Procédé de préparation d'antigènes cellulaires
On sait que les antigènes cellulaires à base de tissus ou d'organes broyés sont injectés à des animaux pour l'obtention de sérums antitissulaires. Toutefois, les rendements en anticorps obtenus jusqu'à ce jour pour un animal donné sont relativement faibles, du fait que le volume d'antigène pouvant être injecté est limité.
Le procédé de préparation des antigènes cellulaires selon l'invention permet d'obtenir, pour une injection de volume donné, une bien meilleure production d'anticorps tant en qualité qu'en quantité.
La présente invention a pour objet un procédé nouveau de préparation d'antigènes cellulaires, destinés à être injectés à des animaux pour l'obtention de sérums antitissulaires, qui est caractérisé en ce qu'on prépare une première solution en faisant macérer en solution aqueuse un organe ou du tissu broyé, dont on désire obtenir l'antigène, puis en centrifugeant pour en éliminer le résidu, puis une deuxième solution en reprenant par un mélange d'eau et d'alcool éthylique le résidu laissé lors de la préparation de la première solution, puis en éliminant le résidu solide par centrifugation, et enfin une troisième solution en dissolvant dans du sérum physiologique de l'acide nucléique purifié provenant du même organe ou tissu utilisé pour préparer la première solution,
et en ce qu'on mélange ces trois solutions immédiatement avant l'injection à l'animal.
De préférence, la préparation de la troisième solution comprend les opérations suivantes: séchage, broyage et dégraissage de la poudre d'organe ou de tissu, extraction de la nucléine brute et purification de Placide nucléique.
Exemple I - Préparation de la première solution
dite solution aqueuse :
On fait macérer pendant un mois 8 la ; tempéra- ture ordinaire une partie en poids de foie préalablement broyé, avec 4 parties en poids d'une solution aqueuse à 1 0/o d'orthoxyquinoléiné, puis on centri- fuge le mélange de façon à éliminer le résidu solide, et on prélève le liquide surnageant, enfin, par addition de sérum physiologique, on ajuste à une valeur prédéterminée la teneur en extrait sec du soluté ainsi obtenu.
Il - Préparation de la deuxième solution
dite solution alcoolique :
On fait macérer à la température ordinaire pendant un mois, le résidu de centrifugation de la solution aqueuse , dans une solution aqueuse d'alcool à 45 /o, après quoi on centrifuge, puis on sépare le liquide surnageant qui constitue la seconde solution.
On conserve la solution aqueuse ainsi que la solution alcoolique ainsi obtenues dans un réfrigérateur maintenu à la température de - 200 C.
III-Préparation de la troisième solution
dite solution nucléique :
On congèle le foie immédiatement après son prélèvement sur un animal de même espèce que celui utilisé pour la préparation des deux premières solutions, puis on sèche à 250 C sous vide, après quoi on procède au broyage et au tamisage du foie de façon à obtenir une poudre d'un degré de finesse suffisant.
On procède au dégraissage Ide la poudre de foie ainsi obtenue en la mettant en contact pendant 15 heures avec du toluène à raison de 2 litres de toluène par kg de poudre. Après filtration r un filtre à as piration communément désigné sous le nom de Bil-chuer , et essorage, on reprend la poudre par de l'acétone, à raison de 2 litres d'acétone par kg de poudre. On procède à une nouvelle filtration sur
Büchner et à un nouvel essorage, puis on fait sécher la poudre en l'étalant en couches minces sur des plateaux, pendant 15 heures à la température ambiante.
La perte de poids lors du dégraissage est ide l'ordre de 7 à 10 o/o du poids initial d'organe séché.
Pour extraire la nucléine brute, on délaye dans 6 litres d'eau 2 kg de la poudre de foie dégraissée et séchée comme indiqué cidessus, puis on verse la solution ainsi obtenue dans une solution boufflante ayant la composition suivante: eau distillée 14 14 litres
acétate de soude 1000 g
lessive de soude 800 cc
On agite, afin d'obtenir un mélange homogène, puis on porte à l'ébullition et on maintient pendant 2 heures le mélange au contact d'un bain-marie bouillant.
On ajoute alors à ce mélange 6,6 litres d'eau distillée bouillante et de l'acide acétique en quantité suffisante pour obtenir une solution ayant un pH égal à 6,5, ce qui a pour effet de précipiter et de séparer les matières inertes.
On chauffe à l'ébullition, puis on filtre la solution bouillante sur un filtre à sirop. On concentre de manière à obtenir un volume correspondant à 7 kg de solution, cette concentration étant réalisée pro- gressivement, sans faire bouillir.
Après refroidissement, on précipite dans 10 litres d'alcool absolu refroidi à la température de 50 C de façon à obtenir une solution alcoolique titrant approximativement 60 à 70 o/o d'alcool, puis on laisse reposer ce mélange pendant 15 heures environ.
Pour purifier l'acide nucléique, on prélève la liqueur alcoolique surnageante, puis on centrifuge pendant 15 minutes le mélange restant.
On lave le précipité obtenu, une première fois à l'alcool à 80 /o, puis une seconde fois à l'alcool à 95 O/o, chaque lavage étant suivi d'une centrifugation.
On délaye dans 4 litres d'eau bouillante le précipité obtenu après la dernière centrifugation.
On maintien la solution à une température de 90 à 95O C pendant 1/2 heure, puis on y ajoute 132 cm d'une lessive de soude à 50 O/o. On filtre la solution bouillante sur filtre à sirop, puis on laisse reposer pendant 15 heures. On ajoute ensuite 2 g de norite par litre de filtrat, puis on filtre sur Chardin.
On amène la solution à un pH de 4,8 au moyen d'acide acétique et on ajoute 10 litres d'alcool absolu refroidi à + 50 C.
Après une décantation d'une durée de 2 jours environ, on prélève la liqueur alcoolique surnageante, on déshydrate le précipité restant au moyen d'acétone, puis on le sèche. Le produit ainsi obtenu constitue la nucléine spécifique du foie et renferme 6,5 O/o de phosphore et 12 o/o d'azote.
On réalise une purification complémentaire de nucléine en pulvérisant 20 g de nucléine dans un mortier, puis en la délayant dans une solution comprenant 1000 cmg d'eau distillée et 10 cm3 d'une lessive de soude à 50 O/o. On porte cette solution à la température de 700 C, puis on refroidit.
Après centrifugation pendant au moins un quart d'heure, on ramène la solution à un pH égal à 8 au moyen d'acide acétique cristalLisé. On verse un volume de cette solution limpide, refroidie à une température de 20 C, dans 1,25 volume d'acide acétique 2N également refroidi à la température de 20 C, on laisse en contact pendant une heure environ, puis on centrifuge pendant 5 minutes et on lave le précipité, tout d'abord deux fois à l'alcool à 95 o/o et une fois à l'éther; finalement, on sèche le précipité à l'étuve puis on le pèse. On pulvérise dans un mortier le produit sec ainsi obtenu puis on le mélange avec un poids égal d'acétate de soude pur cristallisé.
On dissout ce mélange dans l'eau distillée en utilisant 66con d'eau distillée par gramme d'acétate de soude. On -porte la solution à la température de 700 C, puis on y ajoute de l'alcool à 95 o/o à raison de 30 cm3 d'alcool par gramme d'acétate de soude.
Après un repos de 15 heures, on centrifuge puis on verse la solution surnageante dans 1,25 volume d'acide acétique 2N à la température de 20 C. On laisse reposer de une heure à deux heures, puis on lave à l'éther, on sèche et on pèse. On traite le produit obtenu en opérant dans les mêmes conditions que précédemment, mais toutefois sans chauffer à 700 C et sans ajouter d'alcool.
Après un nouveau lavage à l'alcool et à l'éther, on obtient un produit qui constitue l'acide nucléique purifié; ce produit
Tenferme une quantité de phosphore de l'ordre de 7 /o et une quantité d'azote de l'ordre de 12 /o. Si l'on désire obtenir le sel de sodium de l'acide nucléique, on précipite la dernière solution par 2,8 volumes d'alcool à 95 O/o, cette opération étant réalisée à la température de 300 C.
Immédiatement avant l'injection à l'animal, on prépare la solution dite solution nucléique en dissolvant dans 100 g de sérum physiologique 1 g du produit sec obtenu suivant le procédé décrit ci-dessus.
En même temps, on ramène à la température ambiante la solution aqueuse et la solution alcoolique préparées comme indiqué sous I et II.
Enfin, on mélange par parties égaies les trois solutions ainsi obtenues. On obtient ainsi l'antigène qui doit être injecté immédiatement à l'animal.
Le procédé conforme à Invention permet d'obtenir un antigène tissulaire ayant une grande efficacité sous un faible volume. En effet, conformément à l'invention, on prépare cet antigène en dissolvant tout d'abord par une solution aqueuse, ensuite par une solution alcoolique toutes les substances solubles du tissu, puis en ajoutant à ces deux solutions une solution d'acide nucléique purifiée et concentrée provenant d'un tissu de même origine.
Un tel procédé de préparation permet d'obtenir en solution, immédiatement avant l'injection, une quantité de produit actif qu'il était impossible d'obtenir jusqu a ce jour du fait que les seuls antigènes qui étaient connus étaient constitués soit par des so lutions aqueuses, soit encore par des solutions s alcoo- liques.