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" PERFECTIONNEMENTS AUX COMPOSES STEROIDES ET A LEUR
PREPARATION ".-
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La présente invention est relative à l'oxydation de certains composés stéroides par des moyens microbiologi- ques. Elle concerne, en particulier, l'oxydation de certains certains composés stéroides 3-céto-4,5-non saturés à l'aide de/micro- organismes ou d'enzymes oxydantes élaborées par ces micro- organismes .
Il a été constaté qu'en soumettant un composé sté- roide 3-céto-4,5-non saturé à l'action d'une espèce du genre Mycobactérium. une ou plusieurs fonctions oxygène sont intre duites dans le noyau stéroide . On a également constaté que l'oxydation ainsi produite n'est pas limitée uniquement à une telle oxydation nucléaire, mais implique également une déshydrogénation nucléaire, essentiellement dans les posi- tions 1,2. L'expression "oxygénation nucléaire" est utilisée pour désigner l'introduction d'un ou plusieurs atomes d'oxy- gène, sous forme de groupes hydroxyle ou de groupes céto, dans le système nucléaire stéroide.
L'expression "déshydro- génation nucléaire" est utilisée pour désigner l'enlèvement d'un atome d'hydrogène de deux atomes de carbone du noyau avec formation d'une double liaison entre ces deux atomes de carbone . Les deux expressions sont englobées dans le terme générique "oxydation", qui dans son sens le plus lar- ge englobe tout procédé dans lequel se produit une perte d'électrons. On voit donc que deux types d'oxydation, à sa- voir une oxygénation et une déshydrogénation, se produisent en même temps et les produits oxydés résultants englobent non seulement des composés oxygénés, mais également des com- posés déshydrogénés.
La proportion dans laquelle ces deux
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types de composés oxydés sont produits dépend du stéroïde de départ particulier et du microorganisme particulier uti- lisé, mais les deux types de composés sont produits dans tous les cas. Dans certains cas, notamment lorsque la matière de départ est constituée par de la progestérone, des proportions mineures d'un produit de réduction,dans le-- quel la double liaison présente en position 4 a été saturée, sont également isolées.
Divers procédés chimiques ont été proposés pour l'oxydation de divers composés stéroides. Ces procédés, en particulier ceux relatifs à la substitution des fonctions oxygène dans le noyau, impliquent généralement une série de réactions et nécessitent souvent l'utilisation de produits chimiques corrosifs ou coûteux. Dans maints procédés , des rendements globaux modérés ou médiocres sont obtenus. Il a également été signalé que la substitution de l'oxygène dans le noyau stéroïde peut s'accomplir par un procédé biologique particulier, à savoir par perfusion de certains organes ani- maux ou de certaines préparations de tissus animaux à l'aide de solutions de la matière de départ stérolde désirée.
Ce procédé présente maintes difficultés, notamment celle d'obtc nir de grandes quantités des glandes nécessaires, celle de permettre l'exécution du procédé à grande échelle et celle- de maintenir des conditions stériles .
On a constaté à présent qu'en soumettant un compo- sé stéroïde 3-céto-4,5-non saturé à l'activité oxydante d'une espèce du genre Mycobactérium, on réalise une oxyda- tion dudit composé stéroïde. Certaines des molécules stë- roides sont oxygénées, c'ést-à-dire qu'une ou plusieurs fonctions oxygène sont introduites dans le noyau stéroïde.
D'autres molécules stéroïdes sont déshydrogénées,
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c'est-à-dire que deux atomes d'hydrogène sont enlevés du noyau stéroide et qu'une double liaison est introduite. Il est possible parfois que les deux types d'oxydation se pro- duisent dans la même molécule, mais ceci n'est généralement pas le cas dans une large mesure.
Le procédé suivant la pré- sente invention, à savoir le fait de soumettre un composé stérôide approprié à l'action oxydante d'une espèce du genre Mycobactérium, peut être exécuté en mettant le composé sté- roide choisi en solution ou suspension aqueuse en contact avec une culture à croissance active de Mycobactérium , avec des cellules du Mycobactérium extraites de la culture et mise: en suspension dans un milieu approprié, ou en mettant le composé stéroïde en contact avec des extraits d'enzymes oxy- dantes obtenues par la culture d'une espèce du genre Myco- bactérium.
La présente invention a pour objet un procédé pour la préparation de stéroides oxydés, y compris des stéroïdes oxygénés dans le noyau et des stéroides déshydrogénés dans le noyau, à partir des composés 3-céto-4,5-non saturés cor- respondants. L'invention a encore pour objet un procédé éco- nomique, grâce auquel la réaction d'oxydation en question peut aisément être exécutée de manière à produire un grand volume de stéroïdes oxydés . D'autres objets de l'invention ressortiront de la description suivante .
De nombreux composés stéroides 3-céto-4,5-non sa- turés peuvent être utilisés comme matières de départ pour l@ réactions de la présente invention . Parmi ces composés, on peut citer le testostérone, la stigmasténone, la 17-hydroxy- désoxycorticostérone, la désoxycorticostérone, et d'autres composés de cette nature, qui présentent tous la structure de base suivante :
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EMI5.1
Dans cette formule, R peut désigner des groupes très divers sans que la réaction soit affectée de quelque manière que ce soit.
Ainsi, R peut désigner l'un ou l'autre des groupes suivants : hydrogène, hydroxyle, céto, alcoyle,
EMI5.2
acyle, alcoylène, -CO-CH20H, -CO-CH20acyle, -CO-CH20alc9yl etc... , les radicaux alcoyle, acyle et alcoylène ne conte- nant pas plus de 10 atomes de carbone. Si R est un radical à valence simple, R1 peut désigner de l'hydrogène, un groupe hydroxyle ou un groupe 0-acyle. Une telle structure se pré- sente dans le composé dénommé "composé S" ou 17-hydroxydé- soxycorticostérone, dans laquelle R désigne un groupe -COCH2OH et R1 désigne un groupe hydroxyle. Bien entendu si R est divalent, il n'y a pas de substituant R1.
L'emploi dans la formule donnée plus haut de lignes pleines pour mon- trer la position de R et R1 ne doit pas être interprété com- me une limitation des stéréo-isomères, étant donné que R ou R1 peut présenter la configuration o(,/3.
Lorsqu'un stéroïde 3-céto-4,5-non saturé est sou- mis aux conditions du nouveau procédé, l'oxygène est substi- tué dans le noyau stéroïde de certaines des molécules origi- nelles. Il est évidemment hautement souhaitable d'oxygéner diverses parties du noyau stéroide. Les matières de départ utilisées diffèrent par la facilité d'introduction d'une fonction oxygène. On a cependant constaté que dans tous les cas essayés où une molécule stéroïde ayant la structure in- diquée plus haut est utilisée comme matière de départ, on
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obtient un composé, dont le noyau est additionné d'oxygène.
L'oxygène de présente sous la forme d'un groupe hydroxy ou d'un groupe céto. Ordinairement, la réaction se déroule avec introduction initiale d'un groupe hydroxy et, si la réaction est poursuivie dans des conditions appropriées, le groupe hydroxy est partiellement ou entièrement converti en un groupe céto. Il est possible que plus d'un oxygène soit substitué sur le noyau d'un composé stéroïde donné.
La tendance générale est cependant à la substitution d'une seule fonction oxygène. En plus de cette oxygénation, il se produit pendant le procédé, une déshydrogénation de cer- taines des molécules stéroïdes. Cette déshydrogénation se fait essentiellement dans la position 1,2.
Les produits stéroïdes oxydés peuvent être détec- tés par comparaison soigneuse des chromatogrammes sur pa- pier des produits obtenus par les réactions de la présente invention avec les chromatogrammes de composés stéroïdes connus. Les produits oxygénés sont comparés à des stéroïdes connus substitués en diverses positions du noyau par de l'oxygène, en plus de la substitution se présentant dans la position 3, et les stéroïdes déshydrogénés sont comparés à des stéroides connus présentant une non-saturation nu- cléaire en diverses positions, en plus de celle se présen- tant dans la position 4,5. Cette méthode a été étudiée avec une variété de composés et l'on sait qu'elle donne des ré- sultats sûrs pour déterminer le degré d'oxydation de la molécule stéroïde.
Un exposé de la méthode a été donné dans la littérature chimique (Rapport du XIIe Congrès Interna- tional de Chimie Pure et Appliquée). D'autres méthodes cou- rantes ont également été utilisées pour démontrer l'oxyda- tion du noyau stéroïde. Lors de la mise en oeuvre de la présente invention, diverses espèces du genre Myc@bacterium
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peuvent être employées pour provoquer l'oxydation du noyau stéroide. Parmi ces espèces, on peut citer des espèces connue telles que Mycobacterium species 607, M.berolinense, M.lacticola, M. thamnopheos, et, en particulier, des souches de l'espèce M. smegmatis ATCC 101.
Les diverses espèces de
Mycobacterium varient considérablement en ce qui concerne la vitesse et l'aisance avec lesquelles l'oxydation est produite par les cellules des microorganismes ou par les pro- duits formés durant leur croissance. On a constaté que cer- taines souches de M. smegmatis sont particulièrement actives pour produire la réaction selon la présente invention. Les diverses mycobactéries varient quelque peu en ce qui concerne leurs besoins en milieux nutritifs. Toutefois, il est possi- ble avec un minium d'expérimentation de déterminer la compo- sition de milieux appropriés, ainsi que les conditions opti- ma, telles que le pH, le degré d'aération, la vitesse d'agi- tation, etc...
Divers modes opératoires peuvent être utilisés pour l'oxydation de composés stéroides conformément à la pré- sente invention. Dans le premier de ces modes opératoires, des milieux nutritifs sont ensemencés à l'aide de colonies des mycobactéries choisies. Un milieu nutritif approprié peut consister, par exemple, en un mélange d'une base de bo uil- lon nutritif bactériologique standard et de glycérol. Il a été constaté qu'un agent à activité superficielle neutre, tel qu'un dérivé polyoxyéthylénique d'un ester acide gras - alcool sucre (par exemple, Tween 80), est utile, lorsqu'il est ajouté en proportion mineure au milieu nutritif. L'addi- tion de l'amino acide que constitue l'asparagine, est égale- avec beaucoup de détails ment utile. La culture des mycobactéries a été décrite /dans maintes publications .
Les solutions nutritives stériles et ensemencées peuvent être laissées dans des flacons à agiter
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pendant deux à trois jours, de manière à fournir un inoculum pour des récipients plus grands, tandis qu'à leur tous les grands récipients aérés)et agités peuvent être utilisés pour l'inoculation de récipients destinés à une production à gran- profondeur de échelle, par fermentation en /. Le même milieu du type décrit plus haut peut être utilisé pour l'oxydation, sur une grande échelle, de domposés stéroïdes par le procédé selon l'invention. Le milieu peut évidemment subir des varia- tions considérables. En général, on a besoin d'un hydrate de carbone, d'une source d'azote organique, de sels minéraux et de divers métaux en traces.
Comme on l'a fait remarquer plus haut, plutôt que d'exécuter l'oxydation du composé stéroïde choisi en présence de l'entiéreté du produit de fermentation, des cellules peu- vent être extraites des cultures et remises en suspension dans un milieu désigné comme étant le milieu de réaction enzymatique. Un tel mélange de réaction peut consister ;, par ; exemple, en une solution qui est 0,01 molaire dans du fnma- rate de sodium ou un autre accepteur d'hydrogène et dans du sulfate de magnésium et 0,03 molaire dans du citrate de so- dium. Il a été constaté que la présence d'une certaine quan- tité de triphosphate d'adénosine (par exemple 0,125%) est également très utile.
Des cellules lavées et centrifugées du
Mycobacterium choisi peuvent être mises en suspension dans ce type de mélange réactionnel, dont le pH -est ajusté à envi= ron 6, par exemple à l'aide d'acide citrique. Après addition du composé stéroide que l'on désire oxyder, le mélange peut être incubé à environ 37 C et des échantillons peuvent être prélevés de temps en temps de façon à déterminer le moment auquel une conversion maximum du stéroïde a eu lieu. En gène ral, ceci se produit après environ 1 à 4 jours. On a consta- té que les-cellules provenant d'environ 100 cc des cultures aérées et agitées de mycobactéries peuvent être mises en sus
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pension dans environ 20 cc d'un mélange de réaction enzyma- tique, de manière à obtenir des résultats appropriés.
Ces proportions peuvent être modifiées dans une mesure considé- rable. Le composé stéroïde peut être utilisé à raison d'en- viron 25 à environ 200 mgr/100 cc du mélange de réaction en- zymatique. Le composé à l'état solide est simplement ajouté au milieu après ajustement du pH. Les flacons sont bouchés à l'aide de tampons en coton de façon à être exposés à l'air pendant l'incubation. On préfère utiliser mi petit volume de milieu par rapport à la capacité du flacon, ce volume étant, par exemple, de 20 cc dans un flacon Erlenmeyer d'une capaci té de 125 cc. En général, au moins un accepteur d'hydrogène, un métal bivalent (en particulier, le magnésium ) et un tampon sont nécessaires dans le milieu.
Plutôt que d'extraire les cellules de Mycobacteri- et d'exécuter la réaction suivant l'invention dans un m@lang . de réaction enzymatique, le composé stéroïde peut être ajou- té directement à une portion stérilisée de milieu nutritif, tel que décrit plus haut, après quoi le milieu est ensemencé à l'aide des mycobactéries choisies. Dans ce cas, on peut également utiliser sensiblement la même proportion du compo- sé stéroïde choisi. Des échantillons du mélange aéré et agi- té peuvent être prélevés de temps en temps, pour déterminer la mesure dans laquelle le composé stéroïde a été converti en produits oxydés. Le mélange.est maintenu à une températu- re comprise entre 25 et 30 C pendant la croissance des cellu les et la conversion du stéroïde.
En général, environ 2 à
7 jours sont nécessaires pour obtenir une production maximum des composés oxydés. La croissance des cellules peut aussi être produite avant addition du stéroïde.
Un troisième mode opératoire, qui convient égale- ment très bien pour l'oxydation des composés stéroïdes choi-
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sis, implique l'utilisation d'enzymes oxydantes élaborées par les mycobactéries. Ces enzymes peuvent être préparées par diverses méthodes à partir des cellules des microorganis mes choisis. Ces enzymes peuvent soit être formées pendant la fermentation et excrétées par le microorganisme soit être retenues dans le microorganisme. Si la matière est excrétée, '- le milieu exempt de cellules, sur lequel le microorganisme a poussé, peut être utilisé pour exécuter l'oxydation des composés stéroides choisis. Dans maints cas, une quantité appréciable des enzymes qui sont utilisées pour la réaction est retenue dans les cellules.
Cette matière peut être li- bérée des cellules par plusieurs traitements différents. Par mi ces traitements, on peut citer le broyage, en particulier avec des matières abrasives, telles que sable ou verre en poudre, qui sert à briser les parois des cellules et à libé- rer les matières essentielles. Un second mode de traitement est l'autolyse . Les cellules peuvent être retirées du mi- lieu dans lequel elles ont poussé. Elles sont alors lavées et mises en suspension dans de l'eau. L'eau peut être cou- verte d'une mince couche de toluène, de manière à empêcher la contamination et le mélange est laissé au repos à une température comprise entre environ 20 et environ 50 C.
Les cellules se désintègrent en l'espace d'un à plusieurs jours et les résidus cellulaires peuvent être séparés par filtra- tion, par exemple sur un filtre Seitz ou sur un filtre bac- térien en verre fritté. Une troisième méthode pour préparer des produits d'élaboration exempts de cellules des mycobac- téries utilisables pour exécuter les réactions conformes à l'invention consiste à geler et à dégeler rapidement @t de manière répétée la matière cellulaire. Une autre méthode applicable aux mêmes fins consiste à faire usage d'un sol- vant miscible à l'eau et, en particulier, d'acétone. Lors-
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qu'elles sont placées dans un tel solvant, les cellules sont brisées et un extrait des enzymes désirées est obtenu.
Les enzymes de mycobactéries peuvent être utilisées pour l'oxy- dation de composés stéroides 3-céto-4,5-non saturés dans des milieux similaires à ceux utilisés avec les cellules, notam- ment dans un milieu contenant un accepteur d'hydrogène tel qu'un fumarate, un tampon et, dans certains cas, un métal bivalent, en particulier du magnésium, ainsi qu'une porpor- tion mineure de triphosphate d'adénosine. Les enzymes oxy- dantes, exemptes de cellules, des mycobactéries peuvent ê- tre utilisées dans les milieux susmentionnés à une tempéra- ture allant d'environ 20 à environ 40 C.
En général, l'oxy- dation des composés stéroides dérivés est exécutée en une période allant de quelques heures à trois jours, La durée et la température optima, ainsi que les autres conditions op tima peuvent aisément être déterminées par un minimum d'ex- périmentation. Des descriptions détaillées de milieux conve- nant aussi bien dans le cas où l'on utilise des cellules isolées et remises en suspension que dans celui où il est fait usage de produits d'élaboration -'exempts de cellules sont données dans les publications suivantes : "Manometric Technique in Tissue Metabolism" par W.W. Umbreit et autres, Burgess Publishing Company, Minneapolis (1949); "Respirato- ry Enzymes" par H. Lardy, Burgess Publishing 6ompany, Minnea- polis (1949).
La manière la plus commode de suivre le déroule- ment de la réaction d'oxydation est la chromatographie sur papier. Comme on l'a signalé plus haut, d'autres méthodes peuvent également être utilisées à cette fin, Dans le pro- cédé de chromatographie sur papier, du papier-filtre impré- gné d'alumine est préparé en plongeant de grandes feuilles de papier-filtre (le papier-filtre Whatman n 54-en feuilles
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de 27 x 22,5 pouces, convient particulièrement) dans une so- lution de sulfate d'aluminium (13 gr 100 cc) . Le papier est égoutté, exposé à une atmosphère d'ammoniac pendant 15 heures, après quoi les feuilles sont lavées de manière conti nue, pendant 6 heures, à l'aide d'eau du robinet.
Les feuil- les sont alors égouttées, repassées à température modérée de manière à présenter une surface plane et laissées à une tem- pérature ambiante pendant 24 heures avant d'être utilisées.
Divers systèmes de solvants sont utilisés pour le développe- ment des chromatogrammes sur papier. Ces systèmes ont été dé signés comme suit : Ssytème I - Hexane Système II- Hexame-éther (19 volumes à 1 volume) Système III- Hexane-éther (16 volumes à 1 volume) Système IV- Ether.
Des quantités de 5 microlitres de solutions conte- nant les stéroides sont placées sur le papier le long d'une ligne s'étendant à 3 centimètres d'un bord du papier et les taches formées sont espacées de deux centimètres. Le bord de chaque papier est réuni au bord opposé, de manière à former des cylindres et chaque papier est placé dans un flacon en verre de grandeur appropriée. Les cylindres sont exposés aux vapeurs du système solvant pendant une heure à 4-8 C.
Les récipients sont alors fermés par des couvercles en matière plastique transparents, qui sont scellés à l'aide de graisse de silicone sous un vide élevé, après avoir mis'suffisamment de solvant dans les fonds des récipients, Le solvant est absorbé par le papier par capillarité, et, en passant par le divers endroits où lés stéroides ont été déposes, les divers composants de ces produits sont entraînés vers le haut du papier par le solvant ¯ ¯ ¯ . ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ dans une mesure plus ou
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moins grande, selon la structure du composé individuel.Le développement des feuilles est exécuté dans une pièce froide à environ 4-8 jusqu'à ce que le front du solvant atteigne un point situé à environ 8 cm du bord supérieur de la feuil- le de papier. Ceci prend généralement de 4 à 5 heures.
Les cylindres en papier sont alors retirés des récipients et séchés à température ambiante.
Un autre système a été utilisé pourla comparaison des divers produits stéroides. Ce système est connu comme é- tant le système Y. Il s'agit de benzène saturé d'eau. Avec ce système, on utilise cependant des feuilles de papier-fil- tre Whatman n 54 non traité plutôt que les feuilles impré- gnées d'alumine, tandis que l'on prépare des cylindres de papier de 8 x 18 pouces. Avant de chromatographier les pro- duits, l'atmosphère des récipients est saturée d'eau au moyen de vapeur. Le benzène saturé d'eau est versé au fond du récipient et le couvercle est scellé. Le développement est admis à s'opérer à température ambiante jusqu'à ce que le front de solvant soit voisin du bord supérieur du papier (3 à 4 heures).
Le papier est alors retiré du récipient et séché à température ambiante;
Divers procédés peuvent être utilisés pour détecta les divers stérpides sur les chromatogrammes. Le premier de ces procédés n'implique aucune réaction chimique avec les stéroldes séparés et peut être utilisé avant la mise en oeuvre de l'un ou l'autre des autres procédés. Dans ce pre- mier procédé, les feuilles sont examinées à l'aide d'un ex- plorateur fluorescent, tel que décrit par Haines et autres, Fédération Proceedings, Volume 9. page 180 (1950). Les stéroides ayant une structure de cétone [alpha], ss -non saturée et certains stéroides diéniques apparaissent sous forme de tâches sombres, lorsqu'ils sont vus à travers l'écran
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phosphorescent.
Ces tâches peuvent être marquées au crayon sur les feuilles afin d'établir leur position. Des échantil- lons connus standards des stéroïdes peuvent être essayés côte à côte avec la matière préparée conformément à la pré- sente invention. De cette manière, il est possible de dis- tinguer les stéroïdes oxydés nouvellement préparés. Un se- cond procédé pour localiser les composés stéroïdes sur les feuilles de papier consiste à traiter ces dernières à l'aide de chlore pendant 20 minutes, puis à arroser les feuilles à l'aide d'une solution de 380 gr de trichlorure d'antimoine dans 100cc d'anhydride acétique. Une solution fraîche est préparée journellement.
Les feuilles ainsi traitées sont chauffées à 90-100 jusqu'à, être sèches, après quoi elles sont directement examinées en chambre noire avec une lampe solaire en utilisant un filtre Cmrning n 9863. Les tâches formées sur le papier peuvent être soulignées au crayon et la position relative vis-à-vis des échantillons connus des divers stéroïdes peut alors être établie.
Un autre procédé pour localiser certains des pro- duits stéroïdes est celui consistant 4 utiliser le réactif décrit par Burton et autres, J. Biol.Chem., Volume 188, p.
763 (1951), ce procédé consistant à arroser le papier à l'ai- de d'une solution de chlorure de triphényltétrazolium dans de l'hydroxyde potassique alcoolique. Les stéroïdes possé- dant une chaîne latérale 21-hydroxy-20-céto apparaissent sous forme de tâches rouges après séchage du papier. Les tà- ches sont immédiatement marquées au crayon, étant donné que le contraste avec le fond disparaît rapidement. En exécutant des chromatogrammes sur papier avec un groupe de composés stéroïdes oxydés connus, il a été possible de distinguer les produits formés par le procédé suivant la présente in- vention et de mettre en lumière l'oxydation qui a lieu pen-
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dant la réaction. Les divers systèmes de solvants ont été utilisés pour établir avec certitude la nature des matières qui ont été formées.
Lors de l'exécution du travail de chro- matographie sur papier, une valeur connue comme étant le Rf a été utilisée pour identifier la position des divers compo- sés stéroides sur les chromatogrammes. La valeur Rf pour un composé donné avec un système solvant spécifique est le rap- port de la distance parcourue par le composé depuis l'endroit où il a été appliqué sur la feuille de papier, à la distance parcourue par le front du solvant exactement dans les mêmes conditions. La valeur Rf variera évidemment selon les dif- férents types de composés, selon les différents systèmes solvants, selon les variations de température et selon les variations dans la nature du papier utilisé. Toutefois, le même composé donnera, dans les mêmes conditions, le même
Rf et servira ainsi à indiquer l'identité du produit particu- lier.
Une table standard de valeurs Rf peut être préparée et utilisée avec un système solvant donné dans des conditions spécifiques. Ces valeurs ont été rassemblées dans une publi- cation de Gilbert M. Shull et autres (Archives of Biochemis- try and Biophysics) vol.37, p.186 (1952).
Les produits obtenus par le nouveau procédé décrit dans le présent mémoire peuvent être isolés de la solution aqueuse les contenant par extraction à l'aide de divers sol- vants organiques non miscibles à l'eau. Les hydrocarbures halogénés inférieurs, tels que le chloroforme, conviennent particulièrement' Après extraction, le solvant peut être chassé par distillation et le produit solide est alors iso- lé. Ce produit peut encore être purifié par recristallisa- tion dans des solvants organiques ou par chromatographie, par exemple dans des colonnes d'alumine ou sur d'autres ma- tières adsorbantes solides appropriées.
L'utilisation d'une
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colonne gel de silice-éthanol avec un mélange à 98-2% en volume de chlorure de méthylène et d'éthanol (95%) comme agent de développement s'est révélée particulièrement avan- tageuse. Des procédés pour la séparation de produits de cet- te nature ont été décrits déjà dans la littérature. Pour cer- tains usages, les produits ne doivent pas être séparés, mais le mélange brut peut être utilisé comme tel. Il s'est révé- lé avantageux, dans certains cas, d'acyler les produits bruts et de travailler avec les esters résultants, qui sont quelque peu plus stables.
Be nombreux stéroïdes 3-céto-4,5-non saturés cons- tituent des matières de départ possibles pour exécuter les réactions suivant l'invention, Parmi ces composés, on peut citer la testostérone, la stigmasténone, la progestérone,
S de et le composé/Reichstein . Les produits oxydés sont utilisa- bles comme intermédiaires dans la synthèse d'autres composés utiles. Ainsi, les produits déshydrogénés, qui présentent de la non-saturation dans la position 1,2, ainsi que le groupe
3-céto et la 4,5-non-saturation originellementprésents dans la matière de départ, conviennent spécialement pour l'exécu- tion de la réaction d'aromatisation d'Inhoffen. Cette réac- tion donne lieu à l'obtention d'un groupe de dérivés d'oes- trone.
Dans le cas du produit de déshydrogénation du compo- sé S, une scission de chaîne latérale pour donner un groupe
17-céto peut aisément être obtenue par des méthodes couran- tes, telles que l'oxydation à l'aide d'acide chromique, et lorsque le produit de cette réaction est aromatisé par la réaction d'Inhoffen, par exemple chauffé à température élevée dans un solvant hydrocarboné, on obtient le composé oestrone très précieux . L'introduction de fonctions oxygène dans les hoyaux des stéroides, qui ont été oxygénés, a com-
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muniqué à ces molécules de nouveaux centres d'activité chi- mique et a grandement amélioré leur versatilité à subir d'au tres réactions chimiques.
Des changements très désirables de solubilité sont également produits par l'introduction de groupes hydroxyle.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustra tif et ne doivent pas être considérés comme limitant la por- tée de l'invention. En fait, étant donné que de nombreuses formes d'exécution appreement très différentes de la présen- te invention peuvent être utilisées sans s'écarter de l'es- prit et de la portée de celle-ci, il est entendu que l'in- vention n'est limitée que par les revendications terminant le présent mémoire.
EXEMPLE I.-
Une culture de Mycobacterium smegmatis (Collection de cultures Pfizer n 2) obtenue sur un milieu d'agar ou gé- lose solide a été ajoutée à 50 cc d'une solution nutritive ayant la composition suivante : bouillon nutritif standard solide 8 grs/litre glycérol 20 cc/litre
Tween 80 0,2 cc/litre
Asparagine 5 gr/litre
Le milieu a été stérilisé avant ensemencement .
Ce mélange a été placé dans un flacon d'Erlenmeyer d'une ca- pacité de 250 cc et le flacon a été agité à environ 27 C pendant 3 jours. Le contenu d'un flacon agité a été utilisé pour inoculer deux litres du même milieu stérilisé dans un récipient d'une capacité de 4 litres équipé de manière à permettre une fermentation en profondeur. Le milieu a été ensemencé et le mélange a été agité et aéré dans des condi- tions stériles. On a fait marcher l'agitateur à une vitesse de 1750 tours par minute et on a poursuivi l'aération pen-
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dant 48 heures, en faisant passer un volume d'air stérile par volume de milieu, par minute. Les cellules formées dans le milieu ont été centrifugées et lavées à l'eau.
On a préparé un mélange de réaction enzymatique contenant 0,01 équivalent molaire de fumarate de sodium, 0,01 équivalent molaire de sulfate de magnésium, 0,03 équi- valent molaire de citrate de sodium et 0,125% de triphospha- te d'adénosine. 20 cc de ce milieu ont été placés dans un flacon d'Erlenmeyer d'une capacité de 125 cc. Après ajuste- ment du pH à 6,0 avec de l'acide citrique, on a ajouté 25 mg d'acétate du composé S au mélange réactionnel. Le mélange réactionnel a été ensemencé à l'aide des cellules provenant de 100 cc du milieu de fermentation et le mélange a été inc bé à 37 C. Des échantillons ont été prélevés de temps à au- tre et les stéroides présents ont été extraits au moyen de chloroforme.
Après séparation de la phase organique, le solvant a été chassé et le produit obtenu a été dissous dan de l'éthanol. Des échantillons de la solution éthanolique ont été placés sur des feuilles de papier en appliquant la technique chromatographique décrite plus haut. On a. constat. qu'au bout de 6 heures, une certaine oxydation du noyau de l'acétate de composé S s'était produite. La réaction a progressé assez rapidement et, après 24 heures, une conver- sion appréciable avait eu lieu. Au bout de 48 heures, le noyau stéroide avait subi une oxydation maximum. Les chroma togrammes sur papier obtenus avec le système solvant V ont donné les résultats suivants.
Les valeurs données dans le tableau suivant sont les valeurs Rf et les noms donnés entre parenthèses sont ceux des composés stéroides auxquels chacune des tâches apparaissant sur le chromatogramme cor- respond. Ces essais ont été exécutés 48 heures après inocu- lation du milieu au moyen de cellules.
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Valeurs Rfavec le système V 1,0 (acétate du composé S) 0,58 (composé S) 0,30 #1-déhydro-composé S et 14 [alpha] -hydroxy-composé $) 0,20 (pas identifié)
EXEMPLE II.-
Dans un récipient en verre pyrex d'unebapaci- té de 4 litres, équipé de manière à permettre une fermen tation aérée en profondeur, on a introduit deuxlitres du milieu suivant (milieu de Turfitt): Nitrate ammonique 0,1% Phosphate acide dipotassique 0,035 Sulfate de magnésium heptahydraté 0,25 chlorure de sodium 0,0005 Sulfate ferreux heptahydraté 0,00001 carbonate de calcium 0,5
Le milieu aqueux a été stérilisé, puis traité avec 0,25 gr d'acétate de composé S.
Le mélange a été ensuite ensemencé à l'aide de 100 cc d'une culture de Mycobactérium smegmatis (collection de cultures Pfizer n 2) obtenue dans un flacon à agiter sur du bouillon nutritif. Le mélange a été agité et aéré avec de l'air stérile. Tout le mélange a alors été extrait avec deux litres de chloroforme. Des échantillons de ce produit ont été soumis à un examen à l'aide de chromatogrammes sur pa- pier, en utilisant trois systèmes solvants. Le tableau suivant indique les valeurs Rf des divers systèmes. Les composés auxquels les tâches correspondent sont désignés sur le côté du tableau.
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Valeurs Rf SSystème III IV ¯V 0,07 0,5 - (composé S)
0,94 (acétate du composé S)
0,72 (composé S)
EMI20.1
0,45 (à-déhydro-composé S et 14 o(-hydroxy- composé S)
0,22 (pas identifié).
Un autre système de chromatographie sur papier a donné de meilleurs résultats , spécialement en ce qui concerne la séparation du 2 -déhydro-composé S et du 14o(-hydroxy-composé S, qui présentaient chacun une valeur Rf de 0,45 lorsqu'on a utilisé le système V. Cet autre système a été employé dans un chromatographe descendant au lieu d'un chromatographe ascendant, commceux précé- demment décrits, Le papier a été imprégné à l'aide d'un mélange de 80 volumes de méthanol et 20 volumes d'eau.
L'atmosphère du récipient a été saturée à l'aide de vapeur de toluène elle-même saturée d'eau. Le développement du chromatogramme a été effectué à l'aide d'un mélange de 100 volumes de toluène et 20 volumes d'alcool éthylique,
Les résultats suivants ont été obtenus : Valeurs RS 1,00 (composé S) 0,68 (#1 -déhydro-composé S) 0,45 (14 a(-hydroxy-composé S) 0,25 (pas identifié)
Ces valeurs RS ont été obtenues en assignant une valeur de 1,00 à la distance parcourue par le composé S et en assignant à chacun des autres composés une valeur égale au rapport de la distance parcourue par ce composé à la distance parcourue par le composé S.
Le solvant et l'acétate du composé S se sont déplacés sur toute la lon-
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gueur de la feuille de papier et au delà de celle-ci.
Le mélange a été finalement séparé par applications successives à des colonnes gel de silice-éthanol. Lorsque la fermentation était terminée, le mélange de fermentation a été extrait avec du chloroforme et évaporé jusqu'ànun volume d'en- viron 20 cc. L'extrait concentré a ensuite été appliqué à une colonne gel de silice-éthanol et élué avec un mélange de chlorure de méthylène et d'alcool jusqu'à de que la majeure partie du # 1 -déhydro-composé S ait été éliminée. La colonne a ensuite été éluée avec du méthanol de manière à enlever tous les stéroïdes restants. Ce mode opératoire a été répété à plu- sieurs reprises, en partant chaque fois de l'extrait d'une fermentation exécutée de la manière décrite plus haut.
Les éluats méthanoliques ont ensuite été combinés, évaporés jus- qu'à siccité et dissous dans 20 cc de chloroforme. La solution chloroformique a alors été appliquée à une colonne gel de sili- ce-éthanol et éluée avec un mélange de chlorure de méthylène et d'alcool.
Des fractions de 50 cc ont été recueillies environ toutes les deux heures* Ces fractions contenaient ; Fractions 1 - 8 (néant) Fractions 9 - 17 (composé S) Fractions 18 - 19 (-déhydro-composé S) Fractions 20 - 21 (#1-déhydro-composé S et 14 [alpha] hydroxy composé S) Fractions 22-23 (f14 [alpha] -hydroxy-composé S)
Les fractions ont été évaporées jusqu'à siccité et les cristaux recueillis. Le #1 -déhydro-composé S a été re- cristallisé à deux reprises dans l'acétate d'éthyle et, le 14 [alpha] -hydroxy-composé S également à deux reprises dans l'al- cool éthylique.
Le #1 -déhydro-composé S ou 17 [alpha] ,21-déhydroxy- l,4-prégnadiène-3,20-dione a les constantes physiques suivan- tes : P.F.: 235-236 C; rotation optique [[alpha]]D acétone = +71,9 ;
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maximum d'adsorption d'ultra-violet à 245 m u.
Le 14 [alpha] -hydroxy-composé S ou 14 c( ,17 c( ,21trihy- droxy-4-prégnène-3,20-dione est un composé cristallin blanc et possède les constantes physiques suivantes : P.F.: 226- 228 C; rotation optique [[alpha]] acétone = +129,6 ; Analyse :
D C = 69,64%, H= 8,30%; calculé pour C21H30O5 : C=69,57%; H=8,35%.
EXEMPLE III.-
Un essai a été effectué exactement de la manière décrite dans l'exemple précédent, sauf que l'on a utilisé 0,25 gr d'acétate de désoxycorticostérone comme matière de dé- part. Après incubation pendant 4 jours à 27 C dans des condi- tions par ailleurs identiques, le produit a été récupéré et a- nalysé par chromatographie sur papier.
Le tableau suivant don- ne les résultqts :
Valeurs Rf
Système
EMI22.1
<tb> II <SEP> III <SEP> IV <SEP> V
<tb>
<tb> 0,39 <SEP> 0,87 <SEP> 1,0 <SEP> - <SEP> (acétate <SEP> de <SEP> désoxycorticostérone)
<tb>
<tb> 0,27 <SEP> 0,67 <SEP> 0,97 <SEP> (désocycorticostérone)
<tb>
EMI22.2
0,3^ 0$72 (4ldéhydro.-désocycorticostéH
EMI22.3
<tb> rone)
<tb>
<tb> 0,17 <SEP> 0,44 <SEP> (produit <SEP> de <SEP> substitution <SEP> nucléai
<tb> -re <SEP> monohydro@@éde <SEP> désoxycorticostérone)
<tb>
Dans cet exemple, comme dans tous les autres cas, les produits sont formés par l'oxydation nucléaire de la ma tière de départ stéroYde , un de ces produits étant dans formé chaque exemple/par oxygénation et e'autre, dans chaque exemple, par déshydrogénation.
La position exacte du groupe hydroxyb dans le produit de substitution nucléaire monohydroxylé obtenu n'est pas connue, sauf que l'on sait que cette position est différente de celle du groupe hydroxy nucléaire dans la corti costérone.
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EXEMPLE IV.-
En utilisant la technique décriteplus haut, de la testostérone a été soumise à l'action d'une culture d'un
EMI23.1
1[veobactérium smegmatis (collection de culture Pfizer nO 2 ) dans des flacons agités, incubés pendant 9ours. Le produit ob- tenu a été examiné par chromatographie sur papier et on a con- wtaté qu'un dérivé nucléairement oxydé de testostérone s'é- tait formé pendant la réaction. Le composé a été isolé par ex- traction. La position exacte, dans laquelle de l'oxygène a été introduit dans le noyau, n'a pas encore été déterminée. Il s'est également formé un autre produit, à savoir par déshydro génation du noyau stéroï de.
EXEMPLE V.-
Une série d'expériences a été réalisée en utilisant le mode opératoire décrit dans l'exemple I, mais au lieu d'em-
EMI23.2
ployer du Mvcobacterium smegmatis, on a fait usage des espè.- ces suivantes de mycobactéries : M. phlei M. thamnopheos M. ranae M. lacticola M. butyricum M, friemanni M. berolinense M. tuberculosis
Les produits formés à partir d'acétate du composé S ont été récupérés du mélange réactionnel par extraction et ont été identifiés par chromatographie sur papier.
Dans chaque cas on a constaté la fixation d'oxygène sur le noyau stéroïde de certaines des molécules originelles grâce à l'activité oxy- dante du Mycobacterium utilisé, tandis que dans d'autres molé- cules originelles, une déshydrogénation nucléaire s'est pro- duite.
EXEMPLE VI.-
Un essai a été effectué en suivant exactement le mode opératoire de l'exemple II, mais en utilisant 0,25 gr de pro- gestérone comme matière de départ. Les produits obtenus étaient
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EMI24.1
la ,( ldéhydroprogestérone et une progestérone monohydroxylées Les constantes physiques mesurées pour la #1 déhydroproges- térone obtenue correspondent à celles données dans la litté- rature. La position exacte du groupe hydroxy introduit dans l'autre produit n'est pas encore connue.
Dans cet essai, on a obtenu également, en plus des produits d'oxydation mentionnés ci-dessus, unepetite quanti- té d'un produit de réduction formé par saturation de la double liaison dans la position 4. Les constantes physiques trouvées pour ce produit, qui constitue l'alloprégnane-3-ss -ol-20-one, correspondent à celles figurant déjà dans la littérature.
REVENDICATIONS.-
1.- Procédé pour l'oxydation nucléaire d'un compo+ se stérolde 3-céto-4,5-non saturé, dans lequel procédé on sou- met ce composé stéroïde à l'activité oxydante d'une espèce du genre Mycobacterium.