CH637659A5 - Verfahren zur herstellung von reagentien zur bestimmung von herzglykosiden. - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Reagentien, die zur Untersuchung von Herzglykosiden (Digi-talisglykosiden) geeignet sind.
Bei den Methoden zur Untersuchung von Digitalisglyko-siden, insbesondere zur Messung des pharmakologischen Spiegels an solchen Glykosiden, handelt es sich um immunologische Tests in wässriger oder physiologischer Lösung, z.B. im Plasma, Serum und Urin. Solche Immuntests für die Bestimmung von Digitoxin und Digoxin sind bekannt. So wird nach dem aus G.C. Oliver, B.M. Parker, D.L. Brasfield und C.W. Parker, «The Measurement of Digitoxin in Human Serum by Radioimmunoassay», J. Clin, Investig. 47,1035 (1968), bekannten Verfahren eine bestimmte Menge eines mittels immunologischer Standardverfahren hergestellten Antidigitoxinserums mit einer wässrigen oder physiologischen Lösung, deren Digitoxingehalt bestimmt werden soll, also z.B. mit Testplasma, -serum oder -urin, oder mit einer Standarddigitoxinlösung jeweils zusammen mit einer konstanten Menge Digitoxigenin umgesetzt, das entweder radioaktiv markiert oder an ein Enzym gebunden ist, und zwar
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jeweils so, dass die antigenen Eigenschaften unverändert erhalten bleiben. Nach der Inkubation des Gemisches wird das mit dem Antikörper verbundene Digitoxin bzw. Digitoxi-genin von freiem Digitoxin bzw. Digitoxingenin abgetrennt und die Radioaktivität oder die Enzymaktivität gemessen. Das Reagens, also das radioaktiv markierte oder an ein Enzym gebundene Digitoxigenin, ist ein mit einem Peptid, einer Aminosäure oder einem Aminosäureester kondensiertes 3-O-Succinyl-digitoxigenin, das durch Umsetzung von Digitoxigenin mit Bernsteinsäureanhydrid hergestellt wird.
Aus der DE-OS 2 142 422 ist ein analoges, ebenfalls auf Immuntests beruhendes Verfahren zur Bestimmung von Digoxin bekannt, bei dem das entsprechende Reagens aus Digoxigenin, dem 12-Hydroxydigitoxigenin, ebenfalls durch Succinylierung, bei der die OH-Gruppe in 12-Stellung geschützt werden muss, und anschliessende Kondensation mit einem Peptid, einer Aminosäure oder einem Aminosäureester hergestellt wird. Es ist auch bekannt, das succinylierte Genin zur Antikörperherstellung als Antigen an ein Protein, z.B. an Rinderserumalbumin (RSA), zu binden.
Da der Komplex des Antikörpers mit dem Genin weniger stabil als der entsprechende Komplex mit dem vollständigen Herzglykosid ist, wurde ebenfalls bereits vorgschlagen, das Herzglykosid über den endständigen Zuckerrest mit einer Aminosäure oder einem Protein zu kondensieren. So ist es aus V.P. Butler und J.P. Chen, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S., 57, 71 (1966), bekannt, den endständigen Digitoxose-Rest mittels Perjodat zu oxidieren und anschliessend mit einem Protein, wie RSA, zum Immunogen zu kondensieren. Aus der DE-OS 2 331 922 ist dasselbe Verfahren, jedoch zur Herstellung jodierbarer Digoxin-Aminosäure- und -Peptidderivate, bekannt.
Da Digoxin gegenüber Säuren und Laugen ausserordentlich empfindlich ist, entsteht das Digoxin-Aminosäure-Derivat unter den drastischen Bedingungen des zuletzt genannten Verfahrens nur in einer Ausbeute von 10% d.Th. Derselbe Nachteil einer geringen Ausbeute entsteht auch bei der Umsetzung mit einem Protein, wobei jedoch noch hinzu kommt, dass eine Reinigung des Digoxin-Protein-Derivates nicht mehr, wie im Falle des niedermolekularen Aminosäure-Derivates, möglich ist, so dass das auf diese Weise erhaltene Immunogen noch Nebenprodukte, wie z.B. isomerisiertes Digoxin, enthält. Ein weiterer Nachteil dieses bekannten Verfahrens zur Herstellung eines Digoxin-Reagenses ist die irreversible Veränderung des endständigen Zuckerrestes im Digoxinmolekül sowie dessen direkte Verknüpfung mit dem Protein oder der Aminosäure. Hierdurch werden die steri-schen Verhältnisse innerhalb des Digoxinmoleküls verändert, was wiederum die Genauigkeit des mit diesem Molekül als Reagens durchgeführten Tests beeinflusst, bei dem ja letzten Endes der Antikörperkomplex dieses Moleküls mit dem Antikörperkomplex des freien Digoxins verglichen wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu vermeiden und Verbindungen zu schaffen, die es ermöglichen, Digitalisglykoside, wie z.B. Digoxin oder Digitoxin, ohne deren molekulare Struktur zu verändern, über eine «Brücke» mit mindestens einer Aminogruppe enthaltenden Verbindungen, z.B. Aminen, Aminosäure-Derivaten oder Proteinen, zu kondensiereh, also Verbindungen zu schaffen, die zur Herstellung von Reagentien zur Untersuchung von Herzglykosiden geeignet sind.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Reagentien zur Bestimmung von Herzglykosiden in wässriger oder physiologischer Lösung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Verbindung der Formel I
Ri
R2-C-(CH2)n-COX (I),
I
Ra
worin
Ri einen Digoxin- oder Digitoxinrest darstellt;
R2 und R3 je einen Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen; X einen Succinimid-N-oxy-, N-Methyl-pyridiniumoxy-, Piperidyl-N-oxy-, Phthalimid-N-oxy- oder Benztriazol-N-oxy-Rest; und n die Zahl 2,3,4 oder 5 bedeuten, mit einer, mindestens eine Aminogruppe aufweisenden, Verbindung umsetzt.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Reagentien zur Bestimmung von Herzglykosiden in wässriger oder physiologischer Lösung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Verbindung der Formel II
ri
I
0=C-CH2)n-C0X (II),
worin
Ri einen Digoxin- oder Digitoxinrest darstellt;
X einen Succinimid-N-oxy-, N-Methyl-pyridiniumoxy-, Piperidyl-N-oxy-, Phthalimid-N-oxy- oder Benztriazol-N-oxy-Rest; und n die Zahl 2,3,4 oder 5 bedeuten, mit einer, mindestens eine Aminogruppe aufweisenden, Verbindung umsetzt.
Das nach den beiden oben genannten Verfahren hergestellte Reagens weist einen Rest der Formel ri
I ^
R2-C-(CH2)n-CON<T
I
r3
auf, worin
Ri, r2, R3 und n die oben angegebenen Bedeutungen haben oder worin R2 und R3 zusammen ein Sauerstoffatom darstellen.
Die Verbindungen der Formel I und II können hergestellt werden, indem man einen Monoorthotrimethyl-, Monoorth-otriäthyl- oder Monoorthotripropylester einer Dicarbon-säure der Formel III
\ s
J,C-(CH2)n-C" (HI)
YiÇf ^^OH
in Form eines Monoalkalisalzes in Gegenwart eines Kronenäthers oder eines Cryptâtes in einem polaren oder unpolaren aprotischen organischen Lösungsmittel mit einer den Rest X abgebenden Verbindung umsetzt, diese anschliessend mit Digoxin oder Digitoxin in Gegenwart von p-Toluolsulfon-säure umestert und gegebenenfalls mit Säure behandelt.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die im Patentanspruch 17 angegebene Anwendung des Herstellungsverfahrens nach Patentanspruch 9.
Die reaktiven Dicarbonsäureester der Formeln I und II sind zur Herstellung von Reagentien zur Untersuchung von Digitalisglykosiden im Rahmen immunologischer Tests der eingangs genannten Gattung hervorragend geeignet. Jeder dieser Carbonsäureester kann entweder mit einer radioaktiv
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markierbaren, mindestens eine Aminogruppe enthaltenden Verbindung, z.B. mit einer mit 125J jodierbaren aminogrup-penhaltigen Verbindung, wie Tyramin, Histidin, Tyrosin und Tyrosin-äthylester, oder einem tyrosinhaltigen Peptid umsetzt werden, wobei man einen Tracer erhält, oder mit einem biologisch aktiven Protein zur Herstellung von Antikörpern, z.B. mit Rinderserumalbumin, und jede der neuen Verbindungen kann schliesslich auch mit einem enzymatisch aktiven Protein zu einem Reagens für den ELISA-Test kondensiert werden. Mit der Erfindung werden also Reagentien zur Bestimmung von Herzglykosiden zur Verfügung gestellt, wobei jedoch mit diesen Reagentien die Messung ganz verschiedener Grössen, nämlich der Antikörperaktivität, der Enzymaktivität und der Radioaktivität, ermöglicht wird.
Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beispielsbeschreibung und den Ansprüchen.
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung der reaktiven Dicar-bonsäureester kann ein Monoorthotrimethyl-, -triäthyl- oder -tripropylester einer Dicarbonsäure mit 4 bis 7 C-Atomen in Form ihres Alkalisalzes, z.B. Glutarsäuremonoorthotrime-thylester dienen.
Glutarsäure-monoorhtotrimethylester kann z.B. hergestellt werden, indem in eine Mischung aus 37,3 g Cyanobuttersäu-reäthylester und 12 ml absol. Methanol unter Eiskühlung 10,7 g HCl eingeleitet werden. Nach 5-tägigem Stehen im Kühlschrank kristallisiert Glutarsäure-co-imido-O-methyl-ester-co'-äthylester-hydrochlorid langsam aus. Es wird mit absol. Äther viermal digeriert und unter Luftausschluss abgesaugt und über KOH getrocknet. Zu dem so erhaltenen Imi-doestersalz wird unter Luft- und Feuchtigkeitsausschluss ein Überschuss von Methanol gegeben. Zunächst gehen die Kristalle in Lösung, dann, nach 12stündigem Stehen bei Raumtemperatur, beginnt langsam die Ausscheidung von Ammoniumchlorid. Man lässt noch weitere 48 Stunden stehen und vervollständigt dann die Ausfällung durch Zusatz der dreifachen Menge Äther. Dann wird abfiltriert, eingeengt und in absol. Äther aufgenommen, erneut abfiltriert und wieder eingeengt. Der zurückbleibende Glutarsäure-co-orthotrimethyl-ester-co'-äthylester wird anschliessend destilliert (Kpo.os = 55 bis 6Q°C). Die Ausbeute über diese ersten beiden Stufen beträgt 41 %d.Th.
Dieselbe Verbindung, also Glutarsäure-co-orthotrimethyle-ster-co'-äthylester, erhält man - allerdings in geringerer Ausbeute -, indem in entsprechender Weise ein Überschuss von Methanol zu Glutarsäure-co-imido-O-methylester-ra'-äthyle-ster-tetrafluoroborat gegeben wird, das durch Umsetzung von Glutarsäureäthylesteramid mit Trimethyloxonium-tetra-fluoroborat zugänglich ist.
Der Glutarsäure-co-orthotrimethylester-co'-äthylester wird in 50 ml Aceton gelöst und mit der äquivalenten Menge KOH in 10 ml h2o versetzt und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Aceton und die Hauptmenge des Wassers abgezogen und mit absol. Methanol versetzt. Beim Einengen fällt das Kaliumsalz des Glutarsäure-monoortho-trimethylesters aus, das am Hochvakuum getrocknet wird und als Ausgangsmaterial zur Herstellung reaktiver Dicar-bonsäureester zur Herstellung der Reagentien von Herzglykosiden dient.
a) Glutarsäure-cü-orthotrimethylester-co' -hydroxysuccini-midester
In 20 ml Chloroform werden äquivalente Mengen des Kaliumsalzes des Glutarsäure-monoorthotrimethylesters mit dem Methylsulfonat oder dem p-Toluolsulfonat des Hydro-xysuccinimids und einer katalytischen Menge eines Kronenäthers oder eines Kryptates versetzt und 8 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Von ausgefallenem Natriumchlorid wird abgetrennt und die Lösung wird mit Natriumdi-
carbonat ausgeschüttelt, getrocknet und eingeengt. Der Hydroxysuccinimidester bleibt als farbloses Öl zurück.
b) Digoxin-4"'-glutaryl-hydroxysuccinimidester
Zu 2 g des gemäss a) hergestellten Glutarsäure-co-ortho-orthotrimethylester-co'-hydroxysuccinimidesters in 20 ml absol. THF werden 100 mg p-Toluolsulfonsäure und 1,5 g Digoxin gegeben. Das Digoxin geht unter Rühren bei Raumtemperatur langsam in Lösung. Nach 6 Stunden wird die Lösung mit 4 ml 0,1 n HCl auf pH 2 gebracht, dann wird eine halbe Stunde weitergerührt und schliesslich mit 0,1 n NaOH auf pH 6 gebracht. Dann wird eingeengt, in absol. Äthanol aufgenommen und wieder eingeengt. Aus dem zurückbleibenden Öl kristallisiert die Verbindung langsam in der Kälte aus. Es wird aus Essigester/Petroläther umkristallisiert. Fp. 125 bis 140°C (Zers.).
Analyse:
Ber.: C 60,5; H 7,35; N 1,4 Gef.: C 59,89; H 7,51; N 1,24
Mit den im folgenden beschriebenen Reaktionen wird die Herstellung von Reagentien zur Untersuchung von Digitalis-glykosiden näher erläutert.
Beispiel 1
Digoxin-4'" -glutaryl-tyramid
0,5 g eines gemäss b) hergestellten aktiven Dicarbonsäure-esters, 0,082 g Tyramin und 0,082 ml Triäthylamin werden 4 Tage lang bei Raumtemperatur in 20 ml absol. THF gerührt. Das THF wird abgezogen, der Rückstand in Methylenchlorid aufgenommen und zweimal mit 0,1 n HCl und einmal mit h2ö ausgeschüttelt. Die organische Phase wird getrocknet, eingeengt, in Essigester aufgenommen und mit Petroläther gefällt. Das so erhaltene kristalline Produkt wird in Essigester gelöst und an einer Silikagel-Säule chromatographiert. Hierbei läuft eine Verunreinigung durch, das reine Produkt wird mit THF eluiert, das Eluat eingeengt und mit Essigester versetzt. Durch Zugabe von Petroläther krisallisiert reines Digoxin-4"'-glutaryl-tyramidaus[Fp.: 120 bis 160°C(Z.)], das nach radioaktiver Markierung ein ausgezeichnetes Reagens zur Bestimmung von Digoxin in wässriger oder physiologischer Lösung darstellt.
Beispiel 2
Dogixin-Rinderserumalbumin-Konjugat
Zu einer 5%igen Lösung von Rinderserumalbumin in einer wässrigen KîCOs-Lôsung (pH = 8,5) wird eine äthanolische Lösung eines nach b) hergestellten aktiven Dicarbonsäuree-sters zugetropft. Nach mehrtägigem Rühren bei Raumtemperatur fällt ein weisser Niederschlag aus, der abzentrifugiert und mit Essigester gewaschen wird. Sowohl das Zentrifugat als auch der Rückstand, der in Wasser dispergiert wird, werden 1 Tag lang gegen fliessendes Wasser dialysiert. Die Lösung des Rückstandes wird sofort gefriergetrocknet. Die Lösung des Zentrifugats wird mit 0,1 n HCl auf pH 7 gebracht und eingeengt und anschliessend in Äthanol aufgenommen und auf pH 4,5 gebracht. Dabei fällt ein weiterer Teil des Konjugates aus. Dieses wird in 10 ml 0,15 n NaHCQ3-Lösung aufgenommen und 3 Tage lang gegen fliessendes Wasser dialysiert und schliesslich gefriergetrocknet.
Analog hierzu werden Edestin- und Polylysin-Digoxin-Konjugate aus den gemäss b) hergestellten aktiven Dicarbon-säureestern hergestellt, die wie das Digoxin-Rinderserumal-bumin-Konjugat, hervorragende Immunogene darstellen.
Auch die Herstellungeines Peroxidase-Digoxin-Derivates
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erfolgt analog zu der des Digoxin-Rinderserumalbumin-Konjugates, wobei bei einem Äthanolgehalt der Reaktionslösung von wengier als 20% gearbeitet wird und gegen eine 0,1 n Tris-Puffer-Lösung (pH = 6,2) dialysiert wird. Das
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POD-Digoxin-Derivat stellt ein hervorragendes Enzymtest-Reagens zur Bestimmung von Digoxin dar. Auch die Kondensation an Aminohexyl-Sepharose erfolgt nach analogen Verfahren.
B

Claims (17)

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1. Verfahren zur Herstellung von Reagentien zur Bestimmung von Herzglykosiden in wässriger oder physiologischer Lösung, die einen Rest der Formel
Ri
I ^
r2-C-(ch2)n-CON<T
I
R3
worin
Ri einen Digoxin- oder Digitoxinrest darstellt;
R; und R3 je einen Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und n die Zahl 2,3,4 oder 5 bedeuten, aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel I
Ri
I
R2-C-(CH2)n-COX (I),
I
R}
worin
Ri, Ra, Rî und n die oben angegebenen Bedeutungen haben und
X einen Succinimid-N-oxy-, N-Methyl-pyridiniumoxy-, Piperidyl-N-oxy-, Phthalimid-N-oxy- oder Benztriazol-N-oxy-Rest bedeutet, mit einer mindestens eine Aminogruppe aufweisenden Verbindung umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als mindestens eine Aminogruppe aufweisende Verbindung ein radioaktiv markierbares Amin, vorzugsweise ein mit 125J markierbares Amin, umsetzt.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein jodierbares Aminosäurederivat umsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Tyramin, Histidin, Tyrosin, Tyrosinäthylester oder ein tyrosinhaltiges Peptid umsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als mindestens eine Aminogruppe aufweisende Verbindung ein Protein, vorzugsweise ein biologisch aktives Protein, umsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man Rinderserumalbumin, Edestin oder Polylysin umsetzt.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man ein enzymatisch aktives Protein umsetzt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man Peroxydase umsetzt.
9. Verfahren zur Herstellung von Reagentien zur Bestimmung von Herzglykosiden in wässriger oder physiologischer Lösung, die einen Rest der Formel
Ri
I _
0=C-(CH2)„-C0N<^
worin
Ri einen Digoxin- oder Digitoxinrest darstellt, und n die Zahl 2,3,4, oder 5 bedeuten, aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel II
Ri
0=C-(CH2)n-C0X (II),
worin
Ri und n die oben angegebenen Bedeutungen haben und X einen Succinimid-N-oxy-, N-Methyl-pyridiniumoxy-, Piperidyl-N-oxy-, Phthalimid-N-oxy- oder Benztriazol-N-oxy-Rest bedeutet, mit einer mindestens eine Aminogruppe aufweisenden Verbindung umsetzt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als mindestens eine Aminogruppe aufweisende Verbindung ein radioaktiv markierbares Amin, vorzugsweise ein mit l25J markierbares Amin, umsetzt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man ein jodierbares Aminosäurederivat umsetzt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man Tyramin, Histidin, Tyrosin, Tyrosinäthylester oder ein tyrosinhaltiges Peptid umsetzt.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als mindestens eine Aminogruppe aufweisende Verbindung ein Protein, vorzugsweise ein biologisch aktives Protein, umsetzt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man Rinderserumalbumin, Edestin oder Polylysin umsetzt.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man ein enzymatisch aktives Protein umsetzt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man Peroxydase umsetzt.
17. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 9 auf Ausgangsstoffe der Formel II, die durch Behandlung einer Verbindung der Formel I
Ri
R2-C-(CH2)„-COX (I),
I
R3 worin
Ri einen Digoxin- oder Digitoxinrest darstellt;
R2 und Rs je einen Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen; X einen Succinimid-N-oxy-, N-Methyl-pyridiniumoxy-, Piperidyl-N-oxy-, Phthalimid-N-oxy- oder Benztriazol-N-oxy-Rest; und n die Zahl 2,3,4 oder 5 bedeuten, mit Säure erhalten werden.
CH25182A 1975-08-20 1982-01-15 Verfahren zur herstellung von reagentien zur bestimmung von herzglykosiden. CH637659A5 (de)

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