CH631484A5 - Verfahren zum herstellen von proteine und peptide abbauenden enzymen. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum mikrobiologischen Herstellen von Proteine und Peptide 2s hydrolytisch zu Aminosäuren abbauenden Enzymen, sowie nach dem Verfahren hergestellte Enzyme.

Gegenwärtig erzeugt man Proteine und Peptide abbauende Enzyme durch Isolieren derselben aus tierischen Verdauungskanälen, Verdauungsdrüsen, aus sonstigen tieri- 30 sehen Geweben, aus Pflanzengeweben sowie in letzten Jahren auch durch Züchten von diese Enzyme erzeugenden Bakterien, Schimmelpilzen, Hefen und Strahlenpilzen.

Zum grössten Teil sind jedoch die bekannten Proteine und Peptide abbauenden Enzyme Endopeptidasen, d. h. sie bauen 3s die Proteinmoleküle ab, indem sie die Peptidbindungen in den Molekülen spalten. Die Exopeptidasen, d. h. die nahe an den Enden der Moleküle liegende Peptidbindungen hydroly-sierenden, im technischen Masstab isolierbaren und produzierbaren Enzyme, waren gering an der Zahl. Weiterhin sind 40 die Enzyme in den meisten Fällen in ihrer Wirkung höchst spezifisch, d. h. sie brechen ganz genau bestimmte Bindungen auf oder erzeugen entsprechend gewisse Verbindungen,

womit die Auswahl von Enzymen für den praktischen Bedarf in der Technik, in der Lebensmittelfertigung, in Medizin und Forschung unzulänglich war. Ferner ist die Aktivität der bekannten Enzyme in der Proteinhydrolyse unbefriedigend; beispielsweise ist die Protease von Streptomyces griseus, die als das am effektivsten Proteine hydrolysierende Mikrobenenzym gilt, nur imstande, etwa 55% von den Aminosäureresten in Kasein zu Aminosäuren freizusetzen.

Es war Aufgabe der Erfindung, die oben angeführten Nachteile zu beseitigen und ein Verfahren zur Herstellung von neuen, effektiveren Enzymen der vorstehend genannten Art zu schaffen. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens Mc 864/VTTE 8.7 und/oder der Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens MC 865/VTTE 1.9 gezüchtet wird und die betreffenden Enzyme gewonnen werden. «o

Die Bakterienstämme, die zur Art Pseudomonas fluorescens gehören, werden seit 14.4.76 in der Universität Helsinki, Abteilung der Mikrobiologie Viikki, SF-00710 Helsinki 71, Finnland, unter Nummer 864 und 865, und seit 29.4.75 in dem Staatlichen Technischen Forschungszentrum, Laborato- «s rium für Lebensmittelforschung, Biologinkuja 1, SF-02150 Espoo 15, Finnland, unter Nummer Vl'l'E 8.7 und V i i E 1.9 aufbewahrt.

Die neuen Bakterienstämme gemäss der Erfindung sind in der weiter unten stehenden Tabelle 1 charakterisiert. Die Bakterien können in einer Kulturlösung oder auf einem Kultursubstrat in gewöhnlicher Weise gezüchtet werden.

Die Reinigung der Enzyme und/oder ihr Abtrennen für den Gebrauch der Kulturlösung bzw. des Substrats kann unter Anwendung üblicher Verfahren, wie z.B. Zentrifu-gieren, Ausfällen, Filtrieren, Adsorbieren, Chromatographie usw., erfolgen. Ferner kann man zusammen mit den Enzymen an sich bekannte Aktivatoren, Inhibitoren, Puffersubstanzen u. dgl. Stoffe je nach Anwendungszweck und Bedarf einsetzen.

Es ist festgestellt worden, dass die nach dem erfindungsge-mässen Verfahren hergestellten Enzyme effektiv imstande sind, die meisten in Proteinen vorkommenden Peptidbindungen zu hydrolysieren, indem z. B. das Kasein der Milch oder das Coprezipitat der Eiweisstoffe in der Milch durch die jetzt hergestellten Enzyme so hydrolysiert wird, dass lediglich durch Einwirkung der von einem einzigen Bakterienstamm herstammenden Enzyme von den Aminosäureresten der Proteine 60 bis 90% Aminosäuren freigesetzt wurden. Zugleich ist der Abbau der Aminosäuren sehr gering; es fand somit keine Bildung von Schwefelwasserstoff statt. Auch die Entstehung von Ammoniak und Aminen ist gering; beispielsweise hielt sich die Gesamtmenge von Histamin, Tryptamin und Tyramin in den Grenzen von 6 bis 60 mg je 100 g Trockensubstanz.

Tabelle 1

Pseudomonas Pseudomonas fluorescens fluorescens

Mc 865/VTTE 1.9 Mc 864/VTTE 8.7

45

SO

55

Biotyp

Gram-Färbung

Sporenbildung

Beweglichkeit

Flagella

Aurobizität

Heterotrophie Wachstum bei 273 K Wachstum bei 303 K Wachstum bei 308 K Schwefelwasserstoffbildung

Nitratreduktion

Phenylalanindeaminase

Hämolyse

Oxidase

Arginindihydrolase Gelatineverflüssigung Bildung von Levan Bildung von fluoresz. Pigment

Als Kohlenstoffquelle

- Saccharose

- Trehalose

- Maltose

- Mannose

- Mannitol

- Xylose

- Glycerol

- Acetat

- Arginin

- p-Hydroxybenzoesäure

+

1-2 polar absolut, NO3" keine

Alternative +

+

+

G

+

1-2 polar absolut, NO3" keine

Alternative +

+

+

verwendet allein verwendet allein verwendet allein verwendet allein verwendet allein verwendet allein verwendet allein verwendet allein

+ + + +

verwendet verwendet verwendet verwendet nicht verwendet nicht verwendet verwendet verwendet verwendet

3

631484

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Enzyme können auch mit Vorteil dazu eingesetzt werden, bitteren Geschmack hervorrufende Peptide in Lebensmitteln zu zersetzen, z. B. die in einigen Käsearten von Mikrobenlaben oder Bakterien herbeigeführten bitteren Peptide. Ferner können die erfindungsgemässen Enzyme in analytischen und Strukturuntersuchungen der Proteine infolge ihres überragenden Hydrolysiervermögens verwendet werden. Ferner kann man die Enzyme dazu heranziehen, die der Hydrolyse entsprechende umgekehrte Reaktion, die Plasteinbildung, zu katalysieren.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren von den Bakterienstämmen erzeugten Endopeptidasen sind zelläus-sere oder extrazellulare Enzyme, und die Exopeptidasen sind grösstenteils zellinnere oder intrazellulare Enzyme. Die Exopeptidasen werden in einer späteren Phase der Züchtung abgesondert, in der die Zellen beginnen, der Autolyse zu unterliegen. Es wurde festgestellt, dass man die sich abscheidende Exopeptidaseaktivität günstig steigern kann, indem man zur Kulturlösung oder alternativ zum festen Kultursubstrat anionaktive oder nichtionisierbare Tenside zugibt oder auch Tenside in den nach der Züchtung nachfolgenden Behandlungsphasen, wie in der Zellenzertrümmerung, im Waschen und in den Abtrennphasen, benutzt. Bei der Verwendung von Tensiden wurde überraschenderweise wahrgenommen, dass intrazellulare Enzyme in die Kulturlösung bzw. in das feste Substrat übergehen, während das Wachstum der Kultur weiter fortgeht. Die in das Nährsubstrat übergetretene Exopeptidaseaktivität ist hierbei höher als in einer ohne Tensidzusatz erfolgten Züchtung die Gesamt-Exopeptidase-aktivität von Zellen und Substrat. Die Zugabe von Tensid erhöht somit offenbar die Gesamtmenge der während der Züchtung entstehenden zelleninneren Peptidasen. Der Ein-fluss des Tensidzusatzes auf die L-Leu-L-Thyr-Dipeptidase-aktivität bei der Temperatur 28°C ist in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

Tensid

Konz. (%) bei höchster Aktivität

Ohne Tensid Ohne Tensid

Nichtionisierbare

Triton X-100 0.2

Triton X-305 0.2

Triton X-405 0.2

Tween 20 0.2

Tween80 0.1

Cholesterol 0.2

Brij-35 0.2

Anionische

Na-Laurylsulfat 0.2 Na-Dodecylbenzesulfonat 0.2 Dioctylnatriumsulfosuccinat 0.1

Na-Taurocolat 0.5

Na-Dehydroxycholat 0.5

Kationische

Cetylpyridiniumchlorid 0.025

Kombinationen Na-Laurylsulfat+Cholestrol 0.1

Na-Laurylsulfat+Triton 0.15

<24

34 34

<24 <24 <24 <24 <24

24

24 24

io

15

20

25

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Alkylmethylbensylammo- 0.004*0.004 24 niumchlorid+Alkylmethyl-äthylbensylammonium-chlorid

Na-Laurylsulfat+Dodecanol 0.1+0.5 24

Na-Laurylsulfat+Stearyl- 0.1+0.5 alkohol

Teepol GD 53 0.5 24

0.53

1.3 0.10

0.50

Triton X-100 = Polyäthylenglykol-Mono-[a-(l,1,3,3-Tetramethylbutyl)-Phenyl]-Äther, etwa 10 M Äthylenoxyd enthaltend

Triton X-305 = Polyäthylen-Mono-[p-(l,l,3,3-Tetramethyl-butyl)-Phenyl]-Äther

Triton X-305 = enthält etwa 40 M Äthylenoxyd

Tween 20 = Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat

Tween 80 = Polyoxyäthylensorbitanmonooleat

Brij-35 = Polyoxyäthylen-23-Lauryläther

Teepol GD 53 = Alkylbenzen-Sulfonat, Alkoholäthoxysul-

fonat, und Alkoholäthoxylat.

30

35

40

Zeit (h) Aktivität bis zum Einh. je mi Anstieg 27 h der

Aktivität

0.04...0.07 0.13

2.7 0.18 0.11

50

Bei den mittels des Verfahrens aus dem Bakterienstamm Pseudomonas Mc 864/VTTE 8.7 hergestellten extrazellularen Endopeptidasen wurde ein Molekulargewicht von etwa 28 000 und bei den Exopeptidasen Molekulargewichte von 71000 und 62 000 festgestellt. Als intrazellulare Enzyme wurden Exopeptidasefraktionen festgestellt mit Molekulargewichten von 71000 und 33 000; von der letztgenannten Fraktion wurden Spuren auch in den extrazellularen Präparaten festgestellt.

Es wurde festgestellt, dass die Endopeptidasefraktion bei den pH-Werten 6 bis 11 aktiv war, wo die Fraktion zwei deutliche Optimalstellen bei 7,8 und 10,5 aufwies. Diese Enzyme werden durch Cystein aktiviert und durch chelatisierende Verbindungen sowie durch Phenylmethylsulfonylchlorid inaktiviert. Die Exopeptidasefraktion hat mehrere Maxima bei pH-Werten zwischen 5.25 und 10.0 je nach dem Substrat. EDTA verhindert effektiv die Akvtivität bei den pH-Werten 7.0 und 10.0 und in geringerem Mass bei den Werten 6.0,8.0 und 9.0. Die Aktivität bei 9.0 nimmt zu, wenn man das Enzym in Phosphat-Pufferlösung stehen lässt, der Magnesiumsalze zugesetzt worden sind. p-Chloromercuribenzoat tilgt die Dipeptidaseaktivät fast gänzlich im gesamten genannten pH-Intervall. Phenylmethylsulfonylfluorid hat keine herabsetzende Wirkung auf die Exopeptidaseaktivität.

Die Erfindung wird im folgenden eingehend anhand von Ausführungsbeispielen beschrieben.

0.11 0.15

2.6

0.23 Beispiel 1

0.15 55 Der zur Gattung Pseudomonas gehörige Bakterienstamm Mc 864/VTTE 8.7 wurde in einem Nährsubstrat, das Glukose 0.5%, Hefeextrakt 0.5%, fettfreie Trockenmilch 1% und Kaliumdihydrogenphosphat 0.1% enthielt und dessen

4.0 pH-Wert auf 7.0 eingestellt war, bei 23 °C als Rüttelkultur «o gezüchtet. In das Nährsubstrat schied sich von Beginn der

1.1 Züchtung an Endopeptidaseaktivität aus, deren Spiegel sein 3.0 Maximum nach 38,5-stündiger Züchtung erreichte und

4.3 hierbei 0.54 Einh. je ml (Mikromol freigesetzte Tyrosin je Minute bei 30°C) betrug, auf Grund der kaseinhydrolysie-0.82 65 renden Wirkung bestimmt. Der Maximalwert der Exopeptidaseaktivität wurde nach 14-stündiger Züchtung erreicht, mit 0.42 0.047 Einh. je ml (Mikromol freigesetztes Leucin je Minute 2.5 bei 30°C) mit Pepton als Substrat.

631484

Beispiel 2

Peptidasen wurden erzeugt in einem Medium, das 3% Destillierlösung, 0,5% Kaseinhydrolysat und 0,01% Magnesiumsulfat (wie MgSC>4» 7 H2O) enthielt, der pH-Wert des Mediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Ein Substrat bestehend aus Zellen des Stammes Pseudomonas fluorescens VTTE 8.7 wurde zuvor in Schüttelflaschen gezüchtet. Eine biotechnische Labor-Fermentiereinrichtung von 2,5 Liter Volumen wurde für die Enzymerzeugung verwendet, wobei die Züchtungsbedingungen wie folgt waren: Temperatur 28°C, Rührgeschwindigkeit 620 U/min und 1 Liter Luftzufuhr pro Liter Flüssigkeit und Minute. Bei einer anderen Kultur waren die Bedingungen gleich, jedoch wurde Laurylsulfat (Natriumdodecylsulfat) sukzessive über 16 bis 20 Stunden während der Züchtung hinzugefügt, bis eine Endkonzentration von 0,2% erreicht war. Die Ergebnisse, die in den Figuren 1 und 2 dargestellt sind, zeigen, dass die Erträge aller analysierten Enzyme durch die Hinzufügung von Laurylsulfat verbessert wurden und dass die Organismen nach einer Anpassungsdauer weiter wuchsen und Enzyme erzeugten.

Beispiel 3

Bei Verwendung der nach den Beispielen 1 und 2 hergestellten Enzymmischung zum Hydrolysieren von Kasein konnte proteinabbauende Aktivität im pH-Bereich 5.0 bis 11.0 festgestellt werden, mit den Maxima der Aktivität bei pH 7.8 und 10.5. Beim Verwenden der von dem gleichen Enzymgemisch mittels Gelfiltrierens abgeschiedenen Dipeptidase-fraktion zum Abbauen von Dipeptiden konnten deutliche pH-Optima bei pH 5.25,6.3,6.8,8.0,9.0 und 10.0 beobachtet werden.

Beispiel 4

Beim Verwenden des aus den nach Beispiel 1 oder 2 erfolgten Züchtungen mit Ammoniumsulphat ausgefällten Enzymgemisches zum Hydrolysieren des Coprezipitats der Milchproteine bei pH 4.0 und bei 35°C hatten sich nach Erreichen des Gleichgewichtszustands aus 100 g Protein 73.6 g freie Aminosäure ergeben. Von den verschiedenen in den Proteinen enthaltenen Aminosäuren waren hierbei jeweils die folgenden Anteile frei vorhanden:

Alanin Valin

Cystein/Cystin Methionin 5 Icoleucin Leucin Thyrosin Phenylalanin Lysin 10 Histidin Tryptophan Arginin

97% 93% 34% 77% 91% 82% 63% 84% 89% 100% 90% 100%

Asparaginsäure und deren Amid

Threonin

Serin

Prolin

Glutaminsäure und deren Amid Glycin

100% 82% 67% 59% 61% 59%

Beispiel 5

15 Ein Pseudomonas fluorescens-Stamm VTTE 1.9 wurde während 6 Tagen in einem Medium, das 0,1% Glucose, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Trypton und 0,1% Kaliumdihydrogenphos-phat enthielt und dessen pH-Wert auf 6,8 eingestellt war, bei 25°C als eine Oberflächenkultur in Roux-Flaschen gezüchtet. 20 Der Stamm erzeugte proteolytische Enzyme, deren pH-Maximalwerte bei 3,0 und 6,2 lagen. Die Enzyme wurden von dem Medium getrennt durch Ausfällung mit 63 g (NH4)2S04pro 100 ml des Mediums, Stehenlassen über Nacht bei 4°C, Zen-trifugieren und Dialysieren des Niederschlages. Die proteoly-25 tische Aktivität wurde festgestellt durch Hinzufügung von 1 ml der Enzymlösung in 5 ml einer 3%igen Lösung eines auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellten Milchprotein-Coprecipi-tats, Einwirkenlassen bei 50°C über 10 Minuten, Ausfällung der Proteine durch Hinzufügung von 10 ml einer 0,3molaren 30 Lösung von Trichloressigsäure, Filterung und Messung der optischen Dichte bei 280 nm und 10 mm Lichtweg. Eine Erhöhung der optischen Dichte gegenüber der enzymfreien Lösung um den Faktor 4,545 wurde als Einheit der Enzymaktivität genommen. Die Aktivität der Enzyme in der Kultur 35 war 15,6 Einheiten/ml, der Ertrag nach der Ausfällung und Dialyse war 53%. Die Aktivität der gefriergetrockneten Dia-lysate war 14,6 Einheiten/mg. Wenn das Milchprotein-Coprecipitat bei dieser Préparation hydrolisiert wurde, wurden bei Erreichung des Gleichgewichtes 90,2 g freie Ami-40 nosäuren aus 100 g Protein freigesetzt.

Beispiel 6

Beim Erhitzen des gemäss Beispiel 2 hergestellten Enzymgemisches in l/15molarem und 0,4 M Magnesiumsulfat ent-45 haltendem Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0 und bei 60°C blieb die L-Leucyl-L-Tyrosin abbauende Aktivität des Enzyms folgendermassen erhalten: nach 10 Minuten waren von der Aktivität 97% übrig, nach 30 Minuten 88% und nach 60 Minuten 33%.

B

1 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

1. 631484

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zum mikrobiologischen Herstellen von Proteine und Peptide hydrolytisch zu Aminosäuren abbauenden Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens Mc 864/VTTE 8.7 und/oder der Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens Me 865/VTTE

   1.9 gezüchtet wird und die betreffenden Enzyme gewonnen werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten Enzyme intrazellulare Exopeptidasen enthalten, wobei der Kulturlösung oder dem Kultursubstrat anionaktives oder nichtionisierbares Tensid zugesetzt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Laurylsulfat der Bakterienkultur zugesetzt wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert auf 7.0-11.0 einjustiert wird.
5. 5. Enzyme, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.

   10

   IS

   20