Verfahren zur Herstellung eines neuen Glucosids
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tetra-O-acetyl-4'-demethyl-epipodophyl lotoxin.p.D.glucosid (Formel I, siehe Formelblatt) durch Kondensation von 4'-Carbobenzoxy-4'-demethyl-epipodo- phyllotoxin (Formel II) mit a-Acetobromglucose in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten organischen Lösungsmittel und in Gegenwart von Zinkoxyd oder Quecksilber-II-oxyd und anschliessende hydrogenolytische Abspaltung der Carbobenzoxygruppe aus dem so erhaltenen Tetra -0- acetyl 4' carbobenzoxy - 4'-demethyl-epipodo phyllotoxin-e-D-glucosid (Formel III).
Ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung bildet die Verwendung von Tetra-O-acetyl-4'.demethyl.epi.
podophyllotoxin-:B-D-glucosid zur Herstellung von 4'-De methyl-epipodophyllotoxin-p-D-glucosid (Formel IV) durch Alkoholyse von Tetra-O-acetyl-4'.deinethyl.epi.
podophyllotoxin-ss-D-glucosid in Gegenwart von wasserfreien Zinksalzen.
Die Herstellung des Tetra-O-acetyl-4'-demethyl-epi podophyllotoxin.p.D.glucosids stiess wegen der durch die ungünstige Lage der sekundären OH-Gruppe am C1 Atom bedingten sterischen Hinderung am Aglukon auf Schwierigkeiten. So war es nicht möglich, diese Verbindung z.B. unter den Bedingungen der Koenigs-Knorr Synthese in Benzol unter Zusatz von Silbersalzen (wie Ag2O oder Ag2CO3) oder in Acetonitril in Gegenwart von Hg(CN)2 in praktisch verwertbarer Ausbeute aus 4'-Demethyl-epipodophyllotoxin und ,-Acetobromglucose zu gewinnen.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass sich Tetra-O-acetyl-4'-demethyl.epipedophyllotoxin.i..D.
-glucosid in guter Ausbeute erhalten lässt, wenn man 4' Carbobenzoxy-4'-demethyl.epipodophyllotoxin mit - Acetobromglucose in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten organischen Lösungsmittel und in Gegenwart von Quecksilber-1I-oxyd oder Zinkoxyd umsetzt u.
aus dem so erhaltenen Tetra-O-acetyl.4'-carbobenzoxy- -4'-demethyl-epipodophyllotoxin-p - D - glucosid (Formel III) die Carbobenzoxygruppe auf an sich bekannte Weise hydrogenolytisch abspaltet. Unerwarteterweise tritt hierbei keine nennenswerte Epimerisierung am C-3-Atom auf.
Es war bekannt, dass Rhizome von Podophyllumarten Glucoside enthalten, die, wie z.B. Podophyllotoxinglucosid, eine mitosehemmende Wirkung besitzen. Versuche, auf synthetischem oder halbsynthetischem Wege zu einem der in Podophyllum emodi und Podophyllum peltatum enthaltenen Lignanglucosiden zu gelangen, führten wegen der Empfindlichkeit dieser Glucoside sowohl gegenüber Basen als auch Säuren bisher zu keinem Resultat. So lagern sich die Lignankomponenten, wie z.B. das Podophyllotoxin oder dessen synthetisch hergestellten l-Epi- derivate, wie z.B. das 4'-Demethyl-epipodophyllotoxin, unter Einwirkung von Basen sehr leicht durch Epimerisierung am C-3-Atom in die entsprechenden Pikroverbindungen um.
Ausserdem war es nicht möglich, aus den durch Kondensation des Aglukons (II) mit x-Acetobrom- glucose erhaltenen Tetra-O-acetylglucosiden (I und Ift) die Acetylgruppen unter den üblichen basischen oder sauren Bedingungen hydrolytisch abzuspalten und auf diese Weise zu dem intakten freien Glucosid (IV) zu gelangen. Wie oben erwähnt, erleiden Lignanglucoside durch Basen Epimerisierung, während dem die Einwirkung von Säuren zur Zersetzung unter Abspaltung des Zuckerrestes führen kann.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass im Falle des Tetra-O-acetyl-4'-demethyl-epipodophyllotoxin -e-D-glucosids die Abspaltung der Acetylreste ohne gleichzeitige Epimerisierung des Aglukons am C-3-Atom und ohne Abspaltung des gesamten Zuckerrestes erreicht werden kann, indem man diese Verbindung einer Alkoholyse in Gegenwart eines Zinksalzes unterwirft.
Eine vorzugsweise Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass man 4'-Carbobenzoxy-4'-demethyl-epipodophyllotoxin mit Aceton bromglucose in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B.
Äthylenchlorid, oder vorzugsweise Acetonitril, bei Temperaturen von 20-800, vorzugsweise zwischen 40 bis 70 , in Gegenwart von Quecksilber-II-oxyd oder Zinkoxyd umsetzt. Die von der Temperatur, Konzentration der Ausgangsstoffe und Korngrösse des Metalloxyds abhängige Reaktionsdauer liegt im Bereich von 0,5 bis 12 Stunden. Um einen möglichst hohen Umsatz von 4'-Car bobenzoxy-4'-demethyl-epipodophyllotoxin bei der Glucosidierung zu erreichen, wird die oc-Acetobromglucose in 2-4fachem molaren Überschuss angewandt. Das Metalloxyd setzt man in der gleichen molaren Menge wie die z-Acetobromgl ucose ein. Die Anfangskonzentration von 4'-Carbobenzoxy-4'-demethyl -epipodophyllotoxin im Lösungsmittel soll zwischen 5-20 Gewichts-% betragen.
Der Reaktionsverlauf wird durch laufende Probeentnahmen dünnschichtchromatographisch auf Kieselgelplatten mit dem Fliessmittel Chloroform + 10% Aceton verfolgt (Entwicklung der Chromatogramme durch Besprühen mit einer 0,2%igen Cer(IV)-sulfatlösung in 50%iger Schwefelsäure und Erhitzen auf 110 bis 1300).
Zur Isolierung des Tetra-O-acetyl-4'-carbobenzoxy -4'-demethyl-epipodophyllotoxin-wp-D-glucosids wird vom überschüssigen Metalloxyd abfiltriert, das Lösungsmittel im Vakuum grösstenteils abdestilliert und der Rückstand zur Entfernung von Quecksilbersalzen mit Natriumbro mid-Lösuna bzw. von Zinksalzen mit Wasser-Methanol (9 :1) waschen. Zur Entfernung des Hauptteils der Zersetzungsprodukte wird das Reaktionsgemisch entweder einer Vorchromatographie unterworfen oder mit 5 001cigem wässrigem Äthanol bei erhöhter Temperatur ausgezogen. Zur weiteren Reinigung werden die Spitzenfraktionen der Chromatographie unterworfen bzw. der äthanohmlösliche Rückstand an Kieselgel nachchromatographiert.
Das dabei anfallende rohe Tetra-O-acetyl -4' - carbobenzoxy - 4' - demethyl- epipodophyllotoxin-,-D- -¯lucosid wird hierauf direkt der Hydrogenolyse unterworfen. Hierbei wird zweckmässigerweise ohne über druck und bei 200 bis maximal 400 in Gegenwart von Palladium-Katalysatoren, wie z.B. Pd auf Kohle oder auf Bariumsulfat hydriert.
Als Lösungsmittel kommen vorzugsweise Alkohole, wie z.B. Methanol, Äthanol, unter Zusatz von 2-5 Volumen-prozenten Eisessig und 10-40 Volumen-prozenten Aceton in Frage. Die Katalysatormenge beträgt 1-5 Ge wichtsprozent, bezogen auf eingesetzte Substanz.
Aus dem nach der Hydrierung anfallenden Rohprodukt kann durch Chromatographie oder Kristallisation das reine Tetra-O-acetyl-4'-demethyl-epipodophyllotoxin- -3-D-glucosid erhalten werden. Die Entacetylierung des Tetra-O-acetyl-4'-demethyl-epipodophyllotoxin - - D-glucosid erfolgt durch Alkoholyse vorzugsweise mit Me thanol in Gegenwart von wasserfreien Zinksalzen, vor zusweise Zinkacetat.
Die Methanolyse führt man in wasserfreiem Methanol mit oder ohne Zusatz von inerten Verdünnungsmitteln, z.B. Dioxan. Tetrahydrofuran, bei Rückflusstempe raturen durch. Die Katalysatormenge liegt bei ca. 20-50 Gewichtsprozent. bezogen auf eingesetztes Tetra-O-ace tyl-4'-demethyl-epipodophyllotoxin-8-D-glucosid. Die Re (ktionszeit liegt zwischen 15 und 30 Stunden. Nach Ein dampfen wird der Rückstand in Chloroform-Butanol -Gemisch gelöst und die Zinksalze durch Ausschütteln rnit Wasser entfernt. Aus der organischen Phase gewinnt man nach dem Eindampfen das rohe 4'-Demethyl-epipodophyllotoxin-3-D-lucosid.
Bei der Methanolyse von Tetra-O-acetyl-4'-demethyl- -epipodophyllotoxin-o-D-glucosid bildet sich bei Verwen dung von Zinkacetat als Katalysator im Verlaufe der Re aktion eine Fällung. Zur Aufarbeitung wird dieser Nie derschlag durch Zusatz von Essigsäure unter leichtem
Erwärmen in Lösung gebracht. Nach Abdampfen der
Lösungsmittel und Entfernung der Zinksalze, wird das rohe 4'-Demethyl-epipodophyllotoxin-p-D-glucosid -wie oben beschrieben gewonnen. Die Reinigung roher Präparate erfolgt zweckmässig durch Chromatographie an Kieselgel und Kristallisation der Spitzenfraktionen aus Methanol.
Reines 4' -Demethyl-epipodophyIlotoxin-9-D- -glucosid wird in Form weisser Kristalle vom Smp. 2222300 oder vom Smp. 262-264 erhalten.
Das als Ausgangsmaterial verwendete, bisher unbekannte 4'-Carbobenzoxy-4'-demethyl-epipodophyllotoxin wird hergestellt, indem man 4'-Demethyl-podophyllotoxin epimerisiert (siehe Beispiel I) und das dabei entstehende 4'-Demethyl-epipodophyllotoxin mit Carbobenzoxychlorid umsetzt (siehe Beispiel 2).
4'-Demethyl-epipodophyllotoxin-1,3- D-glucosid besitzt eine starke und selektive Hemmwirkung auf die Teilungsvorgänge im Zellkern und kann in den Fällen nutzbringend angewandt werden, in denen aus medizinischen oder anderen Gründen die Zellteilung bzw. die Zellvermehrung verlangsamt oder verhindert werden soll.
Die neue Verbindung kann als Arzneimittel allein oder in entsprechenden Arzneiformen für orale, enterale oder parenterale Verabreichung verwendet werden.
Zwecks Herstellung geeigneter Arzneiformen wird diese mit organischen oder anorganischen, pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verarbeitet. Als Hilfsstoffe werden verwendet z.B.
für Tabletten und Dragees: Milchzucker, Stärke, Talk,
Stearinsäure usw.
für Sirupe: Rohrzucker-, Invertzucker-, Glucoselösungen u.a.
für Injektionspräparate: Wasser, Alkohole, Glycerin, pflanzliche Öle und dgl.
für Suppositorien: natürliche oder gehärtete Öle, Wachse u.a. mehr.
Zudem können die Zubereitungen geeignete Konservierungs-, Stabilisierungs- Netzmittel, Lösungsvermittler, Süss- und Farbstoffe, Aromantien usw. enthalten.
4'-Demethyl-epipodophvllotoxin- - D-glucosid findet ferner Verwendung als Zwischenprodukt zur Synthese von weiteren, cytostatisch hochaktiven Verbindungen, so z.B. der entsprechenden Aralkylidenverbindungen, deren Herstellung in der Schweizer Patentschrift Nr. 469 000 beschrieben ist.
In den nachfolgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Die Schmelzbzw. Zersetzungspunkte sind auf dem Kofler-Block bestimmt.
EMI2.1
EMI3.1
EMI3.2
EMI3.3
Beispiel I ) 4'-Demethyl-epipodophyllotoxin
2 g 4'-Demethyl-podophyllotoxin werden in 25 ml Aceton und 15 ml Wasser gelöst und nach Zusatz von 5 ml konz. Salzsäure 2 Stunden unter Rückfluss erwärmt.
Danach wird die Säure mit festem Bariumcarbonat neutralisiert, filtriert und das Filtrat im Vakuum bei 400 vom Aceton befreit. Das ausgefallene Material wird in Chloroform und 5% Aceton aufgenommen, die Lösung über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der verbleibende Rückstand wird an Kieselgel mit Chloroform + 1% Methanol chromatographiert, wobei man zuerst geringe Mengen Verunreinigungen, dann reines 4'-Demethyl-epipodophyllotoxin und schliesslich unumgesetztes Ausgangsmaterial erhält.
Kristallisation der reinen Fraktionen von 4'-Demethyl-epipodophyllotoxin erfolgt aus Chloroform und Methanol. Smp. 228-2300, [15C]D = -69,80 (c = 0,630 in Chloroform).
b) 4'-Carbobenzoxy-4'-demethyl-epipodophyllotoxin
60 g staubfein pulverisiertes 4'-Demethyl-epipodophyllotoxin werden in 1000 ml wasserfreiem Äthylenchlorid suspendiert und nach Versetzen mit 19 ml abs.
Pyridin auf -100 abgekühlt. Unter Rühren und Feuchtigkeitsausschluss wird bei - 100 innert 2,5 Stunden eine Lösung von 34 g Chlorameisensäure-benzylester in 100 ml Äthylenchlorid zugetropft und danach eine weitere halbe Stunde reagieren gelassen. Anschliessend wird die Reaktionslösung mit Wasser gewaschen, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum bei 70-800 getrocknet.
Kristallisation des Rohproduktes aus Aceton Äther und dann zweimal aus Methanol liefert 4'-Carbobenzoxy-4'-demethyl-epipodophyllotoxin vom Doppelschmelzpunkt 117-119 /202-205 . Durch Trocknen im Hochvakuum zuerst bei 95-1100 und dann bei 1300 oder Kristallisation aus Aceton-Äther wird die lösungsmittelfreie Form vom Smp. 201-2040, [sc]D21 = -43,90 (c = 0,535) in CHCIs, erhalten.
r) Tetra-O-cEctyl-4'-demethyl-epipodophvl -glucosid
8,56 g 4'-Carbobenzoxy-4'-demethyl-epipodophyllotoxin werden in 55 ml Acetonitril bei 650 bis zur Lösung verrührt, 3,92 g trockenes Zinkoxyd zugesetzt und nach Zugabe von 20,0 g a-Acetobromglucose unter Feuchtigkeitsausschluss bei 650 verrührt. Nach je 10 Minuten wird eine Probe entnommen und im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel/Chloroform + 10% Aceton) untersucht. Nach vollständigem Umsatz der Acetogramglucose (ca. 40-60 Minuten nach Beginn der Reaktion) kühlt man auf Zimmertemperatur ab, verdünnt mit 50 ml Chloroform, filtriert nicht umgesetztes Zinkoxyd ab und dampft das Filtrat im Vakuum bei 400 auf ein Volumen von ca.
20 ml ein. Dieses Konzentrat wird in 250 ml Chloroform gelöst, die Chloroformphase zweimal mit je 300 ml Wasser-Methanol (9 :1) gewaschen und die Chloroformschicht nach Trocknung über Natriumsulfat im Vakuum eingedampft. Den getrockneten Rückstand extrahiert man viermal mit je 70 ml siedend-heissem Äthanol-Wasser - 1: 3-Gemisch. Den Äthanol-unlöslichen Anteil chroma- tographiert man an der 50fachen Menge Kieselgel mit Chloroform-Aceton (95 : 5) als Elutionsmittel.
Die reinen Glucosidfraktionen werden vereinigt und ergeben nach Trocknung im Hochvakuum bei 800, 7 g Tetra-O- acetyl - 4' - carbobenzoxy -4'-demethyl-epipodo phyllotoxin--D-glucosid. Zur Abspaltung des Carbobenzoxyrestes werden 7 g dieser Verbindung in 250 ml Äthanol-Aceton-4:1 gelöst, mit 10 ml Eisessig und 2 g Palladium-Kohle (mit 10% Pd) versetzt und bei 200 hydriert. Danach filtriert man vom Katalysator ab, wäscht diesen mit warmem Chloroform-Methanol-Gemisch (1:1) nach und dampft das Filtrat im Vakuum ein. Den Rückstand kristallisiert man aus Methanol und dann mehr mals aus Äthanol.
Tetra-O-acetyl-4'-demethyl-epipodo phyllotoxin-9-D-glucosid kristallisiert in feinen Nadeln vom Smp. 213.2170, []D21 = 48,50 (c = 0,536) in Chloroform.
Beispiel 2 4'-Demethvl-epipodopzyllofoxin-B-D-X
2.0 g des nach Beispiel 3 erhaltenen Tetra-O-acetyl .4'.demethyl.epipodophyllotoxin--D-glucosid und 1 g wasserfreies Zinkacetat werden in 30 ml absolutem Methanol 25 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Anschliessend wird der entstandene weisse Niederschlag durch Zusatz von wenigen ml Eisessig und leichtem Erwärmen in Lösung gebracht, das Lösungsmittel im Vakuum bei 40 entfernt und der Rückstand in 50 ml Chloroform-Butanol (4:1) aufgenommen. Die organische Phase wäscht man zweimal mit je 10 ml Wasser, dampft nach Trocknung über Natriumsulfat im Vakuum ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel.
Isopropylacetat -Methanol (9:1), wassergesättigt, eluiert zuerst unpolare Anteile, dann reines 4'.Demethyl-epipodophyllotoxin-p- -D-glucosid. Die einzelnen Fraktionen werden im Dünn schichtchromatogramm auf Kieselgelplatten mit dem Fliessmittel Isopropylacetat-Methanol (8:1), wassergesättigt, untersucht und die Glucosidfraktionen vereinigt und zweimal aus Methanol kristallisiert. 4'-Demethyl-epipodo- phyllotoxin--D-glucosid schmilzt bei 222.2300, eine andere Modifikation bei 262.2640, [sc]D21 = - 880 (c = 0.507) in Methanol.