CH695072A5 - Verfahren zur Aufzeichnung von Impulssignalen. - Google Patents

Description

  



   In der Mikroskopie, insbesondere der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie  (FCS), wie diese beispielsweise vom ConfoCor der Anmelderin bekannt  ist, werden die von einzelnen Fluoreszenzereignissen erzeugten und  über sogenanntes Single Photon Counting detektierten zeitlichen Signalfolgen  zur Auswertung entweder mit sich selbst zeitlich korreliert (Autokorrelation)  oder mit der zeitlichen Signalfolge eines zweiten Einganskanals zeitlich  korreliert (Kreuzkorrelation). Die Korrelationsauswertung erfolgt  mittels spezieller hardwaremässiger Korrelatoren, wie diese beispielsweise  von der Firma ALV-Laser Vertriebsgesellschaft, Langen, Deutschland,  unter der Bezeichnung "5000 Multiple Tau Correlator" angeboten werden.

    Derartiger Korrelatoren arbeiten nach dem sogenannten Multiple-Tau-Verfahren,  bei dem die Eingangssignale jeweils über eine Korrelationsstufenzeit  miteinander multipliziert und die dabei entstehenden Produkte addiert  werden, wobei stufenweise die Korrelationsstufenzeit logarithmisch  verlängert wird. Vorteil dieses Verfahrens ist, dass auch bei längeren  Korrelationszeiten der Rechenaufwand relativ gering bleibt. Nachteilig  ist jedoch, dass durch die Zusammenfassung der Eingangssignale in  den höheren Korrelationsstufen eine Tiefpassfilterung erfolgt. Ausserdem  gehen die Originaldaten verloren, so dass eine Bearbeitung und nachfolgende  erneute oder anderweitige Auswertung nicht möglich ist. 



   Für die Korrelationsauswertung eines einzigen Kanals mit einzelnen  Impulssignalen, also einer Signalfolge, die binäre Daten 0 und 1  liefert, wobei die 1 nur gelegentlich auftritt, ist es bekannt, den  Eingangskanal mit einer festen Frequenz abzutasten und lediglich  die Zeitabstände zwischen den einzelnen Impulsen aufzuzeichnen und  zu speichern. Die Korrelationsberechnung erfolgt dann einfach durch  die Bestimmung aller aufgetretenen zeitlichen Impulsabstände in der  Impulsfolge. Eine Anwendung dieses Verfahrens auf die Signale mehrerer  Eingangskanäle ist jedoch nicht bekannt. 



     Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Aufzeichnung von Impulssignalen  mehrerer Eingangskanäle, das eine möglichst kompakte Speicherung  der Information ohne Informationsverlust ermöglicht. 



   Dieses Ziel wird durch Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche  1 und 2 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben  sich aus den Merkmalen der abhängigen Ansprüche. 



   Bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung werden die mehreren  Eingangskanäle mit einer vorgegebenen festen Frequenz auf auftretende  Ereignisse abgetastet und nach Detektion eines Ereignisses in einem  der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines Zählers - je nachdem  welches Ereignis von beiden zuerst eintritt - wird der aktuelle Zustand  aller Eingangskanäle in einem Speicherregister zusammen mit einer  den Zeitabstand zur letzten Abspeicherung charakterisierenden Grösse  gespeichert. 



   Bei einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden ebenfalls  die mehreren Eingangskanäle mit einer vorgegebenen festen Frequenz  auf auftretende Ereignisse abgetastet. Und auch bei dieser zweiten  Ausführungsform erfolgt die Abspeicherung nach der Detektion eines  Ereignisses in einem der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines  Zählers - je nachdem, welches der beiden Ereignisse zuerst auftritt.  Jedoch werden bei dieser Ausführungsform die Zustände der Eingangskanäle  in dem Abtastzyklus, in dem das Ereignis eintritt und zusätzlich  für eine vorgegebene Anzahl an Abtastzyklen nach Eintritt des Ereignisses  zusammen mit einer den Zeitabstand zur letzten Abspeicherung charakterisierenden  Grösse abgespeichert. 



   Bei beiden Ausführungsformen ist in den abgespeicherten Daten die  Information über die Signalfolgen in allen Eingangskanälen vollständig  erhalten; durch die vorgenommene Zeit-Abstandskodierung liegen die  Rohdaten in einer Form vor, die eine spätere Autokorrelations- und/oder  Kreuzkorrelationsauswertung durch Auswertung der Histogramme der  zeitlichen Impulsabstände der Eingangskanäle ermöglicht. Der Speicherbedarf  ist in beiden Fällen primär von der Häufigkeit der in den Eingangskanälen  auftretenden Ereignisse und nur sekundär von der Abtastfrequenz abhängig.                                                      



     Bei der ersten Ausführungsform wird in den jeweils abgespeicherten  Wörtern für jeden Eingangskanal nur ein einziges Bit benötigt; die  verbleibenden Bits jedes Wortes stehen für die Darstellung des Zeitabstands  zur letzten Abspeicherung zur Verfügung. Bei zwei Eingangskanälen  und Abspeicherung als 16-Bit- Wörter ergeben sich damit 14 Bit für  die Darstellung des Zeitabstandes. Diese Ausführungsform ermöglicht  eine optimal effiziente Ausnutzung des Speicherplatzes bei Signalfolgen,  die gemessen an der Dauer eines einzelnen Abtastzyklus nur sehr wenige  Ereignisse aufweisen, so dass in den meisten Fällen eine Abspeicherung  aufgrund eines Überlaufs des Zählers erfolgt. Bei ereignisreichen  Signalfolgen, bei denen in jedem Abtastzyklus ein Ereignis auftritt,  wird jedoch die abzuspeichernde Datenrate sehr hoch. 



   Bei der zweiten Ausführungsform wird in jedem abgespeicherten Wort  für jeden Eingangskanal eine Anzahl an Bits benötigt, die der Anzahl  der vorgegeben Abtastzyklen entspricht, über die die Kanalzustände  mit abgespeichert werden, zuzüglich einem weiteren Bit für den Zustand,  in dem die Abspeicherung auslösenden Abtastzyklus. Bei zwei Eingangskanälen,  einer Abspeicherung über jeweils drei dem ersten eintretenden Ereignis  oder dem Zählerüberlauf nachfolgende Abtastzyklen und einer Abspeicherung  als 16-Bit-Wörter werden demzufolge 8 Bit für die Speicherung der  Zustände der Eingangskanäle benötigt, so dass nur noch 8 Bit für  die Speicherung des Zeitabstands zur letzten vorhergehenden Abspeicherung  zur Verfügung stehen.

   Bei Signalfolgen, die nur sehr selten Ereignisse  aufweisen und demzufolge in den meisten Fällen die Abspeicherung  durch einen Überlauf des Zählers ausgelöst wird, ist die Abspeicherung  gegenüber der ersten Ausführungsform ineffizienter, da für den Zähler  nur eine geringere Anzahl an Bits zur Verfügung steht und es entsprechend  häufiger zu einem Zählerüberlauf kommt. Dieser Nachteil ist jedoch  nicht sehr störend, da bei Signalfolgen mit selten auftretenden Ereignissen  der insgesamt benötigte Speicherbedarf gering und deshalb unkritisch  ist. Gegenüber der ersten Ausführungsform ist hingegen bei der zweiten  Ausführungsform der bei Signalfolgen mit häufig auftretenden Ereignissen  benötigte Speicherplatz, und damit auch der maximal benötigte Speicherplatz,  deutlich reduziert.

   So ergibt sich bei dem obigen Zahlenbeispiel  und einer Abtast-rate von 20 MHz bei der zweiten Ausführungsform  eine maximale Speicherrate - wenn in jedem Abtastzyklus ein Ereignis  auftritt - von 10 Mbyte/s und ein minimaler    Speicherbedarf - wenn  kein Ereignis auftritt und die Abspeicherung demzufolge stets durch  den Zählerüberlauf ausgelöst wird - von 155 kbyte/s. Im Gegensatz  dazu beträgt die maximale Datenrate bei der ersten Ausführungsform  bei gleicher Abtastfrequenz 20 Mbyte/s. 



   Die entsprechend der Erfindung aufgezeichneten Daten können nachfolgend  ausgelesen und/oder bearbeitet werden. Ausserdem können die aufgezeichneten  Daten auch einer Korrelationsauswertung unterzogen werden, wobei  entweder die Daten jedes einzelnen Eingangskanals mit sich selbst  korreliert werden (Autokorrelation) oder die Daten zweier Eingangskanäle  miteinander korreliert werden (Kreuzkorrelation). Die abgespeicherten  Daten liegen dabei bereits in einer für einen linearen Korrelationsalgorithmus,  bei dem die Korrelationsfunktion aus dem Histogramm der zeitlichen  Impulsabstände verlustfrei, d.h. ohne jeglichen Informationsverlust,  berechnet wird, geeigneten Form vor. 



   Besonders vorteilhaft ist jedoch die kombinierte Anwendung zweier  verschiedener Korrelationsalgorithmen von denen der eine, der lineare  Algorithmus, für kurze Korrelationszeiten und der zweite, das Multiple-Tau-Verfahren,  für längere Korrelationszeiten angewendet wird. Die Grenze zwischen  beiden Verfahren, d.h. die Korrelationszeit, die die Grenze zwischen  den beiden Algorithmen darstellt, ist dabei bei softwaremässiger  Implementierung vom Benutzer wählbar. Der lineare Algorithmus arbeitet  verlustfrei und benötigt bei kurzen Korrelationszeiten geringere  Rechenkapazitäten als das Multiple-Tau-Verfahren; dabei steigt die  erforderliche Rechenkapazität linear mit der Korrelationszeit an.  Die für das Multiple-Tau-Verfahren benötigten Rechenkapazitäten sind  dem hingegen begrenzt und nahezu unabhängig von der Korrelationszeit.

    Die Grenze zwischen den beiden Verfahren wird deshalb sinnvoll bei  solchen Korrelationszeiten angesetzt, bei denen die erforderlichen  Rechenkapazitäten beider Algorithmen einander entsprechen. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist insbesondere zur Datenaufzeichnung  in der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, in der Fluoreszenzsignale  aus mikroskopisch kleinen Volumina aufgezeichnet und durch Korrelationsberechnungen  ausgewertet werden,    bestens geeignet. Entsprechend findet die  Erfindung auch vorzugsweise in Verbindung mit konfokalen Mikroskopen  Anwendung. 



   Nachfolgend werden Einzelheiten der Erfindung anhand der Zeichnungen  näher erläutert. Im Einzelnen zeigen:      Fig. 1: ein Blockschaltbild  für eine Datenaufzeichnungseinrichtung für das erfindungsgemässe  Verfahren;     Fig. 2: eine Prinzipskizze eines konfokalen Mikroskopes  mit Zweikanal-Fluoreszenzdetektion.  



   In der Fig. 1 sind die mehreren Eingangskanäle mit Kanal 1, Kanal  2... Kanal n bezeichnet. Die eingehenden Signale sind binäre Impulssignale,  die jeweils aus einer Folge von "0" und "1" bestehen, wobei eine  "1" ein aufgetretenes Ereignis darstellt. Soweit die Eingangssignale  analog sind, sind sie vor der Datenaufzeichnung in binäre Signale  zu transformieren. 



   Ein Takt-Oszillator (1) gibt die Abtastfrequenz für die Datenaufzeichnung  in einer Einheit (2) vor. Die Abtastfrequenz ist dabei so gewählt,  dass in einem Abtastzyklus, also innerhalb der Zeitdauer eines Taktes  des Oszillators (1) höchstens ein einziges Ereignis in jedem der  Eingangskanäle zu erwarten ist. Die Anzahl der vom Takt-Oszillator  vorgegebenen Takte wird von einem Zähler (3) mit M-Bit-Datenbreite  gezählt. Wenn die Abtastung der Eingangssignale in der Einheit (2)  ein Ereignis - also eine binäre "1" - in einem der n Kanäle feststellt  bevor ein Überlauf des Zählers (3) stattfindet, wird eine Speicherung  der Kanalzustände und des Zählerstandes des Zählers (3) in einem  Speicher (4) ausgelöst. Gleichzeitig wird der Zähler wieder auf Null  zurückgesetzt.

   Wird hingegen bis zum Erreichen des Überlaufs des  Zählers (3) kein Ereignis in einem der Eingangskanäle festgestellt,  so werden ebenfalls die Zustände der Eingangskanäle und der Zählerstand  abgespeichert und nachfolgend der Zähler (3) auf Null zurückgesetzt.  Die Speicherung eines Datensatzes wird also jeweils ausgelöst, wenn  entweder ein Ereignis in einem der Eingangskanäle eintritt oder ein  Zählerüberlauf stattfindet, je nachdem, welches dieser Ereignisse  zuerst auftritt. 



     Der Speicher (4) bzw. jedes im Speicher (4) gespeicherte Wort  besteht aus zwei Teilbereichen (4a) und (4b). In einem Teilbereich  (4b) von M Bit wird der Stand des Zählers (3) und damit ein Mass  für die seit der letzten Speicherung vergangene Zeit gespeichert.  Im anderen Teilbereich (4a) werden die Zustände der Eingangskanäle  binär abgespeichert. Beide Teilbereiche gemeinsam ergeben jeweils  im Hexadezimalsystem ein abgespeichertes Wort, das die Information  über die Zustände aller Eingangskanäle und der seit der letzten Speicherung  vergangenen Zeit enthält. In der Folge der abgespeicherten Wörter  ist demzufolge die vollständige Information über die zeitlichen Signalfolgen  aller Eingangskanäle mit der durch die Taktfrequenz gegebenen Zeitauflösung  enthalten. 



   Im ersten Ausführungsbeispiel ist L=1, d.h. für die Kennzeichnung  jedes Eingangskanals wird 1 Bit benötigt. Die verbleibenden Bits  stehen demzufolge für die Charakterisierung des Zeitabstandes seit  der letzten Speicherung, also für den Stand des Zählers (3) bei Auslösung  der Speicherung zur Verfügung. 



   Beim zweiten Ausführungsbeispiel ist L ungleich und grösser als eins.  In diesem Fall werden für die Kennzeichnung der Zustände jedes Eingangskanals  L Bit benötigt. Entsprechend werden bei jeder Abspeicherung die Zustände  jedes der Eingangskanäle über L Abtastzyklen aufgezeichnet und gespeichert.  Bei L=4 werden beispielsweise die Zustände der Eingangskanäle in  dem Abtastzyklus bt1, in dem das erste detektierte Ereignis auftritt,  und in den drei unmittelbar darauffolgenden Abtastzyklen bt2, bt3  und bt4 gespeichert. Für jeden Eingangskanal geben dann die L Bits  an, ob und in welchem Abtastzyklus ein Ereignis stattgefunden hat.

    Die Zuordnung in einem 16-Bit-Wort bei zwei Eingangskanälen kann  beispielsweise folgendermassen aussehen: Bits 1-7: Abtastzyklen,  die seit der letzten Speicherung vergangen sind Bit 8: =1, wenn  Ereignis im Kanal 1 im Zyklus bt1 stattgefunden hat, sonst = 0  Bit 9: =1, wenn Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt1 stattgefunden hat,  sonst = 0 Bit 10: =1, wenn Ereignis im Kanal 1 im Zyklus bt2 stattgefunden  hat, sonst = 0 Bit 11: =1, wenn Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt2  stattgefunden hat, sonst = 0 Bit 12: =1, wenn Ereignis im Kanal  1 im Zyklus bt3 stattgefunden hat, sonst = 0    Bit 13: =1, wenn  Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt3 stattgefunden hat, sonst = 0  Bit 14: =1, wenn Ereignis im Kanal 1 im Zyklus bt4 stattgefunden  hat, sonst = 0 Bit 15: =1, wenn Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt4  stattgefunden hat, sonst = 0. 



   Die Speicherung eines Wortes erfolgt dann jeweils L-1-Abtastzyklen,  nachdem das erste Ereignis in einem der Eingangskanäle stattgefunden  hat oder nachdem der Zähler seinen Überlauf erreicht hat. Bei Speicherung  in 16-Bit-Wörtern ergibt sich damit folgende beispielhafte Kodierung,  wobei die Low-Bytes die seit der Abspeicherung vergangene Zeit und  die High-Bytes die Kanalzustände angeben: 



    <tb><TABLE> Columns = 2  <tb><SEP> Wort (hex):<SEP> Signalfolge: <tb><SEP>  197B<SEP> Low Byte: 7B (hex) = 123 (dec); high Byte 19 (hex) = 00011001  (bin) In den Abtastzyklen 124 (bt1) und 126 (bt3) wurde ein Ereignis  im Kanal 1 und im Abtastzyklus 125 (bt2) ein Ereignis im Kanal 2  detektiert. <tb><SEP> 00FF<SEP> Low Byte: FF (hex) = 255 (dec);  high Byte 00 (hex) = 00000000 (bin) Die Datenspeicherung erfolgte  nach Zählerüberlauf, also nachdem der Zähler seine Maximalzahl von  255 erreicht hatte, in den nachfolgenden vier Abtastzyklen 256 bis  259 (bt1-bt4) ist in keinem Eingangskanal ein Ereignis aufgetreten. <tb><SEP>  18FF<SEP> Low Byte:

   FF (hex)= 255 (dec); high Byte 18 (hex) = 00011000  (bin) Die Datenspeicherung erfolgte nach Zählerüberlauf, also nachdem  der Zähler seine Maximalzahl von 255 erreicht hatte, im Abtastzyklus  257 (bt2) ist im Kanal 1 und im Abtastzyklus 258 (bt3) im Kanal 2  ein Ereignis aufgetreten. <tb><SEP> 117B<SEP> Low Byte: 7B (hex)  = 123 (dec); high Byte 11 (hex) = 00010001 (bin) In den Abtastzyklen  124 (bt1) und 126 (bt3) ist im Kanal 1 ein Ereignis aufgetreten,  im Kanal 2 sind keine Ereignisse aufgetreten.  <tb></TABLE> 



   



   Die beispielhaft angegebenen Kodierungen veranschaulichen, dass bei  der zweiten Ausführungsform im Fall, dass bis zum Zählerüberlauf  kein Ereignis in einem der Kanäle auftritt, die Speicherung erst  L Abtastzyklen nach Zählerüberlauf erfolgt, ohne dass die vollständige  Signalaufzeichnung verloren geht. Dieses wird dadurch erreicht, dass  die für die    Charakterisierung der Kanalzustände vorgesehenen Bits  auch Information über den Abtastzyklus enthalten, in dem ein Ereignis  auftritt. 



   Die kodierten und abgespeicherten Wörter werden in einem Massenspeicher  (5) abgelegt und können anschliessend über ein PCI-Interface (6)  gelesen und in einem Schritt (7) aufbereitet werden. Bei der Datenaufbereitung  können charakteristische Fehlstellen oder durch Ausbleichen der Farbstoffe  aufgetretene Störungen, die bei der nachfolgenden Auswertung zu fehlerhaften  Ergebnissen führen würden, eliminiert werden. Ausserdem kann bei  der Datenaufbereitung eine Grenz-Korrelationszeit für die anzuwendenden  Korrelationsalgorithmen angegeben werden. 



   Die nachfolgende Berechnung der zeitlichen Korrelationsfunktionen  der Eingangskanäle erfolgt nach zwei verschiedenen Algorithmen. Für  Korrelationszeiten, die kürzer als die gewählte Grenz-Korrelationszeit  sind, wird ein linearer Algorithmus angewendet, der die Korrelationsfunktion  aus den Histogrammen der zeitlichen Impulsabstände der aufgezeichneten  Signalfolgen bestimmt. 



   Bei der Autokorrelation, also der getrennten Auswertung der Kanäle,  werden sämtliche möglichen Impulsabstände ermittelt. Dabei kann wie  folgt vorgegangen werden: 



   Ist tk der zeitliche Abstand zwischen dem k-ten Impuls und dem k+1-ten  Impuls (für k = 1, 2, ...N). Das Histogramm H(t) der zeitlichen Impulsabstände  ergibt sich dann aus der Definition: H(t) = 0 H(t) = H++, wenn  t = = t1 H(t) = H++, wenn t = = t1 +t2  H(t) = H++, wenn t =  = t1 + t2 + t3  H(t) = H++, wenn t = = t1 + t2 + t3 + ...  ...  H(t) = H++, wenn t = = t2  H(t) = H++, wenn t = = t2 + t3  H(t)  = H++, wenn t = = t2 + t3 + ...  ...    H(t) = H++, wenn t =  = tk  H(t) = H++, wenn t = = tk + t(k + 1)  H(t) = H++, wenn  t = = tk + t(k + 1) + t(k + 2)  H(t) = H++, wenn t = = tk + t(k  + 1) + t(k + 2) +... 



   Für binäre Impulsfolgen und unter der Voraussetzung, dass nach einem  bestimmten Impuls keine weiteren Impulse nachfolgen und in jedem  Abtastzyklus maximal ein Impuls auftritt, ist die Autokorrelationsfunktion  A (t) = H(t) gleich dem Histogramm der Impulsabstände. 



   Im Falle der Kreuzkorrelation werden zwei Impulsfolgen n, m miteinander  korreliert. Ist k1 die Nummer des ersten Impulses der Impulsfolge  m, der dem 1-ten Impuls der Impulsfolge n nachfolgt, und ist di1  der zeitliche Impulsabstand zwischen dem 1-ten Impuls und dem 1+1-sten  Impuls der Impulsfolge m sowie dj1 der zeitliche Impulsabstand zwischen  dem 1-ten Impuls und dem 1+1-sten Impuls der Impulsfolge n, wobei  i, j= 1, 2, ....N das betreffende Zeitintervall kennzeichnen, wird  analog zur Definition eines Histogrammes für die zeitlichen Impulsabstände  einer einzelnen Impulsfolge ein Histogramm K für die Zeitabstände  zwischen den Impulsen der beiden Impulsfolgen n, m definiert: K(t)  = 0 K(t) = K++, wenn t = = k1 - i1  K(t) = K++, wenn t = = k1 -  i1 +djk1  K(t) = K++, wenn t = = k1 - i1 + djk1 + djk2  K(t)  = K++, wenn t = = k1 - i1 + djk1 + djk2 + ... ...

   K(t) = K++,  wenn t = = k2 - i2  K(t) = K++, wenn t = = k2 - i2 + djk2  K(t)  = K++, wenn t = = k2 - i2 + djk2 + djk3  K(t) = K++, wenn t = =  k2 - i2 + djk2 + djk3 +...  ... K(t) = K++, wenn t = = k1 - i1  K(t) = K++, wenn t = = k1 - i1 + djk1  K(t) = K++, wenn t =  = k1 - i1 + djk(1 + 1)  K(t) = K++, wenn t = = k1 - i1 + djk1 +  djk(1 + 1) +... ... 



     Es lässt sich zeigen, dass für binäre Impulsfolgen die Kreuzkorrelation  der beiden Impulsfolgen n, m dem oben definierten Histogramm entspricht.                                                       



   Der beschriebene lineare Algorithmus, bei dem die Autokorrelation  und die Kreuzkorrelation anhand der Histogramme der Impulsabstände  ermittelt wird und demzufolge bei kleinen Korrelationszeiten nur  geringen Rechenaufwand erfordert, wird nur für Korrelationszeiten  unterhalb des eingegebenen Grenzwertes angewendet. Für grössere Korrelationszeiten  wird in einem Schritt 8 in Fig. 1 die Autokorrelation und/oder die  Kreuzkorrelation nach dem Multiple-Tau-Verfahren durchgeführt. Hinsichtlich  der hierbei angewendeten Algorithmen sei auf die Produktinformationen  der Firma ALV-Laser Vertriebsgesellschaft m.b.H. Langen, FRG, zum  ALV-5000 Digital Multiple Tau Correlator, insbesondere auf die Schrift  "Introduction to the Multiple Tau Correlation Technique" von Rainer  Perters, verwiesen.

   Die Ergebnisse beider Algorithmen werden nachfolgend  in einem Schritt 10 zu einem Zusammengesetzten Diagramm vereinigt  und dargestellt. 



   Die erfindungsgemässen Verfahren finden bevorzugt Anwendung in der  konfokalen Mikroskopie, bei dem der von einem oder mehreren Lasern  (11) emittierte Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv (13) hoher  numerischer Apertur in eine Probe (12) fokussiert wird. Das Anregungsvolumen  in der Probe (12) beträgt dabei nur wenige Femtoliter. Die in der  Probe (12) erzeugte Fluoreszenzstrahlung wird vom Objektiv (13) wieder  aufgesammelt, mittels eines Farbteilers (15) vom Anregungslicht getrennt  und nachfolgend mittels eines zweiten Farbteilers (14) zwei separaten  Detektionkanälen zugeführt. In jedem der beiden Detektionskanäle  ist eine konfokale Blende (16, 17) vorgesehen, die beide in einer  zur Fokus-ebene des Objektivs (13) konjugierten Ebene angeordnet  sind.

   Nach Transmission durch die konfokalen Blenden wird das in  jedem Detektionskanal enthaltene Lichtsignal von hochempfindlichen  Detektoren, die zum Nachweis einzelner Photonen ausgelegt sind, detektiert.  Die konfokalen Blenden stellen dabei sicher, dass auch das Volumen  in der Probe, aus dem Fluoreszenzstrahlung detektiert wird, die geringe  Grösse des Anregungsvolumens aufweist. Aufgrund des sehr kleinen  Anregungs- und Detektionsvolumens treten in beiden Detektionskanälen  Impulssignale auf, die im Wesentlichen aus einzelnen Impulsen mit  längeren Impulsabständen bestehen.

Claims (9)

1. Verfahren zur Aufzeichnung von Impulssignalen mehrerer, mindestens zweier Eingangskanäle, wobei die mehreren Eingangskanäle mit vorgegebener Abtastfrequenz auf aufgetretene Ereignisse abgetastet werden und nach Detektion eines Ereignisses in mindestens einem der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines Zählers der aktuelle Zustand aller Eingangskanäle in einem Speicherregister zusammen mit einer den Zeitabstand zur letzten Abspeicherung charakterisierenden Grösse abgespeichert werden.

2.

Verfahren zur Aufzeichnung von Impulssignalen mehrerer, mindestens zweier Eingangskanäle, wobei die mehreren Eingangskanäle mit vorgegebener Abtastfrequenz auf aufgetretene Ereignisse abgetastet werden und nach Detektion eines Ereignisses in mindestens einem der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines Zählers die Zustände aller Eingangskanäle im Abtastzyklus, in dem das Ereignis stattgefunden hat und für eine vorgegebene Anzahl an Abtastzyklen nach Eintritt des ersten Ereignisses zusammen mit einer den Zeitabstand zur letzten vorhergehenden Speicherung charakterisierenden Grösse abgespeichert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Daten der Eingangskanäle binär sind.

4.

Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Abspeicherung als Wörter mit mindestens 16Bit erfolgt und wobei die vorgegebene Anzahl an Abtastzyklen bei zwei Eingangskanälen mindestens zwei, vorzugsweise drei ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die abgespeicherten Daten einer Korrelationsauswertung unterzogen werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Kreuzkorrelation der Daten zweier Eingangskanäle berechnet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei eine Korrelationsgrenze wählbar ist und wobei für Korrelationszeiten, die kleiner als die Korrelationsgrenze sind, die Berechnung der Korrelation verlustfrei anhand der Histogramme der Impulsabstände erfolgt.

8.

Einrichtung zur Aufzeichnung von Impulssignalen mehrerer Eingangskanäle nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei ein Takt-Oszillator (1), eine Einrichtung (2) zum Abtasten der mehreren Eingangskanäle, ein Zähler (3) und ein Speicher (4) vorgesehen sind, und wobei der Nachweis eines ersten Ereignisses in einem der Eingangskanäle oder der Überlauf des Zählers (3), je nachdem, welches Ereignis zuerst eintritt, eine Abspeicherung der Zustände aller Eingangskanäle und des letzten Zählerstandes bei Eintritt des Ereignisses auslöst.

9. Konfokales Mikroskop mit mindestens zwei konfokalen Detektionskanälen für den getrennten Nachweis von Licht bei zwei verschiedenen Wellenlängen und mit einer Einrichtung zur Aufzeichnung von Impulssignalen nach Anspruch 8.