CH617588A5

CH617588A5 -

Info

Publication number: CH617588A5
Application number: CH472375A
Authority: CH
Inventors: Stanley A Plotkin
Original assignee: Wistar Inst
Priority date: 1974-04-15
Filing date: 1975-04-14
Publication date: 1980-06-13
Also published as: FR2267117A1; ZA751949B; AU8002475A; DE2516274A1; FR2267117B1; BE827572A; GB1501724A; NL7504480A; JPS5115612A; SE7504221L; CA1045546A; US3959466A; DE2516274C2; JPS58406B2

Description

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, der befähigt ist, eine Immunität gegenüber CMV hervorzurufen und auf diese Weise zum Schutze von Frauen gegenüber Infektion während der Schwangerschaft nützlich ist, wobei Schäden im zentralen Nervensystem, einschliesslich eine geistige Minderentwicklung von Neugeborenen, in hohem Masse herabgesetzt werden kann. Bei dem so erfindungsgemäss erzeugten Impfstoff findet keine Ausbreitung des Virus durch Kontakt statt. Überdies hat der Impfstoff, im Hinblick auf seine Herstellungsart, nicht die Fähigkeit, einen latenten tierischen Virus an Geimpfte zu übertragen. Das vorliegende erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung genannten Impfstoffes ist ein neues Verfahren.

Der erfindungsgemäss erzeugte Impfstoff besitzt die oben angeführten Vorteile aufgrund seiner Herstellungsart. Ein wesentliches Merkmal dieses Verfahrens zur Herstellung dieses Impfstoffes sind serienmässige Passagen von CMV in menschlichen diploiden Lungenbindegewebszellen, insbesondere WI-38- und MRC-5-Bindegewebszellen, vorzugsweise in den ersteren.

Die WI-38-Bindegewebszellen leiten sich ursprünglich von einer einzigen menschlichen Lunge ab; diese sind insofern durch einen Stammbaum bezeichnet, als sie biologisch, biochemisch, virologisch und genetisch umfassend charakterisiert wurden. Die MRC-5-Bindegewebszellen leiteten sich auf ähnliche Weise von einer einzigen menschlichen Lunge ab,

aber von einer verschiedenen Einzelperson, und sie wurden auf ähnliche Weise mit einem Stammbaum bezeichnet. Diese zwei Zellenlinien sind standardisiert im Gegensatz zu üblicherweise verwendeten primären tierischen Zellen.

WI-38 wurde in Exper. Cell Res. 25, 585 (1961) beschrieben und wurde in der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC CCL-75 hinterlegt. MRC-5 wurde in Nature 227 168 (July 11, 1970) beschrieben. WI-38 ist den Laboratorien zugänglich und kann aus obiger Sammlung erhalten werden. Die Verwendung dieser Zellenlinien für die Ausbreitung des Virus minimisiert die Wahrscheinlichkeit, dass latente tierische Viren auf einen Geimpften mittels des Impfstoffes übertragen werden.

Der Towne-Stamm von CMV, das ist ein bevorzugter Stamm für die Verwendung zur Herstellung des Impfstoffes, und zwar wegen seines breiten antigenen Spektrums, wurde aus dem Urin eines zweimonatigen männlichen Kleinkindes,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

617 588

welches von einem Zytomegalie-Inklusionsleiden befallen war mit zentralen Nervensystemschäden und Milz-Leber-Schwellung als Symptome, isoliert. Dieser Stamm von CMV wurde von Stanley A. Plotkin, M.D. vom Wistar Institute of Anatomy and Biology, Philadelphia, Pennsylvania, isoliert und ist in J. Virol. 11 Nr. 6, 991 (Juni 1973) beschrieben. Nun aber können auch andere Stämme von CMV verwendet werden.

Die Verbreitung bzw. Fortpflanzung von menschlichen diploiden Lungen-Bindegewebszellen kann mittels jeglicher in der Literatur beschriebenen Standardmethode durchgeführt werden. Spezifische Beispiele solcher Fortpflanzungstechniken sind in Exper. Cell Res. 25, 585 (1961) und Virology 16,147 (1962) beschrieben. Das Gewebe-Kultursystem umfasst gewöhnlich ein basales Medium von Eagle (BME) oder ein minimales essentielles Medium von Eagle (MEM) in ausgewogener Salzlösung von Eagle, ergänzt durch vorgesiebtes Kalbserum, welches eine sterilisierte Menge eines Antibiotikums, wie Penicillin, Streptomycin, Chlortetracylin oder andere Antibiotika oder Gemische derselben, enthält, wobei das System bei einem pH-Wert von 6,8 bis 8,5 mit einem üblichen biologischen Puffermittel, wie einem Alkalimetall-dicarbonat, Carbo-nat oder Hydrogenphosphat, gepuffert ist.

Der Zytomegalievirus (CMV) wird zur Herstellung eines Impfstoffes durch Impfen von menschlichen diploiden Lungen-Bindegewebszellen mit CMV gezüchtet. CMV enthaltender Urin ist ein besonders nützliches Ausgangsmaterial zur Impfung der Bindegewebszellen. Die trypsinisierten infizierten Zellen werden geerntet und serienmässig in menschlichen diploiden Lungen-Bindegewebszellen passagiert. Jede Inkubation erfolgt in der Regel während einer Zeitspanne von sieben Tagen und wird zweckmässig bei einer Temperatur von etwa 37° C geführt. Die Anzahl der Passagen ist eine solche, damit diese zuerst einen Stamm von CMV erzeugt, der grosse Mengen an zellfreiem Virus abscheidet, wonach der zellfreie Virus attenuiert wird. Es werden insgesamt mindestens etwa 50 und vorzugsweise 125 bis 150 Passagen ausgeführt. Der attenuierte Virus wird dann geerntet und Standard-Sterilitätstests auf Anwesenheit von Bakterien, Pilzen, Mycoplasmen und anderen schädlichen Mitteln unterworfen.

Die Bezeichnung «attenuierter Virus», wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Virus, dessen Virulenz mittels der Züchtungsmethode geändert bzw. herabgesetzt wurde, so dass dieser Virus keine starken Symptome bei Impfung in Menschen erzeugt, obschon dieser die Fähigkeit, Antikörper zu bilden, beibehält d. h. er behält die Fähigkeit, die Erzeugung von Antikörpern zu stimulieren.

Der attenuierte Virus wird als Impfstoff verwendet, und zwar so, dass man das geerntete Material filtriert, um Zellen und Bakterien zu entfernen, und das Filtrat wird entweder als solches verwendet, für spätere Verwendung ausgefroren oder lyophylisiert und hernach mit einem Lösungsmittel, wie Wasser, rekonstituiert. Vorzugsweise wird ein Stabilisator, wie Ei-weiss, verwendet, und zwar dort, wo das Filtrat lyophylisiert wird. Der Impfstoff kann subkutan verabreicht werden. Die Dosismenge, welche verwendet wird, ist ein Minimum von 100 TCID50 von attenuiertem CMV und kann bis etwa 10 000 TCIDso erreichen.

Der attenuierte Virus kann in grossen Mengen erzeugt werden, indem man mit dem Virus menschliche diploide Lungen-Bindegewebszellen impft und darin den attenuierten Virus züchtet. Der attenuierte Virus kann dann im Zeitabschnitt des höchsten Titers, d. h. innerhalb einer Woche, geerntet werden.

Die bevorzugte Art der Herstellung und das Testen des Zytomegaliervirus enthaltenden Impfstoffes wird im nachfolgenden näher dargelegt.

Der verwendete Zytomegalievirus wird aus dem Urin eines zwei Monate alten männlichen menschlichen Kleinkindes mit einem Zytomegalie-Inklusionsleiden erhalten. Dieser Stamm wird als Towne bezeichnet und wurde oben beschrieben. Der Urin wird auf WI-38 menschliche diploide Lungen-Bindegewebszellen geimpft. Das für die Gewebskultur des Virus verwendete Nährmedium ist Eagles minimales essentielles Medium (MEM) mit zugefügten 2 % vorgesiebtem Kalbsserum. Die Konzentration von Antibiotika in jedem ml Medium beträgt 100 jug Penicillin, 10 fig Gentamycin und 2 ßg Amphote-ricin-B. Andere Antibiotika können anstatt der oben spezifisch aufgezählten verwendet werden.

Das Erntegut umfasst die überstehende Flüssigkeit und die von der Oberfläche des Behälters entfernten, mit Virus infizierten Zellen und wird unter Verwendung von 0,25 % Trypsin in einer physiologischen Salzlösung auf stationäre WI-38 menschliche diploide Lungen-Bindegewebszellen geimpft, um eine Infektion dieser Zellen hervorzurufen. Dieses geimpfte Erntegut wird dann passagiert. Das zur Einleitung der Zelleninfektion und in sämtlichen nachfolgenden Wiederholungen verwendete Nährmedium ist dasselbe wie jenes, welches für die Gewebezüchtung des Virus verwendet und schon oben beschrieben wurde. Die verwendete Temperatur für jede Passage beträgt 37° C. Nun aber können auch Temperaturen etwas unterhalb dieser Temperatur, z. B. im Bereich von 30 bis 37° C, gleichfalls verwendet werden. Die Dauer jeder Passage beträgt sieben Tage, wobei aber auch Passagen von etwas kürzerer oder längerer Zeitspanne, z. B. 5 bis 10 Tagen, möglich sein können.

In den Anfangspassagen, welche etwa 10 sein können, wird die virusinfizierte, Zellen enthaltende überstehende Flüssigkeit aus jeder vorgängigen Passage geerntet und auf frischen WI-38 menschlichen diploiden Lungen-Bindegewebszellen passagiert. Die gewählte Zahl der Passagen ist eine solche, um einen Stamm zu erhalten, welcher eine wesentliche Menge von zellfreiem Virus erzeugt; der Zytomegalievirus ist gewöhnlich mit Zellen assoziiert. Auf diese Weise kann eine etwas kleinere oder grössere Zahl von Passagen getätigt werden.

Es wird durch Dekantieren die überstehende Flüssigkeit von zehn Passagen erhalten und bei 1200 Upm zentrifugiert, wobei eine Flüssigkeit mit zellfreiem Virus erhalten wird. Die den zellfreien Virus enthaltende, zellfreie Flüssigkeit wird dann reihenweise 28mal auf frischem WI-38 menschlichen diploiden Lungen-Bindegewebszellen passagiert, und zwar wird 1 ml Flüssigkeit verwendet zur Impfung von Behältern einer Oberfläche von 75 cm2. Obschon 28 Passagen verwendet werden, soll die Anzahl dieser Passagen nur genügend sein, um die gewünschte Zahl von zellfreien Zytomegalieviren zu erhalten. Auf diese Weise kann eine grössere oder kleinere Anzahl von Passagen der zellfreien Flüssigkeit verwendet werden.

Die überstehende Flüssigkeit, welche gegebenenfalls durch Schalleinwirkung von Zellen befreite Viren enthalten kann, wird geerntet und dann reihenweise auf frischen WI-38 genügend oft passagiert, z. B. 115mal, um den Virus zu attenuieren. Die Gesamtzahl der im oben beschriebenen Gesamtverfahren verwendeten Passagen wird gewöhnlich 50 bis 150, vorzugsweise 125 bis 150, betragen.

Die Bildung einer Sorte des attenuierten Virus durch Endverdünnung erfolgt bei 50, 60 und 70 Passagen.

Der Virus für Impfzwecke wird von den überstehenden Flüssigkeiten der infizierten WI-38-Kulturen bei einem Zeitpunkt des maximalen Virustiters, im allgemeinen etwa nach einer Woche, geerntet. Mittels dieses Verfahrens wird eine grössere Menge von attenuiertem Zytomegalievirus aus jenem ursprünglich präparierten erhalten.

Eigenschaften des Zytomegalievirus enthaltenden Impfstoffes

Der Impfstoff entwickelt sich auf menschlichen Bindegewebszellen, wie auf WI-38-Zellen. Dessen Wirkung auf den krankhaften Zellenvorgang ist charakteristisch für den Zyto-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

617 588

megalievirus und ist in der Literatur beschrieben. Der Impfstoff kann leicht in zellfreier Form durch Filtrieren des Überstehenden aus infizierter Kultur mittels eines 3-Mikronfilters fortgepflanzt und auf frische WI-38-Zellen geimpft werden. CPE erscheint innerhalb von 4 bis 10 Tagen in Abhängigkeit von der Multiplizität der Infektion. Es bilden sich inkludierte Körper, wie es in der Literatur beschrieben wird, und sie können mit Haematoxylin-Eosin oder Giemsa gefärbt werden. Der attenuierte Virus bildet Plättchen mit einer Nähragarose-Überschicht.

Der Impfstoff kann bei —70° C in einer Lösung von 70 Gew. % Sorbit in destilliertem Wasser, d. h. ein Volumen Virus auf ein Volumen Sorbitlösung, gelagert werden.

Der zellfreie attenuierte Virus kann mit im Handel erhältlichem menschlichem Antiserum (Flow Labs., Bethesda, Maryland) CF-Titer 1:16 (verdünnt 1:10) seroneutralisiert werden. 0,1 ml an verdünntem Serum neutralisieren 250 TCID50. Hy-perimmunisiertes Meerschweinchenserum kann gleichfalls gegen AD 169-Stamm verwendet werden.

In folgender Tabelle sind die Serum-Neutralisationstiter (SN) allein und in Gegenwart von Ergänzungsstoffen zusammengestellt. SN wurde in Mikroplättchen (Linbro) gegeben; 0,025 ml Suspension von 60 TCIDS0 Towne 125 plus 0,025 ml verdünntes Serum. Nach Ablauf von einer Stunde werden 0,250 ml mit 104 WI-38-Zellen in Eagles modifiziertem Ba-salmedium mit 10% nichterhitztem Kalbsserum zugesetzt. Die Mikroplättchen werden nach 5 bis 7 Tagen Inkubationszeit bei 37° C gezählt. Es wurden 8 Zellen pro Verdünnung verwendet.

Serumprobe Neutralisation allein mit C'

Kaninchen Nr. 1 8 8

Nr. 2 8 64

Nr. 3 8 32

Nr. 4 8 64

Meerschweinchen 20-100 100

menschliches Antiserum 40 40

Testen des erhaltenen Impfstoffes Jeder Einsatz bzw. jedes für die Impfung verwendete Erzeugnis wurde getestet auf Anwesenheit von Bakterien, Pilzen und Mikroplasmen durch Impfung auf entsprechende künstliche Medien. Teste auf Zuverlässigkeit bei Tieren umfassen eine Injektion aliquoter Teile des Einsatzes in erwachsene Mäuse (intraperitoneal und intracerebral), in säugende Jungmäuse (intraperitoneal und intracerebral), in Meerschweinchen (intraperitoneal) und Kaninchen (intradermal). Die Prüfung der Tiere bei verschiedenen Zeitspannen, vor allem nach mehreren Wochen nach der Impfung, zeigten, dass sämtliche Tiere gesund blieben.

Es wurden 20 Cercopithecus-Affen mit 0,5 ml des Impfstoffes intraspinal bzw. intracerebral und 1 ml des Impfstoffes intramuskulär geimpft. Die Affen waren auf 100 TCIDS0 Zy-tomegalievirus-Neutralisation sehr negativ sowohl in Gegenwart und Abwesenheit von frischem Meerschweinchen-Ergän-zungsstoff. Die Affen wurden nochmals drei Wochen später getestet. Es zeigte sich keine Serokonversion bei denselben Affen, und zwar während der Beobachtungszeit nach klinischer oder pathologischer Prüfung.

Weitere Teste auf die Identität und auf die Abwesenheit von kontaminierenden Mitteln wurden in Gewebskulturen durchgeführt. Es wurden eine Niere von einem afrikanischen Grünaffen, eine menschliche Embrioniere, eine primäre Kaninchenniere und WI-38-Zellen mit aliquoten Teilen von Virus, entweder direkt oder nach Neutralisieren während 1 Stunde bei 37° C mit Kaninchen-Zytomegalievirus-Serum geimpft. Im Einsatz zeigte sich kein anderes Mittel als der Zyto-megalievirus-Impfstoff. Ein Titrieren der Einsätze auf die Menge des Zytomegalievirus wurde durch einen Endpunkt-Verdünnungsversuch auf WI-38-Zellen durchgeführt.

Testergebnisse des Impfstoffes bei Menschen

Der Impfstoff wurde auf Erwachsene getestet, vorgetestet auf Antikörper gegenüber Zytomegalievirus, und es wurden nur in die Tests Seronegative einbezogen. Den seronegativen Erwachsenen wurden 103 0 TCIDS0 intranasal verabreicht. Es zeigten sich keine Serokonversionen, was bewies, dass der Virus auf üblichem Wege nicht mehr infektiös wirkt. Es wurde dieselbe Dosis subkutan neun anderen Erwachsenen verabreicht, und es zeigte sich in sämtlichen Fällen eine Serokonversion. Es wurden keine Symptome beobachtet, und es zeigte sich auch kein Virus im Urin, im Rachen oder Blut.

Zwecks Erzielung oben genannter Ergebnisse wurden Viren in einem Volumen von 1 ml subkutan eingeimpft. Es wurden Abstriche am Rachen mit einem auf einem Stab angebrachten Wattebausch und durch Aufetreichen auf die hintere Pharynx durchgeführt. Beide Typen von Aufstrichen wurden sofort in mit einem Schraubenverschluss verschlossene Rohre, die Hanks Medium mit 0,1% Gelatine, 1000/zg Streptomycin und 400 fi g Mycostatin pro ml enthielten, gegeben. Diese Muster wurden entweder bei 4° C aufbewahrt bis zur Einimpfung in Gewebskulturen am selben Tag oder bei —20° C für ein Testen innerhalb von zwei Wochen. Urin wurde direkt auf WI-38-Zellen geimpft. Tests auf Viremie wurden durchgeführt durch Sammeln von heparinisiertem Blut und Absetzen mittels Schwerkraft bei 4° C, bis ein leucocytenreiches Plasma erhalten wurde. Nach einer Schallbehandlung während zwei Minuten wurde das Plasma in eine Gewebekultur geimpft. Es wurden Antikörperversuche am Serum aus Butgerinsel-Proben unter Verwendung von Komplement-Fixations- und Fluoreszenz-Antikörpertests durchgeführt.

In einem weiteren Test wurde an neun neuen seronegativen Erwachsenen dieselbe Dosis (IO30 TCIDS0) subkutan verabreicht. Es wurden keine systemischen Symptome beobachtet, und sämtliche neun Versuchspersonen entwickelten Antikörper auf den Zytomegalievirus.

4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

SO

S

Claims

617 588

1. Verfahren zur Herstellung eines attenuierten Zytomega-lievirus, dadurch gekennzeichnet, dass man einen virulenten Zytomegalievirus genügend Passagen in menschlichen diploi-den Lungen-Bindegewebszellen unterwirft, dass der Virus bei Verabreichung an Menschen, ohne heftige Symptome oder mehr als nur eine minimale Virusausscheidung hervorzurufen, eine solche Immunität induziert, dass ungeimpfte Personen bei Kontakt mit geimpfen Personen nicht infiziert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als menschliche diploide Lungen-Bindegewebszellen die Zellenlinie der Bezeichnung ATCC CCL-75 verwendet.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man trypsinisierte, mit Zytomegalievirus infizierte Zellen zehnmal in frischen menschlichen diploiden Lungen-Bindegewebszellen passagiert und danach den erhaltenen zellfreien Virus in frischen menschlichen diploiden Lungen-Bindegewebszellen passagiert.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man menschliche diploide Lun-gen-Bindegewebszellen mit durch Zytomegalievirus infiziertem menschlichem Urin impft, die überstehende Flüssigkeit, die trypsinisierte, mit Zytomegalievirus infizierte Zellen enthält, erntet, die erhaltene Flüssigkeit in menschlichen diploiden Lungen-Bindegewebszellen passagiert und so einen Stamm von Zytomegalievirus erhält, der einen zellfreien Zytomegalievirus erzeugt, wonach man den erhaltenen zellfreien Zytomegalievirus in menschlichen diploiden Lungen-Bindegewebszellen genügend oft passagiert, dass der Virus bei Verabreichung an Menschen, ohne schwerwiegende Symptome oder mehr als nur eine minimale Virusausscheidung hervorzurufen, eine solche Immunität induziert, dass ungeimpfte Personen bei Kontakt mit geimpften Personen nicht infiziert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die überstehende Flüssigkeit, die trypsinisierte infizierte Zellen enthält, zehnmal passagiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die zellfreien Zytomegalievirus enthaltende Flüssigkeit etwa 115mal passagiert, um den Virus zu attenuieren.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man jede Passage bei einer Temperatur von etwa 37° C während einer Woche ausführt.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtzahl der Passagen 50—150, vorzugsweise 125-150, beträgt und dass man die Passagen bei einer Temperatur von 30—37° C während 5-10 Tagen durchführt.

9. Verwendung des nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellten attenuierten Zytomegalievirus zur Herstellung eines Impfstoffs, dadurch gekennzeichnet, dass man den erhaltenen Virus in menschlichen diploiden Lungen-Bindegewebszellen eine genügend lange Zeitspanne züchtet, um eine grosse Menge an attenuiertem Virus zu erzeugen, und danach den attenuierten Virus erntet.

Eine Infektion durch den Zytomegalievirus (CMV) in utero ist eine wichtige Ursache von Schäden im zentralen Nervensystem bei Neugeborenen. Obschon der Virus in der Bevölkerung weit verbreitet ist, werden etwa 40% der Frauen ohne jegliche Antikörper schwanger und sind auf diese Weise der Infektion ausgesetzt. Etwa 1 % dieser Frauen erleiden eine primäre Infektion in utero. Klassische Cytomegalie-Inklusions-leiden sind selten, wobei aber gefunden wurde, dass ein Teil der infizierten Kleinkinder, einschliesslich jener, welche vorher symptomfrei waren, hernach als geistig zurückgeblieben befunden wurden (Lancet Jan. 5, 1974, Seiten 1 bis 5).

Vorläufige Schätzungen, die auf einer Übersicht von etwa 4000 Neugeborenen aus mehreren geographischen Zonen basieren, geben an, dass der Virus einen bedeutenden Schaden auf das zentrale Nervensystem ausübt und zu einer Geistesschwäche von mindestens 10% und vielleicht zu einem so hohen Wert wie 25 % der infizierten Kleinkinder führt. Es wird angenommen, dass etwa 1 % von neugeborenen Kleinkindern pro Jahr CMV ausscheidet und dass etwa V4 dieser eine geistige Defizienz entwickelt; in den Vereinigten Staaten bedeutet dies etwa 10 000 Hirngeschädigter pro Jahr geborener Kinder. Dies ist eine ungeheure Zahl, insbesondere im Hinblick auf die Fähigkeit dieser Kinder zu überleben (J. of Infect. Dis. 123, Nr. 5, 555, Mai 1971). "

Im Hinblick auf die Ernsthaftigkeit des Problems wurden in den letzten Jahren Forschungen zwecks Entwicklung eines wirksamen CMV-Impfstoffes angeregt. Das Problem der Impfung besteht darin, einen Zellenvermittler und eine Humoral-immunität zu liefern, ohne Ausbreitung des Virus durch den Körper des Geimpften und ohne dass dabei krankhafte Wirkungen hervorgerufen werden. Der Impfstoff soll dem Schutz von Frauen gegen Infektion während der Schwangerschaft nützlich sein. Eine Impfung von heranwachsenden Mädchen soll die Häufigkeit von primärer CMV-Infektion bei der Schwangerschaft herabsetzen und einen fetalen Gehirnschaden aus obigem Grunde ausschliessen.