Procédé de déshydrogénation d'un 3-céto-stéroïde non saturé en position 4(5) Le présent brevet a pour objet un procédé pour la déshydrogénation de 3-céto-stéroïdes non saturés en position 4(5), en vue d'introduire une double Sai son dans le noyau, au moyen d'enzymes oxydantes élaborées par des micro-organismes.
On a trouvé qu'en soumettant un 3-céto-stéroïde non saturé en position 4(5) à l'action oxydante d'en zymes produites par une espèce du genre Mycobacté- rium, on introduit dans le noyau une double liaison, généralement en position 1(2). Dans certains cas, notamment quand la progestérone forme la matière initiale, de faibles proportions d'un produit de réduc tion, dans lequel la double liaison en position 4(5) a été saturée, se forment également. En outre, il peut arriver que la déshydrogénation soit accompagnée de l'introduction d'un ou plusieurs groupes oxy.
Le procédé de la présente invention peut être mis en oeuvre en soumettant le stéroïde choisi, en solu tion aqueuse ou en suspension, à l'action d'une cul ture de Mycobactérium en croissance active, de cel lules de Mycobactérium séparées de la culture en croissance et mises en suspension dans un milieu ap proprié, ou d'extraits d'enzymes oxydantes obtenus à partir d'une culture d'une espèce du genre Mycobac- térium.
Divers 3-céto-stéroïdes non saturés en position 4(5) peuvent être employés comme matière initiale pour le procédé selon la présente invention. Ces com posés comprennent des substances comme la testo stérone, la stigmasténone, la 17-hydroxy-11-désoxy- corticostérone, la 11-désoxy-corticostérone, et d'au tres composés analogues, qui correspondent à la for mule
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dans laquelle R représente de l'hydrogène, un reste hydroxyle, alcoyle, acyle saturé ou non, -CO-CH20H, -CO-CH20-acyle, -CO-CH20-alcoyle, etc.,
les res tes alcoyle ou acyle ne contenant pas plus de 10 atomes de carbone; Ri peut être de l'hydrogène, un radical hydroxyle ou -O-acyle. R et RI peuvent aussi représenter ensemble un groupe céto. L'emploi dans la formule ci-dessus de traits pleins reliant les restes R et Ri ne tient pas compte des stéréisomères, R ou RI pouvant avoir la configuration a ou [3.
Les produits obtenus peuvent être isolés et iden tifiés par des chromatogrammes sur papier. Cette mé thode est connue et décrite par exemple dans le Rap port du XIIe Congrès International de Chimie pure et appliquée.
Pour la mise en oeuvre du procédé différentes es pèces du genre Mycobactérium peuvent être em ployées. Celles-ci comprennent des espèces connues telles que Mycobactérium <I>espèce 607, M.</I> beroli- nense, <I>M.</I> lacticola, <I>M.</I> thamnopheos et, en particu lier, des souches de l'espèce M. smegmatis ATCC 101. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre du procédé.
Suivant la première, des milieux nutritifs sont ensemencés par des cultures en tubes obliques des mycobactéries choisies. Un tel mi lieu peut se composer, par exemple, d'un bouillon nutritif habituel et de glycérine. Un agent tensio- actif, tel qu'un dérivé polyoxyéthylène d'un ester d'un alcool à 6 atomes de carbone avec un acide gras, par exemple Tween 80 (marque déposée), est utile lorsqu'il est ajouté au milieu en une faible proportion. L'addition d'asparagine est également utile.
Les solutions nutritives ensemencées et stériles peuvent être cultivées dans des flacons agités pendant deux à trois jours afin d'obtenir un inoculum apte à être transféré dans des récipients plus grands, agités et aérés et donnant à leur tour les cultures néces saires pour l'inoculation de cuves utilisées pour la fermentation submergée, à l'échelle industrielle. Le même milieu du type décrit ci-dessus peut être em ployé pour le traitement de stéroïdes selon la pré sente invention, à grande échelle. Naturellement, le milieu peut varier considérablement.
En général, il contient en tout cas un hydrate de carbone, une source de composés organiques d'azote, des sels mi néraux et des traces de différents métaux.
Le composé stéroïde peut aussi être ajouté di rectement à une portion stérilisée de milieu nutritif, tel que décrit ci-dessus, et ensuite le milieu est ense mencé avec les mycobactéries choisies. Approxima tivement la même proportion de composé stéroïde choisi peut être utilisée aussi dans ce cas. Des prises d'essai du mélange agité et aéré peuvent être enle vées à des intervalles pour déterminer la conversion du composé stéroïde en produit désiré.
Le mélange est maintenu à une température de 25o à 30o C pen dant la croissance des cellules et la conversion du sté roïde. Généralement de deux à sept jours sont néces saires pour la production maximum des composés désirés. Alternativement, la croissance des cellules peut être établie avant l'addition du stéroïde.
Suivant la deuxième méthode, les cellules sont séparées des cultures en croissance, et mises en sus pension dans un milieu approprié. Un tel milieu peut se composer par exemple, d'une solution 0,01 molaire en fumarate de sodium ou autre accepteur d'hydro gène et en sulfate de magnésium et 0,03 molaire en citrate de sodium.
La présence d'une certaine quan tité de triphosphate d'adénosine, par exemple 0,125 1% est aussi très utile. Des cellules lavées et centrifugées du Mycobactérium choisi peuvent être mises en suspension dans un tel milieu ajusté a un pH d'environ 6, par exemple à l'aide d'acide citri que. Après l'addition du composé stéroïde à traiter, le mélange peut être soumis à l'inoculation à 370 C.
En général, la transformation maximale est atteinte après environ 1 à 4 jours. L'emploi de la suspension des cellules d'environ 100 millilitres des cultures agi tées et aérées de mycobactéries dans environ 20 mil lilitres du- milieu susmentionné et d'environ 25 à en- viron 200 milligrammes de stérôide par 100 millili tres du milieu donne de bons résultats.
Suivant la troisième méthode on utilise les en zymes oxydantes élaborées par les mycobactéries. Ces enzymes peuvent être formées pendant la fermenta tion et soit sécrétées par le micro-organisme, ou rete nues dans les cellules de celui-ci. Dans le premier cas, le milieu exempt de cellules, sur lequel l'organisme a fait sa croissance, peut être utilisé pour effectuer la conversion des composés stéroïdes choisis.
Dans le second cas, les enzymes peuvent être libérées des cel lules par plusieurs procédés connus tels que le broyage, l'autolyse, le gel et le dégel rapides et répé tés de la matière cellulaire ou l'emploi d'un solvant miscible à l'eau, en particulier de l'acétone. Les en zymes de mycobactéries peuvent être utilisées dans des milieux similaires à ceux utilisés avec les cellules cultivées, c'est-à-dire un milieu comprenant un ac cepteur d'hydrogène tel qu'un fumarate, un tampon et dans quelques cas, un métal bivalent, en particu lier du magnésium, ainsi qu'une faible proportion de triphosphate d'adénosine.
Les enzymes oxydantes de mycobactéries, exemptes de cellules, peuvent être em ployées dans des milieux indiqués ci-dessus à une température d'environ 200 à environ 400 C. En gé néral, la déshydrogénation des composés stéroïdes choisis nécessite de quelques heures à trois jours.
La méthode la plus convenable pour suivre le cours de la réaction est celle de la chromatographie sur papier, par exemple du papier imprégné d'alu mine en utilisant pour le développement des chro- matogrammes les systèmes solvants suivants Système I - Hexane Système II -Hexane-éther (19 volumes à 1 volume) Système III - Hexane-éther (16 volumes à 1 volume) Système IV - Ether. Un autre mode d'exécution consiste à employer des feuilles de papier-filtre non traitées et à dévelop per avec le système V, se composant de benzène sa turé avec de l'eau. Le papier est alors enlevé et sé ché à la température ambiante.
Des méthodes diverses et bien connues peuvent être employées afin de détecter les différents stéroï des sur les chromatogrammes sur papier, par exem ple l'examen à l'aide d'un explorateur fluorescent, tel que décrit par Haines et al., Fédération Procee- dings., Volume 9, p. 180 (1950), ou phosphorescent. Des échantillons types des stéroïdes connus peuvent être développés côte à côte avec la matière préparée selon l'invention. De cette manière il est possible de distinguer les stéroïdes nouvellement produits.
Une autre méthode pour déceler les composés stéroïdes sur les feuilles de papier consiste en un traitement dans une atmosphère de chlore suivi de l'arrosage avec une solution de 380 grammes de trichlorure d'antimoine dans 100 millilitres d'anhydride acéti que, du chauffage à 90 - 1000 C jusqu'à siccité et de l'examen dans une chambre obscure avec une lampe. solaire en utilisant un filtre Corning N 9863.
Pour déceler les stéroïdes qui possèdent une chaîne latérale 21-hydroxy-20-céto on arrose le pa pier avec une solution de chlorure de triphényl-tétra- zolium dans l'hydroxyde de potassium alcoolique tel que décrit par Burton et al. J. Biol. Chem, Volume 188, p. 763 (1951).
Les produits obtenus par le nouveau procédé dé crit peuvent être isolés de leur solution aqueuse par extraction à l'aide de divers solvants organiques non miscibles à l'eau. Les hydrocarbures halogénés infé rieurs, tels que le chloroforme, sont particulièrement utiles. Après l'extraction le solvant peut être enlevé par distillation et le produit solide est alors isolé. Cette matière peut être ensuite purifiée par recris tallisation dans des solvants organiques ou par chro matographie, par exemple sur des colonnes d'alu mine ou d'autres matières solides adsorbantes appro priées. L'emploi d'une colonne gel de silice-éthanol avec un mélange de 98 % à 2 % en volume de chlorure de méthylène et d'éthanol (95 0/0) comme développant s'est avéré particulièrement utile.
Des méthodes pour la séparation de produits de cette na ture ont été décrites récemment dans la littérature. Pour certains usages il n'est pas nécessaire de sépa rer les produits, mais le mélange brut peut être di rectement employé. Dans certains cas on a trouvé qu'il est avantageux d'acyler les produits bruts et d'opérer avec les esters résultants qui sont quelque peu plus stables.
Les produits obtenus sont utiles comme intermé diaires dans la synthèse d'autres produits de valeur. Par exemple les produits déshydrogénés, qui contien nent une non-saturation en position 1(2), en même temps que le groupe 3-céto et la non-saturation en position 4(5), sont particulièrement susceptibles d'aro matisation selon Inhoffen. On obtient ainsi un groupe de dérivés de l'estrone. L'introduction de groupes oxy dans les noyaux des stéroïdes déshydrogénés confère à ces molécules de nouveaux centres chimiquement actifs, et augmente fortement leur aptitude à subir d'autres réactions chimiques.
<I>Exemple I:</I> A une culture de Mycobactérium smegmatis cul tivée sur un milieu d'agar solide on ajoute 50 milli litres d'une solution nutritive ayant la composition suivante Bouillon nutritif solide . . .
8 g/litre Glycérine ............... 20 cç/litre Tween 80 (marque déposée) 0,2 cc/litre Asparagine ............ 5 g/litre Le milieu est stérilisé avant l'ensemencement, placé dans un flacon d'Erlenmeyer de 250 millilitres et secoué à 27o C pendant trois jours.
Le contenu d'un flacon à secouer est utilisé pour inoculer deux litres du même milieu stérilisé dans une cuve de 4 li tres équipée pour opérer la fermentation sous condi tions submergées, l'agitateur tournant à- une vitesse de 1750 tours par minute. L'aération est continuée pendant 48 heures à une vitesse d'un volume d'air stérile pour un volume de milieu par minute. Les cel lules formées sont alors essorées et lavées à l'eau.
On prépare un milieu contenant 0,01 mol de fu- marate de sodium, 0,01 mol de sulfate de magné sium, 0,03 mol de citrate de sodium par litre ainsi que 0,125,% de triphosphate d'adénosine. Vingt mil- lilitres de ce milieu sont placés dans un flacon d'Er- lenmeyer de 125 millilitres.
Après ajustage du pH à 6,0 à l'aide d'acide citrique, le mélange de réaction est additionné de 25 mg d'acétate de composé S. Le mélange réactionnel est ensemencé avec les cellules de 100 millilitres de la fermentation et le mélange incubé à 37 C. Des échantillons sont pris à des in tervalles, et les stéroïdes présents extraits au moyen de chloroforme. Après séparation de la phase orga- nique, le solvant est enlevé et le produit dissout dans l'éthanol. La chromatographie sur papier de cette so lution montre qu'à la fin de six heures. une certaine déshydrogénation du noyau de l'acétate du composé S était intervenue.
La réaction procède très rapidement et après 24 heures une conversion appréciable est obtenue. Après 48 heures, une conversion maximum du noyau stéroïde est observée. Des chromatogram mes sur papier exécutés à l'aide du système solvant V donnent les résultats suivants. Les chiffres donnés dans le tableau sont des valeurs Rf et les noms en parenthèse sont les composés stéroïdes qui corres pondent à chacune des taches sur le chromatogramme sur papier. -Ces essais sont opérés 48 heures après l'inoculation du milieu avec les cellules.
<I>Valeurs R</I> f <I>avec système V</I> 1,0 (Acétate de composé S) 1,58 (Composé S) 0,30 (Ai-déhydro-composé S et 14a-hydroxy-composé S) 0,20 (pas encore identifié) <I>Exemple 11:
</I> Dans une cuve en verre de quatre litres équipée pour opérer la fermentation sous conditions submer gées et aérées on ajoute deux litres du milieu suivant (connu comme milieu de Turfitt) Nitrate d'ammonium . . . . . . . . . . . . . . 0,1 0/0 Phosphate de potassium acide <B>......</B> 0,025 0/0 Heptahydrate de sulfate de magnésium 0,25 0/0 Chlorure de sodium . . . . . . . . . . . . . . 0,0005 /o Heptahydrate de sulfate ferreux . . .... 0,00001% Carbonate de calcium - . . . . . . .
. . . . 0,5 0/0 Le milieu aqueux est stérilisé et ensuite addi tionné de 0,25 g d'acétate de composé S. Le mélange est alors ensemencé avec 100 cc d'une culture de Mycobactérium smegmatis cultivé dans un flacon à secouer sur un bouillon nutritif. Le mélange est agité et aéré à l'aide d'air stérile. Le mélange entier est alors extrait avec deux litres de chloroforme.
Des échantillons de ce produit sont soumis à un examen à l'aide de la chromatographie sur papier en utilisant trois systèmes différents. Le tableau suivant indique les valeurs Rp pour les systèmes divers. Les compo sés correspondant à ces taches sont désignes en marge du tableau.
EMI0004.0004
<I>Valeurs <SEP> Ri</I>
<tb> Système
<tb> III <SEP> IV <SEP> V
<tb> 0,07 <SEP> 0,5 <SEP> (Composé <SEP> S)
<tb> 0,94 <SEP> (Acétate <SEP> de <SEP> composé <SEP> S)
<tb> 0,72 <SEP> (Composé <SEP> S)
<tb> 0,45 <SEP> (Ai-déhydro-composé <SEP> S
<tb> et <SEP> 14(x-hydroxy-composé <SEP> S)
<tb> 0,22 <SEP> (pas <SEP> encore <SEP> identifié) Un autre système de chromatographie sur papier donna de meilleurs résultats particulièrement dans la séparation du Ai-déhydro-composé S et du 14a- hydroxy-composé S, qui chacun avait la valeur Rp de 0,45 lors de l'emploi du système V. Cet autre système fut employé dans une chromatographie des cendante au lieu d'une chromatographie ascendante.
Le papier fut imprégné avec un mélange de 80 vo lumes de méthanol et 20 volumes d'eau. L'atmo sphère dans le récipient fut saturée avec de la va peur de toluène, qui était saturé avec de l'eau. Le développement fut accompli à l'aide d'un mélange de 100 volumes de toluène et 20 volumes d'alcool éthylique.
En utilisant ce système, les résultats suivants fu rent obtenus
EMI0004.0011
Valeurs <SEP> Rs
<tb> <B>1,00</B> <SEP> (Composé <SEP> S)
<tb> 0,68 <SEP> (Al-déhydro-composé <SEP> S)
<tb> 0,48 <SEP> (14a-hydroxy-composé <SEP> S)
<tb> 0,25 <SEP> (pas <SEP> encore <SEP> identifié) Ces valeurs Rs furent obtenues en assignant une valeur de 1,00 à la distance parcourue par le com posé S, et à chacun des autres composés une valeur égale au rapport entre la distance parcourue par ce composé et la distance parcourue par le composé S. Le front du solvant et l'acétate de composé S pas saient tous les deux tout au long de la feuille et hors du papier.
Le mélange fut finalement séparé par application successive à des colonnes de gel de silice-éthanol. Lorsque la fermentation fut achevée, le mélange de fermentation fut extrait au moyen de chloro forme et évaporé jusqu'à un volume d'environ 20 cc. Cet extrait concentré fut alors appliqué à une co lonne de gel de silice-éthanol et élué avec un mé lange chlorure de méthylène-alcool jusqu'à ce que la plus grande partie du A1-déhydro-composé S fût enlevée.
La colonne fut alors éluée avec du métha nol afin d'enlever tous les stéroïdes restants. Cette procédure fut répétée plusieurs fois, débutant chaque fois avec l'extrait d'une fermentation opérée comme décrit ci-dessus. Ces éluats méthanoliques furent en- suite combinés, évaporés jusqu'à siccité et dissous dans 20 cc de chloroforme. Cette solution de chloro forme fut alors appliquée à une colonne de gel de silice-éthanol et éluée au moyen du mélange chlo rure de méthylène-alcool.
Des fractions de 50 cc furent recueillies environ toutes les deux heures ; ces fractions renfermaient
EMI0004.0030
Fraction <SEP> <B>1-8</B> <SEP> (rien)
<tb> <B>9-17</B> <SEP> (Composé <SEP> S)
<tb> <B>18-19</B> <SEP> (AI-déhydro-composé <SEP> S)
<tb> 20-21 <SEP> (A'-déhydro-composé <SEP> S
<tb> et <SEP> 14a-hydroxy-com posé <SEP> S)
<tb> Fraction <SEP> 22 <SEP> - <SEP> 23 <SEP> (14-hydroxy-composé <SEP> S) Les fractions furent évaporées jusqu'à siccité et les cristaux recueillis.
Le Al-déhydro-composé S fut recristallisé deux fois dans de l'acétate d'éthyle, et le 19a-hydroxy-composé S fut recristallisé deux fois dans de l'alcool éthylique.
Le AI-déhydro-composé S ou 1,4-prégnadiène- 17a, 21-diol-3,20-dione possède les caractéristiques physiques suivantes : point de fusion 235 - 2360 C ; étone - + 71,9e ; adsorption pouvoir rotatoire [ajD maximum des rayons ultraviolets à 245 m#t.
Le 14a-hydroxy-composé S ou 4-pregnène-14a, 17a-21-triol-3,20-dione est un composé blanc et cris tallin, qui possède les caractéristiques physiques sui vantes<B>:</B> point de fusion 226 - 228e C et pouvoir ro tatoire [a]# étone - + 129,6e.
EMI0004.0051
<I>Analyse</I>
<tb> Calculé <SEP> pour <SEP> C.1H300s
<tb> C <SEP> 69,57 <SEP> ; <SEP> H <SEP> 8,35
<tb> Trouvé <SEP> C <SEP> 69,64 <SEP> ; <SEP> H <SEP> 8,30 <I>Exemple I11:</I> Une expérience fut conduite exactement comme décrit dans l'exemple ci-dessus, excepté que<B>0,25g</B> d'acétate de désoxycorticostérone furent employés comme matière initiale. Après incubation pendant quatre jours à<B>270C</B> dans des, conditions pour le reste identiques, le produit fut recueilli et analysé à l'aide de chromatogrammes sur papier.
Les résultats sont indiqués dans le tableau suivant
EMI0004.0055
<I>Valeurs <SEP> Rf</I>
<tb> système
<tb> <B>il</B> <SEP> III <SEP> IV <SEP> V
<tb> 0,39 <SEP> 0,87 <SEP> 1,0 <SEP> (Acétate <SEP> de <SEP> désoxycor ticostérone)
<tb> 0,27 <SEP> 0,67 <SEP> 0,97 <SEP> (Désoxycorticostérone)
<tb> 0,32 <SEP> 0,72 <SEP> (Al-déhydro-désoxycor ticostérone)
<tb> 0,17 <SEP> 0,44 <SEP> (produit <SEP> de <SEP> substitu tion <SEP> nucléaire <SEP> de <SEP> dês oxycorticostérone <SEP> à
<tb> fonction <SEP> monohydroxy) Comme dans les cas précédents les produits dans cet exemple sont formés par déshydrogénation dans le noyau de la matière stéroïde initiale.
La position exacte du groupe hydroxyle dans le produit de subs titution nucléaire à fonction monohydroxy n'est pas encore connue, sauf qu'il est dans une position diffé rente de celle du groupe hydroxyle nucléaire dans la corticostérone. <I>Exemple IV</I> Une série d'expériences fut conduite en utilisant la procédure décrite dans l'exemple 1, mais au lieu d'employer le Mycobactérium smegmatis les espèces suivantes de mycobactéries furent utilisées M. phlei M. ranae M. butyricum M. berolinense M.
thamnopheos M. lacticola M. friedmanni M. tuberculosis Le produit principal formé au départ d'acétate de composé S, le Al-déhydro-composé S fut isolé du mélange de réaction par extraction. <I>Exemple V</I> Une expérience fut conduite exactement comme décrit dans l'exemple II, excepté que 0,25 g de pro gestérone furent utilisés comme matière de départ.
Les produits obtenus étaient la Al-déhydro-progesté- rone et une progestérone monohydroxylée. Les ca ractéristiques physiques de la Al-déhydro-progesté- rone obtenue sont identiques avec celles rapportées dans la littérature. La position exacte du groupe hydroxyle introduit dans l'autre composé n'est pas encore connue.
Dans cette expérience on a obtenu outre les pro duits susmentionnés une petite quantité d'un produit de réduction formé par saturation de la double liai son en position 4. Les caractéristiques physiques trouvées pour ce produit alloprégnane-3p-ol-20-one sont identiques avec celles rapportées antérieurement dans la littérature.