CN100356922C - 囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白抑制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抑制囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白(CFTR)的组合物、药物制剂及方法，其可用于CFRT介导疾病和病症的研究和治疗。本发明的组合物药物制剂可包括一种或多种噻唑烷酮化合物以及可另外含有一种或多种药物可接受载体、赋形剂和/或佐剂。本发明的方法包括，在某些实施方案中，给予患有CFTR介导疾病或病症的患者有效剂量的噻唑烷酮化合物或衍生物。在其它的实施方案中，本发明提供抑制CFTR的方法，其包括利用有效剂量的噻唑烷酮化合物接触个体细胞。本发明的特点还在于CFTR介导疾病的非人动物模型，该模型通过给予非人动物足以抑制CFTR的噻唑烷酮化合物或衍生物来产生。

Description

囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白抑制剂及其用途
发明背景
囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白(CFTR)为表达在哺乳动物气道、肠、胰腺及睾丸上皮细胞的cAMP活化氯通道。CFTR是负责cAMP介导的Cl-分泌的氯通道。诸如β-肾上腺激动剂的激素、或诸如霍乱毒素的毒素可导致cAMP的增加、cAMP依赖蛋白激酶的活化以及所述CFTR Cl-通道的磷酸化，其可引起该通道的开放。细胞内Ca2+的增加也能活化不同的顶端(apical)膜通道。由蛋白激酶C引起的磷酸化能引起顶端膜中的Cl-通道开放或关闭。CFTR主要位于上皮中，这为Cl-离子跨顶端膜运动提供了途径和关键位点(key point)并以此来调节跨上皮的盐和水的转运比例。CFTR氯通道功能与较广泛的疾病有关，包括囊性纤维化(CF)以及***的一些类型、多发性囊性肾病以及分泌性腹泻。
这种遗传性致死性疾病囊性纤维化(CF)由CFTR的突变引起。人类囊性纤维化(CF)患者以及CF小鼠模型中的观察表明CFTR在肠和胰腺液体转运中以及男性生殖中具有重要功能(Grubb et al.，1999，Physiol.Rev.79：S193-S214；Wong，P.Y.，1997，Mol.Hum.Reprod.4：107-110)。然而CFTR缺失可产生气道疾病是CF中主要的发病和死亡原因，其机制仍不清楚(Pilewski et al.，1999，Physiol.Rev.79：S2 1 5-S255)。了解CF中气道性疾病的主要困难包括CF小鼠模型的不适当(其显现极少和没有气道疾病)、CF大动物模型的缺乏以及人CF气道的可用性限制(其还没有被慢性感染和被炎症所损伤)。尚未使用高亲和性、CFTR选择性抑制剂来研究CF中的气道性疾病的发病机制或在大动物模型中产生CF表型。
高亲和性CFTR抑制剂在分泌性腹泻和囊性肾病的治疗以及在抑制男性生殖中也具有临床作用。化合物二苯胺-2-羧酸盐(DPC)和5-硝基-2-(3-苯丙基氨基)苯甲酸酯(NPPB)在高浓度下可抑制CFTR，但其抑制活性没有特异性(Cabantchik et al.，1992，Am.J.Physiol.262：C803-C827；McDonough et al.，1994，Neurone 13：623-634；Schultz et al.，1999，Physiol.Rev.79：S109-S144)。用于电生理和其它细胞水平研究的最好的CFTR抑制剂优降糖(glibenclamide)使用浓度为＞100μM(Sheppard et al.，1992，J.Gen.Physiol.100：573-591；Hongre et al，1994，Pflugers Arch.426：284-287)。然而在此浓度优降糖也抑制其它Cl-转运剂(transporter)和k+通道(Edwards et al.，1993，Br.J.Pharmacol.110：1280-1281；Rabe et al.，1995，Pflugers Arch.429：659-662；Yamazaki et al.，1997，Circ.Res.81：101-109)。其它离子转运蛋白的有效小分子抑制剂是公知的，但还没有出现适合分泌性疾病治疗的具有特异性CFTR抑制能力的小分子。
因此，需要CTFR抑制剂化合物及使用此化合物来开发用于CF研究和治疗的动物模型以及分泌性病症的治疗和控制。本发明满足了这些需求以及其它方面的要求并克服了背景技术中存在的缺陷。
发明概述
本发明提供抑制囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白(CFTR)的组合物、药物制剂及方法，其可用于CFRT介导疾病和病症的研究和治疗。本发明的组合物药物制剂可包括一种或多种噻唑烷酮化合物或衍生物以及可另外含有一种或多种药物可接受载体、赋形剂和/或佐剂。本发明的方法包括，在某些实施方案中，给予患有CFTR介导疾病或病症的患者有效剂量的噻唑烷酮化合物或衍生物。在其它的实施方案中，本发明提供抑制CFTR的方法，其包括利用有效剂量的噻唑烷酮化合物或衍生物接触个体细胞。本发明的特点还在于CFTR介导疾病的非人动物模型，该模型通过给予非人动物足以抑制CFTR的噻唑烷酮化合物或衍生物来产生。
从以下的详细描述中可显而易见本发明的这些和其它的目的和优点。
附图的简要说明
参考以下附图可更加全面的理解本发明，该附图仅是为了说明的目的。
图1A所示为用于鉴定CFTR抑制剂的筛选技术流程图。通过稳定转染的上皮细胞中的多潜能激动剂可最大地刺激CFTR，该上皮细胞共表达人CFTR和具有Cl-/I-敏感荧光的黄色荧光蛋白(YFP)。在加入试验化合物后，通过加入含I-溶液可诱导I-流入。
图1B所示为利用图1A的筛选技术，分别来自单一的小孔的荧光数据的图示，其中显示了对照(无活化剂、无试验化合物)、非活性化合物，及活性CFTR抑制剂化合物。
图1C所示为通过图1A筛选技术鉴定的CFTR抑制剂化学结构。
图1D所示为具有最大的CFTR抑制活性的噻唑烷酮衍生物环2的化学结构。完整的噻唑烷酮衍生物结构如图1C所示。相对势能为：0.2(CFTRinh-020)、0.3(CFTRinh-029)、1.0(CFTRinh-172)、0.2(CFTRinh-185)、0.1(CFTRinh-214)及0.1(CFTRinh-236)。
图2A所示为利用图1A筛选技术的CFTR抑制剂3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(本文指CFTRinh-172)对时间作图的多个浓度的相对荧光图示。
图2B所示为抑制的时间过程曲线，显示加入2μM CFTRinh-172后在不同时间CFTR介导的I-转运率。***的图为抑制逆转的时间过程曲线图示，显示1μM CFTRinh-172冲洗后不同时间的I-转运率。三组实验结果用平均值±标准误表示。
图2C所示为利用不同激动剂刺激后CFTR抑制的图示，所述激动剂包括苯并黄酮和苯并咪唑酮UCCF化合物(UCCF-029(2-(4-吡啶)苯并[h]-4H-苯并吡喃(chromen)-4-酮硫酸氢盐)和UCCF-853(Galietta et al.2001J.Biol.Chem.276：19723-19728))、染料木黄酮(genistein)、CPT-cAMP、8-甲氧基补骨脂素(8-methoxypsoralen)(8-MPO)，8-环戊烷-1，3-二丙基黄嘌呤(dipropyxanthine)(CPX)(均为50μM)(三组实验结果用±标准误表示)。实心条显示激动剂，空心条显示伴有5μM CFTRinh-172的激动剂。
图3A所示为CFTRinh-172对表达人CFTR的通透性FRT细胞中短路电流(short-circuit current)的抑制作用，通过100μM CPT-cAMP来刺激CFTR。
图3B所示为CFTRinh-172(圆)与优降糖(方块)的剂量-抑制作用数据总结图(三组实验结果以标准误表示)。
图3C所示为在原代培养的(非通透性)人支气管上皮细胞中短路电流的CFTRinh-172抑制作用。在顶端灌洗溶液中加入抑制剂(左侧图)或在基底侧及随后的顶端溶液中加入抑制剂(右侧图)。
图3D所示为CFTR表达FRT细胞的全细胞膜片钳的图示，显示在+80mV(空心圆)和-100mV(实心圆)处引出的膜电流。由5μM毛喉萜(forskolin)刺激CFTR，随后加入2μM CFTinh-172。
图3E所示为间断交替刺激(a-c)(alternate stimulation)产生分级的膜电势的图示。
图3F所示为基础状态下(对照，空心圆)、毛喉萜刺激后(实心圆)、及加入0.2μM CFTRinh-172后出现～50％抑制作用(空心三角)的电流-电压关系图示。
图4A所示为在有或没有5μM CFTRinh-172存在时以短路电流分析来检测的气道上皮细胞中UTP-(100μM)刺激Ca2+依赖Cl-分泌图示。
图4B所示为在FRT细胞中全细胞膜片钳实验检测的容积-活化Cl-电流(低渗的250mosM/kg H2O)图示。在有和没有5μM CFTRinh-172存在时记录电流。
图4C所示为MDR-1表达上调的9HTEo-/Dx细胞中的3H-长春新碱(vincristine)累积图示。在有和没有异搏定(verapamil)(100μM)或CFTRinh-172(5μM)时检测细胞内长春新碱(标准误，n＝3)。
图4D所示为采用CFTRinh-172、二氮嗪(diazoxide)(100μM)及优降糖(10μM)进行细胞外灌注记录的胰腺β细胞(INS-1)膜电势图示。
图4E所示为图4D所示的由操作引起的膜电势平均改变(ΔmV)图示(标准误，n＝4)。
图5A所示为在没有(顶端)和有(中间)腹腔内注射CFTRinh-172(150μg/kg)时、1μg霍乱毒素腔内注射后6小时时分离的小鼠回肠环(loop)照片。盐水对照(没有霍乱毒素，底部)作为对比显示。
图5B从14-16环中研究得到的6小时时的回肠环重量，数据以平均值±标准误表示(n＝6-8只小鼠)。对于无活性类似物，CFTRinh-172中的4-羧基苯基基团被3-甲氧基-4-甲氧基乙烯基苯基取代(标准误，每组6-8只小鼠，*p＜0.001，方差分析)。
图5C所示为口服强饲法给药后6小时时移去腔液前与移去后之间的整个小肠的重量比值(标准误，每组4只小鼠，p＜0.001)。
图5D所示为在分离的大鼠结肠粘膜中加入氨氯吡脒及用毛喉萜(20μM)的刺激后CFTRinh-172抑制作用的短路电流。如所示将CFTRinh-172加入到浆膜、随后是粘膜表面(n＝4)。
图6所示为14C-标记CFTRinh-172合成的示意图。利用标记的14C溴乙酸作为起始材料将14C结合到噻唑烷酮核中。
图7所示为大鼠经单剂量静脉内弹丸(bolus)输注50μCi14C标记CFTRinh-172后，一组CFTRinh-172药代动力学分析结果图。血清放射活性数据以平均值±标准误表示(n＝3-6只大鼠)。拟合曲线(Fitted curve)对应2室模型，其中再分布半衰期为0.14hr，清除半衰期10.3hr，最大血清浓度为3.2μg/mL，曲线下面积为3.8μg.hr/mL，分布容积为1.2L，清除率为99mL/hr。
图8所示为在弹丸输注后14C标记CFTRinh-172的器官分布图。图A中的结果来自单剂量静脉内弹丸输注2μCi14C标记CFTRinh-172的小鼠，在所指示的时间处死动物，收集器官进行14C放射活性的分析，数据以输注后指定时间的整体器官(除骨骼肌以每克组织报道外)14C放射活性表示(平均值±标准误，每一时间点4只小鼠)。图B中的结果来自给予弹丸输注50μCi14C标记CFTRinh-172的大鼠，且在输注后60分钟检测整体器官的CFTRinh-172(3只大鼠)。
图9所示为通过薄层层析检测的小鼠体液和肝脏CFTRinh-172代谢分析结果的一组照片，该小鼠如图8中图A的14C标记CFTRinh-172灌注。14C标记CFTRinh-172标准为1、3和6nCi(左侧图)，以及10、30和60nCi(右侧图)。对底片进行48小时(左侧图)和12小时(右侧图)的放射性自显影。
图10所示为小鼠闭合肠环模型特征结果的一组图示。图A：利用200μL缓冲液进行肠环注射，在所指示的时间进行环重量的检测(平均值±标准误，每个时间点4只小鼠)。***图(底部)为有和没有CFTRinh-172(20μgi.p.(腹腔注射)，n＝4)时在30分钟的吸收率％。***图(上部)为CFTRinh-172的化学结构图。图B：为在小鼠闭合环模型中霍乱毒素诱导的体液分泌时间曲线。虚线显示对照(盐水注射)环。注射环(1μg霍乱毒素/环)的数据以平均值±标准误(4-6只小鼠)表示。
图11所示为给予小鼠霍乱毒素后CFTRinh-172对肠液分泌的抑制作用一组图示。图A：在小鼠环模型中体液累积抑制作用的量-效图。通过腹腔内注射给予小鼠单剂量的CFTRinh-172，在6小时检测环的重量(平均值±标准误，每个剂量4-6只小鼠)。虚线表示相同小鼠的盐水注射对照环的平均重量。图B：CFTRinh-172抑制作用的持续性。在给予霍乱毒素前后的指定的时间给小鼠注射20μg CFTRinh-172(i.p.)(每个时间点4-6只小鼠)。图C：静脉注射(i.v.)(尾静脉，左纵坐标)和口服给药(TPGS中的CFTRinh-172，右纵坐标)后血浆14C-CFTRinh-172放射活性的时间曲线。数据以每分钟每μCi注射的计数表示(4只小鼠)。图D：14C-CFTRinh-172静脉注射和口服给药后6小时，14C-CFTRinh-172在胃肠消化器官的累积(4只小鼠)。图E：口服给予CFTRinh-172(TPGS中200μg)对小鼠开放环模型中霍乱毒素诱导的体液分泌的抑制作用。数据以口服强饲后6小时腔液移去前后的全小肠重量比值表示(平均值±标准误，每组4只小鼠，*p＜0.01)。图F：CFTRinh-172跨Caco-2细胞单层的通透性(平均值±标准误，18个插片(insert))，其中Papp＝16×10-6cm/s。
图12所示为大鼠闭合环模型中CFTRinh-172对霍乱毒素(图A)和STa毒素(图B)诱导的体液分泌的抑制作用的一组图示。数据以平均值±标准误表示(每组4只大鼠)，*p＜0.01。
图13所示为小鼠回肠(图A)和人结肠(图B)中CFTRinh-172对毛喉萜和STa毒素刺激的短路电流的抑制作用的一组图示。STa毒素如***图所示。数据表示5只小鼠和两套人组织的研究结果。在组织的两侧同时加入CFTRinh-172。氨氯吡脒(10μM)存在于顶端溶液中。
图14所示为CFTRinh-172对T84结肠上皮细胞Cl-分泌的抑制作用的短路电流分析的一组图示。图A：数据以实验(每种条件下5-12个插片)的描记表示。在细胞层的两侧同时加入CFTRinh-172。CFTR激动剂包括毛喉萜(左侧)、8-Br-cGMP(中间)及CFTRACT-16(右侧)。图B：(左侧)利用两性霉素B(250μg/mL)进行基底侧通透作用后，CFTRinh-172对毛喉萜刺激的短路电流的抑制作用。所示为6次插片的实验。(中央)在通透性与(vs.)非通透性T84细胞中CFTRinh-172对毛喉萜刺激(圆)和8-Br-cGMP刺激(三角)短路电流的抑制作用平均量-效图(平均值±标准误，6-12个插片)。(右侧)存在高K+(68mM)的基底侧溶液与低Cl-顶端溶液中CFTRinh-172对毛喉萜刺激短路电流的抑制作用。所示为4次实验。
在描述本发明之前，应理解本发明并不限于所述的特定实施方案，其应该可以变化。也应理解，本文所用术语仅为描述特定实施方案的目的，并不是为了限制的目的，因为本发明的范围只能由所附的权利要求所限制。
除非有其它的定义，本文所用的技术和科学术语具有本发明所属技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料相似和等价的方法和材料能够用于本发明的实践和试验，但本文将对优选的方法和材料进行描述。本文所提及的所有出版物在此引用作为参考来公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
应指出，本文和所附权利要求中的单数形式“a”“an”及“the”包括复数的所述事物，除非文中有其它清楚的阐述。因此，例如“an抑制剂”的表示包括此抑制剂的复数，而且“the细胞”包括本领域所属技术人员公知的一种和多种细胞和其等价物的表示，等等。
本发明所讨论的出版物仅提供本申请提交日期之前的公开，并在此引用作为本文的参考。本文的任何参考不能认为是由于在早的发明而否定本发明早于这些出版物。此外，所提供的发表日期也可能与实际的发表日期不同，这需要分别对其证实。
本文所采用的定义是为了说明的原因而提供，而不能认为是限制。本文所用技术和科学术语应具有与本发明所属技术人员通常理解的相同含义。
发明的详细描述
本发明的根据是噻唑烷酮化合物和衍生物的发现，其为高亲和性的CFTR抑制剂。以下将更加详细地描述本发明所述化合物和衍生物的结构，以及药物制剂和使用方法。
定义
“囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白介导的疾病状态或症状”或“CFTR介导的疾病状态或症状”指由囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白(CFTR)的活性(例如，CFTR在离子转运中的活性)引起的任何状态、病症或疾病，或者这种状态、病症、或疾病症状。通过抑制CFTR的活性可对这种状态、病症、疾病或其症状进行治疗，例如，CFTR离子转运抑制作用。已发现CFTR活性包括，例如对各种激动剂(包括霍乱毒素)反应的肠分泌(参见例如，Snyder et al.1982 Bull.World Health Organ.60：605-613；Chao et al.1994 EMBO J.13：1065-1072；Kimberg et al.1971 J.Clin.Invest.50：1218-1230)。
本文所用“CFTR抑制剂”为降低由CFTR引起的离子转运效率的化合物，特别是由CFTR引起的氯离子转运。优选地，本发明的CFTR抑制剂为特异性CFTR抑制剂，即抑制CFTR活性而对其它离子转运剂的活性没有显著的或相反的作用，例如其它氯转运剂、钾转运剂等等。优选地，所述CFTR抑制剂为高亲和性CFTR抑制剂，例如，对CFTR的亲和性至少为约一个微摩尔，通常约一个到五个微摩尔。
本文所用的“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”涵盖个体中疾病、疾病状态、病症或症状的治疗，其中所述疾病、疾病状态、病症或症状由CFTR活性来介导，并包括：(1)预防所述疾病、疾病状态、或病症，即导致个体中所述疾病的临床症状不进展，其可暴露出或倾向于患有所述疾病、状态、或病症，但还没有经历或表现其症状，(2)抑制疾病、状态、或病症，即停滞或减少所述疾病、疾病状态或病症、或其临床症状的发展，或(3)缓解所述疾病、疾病状态、或病症，即导致所述疾病、疾病状态、或病症、或其临床症状的恢复。
“治疗有效作用剂量”或“有效剂量”指本发明化合物的剂量，其在将本发明化合物对需要该化合物的哺乳动物或其他个体给药时，对由所述CFTR活性介导的疾病、疾病状态、病症或症状，足以产生有效的如上所定义的治疗作用。构成“治疗有效剂量”的本发明化合物的量依据所述化合物、所述疾病及其严重程度以及待治疗个体的年龄、体重等等而有所不同，但本领域所属技术人员根据其掌握的知识并根据本公开能够常规确定。
所述术语“个体”和“患者”为任何哺乳动物和非哺乳动物种属的一个成员或多个成员，其可能需要本发明所述的制药方法、组合物和治疗。由此个体和患者包括但不限于，灵长类(包括人)、犬科、猫科、有蹄类动物(例如，马、牛、猪(例如猪(pig))、鸟类及其它个体。特别关注具有商业价值的人和非人动物(例如家畜和驯养动物)。
“哺乳动物”指任何哺乳动物种属的一个成员和多个成员，并包括作为示例的，犬科；猫科；马；牛；羊；啮齿动物等等以及灵长类，特别是人。非人动物模型特别是哺乳动物，例如灵长类、鼠科动物、兔类等可用于实验研究中。
本文所述术语“单位剂量形式”指物理分散的适合用于人和动物个体的单一剂量单位，每一单位中的成分含有预定量的本发明化合物，其根据足以产生所需效果的剂量来计算，并同时含有药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂。说明本发明新的单位剂量形式的说明书依据所用的特定化合物和预产生的作用、以及在宿主中每种化合物的药代动力学来确定。
所述术语“生理状态”包括与活存细胞匹配的状态，例如与活存的细胞匹配的温度、pH、盐度等等的主要的水环境状态。
“药物可接受的赋形剂”指用于制备药物组合物的赋形剂，其通常为安全、无毒、非生物的和不是其它不必要的物质，并包括兽用可接受和人用药物可接受的赋形剂。本发明说明书和权利要求书所用的“药物可接受赋形剂”同时包括一种和多种此类赋形剂。
本文所用的本发明化合物的“药物可接受衍生物”包括盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、乙缩醛、酮缩醇、原酸酯、半缩醛、半酮缩醇、酸、碱、溶剂化物、水合物或其前药。本领域所属技术人员使用公知的这种衍生作用的制备方法可容易地制备这种衍生物。由此制备的化合物不含基本毒性作用可对动物或人给药，或者其是制药活性的或是前药。
本发明化合物的“药物可接受的盐”指药物可接受并具有母体化合物的所需药理活性。这种盐包括：(1)酸加和盐，与无机酸(诸如盐酸、溴化氢、硫酸、硝酸、磷酸等等)形成；或与有机酸形成，该有机酸诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、反丁烯二酸(延胡索酸)、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟苯基)苯甲酸、月桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯亚磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]八-2-烯基-1-羧酸、葡庚糖酸、4，4’-亚甲基双-(3-羟基-2-烯基-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、己二烯二酸等等；或(2)当出现在母体化合物中的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土离子或铝离子)取代时，可形成盐；或与有机碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等等)共同形成盐。
本发明化合物的“药物可接受的酯”指药物可接受并具有所述母体化合物的所需药理学活性，且包括但不限于酸性基团(包括但不限于羧酸、磷酸、次磷酸、磺酸、亚磺酸及硼酸)的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基和杂环基酯。
本发明化合物的“药物可接受的烯醇醚”指药物可接受的烯醇醚并具有所述母体化合物的所需药理学活性，且包括但不限于通式C＝C(OR)的衍生物，其中R为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基或杂环基。
本发明化合物的“药物可接受的烯醇酯”指药物可接受的烯醇酯并具有所述母体化合物的所需药理学活性，且包括但不限于通式C＝C(OC(O)R)，其中R为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基或杂环基。
本发明化合物的“药物可接受的溶剂或水合物”指药物可接受的溶剂或水合物复合物并具有所述母体化合物的所需药理学活性，且包括但不限于本发明化合物与一种或多种溶剂或水分子、或1至约10种、或1至2、3、或4种溶剂或水分子的复合物。
“前药”指当前药对哺乳动物个体给药时，在体释放通式(I)的活性母体化合物的任何化合物。所述通式(I)化合物的前药包含在标准的生理条件下可水解成为对应的羧基、羟基、氨基或巯基的功能基团。这种功能基团的例子包括但不限于通式(I)化合物中羟基酯(例如乙酯、甲酯、苯甲酯衍生物)和氨基甲酸酯(例如，N，N-二甲基氨基羰基)等等。其它的例子包括通式(I)化合物中羟基或羧基的二肽或三肽酯等等。这种功能化合物的制备是本领域公知的。例如，含有与之相连的羟基(例如，当X1、X2、X3、Y1、Y2或Y3为羟基时)的通式(I)化合物可用含有自由羧基末端的羧酸或二肽来处理，在本领域公知的酯化条件下产生所需的酯类功能基团。同样地，含有与之相连的自由羧基的通式(I)化合物可用含有诸如丝氨酸残基的羟基(例如，-N(H)-C(H)(CH2OH)-C(O)-)的醇或三肽来处理，在本领域公知的酯化条件下产生所需的酯类功能基团。此外，含有与之相连的羧基酯基团的通式(I)化合物可用不同的羧基酯来处理，在酯基转移作用条件下生成具有所需功能酯基与之相连的通式(I)化合物。所有这种功能基团属于本发明的范围。
本文所用术语“有机基团”和“有机根”指任何含碳基团，包括烃基，其分为脂肪烃、环烃、芳香烃、其功能化衍生物和/或其各种组合物。术语“脂肪烃”指饱和或不饱和直链或支链烃基并包括例如烷基、烯基和炔基。术语“烷基”指取代或非取代、饱和直链或支链烃基或链(例如，C1-C8)包括例如，甲基、乙基、异丙基、t-丁基、庚基、n-辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基等等。适合的取代包括羧基、保护的羧基、氨基、保护的氨基、卤素、羟基、保护的羟基、巯基、低级烷基硫基(lower alkylthio)、硝基、氰基、单取代氨基、保护的单取代氨基、双取代氨基、C1-C7烷氧基、C1-C7酰基、C1-C7酰氧基等等。术语“取代烷基”指上述定义的烷基基团被羟基、保护的羟基、氨基、保护的氨基、氰基、卤素、三氟甲基、单取代氨基、双取代氨基、低级烷氧基、巯基、低级烷基硫基、羧基、保护的羧基、或羧基、氨基、和/或羟基盐进行了一至三次的取代。如与杂芳香环的取代基使用相关联，下文定义的术语“取代(环烷基)烷基”和“取代环烷基”由所列出的“取代烷基”相同基团所取代。术语“烯基”指具有诸如乙烯基的具有一个或多个碳-碳双键的不饱和、直链或支链烃基。术语“炔基”指具有一个或多个碳-碳三键的不饱和、直链或支链烃基。术语“环基”指闭合的环烃基，其分为脂环基、芳香基或杂环基。术语“脂环基”指具有类似脂肪族基性的环烃基。“芳香基”或“芳基”指单环或多环芳香烃基，并可包括一种或多种杂原子，下文对其做了进一步定义。术语“杂环”指闭合的烃，其中环中的一个或多个原子为非碳元素(例如，N、O、S等)且下文做了进一步定义。
“有机基团”可以功能化或另外含有附加的与有机基团相关的功能基团，诸如羧基、氨基、羟基等等，其可以是保护的或未保护的。例如，短语“烷基基团”应不仅包括纯的开链饱和烃烷基取代基，诸如甲基、乙基、丙基、t-丁基等等，而且还包括含有另外本领域公知的取代基的烷基取代基，所述取代基诸如羟基、烷氧基、巯基、烷基硫基、烷基磺酰、卤素、氰基、硝基、氨基、羧基等等。因此“烷基基团”包括醚、酯、卤代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羟基烷基、磺烷基等等。
本文替换使用的术语“卤代基团”或“卤素”指氟、氯、溴、碘基团。优选的卤素为氯和氟。
术语“卤代烷基”指由一种或多种卤素原子取代的上述定义的烷基基团。所述的卤素可以相同或不同。术语“二卤代烷基”指由两个卤基取代的上述烷基基团，卤基可以相同或不同。术语“三卤代烷基”指由三个卤基取代的上述烷基基团，卤基可以相同或不同。术语“全卤烷基”指上述定义的卤烷基基团，其中烷基基团中的每个氢原子都被卤素原子取代。术语“全氟代烷基”指上述定义的卤烷基基团，其中所述烷基基团中的每个氢原子都被氟基取代。
术语“环烷基”指单环、双环或三环的饱和环，其为完全饱和/或部分不饱和。这种基团的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基、环辛基、顺-或反-萘烷、二环[2.2.1]七-2-烯(bicycle[2，2，1]hept-2-ene)、环己-1-炔基、环戊-1-炔基、1，4-环辛二炔基，等等。
术语“(环烷基)烷基”指上述定义的烷基基团被一个上述环烷基取代。这种基团的例子包括(环己基)甲基、3-(环丙基)-n-丙基、5-(环戊烷)己基、6-(金刚烷基)己基，等等。
术语“取代苯基”特指由一个或多个部分取代的苯基基团，在一些例子中，由一个或两个或三个部分所取代，其选自卤素、羟基、保护的羟基、氰基、硝基、巯基、烷基硫基、三氟甲基、C1-C7烷基、C1-C7烷氧基、C1-C7酰基、C1-C7酰氧基、羧基、氧羧基、保护的羧基、羧甲基、保护的羧甲基、羟甲基、保护的羟甲基、氨基、保护的氨基、(单取代)氨基、保护的(单取代)氨基、(双取代)氨基、甲酰氨基、保护的甲酰氨基、N-(C1-C6烷基)甲酰氨基、保护的N-(C1-C6烷基)甲酰氨基、N，N-二(C1-C6烷基)甲酰氨基、三氟甲基、N-((C1-C6烷基)磺酰)氨基、N-(苯磺酰)氨基或苯基、取代或非取代的例如二苯基或萘基基团产物。
术语“取代苯基”的例子包括单或双(卤代)苯基基团，例如，2-，3-或4-氯苯基、2，6-二氯苯基、2，5-二氯苯基、3，4-二氯苯基、2-，3-或4-溴苯基、3，4-二溴苯基、3-氯-4-氟苯基、2-，3-或4-氟苯基等等；单或双(羟基)苯基基团，例如2，3，或4-羟基苯基、2，4-二羟基苯基、及其保护的羟基衍生物等等；硝基苯基基团例如，2-，3-或4-硝基苯基；氰基苯基基团，例如，2-，3-或4-氰基苯基；单或双(烷基)苯基例如，2-，3-或4-甲基苯基、2，4-二甲基苯基、  2-，3-或4-(异丙基)苯基、2-3-或4-乙基苯基、2-，3-或4-(n-丙基)苯基等等；单或二(烷氧基)苯基基团，例如，2，6-二甲氧基苯基、2-，3-或4-(异丙氧基)苯基、2-，3-或4-(t-丁氧基)苯基、3-乙氧基-4-甲氧苯基等等；2-，3-或4-三氟甲基苯基；单羧基苯基或二羧基苯基或(保护的羧基)苯基基团，例如2-，3-或4-羧基苯基或2，4-二(保护的羧基)苯基；单或二(羟甲基)苯基或(保护的羟甲基)苯基，例如2-，3-或4-(保护的羟甲基)苯基或3，4-二(羟甲基)苯基；单或二(氨甲基)苯基或(保护的氨甲基)苯基例如，2-，3-或4-(氨甲基)苯基或2，4-(保护的氨甲基)苯基；或单或二(N-(甲磺酰氨基))苯基例如，2-，3-或4-(N-(甲磺酰氨基))苯基。而且，所述术语“取代苯基”代表双取代苯基基团，其中所述的取代基是不同的，例如，3-甲基-4-羟基苯基、3-氯-4-羟基苯基、2-甲氧基-4-溴苯基、4-乙基-2-羟基苯基、3-羟基-4-硝基苯基、2-羟基-4-氯苯基等等。
术语“(取代苯基)烷基”指一种上述取代苯基基团连于一种上述烷基基团上。这种基团的例子包括2-苯基-1-氯乙基、2-(4’-甲氧基苯基)乙基、4-(2’，6’-二羟基苯基)-n-己基、2-(5’-氰基-3’-甲氧基苯基)-n-苯基、3-(2’，6’-二甲基苯基)丙基、4-氯-3-氨基苄基、6-(4’-甲氧基苯基)-3-羧基己基、5-(4’-氨甲基苯基)-3-(氨甲基)苯基、5-苯基-3-羰基戊基-1-基、(4-羟基萘基-2-基)甲基等等。
如上所述，术语“芳香的”或“芳基”指五元和六元碳环。同时如上所述，术语“杂芳基”指任意取代的五元或六元环，其含有1-4个杂原子，例如氧、硫和/或氮原子，特别是氮原子，可单独或与环上的氧或硫原子连接。这些五元或六元环可以是完全不饱和的。
此外，上述任意取代五元或六元环可能任意地稠合到芳香族五元或六元环体系中。例如，所述的环能任意地稠合到诸如吡啶或***体系的五元或六元环体系中，且优选苯环。
下列环体系为由术语“杂芳基”表示的杂环(无论取代或非取代)基团的例子：噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡咯烷基、咪唑基、异噁唑基、***基、噻二唑基、氧杂二唑基、四唑基、噻***基、氧杂***基(oxatriazolyl)、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、噁嗪基、三嗪基、噻二嗪基四唑并、1，5-[b]哒嗪基及嘌呤基、以及苯并稠合衍生物，例如苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基及吲哚基。
上述任意取代的杂芳基环的取代基来自一到三个卤素、三卤代甲基、氨基、保护的氨基、氨盐、单取代氨基、双取代氨基、羧基、保护的羧基、羧酸盐、羟基、保护的羟基、羟基基团的盐、低级烷氧基、巯基、低级烷基硫基、烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、(环烷基)烷基、取代的(环烷基)烷基、苯基、取代苯基、苯基烷基以及(取代的苯基)烷基。杂芳基基团的取代基如上所定义，或当为三卤代甲基时，为三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基或三碘甲基。用作与上述杂芳基环相关的的取代基时，“低级烷氧基”指C1-C4烷氧基基团，同时“低级烷基硫基”指C1-C4烷基硫基基团。
术语“(单取代)氨基”指由一种取代基取代的氨基，该取代基选自苯基、取代苯基、烷基、取代烷基、C1-C4酰基、C2-C7烯基、C2-C7取代烯基、C2-C7炔基、C7-C16烷基芳基、C7-C16取代烷基芳基及杂芳基基团。所述的(单取代)氨基可另外含有氨基保护的基团作为术语“保护的(单取代)氨基”所包含的内容。术语“(双取代)氨基”指由两种取代基取代的氨基基团，该取代基选自苯基、取代苯基、烷基、取代烷基、C1-C7酰基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C7-C16烷基芳基、C7-C16取代烷基芳基和杂芳基。这两种取代基可以相同或不同。
术语“杂芳基(烷基)”指由上述定义的杂芳基基团在任何位置上取代上述定义的烷基基团。
“任意的”或“任意地”指随后描述的事件、情况、特征或元素可以(但不必要)发生，且该描述包括该事件和情况发生的例子及其不发生的例子。例如，“利用烷基基团任意地单取代或双取代的杂环基团”指所述的烷基可以(但不必要)出现，且该描述包括利用烷基基团对该杂环基团进行单取代或双取代的状态以及不用该烷基基团对该杂环基团进行取代的状态。
术语“吸电子基团”指在分子中功能基团将电子吸至其本身的能力多于如果是氢原子占据了所述分子中相同的位置时的吸电子能力。吸电子基团的例子包括但不限于，卤素基团，-C(O)R基团(其中R为烷基)；羧酸和酯基；-NR3 +基团(其中R为烷基或氢)；偶氮基；硝基；-OR和-SR基(其中R为氢或烷基)；以及含有此类吸电子基团的有机基团(如本文所定义的)，例如卤代烷基基团(包括全卤代烷基基团)，等等。
具有相同分子式但其原子成键的特性或顺序不同、或者其原子的空间排列不同的化合物称为“同分异构体”。其原子的空间排列不同的同分异构体称为“立体异构体”。相互不是镜像对映的立体异构体称为“非对映异构体”，而相互为非叠加镜像对映的立体异构体称为“对映异构体”。当化合物具有非对称中心时，例如，其结合有四种不同的基团，一对立体异构体的存在是有可能的。能够利用其非对称中心的绝对构型来标记对映异构体，并可利用Cahn与Prelog的R-与S-顺序规则来描述，或者通过其分子旋转偏振光平面并可指定为右旋的或左旋的异构体(即，分为为(+)或(-)异构体)来描述。手性化合物能以单一的对映异构体或以其混合物的形式存在。含有所述对映异构体等份的混合物称为“外消旋混合物”。
本发明的化合物可具有一个或多个非对称中心；因此这种化合物可制备成为独立的(R)-或(S)-立体异构体或其混合物。除非有其它提示，本发明说明书和权利要求书中的特定化合物的描述或命名应同时包括单一对映异构体及其混合物、其外消旋体或其它。立体化学的鉴定和立体异构体的分离方法是本领域公知的(参见例如，“Advanced OrganicChemistry”第四章，第四版，J.March，John Wiley and Sons，New York，1992中的讨论).
概述
本发明提供噻唑烷酮组合物、噻唑烷酮衍生物组合物及其用于高度亲和性的抑制囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白(CFTR)的方法，以及对CFTR介导疾病和状态的研究和治疗方法。本发明主题噻唑烷酮化合物及其衍生物的发现是利用鉴定与CFTR直接作用的CFTR抑制剂的分析来进行的大量潜在候选化合物的筛选实现的。由于通过不同活化途径发挥作用的多种CFTR活化剂包括在鉴定该主题化合物的研究中，因此没有坚持任何特定理论和操作模式，本发明所述的抑制性化合物似乎通过在或邻近CFTR Cl-转运通道发挥抑制作用。对50,000种不同化合物的筛选确定出了作为有效CFTR抑制剂的一些2-硫代-4-噻唑烷酮化合物及衍生物。  这些化合物和衍生物与以往公知的CFTR激动剂和以往公知的CFTR抑制剂DPC、NPPB或优降糖(glibenclamide)没有化学和结构上的关联。从筛选中鉴定的大多数有效的CFTR抑制剂在人气道细胞中Cl-电流抑制作用的KI为～300nM。抑制作用是快速、可逆且CFTR特异的。
现在对本发明的组合物和方法作更加详尽的描述
噻唑烷酮化合物和衍生物
用于本发明组合物和方法中的所述噻唑烷酮化合物和衍生物包括五个或更多原子的杂环，其包括苯环取代的氮、至少一个硫、氧或硒杂原子，以及与杂环结合的一种或多种羰基或硫代羰基。更具体地，该主题噻唑烷酮化合物和衍生物可具有以下通式(I)：
Figure C0382336600241
其中X1、X2和X3独立选自氢、有机基团、卤素、硝基、偶氮基、羟基及巯基；Y1、Y2和Y3独立选自氢、有机基团、卤素、硝基、偶氮基、羟基及巯基；A1和A2独立选自氧和硫，A3选自硫和硒；以及A4含有一个或多个碳或杂原子且可存在或不存在；或者其药物可接受的衍生物，作为单一的立体异构体或其混合物。当在该中心杂环中没有A4时，其为五元环。
在某些实施方案中，上述通式(I)的所述噻唑烷酮化合物和衍生物包括通式(Ia)：
Figure C0382336600251
其中X1、X2和X3独立选自氢、有机基团、卤素、硝基、偶氮基、羟基及巯基；Y1、Y2和Y3独立选自氢、有机基团、卤素、硝基、偶氮基、羟基及巯基；以及A1和A2独立选自氧和硫。在特定的实施方案中，X1可以是吸电子基团、并可包括卤代烷基基团、二卤代烷基基团、三卤代烷基基团(例如，三氟烷基基团)和氟基。Y2独立选自烷基、羟基、羧基、硝基、碳酸酯、氨基甲酸酯、烷氧基、烷基羰基及卤素基团，Y1独立选自羟基和溴基，以及Y3独立选自氢和硝基。
在许多实施方案中，通式(I)所述的噻唑烷酮化合物和衍生物可包括通式(Ib)的3-芳基-5-芳基亚甲基-2-硫代-4-噻唑烷酮，
Figure C0382336600252
其中至少一种X1、X2和X3为吸电子基团；以及Y1、Y2和Y3独立选自氢、烷基、羟基、羧基、硝基、碳酸酯、氨基甲酸酯、烷氧基、烷基羰基及卤素基团。在一个实施方案中，X1所在的位置选自2、3、或4；Y2所在位置选自2、3或4；以及Y1和Y3可以为氢。
所述的3-芳基-5-芳基亚甲基-2-硫代-4-噻唑烷酮可具体地具有通式(Ic)：
Figure C0382336600261
其中Y1-Y3如上所述。在一个实施方案中，所述三氟甲基基团所处的位置选自2、3或4；Y2所处的位置选自2、3或4；其中此实施方案中的Y1和Y3可以为氢。
在本发明的一些实施方案中，本发明所述的噻唑烷酮化合物包括：
Figure C0382336600262
即，3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-硝基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；及
Figure C0382336600263
即，3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-氧羧苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；及
Figure C0382336600264
即，3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；及
Figure C0382336600271
即，3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3，4-二羟基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；及
Figure C0382336600272
即，3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；及
Figure C0382336600273
即，3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3-溴-4-羟基-5-硝基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。可选择地，任何上述的化合物中的三氟甲基基团可以处于苯环的2位或4位。
药物制备
本发明还提供上述主题化合物的药物制备。该主题化合物可组成用于治疗性给药的各种给药途径的各种制剂。更特别的是，本发明化合物通过与适合的药物可接受载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂组合能够组方成为药物组合物，也可组方成为固体、半固体、液体或气态形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂及气雾剂。优选地，所述制剂不含能检测到的DMSO(二甲基亚砜)，其不是非局部、肠道外和肠道内给药的药物可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。所述的制剂可通过包括口服、口腔、直肠、非肠道、腹腔内、皮内、透皮、气管内等等不同的给药途径对需要该药物的个体或患者给药。
在一个实施方案中，局部给药(例如透皮给药)是有益的。局部给药制剂可以是透皮贴、栓剂、糊剂、洗剂、膏剂、胶剂等等的形式。局部制剂可包括一种或多种渗透剂、增稠剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或结合剂。当所述化合物制备成为透皮传输时，所述化合物可与渗透增强剂一同组方或与其一同使用。渗透增强剂(penetration enhancers)包括化学渗透增强剂和物理渗透增强剂，能促进所述化合物通过皮肤传输，并也可替代地称为“渗透增强剂(permeation enhancers)”。物理的渗透增强剂包括例如，诸如离子电渗法的电泳技术、超声的应用(或“phonophoresis”)等等。化学渗透增强剂是在化合物给药前、同时或给药后即刻给药的试剂，其可增加皮肤特别是角质层的通透性，来提供该药物通过皮肤的增强的渗透效果。
用来增强皮肤通透性的化合物包括：亚砜，二甲基亚砜(DMSO)和癸基甲基亚砜(C10MSO)；醚，诸如二乙二醇单乙基醚、十氧乙烯基-十八碳烯醚(dekaoxyethylene-oleylether)，和二乙二醇单乙基醚；表面活性剂，诸如月桂酸钠、十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基三甲基铵、氯化苄烷铵、泊咯沙姆(Poloxamer)(231，182，184)、吐温(20，40，60，80)及卵磷脂；1-取代氮杂环庚烷-2-酮，特别是1-N-月桂基氮杂环庚烷-2-酮；醇，诸如乙醇、丙醇、辛醇、苄基醇等等；矿脂，诸如石油冻胶(矿酯)，矿物油(液体矿脂)等等；脂肪酸，诸如C8-C22和其它脂肪酸(例如，异硬脂酸、辛酸，油酸、月桂酸、戊酸)；C8-C22脂肪醇(例如，油烯醇、月桂醇)；C8-C22脂肪酸和其它脂肪酸的低级烷基酯(例如，油酸乙酯、豆蔻酸异丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸甲酯、豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、甲基丙酸酯、油酸乙酯)；C8-C22脂肪酸的甘油一酯(例如，十二烷基甘油一酯)；四氢化糠基醇聚乙烯乙二醇醚；2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇；二乙二醇单甲醚；聚乙烯氧化物的烷基芳基醚；聚乙烯氧化单甲基醚；聚乙烯氧化二甲基醚；C6-C8二酸的联低级烷基酯(例如乙二酸二异丙酯)；乙酸乙酯；乙酰乙酸酯；其多元醇和酯，诸如丙烯乙二醇、乙烯乙二醇、甘油、丁二醇、聚乙烯乙二醇及单十二酸聚乙烯乙二醇酯；胺和其它含氮化合物，例如尿素、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、2-吡咯烷酮、N-烷基吡咯烷酮(例如1-甲基-2-吡咯烷酮)；乙醇胺、二乙醇胺及三乙醇胺；萜烯；烷酮(alkanones)及有机酸，特别是水杨酸和水杨酸盐、柠檬酸和琥珀酸。其它的化学和物理渗透增强剂例如Transdermal Delivery of Drugs，A.F.Kydonieus(ED)1987 CRL Press；Percutaneous Penetration Enhancers，eds.Smith et al.(CRC Press，1995)；Lenneruas et al.，J Pharm Pharmacol 2002；54(4)：499-508；Karande et al.，Pharm Res 2002；19(5)：655-60；Vaddi et al.，J Pharm Sci 2002 July；91(7)：1639-51；Ventura et al.，J Drug Target 2001；9(5)：379-93；Shokri et al.，Int J Pharm 2001；228(1-2)：99-107；Suzuki etal.，Biol Pharm Bull 2001；24(6)：698-700；Alberti et al.，J Control Release2001；71(3)：319-27；Goldstein et al.，Urology 2001；57(2)：301-5；Kiijavainen et al.，Eur J Pharm Sci 2000；10(2)：97-102；及Tenjarla et al.，Int J Pharm 1999；192(2)：147-58中所述。
当所述化合物与化学渗透增强剂组方时，所述的渗透增强剂选自与所述化合物匹配的并以满足促进所述化合物通过个体皮肤传输的剂量存在，例如用于将该化合物对全身循环的传输。在一个实施方案中，所述化合物与渗透增强剂而不是DMSO组方。
在一个实施方案中，所述化合物在药物传输贴剂中提供，例如透粘膜和透皮贴剂，并可与渗透增强剂组方。所述的贴剂通常包括支持层(其对化合物和其它制剂组分是不通透的)、与所述支持层的一面接触的基质(该基质提供缓释所述化合物，即可控制释放)、以及粘合层(其与所述基质位于所述支持层的相同的一侧)。所述基质可选择为适合给药途径的，且可为例如可为聚合的或水溶胶基质。
在药物制剂中，本发明所述的主题化合物可以其药物可接受的衍生物形式给药，例如盐，或者其可单一或与其它药物活性化合物以适当的联合、以及组合的形式使用。以下的方法和赋形剂仅仅是实例而不是对本发明的任何限制。
对于口服制剂，所述的主题化合物可单一或与适合的添加剂组合来制备片剂、粉剂、颗粒和胶囊，例如，与常规的添加剂，诸如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与结合剂，诸如结晶纤维素、纤维素衍生物、***胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂，诸如滑石或硬脂酸镁；如需要，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂及调味剂组合。特别有益的是，所述主题噻唑烷酮化合物与缓冲剂的组方可提供所述化合物对低pH的胃酸环境的保护的作用。也可优选提供一种肠包被来避免通过胃时所述化合物的沉淀。
本发明所述的主题化合物可通过将其在水溶性或非水溶性溶液(诸如植物或其它类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙稀乙二醇)中溶解、悬浮或乳化组方到注射制剂中；及如果需要，可与常规的添加剂(诸如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂剂防腐剂)组合。特别有益的增溶剂包括维生素E TPGS(d-α-生育酚聚乙烯乙二醇1000琥珀酸酯)、环糊精等等。
本发明的化合物能够用于气雾剂制剂通过吸入给药。本发明的化合物可组方到压力可接受的诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等等的发射剂(气雾剂基质)中。
此外，所述的主题化合物可通过与多种碱(诸如乳化碱或水溶性碱)混合制成栓剂。本发明所述化合物可通过栓剂进行直肠给药、所述的栓剂能够包括诸如可可酯、聚乙二醇及聚乙烯乙二醇的赋形剂，其在体温下溶化，而在室温下固化。
可提供口服或直肠给药的单位剂型，例如糖浆剂、酏剂、悬浮液，其中每种剂量单位，例如一茶匙容量、一汤匙容量、片剂或栓剂，含有组合物(含有一种或多种抑制剂)的预定剂量。同时，注射或静脉内给药的单位剂型可包括溶于无菌水、生理盐水或其它药物可接受载体的溶液组合物中的所述抑制剂。
根据个体和所治疗的疾病状态，以及给药途径，所述的主题化合物以例如每天0.1μg-10mg/kg体重剂量给药。由于治疗作用的通常效力对于不同的哺乳动物有很大的不同，表现为在人中的剂量通常小于大鼠的20、30或甚至40倍(每单位体重)，因此所述的剂量范围较广。同样地，给药的形式对剂量的影响也较大。发明者发现小鼠中霍乱毒素诱导的肠液分泌可被约10-20微克的单剂量腹腔内给药阻断，约10倍高于大鼠的有效剂量。因此例如口服剂量可以是注射剂量的约10倍。更高的剂量可用于局部途径给药。
通常的剂型可以是适合于静脉内给药的溶液；片剂每天摄入2-6次，或每天摄入一次含有较高比例含量活性成分的时间-控释胶囊或片剂等等。通过溶解在不同pH值的胶囊材料、利用渗透压缓慢释放的胶囊、或通过其它任何公知的控制释放手段可获得所述的时间-控释作用。
对于主题方法的应用，所述主题化合物可与其它药物活性试剂包括CFTR抑制剂组方。
用于本发明的药物可接受赋形剂，诸如赋形剂(vehicles)、佐剂、载体或稀释剂，公众可容易地得到。此外，药物可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲试剂、渗透压调节剂、稳定剂、润湿剂等等，也是公众容易得到的。
本领域所属技术人员可以理解，根据特定化合物的功能、所述症状的严重程度以及所述个体产生副作用的敏感性，可改变剂量水平。本领域所述技术人员利用各种手段可容易地确定所给出化合物的优选剂量。
本发明提供含有所述主题化合物的单位剂型的药盒，通常为口服或注射剂型。在这种药盒中，除含有所述单位剂型外，该容器应包括描述所述药物在治疗所感兴趣的病理学状态的用途和伴随效果的信息性包装插页。优选的化合物和单位剂量是上文中所描述的。
属于本发明CFTR抑制剂进行治疗的疾病状态
本文所公开的CFTR抑制剂可用于CFTR介导的疾病状态的治疗，即，由CFTR活性(例如，离子转运中的CFTR活性)导致的任何疾病状态、病症或疾病、或这种疾病状态、病症或疾病状态的症状。这种疾病状态、病症或疾病、或其症状适用通过CFTR活性抑制作用进行治疗，例如CFTR离子转运的抑制作用。
在一个实施方案中，本发明所述CFTR抑制剂用于异常增加的肠分泌相关的疾病状态的治疗，特别是急性异常增加肠分泌。已揭示了CFTR活性在肠分泌中的作用，该肠分泌是对各种激动剂包括霍乱毒素的反应(参见例如，Snyder et al.1982 Bull.World Health Organ.60：605-613；Chaoet al.1994 EMBO J. 13：1065-1072；Kimberg et al.1971 J. Clin.Invest.50：1218-1230)。因此本发明的CFTR抑制剂可以通过抑制CFTR转运的有效剂量给药由此降低肠液分泌。
因此，CFTR抑制剂可用于肠道过敏性病状和腹泻、特别是分泌性腹泻的治疗。在发展中国家，分泌性腹泻是婴儿死亡的最重要原因，每年约有5百万死亡人数(Gabriel et al.，1994 Science 266：107-109)。一些研究，包括使用CF小鼠的研究，表明CFTR是对各种激动剂反应的肠氯离子(并因此形成液体)分泌的最终通用通道(Snyder et al.，1982，Bull.World HealthOrgan.60：605-613；Chao et al.，1994 EMBO.J.13：1065-1072；和Kimberget al.，1971，J.Clin.Invest.50：1218-1230)。本发明使用小鼠肠液分泌模型表明，非毒性剂量的所述抑制剂的***给药产生的CFTR抑制作用可有效地阻断有霍乱毒素诱导的肠液分泌(见实施例)。
能够使用本发明所述的CFTR抑制剂治疗的腹泻是由于暴露于各种病原体和制剂而产生的，其包括但不限于霍乱毒素(Vibrio cholera)、大肠杆菌E.coli(特别是产肠毒素的(ETEC))、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌(Campylobacter)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridiurra difficile)、寄生虫(例如，贾第鞭毛虫属(Giardia)、肠阿米巴属(Entamoeba histolytica)、隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)、无孢子纲(Cyclospora))、腹泻病毒(例如轮状病毒)、食物毒素、或能够产生由CFTR介导的增加的肠分泌的肠毒素暴露。
其它的腹泻包括AIDS伴随腹泻(例如，AIDS相关腹泻)以及炎性胃肠病症，例如溃疡性结肠炎、炎性肠病(IBD)、Crohn′s病等等。有报道，肠炎症可改变三种主要的肠盐转运介导剂的表达并可产生溃疡性结肠炎的腹泻，其同时通过增加跨上皮Cl-分泌和抑制上皮的NaCl吸收而产生(参见例如，Lohi et al.，2002，Am.J. Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.283(3)：G567-75)。
本发明的CFTR抑制剂也可用于诸如多囊肾脏疾病的治疗，并发现通过抑制睾丸的CFTR活性可用作男性不育药物。
本发明的CFTR抑制剂还可用于大动物模型的筛选中(例如，Spira etal.，1981，Infect.Immun.32：739-747所述的家兔模型)。此外，对使用活霍乱弧菌(Vibrio cholerae)产生的大便***物的分析也可进一步检测本发明所述CFTR抑制剂的特性。
CFTR缺陷的非人动物模型和人组织模型
本发明所述的CFTR抑制剂也可用于产生疾病的非人动物模型，其中所述疾病与降低的CFTR功能有关(例如，降低的离子转运)。不断增加的证据表明在CFTR缺乏患者中，特别是在受到囊性纤维化(CF)作用的患者中，气道粘膜下腺产生的液体和大分子分泌缺陷可导致粘膜纤毛和细菌清除功能的损伤；然而，在人气道腺的功能研究限于在肺移植中获得的严重患病气道(Jayaraman et al.2001 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：8119-8123)。急性CFTR抑制作用使测定CFTR在粘膜下腺介导的水、盐和大分子分泌中的作用成为可能。高亲和性CFTR抑制剂能够产生模拟人CFTR缺乏(例如模拟人CF表型)的非人动物模型的药理学创造物。特别是，发现CFTR缺乏的大动物模型(例如CF)在阐明CF气道疾病开始和进程中病理生理学机制，以及评价CF的治疗效果，例如筛选CFTR缺陷或其症状治疗的候选试剂中的特定用途。
在气道和胰腺病症以及男性不育中可阐明CFTR离子转运的抑制作用。例如，在所述肺和气道中的CFTR通道抑制作用可影响气道表面液体产生的粘液堆积，其进一步阻塞气道并严重聚集在肺壁上，提供了发生感染的基本环境，从而导致慢性肺病。这种相同的情况会发生在胰腺中，其中堆积的粘液破坏了胰腺的外分泌功能并阻止了必需的食物处理酶进入肠道。
通过能够有效降低CFTR离子转运活性的CFTR抑制剂剂量的给药可产生非人动物模型。特别有益的是，本发明的CFTR抑制剂在诱导非人动物囊性纤维化(CF)表型中的用途。在例如肺中进行有效抑制CFTR受体的CFTR抑制剂剂量的给药可模拟在CF中发现的CFTR缺乏。CFTR抑制剂的给药途径如上已做了详细的描述。依据所使用的非人动物，所述主题化合物可以例如50-500μg/kg体重，每天1至3次的剂量提供腹腔内、皮下或其它的途径来产生非人的动物模型。口服剂量可高于所述腹腔内或皮下给药剂量的约10倍。
CFTR相关疾病的非人动物模型能够用作任何适合的与降低的CFTR活性相关的疾病状态的模型。这种疾病状态包括与CFTR突变相关的疾病，该突变可产生上皮离子和转运的异常。这些异常可进一步与气道以及其它粘膜上皮和管道上皮粘膜纤毛的清除扰乱有关。通过在非人动物中诱导CFTR缺乏表型，可药理学模建的疾病状态包括但不限于囊性纤维化(包括非典型CF)、特发性慢性胰腺炎(idiopathic chronic pancreatitis)、输精管缺陷(vas deferens defects)、轻度肺病、哮喘等等。与CFTR功能损失有关的病症综述参见例如，Noone et al.Respir Res 2 328-332(2001)。CFTR抑制剂产生的非人动物模型也可用作CFTR缺乏个体中微生物感染的模型(例如，细菌、病毒和真菌，特别是呼吸道感染)。在一个特别有益的实施方案中，本发明所述的CFTR抑制剂用于药理学诱导囊性纤维化(CF)表型。
适合用于产生本发明的动物模型的动物包括任何动物，特别是哺乳动物，例如非人灵长类(例如，猴子、黑猩猩、大猩猩等等)、啮齿类(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂等等)、兔类、猪(swine)(例如猪(pig)、小型猪(miniature pig))、马、犬科、猫科等等。对大型动物是特别感兴趣的。
所述的CFTR抑制剂也可与分离的人组织接触来产生疾病的离体处理在体应用(ex vivo)模型。这种组织可与有效降低所述组织中CFTR活性的CFTR抑制剂剂量接触，其可少至15分钟或多达2小时或更长。感兴趣的人组织包括但不限于，肺(包括气管和气道)、肝、胰腺、睾丸等等。在抑制剂处理的组织上可进行生理学、生物化学、基因组学或其它研究来鉴定对疾病的病理生理学有重要意义的新的治疗靶分子。例如来自人肺CF的分离组织可暴露于足以诱导所述的CF表型的抑制剂，并且可进行这种研究来鉴定对CF病理生理有重要意义的新的治疗靶分子。
本发明化合物的合成
根据本领域所属技术人员公知的方法或与US 5,326,770和US6,380,186(其全部引用作为本的参考)公开的相似方法，或与以下所述方法相似的方法，可制备本发明的化合物。
应理解，在以下的描述中，所述通式的取代基和/或变体的组合只在其结构产生稳定化合物的时候是允许的。
本领域所述技术人员也可理解，在以下所述的步骤中只有中间化合物的功能基团可能需要通过稳定的保护基团来保护。这种功能基团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。对羟基适合的保护基团包括三烷基甲硅烷基或二烷基甲硅烷基(例如，t-丁基二甲基甲硅烷基、t-丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苯甲基等等。对于氨基、脒基和胍基的适的保护基团包括t-丁氧基羰基、苄氧基羰基等等。对于巯基适合的保护基团包括-C(O)-R(其中R为烷基、芳基或芳基烷基)、p-甲氧基苄基、三苯甲基等等。对于羧酸适合的保护基团包括烷基酯、芳基酯或芳烷基酯。
根据本领域所述技术人员公知的并如本文所述的常规技术可加入或移去保护基团。
保护基团的用途参见Theodora W.Greene，Peter G.M.Wuts，Protective groups in Organic Synthesis(1999)，3rd Ed.，Wiley-Interscience中的详细描述。所述的保护基团可以是诸如Wang树脂或2-氯代三苯甲基氯化物树脂的聚合树脂。
本领域所属技术人员也可理解，尽管这种通式(I)化合物的保护衍生物如上所述(例如，在本文的概述和噻唑烷酮化合物和衍生物中所述)，可能不具有如此的药理学活性，但它们可对哺乳动物给药并随后在体内代谢形成本发明的具有药理学活性的化合物。因此这种衍生物称为“前药”。所有通式(I)的前药均在本发明的范围内。
以下的反应方案显示了制备本发明化合物的方法。应理解，本领域所属技术人员可根据相似的方法和根据本领域所述技术人员公知的方法能够制备本发明的化合物。通常，从诸如Aldrich的来源或根据本领域所述技术人员公知的来源合成获得起始组分(参见例如，Smith and March，March′s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，andStructure，5th edition(Wiley Interscience，New York))。此外，根据本领域所述技术人员公知的方法可将本发明化合物的各种取代基团(例如，X1、X2、X3、Y1、Y2及Y3等)连于所述的起始组分、中间组分和/或终产物上。
在以下的反应方案中，R代表烷基或芳基烷基，W代表诸如Cl、Br或I的卤素原子。
以下的反应方案1针对通式(1)化合物的制备，其为上述本发明的化合物(例如，在本文的概述及噻唑烷酮化合物和衍生物中所述)，其中A4不存在，且A1、A2、A3、X1、X2、X3、Y1、Y2及Y3如上所述(例如，在本文的概述及噻唑烷酮化合物和衍生物中所述)。
反应方案1
Figure C0382336600361
通常，首先通过通式(a)化合物与等当量的诸如NaOH的碱在室温下反应制备通式(1)化合物。随后将溶解于适当的诸如THF的溶剂中的通式(b)化合物加入反应混合物中。然后将所产生的反应混合物搅拌约1小时-约24小时。再将一种诸如HCl的酸加入该反应混合物中。然后将所产生的反应混合物搅拌约1小时-约24小时。通过常规的分离和纯化技术将通式(c)的化合物从该反应混合物中分离。在常规的Knoevenagel缩合条件下随后将该通式(c)化合物与通式(d)化合物反应产生所需的通式(1)产物。
可选择地，能够根据以下的反应方案2来制备通式(1)化合物，其中A1、A2、A3、Y1、Y2及Y3如上所述(例如，在本文的概述及噻唑烷酮化合物和衍生物中所述)，且W为卤素：
反应方案2
Figure C0382336600371
通常，首先通过在常规的Knoevenagel缩合条件下，例如在含有催化剂量的哌啶的冰醋酸、乙醇和其它适当的溶剂中，在回流条件下，将通式(e)化合物与通式(f)化合物反应产生通式(1)化合物。随后通过常规的分离和纯化技术从该反应混合物中分离通式(g)化合物。然后在标准的Ullmann缩合条件下，例如升高温度及Cu和Cu2O或CuO的存在下，用通式(h)化合物处理通式(g)化合物来产生所需的通式(1)产物。
可选择地，根据以下的反应方案3来制备通式(1)化合物，其中A1、A2、A3、Y1、Y2及Y3如上所述(例如，在本文的概述及噻唑烷酮化合物和衍生物中所述)，且W为卤素。
反应方案3
在此反应方案中，第一步为在通式(e)化合物与通式(h)化合物间的Ullmann缩合来产生通式(c)的化合物，随后其与通式(d)化合物进行Knoevenagel缩合来产生所需的通式(1)产物。
可从不同的化学供应商购得或根据本领域公知的方法、或利用F.C.Brown et.al.，J.Am.Chem.Soc.，78，384-388(1956)；R.E.Strube，OrganicSynthesis，CV 4，6；K.S.Markley and E.E.Reid，J.Am.Chem.Soc.，52，2137-2141(所有这些文献在此全部引用作为本文的参考)中公开的相似方法合成所述的通式(e)的起始化合物。
与上述相似的方法，3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(本文指CFTRinh-172)(参见图1C)以及含有不同位置三氟甲基和羧基取代基的类似物(参见例如，图1D)的合成是通过将2-硫代-3-[a-三氟甲基-4-苯基]-4-噻唑烷酮(a＝2、3或4)与b-羰基苯甲醛(b＝2，3或4)在哌啶的存在下进行Knoevenagel缩合来完成。过滤该沉淀，用乙醇洗涤，干燥，从乙醇中重结晶2-3次来产生明亮的黄色结晶(70-85％收率)。由1H-NMR验证结构。通过薄层层析和HPLC证明其纯度为＞99％。
实施例
给出以下的实施例为本领域所属技术人员提供怎样制备和使用本发明的完整公开和描述，而不是本发明者发明范围的限制，以及不是表示以下的实验是全部实验或只进行了这些实验。对于所使用的数据(例如，剂量、温度等等)尽量保证准确，但一些实验误差和偏离应考虑在内。除非有其它的说明，比例为重量比例、分子量为平均分子量、温度以摄氏温度表示，压力为大气压或接近大气压。
本发明化合物的合成由以下的非限定性实施例示例。
合成实施例
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮的合成
A.搅拌下，在30分钟内向3-三氟甲苯胺(trifluromethylanilne)(1.6g，10mmol)和三乙胺(1g，10mmol)的乙酸乙酯(10mL)溶液中逐滴加入二硫化碳(0.8g，10mmol)。当加入步骤进行约一半时，开始轻度放热反应，通过使用间断的冰浴可容易控制。搅拌过夜后，过滤深黄的粘稠液并用50mL的***洗涤沉淀，空气干燥，获得3g(89％)的浅黄色二硫代氨基甲酸酯固体，m.p.92-95℃(dec.)。
B.搅拌氯代乙酸钠(将氯代乙酸(0.064g，0.46mmol)加入0.6mL的NaHCO3溶液，pH 8-9中制备)并冷却至5-10℃，在10分钟内加入二硫代氨基甲酸酯(0.3g，0.9mmol)。继续搅拌直到该烧瓶升温到环境温度。在搅拌2小时后，将溶液冷却到10℃并用浓盐酸酸化，并将该反应混合物加热到90-95℃，30分钟。过滤所产生的沉淀，用水洗涤并从乙醇中重结晶产生0.103g的2-硫代-3-(3-三氟甲基苯基)-4-噻唑烷酮的发光晶体，收率83％，m.p.177-178℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ4.18(s，2H，CH2)，7.40(d，1H，苯基，J＝8.0Hz)，7.48(s，1H，苯基)，7.64(t，1H，苯基，J＝8.0Hz)，7.72(d，1H，苯基，J＝7.6Hz)ppm。
C.搅拌下回流上述获得的2-硫代-3-(3-三氟甲基苯基)-4-噻唑烷酮(0.1g，0.36mmol)与4-羧基苯甲醛(0.054g，0.36mmol)的无水乙醇(1mL)和哌啶(1滴)的混合物30分钟。过滤黄色沉淀，用乙醇洗涤，干燥并从乙醇重结晶产生0.108g(73％)的黄色结晶固体的目标化合物，m.p.：180-182℃，1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.78(d，2H，羧苯基，J＝8.2Hz)，7.80-8.00(m，5H，三氟甲基苯基和CH)，8.07(d，2H，羧基苯基，J＝8.31Hz)，13.20(s，1H，COOH，可替代的D2O)ppm。
D.用与上述相似的方法，制备以下化合物：
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3-羧基-4-羟基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3，4，5-三羟基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(2，3，4-三羟基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；
3-[(3-三氟甲基-4-氟)苯基]-5-[(3-羧基-4-羟基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；及
3-[(4-氟-3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。
以下材料和方法用于下面的实施例中。
细胞株、小鼠及化合物
根据以往报道(Galietta et al.2001 J.Biol.Chem.276：19723-19728)来产生共表达人野生型CFTR的Fischer大鼠甲状腺(FRT)细胞和卤素指示剂YFP-H148Q。以每孔20,000个细胞的密度将细胞接种在含有5％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的Coon′s改良F12培养液的96孔黑壁小板(Corning Costar)中。在接种后48小时，进行分析，此时细胞恰好为融合单层(每孔-40,000个细胞)。
利用不同收集的来自ChemBridge(San Diego，CA)的50,000种药物样化合物进行最初的筛选，该化合物以DMSO中的10mM储存溶液形式获得并在96孔小板中稀释到100mM。对购自ChemBridge与ChemDiv(SanDiego，CA)的类似物的结构-活性进行分析。
野生型和囊性纤维化(ΔF508纯合子突变体)小鼠由University ofCalifornia，San Francisco(UCSF)的CF动物饲养中心(Animal Core facility)饲养。由UCSF动物研究委员会(Committee on Animal Research)授权动物实验。
从UCSF细胞培养中心获得T84和Caco-2细胞。将T84细胞培养在含有5％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的1∶1混合的DMEM和Hams F12培养液中并接种在Snapwell inserts(Corning Costar)中，在湿度的(5％O2/95％CO2)气氛，37℃培养细胞。接种后10-14天使用细胞。将Caco-2细胞培养在含有10胎牛血清、1％非必需氨基酸、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM中，在Snapwell inserts上培养。在接种后21-24天使用细胞。CD1遗传背景的野生型小鼠如上述饲养。雄性Wistar大鼠(200-250g)购自Jackson实验室。由动物研究委员会授权动物实验。在切除外科手术的当时获得新鲜的人结肠段并转移到冰冷的盐水中，在切除后1小时内使用。
毛喉萜、8-溴cGMP、氨氯吡脒(amiloride)、霍乱毒素和STa毒素购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。CFTRACT～16来自ChemBridge(SanDiego，CA).
筛选步骤
利用定制的筛选***(Beckman)进行分析，该***含有3-meter机械手、CO2培养箱、平板洗剂器、液体处理平台(liquid handling workstation)、条形码阅读器、开盖台(delidding station)及两台FluoStar荧光平板计数器(BMG Labtechnologies，Offenburg，Germany)，每台配备两个注射泵及HQ500/20X(500±10nm)激发和HQ535/30M(535±15nm)发射滤波器(Chroma)。利用针对两台平板计数器进行改良的SAMI version 3.3软件(Beckman)集合成机器人***。用户软件写入VBA(Visual Basic forApplications)来从储存的数据文件中计算基线扣除，标准化荧光斜度(fluorescence slopes)(给出卤化物流入速率)。
通过在所述的培养箱(37℃、90％湿度、5％CO2)中加载40-60块含有FRT细胞的96孔板、在传送带中加载含有试验化合物的96孔板和一次性使用的塑料移液管头，来建立所述的分析。为开始分析，用PBS对96孔板中的每个小孔洗涤3次(300uL/每次洗涤)，留下50μLPBS。加入10μL的CFTR-活化鸡尾酒(5μM毛喉萜、100μM IBMX，25μM芹黄素的PBS液)，5分钟后，向每孔加入一种试验化合物(0.5μL的1mM DMSO溶液)得到10μM的终浓度。10分钟后，将96孔板转移至平板计数器进行荧光分析。通过连续记录荧光(每点200ms)2秒(基线)，并在快速加入(＜0.5s)160μL isosmolar PBS(其中137mM Cl-由I-取代)后再记录12秒，来分别分析每孔的CFTR-介导的I-转运。
细胞内[cAMP]和毒性分析
[cAMP]与磷酸酶的分析如以往报道(Galietta et al.2001 J. Biol.Chem.276：19723-19728)。利用二氢若丹明(dihydrorhodamine)方法在细胞用0-1000μM抑制剂培养24小时后评价细胞毒性作用。在对小鼠每天进行腹腔内0-100ug/kg的抑制剂注射后第5天时利用血清化学和血液学分析(UCSF临床实验室)来评价动物的毒性作用。
MDR-1活性
通过检测在永生人气管细胞株9HTEo-/Dx中的3H-长春新碱累积来评价MDR-1活性，其中在增加阿霉素浓度的选择中内源性MDR-1表达上调(Rasola et al.1994 J. Biol.Chem.269：1432-1436)。将细胞接种在24孔小板中(200,000细胞/每孔)。48小时后，用含有(单位为mM)：130 NaCl、2KCl、1 KH2PO4、2 CaCl2、2 MgCl2、10 Na-Hepes(pH 7.3)及10葡萄糖的溶液洗涤细胞，并用含有3H-长春新碱(0.7μM；1μCi/mL)的200μl相同溶液在37℃孵育1小时。用冰冷的溶液洗涤细胞三次并用0.25M NaOH裂解。通过闪烁计数来测定长春新碱的含量。
利用CFTR表达FRT细胞进行短路电流试验
将含有表达CFTR的FRT细胞或人支气管上皮细胞的Snapwell插片(Snapwell inserts)装入Ussing槽***中。对于FRT细胞，用5mL的75mMNaCl和75mM葡萄糖酸钠(顶端)以及150mM NaCl(基底)(pH 7.3)来充满半槽，而且用250μg/mL两性霉素B来对基底膜进行通透性处理(Galiettaet al.2001 J. Biol.Chem.276：19723-19728)。对映支气管上皮细胞和T84细胞，两个半槽均含有Krebs碳酸氢盐溶液。用空气(FRT细胞)或含5％CO2的空气(支气管和T84细胞)对半槽连续充气并保持在37℃。通过DVC-1000电压膜片钳(World Precision Instruments，Sarasota，Florida)利用Ag/AgCl电极和1M KCl琼脂桥来连续记录短路电流。
Cl-通道活性的膜片钳分析
以全细胞结构的形式检测膜电流。对于记录Cl-通道，所用的细胞外(浴)溶液含有(单位为mM)：150 NaCl、1 CaCl2、1 MgCl2、10葡萄糖、10甘露糖醇、10 TES(pH 7.4)，以及细胞内(移液管)溶液含有：120 CsCl、1MgCl2、10 TEA-Cl、0.5 EGTA、1 Mg-ATP、10 Hepes(pH 7.3)。在所述细胞外溶液中用毛喉萜(5μM)将CFTR活化。监测膜转导对-100和+80mV交替电压脉冲反应的时间过程。在确定的时间，中断实验来产生电流-电压关系(电压脉冲以20mV的增加幅度从-100增至+100mV)。容量敏感Cl-通道由低渗溶液活化(细胞外NaCl降低到120 NaCl；250mosM/kg)。通过在所述细胞外溶液中加入100μM UTP来活化人支气管上皮细胞中的钙敏感Cl-通道。
ATP敏感K+通道的膜片钳分析
记录胰腺β细胞株INS-1的膜电势，其中所用的细胞外(浴)溶液含有(单位为mM)：130 NaCl、2 KCl、1 KH2PO4、2 CaCl2、2 MgCl2、10 Na-Hepes(pH 7.3)及10葡萄糖。所用的移液管含有(单位为mM)：140 KCl、1 CaCl2、2mM MgCl2、10 EGTA、0.5 MgATP、10 K-Hepes(pH 7.3)。当获得全细胞结构后，将放大器转换到电流钳(current-clamp)模式。
肠液分泌和短路电流
在前3个分析中，检测了在回肠环中的液体累积(Oi et al.2002 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：3042-3046；Gorbach et al.1971 J. Clin.Invest.50：881-889)。将有CD1遗传背景的小鼠(或ΔF508纯合子小鼠)(鼠龄8-10周，体重25-35g)饥饿24小时后通过腹腔注射克他明(氯氨酮，40mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)来麻醉。在手术中使用加热垫使体温维持在36℃-38℃。采用小的腹部切口来暴露小肠并通过缝合来分离近盲肠的闭合回肠环(长度20-30mm)。单独用100μL PBS或含有霍乱毒素(1μg)的PBS来对环进行注射。在某些实验中，所述的抑制剂(150μg/kg)通过腹腔内注射给药。利用缝合关闭腹部切口并使小鼠从麻醉中苏醒。在6小时时，将该小鼠麻醉，从腹腔中取出肠环，在移去肠系膜和***后检测环长度和重量。
在封闭的成年小鼠分泌性腹泻模型中，利用orogastric喂食针头对小鼠灌胃(强饲法)给予溶于0.1mL的7％碳酸氢盐缓冲液的霍乱毒素(10μg)(或单独给予缓冲液)(Richardson et al.1986 Infect.Immun.54：522-528；Gabriel et al.1999 Am J.Physiol.276：G58-G63)。四个实验组为：对照组(单独给予缓冲液)、霍乱处理组、霍乱处理+抑制剂组(灌胃前2分钟腹腔注射150μg/kg)、以及单独抑制剂组。6小时后，将小鼠安乐死，从腹腔中取出小肠(从幽门到盲肠)并剥离相连的肠系膜和***。将肠称重，随后纵向剖开移去腔中液体(通过吸干)并再次称重。根据腔中液体移去前后的肠重比值来计算液体累积。对于短路电流的检测，分离大鼠的结肠条，通过钝性分离剥离肌肉层，放入Ussing槽中(面积0.7cm2)，孵育在含有10μM消炎痛(indomethacin)的氧合碳酸氢盐Ringers溶液中。通过加入氨氯吡脒(10μM)，随后用毛喉萜(20μM)刺激并后续加入抑制剂来抑制Na+电流，而后检测短路电流。
14C-标记的CFTRinh-172的合成(图6)
通过在30分钟内向搅拌的3-三氟甲基苯胺(1.6g，10mM)和三乙胺(1g，10mM)的乙酸乙酯(10mL)溶液中滴加二硫化碳(0.8g，10mM)来合成中间产物2-硫代-3-(3-三氟甲基苯基)-4-噻唑烷酮。利用冰浴防止反应过热。搅拌过夜后，过滤深黄色的粘稠液并用50mL***洗涤所得沉淀，用空气干燥得到3g(收率89％)的浅黄色二硫代氨基甲酸盐固体(熔点92°-95℃)。搅拌Br-14C-乙酸钠(由Br-14C-乙酸制备(Amersham)、55mCi/mmol、64mg、在0.6mL水中为0.46mM、利用NaHCO3调节pH 8-9)并冷却至5°-10℃，10分钟内加入二硫代氨基甲酸盐(0.3g，0.9mM)。持续搅拌同时使该烧瓶升到室温。2小时后，将所述的溶液冷却到10℃，用浓HCl酸化，并加热到90°-95℃保持30分钟。过滤所得到的沉淀，用水洗涤并从乙醇中再结晶得到103mg所需的有光泽的晶体产物(收率83％)，m.D.177°-178℃；特异活性(14C)55mCi/mmol；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ4.18(s，2H，CH2)，7.40(d，1H，苯基，J＝8.0Hz)，7.48(s，1H，苯基)，7.64(t，1H，苯基，J＝8.0Hz)，7.72(d，1H，苯基，J＝7.6Hz)ppm。
对于2-硫代-3-(3-三氟甲基苯基)-5-[4-羧基苯基亚甲基]-4-噻唑烷酮(14C-5)(14C-CFTRinh-172)的合成，将溶于无水乙醇中的2-硫代-3-(3-三氟甲基苯基)-4-噻唑烷酮(14C-5)(100mg，0.36mM)与4-羧基苯甲醛(54mg，0.36mM)混合物与哌啶回流30分钟。过滤所得的黄色沉淀，用乙醇洗涤、干燥、并从乙醇中再结晶得到108mg(收率73％)的黄色晶体，m.p.180°-182℃；特异活性(14C)54mCi/mmol；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.78(d，2H，羧基苯基，J＝8.2Hz)，7.80-8.00(m，5H，三氟甲基苯基和CH)，8.07(d，2H，羧基苯基，J＝8.31Hz)，13.20(s，1H，COOH，D2O交换)ppm。通过反复的重结晶使纯度达到＞99.9％。
药代动力学研究
将溶于含3％DMSO的PBS(用NaOH滴定到pH 7.4)中的14C-CFTRinh-172(50μCi)弹丸剂(bolus)在1分钟内通过预留的颈静脉插管静脉给药到大鼠(雄性Sprague-Dawley大鼠，360-420克)。在特定的时间从颈静脉收集血液。使用LS-6500多功能闪烁计数仪(Multi-PurposeScintillation Counter，Beckman)通过闪烁计数(Scintiverse SE，Fisher，CA)测定血浆(通过将全血以14,000g离心10分钟分离)中的14C-放射活性。利用WinNonLin软件(Pharsight)进行药代动力学分析。在收集最后的血液/组织样品后，用过量的戊巴比妥处死大鼠。所有动物操作得到UCSF动物研究委员会的许可。
组织分布和清除研究
将14C-CFTRinh-172(2μCi)弹丸剂在1分钟内通过尾静脉静脉内给药到小鼠(雄性CD1小鼠，30-35g)。在5、30、120和240分钟处死小鼠。取出器官、称重并在蒸馏水(10-50体积％)中研磨。通过对匀浆(25-50μL)进行闪烁计数测定放射活性并表示为每器官的总14C-放射活性(或对骨骼肌为每克组织)。在相同的时刻，收集血液、尿液和胆汁(从胆囊和十二指肠)，检测14C-放射活性并表示为每mL液体的形式。在14C-CFTRinh-172给药后第一个24小时内通过收集尿液和粪便进行清除研究。在经过与药代动力学研究中相同的处理的大鼠中进行了组织分布研究。
抑制剂代谢分析
将体液(血浆、尿液、胆汁)和肝匀浆的等分试样点在二氧化硅板上，通过采用乙酸乙酯∶己烷∶甲醇(1∶1∶0.1)溶剂体系的薄层层析来溶解，对于原始抑制剂其得到rf～0.5。用Transcreen LE放大***(Kodak)使用Hyperfilm(Amersham)进行放射性自显影。所有板中均包括14C-标记的CFTRinh-172标准。
短路电流检测(实施例7)
对于细胞研究，将含有T84细胞单层的Snapwell插片(Snapwell inserts)放入Ussing槽***中(Navicyte，Harvard Apparatus，Holliston，MA)。用含有(单位为mM)NaCl 120、NaHCO3 25、KH2PO4 3.3、K2HPO4 0.8、MgCl21.2、CaCl2 1.2、葡萄糖10(保持在37℃)的Krebs-碳酸氢盐溶液充满半槽，并连续通入5％CO2/95％O2气体。高K+缓冲液含有(单位为mM)NaCl 65、KCl 67.5、KH2PO4 1.5、CaCl2 1、MgCl2 0.5、HEPES 10、葡萄糖10。低Cl-缓冲液含有(单位为mM)葡萄糖酸钠120、KH2PO4 3.3、K2HPO4 0.8、MgCl2 1.2、CaCl2 1.2、HEPES 10、葡萄糖10(保持在37℃)，并连续通入空气。对于小鼠结肠内的检测，通过腹腔内注射***(40mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)来麻醉小鼠。取出回肠，用冰冷的Krebs缓冲液洗涤，沿肠系膜线切开，并放入微Ussing槽(面积0.7cm2，World PrecisionInstruments，Sarasota，FL)。对于人肠的检测，通过钝性分离剥离结肠段的肌肉层并放入上述槽中。用含有10μM消炎痛的氧合Ringers碳酸氢盐溶液充满半槽。用DVC-1000电压钳(World Precision Instruments)利用Ag/AgCl电极和1M KCl琼脂桥记录短路电流。如下所述将激动剂/抑制剂加入半槽。
小鼠和大鼠模型中的在体肠液分泌(实施例5和7)
对具有CD1遗传背景的小鼠(鼠龄8-10周，体重25-35g)只给水不给食物24小时。用上述方法麻醉小鼠并在手术期间使用加热垫将体温维持在36℃-38℃。采用小的腹部切口来暴露小肠，并利用缝合来分离近盲肠的闭合回肠环(长度20-30mm)。用100μL单独的PBS或含有霍乱毒素的PBS(1μg)注射肠环。在一些实验中，在霍乱毒素注射前或后的特定的时间点通过腹腔注射进行CFTRinh-172(0-200μg)给药。用缝合关闭腹部切口并使小鼠从麻醉中苏醒。在6小时时，麻醉小鼠，从腹腔中取出肠环，
在去除肠系膜和***后检测环长度和重量。
对于检测大鼠闭合环模型中肠毒素诱导的液体分泌，用戊巴比妥钠(45mg/kg)麻醉雄性Wistar大鼠(体重200-250g)。分离肠环(40-60mm)并用单独的300μL PBS或含有霍乱毒素(10μg)或STa毒素(0.1μg)的PBS注射。在一些实验中，在霍乱毒素或STa毒素给药后通过腹腔内注射给予CFTRinh-172(200μg)。在3小时(STa)或6小时(霍乱毒素)时检测环长度和重量。
CFTRinh-172的口服给药研究中，使用开放环小鼠模型，其中使用orogastric喂食针头对小鼠以单独的7％碳酸氢盐缓冲液或霍乱毒素(1μg溶于7％碳酸氢盐缓冲液)并与CFTRinh-172(维生素E TPGS中200μg，参见如下)一起灌胃。6小时后，从腹腔中取出小肠(从幽门到盲肠)并剥离连带的肠系膜和***。称重该小肠，并纵向刨开移去腔液，再次称重以定量液体的累积。
Caco-2通透性分析
将Caco-2细胞培养在多孔插片上达到400-600Ωcm-1的阻抗。对于转运研究，用等体积的Hank′s缓冲盐溶液(HBSS)代替培养液，该溶液含有15mM葡萄糖和25mM HEPES(pH 7.3)。1小时后，在上槽中加入CFTRinh-172(25μM)并在37℃柔和摇动平板。在特定的时间从底(接收)槽取出50μL溶液，通过UV吸收(385nm)检测CFTRinh-172浓度。表观通透性(Papp)通过下式计算：Papp＝dC/dTX(Vr/AC0)，其中dC/dT为接收槽中CFTRinh-172浓度的增加速率，Vr为接收槽的体积，A为单层表面积，以及C0为供体槽中的CFTRinh-172初始浓度。
药代动力学和口服生物利用度的研究
利用三氟溴氯乙烷对小鼠进行短暂麻醉，并将溶于维生素E TPGS(d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，0.5％w/v)CFTRinh-172溶于10％w/v的TPGS水悬浮液中)的14C标记-CFTRinh-172(12μCi)经口灌胃给予小鼠。作为比较，其它小鼠通过尾静脉输注静脉内给予14C-CFTRinh-172(2μCi)。在特定的时间点收集血液来检测血浆中的14C放射活性。在6小时时，用过量戊巴比妥处死小鼠并取出器官用于检测匀浆中的放射活性。
生物学实施例1
CFTR抑制剂的筛选
鉴定本发明化合物的初步筛选技术设计为通过直接的CFTR-抑制剂相互作用来鉴定CFTR Cl-转导抑制剂。如图1A的流程所示，通过含有毛喉萜、IBMX和芹黄素(apigenin)的活化鸡尾酒组合在CFTR-表达FRT细胞中预刺激CFTR。通过多种机制活化CFTR(cAMP升高、磷酸二酯酶抑制以及直接CFTR结合)使得可对抑制剂进行鉴定，该抑制剂直接阻断CFTR Cl-转运途径而不阻断信号途径中的其它临近步骤。FRT细胞共表达黄色荧光蛋白为基础的Cl-/I-感应器，其提供抑制效果的定量荧光读出分析(参见例如，Jayaraman et al.，2000，J.Biol.Chem.275：6047-6050；Galiettaet al.，2001，Am.J.J.Physiol.281：C1734-C1742.)。在CFTR预刺激和化合物加入后，使细胞处于内向的I-梯度中以驱使I-内流并产生降低的荧光。每种分析包括记录两秒的基线荧光，随后在快速加入含I-的溶液后进行12秒的连续荧光记录。使用全自动高通量筛选设备分别在96孔板模式中检测浓度为10μM的化合物(参见以下的实施例2)。
图1B所示为利用图1A的分析方法对50,000化合物初步筛选得到的相对YFP荧光对时间作图的代表性曲线。根据I-加入后荧光降低的斜率进行定量分析，49,993化合物对I-内流的动力学没有显著的作用(＜10％的斜率降低)。七种化合物的负斜率有小幅度降低(10-52％)，几乎所有这类化合物具有相似的结构核心，该核心由带有取代的苯基亚甲基和苯基部分的2-硫代-4-噻唑烷酮杂环构成(图1C)。随后对超过250种具有噻唑烷酮核心结构的类似物进行筛选来鉴定最有效的CFTR抑制剂。
图1D显示，筛选中鉴定的最有效的噻唑烷酮CFTR抑制剂为3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(本文称为CFTRinh-172)，以及五种具有显著抑制效力的类似物。因此下列化合物被鉴定为CFTR抑制剂：3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-172)；3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-硝基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-020)；3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-氧代羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-029)；3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3，4-二羟基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-1 85)，3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3，5-二溴代-4-羟基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-214)及3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3-溴代-4-羟基-5-硝基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-236)。最有效的CFTR抑制剂包括一种或多种吸电子基团，例如上述环1上的3-三氟甲基基团和环2上的吸电子基团或极性取代基。选取CFTRinh-172做进一步分析。相对效力为：0.2(CFTRinh-020)、0.3(CFTRinh-029)、1.0(CFTRinh-172)、0.2(CFTRinh-185)、0.1(CFTRinh-214)及0.1(CFTRinh-236)。
为检验三氟甲基和羧基取代基在环上的位置的作用，合成了CFTRinh-172的8种类似物，其中将所述取代基转移至环1(三氟甲基)和环2(羧基)上的每一独特位置。与CFTRinh-172比较(效力1.0)，3-[(a-三氟甲基)苯基]-5-[(b-羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮类似物的相对抑制效力为：0.69(a＝2，b＝2)，0.70(2，3)，0.66(2，4)，0.74(3，2)，0.90(3，3)，0.67(4，2)，0.64(4，3)和0.56(4，4)。
生物学实施例2
CFTRinh-172的特性
主题噻唑烷酮化合物的特定剂量对CFTR的抑制水平可利用如图1A所示的荧光分析法如上所述进行测定。图2A所示为以相对YFP荧光对时间表示的CFTRinh-172剂量-抑制数据。此噻唑烷酮化合物在0.3-0.6μM浓度时可观察到显著的CFTR抑制作用。图2B显示CFTRinh-172的抑制作用(显示为加入或洗涤后相对转运速率对时间的图像)在～10分钟(t1/2为4分钟)完成，并在洗涤后以t1/2为～5分钟发生逆转(插图)。相对转运速率如图2C所示，表明CFTRinh-172可有效地抑制由多种不包括在起始筛选所用活化鸡尾酒组合中的激动剂引起的CFTR活化。这些激动剂包括染料木黄酮(genistein)、CPT-cAMP、CPX、8-MPO及强力的苯并萸酮(benzoflavone)CFTR活化剂UCCF-029(2-(4-吡啶鎓)苯并[h]4H-苯并吡喃-4-酮硫酸氢盐)及苯并咪唑酮(benzimidazolone)CFTR活化剂UCCF-853(参见Galietta，et al.，2001，J Biol.Chem.276：19723-19728)。
还进行了电生理实验来建立CFTRinh-172的抑制效力和特异性。图3A所示为CFTRinh-172对CFTR表达FRT细胞中的短路电流的快速、剂量依赖的抑制作用，其中将CFTRinh-172加入到孵育顶端细胞表面的溶液中。图3B显示了在相同条件下检测的CFTRinh-172(Kd～300nM，Hill系数～1)和优降糖(Kd～200μM)的平均剂量-抑制关系。
已发现这种噻唑烷酮在天然表达野生型CFTR的细胞(包括T84细胞和人支气管上皮细胞的原代培养物)以及表达G551D-CFTR和ΔF508-CFTR的转染FRT细胞中具有相似的抑制效力(低温校正后(lowtemperature correction))。对于支气管细胞中的研究，用氨氯吡脒阻断Na+通道使得基准电流很大程度上依赖于CFTR。用CPT-cAMP最大活化CFTR后，从顶端侧应用CFTRinh-172强烈地抑制了短路电流(图3C，左侧)。当从基底侧加入时CFTRinh-172也可抑制短路电流(图3C，右侧)。
如图3D所示，在CFTR-表达FRT细胞中检测了全细胞膜电流。用5μM毛喉萜刺激，在+100mV可产生381±47pA/pF(n＝4)的膜电流(总膜电容21±3pF)。如对纯CFTR电流所预期的该电流-电压关系为线性(图3F)。用2μM CFTRinh-172进行细胞外灌注，在所有膜电势下均使电流迅速降低，表明非电压依赖的CFTR抑制作用。利用较低浓度的CFTRinh-172(0.2μM)获得～50％的抑制作用证明通道阻断缺乏电压依赖性(图3F)。
也检测了CFTRinh-172对CFTR抑制作用的特异性。对两种非CFTRCl-通道进行了研究。5μM浓度的CFTRinh-172不能抑制极化的人支气管上皮细胞中的Ca2+活化的Cl-分泌，该分泌通过在顶端孵育溶液中加入UTP(100μM)产生(图4A)。在有和没有CFTRinh-172存在下最大的UTP依赖的短路电流分别为9.9±0.5μA/cm2和10.0±0.2μA/cm2(标准误，n＝4)。5μM的CFTRinh-172也不能阻断用250 mosM/kg低渗溶液进行细胞外灌注在FRT细胞中引起的容量活化的Cl-电流(图4B)。
在过表达MDR-1的9HTEo-/Dx细胞中对CFTR同源物，ATP结合级联转导因子(ATP-binding cassette transpoter)MDR-1(多药物抗性蛋白-1)的活性进行了检测(Rasola et al.1994J.Biol.Chem.269：1432-1436)。MDR-1抑制剂异搏定(verapamil，100μM)可使长春新碱的累积强烈上升，其与MDR-1介导的活性药物排出反向相关(图4C)。CFTRinh-172(5μM)不影响长春新碱的累积因此不抑制MDR-1。
另一种CFTR同源物为磺脲(sulphonylurea)受体(SUR)，其调节ATP敏感K+通道(K-ATP通道)的活性(Aguilar-Bryan and Bryan 1999 Endocr.Rev.20：101-135)。SUR1在胰腺β细胞中表达，其可控制膜电势和胰岛素释放。如优降糖，磺脲通过阻断K-ATP通道和膜的去极化引起胰岛素释放(及低血糖反应)。为确定CFTRinh-172是否也阻断K-ATP通道，对大鼠胰腺β细胞株INS-1的膜电势进行了检测(图4D，图4E)。与优降糖引起的较大的膜去极化相对，CFTRinh-172(2和5μM)不能使膜电势去极化。5μM的CFTRinh-172可引起较小的超极化，其明显小于K-ATP通道活化剂二氮嗪(diazoxide，100μM)引起的超极化。其它的研究表明，5μM的CFTRinh-172不能阻断水通道(AQP1)、尿素转运因子(UT-B)、Na+/H+交换因子(NHE3)和Cl-/HCO3 -交换因子(AE1)。
进一步的分析表明，5μM的CFTRinh-172不能影响细胞的cAMP产生或磷酸酶活性。在FRT细胞中，基础cAMP含量为225±22fmol/每孔，其在20μM毛喉萜刺激后30分钟可增加至1290±190fmol/每孔(没有抑制剂)和1140±50(+CFTRinh-172)(n＝3)。如用二氢若丹明分析所判断的，在高至100μM的浓度下24小时后CFTRinh-172对FRT细胞没有毒性。在小鼠中，每天腹腔内注射1000μg/kg CFTRinh-172共7天不引起明显的毒性。食物和水的摄取没有减少、血清电解质浓度、葡萄糖、肝功能指标、血清肌酐、淀粉酶和血细胞比容没有改变。此外，单次较大全身剂量的CFTRinh-172(10 mg/kg)不引起明显的毒性。
生物学实施例3
在体效力
利用对霍乱毒素诱导的肠液分泌的两种分析，以及在分离的肠中通过短路电流分析对CFTRinh-172的效力进行了在体测试。在第一种分析中，在体建立了一系列的小肠闭合环，并用少量的盐水或含有霍乱毒素的盐水对间隔(alternate)环的腔进行注射。6小时后测定腔中的液体累积。如图5A所示，在霍乱毒素处理的环中有明显的液体累积和扩张，而邻近的对照(盐水)环仍然是空的。在灌注霍乱毒素之前单次给予CFTRinh-172(150μg/kg，腹腔内)可有效防止所述毒素处理的肠环中的液体累积。
一系列这些实验的数据总结如图5B所示。CFTRinh-172使液体分泌明显降低到盐水对照环中的水平，其中非活性噻唑烷酮类似物不能抑制液体分泌。如以往的资料(Gabriel et al.1994 Science 266：107-109)所表明的，霍乱毒素处理的来自纯合子ΔF508-CFTR小鼠的肠环也保持为空的，表明CFTR参与了肠液分泌。在第二种分析中，通过口服霍乱毒素给药(10μg)和***CFTRinh-172给药来诱导肠液分泌。6小时后，通过对整个小肠进行称重检测到有明显的液体累积。如所示地，CFTRinh-172给药可明显降低肠液的累积，并可用腔液移出前后的肠重比值来定量化(图5C)。
图5D显示了CFTRinh-172对跨完整大鼠结肠粘膜的短路电流的抑制作用。用氨氯吡脒抑制Na+电流后，毛喉萜可使短路电流迅速上升。将CFTRinh-172加入到粘膜溶液中时对短路电流的抑制作用比加入到浆膜(serosal)溶液中时大得多，这可能与通过残余的粘膜下组织到达结肠上皮细胞时的损失有关。单独向粘膜溶液中加入5μM CFTRinh-172可降低＞80％的短路电流。这些结果提供了CFTRinh-172在肠中对CFTR Cl-通道具有抑制作用的电生理证据。
生物学实施例4
药代动力学分析
在单剂量静脉内灌注14C标记的CFTRinh-172大丸剂后，通过对血清14C放射活性进行系列检测完成了大鼠的药代动力学分析。灌注的抑制剂总量(400μg，～1mg/kg)可有效地作为大鼠的抗腹泻药。图7显示血清14C放射活性动力学与二室模型吻合较好，并具有1.2L的分布容积和3.8μg·hr/mL的AUC(曲线下面积)。半衰期为0.14hr(再分布)和10.3hr(清除)。给药后72小时在血浆中，或给药后14天在肝或肾匀浆中没有检测到14C标记的CFTinh-172。
在单剂量静脉内灌注大丸剂后，根据器官匀浆和体液的放射活性可确定14C标记的CFTRinh-172的组织分布。图8中，图A总结了CFTRinh-172灌注后指定的时间点在小鼠的主要器官中的14C分布。5分钟内首先在肝和肾中观察到14C放射活性，并随时间降低。在脑、心脏、骨骼肌或睾丸中几乎没有发现放射活性。在较晚的时间点(30-240分钟)，14C放射性在肠中累积。图3中，图B显示在静脉内灌注大丸剂后60分钟在大鼠中检测到14C放射活性的相似器官分布，而在脑、心脏和骨骼肌中几乎没有放射性。在一些实验中，在灌注14C-标记的CFTRinh-172(50μCi)后第10天处死大鼠。
为确定CFTRinh-172在肾脏、肝脏和肠中累积的机制，检测了血清、尿及胆汁中的14C放射活性。灌注后的头2小时内，小鼠的平均尿放射活性为4.2±1.2×105cpm/mL。尿与血液的14C放射活性比值在5-7∶1范围，与尿与血清的摩尔渗透压比值～5∶1(1550mOsm比310mOsm)相比较，表明CFTRinh-172通过肾小球过滤被肾清除，而不经肾小管吸收或分泌。14C放射活性在血清、尿和肾组织中降低的动力学大致相同支持了CFTRinh-172清除的肾脏清除机制(数据未显示)。根据14C放射活性在肝脏中迅速累积并随后在肠中累积的观测结果研究了CFTRinh-172在胆汁中累积的可能性。在对小鼠给药后60分钟，胆汁中的14C放射活性强度为血液中的～9倍。为确定胆汁中的CFTRinh-172是***到粪便中还是返回到循环中，在灌注放射性标记的抑制剂后的头24小时内对小鼠的尿和粪便进行收集。在尿中发现了93±3％的***的放射活性，支持了利用肠肝循环的肾脏***为主的机制。
为确定在器官和体液中检测到的14C放射活性是对应完整的CFTRinh-172还是对应化学修饰的CFTRinh-172，对尿、血清和胆汁样本以及通过离心制备的肝匀浆上清进行薄层层析和放射性自显影。图9所示为对应大丸剂灌注给予的原始CFTRinh-172的rf～0.5的单一斑点。体液和器官匀浆的放射性自显影在同一rf处显示单一斑点，表明没有发生CFTRinh-172的化学修饰。
通过分光光度pH滴定测定CFTRinh-172为pKa为5.5的弱酸。在生理pH下，～1％的CFTRinh-172以具有低极性及高膜通透性的非离子酸存在。上述细胞模型中CFTRinh-172被快速摄取表明口服生物利用制剂的可行性，但为避免沉淀防止低胃酸pH的影响是必需的。从这些药物代谢动力学研究得出的结果表明，在啮齿动物中CFTRinh-172通过肾脏清除被缓慢地排除而不发生化学修饰，且CFTRinh-172在胆汁中浓缩并累积在肠中。CFTRinh-172不能明显跨越血脑屏障，且很少发现CFTRinh-172在包括心脏、肺、骨骼肌和睾丸的其它重要器官中累积。CFTRinh-172的缓慢肾脏清除、肠累积以及几乎没有血脑屏障渗透的特性对于抗腹泻剂应用是有益的。
生物学实施例5
CFTRinh-172抑制作用的剂量效应和持续时间
本实施例的目的是将上述与腹腔内注射单剂量CFTRinh-172的作用有关的观测结果扩展到在小鼠闭合肠环模型中抑制霍乱毒素刺激的液体分泌作用。特别地，本实施例的目的是检测维持CFTRinh-172抑制作用的剂量效应关系和表观半衰期。
首先，测定肠环液体吸收和分泌的动力学从而确定小鼠模型的特征。为进行吸收研究，将200μL PBS注射到独立的肠环后，在特定的时间点检测肠环液体含量。图10中，图A显示在～25分钟时有50％液体保留的快速液体吸收。与对照组比较(图10中，图A的插图)，以强烈抑制霍乱毒素诱导的肠液分泌的剂量(20μg)进行CFTRinh-172的腹腔内给药不能改变液体吸收的速率(在30分钟时检测)。为研究分泌，用霍乱毒素(1μg溶于0.1mL PBS)对肠环进行注射。图10中，图B显示在6小时内液体分泌缓慢启动，这与以往在啮齿动物模型中的研究一致(Gorbach et al.J.Clin.Invest.1971 50-881-889；Oi et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 200299：3042-3046)。正常条件下液体在肠中的快速吸收表明，如果分泌被阻断，活化分泌后肠腔中累积的液体可被快速吸收，预示甚至在给予霍乱毒素之后CFTR抑制作用可有效地防止液体的累积。
图11中，图A总结了小鼠中CFTRinh-172剂量-效应研究的结果，其中在对闭合肠环进行霍乱毒素灌注后立即通过腹腔注射进行单剂量抑制剂的给药。如在非霍乱毒素注射的环中所观察到的，基础肠液含量(虚线)接近零。CFTRinh-172对霍乱毒素注射的肠环中的液体累积的抑制可达～90％，在～5μgCFTRinh-172(150μg/kg)的抑制作用为50％。在所述剂量-效应研究中，除在霍乱毒素给药前后的不同时间的单剂量20μg的CFTRinh-172给药外，对抑制作用的持续时间进行了检测。图11中，图B显示在霍乱毒素给药前后3小时给予CFTRinh-172对腔中的液体累积具有显著的抑制作用。但在霍乱毒素给药前6小时没有显著的抑制作用。考虑到霍乱毒素负载研究的6小时持续时间，CFTRinh-172抑制作用的持续t1/2为～9-10小时。
生物学实施例6
CFTRinh-172的口服生物利用度
为测试口服给予CFTRinh-172的抗腹泻效果，在小鼠中对CFTRinh-172的药代动力学进行了测定，并对CFTRinh-172的跨Caco-2单层转运进行了检测。因为CFTRinh-172为相对非极性的弱酸(pKa 5.5)，其可能会在胃中沉淀，所以利用两种通常用来增溶口服给药药物的试剂-维生素E TPGS和环糊精来实现口服给药。利用14C标记的CFTRinh-172来进行检测。
图11中，图C显示了在口服及静脉内给药后14C-CFTRinh-172在小鼠中的药代动力学。静脉内给药产生较高的起始血清浓度，其在～30分钟内降低(组织再分布)，而血清放射活性在刚口服后较低，在～60-90分钟到达峰值，随后开始降低。图11中，图D总结了口服和静脉给药后6小时时14C-CFTRinh-172的器官分布，显示在胃肠道以及肝和肾中有累积。14C放射活性在胆汁中比血清中浓缩了～10倍，而在粪便中几乎没有放射活性***(在24小时内＜10％的总***放射活性)，表明肠肝循环促进了CFTRinh-172在肠中的累积。口服CFTRinh-172给药与静脉内给药相比(在4-6小时的组织/血清含量)表明TPGS制剂中CFTRinh-172口服生物利用度为15-20％。
图11中，图F显示CFTRinh-172在跨Caco-2单层中表现出线性增加，由此推导得CFTRinh-172的通透性系数为16×10-6cm/s。此值包含在对各种口服给药药物建立的取值范围内(例如，心得乐(pindolol)为36×10-6cm/s、sildenafil为48×10-6cm/s)  (Stenberg et al. J.Med.Chem. 200144：1927-1937。
生物学实施例7
cGMP-与cAMP-介导的液体分泌的抑制作用
利用在体大鼠肠环模型来测定CFTRinh-172对cGMP-和cAMP-介导的液体分泌的抑制效果，以及测试CFTRinh-172在替代的动物模型中的效果。鸟苷酸(guanylyl)环化酶C受体在大鼠的肠细胞(enterocytes)中表达，使得STa毒素结合和细胞浆cGMP升高(Mann et al.Biochem Biophys Rescommun 1997 239：463-466)。已经发现STa毒素在3小时后可在大鼠回肠内引起液体分泌(Cohen et al.Am J Physiol 1989 257：G118-123)。在对小鼠有效的剂量(600μg/kg)时，CFTRinh-172可防止大鼠肠环中霍乱毒素诱导的液体分泌(图12中，图A)。对于STa毒素诱导的液体分泌，用STa毒素(0.1μg溶于300μL PBS)对肠环进行注射，并在3小时后检测环重量。图12中，图B显示CFTRinh-172抑制了～75％的肠液分泌。
在小鼠和人肠上皮片中检测了短路电流，以评价CFTRinh-172对跨上皮离子分泌的抑制作用。图13中，图A显示了毛喉萜或STa毒素(插图)刺激后CFTRinh-172对小鼠回肠中的短路电流的剂量依赖抑制作用。对cAMP和cGMP依赖的氯分泌，～5μM的CFTRinh-172均有50％的抑制作用。图12中，图B显示在人结肠中CFTRinh-172对短路电流有相似的抑制效力。
不理想的观测结果是，CFTRinh-172对肠短路电流(2-5μM)的表观抑制效力基本上低于在对包括CFTR表达FRT细胞(0.2-0.5μM)和Calu-3细胞(0.5μM)在内的几种细胞株进行的电生理研究发现的结果。对这种差异有几种解释可以考虑，包括细胞类型差异、达到完整肠中的肠细胞的CFTRinh-172有限、膜电势作用(内部负细胞电势降低了细胞内[CFTRinh-172])，以及ATP与CFTRinh-172的竞争作用。
对T84结肠上皮细胞进行的短路电流检测对这种现象进行分析。如图14中的代表性实验所示，图A显示通过cAMP激动剂毛喉萜(左侧)、细胞通透性cGMP类似物8-Br-cGMP(中央)或由高通量筛选鉴定的CFTR氯转导直接激动剂CFTRact-16刺激后，～3μM CFTRinh-172对非通透性T84细胞单层中的短路电流产生50％的抑制作用。为测定CFTRinh-172在T84细胞中效力相对减弱是否需要完整的细胞，在用两性霉素B对细胞基底膜进行通透性化后，以及在Cl-梯度存在(产生可检测的电流)下对短路电流进行了检测。图14中，图B(左侧)显示通透性化后CFTRinh-172对短路电流的抑制效能基本增加。图14总结了剂量-效应数据，图B(中央)表明细胞通透性化后对从～3至0.3μM的CFTRinh-172抑制作用表观KI下降。为测试CFTRinh-172在完整细胞中的效能下降是否是由内部负膜电势(降低细胞浆对细胞外的[CFTRinh-172])引起的，在用高K+基底孵育溶液去极化后对T84细胞进行了短路电流检测。图14中，图C显示在去极化的细胞中增加的CFTRinh-172效能(KI～0.3μM)得以恢复，表明细胞膜电势在对CFTRinh-172效能中发挥重要作用。
根据以上数据，可推测本发明的噻唑烷化合物(以CFTRinh-172为代表)对由诸如大肠杆菌(E.coli)和霍乱中的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)产肠毒素(enterotoxogenic)生物体引起的肠毒素诱导分泌性腹泻、Traveller’s及AIDS并发症相关的腹泻中具有抗腹泻作用。CFTR抑制作用可用于由诸如梭状芽胞杆菌和沙门氏菌属种的肠侵入性细菌引起的腹泻的附属治疗；然而，CFTR抑制作用不会降低由这些生物体产生的粘膜损伤。类似地，不能期望CFTR抑制作用会矫正炎症性肠疾病中的基本病理改变，但可降低肠液体的分泌量。最近有证据表明，由诸如轮状病毒的病毒性腹泻引起的液体分泌可有诸如Ca2+介导Cl-通道的其它机制参与，尽管CFTR在液体分泌中的作用仍不清楚，因此可在适合的动物模型中使用本发明化合物进行测试。
综上，噻唑烷酮CFTR阻断剂CFTRinh-172在啮齿动物和人肠中防止cAMP与cGMP诱导的离子/液体分泌而不影响肠液吸收。其良好的药理学和活性特征为开发进一步的抗腹泻应用奠定了基础。
虽然本发明是参考具体的实施方案进行描述的，但本领域所属技术人员应理解在不偏离本发明真实精神和范围的条件下，可对其作出各种改变和进行等价替换。此外，为适应特定的环境、材料、材料组合物、过程、过程步骤，可根据本发明的目标、精神和范围作出各种修改。所有这些修改应包括在本发明附属的权利要求范围内。

Claims (46)

1.以其单一的或混合的立体异构体的形式存在的通式(Ic)化合物或其药物可接受的盐在制备治疗患有囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白介导的疾病状态的个体的药物中的用途，所述疾病状态通过抑制囊性纤维化跨膜传导调节因子介导的离子转运来治疗，所述通式(Ic)化合物：
Figure C038233660002C1
其中Y1、Y2和Y3独立地选自氢、碳酸酯、羧基、卤素、硝基及羟基。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述疾病状态为异常增加的肠分泌。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述疾病状态为分泌性腹泻。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述疾病状态为多囊肾脏疾病。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述通式(Ic)化合物选自：
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述通式(Ic)中的三氟甲基位于与其连接的所述苯基的2、3或4位。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述Y2选自羟基、羧基、硝基、碳酸酯及卤素基团。
8.如权利要求6所述的用途，其中所述通式(Ic)中的三氟甲基位于所述苯基的3位。
9.如权利要求1所述的用途，其中所述Y2为羟基基团。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述Y1为羟基基团。
11.如权利要求9所述的用途，其中所述Y1为溴。
12.如权利要求9所述的用途，其中所述Y3为硝基。
13.如权利要求1所述的用途，其中所述通式(Ic)化合物选自：
Figure C038233660003C1
14.以其单一的或混合的立体异构体形式存在的通式(Ic)化合物或其药物可接受的盐在制备通过接触个体细胞来抑制所述细胞中囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白活性的药物中的用途，所述通式(Ic)化合物：
Figure C038233660004C1
其中Y1、Y2和Y3独立地选自氢、碳酸酯、羧基、卤素、硝基及羟基。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述通式(Ic)化合物为：
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。
16.如权利要求14所述的用途，其中通式(Ic)中的三氟甲基位于与其连接的所述苯基的2、3或4位。
17.如权利要求14所述的用途，其中通式(Ic)中的三氟甲基位于所述苯基的3位。
18.如权利要求14所述的用途，其中Y2选自羟基、羧基、硝基、碳酸酯及卤素基团。
19.如权利要求14所述的用途，其中Y2为羟基基团。
20.如权利要求19所述的用途，其中Y1为羟基。
21.如权利要求19所述的用途，其中Y1为溴。
22.如权利要求19所述的用途，其中Y3为硝基。
23.如权利要求14所述的用途，其中所述通式(Ic)化合物选自：
Figure C038233660005C1
24.如权利要求14所述的用途，其中所述药物是可摄取的。
25.如权利要求14所述的用途，其中所述药物进一步包括药物可接受的载体。
26.分析中离体抑制细胞囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白活性的方法，包括以足以抑制所述细胞中囊性纤维化跨膜传导调节因子离子转运的剂量的、以其单一或混合的立体异构体的形式存在的通式(Ic)化合物或其药物可接受的盐与所述的细胞接触，所述通式(Ic)化合物：
Figure C038233660005C2
其中Y1、Y2和Y3独立地选自氢、碳酸酯、羧基、卤素、硝基及羟基。
27.以其单一的或混合的立体异构体形式存在的通式(Ic)化合物或其药物可接受的盐在制备用于产生非人动物囊性纤维化表型的药物中的用途，所述通式(Ic)化合物：
Figure C038233660006C1
其中Y1、Y2和Y3独立地选自氢、碳酸酯、羧基、卤素、硝基及羟基。
28.3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮在制备治疗患有与由囊性纤维化跨膜传导调节因子引起的异常增加的离子转运相关的疾病状态个体的药物中的用途。
29.如权利要求28所述用途，其中所述的异常增加的囊性纤维化跨膜传导调节因子离子转运与腹泻相关。
30.如权利要求29所述的用途，其中所述的腹泻为分泌性腹泻。
31.如权利要求28所述的用途，其中所述疾病状态为多囊肾脏疾病。
32.一种含有噻唑烷酮化合物，以及药物可接受载体、药物可接受稀释剂及药物可接受赋形剂中的至少一种的药物组合物，所述噻唑烷酮化合物独立地选自：
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-硝基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-氧羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3，4-二羟基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3，5-二溴-4-羟基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮；及
3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3-溴-4-羟基-5-硝基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。
33.如权利要求32所述组合物，其中所述的组合物不含有能检测到的二甲基亚砜。
34.含有以其单一的或混合的立体异构体形式存在的通式(Ic)化合物或其药物可接受的盐，以及药物可接受载体、药物可接受稀释剂及药物可接受赋形剂中的至少一种的药物组合物：
Figure C038233660007C1
其中Y1、Y2和Y3独立地选自氢、碳酸酯、羧基、卤素、硝基及羟基。
35.如权利要求34所述的组合物，其中通式(Ic)中的三氟甲基位于与其连接的所述苯基的2、3或4位。
36.如权利要求34所述的组合物，其中Y2选自羟基、羧基、硝基、碳酸酯及卤素基团。
37.如权利要求34所述的组合物，其中通式(Ic)中的三氟甲基位于所述苯基的3位。
38.如权利要求34所述的组合物，其中Y2为羟基基团。
39.如权利要求38所述的组合物，其中Y1为羟基。
40.如权利要求38所述的组合物，其中Y1为溴。
41.如权利要求40所述的组合物，其中Y3为硝基。
42.如权利要求34所述组合物，其中所述的组合物不含有能检测到的二甲基亚砜。
43.权利要求32所述组合物在制备产生非人动物中囊性纤维化跨膜传导调节因子缺陷的药物中的用途，其中囊性纤维化跨膜传导调节因子离子转运被抑制。
44.如权利要求43所述的用途，其中所述的动物为哺乳动物或鸟类。
45.如权利要求44所述的用途，其中所述的哺乳动物为非人灵长类、啮齿类或有蹄动物类。
46.如权利要求43所述的用途，其中所述的动物具有与囊性纤维化相似的表型。
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