DE3129705A1 - Mit dichlortriazinylaminofluorescein markierte verbindungen von biologischem interesse - Google Patents
Mit dichlortriazinylaminofluorescein markierte verbindungen von biologischem interesseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft fluoreszierende Verbindungen,die sich be:
verschiedenen Immunofluoreszenz-Verfahren, als besonders wertvoll zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von kleinen
Molekülen von biologischem Interesse in Körperflüssigkeiten erwiesen haben. Zu den niedermolekularen Substanzen, .eren Nachweis
oder Überwachung erwünscht ist, gehören zu therapeutischen Zwecken verabreichte Arzneistoffe, Drogen mit Missbrauchsmöglichkeiten
und verschiedene andere Verbindungen, die für die Diagnose von Krankheiten oder zur Therapieüberwachung von Interesse
sind.
Die Verbindungen der Erfindung können in einer Reih·; von Immui ofluoreszenz-Verfahren
eingesetzt werden. Besonders ;ignen sie sich für ein Verfahren, das als Fluoreszen?polarisa*;ionsimmuntest
bezeichnet wirl. Der Fluoreszenzpolarisationsimmuntest
vereinigt die Spezi'"ität eines Immuntests mit der Geschwindigkeit
und der BequemLichkeit eines homogenen Verfahrens. Wenn
ein Fluoreszenzkonjugat an einen Antikörper gebunden ist, wird
linear polarisiertes Licht, das zur Erregung des Fluoreszenzkon jugats verwendet wird, in stark polarisierter Form emittiert,
da der Fluorophor im Zeitraum zwischen der Absorption und der Emission des Lichts am Rotieren gehindert wird. Ist andererseits
das Fluoreszenzkonjugat nicht an einen Antikörper gebunden, so verläuft die Rotation wesentlich rascher, die Moleküle
werden willkürlich orientiert und das emittierte Licht wird depolarisiert. Die Fluoreszenzpolarisation gibt somit ein direktes
Mass für gebundenes und freies Fluoreszenzkonjugat in einem kompetitiven Bindungsimmuntest. Das Fluoreszenzkonjugat
konkurriert mit der zu untersuchenden Verbindung in der Patientenprobe um die Antikörperbindungsstellen. Je grosser die
Konzentration der zu bestimmenden Verbindung ist, desto grosser ist der Anteil des nicht an Antikörper gebundenen Fluoreszenzkonjugats.
Somit wird auch ein grösserer Anteil an depolarisiertem Licht emittiert. Die präzise Beziehung zwischen der Analyt-
3793
konzentration und der Polarisation wird durch AufstelJen einer
Eichkurve bestätigt. Man setzt Eichpräparate mit bekannten Analytmengen ein und stellt die entsprechende Polarisation
fest. Bei Untersuchung einer unbekannten Probe kann deren Konzentration durch Interpolation zwischen den Eichpräparaten
ermittelt werden.
Fluoreszenzkon.; jgat von Derivaten geringen Molekulargewichts
sind an sich bekannt. Die US-PS 3 998 9^3 beschreibt die Herstellung
von fluoreszierend markiertem Insulin unter Verwendung
von Fluor sceinisothiocyanat (FITC) und von fluoreszierend markiertem Mori hin :nter Verwendung von 4-Aminofluoresceinhydrochlorid.
Die erfindungsgemäs.-en Derivate sind mit Dichlortriazinylaminofluorsscein,
da3 allgemein als DTAF bezeichnet wird, markiert.
Bei DTAF hande] . es sich um das Reaktionsprodukt aus Aminofluor3scein
und Cya urchlorid. Blakeslee et al., Journal of Immunological M-tho-s, Bd. 13 (1976), S. 305 bis 320 beschreiben
DTAF als wirksames 1 eagens zur Konjugation von Fluorescein an
Immunoglobuline (IgO mit- einem Molekulargewicht von mindestens
160 000.
Erfi ldungsgemäs 3 wi.-d DTAF dazu verwendet, verschiedenen Verbindungen
von biologischem Interesse Fluoreszenz zu verleihen. Diese
markierten V ;rbi-düngen lassen sich durch folgende allgemeine
Formel w'uederge yen
,Cl
- 5 - BAD ORIGINAL
3793 - 6 "
worin X einen Rest von biologischem Interesse mit
< inem Molekulargewicht von weniger als 2000 bedeutet, de·1 mindestens
einen reaktiven Substituenten aus der Gruppe primäres und sekundäres Amin und Hydroxyl aufweist, der an ein Kohlenstoffatom
des Triazinrings gebunden ist, und Z 4-Aminofluorescein
oder 5-Aminofluorescein, das über die 4-Amirio- bzw. 5-Aminogruppe
an das Kohlenstoffatom in der 2-Stel]ung des Triazin-.rings
gebunden ist, bedeutet.
DTAF lässt sich leicht gemäss Blakeslee et al., a.a.O., herstellen.
Das Isomere I von DTAF wird aus 5-Aminofluorescein hergestellt. Das Isomere T.I erhält man aus ^-Aminofluorescein.
Die Konjugation der beiden Isomeren von DTAF an zu untersuchende Verbindungen wird im allgemeinen durchgeführt, indem man
äquimolare Mengen an DTAF und einer Verbindung mit einer reak-.
tiven Amingruppe (primär oder sekundär) oder einer Hydroxylgrupp in einem geeigneter Lösungsmittel, wie Wasser, Methanol, Dimethylformamid
oder Dimethylsulfoxid, löst. Handelt es sich bei dem reaktiven Amin um ein Salz, wird das Reaktionsgemisch mit
einer geeigneten Base versetzt, um die freie Base des reaktiven Amins zu erhalten. Nach beendeter Umsetzung kann das Konjugat
entweder dünnschiehtchromatographisch oder säulenchromatographisch
gereinigt werden.
Die erfindungsgemäss eingesetzten Verbindungen von biologischem Interesse müssen mindestens eine primäre oder sekundäre Aminogruppe
oder eine Hydroxylgruppe aufweisen', über die eine Umsetzung und Verknüpfung mit einem Kohlenstoffatom des Triazinrings
möglich ist. Diese reaktive Gruppe kann bereits von Natur aus in den biologisch aktiven Verbindungen vorhanden sein, wie
bei Chinidin, Procainamid, Thyroxin und Aminoglycosid-Antibiotika.
Es besteht aber auch die Möglichkeit, diese Gruppen durch Derivatbildung in die Verbindungen einzuführen. Beispiele
_ 6 - BADORJGINAL
für biolt fische irerbIndungen, bei denen die Bildung von Aminoderivater
vor der Herstellung der DTAF-K mjugate erforderlich ist,
sind Theophyllin·, 2-Propyl-pen(.ansäure, Phenobarbital, Phenytoie,
Primidon, Disopyraraj d , Digox;n, Chloramp lenicol, Acety'ls&licylsäure,
Acetaminophen, Carbam>zepin, Desi.^ramin und Nortriptylin,
Nachstehend sind Strukturformeln für besonders bevorzugte
dungender Erfindung wiedergegeben. .
8-Aminomethyltheophyllin » DTAF
ei '
-N
CH2NH
2-Äthyl«>5~aminopentansäure - DTAF
CHCH2CH2CH2NH
■=* 7 -
BAD ORIGINAL
ο ι
2-Propyl-5-aminopentam iure - DTAF
OH
HO-C-CHCH2CH2CH2Nh
CH2CH2CH3
Die Beispiele erläutern die Erfindung. ITAF kann dabei die beiden
möglichen Isomeren bedeuten, wenn nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1
Gentamicin - DTAF
200 mg Gentamicinsulfat werden in 1 ml d ;stilliertem Wasser gelöst.
Der pH-Wert wird mit etwa 0,8 ml 1,0 η Natriumhydroxidlösung auf 9,0 eingestellt. Sodann werden 1O mf DTAF i 1 1,5 ml
Methanol gelöst und "unter Rühren zu der Cent?micinlosung getropft.
Nach 1-stündiger Umsetzungszeit wird das Reaktionsgemisch auf eine mit DEAE-Cellulose mittlerer K?shzahl gepackte
Säule gegeben. Das gebildete Gentamicin-DTAF wird mit 0,1 η Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 eluiert.
Beispiel. 2
Tobramycin - DTAF
250 mg Tobramycin werden in 2 ml 0,1 m (arbonatpuffer vom pH-Wert
9,0 gelöst. 20 mg DTAF werden in 1 ml Methanol gelöst und
zu 1 ml der Tobramycinlösung gegeben. Nach etwa 5 Minuten wird
BAD ORIGINAI
3793 - 9 -
das Reaktionsgemjsch an einer mit 20 ml DEAE-Cellulose gepackten
Säule, die mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 äquilibriert
worden ist, gereinigt. Das Reaktionsprodukt wird mit dem gleichen Puffer eluiert.
Beispiel 3
Amikacin - DTAF
24 mg-Amikacin werden in 0,2 ml Wasser gelöst. 4,5 mg DTAF werden
in 0.2 ml Methanol suspendiert. Diese Suspension wird unter
Rühren zu der Amikacinlösung gegeben. Die kleinen DTAF-Teilchen
gehen ra:ch in Lösung, so dass das Reakti Dnsgemisch nicht gerührt
werden braucht. Nach 30 Minuten wir·! das Reaktionsgemisch
auf eine mit 17 ml DEAE-Cellulose- gepackt e Säule, die mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,1 äquilibriert worden ist, aufge- setzt.
Das Reaktionsprodukt wird mit dem gleichen Puffer eluiert. ·
1,79 g p-Acetamidobenzoesäure und 1,15 g N-Hydroxysuccinimid
werden in 15 ml Pyridin gelöst. Anschliess.end werden'2,3 g
Ν,Ν'-DicyolQhexylcarbodiimid zugesetzt und gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden in einem Kühlschrank gekühlt und
sodann filtriert. Die Kristalle werden mit etwa 2 tnl Aceton
gespült. Sodann wird das vereinigte Pyridin-Aceton-Filtrat'mit
0,88 g N-Äthyläthylendiamin versetzt. Das,Gemisch wird 2 Stunden
gerührt und sodann etwa 24 Stunden in einem Kühlschrank gekühlt. Die erhaltenen Kristalle werden filtriert und mit Aceton
gespült. Die Kristalle (2,0 g) werden in 50 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 6 η Natriumhydroxidlösung auf
den pH-Wert 10 eingestellt. Der weisse Niederschlag wird abfiltriert
und im Kxsikkator getrocknet. Das DTAF-Konjugat wird durch Löeen von äquimolaren Mengen an Desäthyl-N-acetylprocainamid
und DTAF in Methanol gebildet. Die Umsetzung ist in etwa
„ 9 _
I Um V f VW
3793 - - io -
10 Minuten beendet. Das Produkt wird dünnschichtchrornatographisc]
an Kiesulgel unter Verwendung von Chloroform/Aceton (1:1) als
Laufmittel gereinigt.
Beispiel 5
N-p-Acetamidobenzoyläthylendiamin - DTAF
Das Verfahren von Beispiel 4 wird unter Veri-jendung von 0,9 g
Sthylendiamin anstelle von N-Äthyläthylendiamin wiederholt.
Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde gerührt und sodann 1 1/2 Stunden gekühlt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Aceton gespült. Das DTAF-Konjugat wird gemäss Beispiel H hergestellt,
wobei Methanol als Laufmittel verwendet wird.
1,25 g Desäthyl-N-acetylprocainamid von Beispiel k und 0,8 g
Chloracatylchlorid werden in 25 ml Aceton gelöst und 2 Stunden
unter Rickfluss erwärmt. Sodann wird das Gemisch filtriert. Der
nach den Eindampfen des Filtrats zur Trockne erhaltene gelbe
Rückstand und 0,75 g Natriumjodid werden in 20 ml Aceton gelöst
und 1 Stunde unter Rückfluss erwärmt. Sodann wird die "Lösung fLl
triert. Demnach dem Eindampfen des Filtrats zur Trockne erhaltene
rote Rückstand wird in 20 ml Methanol gelcst. Die Lösung
wird mit 20 ml konzentriertem Ammoniak versetzt und 1 1/2 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Nach Abkühlung wi^d das Gemisch
2 mal mit je 20 ml Chloroform extrahiert^ Die vereinigten Extrakte
werden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das DTAF-Konjugat wird gemäss Beispiel 4 hergestellt.
Bei der dünnschichtchromatographischen Reinigung wird Chloroform/Aceton (1:1) als Laufmittel verwendet.
1,1 g Primidon werden in 10 ml konzentrierter Schwefelsäure ge-
- 10 -
3793 - 11 -
löst. Das Reaktionsgemisch wird langsam unter Kühlen mit einer Lösung von 1 ml konzentrierter Salpetersaure in 2 ml konzentrierter Schwefe] säure versetzt.. Sodann wird das Gemisch ^5 * "
Minuten :>ei Raumtemperatur geschüttelt und über 50 ml Eis gegossene
Die gebildeten p-Nitroprimidon-Kristalle werden abfiltriere
und mit Wasser gespült. Die Kristalle (1,17 g) vom Fc 225 bis 228°C werden in 200 ml heissem Äthanol gelöst= 1,5 g
Eispulve" und 100 ml Wasser werden zugesetzt. Das Gemisch wird
bis zum Sieden erhitzt, mit 2 ml konzentrierter Salzsäure ver» · setzt und 2 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Das heisse Gemisch
wird filtriert» Der nach dem Eindampfen ies Filtrats erhaltene Rückstand wird in 100-prozentigem Äthanol gelöst und durch Zusatz
von Diäthyläther ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert= Man erhält 0,8 g braune hygroskopische Kristalle.
Das DTAF-Konjugat wird durch Lösen von 5 mg DTAF und 5 mg der
braunen Kristalle in 0,5 ml Methanol gebildet. Die Reaktion ist in 10 Minuten beendet. Das Konjugat wird dünnschichtchromato·=
graphisch an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform/Methanol" (3s1) als Laufmittel gereinigt. Die endgültige Reinigung wird
dünnschiehtchromatographisch unter Verwendung von Chloroform/
Methanol (2s1) durchgeführt.
Beispiel 8
2~Äthyl-5-atniriopentansäure - DTAF
2~Äthyl-5-atniriopentansäure - DTAF
7j5 g .e^~5-Valerolactam werden unter einer Atmosphäre aus tro.cke»
nem Stickstoff in 60 ml wasserfrei em Tetrahydrofuran gelöst.
Das Reaktionsgefäss wird tropfenweise mit, 90 ml einer 1 „6 m
Lösung von n-Butyllithium in Hexar versetzt und mit einem Trocken
eis/Aceton-Bad gekühlt.. Nach Zusatz des gesamten n-Butyllithium-s
wird das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gekühlt, 30 Minut η unter Rückfluss erwärmt und wieder auf Raumtemperatur
gekühlt ι sämtliche Arbeitsgänge unter wasserfreiem Stickstoff).
Sodann x^ird der Reaktionskolben unter Kühlung in einem Eisbad
langsam mit 8,0 g 1-Bromäthan versetzt. Das Gemisch wird 16
BAD ORIGINAL
3793 ; . . ■ - 12 -
StundenbeL Tauintemperatur gerührt. Sodann werden langsam
100 ml Wasser zubegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Rau
temperatur gerührt. Die organische Phase wird abgetr'nnt. Die wässrige Phase wird mit 50 ml Diäthyläther extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und über Natriumsulfat getrocl·
net. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhält man ein dunkles Öl, das beim Stehenlassen auskristallisiert. Nach Umkristal]
sieren aus Petroläther erhält man 3,8 g Produkt. 2,8g dieses Produkts
wurden 6 Stunden in 25 ml 6 η Salzsäure unter Rückfluss
erwärmt. Nach dem Abdampfen des Wassers erhält man ein dunkles, dickes öl. Das DTAF-Konjugat wird gebildet, indem man äquimolare
Mengen an 2-A'thyl-5-aminopentansäure und DTAF Ln Methanol
löst. Die Reaktion ist in etwa 10 Minuten beendet. Das Produkt wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung
von Chloroform/Methanol (3:1) als Laufmittel gereinigt.
Beispiel 9
D-Thyroxin - DTAF
5 mg DTAF werden in 0,5 ml Methanol gelöst. 5 mg D-Tnyroxin werden
zugegeben. Anschliessend wird Dimethylsulfoxid zugetropft, bis eine klare Lösung entsteht. Hierauf werden 2 Tropfen Triäthylamin
zugesetzt. Nach etwa 16 Stunden wird ein Konjugat gebildet. Das Produkt wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel
unt'3r Verwendung von Chloroform/Methanol (3:1) als Laufmittel
gereinigt.
Beispiel 10
L-Thyroxin - DTAF
Dieses Konjugat wird geoiäss Beispiel 9 hergestellt, wobei aber
L-Thyroxin verwendet wird.
3,3*,5-Trijod-L-thyronin - DTAF
Dieses Konjugat wird gemäss Beispiel 9 hergestellt, wobei man
- 12 - !AB
3793 - 13 -
aber 3,3',5-Trijod-L-thyronin verwendet,
Beispiel 12
S-Atninodibenzocycloheptan - DTAF
Die nachstehend angegebenen Bestandteile werden in 50 ml Methanol gelöst: 8,00 g Ammoniumacetat, 63O mg Natriumcyanoborhydrid
und 2,10 g 10 ,1 i-Dihydro-SH-dibenzOj/T'ajdTcyclohepten-S-on. Die
Lösung wird 24 Stunden unter Rückfluss erwärmt und sodann zur
Trockne eingedampft. Der verbleibende gelbbraune Rückstand wird in 25 ml 2 η Salzsäure gelöst und 2 mal mit je 25 ml Dichlormethan
extrahiert. Sodann wird die wässrige Phase mit 6 η Natriumhydroxidlösung bis zum Erreichen eines pH-Werts von IM versetzt.
Es bildet sich ein braunes öl. Die Lösung fcird 16 Stunden in einem Gefrierschrank gekühlt. Der nach dem Abdampfen des gesamten
Wassers erhaltene Rückstand wird in Methanoi, aufgenommen und filtriert. Nach dem Eindampfen des Filtrats erhält man einen
weissen Rückstand. Das DTAF-Konjugat wird gebildet, indem man
äquimolare Mengen an DTAF und an dem weissen Rückstand in Methanol
list. Das Produkt wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel
unter Verwendung von Chloroform/Aceton (1:1) als Laufmittel gereinigt.
Beispiel 13
Dibenzosuberonhydrazon - DTAF
10 g 10,11~Dihydro-5H-dibenzo_/_~~a,ji7cyclohepten-5=on und 18 g
Dimethylhydrazin werden 24 Stunden in 100-prozentigem Äthanol unter Rückfluss erwärmt. Sodann werden 100 ml destilliertes
Wasser zugesetzt. Die gelbe Lösung wird mit Diäthyläther extrahiert,
bis die Extrakte farblos sind. Die vereinigten Ä'ther·=-
extrakte werden mit 25 ml 2 η Salzsäure gewaschen. Die organische
Phase wird sodann über Natriumsulfat getrocknet urd eingedampft.
Als Rückstand erhält man Dibenzosuberondimethylhydrazon als dickflüssiges, orangefarbenes Öl. Dieses Produkt (2,0 g) wird
- 13 - ;
O UCI/UJ
3793 - 14 -
12 Stunden mit 3 g Hydrazin in 10 ml 100-prozentigem Äthanol unter Rückfluss erwärmt. Das Reaktionsgemis^h wird sodann über
10 ml Eiswasser gegossen und 2 mal- mit je 2'5 ml Di-äthyläther
extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Man erhält Dibenzosuberonhydrazon
als gelbes Öl. Das DTAF-Konjugat wird gemäss Beispiel 12 hergestellt, wobei man Chloroform/Methanol
(3:1) als Laufmittel· verwendet.
5-( (>^-Aminopropyliden)-5H-dibenzo/~a,d7iO , 11-dihydrocyclopenten
DTAF
Gemäss R.D. Hoffsomer, D. Taub und N.L. Wendler, Journal of Or
ganic Chemistry, Bd. 27 (1962), S. 4134 bis 4137 werden 5-(f-Brompropyliden)-5H-dibenzo_/_
a,_d/ 10 ,11-dihydrocyclohepten und
dessen Vorstufe 5-Cyclopropyl-5-hydroxy-5H-dibenzoV~a,d7~10,11-dihydrocyclohepten
hergestellt. Es wird das Verfahren (b) zur Herstellung des Endprodukts, d.h. 5-(/"-Brompropyliden)-5H-dibenzo_/_
a,d/ 10 ,11-dihydrocyclohepten, eingehalten, wobei die
Brompropylidenverbindung anstelle der Chlorpropylidenverbindung verwendet wird. Das DTAF-Konjugat wird gebildet, indem man
äquimolare Mengen an DTAF und Amin in Methanol löst. Sodann wird überschüssiges Triäthylamin zugegeben. Die Umsetzung ist
in 30 Minuten beendet. Das Reaktionsprodukt wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform/Methanol
(2:1) als Laufmittel gereinigt.
Beispiel 15
N-Aminoacetyliminostilben - DTAF
6,0 g Iminodibenzyl werden in 30 ml Chloroform gelöst. Sodann,
werden 6 ml Chloracetylchlorid zugegeben. Das Gemisch wird 45 Minuten unter Rückfluss erwärmt. Nach Zusatz von 60 ml Wasser
wird das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die
Chloroformphase wird abgetrennt und über Natriumsulfat getrock-
- 14 -
3793 - 15 -
net. Der nach dem Eindampfen zur Trockne erhaltene Rückstand wird
in 25 ml Aceton /gelöst und mit einer Lösung von 4,5 g Natriumiodid
in 25 ml Aceton versetzt» Das Gemisch wird 30 Minuten unter
Rückfluss erwärmte- Nach Zusatz von 100 ml Wasser wird das . ·
Reaktiorsprodukt 2 mal mit je 50 ml Chloroform extrahiert und .-sodann : ur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 40 ml Methanol
gelöst, fach Zusatz von 60 ml konzentriertem Ammoniak
wird da:; Gemisch 1 .'.tunde unter Rückfluss erwärmt. Die Lösung
wird zur Trockne .eingedampft. Der Rückstand wird jn 100 ml
Chloroform aufgenonnen- und 2 mal mit je 30 ml 2 η Salzsäure gewaschen.
Die organjsehe Phase wird über Natriumsu■fat getrocknet
und zur Trockne eingedampft. Das DTAF-Konjugat wird hergestellt,
indem man 5 mg DTAF und 5 mg des Amins in 0,5 ml Methanol löst= Das Konjugat bildet sich in 10 Minuten. Es ttfird gemäss
Beispiel 1 2 gereinigt»
Beispiel 16
N-Aminoacetyldesipramin - DTAF
1 j 33 g Desipramin-hydrochlorid und 0,80 g Chloracetylchlorid
werden in 25 ml Chloroform gelöst. Nach 2-stündigem Erwärmen unter Rückfluss wird das Chloroforn abgedampft. Der Rückstand
wird in 25 ml Aceton gelöst,, 0,75 l Natriumiodid werden zugegeben,
DLe Lösung wird 30'Minuten unter Rückfluss erwärmt. Sodann wird die Lösung abfiltriert. Das ausgefallene Salz wird
mit Aceton gespült. Der nach dem Eindampfen des Acetonfiltrats erhaltene Rückstand wird in 20 ml Methanol aufgenommen. Nach
Zusatz von 20 ml konzentriertem Ammoniak ,wird die Lösung 1 Stunde unter Rückfluss erwärmt. Sodann wird das Reaktionsgemisch
mal mit je 25 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft.
Das Konjugat wird hergestellt, indem man je 5 mg DTAF und Amin in 0,5 ml Methanol löst. Zur Lösung des Niederschlags werden
etwa 5 Tropfen Dimethylsulfoxid zugesetzt. Die Umsetzung ist innerhalb von 10 Minuten beendet. Die Reinigung wird gemäss
_ 15 BAD ORIGINAL
O I ΔΌ I UO
3793 - 16 -
Beispiel 12 unter Verwendung von Chloroform/Methanol (3:1) als Laufmittel vorgenommen.
Beispiel 17
8-Aminocnethylthe-ophyllin - DTAF
10 mg DTAF und 5 mg 8-Aminomethyltheophyllin werden in 0,5 ml
Dimethylsulfoxid gelöst. Nach 5 Minuten ist die Reaktion beendet. Das Konjugat wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel
unter Verwendung von Chloroform/Aceton (1:1) als Laufmittel gereinigt.
Beispiel 18
8-Aminomethyltheophyllin - DTAF
Man verfährt wie in Beispiel 17, verwendet aber 8-Aminoäthyltheo
phyllin anstelle des Methylderivats.
Beispiel 19
Chinidin - DTAF
5 mg DTAF und 5 mg wasserfreies Chinidin werden in 0,5 ml Dimethylformamid
gelöst. Nach 16 Stunden ist die Umsetzung beende'. Das Konjugat wird dünnschichtchromatographisch an Kieselgel
unter Verwendung von Chloroform/Methanol (3:1) als Laufmittel gereinigt.
Wie vorstehend erwähnt, lassen sich erfii dungsgemäss hergestellt
fluoreszierend markierte Tracer in einer Reihe von Immuntestverfahren einsetzen. Die nachstehenden Beispiele erläutern die Eignung
von derartigen Tracern bei Fluoreszenzpolarisationstests.
In sämtlichen Beispielen wird das gleiche Grundverfahren angewendet:
BAD ORIGINAL
- 16 -
3793 - 17 -
1) Ein geringes Volumen an Standard oder Testserum wird in ein Teströhrchen gegeben und mit Puffer, verdünnt;
2) ein geringes Volumen an konzentriertem Fluoreszenz-Tracer
mit einem Gehalt an einem oberflächenaktiven Mittel wird sodann
zu jedem Röhrchen gegeben;
3) schliesslich wird ein Volumenteil verdünntes Antiserum zugesetzt;
4) das Reaktionsfemisch wird bei Raumtemperatur inkubier4-.
Beispiel 20 ■ ·
2-Propyl-pentansäure-Test
2-fithyl-5-aminopentansäure-DTAF-Konjugat
1) Puffer: 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt
an 0,01 Prozent (Gew./Vol.) Natriumazid und 0,01 Prozent
(Gew./Vol.) Rinder-^globtflin (BGG).
2) Tracer: 2-Äthyl-5-aminopentansäure-DTAF-Konjugat 50 χ 10 m
in 0,1 m Tris-hydrochlorid-puffer vom pH-Wert 7,8 mit einem
Gehalt an 0,1 Prozent (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat, 0,01
Prozent (Gew-ZVol.) Rinder-/^globulin und 0,01 Prozent (Gew^Vol.)
Natriimazid.
3) Antikörper: Schaf-Antiserum gegen 2^,VxopYlr-p-en%ainsäuxe, mit Puffer
im Verhältnis 1:3,75 verdünnt.
4) Standards oder unbekannte Probe i: Humanserum (oder andere
biologische Flüssigkeiten) mit hinein Gehalt an 2-Propyl-pentansäure
in Konzentrationen von 0 bis
5) "luoreszenzpolarimeter'. Gerät mit dem die Polarisation der
_Q
Fluoreszenz einer 1 χ 10 m Fluoresceinlösung auf + 0,001·
PolarLsations€;inheiten abgelesen werden kann.
1) 0,75 ;il Standard oder unbekannte Probe werden in 12 X 75 mm
Kultu: röhrchen (Küvetten) für einmaligen Gebrauch gegeben.
- 17 -
- 18 -
Dies wird durchgeführt, indem man 20 ^l Standard oder unbekannte
Probe zunächst in einen Vorverdünriungsbehälter pipettiert und anschliessend 500 ^l Puffer zugibt. Sodann werden
20^1 der verdünnten Probe in das 12 χ 75-Kulturröhrchen
pipettiert und hierauf 400 ^yI Puffer zugegeben.
2) 40 ^l Tracer und 800 ^l Puffer werden in die Küvette gegeben.
3) 40 ul Antiserum und 800 ^uI Puffer werden in die Küvette gegeb
Der Küvetteninhalt wird vermischt und etwa 15 Minuten bei Rau temperatur inkubiert.
4) Die Fluoreszenzpolarisa.tion wird abgelesen. Typische Ergebnisse
sind in Tabelle I wiedergegeben.
2-Propyl- pentansäure-Konzentration (,ug/ml) |
Polarisation |
0 | 0,217 |
12,5 | 0,186 |
25 | 0,165 |
50 | 0,132 |
100 | 0,099 |
150 | 0,081 |
Die Polarisation ändert sich in regelmässiger Weise mit variierender
Konzentration der 2-*-Propyl-pentansäure, ί·ο dass eine
kurve aufgestellt werden kann. Unbekannte Proben verden in gleicher Weise behandelt. Aus der Polarisation der Fluoreszenz
der unbekannten Probe kann die Valproasäurek inzentration in der unbekannten Probe durch Vergleich mit der '.i.chkurve
bestimmt werden.
1) Puffer: (vgl. 2-Propyl-pentansäure-Test) """ "
-...·· BAD ORIGINAL
- 19 -
2) Tracer: Gentamicin-DTAF in einer Konzentration von 100 naiiomolar
in Tris-hydrochlori'l-puffer vom pH-Wert 7 }5 mit einem
Gehalt an 0,125 Prozent Nutriumdodecylsulfat, 0,01 Prozent
Natriumazid und 0,01 Prozent Rinder-^-globulin.
3) Antikörper: Kaninchen- oder Schaf-An.t i seren gegen Gentamicin,
in geeigneter Weise mit Puffer verdüm t„
4) Standards oder1 unbekannte Proben: Humanserum (oder andere
biologische Flüssigkeiten) mit einem Gehalt an Gentamicin=
5) Fluoreszenzpolarimeter: (vgl., 2-Propyl-pentansäure-Test).
1) 1,8 ^uI Standard oder unbekannte Probe werden in 12 χ 75 nm
Kulturröhrchen (Küvette) für den einmaligen Gebrauch gegeben..
Hierzu werden 20 ^uI Probe pipettiert und mit 200 ^l Puffer
versetzt. Sodann werden 20 ^l der verdünnten Probe in die
Küvette pipettierto Hierauf werden -200 ^l Puffer in die Küvette
zugegeben.
2) 4OxUl Tracer und 1000 jdl Puffer werden in die Küvette gegeben.
3) 40^1 Antikörper und 1000 ;ul Puffer werden zugesetzt« Der
Inhalt der Küvette wird vermischt und etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert„
4) Die Fluoreszenzpolarisation wird im Anschluss an die Inkubationszeit
abgelesene Typische Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.
Tabelle II | Polarisation | BAD ORIGINAL |
Gentamicin-Konzentration | 0,178 | |
0 | 0,158 | |
0,5 | 0,140 | |
1,0 | 0,115 | |
2,0 | 0,090 | |
4,0 | 0,074 | |
8,0 | ||
- 19 -
I ί. \J I \J
3793 . - 20 -
Die sich in regelmässiger Weise verändernde Polarisation erlaubt
die Aufstellung einer Eichkurve. Unbekannte Proben werden in identischer Weise untersucht. Der Gehal; an Gentamicin
wird durch Vergleich mit der Eichkurve bestimmt. Der Gentamicin-DTAF-Tracer. ist somit ein wertvolles Hilfsmittel
zur Bestimmung der Gentamicin-Konzentration in biologischen Proben.
N-Acetylprocainamid-Test
Materialien
1) Puffer: (vgl. 2-Propyl-pentansäure-Test)
2) Tracer: Desäthyl-N-acetylprocainamid-DTAF-Konjugat in eine
_Q
Konzentration von 50 χ 10 m in einer 5,75-prozentige η
(Gew-ZVol.) Lösung von Natriumtoluolsulfonat.
3) Antiserum: Kaninchen-Antiserum gegen N-Acetylprocainamid,
im Verhältnis 1:6 in Puffer verdünnt.
4) Standards oder unbekannte Proben: Humanserum (oder andere biologische Flüssigkeiten).
5) Fluoreszenzpolarimeter: (vgl. 2-Propyl-penansäure-Test).
1) 0,48^1 Standard oder unbekannte Probe werden1 Ln eine "Küvette
gebracht, indem man 10 _μ3 der Probe in einen Vorverdünnungsbehälter
pipettiert und mit 200 _ul Puffer verdünnt 10 μΐ der verdünnten Probe werden sodann in die Küvette
pipettiert. Hierauf werden 200^1 Puffer zugesetzt.
2) 40 ^l Tracer und 1000 ^l Puffer werden in die Küvette gegeben.
3) 40^il Antiserum und 1000/il Puffer werden sodann in die
Küvette gegeben. Der Küvetteninhalt wird gemischt und sodann etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
4) Die Fluoreszenzpolarisatipn wird im Anschluß an die 15-minütige
Inkubationsdauer abgelesen. Typische Ergebnisse
- 20 -
BAD ORIGIN/
3793 - 21 -
für N-Acetylprocainamid sind in Tabelle III wiedergegeben.
Tabelle | III |
N-Acetylprocainamid (ug/ml) |
Polarisation |
0 | 0,239 |
1 | 0,218 |
2 | 0,209 |
4 | 0,190 |
8 | 0,173 |
16 | 0,158 . |
Aus den Daten von Tabelle III lässt sich eine Eich) urve aufstellen.
Unbekannte Proben werden in identischer Weise bestimmt. Ihre Konzentration lässt sich mit Hilfe der Eichkurve
ermitteln. Somit ist das Desäthyl-N-acetylprocainamid-DTAF-Konjugat
ein wertvolles Hilfsmittel zur Bestimmung von N-Acetylprocainamid in biologischen Flüssigkeiten.
Ende der Beschreibung
- 21 -
Claims (1)
- 'R.-ING. WALTER Alii T'L'R. DIETER F. MOE F •IPL.-PHYS.M.GRI1 1SOHNEDER itcntanv. alte9h1' \.<nsi μ: ϊ!ι .' !'ι· I:,: ΛιΙιΙι S '.If.icll l'I.CUl"· HOnO M- »!ii'tiHiMMi ι MTs'.:.lUi. !'S■:ι·ΐοιι uiiMüaaΙ«Ί;ι·;ιιιιιιιγ· C'ln'miii'Iu·. Mimu-Ikhi ■1<!X : (O) &2:i'.)U23793ABBOTT LABORATORtES
Ncrth Chicago, Illinois 60064Mit Dichlortria inylaminofluorescein markierte Verbindungen ν η biologischem InteressePatentansprüche1.JFluoraszierence Verbindungen der allgemeinen Formelin der X ein R st von biologischem Interesse mit einem Molekulargewicht ν η weniger als ?000 ist und als real· tiven Substituenten ein primäre oder sekundäre Amingruppe oder eine Hydroxylgruppe aufweist, über 'lie er an ein Kohlenstoffatom des Triazinrin s gebunden ist, und Z ^-Aminofluorescein oderBAD ORIGINAL37935-Aminofluorescein bedeutet, das über die 4-Amino- bzw. 5-Aminogruppe an das Kohlenstoffatom in der 2-Steliung des
Triazinrings gebunden ist.2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X ein Arninop;lycosid-Antibiot5kum ist.3- Verbindungen nach Anspruch ?, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Aminoglycos:i d um Gentamicin handelt.4. Verbindungen nacii Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Aminoglycosid um Tobramyci ι handelt.5. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Aminoglycosid um Amikacin mndelt.6. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X Aminophenobarbital ist.7. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gek nnzeichnet, dass X Desäthyl-N-acetylprocainamid ist.8. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X N-p-Acetamidobehzoyläthylendiamin ist.9- Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X N-Acetamidobenzoyl-N'-äthyl-N'-aminoace yläthylendiamin ist10. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X p-Aminoprimidon ist.11. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X 2-Äthyl-5-aminopentansäure ist.12. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X D-Thyroxin ist.3793 - 3 -13- Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X L-Thyroxin ist.■14. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X 2-Propyl-5-aminopentansäure ist.15. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X 3,3',5-Trijod-L-thyronin ist.16. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurci gekennzeichnet, dass X 2-(2-Aminoäthyl)-5,5-diphenylhydantoin ist.17. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X 8-Aminomethyltheophyllin ist.18. Verbildungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X 8-(2-Aminoäthyl)-theophyllin ist.19- Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X Chinidin ist.'- 3 - BAD ORIGINAL
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