CH630410A5 - Process for preparing a biological substance which is bound to a poly(hydroxymethylene) support matrix - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer an Poly(hydroxymethylen)-Trägermatrix gebundenen, biologisch aktiven Substanz und deren Verwendung bei der Affinitätschromatographie.
In den letzten Jahren hat sich eine neue Technik innerhalb der biochemischen Arbeitsmethoden mehr und mehr durchgesetzt, deren primäres Merkmal darin besteht, die Affinität von trägergebundenen, biologisch aktiven Substanzen zu selektiv durchzuführenden Reaktionen einzusetzen.
Über eine spezifische Komplexbildung der trägergebundenen Substanz mit einer zweiten, die in einem Gemisch vorliegt, kann die betreffende Substanz aus dem Gemisch entfernt und gegebenenfalls anschliessend durch Desorption isoliert werden.
Trägergebundene Enzyme bieten den Vorteil, Stoffumwandlungen in präparativen, kontinuierlichen Prozessen durchzuführen und die Reaktionsprodukte enzymfrei zu erhalten. In der biochemischen, enzymatischen Analytik stehen wasserunlösliche Enzyme als mehrfach verwendbare Reagenzien zur Verfügung.
Aufgrund der Eigenschaft der Enzyme, Affinitäten nicht nur gegenüber den Substraten, sondern auch gegenüber den spezifischen Inhibitoren aufzuweisen, hat sich die Gewinnung von Enzyminhibitoren mit Hilfe der Affinitätschromatographie an trägergebundenen Enzymen besonders günstig erwiesen. Andererseits erlaubt die Bindung von Inhibitoren an wasserunlösliche Matrizen die präparative Gewinnung der entsprechenden Enzyme.
Als sogenannte Immunadsorbentien werden Antigene oder Antikörper an wasserunlösliche Matrizen gebunden und erlauben danach die Isolierung der korrespondierenden Antikörper bzw. Antigene.
Als biologisch aktive Substanzen werden entsprechend den vorhergehenden Ausführungen in vivo und in vitro wirksame natürliche und künstlich hergestellte Stoffe verstanden, die im weitesten Sinne als Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, Vitamine, und Hormone bezeichnet werden können. Diese biologisch aktiven Substanzen können, da sie die Wirkprinzipien der wasserunlöslichen Systeme darstellen, Effektoren genannt werden.
Die meisten der bisher beschriebenen trägergebundenen Effektoren sind wesentlich stablier als die entsprechenden Substanzen in Lösung.
Als Trägermaterialien, sogenannte Matrizen, sind vorteilhaft nur solche Stoffe einzusetzen, die neben der Unlöslichkeit in wässrigen Systemen eine möglichst niedrige unspezifische Adsorption aufweisen. Dazu müssen hydrophobe, hydrophile und ionische Wechselwirkungen zwischen Matrize und dem Reaktionspartner des Effektors weitgehend unterbunden werden. Mit Substanzen, die kein Reaktionspartner des Effektors sind, sollte eine Bindung ausgeschlossen sein.
Die bislang verwendeten Matrizen als Träger für biologisch aktive Substanzen können unterteilt werden in diejenigen, die die Effektoren durch physikalische Adsorption binden, dazu gehören Aktivkohle und Glasperlen, und diejenigen, die mit den Effektoren über eine kovalente Bindung mit einander verknüpft sind. Die Letztgenannten schliessen Vinylpolymeren, z.B. Polyacrylsäuren, Polyacrylsäureamide und Amino-, Carboxy- oder Sulfonyl-substituiertes Polystyrol, ferner die Zellulose und ihre Abkömmlinge und schliesslich natürliche und synthetische Polypeptide und Proteine ein. Wegen der ausgeglichenen Wechselwirkung zwischen Matrize und Effektor hat die Verwendung von Kohlenhydraten, insbesondere der Zellulose, des Dextrans, der Stärke, des Agars bzw. deren Abkömmlinge, als Matrize in wässrigen Systemen die höchste Verbreitung gefunden, wenn auch die in diesen Naturstoffen häufig enthaltenen Carboxyl-gruppen wegen ihrer unspezifischen Reaktion als störend empfunden werden. Daneben weisen diese Stoffe eine relativ geringe thermische und chemische Stabilität auf.
Es wurde nun gefunden, dass die Nachteile, die die Koh-lenhydratderivate als Matrizen bei affinitätsabhängigen Reaktionen aufweisen, überwunden werden können, wenn als Matrize Polyhydroxymethylen verwendet wird.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Verbindungen, das in Patentanspruch 1 definiert ist. Die erhaltenen Verbindungen sind gekennzeichnet durch ein wasserunlösliches Poly(hydro-xymethylen), an das eine biologisch aktive Substanz unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität gebunden ist. In diesen Verbindungen a) ist die Trägermatrix Polyhydroxymethylen;
b) sind die biologisch aktiven Substanzen Stoffe, wie Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, andere Plasmaproteine, Blutgruppensubstanzen, Phythämagglutinine, Antibiotika, Vitamine oder Hormone, Peptide oder Aminosäuren oder synthetisch hergestellte Effektoren;
c) sind Polyhydroxymethylen und die biologisch aktiven Substanzen kovalent miteinander direkt oder über eine Zwischenverbindung verknüpft.
Polyhydroxymethylen ist ein synthetisches Polymeres mit einer durchgehenden Kohlenstoff-Kette. Jedes Kohlenstoffatom trägt ein Wasserstoffatom und eine Hydroxylgruppe. Seine Herstellung und seine Eigenschaften sind unter anderem beschrieben von N.D. Field, J.R. Schaefgen, J. Polymer Sei., Vol. 58,533-543 (1962) und G. Smets, K. Hayashi, J. Polymer Sei., Vol. 29,257-274 (1958). Es ist durch basische oder saure Hydrolyse aus Polyvinylencarbonat herstellbar. Im weiteren Sinne ist das Polyhydroxymethylen als Derivat des Polyvinylencarbonats aufzufassen. Die Bindung der Effektoren an das Polyhydroxymethylen kann einerseits durch die Massnahme erreicht werden, die bei der kovalenten Verknüpfung der Effektoren mit der Hydroxylgruppe zum Einsatz kommen, andererseits durch Umsetzung des Poly vi-nylcarbonats über die ebenfalls bekannte aminolytische Reaktion eines Zyklocarbonatringes des Polyvinylcarbonats
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mit einem primären Amin, z.B. mit Hexamethylendiamin, zu Zyklocarbonatgruppen anschliessend zu Hydroxylgruppen einem über eine Urethanbindung mit einem Spacer oder verseift werden:
Effektor substituierten Polyvinylencarbonat, dessen restliche
+ R-NH,
Polyvinylencarbonat
—(jH (jH-
0 0
\c^
0
—CH—
I
OH
n-1
r î
Verseifung
C = 0
I
f|IH R
-CH-
I
OH
-CH-
OH
-CH-
I
OH n-1
C=0
I
NH
I
R
Es ist für die Anwendung der Produkte besonders vorteilhaft, die biologisch aktiven Effektoren nicht direkt mit dem Polyhydroxymethylen umzusetzen, sondern über ein in der Affinitätschromatographie als Arm oder wie im englischen Schrifttum als «Spacer» bezeichnetes Zwischenglied an die Matrix kovalent zu binden.
Die Spacer-Substanzen sind meist Kohlenwasserstoffgerüste der Länge um 1-2 nm. Zwei fuktionelle Endgruppen des Spacers erlauben jeweils die Umsetzung sowohl mit der Matrix als auch mit dem Effektor, wobei bei der Umsetzung mit der Matrix sowohl Polyhydroxymethylen als auch Polyvinylencarbonat unter geeigneten Bedingungen einsetzbar sind.
Besonders einfach erfolgt die Verknüpfung des Effektors an die Matrix nach einer Aktivierung der Hydroxylgruppen des Polyhydroxymethylens mittels Cyanhalogeniden, vorteilhaft mit Bromcyan und einer nachfolgenden Umsetzung der Aminogruppen enthaltenden biologisch aktiven Effektoren über diese aktivierten Gruppen.
Eine weitere Verfahrensvariante beruht darauf, dass in einer Abwandlung der Azid-Methode von Curtius Polyhydroxymethylen wie Polysaccharide mit einer Halogencarbonsäure wie Cloressigsäure im alkalischen Milieu umgesetzt, die entsprechende Säure mit Alkohol verestert, danach der Ester in das Hydrazid überführt und schliesslich das in der Folge resultierende Azid mit der Aminogruppe des Effektorproteins mit der Polyhydroxymethylen-Matrix verknüpft wird.
Eine andere Möglichkeit zur Verknüpfung des Effektors mit einer Polyhydroxymethylen-Matrix besteht in der Acylie-rung der Hydroxylgruppen mit Bromazetylbromid, gefolgt von der Alkylierung der Aminogruppe des Effektors.
Ähnliche Reaktionsverläufe sind beispielsweise durch Umsetzung der Hydroxylgruppen des Trägers mit reaktiven Triazinen zu erreichen, wobei ein Teil der reaktiven Gruppen des Triazins mit der Polyhydroxymethylenverbindung, ein anderer mit Aminogruppen des Effektors in Reaktion tritt.
Diazotierbare aromatische Amine, die über eine weitere reaktive Gruppe mit den Hydroxylgruppen des Trägers einerseits in Verbindung treten können, erlauben auf der anderen Seite die Kupplung mit dazu befähigten, aktivierten Aminosäuren, beispielsweise den Tyrosin oder Histidinre-sten des Proteineffektors.
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Arylaminogruppen enthaltende Vinylsulfonderivate und Schwefelsäurehalbester von ß-Hydroxyäthylsulfonen können mit den Hydroxylgruppen des Trägers zur Reaktion gebracht werden. Sie ermöglichen die Bindung des Effektors nach der vorbeschriebenen Diazotierungsreaktion.
Eine besonders stabile Ätherbindung entsteht bei der Umsetzung der Hydroxylgruppen des Polyhydroxymethylens mit nicht ionenbildenden Epoxiden, die mindenstens 2 reaktive Gruppen enthalten, wie die Epihalohydrine oder die Polyepoxide, beispielsweise Epichlorhydrin oder Bisepoxid.
Neben den hier beispielhaft angeführten Verfahren zur Herstellung der kovalenten Verbindung zwischen der Trägermatrix und dem Proteineffektor oder anderen Effektoren, Hessen sich noch weitere Methoden aufzählen, die zur Reaktion einerseits der Hydroxylgruppen des Polyhydroxymethylens, andererseits bestimmter Gruppierungen des Effektors führen und dadurch die kovalente Verbindung zwischen beiden herstellen, so die bekannte Umsetzung über komplexbildende Metallverbindungen, z.B. Titanverbindungen.
Das Polyhydroxymethylen zeichnet sich neben der erwähnten chemischen und thermischen Stabilität durch vorteilhafte verarbeitungstechnische Eigenschaften aus und führt damit zu einer Überlegenheit gegenüber den bisher als optimal gefundenen Trägermatrizen auf der Basis von natürlichen Kohlenhydraten. Polyhydroxymethylen ist z.B. in Form von Fasern, Fäden, Folien oder sphärischen Partikeln oder vorzugsweise pulverisiertem Material herstellbar, so dass je nach dem Anwendungszweck des daran zu bindenden Effektors die geeignetste Form gewählt werden kann.
Durch die produktionstechnisch lenkbare Grösse der für die Bindung der Effektoren bzw. der Spacer zugänglichen Oberfläche zeigt sich ein weiterer Vorzug des Polyhydroxymethylens gegenüber den Trägermaterialien des Standes der Technik.
Nach den analogen Reaktionsmechanismen, wie sie für die Bindung des Effektors mit der Polyhydroxymethylen-Matrix beschrieben sind, lassen sich auch die Spacersubstanzen an die Matrix binden, wenn z.B. die Spacer als eine der funktionellen Gruppen eine Aminogruppe tragen. Die Einführung eines Spacers bietet jedoch auch die Möglichkeit, für die Bindung des Effektors zusätzlich Reaktionsmöglichkeiten einzuführen. Im Falle, dass der an die Matrix gebundene Spacer
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eine freie Carboxylgruppe trägt, ist diese Carboxylgruppe beispielsweise durch Carbodiimid-Verbindungen aktivierbar, die sodann eine Amidbindung mit Aminogruppen des Effektors einzugehen vermag. Carboxylgruppen lassen ferner die Ausbildung von Amidbindungen mit Hilfe der von Woodward eingeführten Isoxazoliumsalzen zu.
Besitzt der an die Matrix gebundene Spacer eine verfügbare, freie Aminogruppe, so ist mit Arylaminogruppen enthaltenden Vinylsulfonderivaten oder Schwefelsäureestern von ß-Hydroxyäthylsulfonen die Einführung von Arylaminogruppen in der Verlängerung des Spacers möglich, die s sodann nach bekannten Methoden diazotiert und anschliessend mit entsprechend reaktiven Gruppen des Effektors verbunden werden:
z.B.
Ah
OH
/\
0 NH- (CH2) 6-NH-CH2-CH2-S0;
r\_
NH,
Die erfindungsgemäss hergestellten biologisch aktiven Verbindungen eignen sich für die meisten Anwendungsver- 20 fahren, die bisher für andere an hydrophile, wasserunlösliche Träger gebundene Effektoren bekannt geworden sind. Es können demnach Enzyme wasserunlöslich gemacht werden. Die unlöslichen Enzyme werden zunehmend zur Bestimmung von Substraten in Analysenautomaten und als söge- 25 nannte Enzymelektroden verwendet. Wegen der erhöhten Stabilität eignet sich eine Reihe trägergebundener Enzyme für die Durchführung technisch enzymatischer Umsetzungen.
Trägergebundene, biologisch aktive Substanzen haben 38 wegen ihrer Eigenschaft als spezifische Adsorbenzien eine breite Anwendung in der Affinitätschromatographie gefunden. Mit Hilfe von trägergebundenen natürlichen oder synthetischen Enzyminhibitoren gelingt die Hochreinigung von Enzymen, während die Enzyme als Effektoren insbeson- 3S dere zur Gewinnung natürlicher Enzyminhibitoren aus Rohextrakten hervorragend geeignet gefunden wurden. Trägergebundene wasserunlösliche Antigene werden zur Isolierung der zugehörigen Antikörper verwendet, die auf diese Weise frei von anderen Serumbestandteilen und frei von 40 anderen Antigenen erhalten werden. Affinitätschromatogra-phisch können auch nicht präzipitierbare Antikörper sowie solche, die wegen ihrer geringen Konzentration im Serum nicht fällbar sind, isoliert und auch quantitativ bestimmt werden. 45
In den zur Erläuterung der Erfindung nachstehend aufgeführten Beispielen ist aufgezeigt, dass ein nach einem einzigen Verfahren hergestellter Träger sich für die Bindung der verschiedensten Effektoren eignet, und dass der Grundkörper Polyhydroxymethylen durch geeignete Substitution so zur Bindung jedes gewünschten Effektors geeignet gemacht werden kann.
Ferner wird beispielhaft aufgezeigt, wie die matrixgebundenen Effektoren eingesetzt werden können.
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Beispiel 1
Polyhydroxymethylen-Tetanustoxoid-Verbindung
Herstellung der Matrix aus ((O-Amino-n-hexyl)-substitu-iertem Polyhydroxymethylen 60
20 g Polyhydroxymethylen, suspendiert in 900 ml Wasser, werden mit einer Lösung von 20 g BrCN in 50 ml Dimethyl-formamid versetzt und unter Rühren durch langsames Zutropfen von 2 n Natronlauge bei einer Innentemperatur von 15 °C 6 Minuten lang bei einem pH-Wert von 11,5 65
gehalten. Dann wird sofort aubgesaugt, gut mit Eiswasser ausgewaschen und abgepresst. Das so aktivierte, noch wasserfeuchte Polyhydroxymethylen wird zu einer gut gerührten,
bei Raumtemperatur gehaltenen, mitkonc. HCl auf pH 8,5 eingestellten Lösung von 20 g Hexamethylendiamin in 500 ml H2O zugegeben, mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter aufgefüllt, der pH-Wert ständig zwischen 8,5-9,0 einreguliert und noch 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird abgesaugt und gut mit Wasser ausgewaschen. Eine getrocknete Probe des mit (ro-Amino-n-hexyl)-Gruppen substituierten Polyhydroxymethylens hatte einen Stickstoffgehalt von 1,9%. mit Sanger's Reagens zum Nachweis von primären freien Aminogruppen werden intensiv gelb gefärbte Produkte erhalten.
Herstellung des trägergebundenen Effektors
Effektor: Tetanus-Antigen
10 g des Trägers nach Beispiel 1 werden in 200 ml einer 0,5 M Natriumphosphatlösung von pH 10 suspendiert. Die Suspension wird unter Rühren auf 50 °C erwärmt und mit 5 g l-Aminobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäurehalb-ester versetzt. Nach Korrektur des ph-Wertes auf 10 mit 2 M NaOH wird der Ansatz eine Stunde bei 50 °C gerührt. Anschliessend wird über eine Nutsche abfiltriert und mit 21 Wasser, 21 Aceton und 210,2 M HCl gewaschen. Zur Diazo-tierung der in das Polyhydroxymethylen eingeführten Aryl-amingruppen wird der Filterrückstand in 200 ml 0,2 M HCl suspendiert, auf 2 °C abgekühlt und unter Rühren so lange mit 1 M NaNCh-Lösung versetzt, bis mit KJ-Stärke-Papier ein geringer Nitritüberschuss festzustellen ist. Nach 10 Min. wird über eine Nutsche abfiltriert und der Filterrückstand mit 1 Liter einer wässrigen 0,01 M Amidosulfonsäure von 2 °C und anschliessend mit 200 ml 0,2 M Natriumphosphat pH 7,5 von 2 °C gewaschen.
Zur Kupplung wird das Diazoniumgruppen enthaltende Produkt in 150 ml einer Lösung von 2 g Tetanus-Toxoid mit 1260 Lf/mg N in 0,2 M Natriumphosphat pH 7,5 und 2 °C suspendiert und 20 Stunden bei 5 °C gerührt. Nicht gebundene Anteile des Toxoids werden mit 1 Liter 1 M NaCl-Lösung auf einer Nutsche ausgewaschen.
Anwendung der Verbindung Polyhydroxymethylen-Tetanustoxoid
Gewinnung von Tetanus-Antitoxin
10 g des Produktes nach Beispiel 1 werden in 150 ml 0,15 M NaCl-Lösung, mit einem Zusatz von M/15 Natriumphosphat («PBS») pH 7,2 suspendiert und in eine Säule von 3 cm Durchmesser und 10 cm Höhe überführt. 20 ml Tetanus-Pferdeserum mit 1650 IE Tetanus-Antitoxin/ml werden auf die Säule aufgetragen, die anschliessend mit 500 ml PBS pH 7,2 gewaschen wird. Die Elution der Antikörper erfolgt mit 0,5 M Glycin/HCl-Puffer pH 2,5. Das Eluat enthält nach Neutralisation mit 2 M NaOH und nachfolgendem Zentrifu-
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gieren insgesamt 240 mg Protein und, wie in einem Schutzversuch an Mäusen ermittelt wird, 12.300 IE Tetanus-Antitoxin.
Beispiel 2
Polyhydroxymethylen-Aminobenzamidin-Verbindung
Herstellung der Matrix aus (w-Carboxy-n-pentyl)-substitu-iertem Polyhydroxymethylen
20 g Polyhydroxymethylen, nach Beispiel 1 mit BrCN aktiviert, wird zu einer mit verdünnter Natronlauge auf pH 8,5 eingestellten und auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter aufgefüllten, wässrigen Lösung von 25 g e-Aminocapronsäure gegeben. Es wird noch 5 Stunden bei Raumtemperatur und pH 8,5 gerührt und abgesaugt und mit Wasser gut ausgewaschen. Eine getrocknete Probe des mit (co-Carboxy-n-pentyl)-Gruppen substituierten Polyhydroxymethylens hatte einen Stickstoffgehalt von 0,86%.
Herstellung des trägergebundenen Effektors
Effektor: Aminobenzamidin
2 g eines Polyhydroxymethylenderivats, hergestellt nach Beispiel 2, werden in 25 ml 0,1 M Morpholinoäthansulfon-säure suspendiert und mit 1 g l-Äthyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid • HCl versetzt. Durch Zugabe von 2 M HCl unter pH-Kontrole wird der pH-Wert auf 4,8 eingestellt. Unter Rühren wird dem Ansatz 1 g m-Aminobenzamidin zugesetzt. Die Suspension wird unter pH-Korrektur 1 Stunde gerührt und das Adsorbens anschliessend in eine Chromatographie-Säule mit 1 cm Durchmesser überführt. Das Adsorbens wird mit 200 ml 0,05 M Trishydroxymethylaminome-than-HCl-Puffer pH 8,0 mit einem Zusatz von 0,5 M KCl (Tris-KCl) gespült.
Anwendung der Verbindung Polyhydroxymethylen-Ami-nobenzamidin Gewinnung von Thrombin
100 mg Roh-Thrombin vom Rind werden in 5 ml 0,05 M Tris, 0,5 M KCl pH 8,0 gelöst und auf die wie oben präparierte Säule aufgetragen. Die Säule wird anschliessend mit 200 ml Tris-KCl-Puffer gespült. Das an das unlöslich gemachte m-Aminobenzamidin gebundene Thrombin wird von diesem mit 100 ml einer Lösung von 0,05 M m-Aminobenzamidin in Tris-KCl-Puffer abgespalten.
Die Protein enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und über eine 1 x 30 cm Säule Sephadex G-25 in Tris-KCl-Puffer laufen lassen. In dem ersten, das Protein enthaltenden Peak des Säuleneluates konnten durch Bestimmen der Aktivität nach Chase und Shaw, Biochem. 8,1969, S. 2212,78% der Ausgangsaktivität gefunden werden.
Beispiel 3
Polyhydroxymethylen-Pepsin-Verbindung
Herstellung der Matrix aus (cû-Amino-n-hexyl)-substitu-iertem Polyhydroxymethylen:
8,0 g aus Dimethylformamid/Methanol umgefälltes Polyvinylencarbonat, hergestellt nach N.D. Field, J.R. Schaefgen, J. Polymer Sei., Vol. 58, p. 534(1962), wird bei Raumtemperatur in einer Lösung von 7,5 g Hexamethylendiamin in 180 ml Methanol suspendiert und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, abgesaugt, mit Methanol ausgewaschen und in einer Lösung von 10 g Natriummethylat in 300 ml 96%igem Methanol 4 Tage bei Raumtemperatur suspendiert, mit Methanol und dann sehr intensiv mit Wasser ausgewaschen. Eine getrockente Probe des über einen Spacer von 6 CH2-Gruppen mit primären Aminogruppen substituierten Polyhydroxymethylen-Adsorbens hatte einen Stickstoffge-halt von 5,7%.
Herstellung des trägergebundenen Effektors
Effektor: Pepsin
20 g (co-Amino-n-hexyl)-substituiertes Polyhydroxymethylen, hergestellt nach Beispiel 3, werden in 400 ml 0,2 M Natriumphosphat pH 10 suspendiert. Der Suspension werden unter Rühren 40 ml einer 25%igen Glutardialdehyd-lösung zugesetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird über eine Nutsche abfiltiert und der Filterrückstand mit 4 Liter 0,2 M Natriumazetatpuffer pH 4,0 gewaschen. Anschliessend wird das Reaktionsprodukt in 500 ml einer Lösung von 5 g Pepsin mit insgesamt 500 000 Einheiten, bestimmt nach Anson, in 0,2 M Natriumazetat pH 4,0 gegeben und 15 Stunden bei 6°C gerührt. Das danach erhaltene Produkt wird auf einer Nutsche mit 5 Liter 0,1 M Natriumazetat/Essigsäure pH 4,0 und einem Zusatz von 1 M NaCl ausgewaschen.
Anwendung der Verbindung Polyhydroxymethylen- Pepsin
Proteolytische Spaltung von Immunglobulinen
Das Adsorbens nach vorliegendem Beispiel wird in 0,1 M Acetatpuffer pH 4,0 suspendiert und davon eine Aktivitätsbestimmung nach Anson durchgeführt. Die Suspension enthält insgesamt 21 000 Einheiten Pepsin in gebundener und mit diesem Test nachweisbarer Form. Zur proteolytischen Spaltung von Human-Immunglobulin G wird das Pepsin-Adsorbens abfiltriert und der Rückstand in einer 2,5%igen Lösung von 30 g Human IgG in physiologischer NaCl-Lösung pH 4,1 suspendiert. Der Spaltansatz wird 24 Stunden bei 37 °C gerührt. Nach Abfiltrieren des trägergebundenen Pepsins wird das Filtrat mit 1250 ml gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt. Das dabei entstehende Präzipitat wird abzentrifugiert; es enthält das F(ab)2-Fragment des Immunoglobulins mit dessen Antikörperaktivität. Der Abguss wird verworfen.
Beispiel 4
Herstellung der Verbindung Polyhydroxymethylen-Oxaminsäure
10 g Polyhydroxymethylen werden wie in Beispiel 1 beschrieben mit BrCN aktiviert und mit 5 g Tyramin, gelöst in 150 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonat, bei 5 °C durch 60 Minuten langes Rühren umgesetzt. Die nicht gebundenen Anteile des Tyramins werden auf einer Nutsche abfiltriert und der Filterrückstand mit 1 Liter 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 7,0 und 5 °C ausgewaschen. Der Filterrückstand wird in 150 ml einer auf 5 °C abgekühlten Lösung von 1,0 g diazotierter p-Aminophenyloxaminsäure suspendiert und 15 Stunden bei 5 °C gerührt. Das Adsorbens wird auf einer Nutsche mit 1 Liter 0,05 M Natriumacetat-Essigsäure-Puffer pH 5,5 mit einem Zusatz von 2 mM CaCk und 0,2 mM EDTA gewaschen.
Anwendung der Verbindung Polyhydroxymethylen-Oxaminsäure
Gewinnung von Neuraminidase
Das Adsorbens nach Beispiel 4 wird im oben genannten Acetatpuffer resuspendiert und in eine Chromatographie-Säule von 2 cm Durchmesser überführt. Durch diese Säule wird 1 Liter eines Kulturfiltrates von Vibrio Cholerae mit 800 IE Neuraminidase/ml geleitet, das vorher mit 2 M Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt und das mit CaCk und EDTA bis zu einer Konzentration von 2 mM bzw. 0,2 mM versetzt worden war. Die nicht gebundenen Proteine werden mit 500 ml Acetatpuffer ausgewaschen.
Die Elution der an den trägergebundenen Inhibitor adsorbierten Neuraminidase erfolgt durch Waschen der Säule mit 0,1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Sammeln der
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aktive Neuraminidase enthaltenden Fraktionen. Sie enthalten 86% der eingesetzten Aktivität.
Beispiel 5
a) Umsetzung von Polyhydroxymethylen mit Epichlorhy-drin
50 g Polyhydroxymethylen werden in 112 n NaOH suspendiert, mit 250 ml Epichlorhydrin versetzt und 2 Stunden bei 55-60°C gerührt. Der pH-Wert der Suspension sinkt nach kurzer Zeit auf 10-11. Durch Zugabe von NaOH wird noch 1 Std. dieser PH-Wert gehalten. Nach 2 Std. Reaktionszeit wird der Feststoff abgesaugt, mit Wasser, Aceton und zum Schluss wieder mit Wasser gewaschen.
b) 50 g hexamethylendiamin werden in 1,51 Wasser gelöst und mit HCl bis pH 10 versetzt. Zu der Lösung wird das unter 5a) aktivierte Polyhydroxymethylen gegeben und bei 50-55°C 6 Std. gerührt. Danach wird das Produkt abgesaugt und mit Wasser frei von Hexamethylendiamin gewaschen.
c) Das unter Beispiel 5b) erhaltene Produkt wird mit 50 g l-Amonobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester bei 55°C und pH 10 eine Stunde lang gerührt. Anschliessend wird der Feststoff abfiltriert, mit Wasser, Aceton und wieder mit Wasser gewaschen.
d) 10g des unter 5c) erhaltenen Produktes werden auf einer Nutsche mit 200 ml 0,1 n HCl gewaschen und danach in 300 ml 0,5 n HCl suspendiert. Die Suspension wird unter Rühren mit 0,1 n NaN02-Lösung bei 0-4°C versetzt, bis bei der Diazotierung mit KJ-Stärkepapier ein geringer Nitrit-Überschuss festzustellen ist. Nach 10 Min. wird über eine Nutsche abfiltriert und der Rückstand mit Eiswasser und anschliessend mit 0,15 M Natrium-phosphat-Puffer pH 7,5 von 0-4°gewaschen.
e) 0,75 g Albumin werden in 250 ml Phosphatpuffer pH 7,5 gelöst, auf 4°C abgekühlt und das unter 5 d) hergestellte Produkt zugegeben. Die Suspension wird 20 Stunden bei 4°C gerührt, danach abfiltriert und der Feststoff mit
1 M NaCl und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (wässrige 0,9%ige NaCl-Lösung mit einem Gehalt an 1 /15 Mol Na2HP04-KH2P04-Puffer vom pH 7,2) gewaschen.
Filtrat und Waschlaugen werden nach der Methode der radialen Immundiffusion auf Albumin untersucht. Es werden 75 mg Albumin an 1 g des so hergestellten Trägers gebunden.
f) 2,4 g IgM werden in 250 ml Phosphatpuffer pH 7,5 gelöst und auf 4°C abgekühlt. 10 g des nach 5 d) diazotierten Produktes werden zugegeben und die Suspension 20 Std. bei 4°C gerührt. Nach Filtration wird der Feststoff mit
1 M NaCl-Lösung und mit PBS gewaschen.
1 g des nach5 f) hergestellten Trägers binden 240 mg IgM.
Beispiel 6
a) 10g PH M werden wie in Beispiel 5 a)b) beschrieben mit Epichlorhydrin aktiviert, mit Hexamethylendiamin umgesetzt und aufgearbeitet.
b) 10g des so hergestellten Trägers werden bei 10°C und pH 6 mit 5 g Bernsteinsäureanhydrid, die in 200 ml Wasser suspendiert sind, 4 Std. succinoyliert. Der pH-Wert wird mit
2 n NaOH einreguliert. Nach der Waschung des Feststoffes mit Wasser wird das Produkt mit 2,5 g N-Cyclohexyl-N'-(-[N-methylmorpholino]-äthyl)-carbondiimid-p-toluol-sul-fonat bei pH 5 und 5°C 30 Min. gerührt, abfiltriert und schnell mit Eiswasser gewaschen.
c) 1 g IgG werden in 250 ml Phospaht-Puffer pH 7,5 gelöst «nd mit dem unter 6 f) hergestellten Träger 24 Stunden bei 4°C gerührt. Nach Filtration wird das Produkt mit 1 M Koch-
und mit PBS gewaschen.
An 1 ? des Trägers werden 85 mg IgG kovalent gebunden.
Beispiel 7
a) 20 g des unter 5a) hergestellten Produktes werden mit 20 g Aminocapronsäure bei pH 10 und 50-55°C 6 Std. gerührt. Danach wird es abgesaugt und mit Wasser gewa-
s sehen.
b) 10 g des unter 7 a) hergestellten Produktes werden mit 2,5 g N-Cyclohexyl-N'-([N-methylmorpholino]-äthyl)-car-bodiimid-p-toluol-sulfonat versetzt und dazu nach 5 Min. 2 g N-Hydroxysuccinimid bei pH 5 zugegeben. Nach 5 Std.
io Rühren bei 24°C wird der Feststoff abfiltriert und mit Wasser gewaschen.
c) 0,5 g Albumin werden in 200 ml Phosphat-Puffer gelöst und mit dem unter 7 b) hergestellten aktivierten Träger
24 Std. bei 4°C. Nach Filtration wird das Produkt mit 1 M ls Kochsalz und mit PBS gewaschen.
An 1 g des Trägers werden 50 mg Albumin kovalent gebunden.
2o Beispiel 8
10 g PHM werden wie in Beispiel 5 a)b) beschrieben mit Epichlorhydrin aktiviert, mit Hexamethylendiamin umgesetzt und aufgearbeitet.
a) 10 g des so hergestellten Trägers werden in 100 ml 25 Wasser suspendiert und mit 500 ml 25%igem Glutardial-
dehyd umgesetzt. Nach 1 Std. Rühren wird der Feststoff abfiltriert und mit Wasser bzw. PBS gewaschen.
b) 0,5 g Albumin werden in 200 ml Phosphat-Puffer gelöst und mit dem unter 8 a) hergestellten Träger 20 Std. bei 4°C
so gerührt. Nach Filtration wird das Produkt mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen.
Beispiel 9
Direkte Umsetzung von mit Epichlorhydrin aktiviertem 35 Polyhydroxymethylen a) 10 g Polyhydroxymethylen werden mit 50 ml Epichlorhydrin wie in Beispiel 5 a) beschrieben aktiviert. Nach Filtration wird das Produkt schnell mit Wasser, Aceton, Wasser und zum Schluss mit PBS gewaschen.
40 b) 0,5 g Albumin werden in 200 ml PBS gelöst und mit dem unter 9 a) hergestellten Produkt 60 Std. bie 4°C gerührt. Nach Filtration wird das trägergebundene Protein mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen.
45
1 g des so hergestellten Trägers binden 45 mg Albumin.
Beispiel 10
10 g wasserunlösliches Polyhydroxymethylen werden bei so pH 9,5 (0,15 m Na-Bicarbonat/NaOH-Puffer) 3 Tage bei 25°C mit 30 g Diäthylenglykoldiglycidyläther gerührt, das Produkt abgesaugt, gut ausgewaschen und zu 0,5 g Humanalbumin in 200 ml 0,15 m Phospaht-Puffer pH 8 gegeben und 60 Stunden bei 10°C gerührt. Nach Filtration wird das träger-55 gebundene Protein mit 1 M Kochsalzlösung und «PBS» gewaschen.
1 g des so hergestellten Trägers enthält 35 mg gebundenes Albumin.
60
Beispiel 11
10 g Polyhydroxymethylen werden, wie im Beispiel 10 beschrieben, mit 30 g Glycidyltris-(Glycidyläther) umgesetzt, zu 0,5 g Immunglobulin G (IgG) in 200 ml 0,15 m Phospaht-Puffer pH 7,5 gegeben und 60 Stunden bei 4°C gerührt. Nach 65 Filtration wird das Produkt mit 1 M Kochsalzlösung und mit «PBS» gewaschen.
1 g des so hergestellten Proteinharzes enthält 50 mg gebundenes IgG.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung einer, an einer Poly(hydroxy-methylen)-Trägermatrix gebundenen, biologisch aktiven Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass man die biologisch aktive Substanz direkt oder nach Umsetzung mit einer Kupplungskomponente kovalent an Poly(hydroxymethylen) oder Poly(vinylencarbonat) bindet, wobei die Kupplungskomponente mindestens eine zur Bildung einer kovalenten Bindung mit dem Poly(hydroxymethylen) oder Poly(vinylencarbonat) befähigte funktionelle Gruppe und mindestens eine zur Bildung einer kovalenten Bindung mit der biologisch aktiven Substanz befähigte funktionelle Gruppe aufweist, und bei der Verwendung von Poly(vinylencarbonat) die restlichen Car-bonatgruppen hydrolysiert, wobei die Hydrolyse für den Fall, dass die biologisch aktive Substanz über eine Kupplungskomponente an die Trägermatrix gebunden wird, vor der Bindung der biologisch aktiven Substanz an die Trägermatrix vorgenommen wird.
2. An einer Poly(hydroxymethylen)-Trägermatrix gebundene biologisch aktive Substanz, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.
3. Verwendung einer an einer Poly(hydroxymethylen)-Trägermatrix chemisch gebundenen, biologisch aktiven Substanz bei der Affinitätschromatographie.
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