JP2006503853A - 嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子蛋白質阻害薬およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)蛋白質は、哺乳類の気道、腸、膵臓および睾丸の上皮細胞において発現したcAMP-活性化塩素(Cl-)チャネルである。CFTRはcAMP-媒介Cl-分泌に関与する塩素チャネルである。ホルモン、例えばβ-アドレナリン作動薬、または毒素、例えばコレラ毒素によりcAMPが増加し、cAMP-依存性蛋白質キナーゼが活性化され、CFTR Cl-チャネルがリン酸化され、これによりチャネルが開く。細胞Ca2+が増加すると、異なる頂端膜チャネルも活性化される。蛋白質キナーゼCによるリン酸化により、頂端膜のCl-チャネルが開く、または閉じられる。CFTRは主に上皮に位置し、そこでは、頂端膜を横切るCl-イオンの移動のための経路が提供され、経皮塩および水輸送速度を調節するキーポイントが提供される。CFTR塩素チャネル機能は広範囲の疾患、例えば、嚢胞性線維症(CF)、ならびに男性不妊のいくつかの形態、多発性嚢胞腎および分泌性下痢と関連する。
本発明は、CFTR-媒介疾患および状態の研究および治療に有益な嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子蛋白質(CFTR)の阻害のための組成物、薬学的調製物および方法を提供する。本発明の組成物および薬学的調製物は1または複数のチアゾリジノン化合物または誘導体を含んでもよく、さらに、1または複数の薬学的に許容される担体、賦形剤および/またはアジュバントを含んでもよい。本発明の方法は、一定の態様では、CFTR-媒介疾患または状態に苦しむ患者に、有効量のチアゾリジノン化合物または誘導体を投与する段階を含む。別の態様では、本発明は、被験者の細胞を有効量のチアゾリジノン化合物または誘導体と接触させる段階を含む、CFTRを阻害する方法を提供する。さらに、本発明は、ヒト以外の動物にCFTRを阻害するのに十分な量のチアゾリジノン化合物または誘導体を投与することにより引き起こされるCFTR-媒介疾患のヒト以外の動物モデルを特徴とする。
本発明は高親和性CFTR阻害薬であるチアゾリジノン化合物および誘導体の発見に基づく。本発明の化合物および誘導体の構造、ならびに製剤および使用法を以下でより詳細に説明する。
「嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子蛋白質-媒介状態または徴候」または「CFTR-媒介状態または徴候」は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子蛋白質(CFTR)の活性、例えばイオン輸送におけるCFTRの活性により起こる任意の状態、障害もしくは疾患、またはそのような状態、障害もしくは疾患の徴候を意味する。そのような状態、障害もしくは疾患、またはそのような状態、障害もしくは疾患の徴候はCFTR活性の阻害、例えばCFTRイオン輸送の阻害により治療できる。CFTR活性は例えば、様々な作動薬、例えばコレラ毒素に応じる腸内分泌に関係する(例えば、Snyder et al.1982 Bull. World Heath Organ. 60:605-613;Chao et al. 1994 EMBO J. 13:1065-1072;Kimberg et al. 1971 J. Clin. Invest.50:1218-1230を参照のこと)。
本発明はチアゾリジノン組成物、チアゾリジノン誘導体組成物および嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子蛋白質(CFTR)の高親和性阻害におけるその使用方法、ならびにCFTR-媒介疾患および状態の研究および治療のためのその使用方法を提供する。対象のチアゾリジノン化合物およびその誘導体の発見は、CFTRと直接相互作用するCFTR阻害薬を同定するように設計されたアッセイ法を使用する多くの可能性のある候補化合物のスクリーニングに基づく。任意の特別な理論または動作モードに固執せずに、異なる活性化経路に作用する複数のCFTR活性化剤が対象化合物の同定に至る研究に含まれていたので、本発明の阻害化合物はおそらくCFTR Cl-輸送経路で、またはその付近で作用することにより阻害する。50,000の様々な化合物のスクリーニングにより、効果的なCFTR阻害薬としていくつかの2-チオキソ-4-チアゾリジノン化合物および誘導体を同定した。これらの化合物および誘導体は、従来の周知のCFTR活性化剤または従来の周知のCFTR阻害薬DPC、NPPBまたはグリベンクラミドとは化学的および構造的に関係ない。スクリーニングから同定した最も強力なCFTR阻害薬は、ヒト気道細胞におけるCl-電流の阻害に対し〜300nMのKIを有した。阻害は迅速で、可逆で、CFTR-特異的であった。
本発明の組成物および方法において使用するチアゾリジノン化合物および誘導体は5またはそれ以上の原子の複素環を有し、アリール置換窒素、少なくとも1つの硫黄、酸素、またはセレンヘテロ原子、および複素環と結合した1または複数のカルボニルまたはチオカルボニル基を含む。より特定的には、対象チアゾリジノン化合物および誘導体は、下記化学式(I)、または薬学的に許容されるそれらの誘導体を、個々の立体異性体またはその混合物として、有してもよい:
(式中、
X1、X2およびX3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;Y1、Y2およびY3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;A1およびA2はそれぞれ、酸素および硫黄から選択され、A3は硫黄およびセレンから選択され;A4は1または複数の炭素原子またはヘテロ原子を有し、存在してもしなくてもよい)。A4が存在しない場合、中央複素環は5員環である。
(式中、
X1、X2およびX3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;Y1、Y2およびY3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;A1およびA2はそれぞれ、酸素および硫黄から選択される)。特定の態様では、X1は電子吸引性基であってもよく、ハロアルキル基、ジハロアルキル基、トリハロアルキル基(例えば、トリフルオロアルキル基)またはフルオロ基を含んでもよい。Y2は、独立してアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、ニトロ、カーボネート、カルバメート、アルコキシ、アルキルカルボニル、およびハロ基からなる群から選択され、Y1は独立して、ヒドロキシルおよびブロモ基から選択され、Y3は独立して水素および窒素基から選択される。
(式中、
X1、X2およびX3の少なくとも1つは電子吸引性基であり;Y1、Y2およびY3はそれぞれ、水素、アルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、ニトロ、カーボネート、カルバメート、アルコキシ、アルキルカルボニル、およびハロ基から選択される)。1つの態様では、X1は2、3、または4から選択される1つの位置にあり;Y2は、2、3、または4から選択される1つの位置にあり;Y1およびY3は水素であってもよい。
(式中、
Y1〜Y3は上記の通りである)。1つの態様では、トリフルオロメチル基は2、3、または4から選択される1つの位置にあり;Y2は、2、3、または4から選択される1つの位置にあり;Y1およびY3はこの態様では水素であってもよい。
すなわち、3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-ニトロフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;
すなわち、3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-オキシカルボキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;
すなわち、3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-カルボキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;
すなわち、3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3,4-ジヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;
すなわち、3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3,5-ジブロモ-4-ヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;および
すなわち、3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3-ブロモ-4-ヒドロキシ-5-ニトロフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン。また、上記列挙した任意の化合物のトリフルオロメチル基はフェニル環の2位または4位としてもよい。
本発明により、上記対象チアゾリジノン化合物の薬学的調製物も提供される。対象化合物は様々な経路による治療投与用の様々な製剤中に組み入れることができる。より特別には、本発明の化合物は、適当な、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤および/またはアジュバントと組み合わせることにより製剤化して薬学的組成物にすることができ、または製剤化して固体、半固体、液体また気体形態の調製物、例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐薬、注射液、吸入薬およびエアロゾルとしてもよい。好ましくは、製剤は検出可能なDMSO(ジメチルスルホキシド)を含まない。DMSOは、非局所性の非経口投与または経腸投与用の薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントではない。製剤は、投与の必要な被験者または患者に多くの異なる経路、例えば経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内投与などを介して投与されるように、設計されてもよい。
本明細書で開示したCFTR阻害薬は、CFTRの活性、例えばイオン輸送におけるCFTRの活性に起因するCFTRにより媒介される状態、すなわち、任意の状態、障害もしくは疾患、またはそのような状態、障害もしくは疾患の徴候の治療に有益である。そのような状態、障害、疾患、またはそれらの徴候は、CFTR活性の阻害、例えば、CFTRイオン輸送の阻害による治療に適している。
本発明のCFTR阻害薬はまた、減少したCFTR機能(例えば、減少したイオン輸送)に関連する疾患のヒト以外の動物モデルを作成するのに使用することができる。気道粘膜下腺による液分泌および高分子分泌の欠陥により、CFTR-欠乏被験者、特に嚢胞性線維症(CF)の影響を受けた被験者では粘膜毛様体クリアランスおよび細菌クリアランスの低下につながる証拠が益々増えている;が、ヒト気道腺での機能研究は肺移植時に得られる重篤な疾患を有する気道に制限されている(Jayaraman et al.2001 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8119-8123)。急性CFTR阻害により、粘膜下腺による水、塩および高分子分泌におけるCFTRの役割の決定が可能である。高親和性CFTR阻害薬により、ヒトにおけるCFTR-欠乏を模倣する、例えば、ヒトCF表現型を模倣するヒト以外の動物モデルを薬理学的に作成することができる。特に、CFTR欠乏(例えば、CF)の大型動物モデルは、CFにおける気道疾患の始まりおよび進行の病態生理を評価する、およびCF治療の効能を評価する、例えばCFTR-欠乏またはその徴候の治療に対する候補薬剤をスクリーニングするのに特に使用される。
本発明の化合物は、当業者に周知の方法、またはUS第5,326,770号およびUS第6,380,186号(これらは全て参照により全体として本明細書に組み込まれる)で開示された方法と類似する方法により、または下記方法と類似する方法により調製してもよい。
反応スキームI
反応スキーム2
反応スキーム3
下記実施例は、本発明をどのように製造し使用するかを、当業者に完全に開示し説明するために、示したものであり、発明者らが発明であると考えている範囲を限定するものではなく、下記実験が全てであることを示すものではなく、実施した実験にすぎない。使用した数値(例えば、量、温度など)については精度を保証するように努力がなされているが、いくつかの実験誤差および偏差が説明されるべきである。特に記載がなければ、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏温度、および圧力は大気圧またはその付近である。
3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-カルボキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノンの合成
A. 酢酸エチル(10mL)に溶解した3-トリフルオロメチルアニリン(1.6g、10mmol)およびトリエチルアミン(1g、10mmol)の撹拌溶液に、30分の期間中、二硫化炭素(0.8g、10mmol)を滴下した。添加が大体半分完了すると、穏やかな発熱反応が始まり、この発熱反応は氷浴を断続的に使用することにより容易に制御できた。一晩中撹拌した後、粘度の高い黄色スラリーを濾過し、沈澱をジエチルエーテル50mLで洗浄し、空気乾燥すると、3gの黄白色のジチオカルバメート固体(89%)が得られた。m.p.92〜95℃(dec.)。
3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3-カルボキシ-4-ヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;
3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;
3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(2,3,4-トリヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;
3-[(3-トリフルオロメチル-4-フルオロ)フェニル]-5-[(3-カルボキシ-4-ヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;および
3-[(4-フルオロ-3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-カルボキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン。
ヒト野生型CFTRおよびハロゲン化指標YFP-H148Qを共発現するFischerラット甲状腺(FRT)細胞を、前に記述されているように作成した(Galietta et al. 2001 J. Biol. Chem. 276:19723-19728)。細胞を96-ウエルの黒色壁マイクロプレート(Corning Costar)に、1ウエルあたり20,000細胞の密度で、5%ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン、および100μg/mL ストレプトマイシンを補足したCoon改良F12培地中に蒔いた。プレーティング後48時間、細胞が集密(〜40,000細胞/ウエル)となった時点でアッセイ法を実施した。
3メートルのロボットアーム、CO2インキュベータ、プレートウォッシャー、液体処理ワークステーション、バーコード読み取り機、蓋除去(delidding)ステーション、および2つのFluoStar蛍光プレート読み取り機(BMG Labtechnologies、ドイツオッフェンブルグ)、各々2つのシリンジポンプおよびHQ500/20X(500±10nm)励起およびHQ535/30M(535±15nm)発光フィルタ(Chroma)を備える、から構成される特製スクリーニングシステム(Beckman)を用いて、アッセイ法を実施した。ロボットシステムは、2つのプレート読み取り機に対し修正されたSAMIバージョン3.3ソフトウエア(Beckman)を用いて統合させた。カスタムソフトウエアは、保存されたデータファイルからベースラインを引いた正規化蛍光勾配を計算するために(ハロゲン化物流入速度が得られる)、VBA(ビジュアル・ベーシック・フォー・アプリケーション)で書かれていた。
[cAMP]およびホスファターゼアッセイ法を、前に報告されたように実施した(Galietta et al. 2001 J. Biol. Chem. 276:19723-19728)。0〜1000μMの阻害薬による細胞インキュベーション後24時間にジヒドロローダミン法により細胞毒性を評価した。0〜100μg/kgの阻害薬を毎日腹腔内注射した後5日に、マウス中の血清化学物質および血液学の測定(UCSF Clinical Laboratory)により、動物毒性を評価した。
不死化したヒト気管細胞系、9HTEo-/Dx(MDR-1の内因性発現がドキソルビシン濃度の増加における選択により上方制御されている)における3H-ビンクリスチン蓄積を測定することにより、MDR-1活性を評価した(Rasola et al. 1994 J. Biol. Chem. 269:1432-1436)。細胞を24-ウエルマイクロプレートに播種した(200,000細胞/ウエル)。48時間後、細胞を、130 NaCl、2 KCl、1 KH2PO4、2 CaCl2、10 Na-Hepes(pH7.3)および10 ブドウ糖(mMで表す)を含む溶液で洗浄し、1時間37℃で、3H-ビンクリスチン(0.7μM;1μCi/mL)を含む同じ溶液200μlでインキュベートした。その後、細胞を3回、氷***液で洗浄し、0.25M NaOH中に溶解した。ビンクリスチン量をシンチレーション計数により決定した。
CFTR-発現FRT細胞またはヒト気管支上皮細胞を含むSnapwellインサートをUssingチャンバシステム内に載置した。FRT細胞では、半チャンバを5mLの75mM NaClおよび75mM グルコン酸ナトリウム(頂端)ならびに150mM NaCl(側底)(pH7.3)で満たし、側底膜を250μg/mL アムホテリシンBで透過処理した(Galietta et al. 2001 J. Biol. Chem. 276:19723-19728)。気管支上皮細胞およびT84細胞では、両方の半チャンバはKrebs重炭酸塩溶液を含んだ。半チャンバを連続して、空気(FRT細胞)または5% CO2を含む空気(気管支およびT84細胞)により起泡させ、37℃で維持した。DVC-1000電圧クランプ(World Precision Instruments、フロリダ州サラソータ)を使用し、Ag/AgCl電極および1M KCl寒天橋を使用して、短絡電流を連続して記録した。
膜電流を細胞全体構造で測定した。Cl-チャネルの記録では、細胞外(浴(bath))溶液は以下のものを含み(mMで表す):150 NaCl、1 CaCl2、1 MgCl2、10 ブドウ糖、10 マンニトール、10 TES(pH 7.4)、細胞内(ピペット)溶液は下記のものと含んだ:120 CsCl、1 MgCl2、10 TEA-Cl、0.5 EGTA、1 Mg-ATP、10 Hepes(pH7.3)。CFTRはフォルスコリン(5μM)を含む細胞外溶液により活性化された。膜コンダクタンスの時間経過を、-100と+800mVの交流電圧パルスに応じてモニタした。確定した時間で、プロトコルを中断し、電流-電圧の関係を作成した(-100から+100mVまで、20mVのインクリメントの電圧パルス)。体積-感受性Cl-チャネルを低張溶液(120NaClまで減少させた細胞外NaCl;250mosM/kg)により活性化させた。カルシウム-感受性Cl-チャネルをヒト気管支上皮細胞で、100μM UTPを細胞外溶液に添加することにより活性化した。
細胞外(浴)溶液が(mMで表すと)130 NaCl、2 KCl、1 KH2PO4、2 CaCl2、2 MgCl2、10 Na-Hepes(pH 7.3)および10ブドウ糖を含む膵臓β細胞系INS-1において膜電位を記録した。ピペットは下記のものを含んだ(mMで表す):140 KCl、1 CaCl2、2mM MgCl2、10 EGTA、0.5 MgATP、10 K-Hepes(pH7.3)。細胞全体構造を達成した後、増幅器を電流-クランプモードに切り換えた。
3アッセイ法の最初で、回腸ループにおける液体貯留を測定した(Oi et al. 2002 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:3042-3046;Gorbach et al. 1971 J. Clin. Invest. 50:881-889)。CD1遺伝的背景のマウス(8〜10週齢、体重25〜35g)(または△F508ホモ接合マウス)を24時間飢餓にさせ、腹腔内ケタミン(40mg/kg)およびキシラジン(8mg/kg)により麻酔した。加熱パッドを用いて、体温を手術中36〜38℃に維持した。腹腔を小さく切除し、小腸を露出させ、盲腸に近い閉回腸ループ(長さ20〜30mm)を縫合により単離した。ループに100μlのPBSを単毒で、またはコレラ毒素(1μg)を含むPBSを注入した。いくつかの実験では、阻害薬(150μg/kg)を腹腔内注入により投与した。腹腔切除を縫合により閉じ、マウスを麻酔から覚醒させた。6時間でマウスに麻酔をかけ、腸ループを外面化させ、腸間膜および結合組織を除去した後、ループ長および重量を測定した。
酢酸エチル(10mL)に溶解した3-トリフルオロメチルアニリン(1.6g、10mM)およびトリエチルアミン(1g、10mM)の撹拌溶液に二硫化炭素(0.8g、10mM)を30分にわたり滴下することにより、中間体2-チオキソ-3-(3-トリフルオロメチルフェニル)-4-チアゾリジノンを合成した。氷浴を使用し、反応中の過剰加熱を阻止した。一晩中撹拌した後、粘度の高い黄色スラリーを濾過し、沈澱をエーテル50mLで洗浄し、空気乾燥すると、3g(収率89%)の黄白色のジチオカルバメート固体(融点92〜95℃)が得られた。NaBr-14C-アセテート(Br-14C-酢酸(Amersham)、55mCi/mmol、64mg、0.6mLの水中0.46mM、NaHCO3を用いpH8〜9から調製)を撹拌し、5〜10℃まで冷却し、ジチオカルバメート(0.3g、0.9mM)を10分にわたり添加した。フラスコが室温まで温められるまで、撹拌を続けた。2時間後、溶液を10℃まで冷却し、濃縮HClで酸性化し、90〜95℃まで30分間加熱した。得られた沈澱を濾過し、水で洗浄し、エタノールから再結晶化すると、103mgの所望の生成物が光沢のある結晶(収率83%)として得られた。m.p.177〜178℃;比活性度(14C)55mCi/mmol。
3%DMSOを含むPBS(NaOHを用いてpH7.4に滴定)中の14C-CFTRinh-172(50μCi)のボーラスを、留置頸部カテーテルによりラットの静脈内に1分にわたり投与した(オスSprague-Dawleyラット、360-420g)。血液を特定時間にカテーテルから収集した。14C-放射活性を、シンチレーション計数(Scintiverse SE、Fisher、CA)によりLS-6500 Multi-Purpose Scintillation Counter(Beckman)を用いて血漿(14,000gで10分間全血の遠心分離により単離)中で決定した。WinNonlinソフトウエア(Pharsight)を用いて薬物動態分析を実施した。最終血液/組織サンプルを収集した後、ラットをペンタバルビタール過剰摂取により屠殺した。全ての動物手順は動物研究に関するUCSF委員会により承認された。
14C-CFTRinh-172(2μCi)のボーラスを1分にわたりマウス(オスCD1マウス、30〜35g)に尾部静脈により静脈投与した。マウスを5、30、120および240分で屠殺した。臓器を取り出し、計量し、蒸留水中でホモジナイズした(10〜50vol%)。放射活性をホモジネート(25〜50μL)のシンチレーション計数により決定し、臓器あたり(または骨格筋に対する1g組織あたり)の総14C-放射活性として表した。同時に血液、尿および胆汁(胆嚢または十二指腸由来)を収集し、14C-放射活性を測定し、/mL流体として表した。排出研究を、14C-CFTRinh-172投与後最初の24時間にわたる尿および大便収集物により実施した。組織分布研究も、薬物動態研究に対するように調製したラットで実施した。
体液(血漿、尿、胆汁)および肝臓ホモジネートのアリコートでシリカプレート上に斑点をつけ、酢酸エチル:ヘキサン:メタノール(1:1:0.1)溶媒系を用いて薄層クロマトグラフィーにより分離した。元の阻害薬に対してはrf〜0.5が得られた。オートラジオグラフィーをHyperfilm(Amersham)を用い、Transcreen LE増幅システム(Kodak)により実施した。14C-標識CFTRinh-172標準を全てのプレート上に含有させた。
細胞研究では、T84細胞単層を含むSnapwellインサートをUssingチャンバシステム(Navicyte、Harvard Apparatus、Holliston、MA)内に載置した。半チャンバを、(mMで表した)NaCl 120、NaHCO3 25、KH2PO4 3.3、K2HPO4 0.8、MgCl2 1.2、CaCl2 1.2、ブドウ糖 10を含むKrebs-重炭酸塩溶液(37℃で維持)で満たし、5% CO2/95% O2で連続して起泡させた。高K+緩衝液は、(mMで表した)NaCl 65、KCl 67.5、KH2PO4 1.5、CaCl2 1、MgCl2 0.5、HEPES 10、ブドウ糖 10を含んだ。低Cl-緩衝液は、(mMで表した)グルコン酸ナトリウム120、KH2PO4 3.3、K2HPO4 0.8、MgCl2 1.2、CaCl2 1.2、HEPES 10、ブドウ糖 10(37℃で維持)を含み、連続して空気で起泡させた。マウス結腸での測定のために、マウスを腹腔内ケタミン(40mg/kg)およびキシラジン(8mg/kg)で麻酔した。回腸を除去し、氷冷Krebs緩衝液で洗浄し、腸管膜の境界に沿って開き、μ-Ussingチャンバ(面積0.7cm2、World Precision Instruments、Sarasota、FL)内に載置した。ヒトの腸での測定のために、結腸断片を鈍的切開により筋肉層を除去し、上記のように載置した。半チャンバを、10μMのインドメタシンを含む酸素化リンガー重炭酸塩溶液で満たした。Ag/AgCl電極および1M KCl寒天橋によりDVC-1000電圧クランプ(World Precision Instruments)を用いて短絡電流を記録した。作動薬/阻害薬を下記のように半チャンバに添加した。
CD1遺伝的背景のマウス(8〜10週齢、体重25〜35g)を、24時間、水への接近を許可したが、食物は許可しなかった。マウスを上記のように麻酔し、体温を手術中加熱パッドを使用して36〜38℃に維持した。小さな腹部切開部を作成し、小腸を露出させ、盲腸付近の閉回腸ループ(長さ20〜30mm)を縫合により単離した。ループに100μLのPBSのみ、またはコレラ毒素(1μg)を含むPBSを注入した。いくつかの実験では、CFTRinh-172(0〜200μg)を、コレラ毒素注入前後の特定の時間に、腹腔内注入により投与した。縫合により腹部切開部を閉じ、マウスを麻酔から覚醒させた。6時間でマウスに麻酔をかけ、腸ループを外面化させ、腸間膜および結合組織を除去した後、ループ長および重量を測定した。
Caco-2細胞を多孔性インサート上で培養し、400〜600Ωcm-1の単層抵抗を得た。輸送研究では、培地を、15mMのブドウ糖および25mMのHEPES(pH7.3)を含む等量のHank緩衝塩溶液(HBSS)と置換した。1hr後、CFTRinh-172(25μM)を上部チャンバに添加し、プレートを穏やかに37℃で揺り動かした。特定の時間に、低部(レシーバ)チャンバから50μLの溶液を取り出し、UV吸光度(385nm)によりCFTRinh-172濃度を測定した。見かけの透過性(Papp)を下記式から計算した:
Papp=dC/dT X(Vr/AC0)
(式中、dC/dTはレシーバチャンバ中のCFTRinh-172濃度の増加速度を示し、Vrはレシーバチャンバの体積であり、Aは単層表面積であり、COはドナーチャンバ中のCFTRinh-172初期濃度である)。
マウスをハロタンを用いて一時的に麻酔し、ビタミンE TPGSで可溶化した14C-CFTRinh-172(12μCi)(d-α-トコフェニルポリエチレングリコール1000スクシネート、水中に溶解した10% w/v TPGS懸濁液中の0.5% w/v CFTRinh-172)を経口強制飼養した。比較のために、他のマウスに14C-CFTRinh-172(2μCi)を静脈内に、尾部静脈注入により摂取させた。特定の時間に血液を尾部静脈から収集し、血漿14C放射活性を測定した。6時間で、ペントバルビタール過剰摂取によりマウスを屠殺し、臓器を取り出しホモジネート中の放射活性を測定した。
CFTR阻害薬のスクリーニング
本発明の化合物を同定するのに使用される主スクリーニング技術は、直接CFTR-阻害薬相互作用によりCFTR Cl-コンダクタンスの阻害薬を同定するように設計された。図1Aに概略が示されるように、フォルスコリン、IBMXおよびアピゲニンを含むカクテルを活性化することにより、CFTRをCFTR-発現FRT細胞において予め刺激した。複数の機序(cAMP上昇、ホスホジエステラーゼ阻害、および直接CFTR結合)によるCFTRの活性化により、シグナル伝達経路においてより近位の段階ではなく直接CFTR Cl-輸送経路を遮断する阻害薬が同定できた。FRT細胞は、阻害効力の定量的蛍光読み取りを提供する黄色蛍光蛋白質系Cl-/I-センサを共発現した(例えば、Jayaraman et al.、2000、J. Biol. Chem. 275:6047-6050;Galietta et al.、2001、Am、J. Physiol. 281:C1734-C1742を参照のこと)。CFTRを予め刺激し、化合物を添加した後、細胞は内部に向かうI-勾配を受けI-の流入が誘導され、蛍光が減少する。各アッセイ法は2秒間のベースライン蛍光の記録、その後の、I-含有溶液の急速添加後の12秒の蛍光の連続記録から構成した。化合物を、完全に自動化した高スループットスクリーニング装置を使用して、96-ウエルフォーマットにおいて10μM濃度で別個に試験した(下記実施例2を参照のこと)。
CFTRinh-172のキャラクタリゼーション
特定の用量の対象チアゾリジノン化合物のCFTR阻害レベルを、図1Aに示し、上述した蛍光アッセイ法を用いて決定した。図2Aは、相対YFP蛍光対時間としてのCFTRinh-172に対する用量-阻害データを示したものである。0.3〜0.6μMの濃度のこのチアゾリジノン化合物で、かなりのCFTR阻害が見られた。図2Bは、CFTRinh-172による阻害(添加またはウォッシュアウト後の相対輸送速度対時間としてグラフに示す)が〜10minで完了し(t1/2=4min)、ウォッシュアウト後反転しt1/2〜5minであった(挿入図)ことを示す。図2Cで示した相対輸送速度は、最初のスクリーニングのために使用される活性化カクテルに含まれない複数の型の作動薬によるCFTR活性化が、CFTRinh-172により効果的に阻害されることを示す。これらの作動薬としては、ゲニステイン、CPT-cAMP、CPX、8-MPOならびに強力なベンゾフラボンCFTR活性化剤UCCF-029(2-(4-ピリジニウム)ベンゾ[h]4H-クロメン-4-オンビスルフェート)およびベンズイミダゾロンCFTR活性化剤UCCF-853が挙げられる(Galietta、et al.、2001、J. Biol. Chem. 276:19723-19728)。
インビボ効能
CFTRinh-172の効能を、コレラ毒素により誘発した腸液分泌の2つのアッセイ法を用いてインビボで、および単離した腸で短絡分析により試験した。第1のアッセイ法では、一連の小腸の閉ループをインビボで作成し、交互のループの内腔に少量の生理食塩水またはコレラ毒素を含む生理食塩水を注入した。内腔の液体貯留を6時間後に決定した。図5Aに示されるように、コレラ毒素処理ループでは著しい液体貯留および膨張があったが、隣接する対照(生理食塩水)ループは空のままであった。コレラ毒素注入前のCFTRinh-172の単回投与(150μg/kg腹腔内)は、毒素処理腸ループにおける液体貯留を効果的に阻止した。
薬物動態分析
ラットにおける薬物動態分析を、14C-標識CFTRinh-172の単回静脈内ボーラス注入後の血清14C放射活性を逐次測定することにより実施した。注入した阻害薬の総量(400μg、〜1mg/kg)はラットにおける下痢止め薬として効果的であった。図7は、血清14C放射活性の動力学が2-コンパートメントモデルとよく適合し、分布体積が1.2L、AUC(曲線下面積)が3.8μg・hr/mLであることを示す。半減時間は0.14hr(再分配)および10.3hr(排出)であった。投与後72時間の血漿、または投与後14日の肝臓もしくは腎臓ホモジネート中では、14C-標識CFTRinh-172は検出されなかった。
CFTRinh-172の阻害効果の用量反応および期間
この実施例の目的は、CFTRinh-172の単回腹腔内投与がマウスの閉腸ループモデルでコレラ毒素により刺激された体液分泌を阻害することができることに関する上記観察結果を拡張することであった。とりわけ、この実施例の目的は、CFTRinh-172阻害効果の用量反応関係および持続に対する見かけの半減時間を測定することであった。
CFTRinh-172の経口バイオアベイラビリティ
経口投与されたCFTRinh-172の下痢止め効能を試験するために、マウスにおけるCFTRinh-172薬物動態を決定し、Caco-2単層を横切るCFTRinh-172輸送を測定した。CFTRinh-172は、胃で沈澱すると考えられるかなり非極性の弱酸(pKa=5.5)であるので、経口投与のために薬剤を可溶化させるのに通常使用される2つの薬剤、ビタミンE TPGSおよびシクロデキストリンを使用して経口投与を実施した。14C-標識CFTRinh-172を使用して測定した。
cGMP-およびcAMP-媒介体液分泌
インビボラット腸ループモデルを使用して、cGMP-およびcAMP-媒介体液分泌の阻害におけるCFTRinh-172の有効性を決定し、ならびに別の動物モデルにおけるCFTRinh-172の有効性を試験した。グアニリルシクラーゼC受容体がラット腸細胞で発現し、STa毒素結合および細胞質cGMP上昇が可能となる(Mann et al. Biochem Biophs Res commun 1997 239:463-466)。STa毒素は3hr後にラット回腸で液分泌を引き起こすことが見出された(Cohen et al. Am J Physiol 1989 257:G118-123)。CFTRinh-172は、マウスで有効な用量(600μg/kg)でラットの腸ループにおけるコレラ毒素により誘発された液分泌を阻害した(図12、パネルA)。STa毒素により誘発される液分泌では、腸ループにSTa毒素(0.1μgを含むPBS 300μl)を注入し、ループ重量を3hr後に測定した。図12、パネルBはCFTRinh-172による腸液分泌の〜75%阻害を示す。
Claims (64)
- 嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)蛋白質により媒介される状態または徴候を有する患者を治療する方法であって、
被験者に、治療上有効な量の化学式(I)の化合物または薬学的に許容されるそれらの誘導体を、個々の立体異性体またはそれらの混合物として投与する段階を含む、方法:
(式中、
X1、X2およびX3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;Y1、Y2およびY3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;A1およびA2はそれぞれ、酸素および硫黄から選択され、A3は硫黄およびセレンから選択され;A4は1または複数の炭素原子またはヘテロ原子を有し、存在してもしなくてもよい)。 - 状態および徴候が、異常に増加した腸分泌と関連する、請求項1記載の方法。
- 状態および徴候が、分泌性下痢である、請求項2記載の方法。
- 化学式(I)の化合物が、A4が存在せず、A1およびA3が各々硫黄であり、A2が酸素である化合物、すなわち、3-アリール-5-アリールメチレン-2-チオキソ-4-チアゾリジノンである、請求項1記載の方法。
- 化学式(I)の化合物が、下記から選択される、請求項1記載の方法:
3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-ニトロフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-オキシカルボキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-カルボキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3,4-ジヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3,5-ジブロモ-4-ヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;および3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3-ブロモ-4-ヒドロキシ-5-ニトロフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン。 - X1が電子吸引性基である、請求項6記載の方法。
- X1がペルフルオロアルキル基およびフルオロ基からなる群から選択される、請求項7記載の方法。
- Y2が、アルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、ニトロ、カーボネート、カルバメート、アルコキシ、アルキルカルボニル、およびハロ基から選択される、請求項8記載の方法。
- X1が3-トリフルオロメチル基である、請求項7記載の方法。
- Y2がヒドロキシル基である、請求項6記載の方法。
- Y1がヒドロキシル基である、請求項11記載の方法。
- Y1がブロモ基である、請求項11記載の方法。
- Y3がニトロ基である、請求項11記載の方法。
- X1がトリフルオロメチル基である、請求項16記載の方法。
- X1が3-トリフルオロメチル基である、請求項17記載の方法。
- 被験者の細胞において嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子蛋白質の活性を阻害するための方法であって、細胞を化学式(I)または薬学的に許容されるそれらの誘導体と、個々の立体異性体またはそれらの混合物として、細胞内でのCFTRイオン輸送を阻害するのに十分な量で接触させる段階を含む方法:
(式中、
X1、X2およびX3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;Y1、Y2およびY3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;A1およびA2はそれぞれ、酸素および硫黄から選択され、A3は硫黄およびセレンから選択され;A4は1または複数の炭素原子またはヘテロ原子を有し、存在してもしなくてもよい)。 - 化学式(I)の化合物が、A4が存在せず、A1およびA3が各々硫黄であり、A2が酸素である化合物、すなわち、3-アリール-5-アリールメチレン-2-チオキソ-4-チアゾリジノンである、請求項20記載の方法。
- 化学式(I)の化合物が、下記から選択される、請求項21記載の方法:
3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-ニトロフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-オキシカルボキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-カルボキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3,4-ジヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3,5-ジブロモ-4-ヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;および3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3-ブロモ-4-ヒドロキシ-5-ニトロフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン。 - X1が電子吸引性基である、請求項23記載の方法。
- X1がペルフルオロアルキル基およびフルオロ基から選択される、請求項24記載の方法。
- X1が3-トリフルオロメチル基である、請求項24記載の方法。
- Y2が、アルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、ニトロ、カーボネート、カルバメート、アルコキシ、アルキルカルボニル、およびハロ基から選択される、請求項23記載の方法。
- Y2がヒドロキシル基である、請求項23記載の方法。
- Y1がヒドロキシル基である、請求項28記載の方法。
- Y1がブロモ基である、請求項28記載の方法。
- Y3がニトロ基である、請求項28記載の方法。
- X1がトリフルオロメチル基である、請求項33記載の方法。
- X1が3-トリフルオロメチル基である、請求項34記載の方法。
- 細胞を接触させる段階が、被験者が化学式(I)の化合物を摂取する段階を含む、請求項20記載の方法。
- 摂取段階が、化学式(I)の化合物と共に薬学的に許容される担体を摂取する段階を含む、請求項37記載の方法。
- インビボアッセイ法において細胞における嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子蛋白質の活性を阻害するための方法であって、細胞を化学式(I)の化合物または薬学的に許容されるそれらの誘導体と、個々の立体異性体またはそれらの混合物として、細胞内でのCFTRイオン輸送を阻害するのに十分な量で接触させる段階を含む、方法:
(式中、
X1、X2およびX3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;Y1、Y2およびY3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;A1およびA2はそれぞれ、酸素および硫黄から選択され、A3は硫黄およびセレンから選択され;A4は1または複数の炭素原子またはヘテロ原子を有し、存在してもしなくてもよい)。 - ヒト以外の動物において嚢胞性線維症(CF)表現型を作成するための方法であって、ヒト以外の動物に化学式(I)の化合物または薬学的に許容されるそれらの誘導体を、個々の立体異性体またはそれらの混合物として、ヒト以外の動物において嚢胞性線維症(CF)表現型を誘導するのに十分な量で投与する段階を含む、方法:
(式中、
X1、X2およびX3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;Y1、Y2およびY3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;A1およびA2はそれぞれ、酸素および硫黄から選択され、A3は硫黄およびセレンから選択され;A4は1または複数の炭素原子またはヘテロ原子を有し、存在してもしなくてもよい)。 - 被験者における嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)による異常イオン輸送と関連する状態を有する被験者の治療法であって、
被験者に有効量のチアゾリジノン化合物を投与する段階を含み、
CFTRイオン輸送が阻害され、状態が治療される、方法。 - 異常に増加したCFTRイオン輸送が下痢と関連する、請求項41記載の方法。
- 下痢が分泌性下痢である、請求項42記載の方法。
- それぞれ、下記から選択されるチアゾリン化合物:3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-ニトロフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-オキシカルボキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(4-カルボキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3,4-ジヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3,5-ジブロモ-4-ヒドロキシフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;および3-[(3-トリフルオロメチル)フェニル]-5-[(3-ブロモ-4-ヒドロキシ-5-ニトロフェニル)メチレン]-2-チオキソ-4-チアゾリジノン;ならびに少なくとも1つの薬学的に許容される担体、薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容される賦形剤および薬学的に許容されるアジュバントを含む、薬学的組成物。
- 組成物が、検出可能なジメチルスルホキシドを含まない、請求項44記載の組成物。
- 化学式(I)の化合物、または薬学的に許容されるそれらの誘導体を、個々の立体異性体またはそれらの混合物として:
(式中、
X1、X2およびX3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;Y1、Y2およびY3はそれぞれ、水素、有機基、ハロ基、ニトロ基、アゾ基、ヒドロキシル基およびメルカプト基から選択され;A1およびA2はそれぞれ、酸素および硫黄から選択され、A3は硫黄およびセレンから選択され;A4は1または複数の炭素原子またはヘテロ原子を有し、存在してもしなくてもよく、ただし、下記を条件とする:
1)A4が存在せず、A1およびA2がそれぞれ酸素であり、A3が硫黄であり、X1、X2およびX3のうちの1つが4-位ではトリフルオロメチルまたはクロロであり、X1、X2およびX3の残りが各々水素であり、Y1、Y2およびY3のうちの1つが2位では4-メチルピペラジン-1-イルとすることはできず、Y1、Y2およびY3の残りがそれぞれ水素である;
2)A4が存在せず、A1およびA3がそれぞれ硫黄であり、A2が酸素であり、X1、X2およびX3のうちの1つが4-位ではカルボキシルであり、X1、X2およびX3の残りが各々水素であり、Y1、Y2およびY3の各々が水素とすることができない;
3)A4が存在せず、A1およびA3がそれぞれ硫黄であり、A2が酸素であり、X1、X2およびX3のうちの1つが2-、3-または4-位ではヒドロキシであり、4-位ではエトキシであり、X1、X2およびX3の残りが各々水素であり、Y1、Y2およびY3のうちの1つが水素であり、Y1、Y2およびY3のうちの別の1つが4-位ではヒドロキシまたはメトキシであり、Y1、Y2およびY3のうちの残りの1つが3位ではメトキシとすることはできない;および
4)A4が存在せず、A1およびA3がそれぞれ硫黄であり、A2が酸素であり、X1、X2およびX3のうちの1つが4-位ではメチルであり、X1、X2およびX3の別の1つが3-位ではクロロであり、Y1、Y2およびY3のうちの1つが4位ではメトキシであり、Y1、Y2およびY3の残りはそれぞれ水素とすることができない)
ならびに少なくとも1つの薬学的に許容される担体、薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容される賦形剤および薬学的に許容されるアジュバントを含む、薬学的組成物。 - X1が電子吸引性基である、請求項47記載の組成物。
- X1がペルフルオロアルキル基およびフルオロ基から選択される、請求項48記載の方法。
- Y2が、アルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、ニトロ、カーボネート、カルバメート、アルコキシ、アルキルカルボニル、およびハロ基から選択される、請求項47記載の組成物。
- X1が3-トリフルオロメチル基である、請求項47記載の組成物。
- Y2がヒドロキシル基である、請求項47記載の組成物。
- Y1がヒドロキシル基である、請求項52載の組成物。
- Y1がブロモ基である、請求項52記載の組成物。
- Y3がニトロ基である、請求項54記載の組成物。
- X1がトリフルオロメチル基である、請求項57記載の組成物。
- X1が3-トリフルオロメチル基である、請求項57記載の組成物。
- 組成物が検出可能なジメチルスルホキシドを含まない、請求項46記載の組成物。
- 嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)欠乏症を有するヒト以外の動物であって、欠乏症が、チアゾリン化合物が動物にCFTRイオン輸送を阻害するのに有効な量で投与されることにより引き起こされる、ヒト以外の動物。
- 動物が哺乳類である、請求項61記載のヒト以外の動物。
- 哺乳類がヒト以外の霊長類、齧歯類、有蹄類、または鳥類である、請求項62記載のヒト以外の動物。
- 動物が嚢胞性線維症に類似する表現型を有する、請求項61記載のヒト以外の動物。
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