素所致糖尿病小鼠的高血糖症，4周后其体重恢复正常，糖耐量试验也逐渐恢复。

Fujikawa等按照Lumelsky等的方法分化细胞，研究发现细胞移植后出现了畸胎瘤。且由于来源于胚胎，伦理、道德约束甚至法律方面的限制是胚胎干细胞研究和应用的最大障碍。

2.骨髓间充质干细胞(MSC)：

近年来，骨髓间充质干细胞被证明具有向多种世系细胞分化的能力，成为干细胞研究的一个热点。Oh SH等研究表明骨髓细胞体外培养可以诱导分化为胰岛素分泌细胞，经扩增后移植可以纠正糖尿病鼠的高血糖，效果可以持续90天。Kojima等研究表明糖尿病鼠胰腺外许多组织含有胰岛素表达阳性细胞，包括胸腺、骨髓、脂肪组织、脾脏、肝脏，这些胰岛素表达阳性细胞来源于骨髓。Mathews等研究则表明骨髓来源的内皮祖细胞可迁移至小鼠受损伤的胰岛处，这些细胞具有促血管形成作用，参与胰岛B细胞的再生。

国内也有骨髓间充质干细胞可以转化为胰岛素分泌细胞的报道。Lu等将人的胰岛素基因转入人的骨髓间充质细胞，该细胞可以稳定的分泌胰岛素。李艳华和裴雪涛等利用人骨髓来源的间充质干细胞，通过体外扩增和定向诱导分化研究发现，MSC经第一个阶段的诱导后可分化成nestin阳性的祖细胞，继续诱导6天后变圆的细胞逐渐增多，并聚集成团，双硫腙染色阳性；经两个阶段诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等内分泌激素，放射免疫分析表明诱导的胰岛样细胞团可分泌胰岛素，糖反应性较弱。

3.骨髓造血干细胞：

造血干细胞是最先被发现和研究而得以应用于临床治疗的干细胞。

Ianus等研究表明，移植的骨髓造血干细胞可以参与小鼠完好胰岛的自我更新，并增殖、转分化为有功能的胰岛β细胞，而且排除了发生细胞融合的可能。Steptoe等研究结果显示造血干细胞移植给NOD小鼠后，NOD小鼠的糖尿病发病率明显下降，造血干细胞能够诱导自身抗原胰岛素原的合成，用于自身免疫性小鼠糖尿病的预防有明显的效果。Rachdi等研究表明小鼠胰岛中有10-20％的胰岛素阳性细胞可以检测出造血干细胞的KIT标志物，说明造血干细胞参与胰岛素分泌细胞的再生。所以利用骨髓干细胞动员剂进行自体骨髓干细胞动员，在体内原位移植治疗糖尿病也值得引起重视。2007年，巴西研究人员对14名I型糖尿病患者进行了自体非清髓性造血干细胞移植，结果显示除了一名患者外，其余病患的胰岛素分泌细胞功能都得到了相应的恢复，胰岛素水平有所上升，大部分患者脱离胰岛素依赖。

4.脐血干细胞：

2007年以前，有人用脐血细胞直接经静脉注入1型、2型糖尿病小鼠体内治疗糖尿病。Ende等用人的脐血细胞经静脉注入2型糖尿病小鼠体内后，能缓解糖尿病症状，改善肾脏的症状，延长存活时间。而将人脐血细胞经静脉注入1型糖尿病小鼠体内后，血糖显著降低，并且移植的细胞越多，血糖下降幅度也越大，能减少胰腺炎的发生，延长存活时间。

5.胰腺干细胞：

Peck等成功地从人和小鼠的胰腺导管上皮分离了干细胞，在体外培养条件下能快速增殖，并失去导管上皮细胞特异性的表型，该细胞在合适的条件下可分化形成胰岛的各种分泌细胞，具有多向分化潜能，被称为胰腺干细胞。它们是一种嗜碱性的单核细胞，直径约8μm，呈圆形，细胞核呈圆形或肾形，较大，含2个核仁，染色质细腻而分散，胞质中不含颗粒，在形态上与小淋巴细胞极为相似。Ramiya等将成体NOD小鼠胰腺富含导管部分离体培养，发现培养的细胞可以在体外增殖达两年之久，并能被诱导分化形成“胰岛祖细胞”(islet progenitor ceils，IPCs)。Weir等对分离于人胰腺组织的胰管细胞进行培养，成功诱导胰腺干细胞分化为既含胰管细胞又含胰岛素分泌细胞的细胞群。很显然，扩增及诱导胰腺干细胞分化是获得B细胞替代物更直接的途径。但若将胰腺干细胞应用于临床，还需要做很多工作，如如何寻找最佳的扩增及诱导方案、最佳的移植部位等。现已从胰管中分离获得胰腺干细胞，但由于量少、取材困难，用于临床的难度较大。

6.肝脏干细胞：

已有实验证明，一些多能成体干细胞有跨世系分化一即转分化的能力。例如，神经干细胞可以形成血细胞，骨髓间充质细胞可以产生骨骼肌，心肌和肝卵圆细胞等。在发生上，胰腺与肝脏同源，因而，也有很多学者提出用肝脏干细胞诱导分化出胰腺的细胞来治疗糖尿病。实验证明肝干细胞也具有向胰腺细胞世系转分化的能力，成体肝脏中的肝干细胞样细胞在离体条件下具有向胰腺内分泌细胞分化的潜能。Yang等用肝脏的卵圆细胞在高糖环境，尼克酰胺作用下，分化为胰岛样细胞团。这些细胞可表达胰岛素、胰高血糖素等胰岛相关基因的mRNA，移植到糖尿病小鼠的肾被膜下，可以控制血糖。

7.宫内膜(经血)干细胞：

06年日本科学家发现来自经血中的类干细胞，它们具有干细胞特性，例如自我更新和多分化潜能性的特点。不久后研究人员发现用于再生医学的最新的、更丰富的干细胞来源经血，确定经血干细胞具有潜在的、无限的应用价值，同时其来源不受道德伦理约束，容易收集、储存时间长和价格低廉等优点而受到科学家的重视。

目前仅有一篇研究文献报道过宫内膜干细胞诱导胰腺分泌细胞的研究，但是这篇文献中所用的细胞来自于子宫纤维瘤的病人的子宫切除样本，这样获取的干细胞是否具有转化为肿瘤细胞的可能不能忽视。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种宫内膜干细胞定向诱导胰岛素分泌细胞的方法，所得的胰岛素分泌细胞用于治疗糖尿病，从而为干细胞治疗提供新的种子资源。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种宫内膜干细胞定向诱导胰岛素分泌细胞的方法，包括以下步骤：

1)、宫内膜干细胞的分离培养和扩增：

将经血经含抗生素的杀菌液的杀菌处理后，离心，去上清液；然后加入Chang氏通用培养基置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养；

培养5～7天后换液去除未贴壁细胞；一旦细胞生长至75～85％汇合度时，即采用胰酶消化传代；

一般，可每隔2～4换液一次，每3～4天传代细胞一次；

2)、体外诱导分化：

将上述步骤1)所得的第4～6代生长状况良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度为13～17％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得的细胞沉淀用PBS清洗；

在上述PBS清洗后的细胞中加入诱导培养基置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养；每5×10⁵个的细胞中加入0.8～1.2ml诱导培养基，诱导培养基为：低糖DMEM培养基，0.9～1.1％非必需氨基酸，0.09～0.11mmol/L β-巯基乙醇(β-ME)，0.9～1.1mmol/L谷氨酰胺，4～6μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；

每2～3天半量换液，培养13～15天，得胰岛素分泌细胞。

上述诱导培养基的制备方法为：在每L低糖DMEM培养基中，加入9～11g的非必需氨基酸，0.09～0.11mmol的β-ME，0.9～1.1mmol的谷氨酰胺，4～6μg的bFGF。该非必需氨基酸购自GIBCO公司。

作为本发明的宫内膜干细胞定向诱导胰岛素分泌细胞的方法的改进：步骤1)依次为：

①、经血收集：

在采集管内设置20ml的Hank′s平衡盐溶液(HBSS)，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素(Vancomycin)60～100μg/mL、头孢氨苄(Claforan)150～350μg/mL、卡那霉素(Amikacin)50～150μg/mL、庆大霉素(Gentamycin)80～160μg/mL、两性霉素B(Amphotericin B)2～3μg/mL及300～500单位肝素钠；以此作为含抗生素的杀菌液；将15～20ml的经血放入上述采集管内，于0～4℃的低温下保存24～48小时；然后离心，去上清液；

②、原代培养：

A)、取6～10ml的Chang氏通用培养基加入到步骤①所得物中；

B)、将步骤A)的所得物放入培养瓶中置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱内培养；培养5～7天后全量换液；再将上述培养瓶直立3～8分钟，从而使未贴壁的细胞滑落至培养瓶底部，用移液管去除培养瓶中的培养基；

C)、在步骤B)所得的培养瓶中加入2～4mL的Chang氏通用培养基进行润洗(润洗细胞层)，然后用移液管去除培养瓶中的培养基；

D)、在步骤C)所得的培养瓶中加入6～10mL的Chang氏通用培养基，置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱内培养；

Chang氏通用培养基的配制方法如下：在无菌条件下，在无菌容器中加入650mL MEM-alpha培养基(MEM alpha，Invitrogen公司)、160～200mL Chang B基液(Irvine Scientific公司)、10～30mL Chang C基液(Irvine Scientific公司)、5～15mL青霉素/链霉素双抗(10,000U/mL苄青霉素钠，10,000μg/mL链霉素)，5～15mL的浓度为200mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine，Invitrogen公司)、130～170mL的胎牛血清(ES-FBS，Invitrogen公司)；充分混匀，高压蒸汽灭菌后放入0～4℃冰箱保存待用；

③、细胞传代培养：

一旦步骤②原代培养的细胞生长至75～85％汇合度时，即采用胰酶消化传代；(一般每3～4天传代细胞一次)；具体如下：

A)、一旦步骤②原代培养的细胞生长至75～85％汇合度时，去除培养液，然后用无钙镁离子的PBS洗涤液进行洗涤；

B)、加入2～4ml胰酶，置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中孵育4～6分钟；

C)、加入4～6ml的Chang氏通用培养基使胰酶失活；

D)、轻柔吹打，使贴壁细胞脱落并成单细胞状态；

E)、按1∶8的比率传代；

F)、在每1ml的细胞悬液中加入5～7ml的Chang氏通用培养基；然后置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养。

在本发明中，孵育和培养均是在4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中进行的。

在本发明中，用于消化的胰酶是指常规的0.25％或者0.2％(质量体积比)的胰酶(胰蛋白酶)。

宫内膜干细胞是最近发现的成体干细胞的一种，属于间充质干细胞(MSCs)。子宫内膜组织内发现存在丰富的间充质干细胞，在月经期间随经血排出体外，是一种无创、安全的干细胞来源方式。在细胞标记分子表达和细胞增殖、分化能力上，经血干细胞与胚胎干细胞更相似。

经血干细胞(MenSCs)是一类存在于经血中具有自我更新与多分化潜能的间充质干细胞；女性每个***其子宫内膜组织和血管都会大量增长，然后子宫内膜脱落随经血一起排出体外，这些组织中含有具有可再生能力的细胞就是经血干细胞，也叫宫内膜干细胞(EMCs)。宫内膜干细胞增值速度快，能够表达Oct-4和SSEA-4人体胚胎干细胞的标志物，可分化为心肌、成骨、软骨、脂肪和神经细胞。这些数据表明宫内膜干细胞可以分化成多层胚层的多种细胞类型的能力。

利用干细胞治疗对于I型糖尿病患者来说，是一种可行的比较好的治疗方法，但各种干细胞在临床上的运用都有一些限制，例如胚胎干细胞要受到伦理、道德约束甚至法律方面的限制；骨髓间充质干细胞取材时，病人需遭受身体上的痛苦；造血干细胞要考虑到配型的问题，胰腺、脐血、肝脏造血干细胞往往是一位病人至少需要2份捐献者的量，这受到来源不足的限制；而宫内膜干细胞的发现，克服了以上种种不足，它没有伦理道德的问题，来源丰富、安全，并且容易在体外扩增与储存。宫内膜干细胞这一些优点使得无论是用于干细胞基础研究还是用于临床治疗上都是非常方便的。

本发明将通过体内、体外实验，运用免疫组化染色、RT-PCR、ELISA等技术验证宫内膜干细胞治疗糖尿病的可行性，从而为干细胞治疗提供新的种子资源。

本发明具有以下优点：

1、宫内膜干细胞诱导的胰岛素分泌细胞能够分泌胰岛素，并且具有胰岛β细胞的功能。

2、宫内膜干细胞诱导的胰岛素分泌细胞相对其他干细胞诱导效率较高。

3、诱导的胰岛素分泌细胞能够改善I型糖尿病小鼠的高血糖症状并能延长生命。

综上所述，本发明采用分离培养的宫内膜(经血)干细胞，利用体外干细胞诱导技术，研究宫内膜干细胞的多能性和向胰岛素分泌细胞分化，并通过ICR小鼠模型(注：小鼠模型是ICR)，进行干细胞体内移植，证实其治疗I型糖尿病的可行性，为I型糖尿病的干细胞治疗提供一种新的途径。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明的宫内膜干细胞定向诱导胰岛素分泌细胞的方法的流程图；

图2是宫内膜干细胞诱导前后形态图；

左图代表诱导前，右图代表诱导14天后；

图3为免疫细胞化学染色实验。左图为对照，右图为诱导第14天的疫细胞化学染色结果；

图4为RT-PCR检测胰岛β细胞相关基因的电泳图；

上图分别代表insulin，PDX4，Glut2，NEUROD1，Nkx2.2，PDX1基因的RT-PCR产物，下图代表β-actin基因的RT-PCR产物；

图5为诱导的干细胞小鼠体内移植免疫组化图；

左上代表阳性对照，左下代表阴性对照，右上代表实验组。

图6为干细胞小鼠体内移植前后胰岛素分泌分布图；编号1代表第一组，编号2代表第二组，编号3代表对照组。

具体实施方式：

一、宫内膜干细胞的分离培养和扩增：

招募10位不同年龄段的经期妇女，在完全自愿的前提下捐献月经血样品。

具体操作规程如下：

1、经血样品收集：

将经血采集管，月事杯放入经血采集盒，送至经血供者手中。采集管事先装有20mlHBSS(Hank′s平衡盐溶液)采集液，其中含有Vancomycin(万古霉素)80μg/mL、Claforan(头孢氨苄)250μg/mL、Amikacin(卡那霉素)100μg/mL、Gentamycin(庆大霉素)120μg/mL、Amphotericin B(两性霉素B)2.7μg/mL及400单位肝素钠。以此作为含抗生素的杀菌液。

即上述HBSS(Hank′s平衡盐溶液)采集液的制备方法如下：

在20ml的Hank′s平衡盐溶液中添加以下成分至以下浓度：万古霉素(Vancomycin)80μg/mL、头孢氨苄(Claforan)250μg/mL、卡那霉素(Amikacin)100μg/mL、庆大霉素(Gentamycin)120μg/mL、两性霉素B(Amphotericin B)2.7μg/mL及400单位肝素钠；然后再按照常规程序于高温高压下进行灭菌。

供者在月经开始的前几天(第1至3天)，利用月事杯获取经血样品。将每15～20ml的经血放入上述1个采集管内。在得到细胞捐赠者知会同意的情况下对细胞进行培养(此知会同意必需获得制定评审委员会的批准)。在获取样品后送往处理实验室之前必须将它们在低温(0～4℃)条件下进行保存(保存期一般为24到48小时)。

1)保存24小时后，观察经血收集管中的样品，如有沉淀，可将样品经由100micron过滤网过滤；

2)准备离心前，仔细将样品收集管的外周擦拭干净；确保离心机上离心管的平衡；

3)在840g、4.0℃的条件下离心样品7分钟；

4)小心取出样品收集管，勿扰乱细胞分层；

5)将样品收集管外周用酒精棉擦拭消毒后，移入生物安全柜进行下一步操作；

6)去除上清液；小心吸液，不要扰乱细胞层，造成额外的细胞丢失。

上述上清液可用于进行细菌检测，即将该上清液按照常规的血培养法进行厌氧菌和需氧菌、真菌的检测，并按照常规方法进行鉴定。若为阳性结果，则结束整个宫内膜干细胞的分离培养和扩增。

将上述HBSS(Hank′s平衡盐溶液)采集液中被处理了24小时后的经血，按照常规方式进行微生物检测及传染病病原体安全检测，一般对常见病毒如HIV、HBV、HCV、CMV和梅毒进行检测。若为阳性结果，则结束整个宫内膜干细胞的分离培养和扩增。

上述2种检测目的是为了保证最终所得的胰岛素分泌细胞的使用安全性。

2、原代培养：

培养基配制——Chang氏通用培养基的成分如下：

1)650mL MEM alpha培养基

2)180mL Chang氏B液(基础培养基)(18％v/v)

3)20mL Chang氏C液(2％v/v)

4)10mL青霉素/链霉素双抗(10,000U/mL苄青霉素钠，10,000μg/mL链霉素；即每ml青霉素/链霉素双抗溶液中含有10,000U的苄青霉素钠和10,000μg的链霉素)

5)10mL的L-谷氨酰胺200mM(100x)

6)150mL的胎牛血清(15％v/v)

Chang氏通用培养基的配制方法如下：在无菌条件下，在无菌容器中加入650mLMEM-alpha培养基(MEM alpha，Invitrogen公司)、180mL Chang B基液(Irvine Scientific公司)、20mL Chang C基液(Irvine Scientific公司)、10mL青霉素/链霉素双抗(10,000U/mL苄青霉素钠，10,000μg/mL链霉素)，10mL的浓度为200mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine，Invitrogen公司)、150mL的胎牛血清(ES-FBS，Invitrogen公司)；充分混匀，按照常规方式高压蒸汽灭菌后放入0～4℃冰箱保存待用。

1)取7mLChang氏通用培养基，加入到已去除上清的经血样品(即步骤1的所得物)中，轻柔吹打混匀；得细胞悬液；

2)取一个T-25培养瓶，将步骤1)所得的全部细胞悬液移取到该培养瓶中；

3)放入36.0-38.0℃的孵箱内(5％CO₂，95％饱和湿度)培养；

4)培养5-7天，全量换液(即换7mLChang氏通用培养基)。在生物安全柜中，先将培养瓶直立5分钟，待未贴壁的细胞大部分随培养基滑落至培养瓶底部，用移液管将培养基去除。

5)取3mLChang氏通用培养基，慢慢在培养瓶侧壁滴入。慢慢将培养瓶放平，轻柔地摇晃，润洗细胞层，然后将培养瓶直立5分钟，用移液管将培养基去除。

6)取7mLChang氏通用培养基，慢慢在培养瓶侧壁滴入。

7)镜下观察，有散落的贴壁细胞。

8)放入36.0-38.0℃CO₂孵箱(5％CO₂，95％饱和湿度)内继续培养。在培养过程中，等干细胞细胞贴壁后，去除未贴壁的细胞，一般每隔2～4天换液一次继续培养。

一周后观察，细胞生长，有成团细胞增殖，此时细胞生长至80％汇合度。

3、细胞传代培养

1)去除上述原代培养步骤的8)所得物中的培养液；

2)用无钙镁离子的PBS洗涤液进行洗涤；

上述无钙镁离子的PBS洗涤液的配制如下：

于高压蒸汽灭菌(常规程序)后放入4℃冰箱保存待用。

3)加入3ml胰酶，36-38℃孵育(5％CO₂，95％饱和湿度)5分钟；

4)加入5ml的Chang氏通用培养基使胰酶失活；

5)轻柔吹打，使贴壁细胞脱落并成单细胞状态；

6)按1∶8的比率传代：在8ml的细胞悬液中取1ml至一新的T-25培养瓶中，

再加入6ml的Chang氏通用培养基，混匀；

7)放入36.0-38.0℃CO₂孵箱(5％CO₂，95％饱和湿度)内培养；

8)每3-4天传代细胞一次(即从步骤1)开始至步骤7)为止，每3-4天传代一次)，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率。

4、经血间充质干细胞的分子表型鉴定：

流式细胞术检测细胞表面抗原

1)细胞传至第2-4代时收集细胞，0.25％胰酶消化细胞，制成细胞悬液，细胞量为1×10⁶；

2)分别取所需数据的0.5ml EP管，分别加入小鼠抗人单克隆抗体(CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105，CD29，SSEA-4，OCT-4，及同型对照)20μl；

3)、管内分别加入细胞样本(步骤1)所得)50μl，避光4°C孵育30min；

4)、300g离心5分钟；

5)、弃上清，加入1％(质量浓度)人血清的PBS 1ml，充分混匀，300g离心5分钟；

6)、弃上清，加入PBS调整样本量至100μl，上流式细胞仪进行分析；

所得结果为：CD44，CD73，CD90，CD105，CD29，SSEA-4，OCT-4为阳性，CD34，CD45为阴性；从而确定所得确为宫内膜干细胞。

二、体外诱导分化：

1.经血干细胞诱导为胰岛素分泌细胞方法：

取第4-6代生长状况良好的细胞，表现为生长旺盛、胞体大、胞核清晰、胞浆丰富、显微镜下折光性强的细胞，以胰酶(例如为0.2％胰蛋白酶)消化，显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含15％胎牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打后离心，获得细胞沉淀，PBS洗2遍(目的是为了洗去胰蛋白酶、胎牛血清等物质)。诱导培养基将细胞沉淀吹散，然后接种于6孔板中进行诱导培养，接种细胞密度为5×10⁵/孔，每孔加1ml诱导培养基(定容至1ml)。置于5％CO₂，95％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养，2-3天半量换液，每日在倒置显微镜下观察细胞生长情况。培养2周(14天)，诱导获得所需的胰岛素分泌细胞。

上述诱导培养基为：低糖DMEM，1％非必需氨基酸(购自GIBCO公司)，0.1mmol/Lβ-ME，1mmol/L谷氨酰胺，5μg/L bFGF。

上述诱导培养基的制备方法如下：在每L低糖DMEM培养基中，加入10g的非必需氨基酸，0.1mmol的β-ME，1mmol的谷氨酰胺，5μg的bFGF，于高压蒸汽灭菌后放入4℃冰箱保存待用。

2.检测并确认诱导生成的胰岛素分泌细胞的方法：

(1)双硫腙(dithizone，DTZ)染色：

将50mgDTZ溶于5ml二甲基亚砜(DMSO)中，混匀，过滤除菌，备用。在诱导14天后进行DTZ染色。染色时，向每1ml分化诱导培养体系中加入10ulDTZ染色液，于37℃培养箱中继续培养20分钟，吸取染色孔内的细胞少许，用PBS洗涤2次，显微镜下观察、拍照。如图2所示。

根据图2可得知：本发明诱导的细胞能够正常分泌胰岛素。

(2)ELI5A试剂盒检测诱导的细胞是否具有β胰岛细胞功能：

这一检测过程直接按照Mercodia公司所提供的“C-peptide ELISA assays”标准操作过程做。最终结果检测出C-肽，说明诱导的细胞能够分泌胰岛素。

(3)免疫细胞化学染色检测诱导的细胞能够分泌胰岛素：

取诱导第14天的细胞涂片，40g/L甲醛常规固定后行免疫细胞化学染色，一抗使用鼠抗人胰岛素抗体，操作步骤具体如下：PBS冲洗玻片3次，每次10分钟。3％过氧化氢孵育10分钟，蒸馏水冲洗3次，每次不少于5分钟。滴加山羊血清封闭，室温孵育30分钟，倾掉后吹干。滴加特异性酶标抗体，稀释抗体为1∶50，37℃孵育30分钟，PBS充分冲洗3次，每次5分钟。滴加显色剂二氨基联苯胺(DAB)显色，室温下20分钟后显微镜下观察、拍照。如图3所述。左图为对照，右图为诱导第14天的疫细胞化学染色结果。

根据图3，可得知：本发明所诱导的细胞能够产生胰岛素。

(4)RT-PCR检测诱导胰岛素分泌细胞：

取诱导第14天的培养细胞，弃除上述各培养孔中的培养液，PBS洗2遍，加入0.2％胰蛋白酶溶液，用吸管轻轻吹打，使细胞分散，加入含10％胎牛血清的培养液终止消化，吹打后，将培养液转入无菌离心管中，1000转，离心5分钟，弃去上清液，PBS洗2遍，重新用PBS悬浮细胞并将细胞悬液转入经高压处理的无菌管中，2000转，离心5分钟，用滤纸吸干液体，用试剂盒提取总RNA，RT-PCR检测胰岛β细胞相关基因：insulin、PDX-1、Glut2、PAX4、NEUROD1、Nkx2.2和β-actin的mRNA的表达。

PAX4上游引物：5-GGCGTCGGCAAGAGAAGCTCAA-3

下游引物：5-TGGGCTGAGCTGTTTTCTACTTTT-3

扩增片段长度为300bp；

PDX-1上游引物：5-GCCCCGCGGGTAGATGCCGGCA-3

下游引物：5-ATTTCTAAACTTAAAGGGGTCG-3

扩增片段长度为300bp；

Insulin上游引物：5-CCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTC-3

下游引物：5-CAGTAGTTCTCCAGCTGGTAGA-3

扩增片段长度为300bp；

NEUROD1上游引物：5-TTACAAAAGGCAGCCCTTTGGG-3

下游引物：5-GCCCATTACTAGTTTAAAAATT-3

扩增片段长度为300bp；

Nkx2.2上游引物：5-TCACGCGCTCAAAGCCCAGGAC-3

下游引物：5-TCGACTCCATAATAATAATTAT-3

扩增片段长度为300bp；

Glut2上游引物：5-CCCCTGGTTCATGGTGGCTGAG-3

下游引物：5-TTTGGTTTCTGGAACTTTAAAA-3

扩增片段长度为300bp；

β-actin上游引物：5-CCTTAATACTTTTTTATTTTGT-3

下游引物：5-CGCGAAGCCGGCCTTGCACATGG-3

扩增片段长度为300bp

扩增条件：预变性94℃5min，94℃30s，63℃40s，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸4min。取5ul扩增产物，2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用凝胶成像***照相并作吸光度扫描分析。

所述扩增体系为：

所得结果如图4所示。

图4所述的结果表明：胰岛素相关基因在诱导14天的细胞中都有表达，说明诱导的细胞具有胰岛素分泌细胞的特点，即本发明的诱导是成功的。

(5)诱导的胰岛素分泌细胞体内移植：

将12只ICR 1型糖尿病雄性小鼠(6-8周龄)随机分成以下2组：第一组经尾静脉注射细胞量4×10⁴/只，第二组经尾静脉注射细胞量1×10⁶/只。取6只正常ICR雄性小鼠注射等体积生理盐水作为对照组。每周检测小鼠血糖胰岛素水平，并采血检测小鼠胰岛素和血糖，具体如表1和表2所示。小鼠处死后(追踪8周)，取部分胰腺组织用***固定，石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色后观察胰岛的恢复情况，结果如图5所示。阳性对照为正常人胰腺组织免疫组化染色人胰岛素，呈棕红色，作为实验步骤对照，表明本实验过程正确无误，阴性对照表示没有注射干细胞的小鼠组织，未染出人胰岛素，另外一个表示注射干细胞的小鼠组织，染色染出人胰岛素，表示干细胞迁移到受损的胰腺部分并分泌胰岛素。干细胞小鼠体内移植前后胰岛素分泌变化情况如图6所示。对糖尿病小鼠进行体内宫内膜干细胞移植，每只小鼠移植一百万个细胞。一周后，尾静脉采血，检测血清中的胰岛素。从图6中，可得知移植干细胞后的小鼠胰岛素水平升高，说明干细胞有改善糖尿病小鼠低胰岛素的作用。

表1、胰岛素含量

平均值(ug/l)	第一组	第二组	对照组
				注射前	0.038	0.0377	0.0509
注射后(2周)	0.0395	0.0432	0.0498

表2、血糖浓度

平均值(mmol/l)	第一组	第二组	对照组
				注射前	＞33.3	＞33.3	10.4
注射后(2周)	27.5	12.4	12

从表2可看出：注射后糖尿病小鼠的血糖降低了，说明干细胞注射对糖尿病小鼠有一定的治疗作用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.宫内膜干细胞定向诱导胰岛素分泌细胞的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、宫内膜干细胞的分离培养和扩增：

将经血经含抗生素的杀菌液的杀菌处理后，离心，去上清液；然后加入Chang氏通用培养基置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养；

培养5～7天后换液去除未贴壁细胞；一旦细胞生长至75～85％汇合度时，即采用胰酶消化传代；

所述Chang氏通用培养基的配制方法如下：在无菌条件下，在无菌容器中加入650mLMEM-alpha培养基、160～200mL的Chang B基液、10～30mL的Chang C基液、5～15mL青霉素/链霉素双抗、5～15mL的浓度为200mM的L-谷氨酰胺、130～170mL的胎牛血清；充分混匀，高压蒸汽灭菌后放入0～4℃冰箱保存待用；每ml青霉素/链霉素双抗溶液中含有10,000U的苄青霉素钠和10,000μg的链霉素；

2)、体外诱导分化：

将上述步骤1)所得的第4～6代生长状况良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度为13～17％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得的细胞沉淀用PBS清洗；

在上述PBS清洗后的细胞中加入诱导培养基置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养；每5×10⁵个的细胞中加入0.8～1.2ml诱导培养基，所述诱导培养基为：低糖DMEM培养基，0.9～1.1％非必需氨基酸，0.09～0.11mmol/L β-巯基乙醇，0.9～1.1mmol/L谷氨酰胺，4～6μg/L碱性成纤维细胞生长因子；

每2～3天半量换液，培养13～15天，得胰岛素分泌细胞。

2.根据权利要求1所述的宫内膜干细胞定向诱导胰岛素分泌细胞的方法，其特征是所述步骤1)依次为：

①、经血收集：

在采集管内设置20ml的Hank′s平衡盐溶液，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素60～100μg/mL、头孢氨苄150～350μg/mL、卡那霉素50～150μg/mL、庆大霉素80～160μg/mL、两性霉素B2～3μg/mL及300～500单位肝素钠；以此作为含抗生素的杀菌液；

将15～20ml的经血放入上述采集管内，于0～4℃的低温下保存24～48小时；然后离心，去上清液；

②、原代培养：

A)、取6～10ml的Chang氏通用培养基加入到步骤①所得物中；

B)、将步骤A)的所得物放入培养瓶中置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱内培养；培养5～7天后全量换液；再将上述培养瓶直立3～8分钟，从而使未贴壁的细胞滑落至培养瓶底部，用移液管去除培养瓶中的培养基；

C)、在步骤B)所得的培养瓶中加入2～4mL的Chang氏通用培养基进行润洗，然后用移液管去除培养瓶中的培养基；

D)、在步骤C)所得的培养瓶中加入6～10mL的Chang氏通用培养基，置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱内培养；

③、细胞传代培养：

一旦步骤②原代培养的细胞生长至75～85％汇合度时，即采用胰酶消化传代；具体如下：

A)、一旦步骤②原代培养的细胞生长至75～85％汇合度时，去除培养液，然后用无钙镁离子的PBS洗涤液进行洗涤；

B)、加入2～4ml胰酶，置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中孵育4～6分钟；

C)、加入4～6ml的Chang氏通用培养基使胰酶失活；

D)、轻柔吹打，使贴壁细胞脱落并成单细胞状态；

E)、按1∶8的比率传代；

F)、在每1ml的细胞悬液中加入5～7ml的Chang氏通用培养基；然后置于4～6％CO₂、94～96％饱和湿度的36～38℃培养箱中培养。

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