CH617853A5 - Process for the preparation of a tumour polypeptide antigen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidantigens, das monospezifisch ist und in einer grossen Vielzahl menschlicher Krebserkrankungen unterschiedlicher Lokalisierungen vorhanden ist.

Es wurden viele Versuche unternommen, um die Gegenwart von Tumor-reaktiven Antikörpern in Seren zu demonstrieren, die man von Tieren erhalten hat, denen Präparate menschlicher Krebstumore verabreicht wurden. Wenn solche Demonstrationen zeigen würden, dass sie übereinstimmend reproduzierbar sind, würde dies die Anwesenheit wichtiger Antigene in menschlichem Krebsgewebe zeigen, die in normalen Geweben nicht vorhanden sind, und würde so zu einem besseren Verständnis der Natur des neoplastischen Prozesses führen. Zum Zwecke eines besseren Verständnisses von Krebskrankheiten wurde menschliches Krebsgewebe studiert, um die Existenz von monospezifischem, mit Krebs verbundenem Antigen herauszufinden und um vor allem einen reproduzierbaren Weg einer Isolierung und Reinigung eines solchen Antigens zu finden.

In Gegenwart von Antigenen, die mit Adenokarzinomen des Dickdarms und des Verdauungssystems verbunden sind, wurden von Gold et al., J. expt. Med., 121 (1965), Seiten 439 bis 462 und J. expt. Med. 122 (1965), Seiten 467 bis 487 gezeigt. In diesen Berichten wird Bezug genommen auf frühere Arbeiten von B. Björklund, die die Existenz von menschlichem, mit Krebs verbundenem Antigen zeigen, welches bei dem grösseren Teil aller bekannter bösartiger Tumore von Epithelursprung üblich ist, siehe Internat. Arch. Allergy and Appi. Immunol. 1966, 8, Seite 179 und Internat. Arch. Allergy and Appi. Immunol. 1958,12, Seite 241. In der USA-Patentschrift 3 663 684 von Freedman et al. ist ein karzinomembryonisches Antigen beschrieben, das sogenannte «CEA-Aktivität» zeigt. Dieses Antigen ist jedoch vollständig verschieden von dem Antigen der Erfindung, was im einzelnen nachfolgend gezeigt werden wird.

Eine praktisch und gewerblich verwertbare Isolierung von Antigen an sich sowie dessen Verbindung mit verschiedenen

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karzinomatösen Krankheiten wurde bisher nicht erreicht. So war es bisher nicht möglich, menschliches Tumor-Antigen nach praktischen und reproduzierbaren Methoden zu isolieren und zu kennzeichnen oder die Gegenwart des Antigens im Blut von Personen, die unter verborgener oder offener Krebskrankheit leiden, mit Hilfe eines diagnostischen Tests, der für die Untersuchung in einem grossen Massstab geeignet ist, zu beweisen oder auch nur glaubhaft zu machen.

Um die Gegenwart von Antikörpern, die für Tumor-Antigen in tierischen Antiseren spezifisch sind, als ein diagnostisches Mittel voll auszunutzen, muss ein Test entwickelt werden, der das Vorhandensein des Tumor-Antigens in dem Blut des Patienten zeigt. Bisher vorgeschlagene Verfahren erwiesen sich als unwirksam zur Diagnose von Krebserkrankungen.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines Tumor-Polypeptidantigens (CAPA) ist im Patentanspruch 1 definiert.

Bei der charakterisierenden isoelektrischen Ausfällung unter Überführen der Polypeptidmoleküle in die Form von Zwitterionen, werden die im Polypeptidmolekül vorhandenen, basischen Gruppen mit den sauren Gruppen in einer Art von Salzbildung abgesättigt.

Bei der Elution des Gels in Stufe (d) des Patentanspruches 1 wird also eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 10 • 106 bis 20 • 106 erhalten, die in Stufe (e) weiterverarbeitet wird. Dieses Material weist nur scheinbar ein Molekulargewicht in dem angegebenen Bereich auf, da es eigentlich aus einem Agglomerat kleinerer Moleküle besteht, die durch Ionenanziehung und hydrophobe Wechselwirkung, Wasserstoffbrücken usw. miteinander verbunden sind. Dies bewirkt, dass die aus der Gelfiltration erhaltene Fraktion wie ein Material reagiert, das ein Molekulargewicht im angegebenen Bereich von 10 bis 20 • 106 hat, während die eigentlichen Moleküle des Materials ein erheblich niedrigeres Molekulargewicht, auf jeden Fall niedriger als etwa 50 000 aufweisen. Wenn das aus der Gelfiltration eluierte Material in der angegebenen Weise der isoelektrischen Ausfällung und anschliessend der pH-Wert-Gradient-Elution unterworfen sind, werden die Molekularkräfte aufgehoben und ergeben eine Fraktion, die Moleküle mit einem Gewicht im Bereich von etwa 20 000 bis 27 000 haben.

In der Beschreibung wird der Ausdruck «Tumor-Polypep-tidantigen» als «CAPA» abgekürzt.

Das CAPA kann a) zur Diagnose der Anwesenheit von Krebs durch Anzeige des Vorhandenseins von zirkulierendem CAPA und b) für die Herstellung von Antikörpern, die gegenüber solchem CAPA monospezifisch sind, verwendet werden.

Ein Material, das CAPA-Aktivität besitzt, wird mit Hilfe des Verfahrens isoliert und gereinigt, indem man bösartige Gewebe von Autopsien homogenisiert und Karzinomgewebe verschiedener Typen und Stellen sammelt, um eine Tumoransammlung zu erhalten. Ein stattdessen verwendbares Ausgangsmaterial ist Gewebe aus menschlicher Plazenta oder Kulturen bösartiger Zellen in vitro (bezüglich der Einzelheiten bei solchen Kulturen, siehe B. Björklund, V. Björklund und I. Hdlöf, J. Nat. Cancer Inst., 26, Seiten 533 bis 545 (1961) und «Antigenicity of Pooled Human Malignant and Normal Tissues by Cytoimmunological Technique. III. Distribution of Tumor Antigen»), Normale Gewebe werden parallel zu den bösartigen Geweben ebenfalls gesammelt, und um eine brauchbare Verfahrensstufenfolge, die zu einer Isolierung eines reinen Antigens führt, zu erreichen, wurde ein neues Testverfahren entwickelt, das durch die anliegende Fïg. 1 erläutert wird. So wurde die Anwendung biochemischer Trennmethoden durch eine empfindliche immunologische Prüfmethode gelenkt, die die Entdeckung von weniger als einem ng (Nanogramm) Antigen gestattet. Der grösste Wert der Prüfmethode, wie sie durch

Fig. 1 erläutert wird, beruht auf deren Selektivität. Antigenun-terschiede zwischen zu vergleichenden Extrakten wurden gegen einen Hintergrund unwichtiger Ähnlichkeiten deutlich gemacht, wobei die Versuchsanordnung als eine Rückkopplungskontrolle einer Reihe chemischer Verfahren dient, die so variiert wurden, dass sie zu Tumorfraktionen von

1. maximaler Antigenreaktivität mit Antitumorseren, die von normalen Antigenen absorbiert wurden, und

2. minimaler Antigenreaktivität mit Antitumorseren, die von Tumor-Antigenen absorbiert wurden, führten. Für zusätzliche Kontrollzwecke wurden auch Tumorfraktionen minimaler Reaktivität mit antinormalen Seren, die von normalen oder Tumor-Antigenen absorbiert wurden, erstellt.

Krebsgewebe und normale Gewebe werden im gefrorenem Zustand mit Wasser mit einer Temperatur von etwa 0° C vermischt und auf solche Weise homogenisiert, dass sie keine überschüssige Reibungswärme erzeugen, die eine Inaktivie-rung des betreffenden CAPA verursachen würde. Die Temperatur der Suspension sollte man nicht über etwa 0° C ansteigen lassen.

Das resultierende kalte Gemisch von flüssigem Homogenat und Feststoffen wird mit einem organischen Lösungsmittel mit der Fähigkeit, Lipide, wie neutrale Fette, aufzulösen, wie beispielsweise Aceton oder Äthyläther, bei einer Temperatur bei etwa 0° C vermischt, wobei die Lösungsmittelbehandlung eine Entfernung unter anderem von Lipoidsubstanzen zum Zwecke hat und zur erhöhten Freilegung antigener Gruppen führt. Die Feststoffe werden von dem Gemisch abgetrennt, zweckmässig durch Zentrifugieren, und die wässrige Schicht und die Lösungsmittelschicht werden verworfen. Die Temperatur sollte etwa +4° C nicht überschreiten.

Die gewonnenen Feststoffe werden lyophilisiert, und das lyophilisierte Gewebepulver wird, beispielsweise in einer Kugelmühle aus rostfreiem Stahl, bei einer niedrigen Temperatur gemahlen, vorzugsweise unterhalb etwa 0° C und zweckmässig bei einer Temperatur unterhalb etwa —70° C. Das Mahlen führt zu einem feinen graubraunen Pulver.

Wenn erwünscht, wird das resultierende Pulver mit einer Salzlösung, wie beispielsweise mit einer Kochsalzlösung, bei einem neutralen pH-Wert bei niedriger Temperatur, zweckmässig bei etwa 0° C, extrahiert, wobei die nach dem Zentrifugieren obenliegende Schicht verworfen wird. Das resultierende Sediment kann erneut in kaltem Wasser suspendiert werden, worauf das Sediment gewonnen und lyophilisiert wird. Das resultierende Pulver kann jahrelang in geschlossenen Flaschen bei etwa 4° C gelagert werden.

Bei einem Extrahieren des obigen polypeptidhaltigen Tumorpulvers und des normalen Pulvers mit H20 bei einem alkalischen pH-Wert werden die Extrakte bei der Zugabe von NaCl bei neutralem oder etwas alkalischem pH-Wert trübe. Diese Trübheit beruht hauptsächlich auf der Anwesenheit von Verunreinigungen von Nucleinsäurecharakter. Nach dem Zentrifugieren der mit Salzlösung behandelten Extrakte bleibt die gesamte Aktivität in der klaren darüberstehenden Flüssigkeit. Diese wird isoelektrisch bei saurem pH-Wert, zweckmässig bei etwa 4,8, ausgefällt, und die resultierenden Niederschläge werden in einer wässrigen mit Phosphat gepufferten Lösung eines pH-Wertes von etwa 7,0 aufgelöst.

Die aus dem obigen Verfahren resultierenden Lösungen werden mit einem geeigneten Molekularsiebgel in Perlenform filtriert, was eine Fraktionierung von Verbindungen mit einem Molekulargewichtsbereich von 10 • 106 bis 20 • 106, besonders etwa 15 • 106, gestattet, wobei das Filtriergel mit einem Puffer von etwa neutralem pH-Wert eluiert und die Molekulargewichtsfraktion von 10 • 10® bis 20 • 106, besonders von etwa 15 • 106, gewonnen wird. Das Gel oder Molekularsieb kann unter den Polyacrylamidgelen, vernetzten Dextrangelen, Agarund Agarosegelen sowie äquivalenten Gelen oder Molekular5

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sieben ausgewählt werden, wie Bio-Gel A-50 m [Handelsname für ein Agarosegel der Bio-Rad Laboratories, München, 100 bis 200 Maschen, Ausschussgrenze (Daltons) 50-10®, Fraktionierbereich (Daltons) IO5 bis 50-10®, ungefährer Agarosegehalt 2 %] oder Sepharose 2 B (Handelsname für ein Agarosegel der Pharmacia Fine Chem., Uppsala, Schweden, 60 bis 300 Mikron, Perlen, Fraktionierungsbereich 10s bis 20 • 10®, ungefährer Agarosegehalt 2%). Das Gel wird mit einer geeigneten Pufferlösung bei einem pH-Wert von etwa 7,0, wie Sörensen-Puffer (l/15molare Pufferlösung, bezogen auf die Natrium- und Kaliumphosphate), 1:10 verdünnt, äquilibriert. Der Typ des für diese Gelfiltration verwendeten Molekularsiebs oder Gels ist nicht kritisch, und das einzige Erfordernis in dieser Hinsicht ist jenes, dass es die Fähigkeit haben sollte, Verbindungen in dem oben genannten Molekulargewichtsbereich zu fraktionieren. Ein anderes brauchbares Gel für die Erfindung ist Bio-Gel A-150 m (Bio-Rad Laboratories, 100 bis 200 Maschen, Ausschlussgrenze (Daltons) 150 ■ 10®, Fraktionierungsbereich (Daltons) 10® bis > 150 • 106). Bezüglich weiterer Einzelheiten der Gelfiltrationsmethode wird auf H. Determann, «Gelchromatographie», Springer-Verlag, Ber-lin-Heidelberg-New York, 1967, hingewiesen. Das für die Filtration verwendete Eluiermittel ist eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 7, und in dem Auslauf findet sich die Antigenaktivität in der Fraktion, die diesen Molekulargewichtsbereich enthält, und diese Fraktion wird gewonnen.

Die abgesetzten aktiven Fraktionen aus der obigen Gelfiltration werden in einem geeigneten Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,0, wie einem auf 1:10 verdünnten Sörensen-Puffer, gelöst, und die resultierenden Lösungen werden durch eine Säule filtriert, die mit einem schwachen Ionenaustauscher-Mo-lekularsiebgel mit schwachen Ionenaustauscheigenschaften, wie beispielsweise einem Polyacrylamidgel, wie Bio-Gel P-2 (wie oben definiert) gefüllt ist, wobei die Säule mit einem ähnlichen Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,0 äquilibriert ist. Die Antigenaktivität zeigende Fraktion findet sich als die erste Fraktion der Lösung, die die Säule verlässt, und diese Fraktion wird gewonnen.

Die bei der Chromatographie auf Bio-Gel P-2 wie oben gewonnene Fraktion wird einem speziellen Verfahren unterzogen, das zum Zwecke einer weiteren Reinigung des CAPA entwickelt wurde. Im Prinzip umfasst dieses Verfahren die folgenden Stufen:

Die Fraktion wird der isoelektrischen Ausfällung unter Bildung von Zwitterionen unterworfen, indem man Säure zusetzt, bis die Polypeptide ein Löslichkeitsminimum zeigen.

Die dabei erhaltene Ausfällung wird mit einem geeigneten Gel vermischt, das unter Betrachtung des zur Hand befindlichen Proteingemisches ausgewählt wird. Das resultierende Gemisch von Ausfällung und Gel wird als Schicht auf eine Säule aufgegeben, die ein identisches Gel des gleichen isoelektrischen pH-Wertes enthält, d. h. des pH-Wertes, der für die Proteine isoelektrisch ist und diese in der vorausgehenden Stufe ausgefällt hat. Die Säule wird dann unter allmählicher Steigerung oder Herabsetzung des pH-Wertes eluiert. In dem Eluat sind die gewonnene Fraktion oder gewonnenen Fraktionen jene, die das erwünschte Protein oder die erwünschten Proteine enthalten. Obwohl das Verfahren nach der Erfindung nicht an irgendeine spezielle Theorie gebunden werden soll, wird angenommen, dass die Trennung von Molekülarten des Proteingemisches auf folgende Weise erklärt werden kann:

Die ausgefällten Proteine werden einem Ionenfluss ausgesetzt, der ein Protein nach dem anderen in Lösung bringt. Die für das Löslichmachen der verschiedenen Proteine erforderliche Zeit hängt von der Ionenstärke, dem pH-Wert, der Temperatur und der Fliessgeschwindigkeit ab. Da der Verteilungskoeffizient eines jeden gelösten Proteins geringer ist als der des Ionengradienten, wandert das Protein schneller in das Gel als der Gradient. Folglich wird das Protein wieder ausgefällt und wird stationär, bis es durch die ankommende Ionenfront erneut gelöst wird. Dieses Verfahren wiederholt sich ungezählte Male hintereinander und bewirkt so eine Trennung der Molekülarten, die sich nur etwas voneinander unterscheiden.

Bio-Gel P-2 ist ein vernetztes Polyacrylamid (100 bis 200 Maschen) mit einer Molekulargewichtsausschlussgrenze von etwa 2000, doch ist diese Ausschlussgrenze nicht kritisch. Andere brauchbare Gele sind vernetzte Dextrangele, wie Sepha-dex G-25, das eine Molekulargewichtsausschlussgrenze von etwa 25 000 besitzt, doch ist auch diese Ausschlussgrenze nicht kritisch. Diese Gele sind Molekularsiebe und werden gewöhnlich in Perlenform verwendet. Jedes derartige Molekularsieb-gel mit Molekulargewichtsausschlussgrenzen von wenigstens etwa 2 bis 3000 kann zufriedenstellend verwendet werden. Bezüglich der Molekularsiebgele, die für die Gelfiltration in Verbindung mit einer Gradientenelution gemäss der Erfindung geeignet sind, wird auf Gellotte, Fractionation of Proteins, Peptides and Amino Acids by Gel Filtration, in «New Bio-chemical Separations», Van Nostrand, London/New York, 1964, hingewiesen.

Die normale Fraktion und die CAPA-Fraktion, die bei der obigen Chromatographie gewonnen wurden, werden bei einem pH-Wert von etwa 5 einer Ausfällung der aktiven Substanz unterzogen, wobei das Sediment gewonnen und in Wasser mit einem pH-Wert von etwa 8,5 aufgelöst wird. Der pH-Wert der klaren Lösungen wird dann mit Ameisensäure eingestellt, zweckmässig auf etwa 5,0, und diese Behandlung führt zu einer Ausfällung. Jede Ausfällung wird mit einem Schlamm eines ähnlichen Gels wie oben vermischt, das mit HCOOH-HCOONH4 auf einem pH-Wert von etwa 5,0 äquilibriert wurde. Jedes dieser Gemische wird auf eine wie oben äquilibrierte Gelsäule aufgegeben.

Zum Eluieren der Ausfällungen wurde ein pH-Gradient verwendet, in diesem Fall mit einem nach und nach abnehmenden pH-Wert. Ein geeignetes Puffersystem ist HCOOH-HCOONH4 und NH4HC03-NH3. Die Antigenaktivität findet sich in dem Auslauf im pH-Bereich vom An-fangs-pH bis etwa 3.

Die in dem oben genannten pH-Bereich gewonnene Auslauffraktion enthält das erwünschte CAPA, das durch Gefriertrocknung gewonnen werden kann. Um das Molekulargewicht des CAPA dieser Auslauffraktion zu bestimmen, kann die Fraktion einer Filtration auf einer mit HCOOH-HCOONH4 bei einem pH-Wert von etwa 3,0 äquilibrierten Gelsäule unterzogen werden, wobei das Gel aus der Aufstellung der oben erwähnten ausgewählt wurde und Bio-Gel P-30 (Handelsname für ein Polyacrylamidgel der Bio-Rad Laboratories, München, 100 bis 200 Maschen, Ausschlussgrenze (Daltons) 40 000, Fraktionierbereich (Daltons) 2500 bis 40 000) und Sephadex G-75 oder G-50 (Handelsnamen für Dextrangele der Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, 40 bis 120 und 50 bis 150 Mikron, Fraktionierungsbereich 3 bis 70 000 bzw. 1 bis 30 000) besonders geeignete Gele für die Durchführung dieser Filtrationen sind. Die eluierten Fraktionen von CAPA mit einer Wellenlänge beim spektrophotometrischen Absorptionsmaximum im Bereich von etwa 229 bis etwa 233 nm und einem Molekulargewicht von etwa 20 000 bis etwa 27 000 werden gewonnen.

Das CAPA kann aus der aktiven Fraktion nach der Filtration durch Gefriertrocknung gewonnen und lange Zeit im Vakuum, in der Kälte und in der Dunkelheit gelagert werden.

Das isolierte Material besteht aus einem Polypeptid auf der Grundlage einer einzigen Peptidkette, wie durch Behandlung mit Perameisensäure gezeigt wird. Das CAPA zeigt basische Reaktion und ist bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 1 bis 3,5 löslich. Das ungeschützte Polypeptid denaturiert irreversibel bei neutralen pH-Werten, nämlich bei pH-Werten, die

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etwa 4,5 übersteigen. Das Antigen ist hygroskopisch und wird gelb, inaktiviert und schmierig, wenn es Feuchtigkeit aufnimmt.

Das gereinigte CAPA enthält eine fluoreszierende Gruppe, und diese Gruppe ist Gegenstand einer Aktivierung bei einer Wellenlänge von etwa 288 nm, während sie Licht bei einer Wellenlänge von etwa 350 nm emittiert. Die Fluoreszenz ist proportional zu der CAPA-Menge und kann verwendet werden, um die Gegenwart von Polypeptid während des Verfahrens zu ihrer Isolierung zu bestimmen.

Das CAPA zeigt eine spektrophotometrische Spitzenabsorption bei einer Wellenlänge im Bereich von etwa 229 bis etwa 233 nm. Ausserdem zeigt es eine starke Neigung zur Aggregation und ist auf normalen Filtermedien, die für Sterilisation benützt werden, nicht filtrierbar. Es wurde bewiesen, dass das CAPA aus den Krebszellenwänden stammt, da Antikörper, die durch Injektion des CAPA in einem lebenden Tierkörper gebildet wurden, eine vollständige Lysis oder Zersetzung von Krebszellen in vivo verursachen, wenn solche Zellen dem Einfluss solcher Antikörper ausgesetzt werden.

Wie oben gezeigt wurde, besitzt das Polypeptid ein Molekulargewicht im Bereich von 20 000 bis 27 000, spezieller von etwa 24 000. Analysen zeigen, dass es kein Kohlenhydrat enthält, und die Spektrophotometrie zeigt, dass das CAPA frei von Nucleinsäuren ist. Mit Aminosäureanalysator mit und ohne Oxydation gemachte Analysen stehen in Übereinstimmung mit diesem Molekulargewicht, das durch die Gelfiltration auf Bio-Gel P-30 oder dessen Äquivalent bestimmt wurde.

Das isolierte CAPA kann auf vielen Anwendungsgebieten verwendet werden, wie bei der Herstellung von monospezifischen Antikörpern, für diagnostische Zwecke, für Immunisierungsverfahren, wie als aktiver Bestandteil in Zusammensetzungen, die als Immunisierungsmittel brauchbar sind.

In Verbindung mit der Herstellung von Antikörpern, die bezüglich des Tumor-Polypeptidantigens monospezifisch sind, wurde ein neues Verfahren entwickelt. Wie oben angegeben wurde, denaturiert das ungeschützte CAPA irreversibel bei neutralen pH-Werten, was bedeutet, dass eine Injektion einer sauren Lösung des CAPA in einen lebenden Tierkörper zu einer unmittelbaren Denaturierung des CAPA führt, wenn dieses in Berührung mit den neutralen Körperflüssigkeiten kommt. Um eine solche Denaturierung zu verhindern, wird eine Ölemulsion hergestellt, worin eine wässrige Lösung des CAPA bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 2 bis etwa 3 die eingeschlossene oder disperse Phase ausmacht, die von der Ölphase umgeben ist. Beim Injizieren einer solchen Ölemulsion in einen lebenden Tierkörper wird die saure wässrige Lösung des CAPA durch die umgebende Ölphase geschützt,

wenn sie in Berührung mit den neutralen Körperflüssigkeiten kommt. Auf diese Weise behält das CAPA seine Aktivität in vivo und kann zu den Antikörper produzierenden Zellen befördert werden.

Ein Versuch, die Antigenaktivität in vitro bei neutralen pH-Werten beizubehalten, besteht in der Komplexbildung des CAPA mit einem inerten Protein, wie Menschen- oder Rinderalbumin. Wenn man hiervon Gebrauch macht, bildet sich ein Komplex, der bei neutralen pH-Werten löslich ist, während die Antigenaktivität in vitro beibehalten wird.

Bezüglich einer Krebsdiagnose wurde eine modifizierte Hämagglutinations-Hemmungsmethode entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung der Anwesenheit von CAPA in verschiedenen Stufen der Krebsentwicklung durch Untersuchung von interessierenden Materialien, wie Patientenseren, Geweben, Sekretionen und Extrakten aus lebenden Tierkörpern, einschliesslich beispielsweise Biopsiematerial, chirurgischer Proben, Punktierungen und Abstrichen. Diese neue modifierte Hämagglutinations-Hemmungsmethode besteht aus folgenden Stufen:

a) Herstellung einer Reihe von Proben des zu untersuchenden Materials durch Reihenverdünnung,

b) Zugabe einer vorbestimmten Menge von Antiserum, das die für CAPA spezifischen Antikörper enthält, zu jeder Probe,

c) Zugabe einer vorbestimmten Menge von CAPA auf einem feinteiligen Träger nach Inkubation zu jeder inkubierten Probe,

d) Vergleich der resultierenden Reihe behandelter Proben mit einer Reihe von Kontrollproben abnehmender bekannter Mengen von CAPA, die Hemmung ergeben, und vorbestimmter Mengen von Antiserum, die die Antikörper enthalten, und anschliessende Zugabe einer vorbestimmten Menge von CAPA auf einem ähnlichen feinteiligen Träger zu jeder der Kontrollprobe und e) Bestimmung der Menge an CAPA in dem untersuchten Material durch Vergleich der Probenreihe mit der Kontroll-probenreihe, um das Vorhandensein von Krebs und dessen Entwicklungsstadium herauszufinden.

Zusammensetzungen, die als in vivo aktives Immunisierungsmittel brauchbar sind, enthalten das CAPA zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermaterial.

Durch das folgende Beispiel wird die Erfindung erläutert.

1. Vorbereitungen Isolierung von reinem Antigen

Da gezeigt wurde (Int. Arch. Allergy, 36, Seiten 191 bis 203, (1969), «Systematic Antigenic Change in Human Carcinoma Tissues by Hemagglutination Techniques», von B. Björklund), dass das meiste Krebsgewebe das Antigen enthält, wurden Krebsgewebe verschiedener Typen und von verschiedenen Stellen gesammelt, um eine Tumoransammlung zu bekommen. In diesem Fall bestand die Ansammlung aus makroskopisch reinen, histologisch bestätigten Krebsgeweben von den folgenden Organen (Autopsie): Brust, Bronchien, Blinddarm, Dickdarm, Zwölffingerdarm, Gallenblase, Niere, Kehlkopf, Leber, Lunge, Speiseröhre, Eierstock, Pankreas, Prostata, Mastdarm, Magen, Uterus. Normale Gewebe wurden von einer Reihe von Individuen gesammelt, um eine Ansammlung von Isoantigenen, Gewebeantigenen und Einzelantigenen zu bekommen. Autopsiefälle wurden verwendet, und die Tumordiagnosen wurden histologisch bestätigt. Ausserdem wurde geprüft, dass das betreffende Tumor-Antigen auf Grund seiner immunologischen Kreuzreaktivität mit frischen Tumorgeweben und lebenden Tumorzellen intakt war. Aseptische Vorkehrungen wurden getroffen, wo immer dies möglich war.

2. Herstellung des Tumorpolypeptidantigens

Die Krebsgewebe und die normalen Gewebe von Autopsien wurden getrennt von Nachbargeweben befreit und zu 2 bis 3 cm langen Würfeln zerschnitten, die in 0,9%iger NaCl bei 0° C gewaschen wurden, bis sie kein Blut mehr abgaben. Die gewaschenen Würfel wurden eingefroren und bei -24° C gelagert.

.1. Homogenisierung:

Noch in gefrorenem Zustand wurden die Gewebewürfel mit 10 ml H20 von 0° C je Gramm gefrorenen Gewebes vermischt und in einem gekühlten MSE-Ato-Mischhomogenisator mit rotierenden Messern bei halber Geschwindigkeit für drei Perioden von 1 Minute homogenisiert. Dabei sollte darauf ge-achet werden, dass die Temperatur der Suspension etwas unterhalb 0° C gehalten wird.

Das kalte homogenisierte Gemisch wurde in kalte 100-ml-Polythenflaschen gegossen. 400 ml Suspension und 400 ml Äthyläther von -20° C («Äther ad narcosin PH Nord» mit einem Gehalt von 0,002% Diphenylamin der Skanska Bomulls-krutfabriken AB, Dösjebro, Schweden) wurden in jeder Flasche miteinander vermischt und 120 Minuten bei -2° C in ei-

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ner International PR-2-Schüttelzentrifuge mit einer Motorgeschwindigkeit von 300 U./min bewegt. Das Gemisch wurde mit 1000 G bei —2° C während 5 Minuten zentrifugiert. Während dieser Stufe mischte sich die Lipidschicht nicht mit der Gewebeschicht. Der Äthyläther und das Lipid wurden verworfen, und eine zweite Extraktion wurde während 60 Minuten durchgeführt, worauf während 5 Minuten zentrifugiert und die Äther-Lipidschicht entfernt wurde. Schliesslich wurde mit 1000 G bei —2° C 30 Minuten zentrifugiert, und die Wasserschicht wurde entfernt, obwohl sie etwas CAPA enthielt. Die verbleibenden unlöslichen Bestandteile wurden genommen, der restliche Äthyläther wurde durch Anlegen von Vakuum während 5 Minuten entfernt.

Das antigene Material wurde in 50 ml H20 von 0° C suspendiert, in 500-ml-Infusionsflaschen überführt und bei —'70° C (Trockeneis und Äthanol) eingefroren.

Es wurde in einem Texvac-Lyophilisator vom Typ IV A (Textor, Bad Soden/Taunus, BRD) bei kontrollierter Temperatur lyophilisiert.

.2. Abtrennung der Feststoffe:

Das lyophilisierte Gewebepulver wurde in einer Kugelmühle aus rostfreiem Stahl («Cytolator», Lars Ljungberg Company, Stockholm, Schweden) bei einer Temperatur von etwa —70° C während 2 Stunden bei 40 U./min gemahlen. Das Mahlen führte zu einem feinen, graubraunen Pulver. Dieses Pulver wurde mit vorgekühltem Äthyläther von —2° C in einer PR-2-Schüttelapparatur mit 300 U./min während 60 Minuten extrahiert und mit 1000 G bei —2° C während 30 Minuten zentrifugiert. Die Ätherschicht wurde entfernt und das Sediment im Vakuum getrocknet. Das resultierende Rohgewebepulver (CTP) kann jahrelang bei 4° C in geschlossenen Flaschen ohne merklichen Aktivitätsverlust gelagert werden.

5 g CTP wurden bei neutralem pH-Wert in 500 ml Kochsalzlösung suspendiert, die sterile Eiswûrfèl enthielt. Die Suspension wurde in einem MSE-Ato-Mischer bei halber Geschwindigkeit für drei Perioden von 1 Minute homogenisiert. Die Temperatur wurde auf 0° C gehalten. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei langsamem Rühren auf 0° C gehalten. Es wurde mit 1000 G bei 0° C 40 Minuten zentrifugiert. Die oben stehende Flüssigkeit wurde weggeworfen.

Das Sediment wurde erneut in 500 ml kalten destillierten Wassers suspendiert und langsam bei 0° C während 30 Minuten gerührt. Nach dem Zentrifugieren mit 1000 G bei 0° C während 40 Minuten wurde die oben schwimmende Schicht weggeworfen. Das verbleibende Sediment wurde in 25 ml kalten destillierten Wassers suspendiert und bei —70° C (Trockeneis und Äthanol) eingefroren. Lyophilisieren führte zu einem gewaschenen Gewebepulver (WTP), das jahrelang in geschlossenen Flaschen bei 4° C gelagert werden kann.

.3. Alkalische Extraktion:

Wässrige Extrakte von CAPA und normalem WTP mit einem pH-Wert von 9,5 wurden hergestellt und lOmal durch isoelektrische Ausfällung bei pH 4,8 und Auflösung des Niederschlages in Vio des Volumens an Wasser von pH 9,5 konzentriert. Das resultierende Konzentrat wurde durch schnelles Erhitzen auf eine Temperatur von 98 bis 100° C stabilisiert, und diese Temperatur wurde 5 bis 10 Minuten beibehalten. Diese Hitzebehandlung zerstört Enzyme, die sonst das CAPA inaktivieren würden. Der stabilisierte Extrakt wurde bei der Zugabe von Salzlösung bei pH 7,5 infolge der Ausfällung restlicher Verunreinigungen von Nucleinsäurecharakter trübe. Um solche restlichen Verunreinigungen auszufällen, wurden 8,0 ml CAPA und normale wässrige Extrakte getrennt durch Zugabe von 0,8 ml einer 10%igen Lösung von NaCl ausgefällt. Nach dem Zentrifugieren mit 27 000 g bei 0° C während 1 Stunde wurde die klare, oben schwimmende Flüssigkeit bei pH 4,8

(pH-Einstellung mit 0,ln HCl oder 0,ln HCOOH) einer isoelektrischen Ausfällung unterzogen. Die Ausfällungen wurden in 2 bis 3 ml m/150 Phosphatpuffer, pH 7,0, gelöst.

.4. Fraktionierung:

Die resultierenden Lösungen, die von Tumor und normalem WTP stammten, wurden mit Bio-Gel A-50 m (wie oben definiert) in gekühlten Säulen mit einem Innendurchmesser von 2,50 cm und einer Länge von 138 cm mit einer Fliessgeschwindigkeit von 6,3 ml/cm2/Std. filtriert. Das Gel wurde mit m/150 Phosphatpuffer von pH 7,0 mit 2% n-Butanol äquilibriert und mit dem gleichen Puffer eluiert. Bei jedem Durchgang wurden 4 bis 8 ml Extrakt mit einem Gehalt einer Gesamtmenge von 50 bis 100 mg Protein verwendet.

Die Antigenaktivität fand sich in der Mittelfraktion des Auslaufs des Tumorextraktes. Anteile von 1,0 ml dieser Fraktion, insgesamt 160 bis 180 ml, wurden 3mal verdünnt und auf verschiedene pH-Werte im Bereich von 2,0 bis 9,0 eingestellt. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Proben auf Küvetten überführt, und ihre Lichtstreuung bei 500 nm wurde bei einem Winkel von 90° gemessen. Die Streuungsintensitäten, aufgetragen gegen den pH-Wert, ergaben ein Maximum bei pH 4,8, wobei dieser pH-Wert der isoelektrische Punkt der Fraktion ist.

Der restliche Teil der aktiven Mittelfraktion wurde bei pH 4,8 mit Hilfe von 0,ln HCl ausgefällt. Zentrifugieren mit 3800 G bei 0° C während 5 Minuten führte zu einer quantitativen Aktivitätsausbeute.

.5. Chromatographische Reinigung:

Um eine weitere Reinigung des CAPA zu bewirken, wurden die sedimentierten aktiven Mittelfraktionen aus fünf Bio-Gel-A-50-m-Säulen in m/150 Phosphatpufferlösung von pH 7,0 (Sörensen-Puffer in 2% n-Butanol) auf 5% des ursprünglichen Auslaufvolumens gelöst. Diese Lösung, die 130 mg Protein in 8,5 ml enthielt, wurde durch eine Bio-Gel P-2-Säule (wie oben definiert wurde) mit einem Verhältnis von Durchmesser zur Höhe von 1/35 und mit einer Fliessgeschwindigkeit von 35 ml/cm2/Std. filtriert. Die Säule war mit m/150 Phosphatpuffer von pH 7,0 (Sörensen-Puffer in 2% n-Butanol) äquilibriert worden. Für jedes mg Protein wurde ein Schichtvolumen von 10 ml zugelassen.

Die erste Fraktion war aktiv und wurde mit dem Eluierpuf-fer von pH 7,0 abgetrennt, während Verunreinigungen auf dem Gel bei der angewendeten niedrigen Ionenstärke absorbiert wurden.

Erfindungsgemässe Ausfällung

Die aktive Substanz wurde bei pH 4,8 mit 0,1m HCOOH ausgefällt und mit 3800 G bei 0° C während 5 Minuten zentrifugiert. Das Sediment wurde in 8,5 ml H20 aufgelöst und der pH-Wert mit 0,1m NH4OH auf 8,5 eingestellt. Die klare Lösung wurde 3mal mit 0,1m HCOOH bei pH 4,8 umgefällt, in der Zentrifuge bei dem gleichen pH-Wert gewaschen und bei pH 8,5 aufgelöst. Das Verschwinden von n-Butanol wurde durch Gas-Flüssigkeitschromatographie verfolgt. Die fertige Lösung wurde in Ampullen gelagert, eingefroren und lyophilisiert. Das resultierende Produkt war ein trockenes, fast weisses Pulver, und dieses Pulver wurde bei —24° C in den evakuierten und dicht verschlossenen Ampullen gelagert.

Ein identisches Verfahren wurde angewendet mit einem entsprechenden Extrakt, der aus normalem Gewebe stammte, und es wurde keine Aktivität gefunden.

.6. Reinstdarstellung:

Für eine weitere Reinigung des bei dem obigen Chromatographieverfahren erhaltenen Produktes wurde ein Eluierver-fahren mit pH-Gradient entwickelt. Dieses Verfahren besteht im Prinzip aus folgenden Stufen: Das bezüglich seiner aktiven

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Komponente zu reinigende Proteingemisch wird durch eine isoelektrische Einstellung des pH-Wertes ausgefällt. Die Ausfällung wird mit einem geeigneten Gel vermischt, wie beispielsweise mit Sephadex G-25 (wie es oben definiert wurde) oder mit Bio-Gel P-2 (wie es oben definiert wurde). Dieses Gemisch wird als Schicht auf eine Säule aufgegeben, die ein identisches Gel mit dem gleichen isoelektrischen pH-Wert enthält. Die Säule wird dann einer Eluierung mit pH-Gradient unter konstanter Fliessgeschwindigkeit und Temperatur unterzogen. So wird die Säule mit einem Medium mit kontinuierlich oder stufenweise steigendem oder fallendem pH-Wert eluiert.

Im vorliegenden Fall erfolgte das Eluieren mit pH-Gradient mit 15 mg lyophilisiertem und salzfreiem CAPA-Pulver und normalem Antigenpulver, das gemäss dem vorausgehenden Abschnitt gereinigt worden war, und in diesem Fall wurden abnehmende pH-Werte angewendet. Die Pulver wurden getrennt in H20 gelöst, und der pH-Wert wurde mit 0,ln NR,OH auf 8,5 eingestellt. Der pH-Wert der klaren Lösungen wurde dann mit 0,ln HCOOH auf 5,0 eingestellt, was zu einer Ausfällung führte. Jeder Niederschlag wurde mit 10 ml Bio-Gel P-2 Schlamm, der mit einer aus 0,02m HCOOH und 0,02m HCOONH4 hergestellten wässrigen Lösung unter Herstellung eines pH-Wertes von 5,0 äquilibriert worden war, vermischt. Jedes dieser Gemische wurde auf eine mit Silikon behandelte 15 ml Bio-Gel P-2-Säule mit einem Innendurchmesser von 16 mm und einer Länge von 150 mm aufgegeben, die wie oben äquilibriert worden war. Das Gel wurde von einem kleinen Stück Glaswolle gehalten.

Es wurde ein pH-Gradient zum Eluieren der Niederschläge verwendet. Mit Hilfe eines Gradientenmischers (Ultrograd, LKB, Schweden) wurde der pH-Wert während einer kurzen Zeit auf etwa 5 gehalten, um den Niederschlag zu waschen, und dann wurde der pH-Wert allmählich auf 2,8 gesenkt. Schliesslich wurde der pH-Wert auf 9 gesteigert. Das Puffersystem umfasste 0,02m HCOOH-HCOONH4 und 0,02m NH4HCO3-NH3, und das Eluieren erfolgte bei Raumtemperatur. Die Fliessgeschwindigkeit wurde auf 27,2 ml/cm2 Säulenquerschnitt je Stunde gehalten.

Der Auslauf aus dem Tumorextrakt wurde durch Fluores-zenzspektrometrie (Aktivierung bei 288 nm, Fluoreszenz bei 350 nm emittiert) geprüft. Die zwischen dem Anfangs-pH-Wert und einem pH-Wert von etwa 3 eluierte Fraktion wurde für weitere Verwendung gewonnen. Nach dem Lyophilisieren und Gefriertrocknen konnte das Produkt in dicht verschlossenen Ampullen nach Luftentfernung bei —24° C gelagert werden.

Zur Kennzeichnung der Molekülgrösse und zur Bestätigung der Reinheit wurde das Antigenmaterial in der Form von Lösungen derselben mit Bio-Gel P-30 (wie oben definiert) filtriert, das mit einem Puffer von 0,02m HCOOH—HCOONH4 von pH 3,0 äquilibriert worden war. Das pH-eluierte CAPA wurde in einer kleinen Menge des gleichen Puffers aufgelöst. Die Fliessgeschwindigkeit betrug 3,25 ml/cm2/Std., und die gesammelten Fraktionen umfassten 1,24 ml. Die aktiven Fraktionen zeigten ein spektrophotometrisches Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 229 bis 233 nm und eine Fluoreszenz von 350 nm, wenn sie bei 288 nm aktiviert wurden.

In einem typischen Versuch führten 10,4 mg CAPA, gelöst in 3,0 ml des obigen Puffers, auf einer silikonisierten Bio-Gel P-30-Säule (Innendurchmesser 2,54 cm, Länge 50 cm) zu einer vollständigen Gewinnung der Substanz und der Aktivität. Das Eluiervolumen war verträglich mit einem Molekulargewicht im Bereich von 22 000 bis 24 000. Diese Molekulargewichtswerte wurden durch Vergleich der Eluiervolumina mit jenen von Verbindungen bekannter Molekulargewichte, wie Ribonuclease und Insulin, erhalten. Nach dem Gefriertrocknen erhielt man ein weisses hygroskopisches Pulver, das in der

Kälte und in Abwesenheit von Licht und Sauerstoff gelagert werden kann. Beim Analysieren des Produktes wurden keine Kohlenhydrate und keine Nucleinsäuren gefunden. Analysen mit Hilfe eines Aminosäureanalysators ergaben Übereinstimmung mit dem Molekulargewicht, das durch Gelfiltration bestimmt wurde. Analysen der Aminosäuren zeigen die folgenden Molprozentsätze, wobei die Werte eine Genauigkeit von ±5 % haben. Das berechnete Molekulargewicht war 23 200 ±2500.

Alanin

8,62

Arginin

4,57

Asparaginsäure

10,39

Cystein

0,95

Glutaminsäure

17,04

Glycin

6,87

Histidin

1,00

Isoleucin

4,75

Leucin

10,49

Lysin

3,69

Methionin

1,91

Phenylalanin

2,75

Prolin

3,79

Serin

7,74

Threonin

5,92

Tyrosin

3,21

Valin

6,36

Dieser Aminosäuregehalt entspricht einem theoretischen Stickstoffgehalt von 16,2 bis 17,8%. Bestimmung des Gesamtstickstoffs nach Dumas ergab einen Wert von 17,0± 0,5%. Wie durch Behandlung mit Perameisensäure gezeigt wurde, beruht das Polypeptid auf einer einzelnen Peptidkette. Ausserdem denaturiert das Polypeptid, wenn es nicht durch Komplexbildung mit Albumen geschützt wird, irreversibel bei pH-Werten oberhalb etwa 5.

Herstellung von CAPA-Albumenkomplex

Ein Anteil des CAPA, wie es gemäss Beispiel hergestellt wurde, wird in Ameisensäure (beispielsweise 0,05molarer, der pH-Wert sollte im Bereich von 2 bis 3 liegen) gelöst. Man erhielt eine klare Lösung. Zu dieser Lösung wurde Albumenpul-ver oder eine Lösung von Albumen mit dem gleichen pH-Wert wie die obige Ameisensäurelösung (200 Gewichtsteile Albumen je Gewichtsteil CAPA) zugesetzt, was zu einer klaren Lösung von CAPA und Albumen führte. Sodann wurde der pH-Wert der Lösung langsam durch Zugabe einer Base (beispielsweise einer wässrigen Natronlauge oder von Ammoniak) gesteigert, bis der pH-Wert etwa 7,5 erreichte. Dies führte zu einer klaren Lösung, die CAPA und Albumen in der Form eines Komplexes enthielt.

Diese Lösung mit einem Gehalt von 12 /ig CAPA/ml kann direkt in dem nachfolgend beschriebenen diagnostischen Verfahren verwendet werden, oder der Komplex kann in der Form eines weissen Pulvers durch Gefriertrocknung isoliert werden. Das Pulver ist in der Kälte (+4° C) lange Zeit stabil.

Es wurde durch Experimente gezeigt, dass man eine maximale Ausnutzung der CAPA-Aktivität bei einem Gewichtsverhältnis von Albumen zu CAPA gleich oder oberhalb 200:1 erhält.

Frisches Schafsblut (1 Volumteil) wurde zu steriler Alse-ver-Lösung (1,2 Volumteil) (Alsever-Lösung wird aus 250 g Glukose, 80 g Natriumcitratdihydrat, 42 g NaCl und Wasser auf 101 unter Einstellung des pH-Wertes auf 6,1 mit 10%igem Zitronensäuremonohydrat hergestellt) zugesetzt. Das Gemisch wurde zentrifugiert, und die roten Blutzellen wurden erneut lmal in Alsever-Lösung und 2mal in einer Pufferlösung von pH 6,8 suspendiert. Schliesslich wurde eine Suspension der ros

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ten Blutzellen in dem Puffer von pH 6,8 mit einer Konzentration von 109 Zellen/ml bereitet.

Ein Volumteil der wie oben hergestellten Suspension der roten Blutzellen wurde zu einem Volumteil Pufferlösung von pH 6,8 mit einem Gehalt von 18 wg Gerbsäure je ml unter Rühren zugesetzt. Die so gegerbten roten Blutzellen wurden zentrifugiert und erneut 2mal in Puffer von pH 7,5 suspendiert. Schliesslich wurden die roten Blutzellen in Puffer von 7,5 mit einer Konzentration von 109 Zellen je ml suspendiert.

Ein Anteil des CAPA-Komplexes wurde in einer Pufferlösung von pH 7,5 gelöst und ergab eine Konzentration von 3 ju g CAPA je ml (berechnet auf reines CAPA). Ein Volumteil der oben hergestellten Suspension von gegerbten roten Blutzellen wurde tropfenweise bei 0° C zu einem Volumteil der CAPA-Komplexlösung während 10 Minuten zugesetzt. Die markierten Zellen wurden zentrifugiert und erneut in einer Pufferlösung von pH 7,5 mit einem Gehalt einer stabilisierenden Menge (etwa 1,2 Volumteile je Volumteil) von inertem menschlichem Serum suspendiert, um eine Suspension zu ergeben, die 1,6 +108 markierte Zellen je ml enthielt. Diese markierten Zellen wurden, wie nachfolgend gezeigt, in dem diagnostischen Verfahren verwendet.

Herstellung von Antikörpern

Im Hinblick auf die Tatsache, dass das CAPA irreversibel bei neutralen pH-Werten denaturiert, wie oben aufgezeigt wurde, wurde vermutet, dass parenterale Injektion des Polypeptids nicht zur Produktion von Antikörpern führen würde. Mit Kaninchen durchgeführte Experimente bestätigten dies, und es wurde gefunden, dass keine Antikörper nach der Injektion von Polypeptid-Albumenkomplex bei Kaninchen gebildet wurden. Alle Hämagglutinations-Reaktionen waren negativ.

Um in der Lage zu sein, das Polypeptid in einem aktiven Zustand in Antikörper produzierende Zellen zu überführen, ist es erforderlich, das Polypeptid in der Lösung auf pH-Wer-ten unterhalb etwa 3 (0,02m HCOOH, pH 2,8) zu halten und die Lösung in Öl zu emulgieren, um extrem kleine Tropfen, die von einer schützenden Ölschicht umgeben sind, zu bilden. Die Injektion der Emulsion führte zur Produktion zufriedenstellender Mengen von Antikörpern, die spezifisch mit dem CAPA in Hämagglutinationsreaktionen reagierten, worin Blutzellen mit CAPA markiert waren.

816 Mikrogramm reines CAPA, das aus angesammelten menschlichen Krebstumoren hergestellt worden war, wurden in 1,0 ml 0,02m HCOOH von pH 2,8 aufgelöst. Zu der resultierenden Lösung wurde tropfenweise 1,0 ml Öl (handelsübliches Präparat der Difco Laboratorier, Detroit, Michigan, USA, Bacto-Adjuvant, Freund) unter gleichzeitigem Emulgieren zugesetzt. Das Emulgieren erfolgte nach Freund mit Hilfe einer Injektionsspritze, wobei das Gemisch in der Spritze bis zur Bildung einer gleichförmigen weissen Emulsion mit etwa dergleichen Konsistenz wie Schlagsahne auf- und abgezogen wurde. Ein Tropfen dieser Emulsion wurde mit Eiswasser getestet, um zu bestätigen, dass er getrennt schwamm und intakt geblieben war. Die resultierende halbflüssige Emulsion wurde für subkutane und intramuskuläre Injektionen bei Kaninchen verwendet.

In der ersten Injektion wurde ein sogenannter vollständiger Hilfsstoff verwendet, und in den nachfolgenden Injektionen wurde ein sogenannter unvollständiger Hilfsstoff verwendet. Nach dem anfänglichen Blutablassen von jedem der fünf Kaninchen, um O-Werte zu bestimmen, wurden insgesamt 408 Mikrogramm emulgiertes CAPA bei einem pH-Wert von 2,8 subkutan an jeder rechten und linken Handfläche injiziert. In lOtägigen Intervallen wurden zusätzlich drei Injektionen verabreicht, die erste intramuskulär in jedes Hinterbein und die zweite und dritte subkutan an beiden Vorderseiten bzw. Hinterseiten. Die Auswahl der Injektionsstellen erfolgte, um die

Zugangsbereiche der regionalen Lymphdrüsen auszunutzen. Insgesamt erhielt jedes Kaninchen etwa 1,6 mg CAPA in der Form der Emulsion. 14 und 24 Tage nach der letzten Injektion wurden Testproben von Blut abgenommen, die einer Hämag-glutinationsanalyse bezüglich des Vorhandenseins spezifischer Antikörper gegen CAPA unterzogen wurden. 2 Tage nach der letzten Probenabnahme wurde eine maximale Menge an Blut abgelassen, das in der Form von Serum gewonnen wurde, welches seinerseits steril filtriert und in kleinen Anteilen auf sterile Röhrchen überführt wurde. Diese Röhrchen konnten in der Kälte gelagert werden, wobei sie ihre Spezifität erhielten.

Dignostisches Verfahren

Blutproben wurden von dem Zentralkrankenhaus von Es-kilstuna Schweden, erhalten, und 42 dieser Blutproben stammten von Patienten aus der Infektionsklinik, eine aus der chirurgischen Klinik, zwei aus der Radiotherapie, zehn von Frauen nach dem Gebären, zehn von Nabelschnurblut und zehn von schwangeren Frauen im ersten Drittel und sechs von schwangeren Frauen im zweiten Drittel. Ausserdem wurde Blut von zwanzig 10 Jahre alten Kindern aus Slottsskolan und zehn Proben von älteren gesunden Erwachsenen aus der Privatklinik von Dr. Lundström in Eskilstuna in Schweden besorgt. Aus der chirurgischen und der medizinischen Klinik von Ersta Sjukhus in Stockholm, Schweden, wurden Proben von 44 Patienten, vom Akeshoys Hospital, Proben von 45 Patienten und aus der chirurgischen Klinik von Karolinska Sjukuset in Stockholm, Schweden, Blutproben von 72 Patienten, die für einen möglichen chirurgischen Eingriff vorgesehen waren, beschafft. Die Blutspenderabteilung von Karolinska Sjukhuset in Stockholm, Schweden, lieferte 118 Proben von Spendern im Alter von 20 bis 67 Jahren und mit einem Durchschnittsalter von 37,2 Jahren (Standardabweichung ±11,3 Jahre), und von dem klinischen Zentrallaboratorium dieses Krankenhauses wurden Seren von 29 Patienten erhalten, die in den allgemeinen Abteilungen von Radiumhemmet in Stockholm, Schweden, untersucht wurden, sowie von 12 Patienten in den dortigen gynäkologischen Abteilungen.

Die Gesamtzahl der Blutproben war 431. Bezüglich der 111 Fälle aus Eskilstuna wurde eine klinische Untersuchung und ein medizinischer Bericht ausser für die offensichtlich gesunden Patienten gemacht. Bezüglich der Fälle aus Stockholm wurden für 101 Fälle detaillierte Studien der Patienten und medizinische Berichte angefertigt. In den übrigen Fällen waren andere klinische Diagnosen als bösartige Tumoren zur Hand, und es bestand kein Verdacht auf eine bösartige Krankheit.

Venenblut wurde auf Wassermann-Röhrchen ohne Zusatz überführt und in das Laboratorium gebracht, in einigen Fällen nach der Entfernung von Koagulum und Blutzellen durch Zentrifugieren.

Die Blutanalyse beruhte auf der Indikation des Vorliegens von CAPA mit Hilfe einer modifizierten Hämagglutinations-Hemmungsmethode (Mikromethode). Im Prinzip wurde das folgende Verfahren angewendet:

25 fA von Patientenserum, das mit roten Blutkörperchen vom Schaf absorbiert worden war, wurden in acht Stufen mit doppelter Verdünnung in Linbro IS-MRS-96-Verdünnungs-platten titriert, und dann wurden 25 u\ von spezifischem Antiserum in Grenzverdünnung (etwa 1:2000) jedem Hohlraum zugesetzt. Nach einer Inkubation bei 22° C während 10 Minuten wurden jedem Hohlraum 50 (i\ einer Suspension von etwa 6 bis 8 Millionen roten Blutkörperchen vom Schaf zugesetzt, die entsprechend oben dargestellten Methode gegerbt und mit isoliertem CAPA, das mit menschlichem Albumen verknüpft war, markiert worden waren (etwa 2 bis 4 (ig je 109 Blutkörperchen). Es können auch andere feinteilige Träger, wie Latex, Bentonit und Kollodium an Stelle der roten Blutkörperchen verwendet werden. Die Reaktion wurde mit Hilfe eines ge5

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neigten Spiegels und einer Standardreihe nach 4 bis 24 Stunden Inkubation bei 1 bis 2° C aufgezeichnet. Zu Kontrollzwek-ken wurde folgendes verwendet:

1. Mit CAPA markierte Blutzellen plus Antiserum;

2. mit CAPA markierte Blutzellen ohne Antiserum; 5

3. Patientenserum plus mit menschlichem Albumen markierte Blutzellen;

4. Patientenserum und unbehandelte Blutzellen;

5. mit CAPA markierte Blutzellen und Antikörper in einer Reihe, wo eine Hemmung durch stufenweise Abnahme be- 10 kannter Mengen von CAPA erreicht wird.

Die verwendeten Vefcüinnungsflüssigkeiten enthielten gesammeltes (d. h. von vielen Personen vereinigtes) inaktiviertes neutrales menschliches Serum für die Stabilisierung der Blut- 15 zellen.

CAPA-Reagens wurde aus angesammelten menschlichen Karzinomgeweben hergestellt und entsprechend den obigen Angaben mit Hilfe der Gelfiltration, pH-Gradientenelution, Filtrierung durch Bio-Gel P-30 und Komplexbildung mit AI- 20 bumen gereinigt.

Als Antiserum wurde Pferdeanti-HeLa vom 19. November 1962, absorbiert von normalen Geweben und angesammeltem menschlichem Serum, verwendet. Die Immunisierung erfolgte mit gewaschenen Bruchstücken von HeLa-Zellen, die in Eag- 25 le's-Medium mit einem Gehalt von 20% inaktiviertem menschlichem Serum in flachen Glasflaschen gewachsen waren. Die Zellen waren mit EDTA gewonnen, zentrifugiert und 3mal mit Wasser gewaschen worden. In Gegenwart von CAPA in Patientenserum wurden die Pferdeantikörper neutralisiert, was nicht zu einer Agglutination führte, wenn die mit Polypeptid markierten Blutzellen anschliessend zugesetzt wurden. Die Aufzeichnung erfolgte nach einer steigenden Punktebewertung von 0 bis 6, wobei 0 die Abwesenheit von Hemmung und 6 die maximale Hemmung der Agglutination anzeigt. Das Verhältnis zwischen den Bewertungspunkten und der Konzentration an CAPA je ml Serum ergibt sich aus Tabelle I, die man durch Eichung von Verdünnungen vorbestimmter Mengen an CAPA in neutralem Serum erhielt.

Tabelle I

Ungefähre Eichung der Bewertungspunkte und CAPA-Mengen

Bewertungspunkte fig CAPA/ml

0

È 0,03

1

0,04-0,08

2

0,09-0,12

3

0,13-0,24

4

0,25-0,49

5

0,50-0,99

6

êl,0

Die Aufzeichnungen erfolgten ohne Kenntnis des Gesundheitszustandes der Patienten. Das untersuchte Material wurde gemäss der nachfolgenden Tabelle II eingestuft.

Tabelle II

Anwesenheit von CAPA in 431 Seren von Menschen verschiedener Gruppen nach ganzen Bewertungspunkten von 0 bis 6, durchschnittlichen Bewertungspunkten (M) und Standardabweichungen (SD)

Gruppen ganze Bewertungspunkte

0 1 2 3 4 5 6 Zahl M ± SD

1.

primärer Krebs mit Metastasen

5

4

1

2

12

3,00

+

1,13

2.

ausgedehnter Krebs

4

2

1

4

8

2

1 22

2,91

±

1,82

3.

nicht radikal behandelter Krebs

6

10

15

8

39

1,64

±

0,99

4.

unbehandelter primärer Krebs

3

1

4

2

10

1,50

±

1,18

5.

radikal entfernter Krebs

19

1

1

21

0,14

±

0,19

6.

bösartige Krankheit,

doch kein Krebs

7

3

1

11

0,45

+

0,68

7.

nicht bösartige Krankheit

118

3

3

7

1

132

0,26

±

0,22

8.

gesunde Erwachsene

(M = 71 Jahre)

8

2

10

0,20

±

0,42

9.

Blutspender (M = 39 Jahre)

116

2

118

0,02

±

0,13

10.

10 Jahre alte Kinder

19

1

20

0,10

±

0,44

11.

Neugeborene (Nabelschnurblut)

1

1

1

4

2

1

10

2,80

±

1,48

12.

schwangere Frauen

12

2

2

16

0,38

+

0,72

13.

Frauen nach dem Gebären

8

1

1

10

0,40

+

0,97

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass die höchsten Bewertungspunkte mit den Gruppen erhalten wurden, die durch «primären Krebs mit Metastasen» (lokal), «ausgedehnten Krebs» und «Neugeborene» (Nabelschnurblut) gekennzeichnet sind.

Niedrige Bewertungspunkte erhielt man für Blutspender. Eine mittlere Position bekommt man bei der Gruppe «primärer unbehandelter Krebs» und bei der Gruppe «nicht radikal behandelter Krebs». Bewertungspunkte, die etwa denen der Blutspender gleich waren, fand man in der Gruppe «radikal 65 entfernter Krebs».

Die Mittelwerte für CAPA in allen Gruppen wurden paarweise verglichen und sind in der nachfolgenden Tabelle III gezeigt.

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10

Tabelle III

Statistische Bedeutung3 der Unterschiede zwischen den Bewertungspunkten für die Anwesenheit von CAPA

in Seren von neun Patientenkategorien

Gruppen Bedeutung b des Unterschiedes zwischen den Kategoriezahlen

1.

primärer Krebs mit Metastasen

3,00

±

1,13

0

XX XX

XXX

XXX

XXX

XXX

XXX

2.

ausgedehnter Krebs

2,91

±

1,82

XX XX

XXX

XXX

XXX

XXX

XXX

3.

nicht radikal behandelter

Krebs

1,64

+

0,99

0

XXX

XX

XXX

XXX

XXX

4.

unbehandelter primärer Krebs

1,50

±

1,18

XXX

X

XXX

XX

XXX

5.

radikal entfernter Krebs

0,14

+

0,19

0

0

0

0

6.

bösartige Krankheit,

aber kein Krebs

0,45

+

0,68

0

0

0

7.

nicht bösartige Krankheit

0,26

±

0,22

0

XXXe

8.

9.

alte gesunde Menschen Blutspender

0,20 0,02

+ +

0,42 0,13

0

die Bedeutungstests für die Unterschiede erfolgten mit Hilfe einer ungefähr normalen Verteilungsvariablen Z, die wie folgt definiert ist:

Mt-M2

Z = -

SDt2 SD22

ni n2

wenn Z> 1,96 ist, dann ist die Bedeutung des Unterschiedes x, was 0,01 <P< 0,05 bedeutet;

wenn Z>2,6 ist, dann ist die Bedeutung des Unterschiedes xx, was 0,001 <P<0,01 bedeutet;

wenn Z>3,5 ist, dann ist die Bedeutung des Unterschiedes xxx, was P<0,001 bedeutet.

diese Gruppe schliesst elf positive Tests ein, von denen acht sich auf vermuteten aber nicht bewiesenen Krebs beziehen.

Aus der obigen Tabelle ist klar ersichtlich, dass bei «primärem Krebs mit Metastasen» sowie bei «ausgedehntem Krebs» wesentlich höhere mittlere Bewertungspunkte auftreten als bei allen anderen Gruppen, jedoch mit der Ausnahme von Neugeborenen (siehe auch Tabelle II).

Für die Gruppen «nicht radikal behandelter Krebs» sowie «unbehandelter primärer Krebs» sind die durchschnittlichen Wertungspunkte wesentlich höher als bei allen anderen Gruppen, mit Ausnahme der beiden oben erwähnten, und im Vergleich mit der Gruppe «bösartige Krankheit, aber kein Krebs», gegenüber der der Unterschied wesentlich ist (0,01 < P < 0,05).

Die Gruppen 5 bis 9 zeigen keine wesentlichen gegenseitigen Unterschiede, mit Ausnahme des wesentlichen Unterschiedes zwischen 7 und 9. Dieser Unterschied kann durch die Tatsache erklärt werden, dass unter den Fällen echte, verborgene Krebsfälle vorliegen können, die Bewertungspunkte zwischen 1 und 4 ergeben.

Die positive Indikation in Nabelschnurblut verdient einige Aufmerksamkeit. Um festzustellen, ob das CAPA aus der Plazenta stammt, wurden Stücke eines solchen Gewebes extrahiert. Mengen von 300 mg gefrorenen Plazentagewebes je ml gepufferter physiologischer Kochsalzlösung mit einem pH-Wert 7,5 wurden bei 0° C homogenisiert und mit 1000 G während 30 Minuten bei 0° C in konischen Röhrchen (nach Markham) zentrifugiert. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde hinsichtlich der Anwesenheit von CAPA mit Hilfe der oben beschriebenen Hämagglutinationsmethode getestet. Um die Möglichkeit auszuschliessen, dass die erhaltenen Hemmungsreaktionen durch unspezifische Inaktivierung des reinen, auf die Blutkörperchen aufgebrachten CAPA verursacht wurden, wurden diese Blutkörperchen nach jeder Aufzeichnung geschüttelt, und es wurde eine Standardmenge von Antikörpern, die für CAPA spezifisch sind, zugesetzt. Die Antigeni-naktivierung konnte in jedem dieser Fälle aufgezeigt werden. Als Kontrollmaterial wurde ein Extrakt von Antigenpulver verwendet, das aus menschlichen Krebsgeweben unterschiedlicher Herkunft und unterschiedlicher Lokalisierung gewonnen worden war. Die Ergebnisse zeigen, dass von 26 Plazentas von ebensoviel Individuen alle ohne Ausnahme wesentliche Mengen an CAPA enthielten. Der Mittelwert (der geometrische) für die 26 Plazentas betrug 297 ± 8 Mikrogramm je Gramm 35 feuchtes Gewebe (0,03 %).

Da aus der obigen Untersuchung klar hervorgeht, dass das CAPA in der Plazenta synthetisiert wird, und da die in der Plazenta enthaltenen Gene auch in dem aus der gleichen Eizelle stammenden Wesen vorhanden sein müssen, ist zu fol-40 gern, dass die Fähigkeit oder Kapazität, CAPA zu entwickeln, ein normales Phänomen ist. Normalerweise wird diese Kapazität unterdrückt, da normale Zellen das CAPA nicht in messbaren Mengen enthalten. In Krebszellen jedoch tritt eine Aktivierung der Kapazität auf, die durch ein starkes Vorhanden-45 sein von CAPA in und um die Zellen gekennzeichnet ist. Die Antigene und in einigem Umfang funktionelle Ähnlichkeit zwischen Trophoblastzellen der Plazenta und Krebszellen und der Unterschied bezüglich anderen Zellen des Individuums scheint in der Hinsicht vergleichbar zu sein, dass die Krebs-50 krankheiten auf eine veränderte Kontrolle inhärenter Eigenschaften zurückzuführen sind.

Eine statistische Analyse der experimentellen Ergebnisse zeigt, dass eine sehr bedeutsame Wechselbeziehung zwischen positiver Krebsdiagnose und erhöhter CAPA-Konzentration 55 (P < 0,001) besteht. Das gleiche gilt für die Beziehung zwischen der Grösse der betrachteten Tumormasse und der erhöhten CAPA-Konzentration innerhalb der gleichen Altersgruppen (P < 0,001). Die erhöhte Konzentration an CAPA wurde in Verbindung mit einer grossen Vielzahl unterschiedli-60 eher Krebslokalisierungen gefunden. Unabhängig von der Art und der Lokalisierung der Krebstumore wurde gefunden, dass diese das CAPA enthalten, so dass im Hinblick auf diese Tatsache das CAPA allen bekannten Krebsarten, d. h. bösartigen Tumoren von Epithelursprung, gemeinsam zu sein scheint.

65

Doppelblindprobe Um die Gültigkeit der obigen Schlussfolgerungen weiter zu erhärten, wurde eine Doppelblindprobe unter den am streng-

11

617 853

sten kontrollierten Bedingungen durchgeführt. Verschlüsselte Blutproben wurden von verschiedenen Abteilungen des Zentralkrankenhauses von Eskilstuna in Schweden geliefert. In diesem Fall wurden quantitative Messungen des CAPA-Gehal-tes der Patientenseren durchgeführt.

Die Ergebnisse dieser Doppelblindprobe sowie die Ergebnisse der vorausgehenden Einzelblindprobe sind in Tabellen IV bis VIII nachfolgend zusammengestellt. Darin zeigt Tabelle IV die Gesamtzahl der geprüften Patienten und die Zahl der Krebsdiagnose zeigenden Patienten,

Tabelle V die Zahl der Patienten der unterschiedlichen Gruppen zusammen mit ihrem Durchschnittsalter und den Abweichungen hiervon,

Tabelle VI die Anwesenheit von CAPA in den Seren aller geprüfter Patienten,

Tabelle VII die Prozentsätze der Patienten mit einer CAPA-Konzentration = = 0,15 «g/ml Serum unter Ausschluss der Gruppen 9,10 und 12 der Tabelle V,

Tabelle VIII die Anwesenheit von CAPA in Beziehung zu Tumorlokalisierungen für die Gruppen 1 bis 3 in Tabelle V. Die Stellennummern beziehen sich auf «Cancer Incidence in Sweden 1968», worauf hier Bezug genommen wird.

Tabelle IV Zahl der geprüften Patienten

10

Prüfung

Zahl der Patienten

Zahl der Patienten mit Krebsdiagnose

15

Einzelblindprobe Doppelblindprobe

431 503

104 49

934

153

Tabelle V

Zahl der Patienten verschiedener Gruppen und Durchschnittsalter sowie der Abweichungen hiervon

Gruppen

Einzelblindprobe

Doppelblindprobe

Zahl

Durchschnittsalter

±

Abweichung

Zahl

Durchschnittsalter

+

Abweichung

1. Krebs mit Metastasen

34

72

+

9

14

66

±

10

2. unbehandelter Krebs ohne

Metastasenanzeichen und nicht

radikal behandelter Krebs

49

67

±

11

14

66

+

12

3. radikal entfernter Krebs

21

66

+

15

21

64

+

12

4. bösartige Krankheit, aber kein

Krebs

11

70

±

7

5

58

±

18

5. nicht bösartige Krankheit

132

61

±

22

186

46

+

21

6. gesunde Erwachsene

10

71

±

5

46

36

±

14

7. Blutspender

118

38

±

11

-

-

-

8. 10 Jahre alte und jüngere

Patienten

20

10

±

0

62

2

±

1,5

9. Nabelschnurblut

10

0

±

0

20

0

±

0

10. Frauen nach dem Gebären

10

21

±

3

20

25

±

4

11. schwangere Frauen

16

26

±

4

110

26

±

4,5

12. Krebs in situ

—

—

±

—

5

27

±

6

Insagesamt 431 503

Tabelle VI

Vorhandensein von CAPA in den Seren von 934 Patienten

Gruppen

CAPA

SO^SjUg/m Zahl

(%)

CAPA ä 0,09 fig/ml Zahl

(%)

insgesamt Zahl

(%)

1. Krebs mit Metastasen

9

(19)

39

(81)

48

(100)

2. unbehandelter Krebs ohne

Metastasenanzeichen und nicht

radikal behandelter Krebs

28

(44)

35

(56)

63

(100)

3. radikal entfernter Krebs

36

(86)

6

(14)

42

(100)

4. bösartige Krankheit,

aber kein Krebs

15

(94)

1

(6)

16

(100)

5. nicht bösartige Krankheit

269

(85)

49

(15)

318

(100)

6. gesunde Erwachsene

54

(96)

2

(4)

56

(100)

7. Blutspender

118

(100)

0

(0)

118

(100)

8. 10 Jahre alte und jüngere

Patienten

79

(96)

3

(4)

82

(100)

9. Nabelschnurblut

21

(70)

9

(30)

30

(100)

10. Frauen nach dem Gebären

25

(83)

5

(17)

30

(100)

11. schwangere Frauen

123

(98)

3

(2)

126

(100)

12. Krebs in situ

4

(80)

1

(20)

5

(100)

Insgesamt

781 (84) 153 (16) 934 (100)

617 853

12

Tabelle VII

Prozentsatz der Patienten mit einer CAPA-Konzentration von 0,15 (die Gruppen 9, 10 und 12 der Tabelle V wurden ausgeschlossen)

Gruppen

%

Zahl

1. Krebs mit Metastasen

64

48

2. unbehandelter Krebs ohne

Metastasenanzeichen und nicht

radikal behandelter Krebs

21

63

3. radikal entfernter Krebs

10

42

4. bösartige Krankheit, aber kein

Krebs

0

16

5. nicht bösartige Krankheit

6

318

6. gesunde Erwachsene

0

56

7. Blutspender

0

118

8. 10 Jahre und jüngere Patienten

0

82

11. schwangere Frauen

1

126

Insgesamt 869

Tabelle VIII

Vorhandensein von CAPA in Beziehung zu der Tumorlokalisierung für die Gruppen 1 bis 3

Lokalisierung

Stelle

1. Krebs mit

2.

unbehandelter

3. radikal

Ins

Nr.*

Metastasen

Krebs ohne entfernter gesamt

Metastasen

Krebs

anzeichen und

nicht radikal

behandelter Krebs

g 0,08

S 0,09

<

0,08 ä0,09

g 0,08

g 0,09

B ackenzahnfleisch

144

1

1

2

Nasenrachenraum

146

2

1

3

Speiseröhre

150

1

3

1

1

6

Herzkammer

151

1

2

1

2

8

Dünndarm

151

1

1

Dickdarm

153

2

1

7

6

16

Mastdarm

154

4

1

3

1

14

Gallenblase

155

1

1

1

3

Leber

156

1

• 1

Bauchspeicheldrüse

157

3

1

2

6

Naseneingang usw.

160

1

1

2

Luftröhre, Lunge usw.

162

4

2

5

14

Brustdrüsen

170

2

7

1

3

2

18

Cervix uteri

229

2

3

1

6

Corpus uteri

198

1

1

1

1

1

2

7

Eierstöcke usw.

175

1

4

1

1

2

9

Prostata

177

2

3

3

1

9

Hoden

178

1

1

1

3

Penis usw.

179

1

1

2

Nieren

180

1

3

1

5

Harnblase

181

1

2

3

1

10

bösartige Melanome

190

1

1

2

Schilddrüse

194

1

1

1

2

5

primärer Tumor

unbekannten Ursprungs

1

1

Insgesamt

9

39

28

35

36

6

153

* gemäss «Cancer Incidence in Sweden 1968».

Eine sorgfältige statistische Analyse der in dieser Doppelblindprobe erhaltenen Werte zeigt wiederum die äusserst wichtige Wechselbeziehung zwischen der positiven Krebsdiagnose und einer erhöhten CAPA-Konzentration (P < 0,001). Diese Doppelblindprobe bestätigt auch das Verhältnis zwischen der

Grösse der untersuchten Tumormasse und der erhöhten 65 CAPA-Konzentration innerhalb der gleichen Altersgruppen (P < 0,001). Der erhöhte Serumgehalt an CAPA zeigte sich in Verbindung mit etwa 20 verschiedenen Typen und Lokalisierungen von Krebs. Somit bestätigt die Doppelblindprobe

13

617 853

vollständig die Gültigkeit der neuen Erkenntnisse und ihrer praktischen Brauchbarkeit.

In der Einleitung dieser Beschreibung wurde gesagt, dass das in der USA-Patentschrift 3 663 684 beschriebene Antigen eindeutig von dem Antigen nach der Erfindung verschieden 5 ist. Um den Unterschied zwischen dem bekannten Antigen und dem Antigen nach der Erfindung zu demonstrieren, ist nachfolgend eine detaillierte Übersicht über einige spezifische Unterschiede bezüglich des Verfahrens der Antigenisolierung und bezüglich der Eigenschaften des Antigens aufgeführt. io

CEA

Quelle: Krebs des Dickdarms, Fötus (Mekonium, gut)

Extraktion aus den antigen-haltigen Geweben durch Glycoproteinlösungsmittel bei niedrigem pH-Wert bei Raumtemperatur:

Aufheben des Extraktes isoelektrischer Punkt:

nicht angegeben oder nicht vorhanden

Absorption von UV-Licht bei 280 nm

Fluoreszenz:

nicht erwähnt

Molekulargewicht 200 000, (kann so wenig wie 70 000 sein)

aktiv bei neutralem pH-Wert enthält Zucker (Glycoprotein)

CAPA

Quelle: Alle Krebsarten, 15 Krebszellenkulturen in vitro, Plazenta. (Wenig, wenn überhaupt, im Fötus.)

Waschen des Gewebes mit Wasser bei neutralem 20

pH-Wert, Extraktion mit Äthyläther (gegebenenfalls), Wegwerfen des Extraktes, Extraktion der Feststoffe bei hohem pH-Wert (9,5), Aufheben des Extraktes, Temperatur in der Wasserbehandlung: ä0°C.

isoelektrischer Punkt:

etwa 5 (vor der Endstufe)

Absorption von UV-Licht bei 230 nm

(sehr wenig bei 280 nm) Fluoreszenz:

Aktivierung bei 288 nm, Emission bei 350 nm Molekulargewicht 23 200 ±2500

bei neutralem pH-Wert zerstört kein Zucker gemäss Gas-Flüssigkeitschromatographie, Massenspektroskopie und anderen Analysen

CEA

keine Antikörperhemmung gegenüber CAPA durch Hämagglutination markiert nicht rote Blutkörperchen vom Schaf, die mit Gerbsäure behandelt wurden ist bei Krebserkrankung in Konzentration von einigen Nanogrammen von 100 bis 200 nm je ml vorhanden

Probe: kostspielig, zeitraubend, erfordert radioaktive Isotopen

CAPA

hemmt spezifische Antikörper durch Hämagglutination markiert solche Zellen ist im Serum in Konzentrationen von 0,09 bis 8 «g/ml (äquivalent zu 90 bis 8000 ng/ml) vorhanden, d. h. in einer etwa 20mal grösseren Menge als CEA leicht, schnell, billig, keine Isotopen und keine aufwendige Apparatur erforderlich

Zusammengefasst finden sich nachfolgend kurze Definitionen des Tumor-Polypeptidantigens und des damit durchführbaren diagnostischen Tests.

Definition von CAPA HeLa-Zellen (die von einem Krebsfall 1952 stammen) werden in vitro gezüchtet. Diese Zellen werden als eine Anti-genquelle verwendet. Die gewonnenen Zellen werden injiziert, was zur Produktion spezieller Antikörper führt, die verwendet 30 werden, um das Antigen in Tumoren, Serum, Plazenta usw. zu identifizieren. Das letztere Antigen muss eine identische immunologische Reaktionsstelle haben und hat sie auch (im Vergleich mit dem HeLa-Antigen), doch kann es natürlich in anderer Hinsicht auch verschieden sein, wenn es in natürlichem 35 Zustand vorliegt.

Definition des diagnostischen Tests Antigen von HeLa-Zellkulturen in votro werden verwendet, um Antikörper in Pferden zu produzieren. Nach Absorp-40 tion unerwünschter Antikörper wird das Pferdeserum verwendet, um rote Blutkörperchen zu agglutinieren, die mit Antigen markiert wurden, welches von Tumoren (oder Plazenta oder Zellkulturen von HeLa oder HEp-2 oder Detroit-6) abgenommen wurden. Dies ist das Indikatorsystem. Wenn eine un-45 bekannte Probe Antigenaktivität enthält, stört sie den Antikörper und hemmt Agglutination.

s

1 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

617 853

1. Verfahren zur Herstellung eines Tumor-Polypeptid-An-tigens, bei dem man a) Material mit Tumor-Polypeptid-Antigen-Aktivität bei einer 0° C nicht übersteigenden Temperatur in einer Flüssigkeit homogenisiert,

b) aus dem gemäss (a) erhaltenen Gemisch aus flüssigem Homogenisat und Feststoffen direkt oder nach Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel in der Kälte die Feststoffe abtrennt,

c) die Feststoffe mit einer alkalischen, wässrigen Lösung extrahiert,

d) den Extrakt auf einem Filtrationsgel vom Molekularsiebtyp in Perlenform, das eine Fraktionierung von Verbindungen mit einem Molekulargewichtsbereich von 10 000 bis 20 x 106 gestattet, filtriert, das Gel eluiert und die Fraktion mit einem Molekulargewicht von 10 x 106 bis 20 x 106 gewinnt und e) die aus Stufe (d) resultierende Fraktion zur Entfernung von Verunreinigungen der Chromatographie an einem schwachen Ionenaustauscher unterzieht, darauf Verunreinigungen absorbiert und die die Antigenaktivität aufweisende Fraktion gewinnt,

dadurch gekennzeichnet, dass diese Fraktion der isoelektrischen Ausfällung unter Überführen der Polypeptidmoleküle in die Form von Zwitterionen unterworfen wird, indem man Säure zusetzt, bis die Polypeptide ein Löslichkeitsminimum zeigen, worauf man f) den resultierenden Niederschlag mit einem Molekularsiebgel vermischt und das resultierende Gemisch dann einer pH-Gradienteluierung unterzieht und g) unter Herabsetzung des pH-Wertes bis zu einem pH-Wert von etwa 3 die Tumor-Polypeptid-Antigen enthaltende Fraktion, die einen Absorptionspeak im Spektrum bei 229 bis 233 nm aufweist und ein Molekulargewicht im Bereich von 20 000 bis 27 000 hat, gewinnt.

2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man antigenhaltiges Material noch in gefrorenem Zustand in Wasser bei einer Temperatur von nicht mehr als 0° C homogenisiert, das resultierende Homogenisat mit Äthyläther und/oder Aceton behandelt, von dem resultierenden Gemisch Feststoffe abtrennt, diese lyophilisiert und in einer Stahlkugelmühle bei einer Temperatur unterhalb des Gefrierpunktes des behandelten Materials mahlt, die resultierenden Feststoffe mit einer alkalischen wässrigen Lösung extrahiert und nach dem Zentrifugieren die obere Flüssigkeitsschicht schnell auf 95 bis 100° C erhitzt und zur Zerstörung der Enzyme 5 bis 10 Minuten auf dieser Temperatur hält, die Flüssigkeit dann zur Ausfällung von Verunreinigungen mit einer wässrigen Natriumchloridlösung behandelt, die resultierende Flüssigkeit auf einer kalten Säule eines Molekularsiebgels in Perlenform mit einem Fraktionierungsbereich von

10 000 bis 20 x 106, das mit Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0 äquilibriert ist, filtriert und die aktive Fraktion des Eluats als Mittelfraktion gewinnt und an einer Säule eines schwachen Ionenaustauscher-Molekularsiebgels, das mit Phosphatpuffer eines pH-Wertes von etwa 7,0 äquilibriert ist, chro-matographiert; dass man die die Antigenaktivität aufweisende Flüssigkeitsfraktion der isoelektrischen Ausfällung unter überführen der Polypeptidmoleküle in die Form von Zwitterionen unterwirft, indem man Säure zusetzt, bis ein pH-Wert von etwa 5 erreicht ist, worauf man den resultierenden Niederschlag mit einem Molekularsiebgel mit einer Molekulargewichtsausschlussgrenze von wenigstens 2000, das mit HCOOH—HCOONH4 eines pH-Wertes von etwa 5 äquilibriert ist, vermischt, das so gewonnene Gemisch auf eine Säule eines identischen und in gleicher Weise äquilibrierten Gels aufgibt, die Säule einer pH-Gradienteneluierung unterzieht und unter Herabsetzung des pH-Wertes die das Antigen enthaltende Fraktion, die einen Absorptionsgipfel im Spektrum bei 229 bis 233 nm aufweist und ein Molekulargewicht von 20 000 bis 27 000 hat, gewinnt.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Tumor-Polypeptid-Antigen hergestellt wird, das ein Molekulargewicht von 23 200 ±2500 besitzt, im Spektrum eine Absorptionsbande bei einer Wellenlänge von 229 bis 233 nm zeigt und das eine durch Behandlung mit Perameisensäure bewiesene einzelne Peptidkette aufweist.

4. Verwendung des nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 hergestellten Tumor-Polypeptid-Antigens zur Herstellung von gegenüber dem Polypeptid-Antigen monospezifischen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine wässrige Lösung des Antigens mit einem pH-Wert von weniger als 3 herstellt,

b) daraus eine Ölemulsion bereitet, in der die aus Stufe a) resultierende Lösung die dispergierte Phase bildet, die von der umgebenden Ölphase geschützt ist, und c) diese Ölemulsion lebenden Tieren injiziert und so das in der Emulsion enthaltene Antigen zu den Antikörper produzierenden Zellen transportiert und die derart erzeugten Antikörper gewinnt.

5. Verwendung gemäss Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung in der Stufe a) bei einem pH-Wert unterhalb 3 unter Verwendung einer schwachen Säure, vorzugsweise Ameisensäure, herstellt.