Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfah ren für die Herstellung des Antibiotikums Validamycin As
Es hat sich gezeigt, dass das Antibiotikum, genannt Valid amycin oder T-7545, durch Züchtung eines Stammes von
Streptomyces hygroscopicus var. limoneus, welcher zur Gattung Streptomyces gehört, erhalten werden kann und dass die Validamycine eine hervorragende Hemmwirkung gegen Pflanzenkrankheiten, z. B. den Blattscheidebrand von Reispflanzen, besitzen (vergleiche britische Patentschrift Nummer 1278289).
Bei Versuchen wurden die folgenden Resultate mit Valid amycinen festgestellt: i) 8 Komponenten von Validamycinkomplexen, nämlich der Validamycine A, B, C, D, E und F und die Validoxyl amine A und B wurden in der Fermentierbrühe festgestellt.
ii) Validamycin A besitzt die höchste Wirksamkeit unter diesen Verbindungen gegen Pellicularia sasakii, und die Validamycine C, E und F können in das Validamycin A übergeführt werden, welches der folgenden Formel entspricht:
EMI1.1
iii) Sämtliche Validamycine C, E und F bestehen aus 2 Mol D-Glucose und 1 Mol Validoxylamin A der Strukturformel:
EMI1.2
und besitzen die gleiche Molekularformel, nämlich die Formel C26H45NOi8.
iv) Eines von zwei Mol D-Glucose ist ss-glycosidisch verbunden mit der in 3-Stellung vorhandenen Hydroxylgruppe des gesättigten Cyclitolteiles (Validaminteiles) von Validoxylamin A in den Validamycinmolekülen C, E und F.
v) Die andere D-Glucose ist a-glycosidisch in jedem Molekül der Validamyome C, E und F an eine andere Hydroxylgruppe gebunden.
vi) In der Struktur von Validamycin E haftet die a-D Glucopyranosyl-(1e4)-ss-D-Glucopyranosylgruppe an der in 3-Stellung vorhandenen Hydroxylgruppe des gesättigten Cyclitolteiles (Validaminteiles) von Validoxylamin A.
vii) Die a-glycosidisch gebundene D-Glucose in den beiden Validamycinen C und F haftet am ungesättigten Cyclitolteil (Valienaminteil) des Validoxylamins A. Wenngleich die Strukturen der Validamycine C und F in bezug auf die Haftung an der a-D-Glucosidbindung sich voneinander unterscheiden, verbleibt die Bestimmung der genauen Stellen der Bindungen.
Es wurde nun die Überführung der Validamycine C, E und F in das Validamycin A durch Hydrolyse derselben mittels eines chemischen Vorganges und eines enzymatischen Vorganges mit Erfolg durchgeführt.
Gemäss vorliegender Erfindung verwendet man als Ausgangsmaterial mindestens eines der Validamycine C, E und F. Sie werden aus den Antibiotika, nämlich den Validamycinen, wie dies nachstehend beschrieben wird, chromatographisch isoliert.
Für die Hydrolyse der Validamycine C, E oder F in das Validamycin A durch enzymatische Umsetzung kann man Enzyme beliebigen Ursprungs verwenden, vorausgesetzt, dass sie eine a-Glucosidasewirkung aufweisen. Solche Enzyme können vorzugsweise durch Züchtung verschiedener Mikroorganismen erzielt werden. Aspergillus terreus (IFO 6346), Endomycopsis fibuligera (IFO 0109), Endomycopsis chodatii (IFO 6130), Endomyces decipiens (IFO 0102) sind typische Beispiele solcher Mikroorganismen. Die in Klammern wiedergegebenen IFO-Zahlen geben an, unter welchen Nummern dieselben in List of Cultures , 4. Ausgabe, veröffentlicht durch Institute for Fermentation , Osaka, zugänglich sind.
Zum Wachstum dieser Organismen verwendet man vorzugsweise ein Nährmedium, welches Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und zu deren Wachstum erforderliche anorganische Salze aufweist. Als Kohlenstoffquellen kann man beispielsweise Glucose, Sucrose, Dextrin, Stärke und Glycerin verwenden.
Als Stickstoffquellen kommen beispielsweise organische Materialien enthaltendes Stickstoff, z. B. Pepton, Fleischextrakt, Casein, Hefe und Hefeextrakt sowie anorganische Stickstoffverbindungen, z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat, und als anorganische Salze beispielsweise Kaliumphosphat, Kaliumchlorid oder Magnesiumsulfat. in Frage.
Man kann für die Züchtung des Mikroorganismus eine stationäre Kultur verwenden, doch eignet sich eine submerse Kultur oder eine Schüttelkultur eher.
Die erfindungsgemäss durchzuführende Hydrolyse kann durch Verwendung der so erhaltenen Kultur als solche oder nach Aufarbeitung dieser Kultur durchgeführt werden. Die Bezeichnung aufgearbeitete Kultur bezieht sich auf ein beliebiges Material, welches so bearbeitet worden ist, dass die gewünschten Enzyme so konzentriert worden sind, dass die Hydrolyse leichter vor sich geht; somit kann eine Kulturbrühe als solche, die gewaschenen Zellen oder die Enzymlösung, welche aus den Zellen erhalten worden ist, als Enzymquelle für die Hydrolyse Verwendung finden. Verwendet man die Kulturbrühe als solche als Enzymquelle, so kann man die Validamycine C, E und F vor dem Wachstum des Mediums oder in einem beliebigen Zeitpunkt der Züchtung zugeben.
Verwendet man gewaschene Zellen, so erfolgt die Hydrolyse im allgemeinen in folgender Weise. Die gewaschenen Zellen werden in einem geeigneten Medium, z. B. destilliertem Wasser, einer Pufferlösung, z. B. einer Phosphatpufferlösung, oder in einer physiologischen Kochsalzlösung, suspendiert.
Bei der Hydrolyse des Validamycins C, E oder F zur Überführung in Validamycin A in chemischer Weise wird man diese Hydrolyse vorzugsweise unter Verwendung einer Mineralsäure, z. B. Salzsäure, oder einer organischen Säure, z. B. p-Toluolsulfonsäure, in verdünnter Konzentration, nämlich in ungefähr 0;05 bis In-Verdünnung, im Lösungsmittel, z. B. Wasser, einem niederen Alkylalkohol, z. B. Methanol, Äthanol oder einer Mischung davon, bei einer Temperatur im Bereiche zwischen Zimmertemperatur bis 1000 C durchführen. Obwohl die Reaktionsdauer hauptsächlich von der Reaktionstemperatur und der Konzentration der Säure abhängt, liegt die Reaktionsdauer vorzugsweise zwischen 3 bis 6 Stunden, sofern die Hydrolyse bei einer Temperatur von ungefähr 800 C mit 0,5 n-Schwefelsäure durchgeführt wird.
Bei der oben erwähnten Hydrolyse ist es ferner möglich, ein Kationenaustauschharz vom Sulfonsäuretypus, z. B. Amberlite IR120 (Warenzeichen der Firma Rohm & Haas, Co.) oder Dowex 50W (Warenzeichen der Firma Dow Chemical, Co.) als Säure zu verwenden.
Da die gewünschte Verbindung, nämlich Validamycin A, wasserlöslich und eine schwach basische Polyhydroxyverbindung ist, wird man diese Verbindung vorzugsweise durch Verwendung der physikochemischen Eigenschaften einer basischen Polyhydroxyverbindung reinigen.
Es wurde festgestellt, dass man nach dem Adsorbieren des Reaktionsproduktes auf einem geeigneten Adsorptionsmittel, z. B. Aktivkohle, die gewünschte Verbindung mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels, z. B. wässrigemAlkohol oder wässrigem Aceton, eluieren kann. Man kann aber auch nach der Adsorption des Reaktionsproduktes auf dem Kationenaustauschharz die gewünschte Verbindung durch Verwendung einer sauren oder basischen wässrigen Lösung oder einer Pufferlösung eluieren. Schliesslich kann man auch chromatographieren unter Verwendung eines stark basischen Anionenaustauschharzes in der CH-Form als Adsorptionsmittel und Wasser als Eluiermittel.
Das Verfahren für die Herstellung der als Ausgangsmaterialien verwendeten Validamycine C, E und F wird in den nachstehenden Absätzen beschrieben. Die Erfindung selbst wird in den folgenden Beispielen näher erläutert. Im folgenden bedeuten die Prozentsätze mit Ausnahme jener hinsichtlich der Ausbeuten Gewichtsprozent/Volumenprozent.
1. Einem einen pH-Wert von 7,0 aufweisenden Medium, enthaltend 3 0/0 Glucose, 2,2 0/0 Sojabohnenmehl und 0,3 0/0 Pepton, gibt man 0,4 Olo ausgefälltes Calciumcarbonat hinzu.
Dann werden jeweils 50 ml (insgesamt 2 Liter) des obigen Mediums in vier 2-Liter-Kolben gegossen, worauf man die Medien sterilisiert. Jedem dieser Medien gibt man eine Öse voll einer Schrägkultur von Streptomyces hygroscopicus var.
limbneus (IFO-12703) als Impfstoff hinzu, worauf man während 2 Tagen bei 280 C unter Schütteln züchtet, um eine Samenkultur zu erzielen.
Hierauf gibt man in einen rostfreien 200-Liter-Stahlbehälter 100 Liter (pH 7,0) eines Mediums hinzu, welches 5 o/o Glucose, 3,6 O/o Sojabohnenmehl und 0,5 0/0 Pepton enthält, worauf man 0,6 ovo ausgefälltes Calciumcarbonat zusetzt. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit 2 Liter der oben erwähnten Samenkultur angeimpft. Die Züchtung erfolgt dann während 114 Stunden.
Die Kulturbrühe (950 Liter), bestehend aus Streptomyces hygroscopicus var. limoneus (IFO-12703), welche nach der obigen Methode erhalten worden ist, wird mittels Oxalsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und durch Zugabe eines Filterstoffes filtriert. 720 Liter des so erhaltenen Filtrates werden durch eine Säule (Harzgehalt 120 Liter) Amberlite (Rohm & Haas Co.) IR-120 (OH-Form) geleitet. Diese Säule wird mit 360 Liter Wasser gewaschen. Die Waschwasser und das ausfliessende Material werden durch eine Säule (Harzgehalt: 140 Liter) Amberlite IR-45 (OH-Form) geleitet und hierauf auf eine Säule (Harzgehalt: 60 Liter) Dowex (Dow Chemical Company) 50W X 2 (H-Form) durchfliessen gelassen.
Diese letztere Säule wird mit Wasser gewaschen und mit 200 Liter einer wässrigen 0,5-n-Ammoniaklösung eluiert und die Validamycin enthaltenden Fraktionen gepoolt und unter vermindertem Druck eingeengt.
40 Liter des Konzentrates werden unter Verwendung einer Säule (Harzgehalt: 30 Liter) Amberlite IRA-900 (OH Form) und unter Verwendung von Wasser als Eluiermittel chromatographiert. Jede Fraktion wird durch Dünnschichtchromatographie (Silicagel G; Entwickler: Mischung von n Propanol, Essigsäure und Wasser im Mischungsverhältnis von 4:1:1), durch Gaschromatographie und durch Flüssigkeitschromatographie getestet. Die wirksamen Komponenten werden in der Reihenfolge der Validamycine D, A, B, C, F und E eluiert.
Die aus Amberlite IRA-900 eluierten Validamycine C, E und F enthaltenden Fraktionen werden unter vermindertem Druck zu einem Sirup eingeengt, worauf man Aceton hinzugibt, um die wirksamen Komponenten in Form eines rohen Pulvers auszufällen. 400 g des so erhaltenen rohen Pulvers werden in 2 Liter Wasser gelöst und die Lösung unter Verwendung einer Säule (Harzgehalt: 22 Liter) Dowex 1x2 (OH Form) und Wasser als Eluiermittel chromatographiert. Jede der Fraktionen wird durch Dünnschichtchromatographie und Gaschromatographie getestet. Dabei findet man Validamycin A in den 75 bis 115 Liter Fraktionen, die Validamycine B und C-in den 135 bis 275 Liter Fraktionen und die Validamycine E und F in den 325 bis 760 Liter Fraktionen.
Jede der das Validamycin C und die Validamycine E und F enthaltenden Gruppen der Fraktionen wird gesammelt und untervermindertem Druck eingeengt, worauf man mit Aceton versetzt. Auf diese Weise erhält man weisse Pulver. Auf diese Weise erhält man 42,0 g eines weissen Pulvers, welches zur Hauptsache die Validamycine B und C enthält, und 5,6 g eines weissen Pulvers, welches zur Hauptsache die Validamycine E und F enthält.
15 g dieses an Validamycinen B und C relativ reichen, rohen Produktes, welches man nach der obigen Methode erhalten kann, werden unter Verwendung einer Säule (870 ml, 3,5 cm X 95 cm) Dowex 1 X 2 (OH-Form, Teilchengrösse 0,125 bis 0,149 mm) und Wasser als Eluiermittel chromatographiert.
Jede der Fraktionen wird durch Dünnschichtchromatographie (Silicagel G; Mischung von n-Propanol, Essigsäure und Wasser im Mischungsverhältnis 4:1:1; Farbreagenz: Naphthoresorcinol -H2SO4) oder durch Gaschromatographie getestet.
Dabei werden ungefähr 0,2 g Validamycin C in den Fraktionen, welche ungefähr den 10- bis 20fachen Mengen des Volumens des Harzes entsprechen, eluiert.
Da sich das aus der oben erwähnten Methode erhältliche rohe Pulver zur Hauptsache aus Validamycin C zusammensetzt, aber noch eine kleine Menge Validamycin B enthält, wird es nach den nachstehenden Angaben weiter gereinigt.
1 g des obigen Pulvers wird unter Verwendung einer Säule (1,3 cm X 90 mm); Kieselgel (Merck's Kieselgel, 0,05 bis 0,2 mm) und als Entwickler eine Mischung n-Propanol, Essigsäure und Wasser im Mischungsverhältnis von 4:1:1 chromatographiert. Bei den so erhaltenen Fraktionen werden jene, welche eine positive Naphthoresorcinreaktion ergeben, durch Dünnschichtchromatographie bestätigt. Jene Fraktionen, welche nur Validamycin C enthalten, werden gesammelt und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird dann auf Dowex 50W X 2 (Pyridinform) adsorbiert, worauf man mit einer ln Pyridin-Acetatpufferlösung (pH 6,5) eluiert. Die einen positiven Naphthoresorcinoltest ergebenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, worauf man ein weisses Pulver, bestehend aus Validamycin C, erhält.
Zur Feststellung der physikochemischen Werte wird das Pulver mittels einer Säule von Dowex 1 X 2 (OH-Form) weiter gereinigt.
5,2 g des weissen Pulvers, welches zur Hauptsache aus den Validamycinen E und F besteht, werden unter Verwendung einer Säule (2,7 cm X 43 cm) Dowex 1 X 2 (OH-Form, Teilchengrösse 0,125 bis 0,149 mm) unter Verwendung von Wasser als Eluiermittel chromatographiert. Das Eluat wird durch Verwendung eines Refraktometers überwacht und jede Fraktion wird identifiziert und mit Hilfe einer automatischen Flüssigkeitschromatographie und Gaschromatographie auf deren Reinheitsgrad getestet.
Die Validamycine E und F werden im Eluat, entsprechend ungefähr dem 30fachen Volumen des Harzes, erhalten.
Bei dieser Arbeitsweise wird das Validamycin F etwas vor demValidamycinE eluiert und, wie durch automatische Flüssigkeitschromatographie bestimmt wird, enthalten die ersten Fraktionen verhältnismässig grosse Mengen an Validamycin F, während die letzteren Fraktionen reich an Validamycin E sind. Die 80 o/o oder mehr Validamycin E enthaltenden Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man 1,3 g eines weissen Pulvers erhält.
Das so erhaltene Pulver, welches 80 o/o oder mehr Validamycin E enthält, wird durch Chromatographie mittels Dowex 50W X 8 (Pyridinform; Eluierungsmittel: 0,1 molare Pyridin Acetatpufferlösung, pH 6,0) und hierauf auf Dowex 1 X 2 (OH-Form; Eluierungsmittel: Wasser) gereinigt. Die das Validamycin E enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Auf diese Weise erhält man ein weisses Pulver, bestehend aus Validamycin E. Nötigenfalls wird die obige Arbeitsweise einmal wiederholt wobei man das Validamycin E von hohem Reinheitsgrad erhält.
In der gleichen Weise, wie dies für das Validamycin E beschrieben worden ist, werden die an Validamycin F reichen Fraktionen gesammelt und gereinigt, wobei man ein weisses Pulver, bestehend aus Validamycin F, erhält. Nötigenfalls wird diese Massnahme einmal wiederholt, worauf man das Validamycin F in reiner Form erhält.
Die als Ausgangsmaterialien verwendetenValidamycine 0, E und F sowie das Validamycin A weisen die folgenden Molekularformeln auf, entsprechend den folgenden Elementaranalysen, und besitzen die folgenden Zersetzungspunkte.
Eigenschaften Molekularformel Molekular- Elementaranalyse Zers. Verbindung gewicht Gef. Ber. produkt
C 46,64 C 46,60 Validamycin A C20H3sNOl3H2O 515,5 H 7,15 H 7,24 1001350 C
N 2,95 N 2,72
C 46,48 C 46,08 Validamycin C C20H45NOl8H2O 677,7 H 6,99 H 6,99 142-1600 C
N 2,15 N 2,07
C 46,22 C 46,08 Validamycin E C2sH4sNOt8H20 677,7 H 7,19 H 6,99 263-2680 C
N 1,94 N 2,07 046,00 C 46,08 Validamycin F C26H4sNO18H20 677,7 H 6,90 H 6,99 165-1730 C
N 1,95 N 2,07
Beispiel 1
In 60 ml eines Mediums (pH 5,7), bestehend aus 0,5 o/o Validamycin C, 0,5 0/0 Ammoniumsulfat,
0,1 0/0 monobasischem Kaliumphosphat, 0,050/0 Ferrichlorid, 0,05 /0 Kaliumchlorid, 0,05 o/o Magnesiumsulfat und 0,05 o/o Hefeextrakt, wird Endomyces decipiens (IFO 0102) während 6 Tagen bei 280 C inkubiert. Hierauf wird das Filtrat durch eine mit Aktivkohle beschickte Säule (10 ml) geleitet. Nach dem Waschen mit Wasser wird die Säule mit 50 ml Wasser, enthaltend 7 0/0 n-Butanol, eluiert. Die ausfliessende Flüssigkeit wird hierauf durch eine Dowex 50W X 2 Säule (H-Form, 10 ml) geleitet.
Nach dem Waschen mit Wasser wird die Säule mit 50 ml 0,5n-NH40H eluiert. Die abfliessende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird hierauf in 10 ml Wasser gelöst und über einer Säule von Dowex 1 X 2 (OH-Form 95 ml) unter Verwendung von Wasser als Entwickler chromatographiert. Zum Überwachen der Eluierungskurve wird ein Refraktometer eingesetzt, wobei jede Fraktion durch Gaschromatographie geprüft wird. Die nur Validamycin A (240 bis 320 ml) enthaltenden kombinierten Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man 165 mg Validamycin A in Form eines weissen Pulvers in einer Ausbeute von 72 0/0 erhält.
Beispiel 2
300 mg Validamycin F werden einer durch Enzym katalysierten hydrolytischen Spaltung unterworfen, wobei man 140 mg Validamycin A in einer Ausbeute von 61 o/o erhält, wenn man nach der Methode gemäss Beispiel 1 arbeitet. Bei dieser Arbeitsweise werden jedoch das Substrat und die den Mikroorganismus erzeugende a-Glucosidase durch Validamycin F bzw. Endomycopsis chodatii (IFO 6130) ersetzt.
Beispiel 3
Endomyces decipiens (IFO 0102) wird in 800 ml eines Mediums (pH 5,7), das sich aus 2 o/o Stärke, 0,5 o/o Ammoniumsulfat, 0,1 0/0 monobasischem Kaliumsulfat, 0,05 o/o Ferrichlorid, 0,05 0/0 Kaliumchlorid, 0,05 o/o Magnesiumsulfat und 0,05 o/o Hefeextrakt zusammensetzt, inokuliert. Die Züchtung erfolgt während 4 Tagen bei 280 C, worauf man die Zellen durch Filtrieren sammelt. Die Zellen werden hierauf mit jeweils 200 ml Portionen Wasser gewaschen.
200 mg Validamycin E werden 40 ml einer Phosphatpufferlösung (0,1 Mol, pH 6,5) zugegeben, in welcher die gewaschenen Zellen suspendiert werden. Die Umsetzung wird während 6 Stunden bei 300 C durchgeführt.
Nach der Eliminierung der Zellen durch Filtrieren wird das Filtrat durch eine Säule aus Dowex 50W X 2 (H-Form, 30 ml)-Harz hindurchgeführt.
Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird das Produkt mit 150 ml einer 0,5n-Ammoniumhydroxydlösung eluiert und die ausfliessende Flüssigkeit unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wird unter Verwendung einer Säule, enthaltend Dowex 1 X 2 (OH-Form, 95 ml) und Wasser als Entwicklerlösungsmittel, chromatographiert.
Jede so erhaltene Fraktion wird mit einem Differentialrefraktometer und mittels Gaschromatographie getestet, wobei man feststellt, dass Validamycin A in den Fraktionen zwischen 240 ml und 300 ml eluiert wird.
Die vereinigten Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man 135 mg Validamycin A als weisses Pulver in einer Ausbeute von 89 O/o erhält.
Beispiel 4
Gewaschene Zellen von Endomyces decipiens (IFO 0102), welche man in ähnlicher Weise wie in Beispiel 3 erhält, werden in 40 ml einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 suspendiert, worauf man sie unter Anwendung einer Ribo-Cell-Fraktioniervorrichtung (Modell RF-1, Sarvall Co.) und durch anschliessendes Zentrifugieren verkleinert.
Die oben schwimmende Flüssigkeit wird zu 200 mg Validamycin E hinzugegeben. Das Gemisch wird hierauf während 6 Stunden bei 300 C stehengelassen, worauf man mit 50 ml Wasser verdünnt. Die verdünnte Lösung wird in ähnlicher Weise wie in Beispiel 3 chromatographiert, wobei man 110 mg Validamycin A als weisses Pulver in einer Ausbeute von 72 /o erhält.
Beispiel 5
Man arbeitet in gleicher Weise wie in Beispiel 3, wobei man eine Mischung von 200 mg der Validamycine E und F im Verhältnis von 3:1 unter Verwendung von Endomyces decipiens (IFO 0102) hydrolysiert. Auf diese Weise erhält man 120 mg Validamycin A als weisses Pulver in einer Ausbeute von 79 /o.
Beispiel 6
In 60 ml eines Mediums (pH 7,0), das sich aus 0,5 0/0 Validamycin E, 1,0 0/0 Ammoniumnitrat, 0,5 0/0 monobasischem Kaliumphosphat, 0,2 o/o Magnesiumsulfat und 0,05 o/o Hefeextrakt zusammensetzt, wird Aspergillus terreus (IFO 6346) während 10 Tagen bei 240 C inkubiert.
Das durch Filtrieren des Reaktionsgemisches erhaltene Filtrat wird in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, wobei man 80 mg Validamycin A als weisses Pulver in einer Ausbeute von 53 /0 erhält.
Beispiel 7
Eine Lösung von 2 g Validamycin E in 200 ml einer 0,5n Schwefelsäurelösung wird während 3 Stunden auf dem Wasserbade bei ungefähr 800 C hydrolysiert. Das Reaktionsgemisch wird hierauf durch eine Säule aus Amberlite IR-45 (OH-Form, 100 ml) hindurchgeleitet, um die Sulfationen zu entfernen.
Die ausfliessende Flüssigkeit und die Waschwasser (300 ml) werden durch eine Säule aus Dowex 50W X 2 (H-Form, 30ml) geleitet.
Nach dem Waschen mit Wasser wird die Säule mit 150 ml einer 0,5n-Ammoniumhydroxydlösung eluiert. Die ausfliessende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird hierauf in 10 ml Wasser gelöst. Dann wird diese Lösung unter Verwendung einer Säule von Dowex 1 X 2 (OH-Form, 150 ml) und unter Verwendung von Wasser als Entwicklerlösungsmittel chromatographiert, worauf man Validamycin A in den Fraktionen zwischen 420 ml und 600 ml eluiert. Die kombinierten Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man 650 mg Validamycin A in einer Ausbeute von 43 o/o erhält.
Beispiel 8
Validamycin C wird mit einer 0,5n-Schwefelsäurelösung während 6 Stunden bei 800 C hydrolysiert. Hierauf wird die Reaktionslösung in ähnlicher Weise wie in Beispiel 7 gereinigt, worauf man das Validamycin A in einer Ausbeute von 10 0/0 erhält.