DE3785021T2

DE3785021T2 - Verfahren zur herstellung von neuraminidase.

Info

Publication number: DE3785021T2
Application number: DE8787903919T
Authority: DE
Inventors: Yasuhiro Ohta; Tsunetake Sugimori; Yoji Tsukada
Original assignee: MARUKIN SHOYU KK
Current assignee: MARUKIN SHOYU KK
Priority date: 1986-06-16
Filing date: 1987-06-12
Publication date: 1993-09-16
Anticipated expiration: 2007-06-13
Also published as: EP0274533A1; JPH07114695B2; US5116752A; DE3785021D1; EP0274533A4; WO1987007640A1; EP0274533B1; JPS62296875A

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Neuraminidase, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Neuraminidase durch Züchten eines neuen Mutantenstammes mit der Fähigkeit, Neuraminidase in Abwesenheit irgendeiner induzierenden Substanz zu produzieren.

Stand der Technik

Neuraminidase, die auch Sialidase genannt wird, ist ein Enzym, das unter der Enzymnummer EC 3.2.1.18 der Nomenklaturkommission der International Union of Biochemistry klassifiziert ist, und das systematisch als N-Acetylneuraminatglycohydrase bezeichnet wurde. Dieses Enzym wirkt auf verschiedene sialinsäurehaltige Glycokonjugate und dergleichen ein, die wichtige Bestandteile von Organismen sind, und verursacht die Abspaltung und Freisetzung von Sialinsäure.
Daher waren die Hauptquellen für die vorstehende Neuraminidase pathogene Bakterien, wie Vibrio cholerae, Clostridium perfringens, Diplococcus pneumoniae, Corynebacterium diphtheriae und dergleichen. Die Forschungen der Erfinder führten bereits zu Techniken zur Herstellung des vorstehenden Enzyms in industriellem Maßstab aus nichtpathogenen Bakterien der Gattung Arthrobacter und mehreren anderen Gattungen ohne Infektionsgefahr (vgl. geprüfte Japanische Patentveröffentlichung Nr. 50-11991, Japanisches Patent Nr. 801089 und geprüfte Japanische Patentveröffentlichung Nr. 52-39917, Japanisches Patent Nr. 914556).
Bei den vorstehenden, von den Erfindern etablierten Techniken ist es jedoch erforderlich, daß eine induzierende Substanz, wie Colominsäure oder dergleichen, im Kulturmedium vorhanden ist, und in Abwesenheit einer solchen induzierenden Substanz kann das gewünschte Enzym keineswegs in industriellem Maßstab hergestellt werden. Mit anderen Worten, die Mikroorganismen, die für die vorstehenden etablierten Techniken verwendet wurden, sind im wesentlichen unfähig, Neuraminidase in Abwesenheit einer induzierenden Substanz, wie Colominsäure oder dergleichen, zu produzieren. Ferner sind Colominsäure und dergleichen üblicherweise aufwendig herzustellen und teuer und nicht leicht verfügbar, und somit nachteilig.

Offenbarung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Technik, die den größten Nachteil der vorstehenden Techniken überwindet, nämlich, daß sie im wesentlichen die Verwendung einer induzierenden Substanz, wie Colominsäure oder dergleichen, benötigen, und die eine große Menge Neuraminidase in industriellem Maßstab ohne die Notwendigkeit, Colominsäure oder dergleichen zu verwenden, erzeugen kann.
Die Erfinder haben ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, um die vorstehende Aufgabe zu erfüllen. Als Folge davon stellten sie fest, daß unter den Mutanten, die man erhält, wenn man Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter, die für die vorstehenden früheren Techniken verwendet wurden, einer Mutationsbehandlung unterwirft, es bestimmte Mikroorganismen gibt, die die Fähigkeit besitzen, eine große Menge des gewünschten Enzyms in einem Kulturmedium zu erzeugen, das von einer induzierenden Substanz, wie Colominsäure oder dergleichen, frei ist, d. h., daß die vorstehende Mutationsbehandlung mutierte Mikroorganismen erzeugt, die fähig sind, Neuraminidase in Abwesenheit einer induzierenden Substanz zu produzieren. Die Erfinder stellten fest, daß die vorstehende Aufgabe durch Züchten des mutierten Mikroorganismus gelöst werden kann. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser neuen Entdeckung ausgeführt.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Neuraminidase bereitgestellt, umfassend die Züchtung einer Mutante der Gattung Arthrobacter mit der Fähigkeit, in Abwesenheit einer induzierenden Substanz Neuraminidase zu produzieren, und die Gewinnung der Neuraminidase aus der so erhaltenen Kultur.
Erfindungsgemäß wird auch eine Mutante der Gattung Arthrobacter bereitgestellt, die fähig ist, Neuraminidase nach Inkubation in einem Nährmedium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Substanzen, aber keine induzierenden Substanzen enthält, zu produzieren, oder eine biologisch reine Kultur der Mutante.
In dieser Beschreibung bedeutet der Ausdruck "induzierende Substanz" eine Substanz, die bei Zugabe zu dem Kulturmedium, in dem die Bakterien der Gattung Arthrobacter oder andere, bei früheren Techniken verwendete Bakterien inkubiert werden, diesen Bakterien die Fähigkeit zur Produktion von Neuraminidase verleiht. Eine solche induzierende Substanz umfaßt Colominsäure und verwandte Verbindungen davon, wie Sialinsäure, Ganglioside, in denen Sialinsäure gebunden enthalten ist, Sialomucopolysaccharide und dergleichen, oder Zersetzungsprodukte von Sialinsäure, wie Mannosamin, N-Acetylmannosamin und dergleichen.
Erfindungsgemäß macht die Verwendung der vorstehenden mutierten Stämme die Verwendung einer induzierenden Substanz, wie Colominsäure oder dergleichen, welche aufwendig herzustellen, teuer und mit Nachteilen verbunden ist, überflüssig, und es ist nun möglich, eine große Menge an Neuraminidase in einem Kulturmedium, das zur Inkubation üblicher Mikroorganismen verwendet wird, zu erzeugen und anzureichern. Somit kann erfindungsgemäß das Enzym leicht und in einer großen Menge in industriellem Maßstab hergestellt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es wichtig, Mutanten der Gattung Arthrobacter zu verwenden. Solche Mutanten können aus bekannten Bakterien der Gattung Arthrobacter als Elternstamm durch Anwendung üblicherweise zur Mutationsbehandlung verwendeter Mittel erzeugt werden. Als Elternstämme können beliebige Stämme der Gattung Arthrobacter mit der Fähigkeit, Neuraminidase in Gegenwart einer induzierenden Substanz zu produzieren, verwendet werden. Beispiele dafür sind Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562, Arthrobacter aurescens ATCC 13344, Arthrobacter oxydans ATCC 14358 und dergleichen. Beispiele für nützliche Mutagene sind eine Vielzahl von weithin bekannt Substanzen, und umfassen chemische Mutagene, wie Nitrosoguanidin (nämlich N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin), Mitomycin C, 4-Nitrochinolin-1-oxid, Methylmethansulfonat, Ethylmethansulfonat, Ethylethansulfonat, 2-Aminopurin, 5-Bromuracil, salpetrige Säure, Hydroxylamin, Acriflavin, Acridin- Lost und dergleichen, Bestrahlung, wie Röntgenbestrahlung, UV- Bestrahlung etc.. Diese Mittel können einzeln oder in einer geeigneten Kombination verwendet werden. Diese Mutagene können auf herkömmliche Weise verwendet werden. Beispielsweise werden bei den chemischen Mutagenen die Konzentrationen und die Dauer der Behandlung geeigneterweise nach der herkömmlichen Technik, die für jedes Mutagen verwendet wird, bestimmt. Typischerweise wird N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von etwa 50 bis etwa 200 ug/ml für etwa 0,5 bis etwa 1 Stunde verwendet; Ethylmethansulfonat wird in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 0,5 M für etwa 0,5 bis etwa 12 Stunden verwendet; 2-Aminopurin wird in einer Konzentration von etwa 100 bis etwa 500 ug/ml für etwa 3 bis etwa 24 Stunden verwendet; s-Bromuracil wird in einer Konzentration von etwa 20 bis etwa 100 ug/ml für etwa 1 bis etwa 12 Stunden verwendet; Acriflavin wird in einer Konzentration von etwa 1 bis 100 ug/ml für etwa 0,5 bis etwa 12 Stunden verwendet. Die Konzentration der anderen Mutagene und die Behandlungsdauer fallen in die Kenntnis eines Fachmannes und werden geeignet ausgewählt. UV-Bestrahlung wird bevorzugt durch Bestrahlung des Mediums für etwa 10 s bis etwa 3 min unter Verwendung einer 10 bis 70 cm über dem Medium angebrachten Quecksilberlampe mit 10 bis 15 W durchgeführt. Die Menge der einzustrahlenden Röntgenstrahlung beträgt etwa 10 000 bis etwa 100 000 Röntgen.
Ein besonders bevorzugtes Beispiel der vorstehenden Mutante, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist Arthrobacter ureafaciens M1057, der von Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 als Elternstamm durch Behandlung mit einem chemischen Mutagen erhalten wird.
Das Verfahren zur Herstellung der in Betracht gezogenen Mutante wird nachstehend anhand von Arthrobacter ureafaciens M1057 als ein Beispiel näher erläutert.
Der Stamm M1057 wird, wie folgt, hergestellt. Eine Öse des vorstehenden Elternstammes wird zuerst in L-Medium inokuliert, das 1,0 % Pepton (Gewichts-%; nachstehend das gleiche), 0,5 % Hefeextrakt und 0,1 % Glucose enthält und auf einen pH-Wert von etwa 7,2 eingestellt ist. Das Medium wird unter Schütteln bei 30ºC inkubiert. Die Bakterien werden in der mittleren Phase des logarithmischen Wachstums geerntet, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, wodurch eine Zellsuspension mit einer Konzentration von etwa 5 · 108 Zellen/ml hergestellt wird. Die so hergestellte Suspension wird mit Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von etwa 50 bis 200 ug/ml versetzt, und das Gemisch wird bei etwa 30ºC etwa 30 bis etwa 120 Minuten lang unter sanftem Schütteln inkubiert. Die Bakterien werden durch Zentrifugation gewonnen, mit physiologische Kochsalzlösung gewaschen und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Ein Aliquot der Suspension wird auf ein übliches Kulturmedium, wie ein festes Medium aus 0,5 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt und 0,2 % Agar (nachstehend als "YPA-Medium" bezeichnet), aufgebracht. Dieses wird bei etwa 30ºC unter Koloniebildung inkubiert. Jede gebildete Kolonie wird auf ein Medium (YP-Medium) überführt, das ein YPA-Medium ohne Agar ist, und über Nacht bei etwa 30ºC unter Schütteln weiter inkubiert. Nach Zentrifugation der so erhaltenen Kulturlösung wird die Neuraminidaseaktivität des Überstandes nach einem herkömmlichen Verfahren bestimmt, um einen Stamm mit ausgeprägter Produktivität für das gewünschte Enzym auszuwählen.
So wird der Stamm M1057 als einer der ausgewählten Stämme erhalten. Dieser Stamm unterscheidet sich deutlich von dem Elternstamm dahingehend, daß der erstere die Fähigkeit besitzt, beträchtliche Mengen an Neuraminidase in Abwesenheit einer induzierenden Substanz zu produzieren. Abgesehen von dieser Eigenschaft besitzt der Stamm die gleichen mykologischen Eigenschaften wie der Elternstamm. Somit wurde der Stamm als eine Mutante der Gattung Arthrobacter identifiziert.
Der vorstehende Stamm M1057 wurde am 11. Juni 1986 als Arthrobacter ureafaciens M1057 unter der Nummer FERM P-8804 bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, Japan, hinterlegt, und die Hinterlegung wurde in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-1391 am 5. Juni 1987 umgewandelt.
Die Forschung der Erfinder zeigte, daß nicht nur der Elternstamm (A. ureafaciens ATCC 7562), sondern auch die für das von den Erfindern früher etablierte Verfahren verwendeten, nützlichen Mikroorganismen, d. h. die der Gattung Arthrobacter mit der Fähigkeit zur Erzeugung von Neuraminidase in einem eine induzierende Substanz enthaltenden Medium, bei Behandlung mit Nitrosoguanidin, wie vorstehend beschrieben, auf ähnliche Weise reproduzierbar zu Mutanten mit der Fähigkeit zur Produktion einer beträchtlichen Menge an Neuraminidase in einem Medium ohne eine induzierende Substanz mutiert werden können. Ferner können von den verschiedenen genannten Mikroorganismen, einschließlich des vorstehenden Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562, als Elternstämme Mutanten mit einer vergleichbaren Fähigkeit zur Produktion von Neuraminidase auf ähnliche Weise reproduzierbar, unter Verwendung der vorstehenden Mutagene, durch chemische Mutagene und/oder Bestrahlungsverfahren, wie Röntgenstrahlen oder UV-Bestrahlung, anstelle des vorstehenden Nitrosoguanidins abgeleitet werden.
Diese Fakten scheinen anzuzeigen, daß die vorstehenden Mikroorganismen die latente Fähigkeit zur Produktion von Neuraminidase besitzen, die - obwohl sie üblicherweise unentwickelt bleibt - sich nach Aktivierung durch die vorstehende Mutationsbehandlung deutlich manifestiert. Jedenfalls war von keinem der Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter das Vorhandensein einer solchen deutlich verbesserte Enzymproduktivität bekannt, noch ist irgendwie bekannt, daß bekannte Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter zu einer solchen Enzymproduktivität nach Mutationsbehandlung veranlaßt werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann durch Inkubieren der Mutante der Gattung Arthrobacter, die auf vorstehende Weise erhalten wurde, durchgeführt werden.
Diese Inkubation kann unter Verwendung von entweder flüssigen oder festen herkömmlichen Medien durchgeführt werden, aber es ist im allgemeinen bevorzugt, ein flüssiges Medium zu verwenden. Inkubation unter Schütteln oder Inkubation unter Belüftung und Rühren wird bevorzugt durchgeführt, um eine große Menge des gewünschten Enzyms herzustellen. Die Medien für die vorstehende Inkubation sind nicht besonders beschränkt, und sind verschiedene Medien, die üblicherweise zur Inkubation von Mikroorganismen verwendet werden, und Nährstoffe etc. enthalten. Beispiele für die Nährstoffe sind Kohlenstoffquellen einschließlich Zuckern, wie Glucose, Fructose, Lactose, Invertzucker, verzuckerte Stärke, Sorbit und Glycerin, und organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Äpfelsäure und Bernsteinsäure, etc; Stickstoffquellen einschließlich Peptiden, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Casaminosäure, Harnstoff, Ammoniumsalz, Nitratsalz, etc., usw. Dem Medium können beispielsweise auch anorganische Phosphor-, Magnesium- Kalium-, Natriumsalze etc., eine Spurenmenge von Elementen wie Bor, Kupfer, Iod, Eisen, Mangan, Zink, Cobalt, Molybdän, und eine Spurenmenge an Wachstumsfaktoren, wie Hefeextrakt und Vitamine, und dergleichen zugesetzt werden. Weiter verwendbar als die vorstehenden Medien sind beispielsweise natürliche oder semisynthetische Medien, die einen Extrakt oder ein Exsudat aus tierischen Geweben enthalten. Beispiele für diese natürlichen oder synthetischen Medien sind solche, die unter dem Namen Todd Hewitt Broth Medium, Hirn-Herz-Infusionsmedium etc. vertrieben werden.
Bezüglich der Bedingungen, unter denen die Mutanten in den vorstehenden verschiedenen Medien inkubiert werden, beträgt die Inkubationstemperatur etwa 20 bis etwa 40ºC, bevorzugt etwa 25 bis etwa 30ºC. Die Neuraminidaseaktivität erreicht ein Maximum etwa 15 bis etwa 70 Stunden nach der Inkubation. Daher ist es vorteilhaft, die Inkubation in diesem Stadium zu beenden, und die gewünschte Neuraminidase aus der Kultur zu gewinnen. Die Gewinnung des gewünschten Enzyms aus der Kultur kann nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, z. B. durch Entfernen der Bakterien aus der Kulturlösung und Reinigen des Überstandes, z. B. durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Säulenchromatographie und dergleichen. So kann gereinigte Neuraminidase erhalten werden.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben.
Die Neuraminidaseaktivität in jeder Probe wird nach dem nachstehenden Verfahren bestimmt. Eine Gesamtmenge von 0,2 ml einer Lösung aus 0,1 ml einer Probenenzymlösung, 0,05 ml einer 0,4 %-igen N-Acetylneuraminosyl-Lactose-Lösung (Produkt von Boehringer-Mannheim-YAMANOUCHI) und 0,05 ml eines 0,2 M Essigsäurepuffers (pH 5,0) wurde bei 37ºC 10 min reagieren gelassen, und die Menge an freigesetzter N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure) wurde nach dem Thiobarbitursäureverfahren (L. Warren, J. Biol. Chem. 234 (1959) 1971) bestimmt.
Eine Einheit Neuraminidaseaktivität ist als die Aktivität definiert, bei der die Enzymlösung ein umol N-Acetylneuraminsäure pro Minute unter den vorstehenden Reaktionsbedingungen freisetzt.

Beispiel 1

In einen 500-ml Erlenmeyerkolben wurden 0,5 g Lactose, 0,2 g Diammoniumhydrogenphosphat, 0,3 g Natriumchlorid, 0,1 g Dikaliumhydrogenphosphat, 0,01 g Magnesiumsulfat und 100 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und dann durch Erhitzen unter Herstellung einer Kulturlösung sterilisiert.
Die vorstehende Kulturlösung wurde mit Arthrobacter ureafaciens M1057 (FERM P-8804) inokuliert und unter Schütteln bei 28ºC 24 Stunden lang inkubiert. Es wurden 105 ml Kulturfiltrat erhalten.
Die Neuraminidaseaktivität pro ml der erhaltenen rohen Enzymlösung betrug 2,8 Einheiten.
Anschließend wurden 100 ml des vorstehend erhaltenen Kulturfiltrats mit Ammoniumsulfat ausgesalzt, und eine Fraktion mit 30 bis 90 %-iger Sättigung (ausgedrückt nach dem Osborne-Verfahren) wurde in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und anschließend gegen 10 mM Essigsäurepuffer (pH 4,5) dialysiert. Lösliche Stärke und Colominsäure wurden in 2 N Natriumhydroxid gelöst, und Epichlorhydrin wurde zugesetzt, um ein Gel mit der Colominsäure als Ligand herzustellen. Das Dialysat wurde zur Adsorption durch die mit dem Gel gepackte Säule geleitet. Die Elution mit 100 mM Essigsäurepuffer (pH 4,5) ergab 273,8 Einheiten gereinigte Neuraminidase (Ausbeute: 97,8 %).
Es wurde gefunden, daß die so erhaltene, gereinigte Neuraminidase keine Protease, N-Acetylneuraminsäurealdolase, Phospholipase C und Glycosidasen enthielt.

Vergleichsbeispiel 1

Unter Verwendung des Elternstammes Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 anstelle der Mutante M1057 und unter Durchführung der Inkubation wie in Beispiel 1 wurde die so erhaltene Enzymaktivität bestimmt. Es wurde gefunden, daß die Enzymaktivität pro ml der Kulturlösung 0,002 Einheiten betrug.
Es sollte darauf hingewiesen werden, daß der Elternstamm eine Kulturlösung ergab, die eine Enzymaktivität von 3,2 Einheiten pro ml Kulturlösung zeigte, bei Inkubation in einem colominsäurehaltigen Medium aus 0,5 g Colominsäure, 0,2 g Diammoniumhydrogenphosphat, 0,3 g Natriumchlorid, 0,1 g Dikalium-hydrogenphosphat, 0,01 g Magnesiumsulfat und 100 ml Wasser, das auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und durch Erhitzen sterilisiert worden war.

Beispiel 2

In einen 500-ml Erlenmeyerkolben wurden 1,0 g Pepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Natriumchlorid und 100 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 6,5 mit Natriumhydroxid eingestellt und dann durch Erhitzen sterilisiert, wodurch eine Kulturlösung erhalten wurde. Das Medium wurde mit dem gleichen Arthrobacter ureafaciens M1057 wie in Beispiel 1 inokuliert, und das Inokulum wurde unter Schütteln bei 30ºC 24 Stunden lang inkubiert. Das so erhaltene Kulturfiltrat wurde als rohe Enzymlösung verwendet.
Die Neuraminidaseaktivität pro ml der Lösung betrug 3,0 Einheiten.
Das Dialysat davon wurde an einer Affinitätssäule adsorbiert, und die Elution wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Es wurden 292,2 Einheiten Neuraminidase erhalten (Ausbeute: 97,4 %). Wie in Beispiel 1 wurden keine verunreinigenden Enzyme beobachtet.

Claims

1. Mutante eines Bakteriums der Gattung Arthrobacter, erhältlich durch chemische und/oder Strahlungsmutagenese, wobei die Mutante von Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562, Arthrobacter aurescens ATCC 13344 oder Arthrobacter oxydans ATCC 14358 stammt und fähig ist, bei Inkubation in einem Nährmedium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Substanzen, aber keine induzierenden Substanzen enthält, Neuraminidase zu produzieren.

2. Mutante nach Anspruch 1, die von Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 stammt.

3. Mutante nach Anspruch 1, nämlich Arthrobacter ureafaciens M1057 (FERM P8804, FERM BP-1391).

4. Verfahren zur Herstellung von Neuraminidase, umfassend das Züchten einer Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die fähig ist, in Abwesenheit einer induzierenden Substanz Neuraminidase zu produzieren, und Gewinnung der Neuraminidase aus der erhaltenen Kultur.