CH662062A5 - Verfahren und vorrichtung zur trennung einer oder mehrerer in loesung befindlicher verbindungen mit hilfe einer dynamischen saeulen-fluessigkeitschromatographie. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von einer oder mehrerer Verbindungen, die in Lösung vorliegen, unter Anwendung einer im folgenden als dynamische Säu-len-Flüssigkeitschromatographie (DCLC) bezeichneten 45 Chromatographietechnik sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Mit Chromatographie werden bekanntlich eine Mehrzahl physikalischer Methoden bezeichnet, die in der Chemie und Biologie zur Trennung und Identifizierung von Gemi-50 sehen chemischer Verbindungen dienen. Das Prinzip aller dieser Chromatographieverfahren besteht darin, ein Gemisch von chemischen Verbindungen wiederholten Extraktionen mit einer Flüssigkeit oder der Adsorption an einer Feststoffoberfläche zu unterwerfen. Das Gemisch wird dabei 55 über eine stationäre Phase (Bett oder Säule) bewegt, bei der es sich entweder um einen Feststoff oder um eine in den Poren eines Feststoffes, der sich in diesem Bett oder dieser Säule befindet, aufgenommene Flüssigkeit handelt. Die Trennung chemischer Verbindungen durch Chromatographie 60 kann von einer oder mehreren der folgenden physikalischchemischen Eigenschaften in Abhängigkeit vom speziellen chromatographischen System Gebrauch machen:

(a) von Unterschieden in der Adsorption an das poröse Medium, dem sogenannten Sorbens,

65 (b) von Unterschieden zwischen den relativen Löslichkeiten einer das inerte Medium (die stationäre Phase) überziehenden Flüssigkeit und der als mobile Phase bezeichneten Flüssigkeit, die durch die poröse Säule perkoliert,

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(c) von Unterschieden im Ionenaustausch mit dem Sorbens und

(d) von Unterschieden in der Molekülgrösse, wenn die Lösung ein Gel von sehr geringer Teilchengrösse durchströmt.

Chromatographie wird auch präparative Chromatographie genannt, wenn sie zur Isolierung einer Fraktion aus einem Gemisch dient zu deren Weiterverwendung für zum Beispiel Spektroskopie, Identifizierung, Synthese für Forschung oder kommerzielle Zwecke.

Die Originalarbeit über Chromatographie basiert auf Unterschieden in der Adsorption an einem in eine Säule gepackten inerten Material. Die als Verteilungschromatographie bekannte Trennung von Komponenten basiert auf den relativen Löslichkeiten in dem Lösungsmittel, das durch eine Säule geschickt wird. Die bei dieser Chromatographietechnik erhaltene Auflösung hängt vom pH-Wert und der Ionenstärke des Lösungsmittels (der mobilen Phase) und den relativen Löslichkeiten der Bestandteile in den beiden Phasen ab; die verschiedenen Materialien können mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert und die Flüssigkeitsfraktionen können in einer Reihe von Röhrchen gesammelt und anschliessend mit Hilfe von chemischen oder physikalischen Methoden analysiert werden. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) und die Papierchromatographie basieren auf Unterschieden zwischen der relativen Adsorption einer Komponente an einem inerten Medium. Bei der TLC besteht die stationäre Phase aus einer dünnen Schicht einer fein verteilten Substanz, die auf ein Blatt oder einen Kunststoffträger oder auf eine Glasplatte aufgebracht ist. Sorbentien, die üblicherweise Verwendung finden und als gebrauchsfertige Platten gehandelt werden, sind zum Beispiel Aluminiumoxid, Kieselgel (Silicagel) und Cellulose. Bei der Papierchromatographie kann sich die mobile Phase durch Kapillarkräfte nach oben (sogenannte aufsteigende Chromatographie) oder durch Schwerkraft nach unten (sogenannte absteigende Chromatographie) bewegen.

Die Ionenaustauschchromatographie macht von der Trennung von Molekülen aufgrund ihrer Ionenladung Gebrauch. Das Sorbens oder die stationäre Phase besteht aus einem Polymer mit kovalent gebundenen Ionen. In Kationenaustauscherharzen sind die fest gebundenen Ionen negativ geladen und mit positiven Ionen, die durch elektrostatische Ladungen lose gebunden sind, assoziiert. Die zu trennenden positiv geladenen Substanzen aus einem Gemisch werden zuerst an das Sorbens adsorbiert unter Ersatz der in dem Harz vorliegenden Kationen. Die Lösung ist auf einen pH-Wert gepuffert, der die Bindung erleichtert, worauf mit dem gleichen Puffer eluiert wird zur Entfernung der nichtgebundenen Fraktionen der Lösung. Ein Anionenaustau-scher arbeitet in genau der gleichen Weise, ausser dass seine kovalent gebundenen Ionen entgegengesetzt geladen sind und dadurch die Anionen aus der Lösung anziehen.

Die auf Unterschieden in der Molekülgrösse basierende Trennung erfolgt in der Gelfiltration, die auch als Molekularsiebchromatographie bekannt ist. Diese Methode trennt Moleküle aufgrund ihrer Partikelgrösse, wobei allerdings die Form des Moleküls die Filtration bis zu einem gewissen Grad beeinflusst. Die verwendeten Gele liegen in Form von Kügelchen vor, welche ein Netzwerk von Porenöffnungen aufweisen, in denen kleine Moleküle eingeschlossen werden können. Das weitgehende kommerzielle Interesse an Chromatographie im allgemeinen und an der präparativen Flüssigkeitschromatographie im besonderen äussert sich in der grossen Zahl an Publikationen, die verschiedene mikrofein-teilige Säulenpackungen und fertig gepackte Säulen vorschlagen, die zu einer besseren Trennung führen sollen als die auf diesem Gebiet bekannten Adsorbentien.

Es wurden nun die Forschungsarbeiten auf die Entwicklung eines neuen Konzepts für die Chromatographie gerichtet, bei der bekannte Adsorbentien zur Anwendung gelangen, wobei jedoch die Trennung sehr schnell erfolgt und leichter als mit den bekannten Techniken durchführbar ist. Das neue Konzept der Chromatographie gemäss vorliegender Erfindung basiert auf dem Einsatz einer sogenannten dynamischen Säule, bei dem das Bett mit dem Adsorbens bewegt wird im Gegensatz zu der konventionellen Chromatographietechnik, bei der das Adsorbentienmaterial stationär ist.

Die Erfindung schafft somit ein Verfahren für einen neuen Typ von Chromatographietechnik, die als dynamische Säulen-Flüssigkeitschromatographie (DCLC) bezeichnet wird und zur Trennung von einer oder mehreren in Lösung befindlichen Verbindungen dient, wie dies in den Patentansprüchen angegeben ist.

Offensichtlich findet besonders häufig der Einsatz eines Feststoffadsorbens in Form einer Säule oder eines Betts als Adsorbentienzone Anwendung und in diesem Falle erweist sich das erfindungsgemässe Verfahren besonders vorteilhaft im Vergleich zu üblichen Chromatographietechniken. Das erfindungsgemässe Verfahren zeichnet sich durch grosse Genauigkeit aus und hat die folgenden Hauptvorteile gegenüber bekannten chromatographischen Verfahren:

(a) Im Gegensatz zum durch Schwerkraft bewirkten Elu-tionsmittelfluss, wie er in der konventionellen Chromatographie vorliegt, wird in der dynamischen Säulen-Flüssig-keitschromatographie im Adsorbentienbett ein gewisser innerer Druck ausgeübt, der zu einer besseren Auflösung bei der Trennung der Komponenten führt.

(b) Das Verfahren ist sehr schnell, was auch auf den inneren Druck zurückzuführen ist, der in dem System ausgeübt wird.

(c) Das Verfahren erfordert weniger Elutionsmittel als in der konventionellen Chromatographie.

(d) Das Vorliegen des inneren Drucks im dynamischen Chromatographiesystem ermöglicht den Einsatz eines Adsorbens mit kleinerer Partikelgrösse als in der konventionellen Chromatographie, was eine höhere Empfindlichkeit zur Folge hat.

Der zum Einsatz gelangende Mehrweghahn ist sehr wichtig, wenn verschiedene aufeinanderfolgende Elutionsmittel in das Testrohr eingeführt und weiter durch das Adsorbentienbett zur Erzielung der gewünschten Fraktionierung geleitet werden müssen. Wird das Adsorbentienbett hauptsächlich zur Vorbehandlung einer Probe oder zur Entfernung von einer Verbindung verwendet, so ist der Einsatz eines derartigen Hahns nicht erforderlich und es kann ein einfaches, am Boden geschlossenes Testrohr, das zum Kolben passt, verwendet werden. In diesem Fall muss das Elutionsmittel in das Testrohr eingebracht werden, bevor der Kolben nach unten geschoben wird. Offensichtlich ist jedoch selbst dann, wenn keine Fraktionierung erforderlich ist, ein Testrohr mit einem Hahn vorteilhafter anzuwenden im Hinblick auf das Waschen des Adsorbens und die Einführung des Elutions-mittels durch Ansaugung desselben durch den Hahn.

Das Abdichtelement gleitet längs den Innenwänden des Testrohrs, wobei es sich in einem guten Kontakt mit diesen Innenwänden befindet und ein bündiges Einpassen des Kolbens in das Testrohr sicherstellt. Das Abdichtelement besteht in der Regel aus Kautschuk oder einem anderen geeigneten Material in Form eines O-Rings mit einer Öffnungsweite. die zum Gleiten längs der Innenwände des Testrohrs geeignet ist. Besteht die erfindungsgemässe Vorrichtung aus Glas, so kann der Schliff der Aussenwand des Kolbens in solcher Weise erfolgen, dass er den O-Ring ersetzen kann.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist sehr flexibel und

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kann in einer grossen Anzahl von Anwendungen mit verschiedenen Ausführungsformen zum Einsatz gelangen, was im Rahmen des Konzepts der vorliegenden Erfindung liegt. Ein Problem, das in jeder Art von Chromatographie existiert. ist das gleichmässige Aufbringen der Probe auf die Oberfläche des Adsorbensbetts. Wird die Probe direkt durch Schwerkraftfluss aufgebracht, so ist eine gleichmässige Aufbringung relativ schwierig, da das Bett dazu tendiert, beim Einbringen der Probe aufgewirbelt zu werden. Es ist daher besonders wichtig, die Oberfläche zu schützen, zum Beispiel mit einem Stück von Rayon-Filterpapier. Ein Hersteller von Säulen (Pharmacia Fine Chemicals AB) stattet einige der Säulen mit einer speziellen, Probeapplikator genannten Einrichtung aus, die zum Schutz der Bettoberfläche dient. Bei dieser Einrichtung ist ein dünnes Nylongewebe am Ende eines kurzen Stücks von Perspex-Rohrauskleidung innerhalb des Chromatographierohrs montiert. Eine derartige Einrichtung erhöht selbstverständlich die Ausstattungskosten und hat zusätzlich den Nachteil, dass ihr Vorliegen einen Druck auf den Fluss der Probe ausübt und deren Perkulation durch die Säule verlangsamt. In den meisten Chromatographiesystemen, in denen das erfindungsgemässe Verfahren zur Anwendung gelangt, ist das Problem einer gleichförmigen Aufbringung der Probe stark erleichtert. Bei dem im chromati-graphischen Bett existierenden dynamischen Fluss wird die Flüssigkeit beim Einschieben des Kolbens in das Testrohr nach oben gedrückt und es besteht keine Tendenz zur Wirbelbildung aufgrund der Einführung der Probe. Ausserdem beschleunigt der in dem System beim Einschieben des Kolbens in das Testrohr ausgeübte Druck die Fliessgeschwindigkeit der Probe. Ein weiterer Weg zur Unterstützung einer gleichmässigen Aufbringung der Probe besteht darin, oberhalb des Betts ein anderes geeignetes Adsorbens, das von dem im Bett bereits vorliegenden Adsorbens verschieden ist, anzuordnen, das die Aufgabe hat, eine Vorkonzentration der Probe zu bewirken und damit eine enge Bandauflösung zu fördern. Ein typisches Beispiel für ein derartiges geeignetes Adsorbens ist rohes Siliciumdioxid, das sich vom aktiven Si-liciumdioxid mit dessen hohen Adsorptionseigenschaften unterscheidet.

Die Partikelgrösse und die Teilchengrössenverteilung muss in den meisten üblichen Chromatographieoperationen sorgfältig gesteuert werden. Ein aus kleinen Partikeln bestehendes Bett ergibt in der Regel eine gute Auflösung. Der Grund hierfür ist darin zu sehen, dass der zu einer Zonenverbreiterung führende Mechanismus bei der Zunahme der Partikelgrösse verstärkt wird. Bei grossen Partikeln dauert die Diffusion in die Partikel und aus diesen heraus eine längere Zeit. Das Fliessdiagramm in einem Bett aus grossen Partikeln ist schlechter und äussert sich in einer stärkeren Wiedervermischung. Andererseits ist der Widerstand gegenüber dem Flüssigkeitsfluss in einem mit grossen Partikeln gepackten Bett geringer und die maximal erzielbare Fliessrate höher. In üblichen bekannten Chromatographieoperationen muss daher in bezug auf Partikelgrösse ein Kompromiss gefunden werden, um unter den erforderlichen Fliessbedingungen eine maximale Zonenauflösung zu erzielen. Demgegenüber ist in der erfindungsgemässen DCLC-Chromatogra-phietechnik ein Adsorbens mit kleiner Partikelgrösse verwendbar ohne mit den Nachteilen, wie sie bei den bekannten Chromatographiemethoden auftreten, konfrontiert zu sein, da der geringe Druck, der im Innern des Systems ausgeübt wird, den durch die kleine Teilchengrösse der Partikel verursachten Widerstand gegenüber der Fliessgeschwindigkeit überwindet. Das erfindungsgemässe Verfahren kann daher selbst für kritische Fraktionierungen eingesetzt werden, wo die Verwendung eines feineren Adsorbentienmaterials unumgänglich ist, um die gewünschte Auflösung zu erzielen.

In der DE-OS 3 126 926 ist ein Verfahren zur Durchführung von Massentransfer- und -trennoperationen unter Verwendung von selektiven Barrieren beschrieben, das mit Hilfe einer Vorrichtung, die ähnliche Komponenten wie gemäss s vorliegender Erfindung aufweist, realisierbar ist. Wie dort angegeben, besteht diese Vorrichtung aus einem eine Membran aufweisenden Mischerseparator und einem Mischbehälter, in den der Mischerseparator eingeschoben wird. Am Mischerseparator sind Einrichtungen zur Ausbildung einer io Lufttasche vorgesehen, um den auf die Membran ausgeübten Druck zu erniedrigen. Während des Betriebs des Mischerseparators wird eine vorbestimmte Menge an Luft in der Lufttasche eingeschlossen, die bei der Kompression als Polster oder Stossdämpfer wirkt und einen Teil des Drucks 15 aufnimmt, der aus dem Widerstand der Membran gegen die Strömung der Flüssigkeit resultiert. Bei der erfindungsgemässen dynamischen Säulen-Flüssigkeitschromatographie ist das Erfordernis nach einer derartigen Lufttasche weniger zwingend als im angegebenen obigen Fall. Für bestimmte 20 Systeme, bei denen relativ hohe Drücke ausgeübt werden, spielt jedoch offensichtlich eine derartige Lufttasche eine wichtige Rolle, da die eingeschlossene Menge an Luft Flüssigkeit, welche im Zwischenraum zwischen den Innenwänden des Testrohrs und den Aussenwänden des äussersten 25 Endes des Kolbens hochgekrochen ist, in das Testrohr zurückdrückt. Die Menge an Luft, die durch eine derartige Einrichtung am Kolben eingeschlossen wird, hängt von zahlreichen Faktoren ab, zum Beispiel vom Typ der Sperrplatte oder Barriere, den Komponenten des zu trennenden Gemi-30 sches und den besonderen Bedingungen, die in dem speziellen Chromatographisystem auftreten. Ein besonderer Vorteil der Verwendung einer derartigen Lufttasche tritt dann zutage, wenn es erforderlich ist, völlig darauf zu verzichten, das Hochkriechen von Elutionsmittel mit Hilfe eines am Boden 35 des Kolbens angeordneten, als Abdichtelement wirkenden O-Rings zu verhindern.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist auf den verschiedensten Gebieten der Chromatographie mit Erfolg einsetzbar, zum Beispiel bei der Silicagel-Chromatographie, der 40 Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie, der Kapillarchromatographie, der Affinitätschromatographie, der Chromato-Fokussierung, der Ausschlusschromatographie (die auch unter dem Namen Gelfiltration bekannt ist) und der Ionenaustauschchromatographie.

45 Bei der Silicagelchromatographie handelt es sich um eine der üblichsten Chromatographiemethoden. Silicagel (Kieselgel) ist bei weitem das beste bekannte Adsorbens und dazu im Vergleich mit anderen Adsorptionsmaterialien auch noch relativ billig. Die mit Silicagel beim erfindungsgemässen Verso fahren erzielbaren Trennergebnisse sind praktisch die gleichen wie bei üblichen Techniken oder sogar noch besser als diese in bezug auf Trenngenauigkeit und Ausbeute an wiedergewonnener Substanz, wobei es sich aber dadurch auszeichnet, dass es einfacher und bequemer ist, weil es schneller 55 arbeitet und weniger Lösungsmittel erfordert. Als besonderer Vorteil kommt auch hinzu, dass die Säulen wiederverwendbar ist. Zusätzlich können auch noch Silicagelpartikel mit kleinerer Teilchengrösse und dichtere Packungen Anwendung finden mit den daraus resultierenden Vorteilen ei-6ones höheren Trenneffekts.

Die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie beruht darauf, dass deren stationäre Phase weniger polar ist als die mobile Phase. Der Hauptnachteil bei Einsatz von Silicagel beruht darauf, dass nur eine teilweise Wiedergewinnung der 65 durch ein derartiges Bett strömenden Verbindungen gelingt. Im Hinblick auf die mit Hilfe der erfindungsgemässen DCLC-Technik erzielbaren Vorteile kann die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie auch mit Erfolg in der prä-

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parativen Chromatographie eingesetzt werden. In jüngster Zeit stieg auch das Interesse an der Kapillarchromatographie, insbesondere im Hinblick auf die Entwicklung von Mi-krosäulen für Hochleistungs-Flüssigchromatographie. Der Grund für diese Entwicklungen liegt in den folgenden Vorteilen dieses Typs von Chromatographie:

(a) Die potentielle Erzielbarkeit einer grösseren Trenneffizienz für komplexe Gemische und schwer in Lösung zu bringende gelöste Stoffe.

(b) Eine wesentliche Erniedrigung des Verbrauchs an Elutionsmittel.

Das erfindungsgemässe DCLC-Verfahren ist für Kapillarchromatographie leichter einsetzbar, wenn in dem zur Anwendung gelangenden Kolben ein enger Kanal vorgesehen wird.

Die Gelfiltration, die auch als Ausschlusschromatographie bekannt ist, gewinnt mehr und mehr Interesse bei der Reinigung von biologischen Substanzen unter Verwendung eines entsprechenden Adsorbens als Trennmedium. Gute Ergebnisse wurden bei der Trennung von markiertem Jod-hCG von markiertem Jod unter Verwendung eines Adsorbens vom Sephadex G-Typ (Handelsprodukt der Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) mit Hilfe der erfindungsgemässen dynamischen Chromatographietechnik (vergleiche das unten angegebene Beispiel 3) erhalten. Die Gelfiltration hat sich auch als einfache und rasche Methode zur Entsalzung oder zur Änderung von Puffer erwiesen. Das Gelbett wird zweckmässigerweise vor der Versuchsdurchführung mit einer Lösung mit der gewünschten Ionenzusammensetzung ins Gleichgewicht gesetzt, zum Beispiel mit destilliertem Wasser im Fall der Entsalzung. Die Elution wird mit der gleichen Flüssigkeit durchgeführt. Im Hinblick auf die dabei auftretenden hohen Fliessraten kann die gesamte Operation in kurzer Zeit beendet und das entsalzte Material innerhalb weniger Minuten gesammelt werden. Andere Anwendungsgebiete für mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens durchgeführte Gelfiltration sind die Vorbehandlung vor einer HPLC-Operation und die Konzentrierung verdünnter Proben mit anschliessender Trennung.

Die Chromato-Fokussierung findet weite Verbreitung zur Trennung von Proteinen aufgrund ihres isoelektrischen Punktes. Da die Chromato-Fokussierung zu extrem engen Banden an getrenntem Material führt und in der Regel lange enge Säulen erfordert, ist offensichtlich, dass die erfindungsgemässe dynamische Säulen-Flüssigkeitschromatographie für diesen Typ von Chromatographie ideal ist, wenn die erfindungsgemässe Vorrichtung mit einem engen Kolben ausgestattet wird.

Die erfindungsgemässe DCLC erweist sich auch als bequem und zweckmässig für Ionenaustauschchromatogra-phie, bei der es sich bekanntlich um eine der weitverbreite-sten Trenntechniken handelt. Es wurden verschiedene Versuche zur Trennung von Kupfersulfat und Natriumbichro-mat an Dowec 50 WX8 als Adsorbens durchgeführt (vergleiche das unten angegebene Beispiel 2), wobei sich zeigte, dass mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens wesentliche Vorteile in bezug auf Zeitersparnis, Lösungsmittelvolumen und Einfachheit der Durchführung erzielbar sind.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemässen DCLC-Technik liegt in der wesentlichen Verminderung des Totvolumens. Das Totvolumen wird bekanntlich als das Volumen an Flüssigkeit in den Zwischenräumen zwischen den Körnern des Adsorbens im Chromatographiebett definiert. In den meisten üblichen Chromatographieoperationen stellt das Totvolumen ein Problem dar, das die Erzielung eines genauen Ergebnisses wesentlich beeinflusst. Demgegenüber wird bei der erfindungsgemässen DCLC aufgrund der Möglichkeit einer dichten Packung die Gleichgewichtsverteilung der Substanz zwischen dem Adsorbens und der Flüssigkeit sehr rasch mit sehr geringem Totvolumen eingestellt. Demzufolge ist es auch möglich, scharfe und enge Zonen zu erhalten. Dies ist sehr wichtig bei Fraktionierungen, bei denen der Unterschied im Elutionsvolumen zwischen den Substanzen im allgemeinen klein sind. Insbesondere bei der Gelfiltration verschlechtern grosse Totvolumen die erhaltene Auflösung.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Adsorbens in einer Hülse angewandt, die in den Längskanal des Kolbens eingesetzt wird. Auf diese Weise ist die Chromatographie Vorrichtungen für zahlreiche Verwendungszwecke gebrauchsfertig durch einfachen Ersatz der Hülse durch eine andere, die das geeignete Adsorbens enthält (vergleiche die beigefügte Fig. 5). Das erfindungsgemässe Verfahren zeichnet sich durch grosse Einfachheit aus und seine Vielseitigkeit neben den verschiedenen anderen Vorteilen wurde bereits erwähnt. Es gibt zahlreiche Ausführungsformen, die für die zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens dienende Vorrichtung in Frage kommen. Einige dieser Ausführungsformen werden im folgenden anhand der beigefügten Fig. 1 bis 9, welche die Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken, veranschaulicht.

Gemäss Fig. 1 ist das Testrohr R mit einem Luer-Verschluss L ausgestattet, an dem ein Dreiweghahn LV angebracht ist. Das gewünschte Elutionsmittel E wird in das Testrohr R gedrückt. Der Kolben C hat einen Längskanal, in dem das Adsorbens P untergebracht und zwischen zwei am Kopf und Boden des Kolbens befindlichen Membranen Fi, F2 gehalten wird. Oberhalb der oberen Membran F2 ist ein Stopfen S vorgesehen mit einer Ausströmöffnung D, durch welche die getrennte Fraktion vom Adsorbensbett gesammelt wird. Am unteren Teil des Kolbens befindet sich ein O-Ring O, der als Abdichtung dient und so ausgestaltet ist, dass er längs der Innenwände des Testrohrs R gleitet.

In der Ausführungsform gemäss Fig. 2 ist am Boden des Testrohrs R kein Mehrweghahn vorgesehen und eine begrenzte Menge an gewähltem Elutionsmittel E wird zu Beginn in das Testrohr R eingefüllt. Der Kolben C besitzt den Längskanal, in dem das Adsorbens P untergebracht und zwischen den beiden Membranen Fi, F2 gehalten wird. Oberhalb der oberen Membran F2 befindet sich ein Stopfen S. Die Ausströmöffnung D, durch welche die getrennte Fraktion aus dem Adsorbensbett gesammelt wird, ist mit dem Kolben C verbunden. Am unteren Teil des Kolbens befindet sich der O-Ring O als Abdichtelement. Diese Vorrichtung bietet sich an, wenn keine Fraktionierung erforderlich ist und die Operation nur aus einem Zyklus mit einem einzigen Elutionsmittel besteht.

Gemäss Fig. 3 ist das Testrohr R genau so wie in Fig. 2 ohne am Boden angebrachten Hahn. Der Kolben C weist den Längskanal auf, in den das Adsorbens P eingebracht und zwischen den beiden Membranen Fi, F2 gehalten wird. Oberhalb der oberen Membran F2 ist ein Stopfen S vorgesehen mit einer Ausströmöffnung D, durch welche die getrennte Fraktion aus dem Adsorbensbett gesammelt wird. Am Boden des Kolbens befindet sich der O-Ring O als Abdichtelement.

In Fig. 4 wird die einfachste Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung veranschaulicht, die ebenfalls am Boden des Testrohrs R keinen Hahn aufweist und ausserdem am Kopfende des Kolbens keinen Stopfen hat. Eine begrenzte Menge des gewählten Elutionsmittels E wird zu Beginn in das Testrohr R eingeführt. Der Kolben C besitzt einen Längskanal, in dem sich das Adsorbens P befindet, das zwischen den beiden Sperrplatten oder Barrieren Fi, F2, bei denen es sich um Membranen oder Filter handelt, gehalten wird. Der O-Ring O ist am unteren Teil des Kolbens vorge5

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sehen und dient als Abdichtung, wobei er in solcher Weise ausgestaltet ist, dass er längs der Innenwände des Testrohrs R gleitet. Mit dem das Adsorbens P aufnehmenden Kanal ist eine Ausströmeinrichtung D verbunden, durch welche die getrennte Fraktion gesammelt wird.

Fig. 5 veranschaulicht eine Ausführungsform, bei der eine Hülse CA, in der sich das gewünschte Adsorbens P befindet, in den Längskanal I des Kolbens C eingeführt wird. Das Sammeln des Elutionsmittels und der getrennten Fraktionen erfolgt durch eine Ausströmeinrichtung, wie sie im Zusammenhang mit den vorstehenden Figuren beschrieben ist. Der zur Abdichtung dienende O-Ring O ist am unteren Teil des Kolbens C vorgesehen. Die Anwendungs- und Wirkungsweise ist sehr einfach, wie im folgenden auch unter Hinweis auf Fig. 1 erläutert werden soll. Der Kolben C wird nach unten in das Testrohr R geschoben, das mit dem gewählten Elutionsmittel E gefüllt ist. Dies führt dazu, dass das Elutionsmittel durch die untere Membran Fi und danach durch das Adsorbens P gedrückt wird, das sich im Längskanal des Kolbens C befindet, worauf es schliesslich durch die Ausströmeinrichtung D (vergleiche hierzu Fig. 4) heraustropft. Bei Füllung mit einem geeigneten Trägermaterial P wirkt die veranschaulichte Vorrichtung als Chromatographiesäule. Das Nachfüllen des Testrohrs R wird gemäss der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform einfach dadurch bewirkt, dass der Ausfluss des Testrohrs geöffnet und mehr ■ Elutionsmittel durch den Hahn LV gepresst wird.

Fig. 6 veranschaulicht eine Ausführungsform der erfindungsgemässen dynamischen Säulenvorrichtung, bei der der Säulenkolben C nach oben bewegt wird in das Testrohr R und der Ausfluss des Elutionsmittels durch einen vertikalen engen Kanal X in direkter Verlängerung des säulenchroma-tographischen Trägermaterials erfolgt. Fig. 7 stellt eine Modifikation der in Fig. 6 gezeigten Säule dar, wobei ein Lösungsmittel-Vorratsbehälter in Form einer Säule über Y mit der dynamischen Säule verbunden ist.

Aus Fig. 8 ist eine Ausführungsform ersichtlich, bei der der Kolben C der dynamischen Säule aus zwei oder mehr Untereinheiten besteht, von denen jede gleiche oder unterschiedliche Adsorbentien P enthält, wobei es möglich ist, das aus jeder Untereinheit austretende Elutionsmittel zu sammeln.

Fig. 9 veranschaulicht eine weitere Ausführungsform, aus der sich die Vielseitigkeit der erfindungsgemässen DCLC ergibt, deren Anwendungsmöglichkeiten dadurch noch nicht erschöpft sind. Im Fall der dargestellten Ausführungsform wird das austretende Elutionsmittel in eine andere Säule geleitet, welche das gleiche oder ein unterschiedliches Adsorbens P enthält.

Die Fig. 10 bis 12 zeigen die grafische Auswertung von Versuchsergebnissen, die bei der Trennung verschiedener Gemische, wie sie in den unten angegebenen Beispielen 4, 5 und 6 beschrieben werden, erhalten wurden.

Fig. 13 stellt ein Diagramm dar, das bei der grafischen Auswertung einer Affinitätschromatographie zur IgG-Isolie-rung erhalten wurde, wie dies im unten angegebenen Beispiel 9 beschrieben ist.

Im Prinzip kann die erfindungsgemässe dynamische Chromatographie auch für einen Einsatz in der Flüssig-Ionenaustauschchromatographie ins Auge gefasst werden. Flüssige Ionenaustauscher werden als Flüssig-Flüssig-Extraktionssysteme definiert, deren Wirkungsweise, zumindest formell, auf dem Austausch von Ionen an der Grenzfläche zwischen einer wässrigen Lösung und einem nichtmischbaren Lösungsmittel mit vernachlässigbarer Verteilung des Extraktanten in die wässrige Phase besteht. Flüssige Anionenaustauscher finden in der Umkehrphasen-Extraktionschromatographie Anwendung. Bei dieser Technik dient das mit dem flüssigen Anionenaustauscher imprägnierte Trägermaterial (Silicagel, Cellulosepulver, und dergleichen) als die stationäre Phase und eine wässrige Lösung einer Säure oder eines ihrer Salze wird als Elutionsmittel (mobile Phase) verwendet. Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens sollte die Membran so gewählt werden, dass sie nur für das Elutionsmittel, nicht jedoch für den flüssigen Ionenaustauscher permeabel ist, der in dem Längskanal des Kolbens verbleiben sollte.

Die zur Durchführung der DCLC verwendbare erfindungsgemässe Vorrichtung kann aus beliebigem inerten Material hergestellt sein, zum Beispiel aus Glas, Polyethylen oder einem anderen geeigneten Kunststoffmaterial und selbst Metall kommt für einige Spezialzwecke in Frage.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Trennung eines Gemisches aus Ferrocen und Ferrocenaldehyd (a) Packmethode 1,0 g Siliziumdioxid (Merk, Kieselgel H, Typ 60) wurde in 5 ml einer entgasten Lösung von Dichlormethan/Hexan 1:1 im verschlossenen Testrohr dispergiert zur Herstellung einer Aufschlämmung; Der mit dem Stopfen und der oberen Membran ausgestatteten Kolben wurde in das Testrohr eingesetzt bis ein fester Kontakt zwischen dem O-Ring und dem Testrohr erreicht war.

Die gesamte Einheit wurde umgedreht, so dass sie senkrecht auf dem Stopfen stand und die Luft wurde durch den Auslass im Testrohr entfernt. Der Testrohrauslass wurde sodann verschlossen und das Packen erfolgte in der Weise,

dass das Testrohr entlang dem feststehenden Kolben nach unten bewegt wurde mit einer Fliessrate von 1 ml/min. Sobald das Siliziumdioxidbett vollständig abgesessen war, wurde der Testrohrauslass geöffnet und das Testrohr vom Kolben entfernt. Die untere Membran wurde installiert und damit war die Säule fertig zur Aufbringung der Probe.

(b) Probenaufbringung Ein Gemisch von Ferrocen und Ferrocenaldehyd wurde in 0,2 bis 0,4 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung wurde auf die untere Membran der senkrecht stehenden Säule aufgebracht. Die Lösung drang durch die Membran und die Komponenten wurden am Siliziumdioxid adsorbiert. Diese Prozedur konnte dadurch beschleunigt werden, dass mit Hilfe des geschlossenen Testrohrs etwas Luftdruck ausgeübt wurde.

(c) Elution

Der gepackte Kolben wurde in das 5 ml des gewählten Elutionsmittels enthaltende Testrohr eingesetzt. Luft wurde entfernt wie während des Packens der Säule und die Elution wurde durch Niederdrücken des Kolbens in das gefüllte Testrohr mit einer Fliessrate von etwa 1 ml/min bewirkt.

Die mit zwei verschiedenen Gemischen erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

Beispiel 2

Trennung von Na2Cr207 • 2H20 von CUSO4 • 5H2O durch Ionenaustausch Das Adsorbens bestand aus Dowex 50 WX8 (200 bis 400 mesh, entsprechend 0,038—0,074 mm lichte Maschenweite). Das Adsorbens wurde zuerst gewaschen und danach etwa 30 Minuten lang in destilliertem Wasser, das mit Salzsäure (2N) angesäuert war, stehengelassen. Die Azidität wurde sodann entfernt durch Waschen mit destilliertem Wasser und das neutrale Adsorbens wurde in den Längskanal des Kolbens eingeführt. Die beiden Membranen, welche das Adsorbens-

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Tabelle I

1) Trennung einer Testmischung aus Ferrocen (13 mg) und Ferrocenaldehyd (19 mg)

Frakt. Elutionsmittel- Elutionsmittel Gewicht des Rückstands (mg) Charakterisierung

Nr. volumen (ml)

0 1

Hexan

0

leer

1 1

Hexan

11,4

Ferrocen

2 1

Hexan

0,79

Ferrocen

3 1

Hexan

0,31

Ferrocen

4 1

Dichlormethan

Spuren leer

5 1

Dichlormethan

1,79

Aldehyd

6 1

Dichlormethan

13,36

Aldehyd

7 1

Dichlormethan

4,59

Aldehyd

8 1

Dichlormethan

1,69

Aldehyd

9 1

Dichlormethan

Spuren leer

2) Trennung einer Testmischung aus Ferrocen (25,3 mg) und Ferrocenaldehyd (15,6 mg)

Frakt. Elutionsmittel- Elutionsmittel Gewicht des Rückstands (mg) Charakterisierung

Nr. volumen (ml)

0 1

Hexan

0,2

Ferrocen

1 1

Hexan

19,0

Ferrocen

2 1

Hexan

1,7

Ferrocen

3 1

Hexan

0

Ferrocen

4 1

Hexan

0

leer

5 1

Dichlormethan

0

leer

6 1

Dichlormethan

0,2

Aldehyd

7 1

Dichlormethan

11,5

Aldehyd

8 1

Dichlormethan

2,9

Aldehyd

9 1

Dichlormethan

0,7

Aldehyd

10 1

Dichlormethan

0

leer bett hielten, bestanden aus zwei Scheiben aus porösem Po-lyethylenfilter.

Die in Form einer wässrigen Lösung vorliegende Probe bestand aus 359,3 mg Na2Cr207 • 2H20 und 369,7 mg Cu-SO4 • 5H2O, gelöst in 1 ml Wasser. Die Probe wurde durch das Adsorbens geleitet und die für Analysezwecke entnommene Menge an Probe betrug 100 nl. Die Ionen wurden von der Säule gewaschen und wie folgt getrennt:

— die Anionen durch destilliertes Wasser;

— die Kationen durch eine saure Lösung, bestehend aus 2N-Salzsäure.

Die Fraktionsanteile wurden in Reagensgläsern gesam-40 melt. Die Beendigung des Waschens wurde nach der Farbe der austretenden Lösung bestimmt. Die Proben wurden ferner quantitativ analysiert, indem die Fraktionsanteile bei 110 C getrocknet und der trockene Rückstand gewogen

Tabelle II

Trennung durch Ionenaustausch mit dynamischer Chromatographie

Versuch

Nr. der Fraktion

Elutionsmittel

Gewicht der trockenen

Gesamtgewicht

Bemerkungen

Nr.

Fraktion (mg)

(mg)

1

1

HoO

43,0

2

H20

0,2

3

H->0

0

43,2

*)

4

HCl (2N)

0,5

5

HCl (2N)

15,2

6

HCl (2N)

27,5

7

HCl (2N)

3,2

AI 7

*1

8

HCl (2N)

1,3

T- /, /

)

2

1

HiO

44,2

2

H->0

1,1

3

H-iO

0,1

45,3

*)

4

HCl (2N)

0,4

5

HCl (2N)

2,3

6

HCl (2N)

34,0

7

HCl (2N)

5,7

8

HCl (2N)

0,8

43,2

*)

*) farblose Fraktion

662062

8

wurden. Eine Blindprobe für den Rückstand wurde durchgeführt, indem 100 jj.1 der Probe in ein Teströhrchen eingeführt und bei 110 :C getrocknet wurden. Der Feststoffrückstand wog 68,5 mg.

Die Ergebnisse, die beim Wiegen der verschiedenen getrockneten Fraktionen erhalten wurden, sind in der Tabelle II wiedergegeben. Im Versuch 2 wurde die Säule nach Durchführung des Versuchs 1 bis zur Neutralität gewaschen und neutralisiert.

Die Ergebnisse zeigen, dass nach Durchlaufen von acht Fraktionen durch das Adsorbens praktisch die Gesamtmenge der Verbindungen entfernt und getrennt waren.

Um die Effizienz der erfindungsgemässen DCLC zu zeigen, wurde ein Vergleichsversuch durchgeführt unter Verwendung einer üblichen Chromatographietechnik durch Elutionsmittelfluss mittels Schwerkraft, wobei die gleiche Menge einer 100 ^I-Probe und das gleiche Adsorbens eingesetzt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III Trennung durch Ionenaustausch mit üblicher bekannter Chromatographiesäule

Nr. der

Elutions

Gewicht der

Gesamt

Be-

Fraktion mittel trockenen gewicht mer

Fraktion

(mg)

kung

(mg)

1

H-iO

0,8

2

H-iO

50,3

3

H-iO

1,3

4

H-iO

0,5

5

H->0

0,2

6

H->0

0,3

7

HoO

0,4

8

H->0

0,1

9

H-iO

0,3

10

H->0

0,4

11

HiO

0,1

12

H->0

0,3

13

H,0

0,1

54,9

*)

14

HCl (2N)

0,0

15

HCl (2N)

2,3

16

HCl (2N)

23,0

17

HCl (2N)

12,7

18

HCl (2N)

3,3

19

HCl (2N)

1,4

20

HCl (2N)

1,4

44,1

*)

*) farblose Fraktion

Die Ergebnisse zeigen, dass in diesem Falle zwanzig Fraktionen zur Trennung erforderlich sind gegenüber acht beim erfindungsgemässen Verfahren.

Beispiel 3

Es wurde eine Lösung von 100 jj.1 ß-hCG mit einem Gehalt an 30 bis 35% markiertem Jod (*J2) mit Hilfe der erfindungsgemässen DCLC unter Verwendung eines Sephadex G-10-Adsorbens getrennt. Die Elution wurde mit 10 ml Puffer bei einem pH-Wert von etwa 8 durchgeführt. Jede Fraktion bestand aus etwa 0,4 ml. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Ausbeute etwa 85% beträgt. Bei Durchführung dieser Trennung mit Hilfe einer üb-

Tabelle IV

Trennung von *J2 enthaltendem ß-hCG auf Sephadex G-10

Fraktion Nr. leer cpm gemessen gesamt

1 29,0 0

2 9348,0 9578,0

3 1946,0 1962,8

4 292,0 267,7

5 130,0 104,8

6 114,0 84,5

7 108,0 82,0

8 78,0 48,2 12125 cmp

9 79,0 49,6

10 98,0 67,7

11 134,0 102,9

12 182,0 152,5

13 414,0 389,3

14 485,0 464,4

15 766,0 757,5

16 854,0 834,7

17 635,0 615,5

18 450,0 424,6

19 504,0 486,4

20 378,0 348,5

21 284,0 256,8

22 158,0 127,7

23 131,0 99,8 5169 cpm gesamt 20534,0 20594,4 17294

liehen Chromatographietechnik wird weitaus mehr Elutionsmittel gebraucht und die Trennoperation dauert sehr viel länger.

Beispiel 4

Mit Hilfe des erfindungsgemässen DCLC-Verfahrens wurde eine Lösung eines Farbstoffgemisches, bestehend aus 35% Ceres rot 7B, 28% Nitro echt blau 2B, 25% Nitro echt violett FBL und 12% Ceres gelb R (alle Angaben in Vol.-%), getrennt. Dieses Farbstoffgemisch wurde von der Firma Merck bezogen (Katalognummer 9354).

Eine Menge von 30 jal des Farbstoffgemisches in Dichlormethan wurde auf eine DCLC-Säule aufgebracht, die ein Adsorbens auf Siliziumdioxidbasis mit einer Partikelgrösse von 15 bis 25 (im (Handelsprodukt Lichroprep Si-60 der Firma Merck, Katalognummer 9336) enthielt. Die Säulendimensionen waren wie folgt: Länge 10,6 cm und innerer Durchmesser 10 mm. Die Fliessrate betrug 2 ml/min und als Elutionsmittel diente Dichlormethan.

Die Ergebnisse der Trennung sind in Fig. 10 in grafischer Auswertung, gemessen als optische Dichte (O.D.) bei 254 nm gegen die Fraktionen, wiedergegeben. Wie aus den Kurven ersichtlich ist, wird eine rasche und saubere Trennung erreicht.

Beispiel 5

Es wurde ein Gemisch von polycyclischen Aromaten, bestehend aus 50% Benzol, 30% Naphthalin und 20% Anthra-cen (Angaben in Vol.-%), in n-Heptan-Lösung mit Hilfe des erfindungsgemässen DCLC-Verfahrens getrennt.

Die aufgebrachte Probe bestand aus 50 jj.1 Lösung und es wurde eine Säule mit den gleichen Ausmassen wie in Beispiel 4, die das gleiche Adsorbens enthielt, eingesetzt. Die Fliessrate betrug 2 ml/min und das Volumen jeder Fraktion war 1 ml. Als Elutionsmittel diente n-Heptan.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

662 062

Die Ergebnisse der Trennung sind in Fig. 11 grafisch ausgewertet als optische Dichte (O.D.) bei 254 nm gegen die Fraktionen. Wie die Kurven zeigen, wurden die Komponenten in drei scharfe Peaks getrennt.

Beispiel 6

Es wurde ein Gemisch von Alkylphthalaten mit Hilfe des erfindungsgemässen DCLC-Verfahrens unter Verwendung einer Säule wie in Beispiel 4 mit dem gleichen Adsorbens getrennt.

Die Alkylphthalate bestanden aus einem Gemisch von Dibutylphthalat, Diethylphthalat und Dimethylphthalat in n-Heptan/Ethylacetat (90/10 Vol.-Teile). Das Elutionsmittel war ein Gemisch aus n-Heptan/Ethylacetat (90/10 Vol.-Teile). Die Fliessrate betrug 3 ml/min, das Volumen jeder Fraktion war 1 ml. Die Ergebnisse der Trennung sind in Fig. 12 grafisch ausgewertet als optische Dichte (O.D.) bei 254 nm gegen die Fraktionen. Wie die Kurven zeigen, wurde eine klare Trennung erreicht.

Beispiel 7 Reinigung von Anti-hCG

Die Reinigung wurde mit Hilfe des erfindungsgemässen DCLC-Verfahrens unter Verwendung zweier verschiedener Bezugsquellen dieser Verbindungen durchgeführt, nämlich a) von Serono und b) von Miles, wobei bekannt ist, dass das letztgenannte Produkt weniger konzentriert ist als das erstgenannte.

a) Reinigung von Anti-hCG (Serono)

Eine Phiole von Anti-hCG wurde rekonstituiert mit 1 ml 5 Phosphatpuffer (pH = 6,3). Die Lösung wurde auf eine Säule von 10,6 cm Länge und 10 mm i nnerem Durchmesser aufgebracht, welche 3 g Cellulose (Handelsprodukt DEAE DE-52 der Firma Whatman) als Adsorbens enthielt. Die Säule wurde mit Phosphatpuffer (pH = 6,3) eluiert mit einer io Fliessrate von 2,5 ml/min. In den ersten Fraktionen (4 bis 8) war sofort ein sehr hoher Peak von Proteinen sichtbar. Die Säule wurde an eine Fliesszelle und einen Recorder zur sofortigen Bestimmung angeschlossen. Ein Pufferwechsel auf pH = 7,1 führte zu einem fast sofortigen Auftreten von Pro-i5 teinen. Zwei weitere Hauptpeaks von Proteinen wurde eluiert.

Die Bestimmung erfolgte durch Messen der Adsorption bei 280 nm optische Dichte (O.D.) jeder Fraktion. Die immunologische Aktivität in jeder Fraktion zum hCG-Nach-20 weis erfolgte mit Hilfe der RIA-Methode unter Verwendung der folgenden Lösungen: 100 jj.1 125J —hCG; 100 (il Serum frei von hCG und 100 nl jeder Fraktion. Die Inkubation wurde 3 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Trennung erfolgte unter Einsatz eines Polyethylenglykol/ 25 Doppelantikörpers (20/1 Vol.-Teile).

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V aufgeführt.

Tabelle V

Trennung von Anti-hCG Serono auf DEAE DE-52

Fraktion O.D. RIA Fraktion O.D. Ria

Nr. % Bindung Nr. % Bindung

1

0,004

0,1

16

0,013

19

2

0,002

0,1

17

0,039

16,4

3

0,004

14,1

18

0,03

5,0

4

0,006

2,1

19

0,012

3,0

5

0,63

22,8

20

0,019

6,4

6

0,879

12,3

21

0,044

10,3

7

0,097

2,8

22

0,029

4,5

8

0,01

0,1

23

0,018

4,0

9

0,008

0,1

24

0,015

3,0

10

0,003

0,1

25

0,008

2,6

11

—

0,1

26

0,002

2,4

12

0,002

0,1

27

0,002

0,1

13

0,002

0,1

28

0,01

0,1

14

0,003

0,1

29

-

0,1

15

0,01

0,1

Die Ergebnisse zeigen, dass drei Hauptpeaks erhalten wurden, wobei die immunologische Aktivität extrem hoch blieb im Vergleich zur Proteinkonzentration.

b) Reinigung von Anti-hCG (Miles) 70 (ri Antikörper (als Kaninchenserum) wurden auf die DEAE DE-52-Säule aufgebracht (wie im Versuch (a) beschrieben) und zuerst mit Phosphatpuffer (pH = 6,3) eluiert. Wie im Versuch a) wurde ein rasch auftretender Pro-teinpeak eluiert in den Fraktionen 3 und 4. Durch Erniedrigung der optischen Dichte (O.D.) und Änderung des Puffers auf pH = 7,1 wurden drei weitere Hauptpeaks gesammelt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI aufgeführt.

Die Ergebnisse zeigen, dass das getrennte Anti-hCG in drei Hauptpeaks gesammelt wurde, die alle immunologische Aktivität zeigten, Absorption bei 280 nm aufwiesen und einen Nachweis durch Protein A* ergaben. Alle Peaks waren scharf voneinander getrennt und wurden gesammelt.

55

Beispiel 8 Trennung von Humanserum Die Trennung mit Hilfe des DCLC-Verfahrens erfolgte nach einer Prozedur, die identisch ist mit derjenigen, wie in 60 Handbook of Expérimental Immunology (D.M. Weir, Md. Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, 1973, 2. Auflage) beschrieben.

Die Chromatographie basiert auf Ionenaustausch auf einem Celluloseadsorbens und einer Gradientenelution mit 65 Phosphatpuffer (0,02 M) von pH 5,7.

Die verwendete Säule hatte einen inneren Durchmesser von 10 mm und war gepackt mit 3 g DEAE DE-52 (Handelsprodukt der Firma Whatman) und sie wurde gewaschen

662062 10

Tabelle VI

Trennung von Anti-hCG Miles auf DEAE DE-52

Fraktion Nr.

O.D.

RIA

% Bindung

Protein A* % Bindung

Fraktion Nr.

O.D.

RIA

% Bindung

Protein A* % Bindung

1

0,01

0,1

_

21

0,094

63,6

7,0

2

0,102

0,1

22

0,042

64,8

7,2

3

0,656

64,2

2.6

23

0,041

63,4

-

4

0,416

45,6

—

24

0,07

1,0

-

5

0,091

0,1

-

25

0,518

60,3

5,9

6

0,055

0,1

26

0,518

67,7

5,3

7

0,044

0,1

-

27

0,299

55,5

4,5

8

0,022

0,1

—

28

0,161

58,4

3,7

9

0,016

0,1

_

29

0,120

66,0

2,5

10

0,007

0,1

-

30

0,112

54

1,8

11

0,005

0,1

-

31

0,091

51,3

3,9

12

0,003

0,1

—

32

0,074

59,7

2,4

13

0,003

0,1

-

33

0,062

55,7

unbekannt

14

0,004

0,1

—

34

0,062

60,9

15

0,001

0,1

-

35

0,043

59,5

1.9

16

0,004

0,1

-

36

0,034

17

0,011

0,1

_

37

0,035

18

0,034

65,4

7,2

38

0,029

19

0,291

55,5

12,1

39

0,021

20

0,247

61,4

11,6

mit dem Phosphatpuffer (pH = 8) mit einer Fliessrate von 2,5 ml/min.

Der Gradient wurde mit einem Zweikammersystem erzeugt unter Verwendung von 40 ml Phosphatpuffer pH 8 und 60 ml Phosphatpuffer pH 5,7. 3 ml Humanserum wurden getrennt in Fraktionen von 1,5 ml, von denen jede gesammelt wurde, worauf der darin enthaltene Proteingehalt durch optische Dichte (O.D.) bei 280 nm gemessen wurde.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VII aufgeführt.

Tabelle VII

Trennung von Humanserum (O.D. bei 280 nm)

Fraktion

O.D.

Fraktion

O.D.

Fraktion

O.D.

Nr.

Nr.

Nr.

1

0,0017

13

0,052

25

0,06

2

1,3

14

0,061

26

0,026

3

1,3

15

0,102

27

0,008

4

1,3

16

28

0,004

5

0,554

17

0,187

29

0,011

6

0,262

18

0,355

30

0,003

7

0,135

19

0,379

31

0,008

8

0,082

20

0,361

32

0,015

9

0,067

21

0,313

33

0,016

10

0,064

22

0,233

34

0,011

11

0,055

23

0,156

35

0,005

12

0,052

24

0,098

36

0,006

Die Ergebnisse zeigen, dass die Trennung nach dem traditionellen Kurvenbild von getrenntem Humanserum erfolgte mit zwei Hauptpeaks (IgG, Albumine). Die Trennung war in kurzer Zeit beendet.

Beispiel 9

Das erfindungsgemässe DCLC-Verfahren wurde auf Affinitätschromatographie angewandt zur Isolierung von Kaninchen-IgG unter Verwendung von Sepharose-4B (Han-30 delsprodukt der Firma Pharmacia) -Antikörper (Antikörper = Ziegen-Antikaninchen) als Ligand.

Sepharose-4B-Antikörper:

Der Antikörper wurde an das aus Sepharose-4B (Han-35 delsprodukt der Firma Pharmacia) bestehende Adsorbens gekuppelt unter Beachtung der Instruktionen, die von Axel Porath et al. in Nature 214,1967, gegeben werden.

DCLC-Säule:

Glassäule von 6 mm innerem Durchmesser, gepackt mit Sepharose-4B-Antikörper 45 Bestimmung:

direkt von der Säule mit Fliesszellen unter Messung der UV-Absorption bei 280 nm Puffer:

1. Phosphatpuffer/NaCl, pH 7,8 so 2. Glycin/HCl (0,1 M), pH 2,5.

Die Verfahrensweise umfasste folgende Stufen: 1. Kuppeln von Sepharose-4B an Ziegen-Antikaninchen-serum

55 2. Packen einer DCLC-Säule mit Sepharose-4B-Antikörper 3 ml Gel, von beiden Seiten geschlossen mit einem Filtersystem VYON (Handelsprodukt), etwa 40 |rm.

3. Waschen der gepackten Säule mit 6 ml Puffer 1.

4. Laden der Säule mit 0,5 ml N.R.S. (Normalkaninchen-60 serum).

5. Inkubation bei 37 °C 2 h lang

6. Elution mit Puffer 1 und Sammeln der Fraktion, bis die optische Dichte am Photometer unter 0,1 beträgt.

7. Elution mit Puffer 2 von pH 2,5 und Sammeln der Frak-65 tionen, bis die optische Dichte unter 0,1 beträgt.

Die grafische Auswertung der erhaltenen Ergebnisse dieser Affinitäts-Chromatographie ist in Fig. 13 gezeigt.

s

6 Blatt Zeichnungen

Claims (19)

1. 662062

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Trennung einer oder mehrerer in Lösung befindlicher Verbindungen mit Hilfe einer dynamischen Säulen-Flüssigkeitschromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass man ein sich bewegendes Feststoffadsorbensbett mit einem Kolben, der an seinem Bodenteil mit einem Abdichtungselement und in seinem Inneren mit einem Längskanal, der ein zwischen zwei als Barrieren dienenden Sperreinrichtungen gehaltenes Adsorbens enthält, versehen ist, sowie ein an seinem Boden gegebenenfalls mit einem Mehrweghahn versehenes Testrohr, in das der Kolben bündig passt, einsetzt, den Kolben in das Testrohr schiebt unter Einführung und Transport des gewünschten, zuvor durch den Hahn gedrückten oder von oben in das Testrohr eingefüllten Elutionsmittels durch den Kanal zur Fortbewegung der zu trennenden adsorbierten Verbindungen zwischen den Barrieren, und die erhaltene Lösung durch eine am Kopfteil des Kolbens befindliche Ausströmeinrichtung abzieht.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man bei geschlossener Stellung des Hahns die Flüssigkeit zur Fortbewegung der zu trennenden adsorbierten Verbindungen zwischen den Sperrplatten unter innerem Druck durch den Kanal führt.
3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zusätzliches geeignetes Adsorbens, das von dem in der dynamischen Säulen-Flüssigkeitschromatographie verwendeten Adsorbens verschieden ist, zur Vorkonzentrierung der eingebrachten Probe einsetzt.
4. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein am Boden geschlossenes Testrohr verwendet und das Elutionsmittel in das Testrohr einbringt, bevor der Kolben nach unten in das Testrohr geschoben wird.
5. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Chromatographie als Silica-gelchromatographie, Umkehrphasen-Flüssigkeitschromato-graphie, Affinitätschromatographie, Kapillarchromatographie, Chromato-Fokussierung, Gelfiltration oder Ionenaus-tauschchromatographie durchführt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Feststoffadsorbens in eine Hülse einführt, die im Längskanal des Kolbens angeordnet wird.
7. 7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

   — ein Testrohr (R), das an seinem Boden gegebenenfalls mit einem Mehrweghahn (LV) versehen ist,

   — einen Kolben (C), der in das Testrohr bündig einpasst und an seinem Bodenteil ein Abdichtelement und in seinem Inneren einen Längskanal aufweist, der ein zwischen zwei als Barrieren dienenden Sperreinrichtungen (Fi, F2) gehaltenes Adsorbens (P) enthält, und

   — eine Ausströmeinrichtung (D), die sich am Kopfende des Kolbens (C) befindet.
8. 8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausströmöffnung für das Elutionsmittel als vertikaler enger Kanal in direkter Fortsetzung der Säule ausgebildet ist.
9. 9. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass am Bodenteil des Kolbens ein Abdichtelement vorliegt, das zum Gleiten längs der Innenwände des Testrohrs ausgestattet ist.
10. 10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Abdichtelement aus einem inerten Material besteht.
11. 11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Abdichtelement aus einem Kautschuk-O-Ring besteht, dessen Öffnungsinnenteil am Längskanal befestigt ist.
12. 12. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Säulenkolben in Form von zwei oder mehreren Untereinheiten ausgestaltet ist, von denen jede das gleiche oder ein unterschiedliches Adsorbens ent-

    s hält.
13. 13. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausströmöffnung an der oberen Sperrplatte des Kolbens angeschlossen ist.
14. 14. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 13, dadurch io gekennzeichnet, dass ein Stopfen am Kopfende des Kolbens vorgesehen ist.
15. 15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausströmöffnung mit einem Kanal in Verbindung steht, der sich durch den Stopfen erstreckt.

    i5 16. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein als Säule ausgebildeter Lösungsmit-tel-Vorratsbehälter mit der Säule für die dynamische Chromatographietechnik verbunden ist.
16. 17. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 16, dadurch 20 gekennzeichnet, dass das Testrohr an seinem Boden geschlossen ist.
17. 18. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Kolben mit Einrichtungen zur Ausbildung einer Gastasche ausgestattet ist.

    25 19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtungen zur Ausbildung einer Gastasche aus am Kolben befindlichen horizontalen, vertikalen oder spiralförmigen Vertiefungen bestehen.
18. 20. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 19, dadurch 30 gekennzeichnet, dass sie aus einem inerten Material hergestellt ist.
19. 21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das inerte Material aus Metall, Glas, Polyethylen oder anderem entsprechenden Kunststoffmaterial

    35 besteht.

    40