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Verfahren zur Herstellung eines Insulinpräparates mit verlängerter Wirkungszeit Wird einem Diabeteskranken Insulin injiziert, so wird ein rasches Absinken des Blutzuckerspiegels beobachtet, doch ist dieser Effekt nicht von langer Dauer. Es sind deshalb oft zwei Insulininjektionen innerhalb 24 Stunden nötig, um einen normalen Blut- znekerspiegel aufrechtzuerhalten.
Uni die Notwendigkeit solch zahlreicher Injektionen zu vermeiden, wird das Insulin gewöhnlieh mit einem basischen Protein, wie Protamin, zusammengebracht, meist unter Zusatz von Zink, wodurch ein Zink-Protamin- Insulin-Präparat in Form einer Suspension erhalten wird, welches bei der Injektion eine längere Wirkungszeit besitzt als Insulin.
Dieser Effekt ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass sieh die gebildete Verbindung bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes nur schlecht löst und somit als Insulinreservoir oder depot im Körper dienen kann, aus dem langsam Insulin in den Blutstrom über- iritt. Derartige Präparate stellen zwar gegen- über den früher verwendeten Insulinlösungen einen beachtlichen Fortschritt dar, vermögen aber doch nicht ganz zu befriedigen, weil sie ihren hypoglykämisehen Effekt ziemlieh langsam ausüben, so dass oft eine gleichzeitige Injektion einer Insulinlösung nötig ist, um den Blutzuekergehalt rasch genug zu senken.
Dieses Vorgehen ist aber auch nicht völlig zufriedenstellend, da verschiedene Marken und Ansätze von Protamin-Zink-Insulin- Suspensionen sich durch die im Überschuss über das isophane Verhältnis anwesende Prot- aminmenge beträchtlich unterscheiden, so dass Mischungen von löslichem Insulin mit solchen Präparaten einen verschiedenen hypoglykämi- schen Effekt besitzen können. Zudem bleiben die Protamin-Zink-Insulin-Suspensionen beim längeren Lagern nicht immer physikalisch unverändert.
Es können sich Zusammenballungen bilden oder ein Dünnerwerden eintreten, so dass die Ansprechzeit des Blut.zucker- gehaltes nach einer Injektion unerwünschte Veränderungen erleiden kann. Ausserdem sedimentieren die Suspensionen beim Lagern, so dass sie vor dem Aufziehen in die Spritze kräftig geschüttelt werden müssen. Dadurch wird aber ein Schäumen mit allen seinen Nachteilen hervorgerufen.
Ein weiterer Nachteil dieser und ähnlieher Präparate liegt in der Verwendung von Protamin, einem aus natürlichen Quellen isolierten Material, dessen Zusammensetzung von Fall zu Fall verschieden sein kann, was ein verschiedenes ehemisehes und biologi sches Verhalten zur Folge hat. Ein weiterer Nachteil der Verwendung von Protamin liegt darin, dass dieses bei 37 und PH 7 einer langsamen Autolyse unterliegt, woraus sich ergibt, dass
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ein unter Verwendung von Protamin hergestelltes Insulinpräparat bei einem physiologischen pH unter Umständen nicht stabil ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von bei einem pji zwischen 2 und 4 löslichen Insulinpräparaten mit verlängerter Wirkungszeit Das Ver fahren ist, dadurch gekennzeichnet, dass man Insulin und ein synthetisches, basisches Poly- peptid, das nicht weniger als 8 Aminosäureeinheiten pro Molekül enthält, miteinander umsetzt.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Reaktion zwischen Insulin und dem synthetischen Polypeptid in Gegenwart einer löslichen Zinkverbindung.
Die erfindungsgemäss erhaltenen Präparate sind dem Protamin-Zink-Insulin (Suspension) darin überlegen, dass sie 1. nach der Injektion einen rascheren Abfall des Blutzuckerspiegels bewirken, 2. Lösungen und nicht Suspensionen darstellen und deshalb leichter aseptisch in einen eine mehrfache Dosis enthaltenden Behälter abgefüllt werden können und 3. so hergestellt werden können, dass sie je nach Wunsch den hypoglykämischen Effekt während einer kürzeren oder längeren Zeit ausüben. Ihre Wirkungszeit ist aber immer länger als diejenige einer Insulinlösung.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung der oben definierten Polypeptide gegenüber natür- liehein Protamin liegt in der grösseren Ein- heitliehkeit der mit den ersteren hergestellten Insulinpräparate.
Gute Resultate werden zum Beispiel mit Poly peptiden aus Ly sin erzielt. Es kommen aber auch Polypeptide aus Ornithin in Be- traeht, ebenso Misehpolypeptide aus Ly sin und Ornithin oder aus den genannten Aminosäuren und Valin, Phenylalanin, Leuzin, Isoleuzin oder Glyzin. Misehpolypeptide aus Lysin, Leuzin und Phenylalanin werden bevorzugt.
Die Synthese der für das erfindungsgemässe Verfahren in Betracht kommenden Polypeptide kann nach den Angaben in der Faehliteratur erfolgen. Sie kann vorteilhafterweise durch eine einstufige Polykondensation eines geeigneten Derivates der Aminosäure, etwa des Na-Carboxy-anhvdrides, durechgeführt werden, wobei die freie Aminogruppe in #-Stellung des Lysins oder Ornithins durch eine geeignete Gruppe, beispielsweise ein Carbobenzoxyradikal, die später wieder entfernt wird, geschützt sein kann. Die Polykondensation wird üblicherweise in einem inerten Lösungsmittel, z. B.
Benzol, Nitro- benzol, Nitromethan, Dioxan, Pyridin oder Äthvlaeetat bei einer zwisechen 20 und 100 C liegenden Temperatur in Gegenwart eines die Reaktion auslösenden Stoffes, wie Wasser oder Ammoniak, durchgeführt. Die Kettenlänge der Polypeptide hängt von der Menge des auslösenden Stoffes ab. Die Polymerisation eines N-Carboxyanhydrides ist eine Kettenpoly me- risation, bei der das Molekulargewicht durch das Konzentrationsverhältnis von Monomer zu Auslöser bestimmt wird, wenigstens für Kettenlängen bis zu 15 Aminosäureresten. Ein Polymer mit jeder gewünsehten mittleren Kettenlänge kann erhalten werden, indem das Molekularverhältnis Mononmer Auslöser der gewünsehten Kettenlänge entsprechend gewählt wird.
Die so erhaltenen synthetischen Polypeptide sind nicht einheitliehe Produkte, sondern bestehen aus Molekülen mit etwas verschiedenen Kettenlängen. Durch sorgfältiges Einhalten bestimmter Reaktionsbedingungen und Verwendung reiner Ausgangsstoffe können aber immerhin Produkte erhalten werden, die eine reproduzierbare mittlere Kettenlänge aufweisen und die sieh für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gut eignen. Die mittlere Kettenlänge der Produkte kann nach einer der zahlreichen bekannten Methoden zur Endgi-uppensehätzung ermittelt werden, z. B. nach der Methode von Woiwod (Bioeheni. Journ. 19.19, 45, 412).
Zur Herstellung soleher Polypeptide werden als Ausgangsstoffe die natürlich vorkoin- inenden L-Aminosäuren bevorzugt. Es können aber auch DL-Aminosäuren und selbst DAminosäuren verwendet. werden.
Die Herstellung gemischter Polypeptide kann dureh Verwendung von Gemischen der
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entsprechenden Na-Carboxy-anhdride in der besehriebenen Weise erfolgen. Die Menge neutraler Aminosäuren in solchen Produkten sollte aber nicht so gross sein, dass das Salz des entstandenen Polypeptids (z. B. das H@drochlorid) in Wasser unlöslich ist. Bei der Verwendung der bevorzugten Aminosäure L-Lysin sollte der Gehalt der gemischten Poly- anminosäuren an L-Lvsin nicht unter 30 Molprozente sinken; 50 Molprozente L-Lysin sind wünsehenswert.
Die Menge des zur Herstellung einer löslichen Insulin-Zink-Polypeptid-Verbindung nötigen Polvpeptides hängt, je nach der gewünschten Wirkungszeit, etwas von der Natur des Polypeptides ab. Bei der Verwendung eines Poly peptids aus L-Ly sin and L-Leuzin (50:50 Molprozente) wird mit einer dem doppelten isophanen Wert entsprechenden Menge Polypeptid ein lösliches Insulinpräparat erhalten, dessen Wirkungszeit diejenige einer Protamin-Zink-Insulin-Suspension übertrifft. Wird das genannte Polypeptid in isophaner Menge verwendet, so entspricht die Wirkungszeit des erhaltenen Produktes etwa derjenigen des Protamin-Zink-Insulin-Präparates. Das trifft auch für ein Präparat zu, das unter Verwendung der dreifachen isophanen Menge Polv-L-Lvsin erhalten wird.
Wenn das Präparat eine Wirkungszeit besitzen soll, welche diejenige eines Protamin-Zink-Insulin-Präpa- rates übertrifft, werden also im allgemeinen Polypeptidmengen zu verwenden sein, die das zwei- bis dreifache des isophanen Wertes betragen.
Unter dem Ausdruck isophanes Verhältnis oder isophaner Wert ist diejenige Menge eines synthetischen basiseben Poly- peptides in Milligramm zu verstehen, die nötig ist, um mit 10 Milligrammen Insulin isophane Verhältnisse herzustellen.
Das isophane Verhältnis kann in folgender Weise bestimmt werden: Insulin und Polv- peptid werden bei einem pH von 7,4 vermischt, wobei sich entweder sogleich oder nach einigem Stehen ein Niederschlag bildet. Dieser wird entfernt und die klare Flüssigkeit in zwei Teile geteilt. Isophane Verhältnisse liegen vor, wenn durch Zusatz von Insulin zum einen Teil und von Polypeptid zum andern Teil der Lösung die gleiche Opaleszenz entsteht. Eine Methode zur Bestimmung des isophanen Verhältnisses wird später mit mehr Einzelheiten beschrieben werden.
Der PH der Insulin-Zink-Poly peptid-Lösung muss niedrig genug sein, um ein vollständiges Auflösen der Insulin-Polypeptid-Verbindung zu erlauben, doch darf anderseits die Lösung nicht so stark sauer sein, dass sie bei der Injektion reizen würde. Der pH der Lösung sollte deshalb innerhalb der Grenzen 2,0 bis 4,0 gehalten werden. Das bevorzugte pH-Gebiet ist 2,8 bis 3,5.
Zum Erreichen einer genügend verlängerten Wirkungszeit ist die Anwesenheit geringer Zinkmengen in dem löslichen Insulinpräparat wünschenswert. Der Zinkgehalt kann zum Beispiel nur 0,075% betragen. Bei der Verwendung kristallinen Insulins ist überhaupt kein zusätzliches Zink nötig. In einigen Fällen ergab ein Zinkzusatz (als Zinksalz) in der Grössenordnung von 1 mg Zink/500 Insulineinheiten zufriedenstellende Ergebnisse (vgl. Beispiele 1, 3 und 4). In Beispiel 5 wurde die Zinkmenge auf 0,075% (Gewicht/Gewicht, bezogen auf Insulin) gesenkt, ohne dass die verlängerte Wirkungszeit verloren ging.
Die Herstellung der Insulin-Zink-Poly- peptid-Lösungen für therapeutischen Gebrauch kann erfolgen, indem eine wässrige Insulinlösung mit einer wässrigen Lösung des Poly peptides vermischt wird. Das Polypeptid wird üblicherweise als wasserlösliches Salz, beispielsweise als Hydroehlorid, verwendet. Eine oder beide Lösungen können ein Zink- salz enthalten und auf einen geeigneten, in der Nähe des physiologischen Wertes liegenden PH gepuffert sein.
Die sieh ergebende Suspension wird zum Erreichen vollständiger Lösung auf den genannten p11-Wert angesäuert. Nach einem andern Herstellungsverfahren werden eine w ässrige Insulinlösung Lind eine wä.ssrige Poly peptidlösung, wovon mindestens die eine ein Zinksalz enthalten kann und beide einen unter 4 liegenden besitzen, miteinander- vermischt und die ent-
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stehende klare Lösung dann auf den früher angegebenen PH eingestellt. Den so erhaltenen Lösungen wird vorteilhafterweise ein Antiseptikum, wie Phenol oder Kresol, zugesetzt.
Auch können sie durch Zusatz von Natriumchlorid oder Glycerin isotonisch gemacht werden und noch weitere Stoffe enthalten, die sie auf den gewünschten PH bringen und puffern. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide Im folgenden werden Verfahren angegeben, nach denen für das erfindungsgemässe Verfahren geeignete Polypeptide hergestellt werden können. Herstellung von Poly-L-lysin-hydrochorid N#-Carbobenzoxy-Na-carboxy-L-lysin-anhy- drid (3,35 g, 0,012 Mol) wurde in getrocknetem, siedendem Benzol (152 em3) gelöst und der Lösung wässriges Dioxan (2,055 em3, 25% Wasser enthaltend) zugesetzt. Nach 16stündi- gem Erhitzen am Rückfluss wurde das ausgeschiedene Polymer (2,9 g) abgetrennt, mit warmem Benzol und Äther gewaschen und getrocknet.
Das erhaltene Poly-carbobenzoxy- L-lysin (1,9 g) wurde in 100 cm3 Eisessig suspendiert und bei 40-50 C während 8 Stunden trockener Chlorwasserstoff durch die Suspension geleitet. Dann wurde das Polymer abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es wurde gereinigt, indem es in Wasser gelöst, die Lösung mit Holzkohle behandelt, filtriert und das Filtrat gefriergetrocknet wurde. Es wurde so 0,9g Poly- L-lysin-hy drochlorid erhalten.
Herstellung von Poly-(L-lysin : L-leuzin)- hydrochlorid mit 50 Holprozent L-Lysin N#-Carbobenzoxy-Na-earboxy-L-lysin-anhy- drid (6,4 g, 0,0209 Mol) und Na-Carboxy-L- leuzin-anhydrid (3,28 g, 0,0209 Mol) wurden in 130 cm3 trockenem Dioxan gelöst, 6,97 cm3 0,2n-Ammoniak in Dioxan zugesetzt und die Lösung eine Stunde bei Zimmertemperatur und anschliessend über Nacht auf dem Wasserbad gerührt. Der abgekühlten, viskosen Lösung wurden 260 em3 0,16n-Chlorwasserstoff zugesetzt und die entstehende Suspension des Polymers (7,8 g) 6 Stunden gerührt. Dann wurde das Produkt abgetrennt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Das Poly-(carbobenzoxy-L-lysin : L-leuzin) (6,2 g) wurde in 200 em3 Eisessig gelöst und trockener Chlorwasserstoff bei 50 C unter Rühren 6 Stunden durch die Lösung geleitet. Durch Zusatz von Äther wurde das Polymer als Öl ausgesehieden. Dieses wurde abzentrifugiert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das Polty - (L-lysin : L-leuzin) - hydroehlorid (3,35 g) wurde durch Lösen in Wasser. Behandlung mit Holzhohle und Gefr iertroeknen des Filtrates gereinigt.
Herstellung von Poly-(L-lysin:L-phenyl- alanin)-hydrochlorid mit 50 Molprozent L-Lysin 7,8 g oder 0,0255 Mol N#-Carbobenzoxy-Nra- earboxy-L-lysin-anhydrid und 4,87 g oder 0,0255 Mol Nα-Carboxy-L-phenylamin-anhy- drid (Smp. 93-95 C) wlurden in 160 em3 trockenem Dioxan gelöst. 3,5 emn3 0,49n-Amnmo- niak in Dioxan wurden zugesetzt und die Lösung zuerst eine Stunde bei Zimmertemperatur und dann über Nacht auf dem Wasserbad gerührt. Der abgekühlten Lösung wurden 325 cm3 0,16n-Chlorwasserstoff zugesetzt und die Mischung weitere 6 Stunden gerührt. Das Polymer (10,05 g) wurde isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Das Poly-(carbobenzoxy-L-lysin : L-phenyl- alanin) wurde in 200 em3 Eisessig suspendiert und bei 40-50 C unter Rühren während q Stunden trockener Chlorwasserstoff in die Suspension eingeleitet. Während dieser Zeit löste sich das Polymer zuerst auf und schied sich dann als Öl aus. Der abgekühlten Mi- sehung wurde Ä tlier zugesetzt und das festgewordene Polymer abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getroeknet. Das Polt' -(L-lysin : L-phenylalanin) -hydroehlorid wurde in Wasser gelöst, mit Holzkohle behandelt und das Filtrat. gefriergetrocknet.
Andere Polymere wurden in gleicher Weiso aus den \7-Carboxy-anhydriden der 'folgenden Aminosäuren hergestellt: DL-iso-Leuzin, DL-
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Valin, Glyzin, S-Carbobenzoxy-DL-ornithin, DL-Phenylalanin, DL-Leuzin (das Anhydrid wurde wie die L-Form hergestellt; Smp. 50 bis 52 C, Zersetzung bei 94 C) und D-Lysin (das Anhy drill wurde wie die L-Form hergestellt; Smp. 97-100 C unter Zersetzung). Methode zur Bestimmung des isophanen Verhältnisses Benötigte Lösungen: 1. 0,25%ige (Gewieht/Volumen) Poly- peptidlösung in Wasser.
2. 4000 Einheiten Insulin werden in einem minimalen Volumen n/10-HCl gelöst und die Lösung mit Wasser auf 100 cm3 verdünnt. Der Lösung werden 0,3 Volumprozent Tri- kresol und 1,82%iges (Gewicht/Volumen) Glycerin zugesetzt. Der Lösung werden 20 em3 Sörensens Phosphatpufferlösung (m/15, pH 7,4) zugegeben und der pH der Mischung auf 7,4 eingestellt.
Sörensens Pufferlösung: 1,75 g KH2PO4 und 7,65 g Na2HPO4 werden in Wasser gelöst und auf 100 em3 verdünnt. Das pH wird auf 7,4 eingestellt. Vorgehen: 1. 4 em3-Portionen der Insulinlösung werden in Reagenzgläser abpipettiert und den Röhrchen von 0,5 bis 2,0 oder wenn nötig mehr cm3 steigende Mengen der Polypeptid- lösung zugesetzt. Die Gläser werden geschüttelt, 5 Minuten stehengelassen und die gebildeten Suspensionen durch ein Filterpapier Nr. 42 von Whatman filtriert.
2. Von jedem Filtrat werden zwei 1-em3- Portionen in je ein Mikroreagenzglas abpipet- tiert. Es werden so zwei Reihen von R.eagenz- gläschen erhalten, die mit I bzw. mit P bezeichnet werden. In jedes Gläschen der Reihe I werden 6 Tropfen Insulinlösung, in jedes Gläschen der Reihe P 2 Tropfen Polypeptid- lösung gegeben.
3. Nach 15 Minuten werden die Trübungen in den beiden Reagenzglasreihen beobachtet. Der Punkt, bei welchem die entsprechenden I- und P-Gläschen gleiche Trübung zeigen, wird als isophaner Punkt angenommen.
Berechnung Wenn x mg Insulin (= 4000 Einheiten) in 120 cm3 der ursprünglichen Insulinpufferlösung enthalten waren, y mg Polypeptid in 100 cm3 Wasser und z cm3 Polypeptidlösung zum Bilden einer isophanen Mischung zugesetzt wurden, werden
EMI5.15
Insulin durch mg Polypeptid gefällt. Also werden
EMI5.16
EMI5.17
Polypeptid 10 mg Insulin fällen. Beispiel. 1 1.74 mg Insulin wurden in 10 em3 n/10-HCl gelöst und der Lösung 0,3 cm3 Kresol, 1,6 g Glycerin, 16,7 mg Zinkchlorid (wasserfrei) und 9 mg Natriumchlorid zugesetzt, so dass die Lösung, auf das Gewicht des Insulins bezogen, 4,6 % Zink enthielt. Eine Lösung von 240 mg Polylysin in m/32-Phosphatpuffer, pH 3,1, wurde zugesetzt, und die Mischung mit Phosphatpuffer auf das Gesamtvolumen 100 cm3 gebracht. Der isophane Wert des Polypeptides war 0,95 mg/10 mg Insulin.
Dieses Präparat wurde durch einen Übers- Kreuz-Test an 12 Kaninchen mit einem Standard-Insulin verglichen. Die Kaninchen worden in 6 gleiche Gruppen eingeteilt und Blutzuckerbestimmungen am vereinigten Blut jedes Paares vor der Injektion und anschlie- ssend stündlich während 6 Stunden ausgeführt. Die verabfolgte Dosis pro Tier war 0,035 cin3 subkutan.
Die beobachteten Blutzuckerwerte sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. t
EMI5.23
<tb> Blutzucker <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> ursprünglichen <SEP> Wertes
<tb> Präparat <SEP> Gehalt <SEP> nach <SEP> Stunden
<tb> i <SEP> '- <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Standard-Insulin <SEP> 40 <SEP> Eicm3 <SEP> 48,9 <SEP> 48,3 <SEP> 60,0 <SEP> 79,3 <SEP> 88,3 <SEP> 95,5
<tb> Polylysin-Zink-Insulin <SEP> 40 <SEP> EI/cm3 <SEP> 68,2 <SEP> 56,0 <SEP> 52,0 <SEP> 53,2 <SEP> 52,0 <SEP> 56,4
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Beispiel 2 Eine Lösung von Poly-L-lysin-Zink-Insulin mit einem Gehalt von 3 mg Polylysin und 2,0 mg Zink pro 100 Insulineinheiten wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Sie hatte den PH 3,1 und enthielt 0,3% Kresol und 1,6% Glycerin. Der isophane Wert des Polypeptides war 0,95 mg 10 mg Insulin.
Dieses Präparat wurde an Kaninchen geprüft. Die während einer Periode von 6 Stunden erhaltenen mittleren Blutzuclkerwerte sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
EMI6.1
<tb> Angenommener <SEP> Blutzucker <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> ursprünglichen <SEP> Wertes
<tb> Gehalt <SEP> Tag <SEP> nach <SEP> Stunden
<tb> I <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> 1 <SEP> 76 <SEP> 66 <SEP> 59 <SEP> 60 <SEP> 63 <SEP> 71
<tb> 40 <SEP> Ecm3 <SEP> 2 <SEP> 83 <SEP> 67 <SEP> 59 <SEP> 64 <SEP> 61 <SEP> 77
<tb> Mittel <SEP> 79 <SEP> 66 <SEP> 59 <SEP> 62 <SEP> 62 <SEP> 74
Beispiel 3 a) l74 mg Insulin (Gehalt 23 I. E/mg) wurden in 10 cm3 n-10-HCl gelöst und der Lösung 16,7 mg ZnCl2, 9 mg NaCl, 0,2 em3 Trikresol und 1,6 cm3 Glycerin zugesetzt, so dass sie, auf das Gewieht des Insulins bezogen, 4,6% Zink enthielten.
Dieser Lösung (Lösung A) wurden etwa 70 cm3 m/32-Na2HPO4 Lösung und dann eine Lösung von 124 mg Poly-(L-leuzin : L-lysin)-hydroehlorid, enthaltend 50 Molprozente L-Ly sin, in 8 em3 der Phosphatlösung zugesetzt. Die Lösungen wurden schnell vermischt und das Volumen durch Zusatz von Phosphatlösung auf 100 cm3 gebracht. Die gebildete Suspension wurde mit 2,5 cm3 n-HCl auf PH 3,2 angesäuert, wodurch eine klare Lösung entstand.
b) Zu einer mit der obigen Lösung A identischen Lösung wurden 2,5 em3 n-HCl gegeben, dann wurden die Puffer- und die Peptidlösung zugesetzt, wodurch eine klare Lösung mit dem pH 3,06 erhalten wurde.
e) Zu einer mit der obigen Lösung A identischen Lösung wurde die gleiche Menge in 0,9 %iger NaCl-Lösung aufgelöstes Polv- peptid gegeben, das Volumen mit Salzlösung- auf 100 em3 gebracht und der pH auf 3,00 eingestellt.
Der isophane Wert des Polypeptides war 1,64 mg/10 mg Insulin.
Diese drei Lösungen wurden an drei Gruppen zu je 5 Kaninchen geprüft, die vor der Verwendung 21 Stunden gefastet hatten. Eine Dosis von 0,4 I.E/kg wurde verwendet; eine gleiche Dosis von Standard-Insulin wurde einer vierten Gruppe von Kaninchen verabreicht. Die nach 0, 1, 2, 4 und 6 Stunden gefundenen mittleren Blutzuckerwerte sind unten angegeben.
EMI6.8
<tb> Zeit <SEP> Blutzuckerwerte <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangswertes
<tb> in <SEP> Stunden
<tb> Standard-Insulin <SEP> Präparat <SEP> 3a <SEP> Präparat <SEP> 3b <SEP> Präparat <SEP> 3c
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 50,8 <SEP> 66,8 <SEP> 66,2 <SEP> 62.9
<tb> 2 <SEP> 53,6 <SEP> 58,4 <SEP> 63,9 <SEP> 54,1
<tb> 4 <SEP> 90,7 <SEP> 65,3 <SEP> 66.7 <SEP> 59,6
<tb> 6 <SEP> 109,2 <SEP> 76,9 <SEP> 87,8 <SEP> 73,0
Beispiel 4 Wirkung der Veränderung der Polypeptid- menge im Verhältnis zum isophanen Wert. a.) 174 mg Insulin wurden in 10 em3 n/10-HCl gelöst, und der Lösung 0,2 cm3 Tri-
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kresol, 1,6 g Gly eerin, 16,7 mg ZnCl2 und 9,
0 mg NaCl zugesetzt, so dass, auf das Ge- wieht des Insulins bezogen, 4,6% Zink vorhanden waren. Eine Lösung von 20 mg Poly- (L-lysin-L-leuzin)-hydroehlorid, 50 Molprozente L-Lysin enthaltend, in m/32-Phosphat- pufferlösung, pH 2,95, wurde zugesetzt und das Gesamtvolumen mit Phosphatpuffer auf 100 em3 ergänzt. h) Ein mit dem obigen identisches Präparat wurde hergestellt, nur dass 40 mg Poly- peptid verwendet wurden. c) Ein mit a) identisches Präparat wurde hergestellt, nur dass 60 mg Polypeptid verwendet wurden.
Der isophane Wert des Polypeptides war 2,87 mg/10 mg Insulin. Die oben verwendeten Mengen sind demzufolge die 0,4-, 0,8- und 1,2fachen isophanen Mengen.
Gruppen von je 5 Kaninchen wurden zur Prüfung dieser Präparate verwendet und dabei mit Standard-Insulin und einer Prot- amin-Zink-Insuzlin-Suspension verglichen. Subkutane Injektionen von je 0,01 cm3/kg wurden verabreicht.
EMI7.13
<tb> Mittlerer <SEP> Blutzuckergehalt <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangswertes
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Standard-Insulin <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<SEP> Präparat <SEP> 4a <SEP> Präparat <SEP> 4b <SEP> Präparat <SEP> 4c
<tb> 1 <SEP> 42,9 <SEP> 62,4 <SEP> 41,7 <SEP> 51,6 <SEP> 49,2
<tb> 2 <SEP> 43,9 <SEP> 56,3 <SEP> 38,8 <SEP> 55,0 <SEP> 48,8
<tb> 4 <SEP> 69,3 <SEP> 58,6 <SEP> 69,6 <SEP> 75,2 <SEP> 53,9
<tb> 6 <SEP> 97,9 <SEP> 76,0 <SEP> 100,1 <SEP> 89,7 <SEP> 67,8
Beispiel 5 174 mg Insulin mit einem Zinkgehalt von 0,075 % wurden in 10 cm3 n/10-HCl gelöst und der Lösung 1,6 em3 Glyeerin, 0,2 em3 Trikresol und 9 mg NaCl zugesetzt. Hierauf wurden der Lösung weiter etwa 80 cm3 iso- toniseher Koehsalzlösung und 120 mg Poly- (L-lysin : leuein)-hy droehlorid, 50 Molprozente L-Lysin enthaltend, in 8 cm3 Kochsalzlösung gelöst, zugefügt. Das Ganze wurde mit Kochsalzlösung auf 100 cm3 ergänzt und der pH auf 3,03 eingestellt.
Drei Gruppen hungriger Kaninchen wurden zum Vergleich dieses Präparates mit Standard-Insulin und mit Protamin-Zink- Insulin-Suspension behandelt.
EMI7.20
<tb> Blutzucker <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangswertes
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Präparat <SEP> 5 <SEP> Standard-Insulin <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<tb> 1 <SEP> 65,0 <SEP> 43,8 <SEP> 69,8
<tb> 2 <SEP> 55,1 <SEP> 41,3 <SEP> 50,7
<tb> 4 <SEP> 69,2 <SEP> 66,4 <SEP> 59,9
<tb> 6 <SEP> 70,2 <SEP> 97,0 <SEP> 68,5
Beispiel 6 174 mg Insulin wurden in der minimalen Menge n/10-HCl gelöst und die Lösung mit einer m/32-Na2HPO4Lösung auf 80 em3 verdünnt. Dann wurden 16,7 mg Zinkehlorid. 9,0 g Natriumehlor id, 0,2 em3 Trikresol und 1,6 cm@ Glycerin zugefügt.
Der Zinkgehalt der Lösung, bezogen auf das Gewicht des Insulins, betrug 4,6 %. Eine Lösung von 322,9 mg Poly- (L-lysin : L-leuzin)-hydrochlorid, 30 Molpro- zente L-Lysin enthaltend (isophaner Wert
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8,5 mg/10 mg Insulin), in 8 em3 Phosphatlösung wurde zugesetzt und das Ganze mit Phosphatlösung auf 100 cm3 gebracht. Die gebildete Suspension wurde durch Einstellen des pH mit n-HCl auf 3,25 in eine Lösung übergeführt.
Dieses Präparat wurde im Übers-Kreuz- Test an Gruppen von 10 Kaninchen mit Standard-Insulin verglichen. Eine Dosis von 0,035 cm3 pro Kaninchen wurde verwendet. Die erreichten mittleren Blutzuckerspiegel und ein typisches mit P. Z. I. an den gleichen Kaninchen erhaltenes Resultat sind der folgenden Tabelle zu entnehmen.
EMI8.1
<tb> Blutzucker <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangswertes
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Präparat <SEP> 6 <SEP> Standard-Insulin <SEP> P. <SEP> Z.
<SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 79,9 <SEP> 55,6 <SEP> 74,8
<tb> 2 <SEP> 72,6 <SEP> 55,9 <SEP> 58,0
<tb> 3 <SEP> 71,8 <SEP> 71,2 <SEP> 57,3
<tb> 4 <SEP> 79,2 <SEP> 83,9 <SEP> 56,7
<tb> 5 <SEP> 80,3 <SEP> 93,7 <SEP> 66,2
<tb> 6 <SEP> 84,4 <SEP> 93,4 <SEP> 73,0
Beispiel i Nach dem Vorgehen von Beispiel 6 wurden mit den unten genannten Polymeren Präparate hergestellt, wobei die zugesetzte Menge Polymer in jedem Fall das 2,4fache des iso- phanen Verhältnisses betrug.
In der Tabelle sind die isophanen Werte jedes Polymers, die zur Herstellung jedes Präparates verwendete Polymermenge und der pH der fertigen Lösung angegeben.
EMI8.4
<tb> Polymerhydrochlorid <SEP> Isophaner <SEP> Wert <SEP> Pulymermenge
<tb> Nr. <SEP> (Molprozente <SEP> jeder <SEP> Komponente) <SEP> mg/Io <SEP> mg <SEP> Insulin <SEP> in <SEP> mg <SEP> pro <SEP> 174 <SEP> mg <SEP> PH
<tb> Insulin
<tb> a <SEP> 40-L-Lysin <SEP> : <SEP> 60-L-Leuzin <SEP> 4,63 <SEP> 193,2 <SEP> 3,0
<tb> b <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-L-Phenylalanin <SEP> 2,19 <SEP> 91,4 <SEP> 3,2
<tb> c <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-DL-Leuzin <SEP> 1,64 <SEP> 68,3 <SEP> 3,2
<tb> d <SEP> 50-DL-Ornithin <SEP> : <SEP> 50-L-Leuzin <SEP> 1,77 <SEP> 74,0 <SEP> 3,0
<tb> 6 <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-DL-Ornithin <SEP> 0,88 <SEP> 36,5 <SEP> 3,2
<tb> f <SEP> 50-L-Lysin <SEP> :
<SEP> 50-DL-Isoleuzin <SEP> 2,19 <SEP> 81,5 <SEP> 3,3
<tb> g <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-DL-Valin <SEP> 2,32 <SEP> 96,6 <SEP> 3,0
<tb> h <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-DL-Phenylalanin <SEP> 2,11 <SEP> 87,6 <SEP> 3,2
<tb> i <SEP> 50-L-Lysin:50-Glyzin <SEP> 1,74 <SEP> 72,5 <SEP> 3,1
<tb> j <SEP> 75-L-Lysin <SEP> : <SEP> 25-DL-Isolerizin <SEP> 2,32 <SEP> 96,9 <SEP> 3,1
<tb> k <SEP> 75-L-Lysin <SEP> : <SEP> 25-DL-Valin <SEP> l,31 <SEP> 54,7 <SEP> 3,3
<tb> Z <SEP> 75-L-Lysin <SEP> : <SEP> 25-DL-Phenylalanin <SEP> 1,35 <SEP> 56,4 <SEP> 3,0
<tb> M <SEP> 75-L-Lysin <SEP> : <SEP> 25-Glyzin <SEP> 1,38 <SEP> 57,6 <SEP> 3,1
<tb> n <SEP> 75-L-Lysin <SEP> : <SEP> 25-L-Leuzin <SEP> 1,37 <SEP> 57,2 <SEP> 3,1
<tb> 0 <SEP> 50-D-Lysin <SEP> :
<SEP> 50-L-Leuzin <SEP> 2,18 <SEP> 91,0 <SEP> 3.3
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Einige dieser Präparate wurden mit Standard-Insulin und Protamin-Zink-Insulin ver- g l ielien, wobei für jedes Präparat eine Gruppe von 5 Kaninchen verwendet wurde. Die Dosis betrug 0,4 I. E./kg.
Die erreichten mittleren Blutzuckerspiegel in Prozenten des Anfangswertes sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt.
EMI9.3
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Standard-Insulin <SEP> 7a <SEP> 7 <SEP> f <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 50,3 <SEP> 65,3 <SEP> 52,4 <SEP> 74,3
<tb> 2 <SEP> 61,4 <SEP> 60,2 <SEP> 53,5 <SEP> 63,2
<tb> 4 <SEP> 96,8 <SEP> 65,8 <SEP> 80,1 <SEP> 74,7
<tb> 6 <SEP> 107,0 <SEP> 70,2 <SEP> 99,1 <SEP> 91,2
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Standard-Insulin <SEP> 7h <SEP> 7i <SEP> P. <SEP> Z.
<SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 45,4 <SEP> 63,3 <SEP> 50,3 <SEP> 60,0
<tb> 2 <SEP> 51,2 <SEP> 55,6 <SEP> 46,8 <SEP> 62,3
<tb> 4 <SEP> 93,3 <SEP> 65,8 <SEP> 82,1 <SEP> 65,8
<tb> 6 <SEP> 103,5 <SEP> 90,2 <SEP> 97,8 <SEP> 76,1
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Standard-Insulin <SEP> 7b <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 51,8 <SEP> 57,6 <SEP> 66,4
<tb> 2 <SEP> 58,3 <SEP> 58,2 <SEP> 57,2
<tb> 4 <SEP> 96,1 <SEP> 73,5 <SEP> 76,7
<tb> 6 <SEP> 98,5 <SEP> 86,8 <SEP> 89,3
Klinische Versuche ball I: Die Lösung enthielt 40 Einheiten Insulin pro cm3 und 1,7 mg Polylysin und 0,6 mg Zink pro 100 Einheiten Insulin.
Sie wurde wie folgt hergestellt: 2,6 g Insulin mit einem Gehalt von 23 Einheiten/mng wurden in einer Mischung von 2,6 cm3 n-HCl und 500 cm3 Wasser gelöst und der Lösung 3,75 g Phenol, 24 g Glycerin und eine Lösung von 0,45 g Zinkoxyd in 114 cm3 n/10 HCl zugesetzt. In diese Lösung wurden 1,02 g gelöstes Polylysin- hydrochlorid (isophaner Wert 0,95 mg/10 mg Insulin) gebracht und der pH durch Zusatz von n-HCl auf 3,2 eingestellt. Das Volumen wurde durch Wasserzusatz auf 1500 cm3 gebracht und das Produkt steril filtriert.
Die Dosis betrug 1,5 cm3. Zum Vergleich wurde beim gleichen Patienten ein anderes Mal Protamin-Zink-Insulin verwendet. 'Die zu den angegebenen Zeiten ausgeführten Blutzuckerbestimmungen ergaben die folgenden Werte, ausgedrückt in mg Zucker/100 ein3 Blut
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EMI10.1
Polylysin-Insulin Blutzucker P rotamin-Zink-Insulin Blutzucker 6o Einheiten/cm3 in mg % Einheiten/cms in mg /o Fasten 1 217 Fasten 1 \308 2 2.10 2 245 Insulin -@ - Insulin Standen 240 Stunden 1 248 1 217 2 202 2 208 3 188 3 210 4 172 4 196 24 163 24 210 25 268 25 204 26 286 26 226 27 268 27 230 28 244 28 283 Fall II: Das Präparat wurde wie bei Fall I hergestellt.
Es enthielt 80 Einheiten Insulin im em3 und pro 100 Einheiten Insulin 1,7 mg Polv- lysin und 0,7 mg Zink. Die Dosis war 1,0 cm3. Die entenstehenden Zahlen geben die mit demn Polvlvsinpräparat allein und mit einer Mi- sehung des Präparates mit einem gleiehen Volumen gewöhnliehen, lösliehen Insulins erhaltenen Werte im Vergleielh zu den mit Protamin-Zink-Insulin und lösliehem Insulin erreiehten an.
EMI10.7
Polylysin-Insulin Mischung von polylysin-Insulin mit protamin-Zink-Insulin Lösliches Insulin 8o Einheiten/em3 8o Einheiten/em3 8o Einheiten/cm3 Blutzucker mg % löslichem Insulin Blutzucker m ' ' Blutzucker mg % g io Blutzucker mg ;
o Fasten 1 490 536 160 250 2 490 556 200 260 3 254 Insulin -3. -Stunden 1/2 480 574 266 258 1 476 456 306 190 2 436 364404 312 21/2 155 3 400 262--36 314 31/ 078 4 344 178258 310 24 284 080 360 25 268 127 360 26 400 153 400 27 388 165 400 28 388 204 400
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Method for producing an insulin preparation with a prolonged duration of action If a person with diabetes is injected with insulin, a rapid drop in the blood sugar level is observed, but this effect is not long-lasting. Two insulin injections are therefore often necessary within 24 hours to maintain normal blood cell levels.
In order to avoid the need for such numerous injections, the insulin is usually combined with a basic protein such as protamine, usually with the addition of zinc, whereby a zinc-protamine-insulin preparation is obtained in the form of a suspension, which when injected has a longer duration of action than insulin.
This effect is presumably due to the fact that the compound formed only dissolves poorly at pH values near the neutral point and can thus serve as an insulin reservoir or depot in the body, from which insulin slowly passes into the bloodstream. Such preparations represent considerable progress compared to the previously used insulin solutions, but they are not entirely satisfactory because they exert their hypoglycaemic effect fairly slowly, so that a simultaneous injection of an insulin solution is often necessary to increase the blood sugar content quickly enough reduce.
However, this procedure is also not completely satisfactory, since different brands and approaches of protamine-zinc-insulin suspensions differ considerably in the amount of protamine present in excess over the isophane ratio, so that mixtures of soluble insulin with such preparations result in different hypoglycemia - can have an effect. In addition, the protamine-zinc-insulin suspensions do not always remain physically unchanged during longer storage.
Clumps can form or become thinner, so that the response time of the blood sugar content after an injection can undergo undesirable changes. In addition, the suspensions sediment during storage so that they have to be shaken vigorously before being drawn into the syringe. However, this causes foaming with all its disadvantages.
Another disadvantage of these and similar preparations is the use of protamine, a material isolated from natural sources, the composition of which can differ from case to case, which results in different past and biological behavior. Another disadvantage of using protamine is that it is subject to slow autolysis at 37 and PH 7, which means that
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an insulin preparation made using protamine may not be stable at physiological pH.
The present invention relates to a process for the production of insulin preparations which are soluble at a pji between 2 and 4 and have a prolonged action time. The process is characterized in that one insulin and a synthetic, basic polypeptide containing no less than 8 amino acid units per molecule contains, implemented with each other.
In a particular embodiment of the invention, the reaction between insulin and the synthetic polypeptide takes place in the presence of a soluble zinc compound.
The preparations obtained according to the invention are superior to protamine-zinc-insulin (suspension) in that they 1. cause the blood sugar level to drop more rapidly after the injection, 2. represent solutions and not suspensions and are therefore more easily aseptically filled into a multi-dose container and 3. can be manufactured in such a way that they exert the hypoglycemic effect for a shorter or longer period of time, as desired. However, their duration of action is always longer than that of an insulin solution.
Another advantage of using the polypeptides defined above over natural protamine lies in the greater uniformity of the insulin preparations produced with the former.
Good results are achieved, for example, with polypeptides from Ly sin. However, polypeptides from ornithine can also be used, as well as mixed polypeptides from lysine and ornithine or from the above-mentioned amino acids and valine, phenylalanine, leucine, isoleucine or glycine. Mixed polypeptides of lysine, leucine and phenylalanine are preferred.
The polypeptides suitable for the process according to the invention can be synthesized according to the information in the false literature. It can advantageously be carried out by a one-stage polycondensation of a suitable derivative of the amino acid, such as the Na carboxy anhydride, with the free amino group in the # position of the lysine or ornithine by a suitable group, for example a carbobenzoxy radical, which is later removed , can be protected. The polycondensation is usually carried out in an inert solvent, e.g. B.
Benzene, nitrobenzene, nitromethane, dioxane, pyridine or Äthvlaeetat at a temperature between 20 and 100 C in the presence of a substance that triggers the reaction, such as water or ammonia. The chain length of the polypeptides depends on the amount of the triggering substance. The polymerization of an N-carboxyanhydride is a chain polymerization in which the molecular weight is determined by the concentration ratio of monomer to trigger, at least for chain lengths of up to 15 amino acid residues. A polymer having any desired mean chain length can be obtained by selecting the monomeric trigger molecular ratio according to the desired chain length.
The synthetic polypeptides obtained in this way are not uniform products but consist of molecules with slightly different chain lengths. However, by carefully observing certain reaction conditions and using pure starting materials, products can at least be obtained which have a reproducible mean chain length and which are well suited for the purposes of the present invention. The mean chain length of the products can be determined according to one of the numerous known methods for end-of-life etching, e.g. B. according to the method of Voivod (Bioeheni. Journ. 19.19, 45, 412).
The naturally occurring L-amino acids are preferred as starting materials for the production of such polypeptides. However, DL-amino acids and even D-amino acids can also be used. will.
Mixed polypeptides can be made using mixtures of the
<Desc / Clms Page number 3>
corresponding Na-carboxy-anhdride in the described manner. The amount of neutral amino acids in such products should not be so great that the salt of the polypeptide formed (e.g. the hydrochloride) is insoluble in water. When using the preferred amino acid L-lysine, the L-Lvsine content of the mixed polyamine amino acids should not fall below 30 mol percent; 50 mole percent L-lysine is desirable.
The amount of polypeptide required to produce a soluble insulin-zinc-polypeptide compound depends somewhat on the nature of the polypeptide, depending on the desired duration of action. When using a polypeptide from L-Ly sin and L-leucine (50:50 mol percent), a soluble insulin preparation is obtained with an amount of polypeptide corresponding to twice the isophane value, the duration of which is longer than that of a protamine-zinc-insulin suspension. If the said polypeptide is used in an isophanic amount, the time of action of the product obtained corresponds approximately to that of the protamine-zinc-insulin preparation. This also applies to a preparation obtained by using three times the isophane amount of Polv-L-Lvsin.
If the preparation is to have a duration of action which exceeds that of a protamine-zinc-insulin preparation, then in general polypeptide quantities which are two to three times the isophane value will have to be used.
The expression isophane ratio or isophane value is to be understood as that amount of a synthetic basic polypeptide in milligrams that is necessary to produce isophane ratios with 10 milligrams of insulin.
The isophane ratio can be determined in the following way: insulin and polypeptide are mixed at a pH of 7.4, with a precipitate forming either immediately or after standing for a while. This is removed and the clear liquid is divided into two parts. Isophane conditions exist when the addition of insulin on the one hand and polypeptide on the other hand results in the same opalescence. A method for determining the isophane ratio will be described in more detail later.
The pH of the insulin-zinc-polypeptide solution must be low enough to allow the insulin-polypeptide compound to dissolve completely, but on the other hand the solution must not be so strongly acidic that it would be irritating on injection. The pH of the solution should therefore be kept within the limits 2.0 to 4.0. The preferred pH range is 2.8 to 3.5.
The presence of small amounts of zinc in the soluble insulin preparation is desirable in order to achieve a sufficiently prolonged period of action. For example, the zinc content can be as low as 0.075%. When using crystalline insulin, no additional zinc is required at all. In some cases an addition of zinc (as zinc salt) in the order of magnitude of 1 mg zinc / 500 insulin units gave satisfactory results (cf. Examples 1, 3 and 4). In example 5, the amount of zinc was reduced to 0.075% (weight / weight, based on insulin) without the prolonged duration of action being lost.
The preparation of the insulin-zinc-polypeptide solutions for therapeutic use can be carried out by mixing an aqueous insulin solution with an aqueous solution of the polypeptide. The polypeptide is usually used as a water-soluble salt such as a hydrochloride. One or both solutions can contain a zinc salt and be buffered to a suitable pH close to the physiological value.
The resulting suspension is acidified to the stated p11 value to achieve complete solution. According to another manufacturing process, an aqueous insulin solution and an aqueous polypeptide solution, at least one of which can contain a zinc salt and both have a value below 4, are mixed together and the
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standing clear solution then adjusted to the PH indicated earlier. An antiseptic such as phenol or cresol is advantageously added to the solutions thus obtained.
They can also be made isotonic by adding sodium chloride or glycerine and contain other substances that bring them to the desired pH and buffer them. Process for the production of the polypeptides In the following, processes are specified by which polypeptides suitable for the process according to the invention can be produced. Preparation of poly-L-lysine hydrochloride N # -Carbobenzoxy-Na-carboxy-L-lysine anhydride (3.35 g, 0.012 mol) was dissolved in dried, boiling benzene (152 cubic meters) and the solution was aqueous dioxane (2.055 em3, containing 25% water) added. After heating under reflux for 16 hours, the precipitated polymer (2.9 g) was separated off, washed with warm benzene and ether and dried.
The resulting poly-carbobenzoxy-L-lysine (1.9 g) was suspended in 100 cm 3 of glacial acetic acid and dry hydrogen chloride was passed through the suspension at 40-50 ° C. for 8 hours. The polymer was then filtered off, washed with ether and dried in vacuo. It was purified by dissolving it in water, treating the solution with charcoal, filtering and freeze-drying the filtrate. 0.9 g of poly-L-lysine hydrochloride was obtained in this way.
Production of poly (L-lysine: L-leuzine) hydrochloride with 50 percent L-lysine N # -carbobenzoxy-Na-earboxy-L-lysine-anhydride (6.4 g, 0.0209 mol) and Na -Carboxy-L-leucine anhydride (3.28 g, 0.0209 mol) were dissolved in 130 cm3 of dry dioxane, 6.97 cm3 of 0.2N ammonia in dioxane were added and the solution was for one hour at room temperature and then overnight stirred on the water bath. 260 cubic meters of 0.16N hydrogen chloride were added to the cooled, viscous solution and the resulting suspension of the polymer (7.8 g) was stirred for 6 hours. The product was then separated off, washed with water and dried in vacuo.
The poly (carbobenzoxy-L-lysine: L-leuzine) (6.2 g) was dissolved in 200 cubic meters of glacial acetic acid and dry hydrogen chloride was passed through the solution at 50 ° C. for 6 hours while stirring. The polymer was separated out as an oil by adding ether. This was centrifuged off, washed with ether and dried. The polty - (L-lysine: L-leuzine) - hydroehlorid (3.35 g) was made by dissolving in water. Treatment with wood and freeze drying of the filtrate cleaned.
Preparation of poly (L-lysine: L-phenylalanine) hydrochloride with 50 mol percent L-lysine 7.8 g or 0.0255 mol of N # -carbobenzoxy-Nra-earboxy-L-lysine anhydride and 4.87 g or 0.0255 moles of Nα -carboxy-L-phenylamine anhydride (m.p. 93-95 C) were dissolved in 160 cubic meters of dry dioxane. 3.5 emn3 0.49n ammonia in dioxane was added and the solution was stirred first for one hour at room temperature and then overnight on the water bath. 325 cm3 of 0.16N hydrogen chloride were added to the cooled solution and the mixture was stirred for a further 6 hours. The polymer (10.05 g) was isolated, washed with water and dried in vacuo.
The poly (carbobenzoxy-L-lysine: L-phenylalanine) was suspended in 200 cubic meters of glacial acetic acid and dry hydrogen chloride was passed into the suspension at 40-50 ° C. with stirring for q hours. During this time the polymer first dissolved and then separated out as an oil. Etlier was added to the cooled mixture and the solidified polymer was filtered off, washed with ether and dried in vacuo. The Polt '- (L-lysine: L-phenylalanine) -hydroehlorid was dissolved in water, treated with charcoal and the filtrate. freeze dried.
Other polymers were prepared in the same way from the 7-carboxy-anhydrides of the following amino acids: DL-iso-leucine, DL-
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Valine, glycine, S-carbobenzoxy-DL-ornithine, DL-phenylalanine, DL-leucine (the anhydride was made like the L-form; m.p. 50 to 52 C, decomposes at 94 C) and D-lysine (the Anhy drill was produced like the L-shape; m.p. 97-100 ° C. with decomposition). Method for determining the isophane ratio Required solutions: 1. 0.25% (weight / volume) polypeptide solution in water.
2. 4000 units of insulin are dissolved in a minimal volume of n / 10-HCl and the solution is diluted to 100 cm3 with water. 0.3 percent by volume of tricresol and 1.82% (weight / volume) glycerol are added to the solution. 20 cubic meters of Sörensen's phosphate buffer solution (m / 15, pH 7.4) are added to the solution and the pH of the mixture is adjusted to 7.4.
Sörensen's buffer solution: 1.75 g KH2PO4 and 7.65 g Na2HPO4 are dissolved in water and diluted to 100 em3. The pH is adjusted to 7.4. Procedure: 1. 4 em3 portions of the insulin solution are pipetted into test tubes and increasing amounts of the polypeptide solution are added to the tubes from 0.5 to 2.0 cm3 or if necessary more cm3. The glasses are shaken, allowed to stand for 5 minutes and the suspensions formed are filtered through Whatman No. 42 filter paper.
2. Two 1-em3 portions of each filtrate are pipetted into a micro test tube each. This gives two rows of reagent vials, which are designated with I and P, respectively. 6 drops of insulin solution are put into each vial in row I and 2 drops of polypeptide solution are put into each vial in row P.
3. After 15 minutes, the cloudiness in the two rows of test tubes is observed. The point at which the corresponding I and P vials show the same turbidity is assumed to be the isophanic point.
Calculation If x mg insulin (= 4000 units) were contained in 120 cm3 of the original insulin buffer solution, y mg polypeptide in 100 cm3 water and z cm3 polypeptide solution were added to form an isophane mixture
EMI5.15
Insulin precipitated by mg of polypeptide. So will
EMI5.16
EMI5.17
Precipitate polypeptide 10 mg insulin. Example. 1 1.74 mg insulin were dissolved in 10 em3 n / 10 HCl and 0.3 cm3 cresol, 1.6 g glycerol, 16.7 mg zinc chloride (anhydrous) and 9 mg sodium chloride were added to the solution, so that the solution, on the Based on weight of insulin, contained 4.6% zinc. A solution of 240 mg polylysine in m / 32 phosphate buffer, pH 3.1, was added, and the mixture was made up to a total volume of 100 cm3 with phosphate buffer. The isophane value of the polypeptide was 0.95 mg / 10 mg insulin.
This preparation was compared with a standard insulin by an cross-over test on 12 rabbits. The rabbits were divided into 6 equal groups and blood glucose determinations were carried out on the pooled blood of each pair before the injection and then every hour for 6 hours. The dose administered per animal was 0.035 cin 3 subcutaneously.
The blood sugar values observed are compiled in the following table. t
EMI5.23
<tb> Blood sugar <SEP> in <SEP>% <SEP> of the <SEP> original <SEP> value
<tb> preparation <SEP> content <SEP> after <SEP> hours
<tb> i <SEP> '- <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Standard insulin <SEP> 40 <SEP> Eicm3 <SEP> 48.9 <SEP> 48.3 <SEP> 60.0 <SEP> 79.3 <SEP> 88.3 <SEP> 95.5
<tb> Polylysine-zinc-insulin <SEP> 40 <SEP> EI / cm3 <SEP> 68.2 <SEP> 56.0 <SEP> 52.0 <SEP> 53.2 <SEP> 52.0 <SEP > 56.4
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Example 2 A solution of poly-L-lysine-zinc-insulin containing 3 mg of polylysine and 2.0 mg of zinc per 100 insulin units was prepared as described in Example 1. It had a pH of 3.1 and contained 0.3% cresol and 1.6% glycerine. The isophane value of the polypeptide was 0.95 mg 10 mg insulin.
This preparation was tested on rabbits. The mean blood sugar values obtained over a period of 6 hours are shown in the table below.
EMI6.1
<tb> Assumed <SEP> blood sugar <SEP> in <SEP>% <SEP> of the <SEP> original <SEP> value
<tb> Salary <SEP> day <SEP> after <SEP> hours
<tb> I <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> 1 <SEP> 76 <SEP> 66 <SEP> 59 <SEP> 60 <SEP> 63 <SEP> 71
<tb> 40 <SEP> Ecm3 <SEP> 2 <SEP> 83 <SEP> 67 <SEP> 59 <SEP> 64 <SEP> 61 <SEP> 77
<tb> Medium <SEP> 79 <SEP> 66 <SEP> 59 <SEP> 62 <SEP> 62 <SEP> 74
Example 3 a) 174 mg of insulin (content 23 IU / mg) were dissolved in 10 cm3 of n-10 HCl and the solution 16.7 mg of ZnCl2, 9 mg of NaCl, 0.2 cm3 of tricresol and 1.6 cm3 of glycerol added so that they contained 4.6% zinc based on the weight of the insulin.
This solution (solution A) was about 70 cm3 m / 32-Na2HPO4 solution and then a solution of 124 mg poly (L-leuzine: L-lysine) hydrochloride, containing 50 mol percent L-Ly sin, in 8 em3 of the phosphate solution added. The solutions were mixed quickly and the volume was brought to 100 cm3 by adding phosphate solution. The suspension formed was acidified to pH 3.2 with 2.5 cm 3 of n-HCl, whereby a clear solution resulted.
b) 2.5 em3 n-HCl were added to a solution identical to the above solution A, then the buffer and peptide solutions were added, whereby a clear solution with a pH of 3.06 was obtained.
e) The same amount of polypeptide dissolved in 0.9% NaCl solution was added to a solution identical to the above solution A, the volume was brought to 100 em3 with saline and the pH was adjusted to 3.00.
The isophane value of the polypeptide was 1.64 mg / 10 mg insulin.
These three solutions were tested on three groups of 5 rabbits that had fasted for 21 hours prior to use. A dose of 0.4 IU / kg was used; an equal dose of standard insulin was given to a fourth group of rabbits. The mean blood glucose values found at 0, 1, 2, 4 and 6 hours are given below.
EMI6.8
<tb> Time <SEP> blood sugar values <SEP> in <SEP>% <SEP> of the <SEP> starting value
<tb> in <SEP> hours
<tb> Standard insulin <SEP> preparation <SEP> 3a <SEP> preparation <SEP> 3b <SEP> preparation <SEP> 3c
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 50.8 <SEP> 66.8 <SEP> 66.2 <SEP> 62.9
<tb> 2 <SEP> 53.6 <SEP> 58.4 <SEP> 63.9 <SEP> 54.1
<tb> 4 <SEP> 90.7 <SEP> 65.3 <SEP> 66.7 <SEP> 59.6
<tb> 6 <SEP> 109.2 <SEP> 76.9 <SEP> 87.8 <SEP> 73.0
Example 4 Effect of the change in the amount of polypeptide in relation to the isophane value. a.) 174 mg insulin were dissolved in 10 em3 n / 10-HCl, and the solution 0.2 cm3 tri
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cresol, 1.6 g glycerine, 16.7 mg ZnCl2 and 9,
0 mg NaCl was added so that, based on the weight of the insulin, 4.6% zinc was present. A solution of 20 mg poly (L-lysine-L-leuzine) -hydrochloride, containing 50 mol percent L-lysine, in m / 32 phosphate buffer solution, pH 2.95, was added and the total volume with phosphate buffer to 100 em3 added. h) A preparation identical to the above was produced, except that 40 mg of polypeptide were used. c) A preparation identical to a) was produced, except that 60 mg of polypeptide were used.
The isophane value of the polypeptide was 2.87 mg / 10 mg insulin. The amounts used above are accordingly 0.4, 0.8 and 1.2 times the isophane amounts.
Groups of 5 rabbits each were used to test these preparations and compared with standard insulin and a protamine-zinc-insuclin suspension. Subcutaneous injections of 0.01 cm3 / kg each were given.
EMI7.13
<tb> Mean <SEP> blood sugar content <SEP> in <SEP>% <SEP> of the <SEP> starting value
<tb> time <SEP> in <SEP> hours <SEP> standard insulin <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<SEP> preparation <SEP> 4a <SEP> preparation <SEP> 4b <SEP> preparation <SEP> 4c
<tb> 1 <SEP> 42.9 <SEP> 62.4 <SEP> 41.7 <SEP> 51.6 <SEP> 49.2
<tb> 2 <SEP> 43.9 <SEP> 56.3 <SEP> 38.8 <SEP> 55.0 <SEP> 48.8
<tb> 4 <SEP> 69.3 <SEP> 58.6 <SEP> 69.6 <SEP> 75.2 <SEP> 53.9
<tb> 6 <SEP> 97.9 <SEP> 76.0 <SEP> 100.1 <SEP> 89.7 <SEP> 67.8
Example 5 174 mg of insulin with a zinc content of 0.075% were dissolved in 10 cm 3 of n / 10 HCl and 1.6 cm 3 of glycerin, 0.2 cm 3 of tricresol and 9 mg of NaCl were added to the solution. Then about 80 cm3 of isotonic saline solution and 120 mg of poly (L-lysine: leuein) -hydrochloride, containing 50 mol percent L-lysine, dissolved in 8 cm3 of saline solution, were added to the solution. The whole was made up to 100 cm3 with saline and the pH was adjusted to 3.03.
To compare this preparation, three groups of hungry rabbits were treated with standard insulin and with protamine-zinc-insulin suspension.
EMI7.20
<tb> Blood sugar <SEP> in <SEP>% <SEP> of the <SEP> starting value
<tb> time <SEP> in <SEP> hours <SEP> preparation <SEP> 5 <SEP> standard insulin <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<tb> 1 <SEP> 65.0 <SEP> 43.8 <SEP> 69.8
<tb> 2 <SEP> 55.1 <SEP> 41.3 <SEP> 50.7
<tb> 4 <SEP> 69.2 <SEP> 66.4 <SEP> 59.9
<tb> 6 <SEP> 70.2 <SEP> 97.0 <SEP> 68.5
Example 6 174 mg of insulin were dissolved in the minimum amount of n / 10 HCl and the solution was diluted to 80 em3 with an m / 32 Na2HPO4 solution. Then there was 16.7 mg of zinc chloride. 9.0 g of sodium chloride, 0.2 cubic centimeters of tricresol and 1.6 cm of glycerine were added.
The zinc content of the solution, based on the weight of the insulin, was 4.6%. A solution of 322.9 mg of poly (L-lysine: L-leuzine) hydrochloride, containing 30 mol percent L-lysine (isophanic value
<Desc / Clms Page number 8>
8.5 mg / 10 mg insulin), in 8 em3 phosphate solution was added and the whole was brought to 100 cm3 with phosphate solution. The suspension formed was converted into a solution by adjusting the pH to 3.25 with n-HCl.
This preparation was compared with standard insulin in the cross-over test on groups of 10 rabbits. A dose of 0.035 cc per rabbit was used. The mean blood sugar levels achieved and a typical result obtained with P. Z.I. in the same rabbits are shown in the table below.
EMI8.1
<tb> Blood sugar <SEP> in <SEP>% <SEP> of the <SEP> starting value
<tb> time <SEP> in <SEP> hours <SEP> preparation <SEP> 6 <SEP> standard insulin <SEP> P. <SEP> Z.
<SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 79.9 <SEP> 55.6 <SEP> 74.8
<tb> 2 <SEP> 72.6 <SEP> 55.9 <SEP> 58.0
<tb> 3 <SEP> 71.8 <SEP> 71.2 <SEP> 57.3
<tb> 4 <SEP> 79.2 <SEP> 83.9 <SEP> 56.7
<tb> 5 <SEP> 80.3 <SEP> 93.7 <SEP> 66.2
<tb> 6 <SEP> 84.4 <SEP> 93.4 <SEP> 73.0
EXAMPLE i Preparations were produced using the polymers mentioned below using the procedure of Example 6, the amount of polymer added in each case being 2.4 times the isophane ratio.
The table shows the isophane values of each polymer, the amount of polymer used to make each preparation and the pH of the final solution.
EMI8.4
<tb> polymer hydrochloride <SEP> isophane <SEP> value <SEP> amount of powder
<tb> No. <SEP> (mole percent <SEP> of each <SEP> component) <SEP> mg / Io <SEP> mg <SEP> Insulin <SEP> in <SEP> mg <SEP> per <SEP> 174 < SEP> mg <SEP> PH
<tb> insulin
<tb> a <SEP> 40-L-Lysine <SEP>: <SEP> 60-L-Leucine <SEP> 4.63 <SEP> 193.2 <SEP> 3.0
<tb> b <SEP> 50-L-Lysine <SEP>: <SEP> 50-L-Phenylalanine <SEP> 2.19 <SEP> 91.4 <SEP> 3.2
<tb> c <SEP> 50-L-Lysine <SEP>: <SEP> 50-DL-Leucine <SEP> 1.64 <SEP> 68.3 <SEP> 3.2
<tb> d <SEP> 50-DL-Ornithine <SEP>: <SEP> 50-L-Leucine <SEP> 1.77 <SEP> 74.0 <SEP> 3.0
<tb> 6 <SEP> 50-L-Lysine <SEP>: <SEP> 50-DL-Ornithine <SEP> 0.88 <SEP> 36.5 <SEP> 3.2
<tb> f <SEP> 50-L-Lysine <SEP>:
<SEP> 50-DL-Isoleuzine <SEP> 2.19 <SEP> 81.5 <SEP> 3.3
<tb> g <SEP> 50-L-Lysine <SEP>: <SEP> 50-DL-Valine <SEP> 2.32 <SEP> 96.6 <SEP> 3.0
<tb> h <SEP> 50-L-Lysine <SEP>: <SEP> 50-DL-Phenylalanine <SEP> 2.11 <SEP> 87.6 <SEP> 3.2
<tb> i <SEP> 50-L-lysine: 50-glycine <SEP> 1.74 <SEP> 72.5 <SEP> 3.1
<tb> j <SEP> 75-L-Lysine <SEP>: <SEP> 25-DL-Isolerizin <SEP> 2.32 <SEP> 96.9 <SEP> 3.1
<tb> k <SEP> 75-L-Lysine <SEP>: <SEP> 25-DL-Valine <SEP> l, 31 <SEP> 54.7 <SEP> 3.3
<tb> Z <SEP> 75-L-Lysine <SEP>: <SEP> 25-DL-Phenylalanine <SEP> 1.35 <SEP> 56.4 <SEP> 3.0
<tb> M <SEP> 75-L-lysine <SEP>: <SEP> 25-glycine <SEP> 1.38 <SEP> 57.6 <SEP> 3.1
<tb> n <SEP> 75-L-Lysine <SEP>: <SEP> 25-L-Leucine <SEP> 1.37 <SEP> 57.2 <SEP> 3.1
<tb> 0 <SEP> 50-D-Lysine <SEP>:
<SEP> 50-L-Leucine <SEP> 2.18 <SEP> 91.0 <SEP> 3.3
<Desc / Clms Page number 9>
Some of these preparations were compared with standard insulin and protamine-zinc-insulin, with a group of 5 rabbits being used for each preparation. The dose was 0.4 IU / kg.
The mean blood sugar levels achieved as a percentage of the initial value are compiled in the following tables.
EMI9.3
<tb> Time <SEP> in <SEP> hours <SEP> Standard insulin <SEP> 7a <SEP> 7 <SEP> f <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 50.3 <SEP> 65.3 <SEP> 52.4 <SEP> 74.3
<tb> 2 <SEP> 61.4 <SEP> 60.2 <SEP> 53.5 <SEP> 63.2
<tb> 4 <SEP> 96.8 <SEP> 65.8 <SEP> 80.1 <SEP> 74.7
<tb> 6 <SEP> 107.0 <SEP> 70.2 <SEP> 99.1 <SEP> 91.2
<tb> time <SEP> in <SEP> hours <SEP> standard insulin <SEP> 7h <SEP> 7i <SEP> P. <SEP> Z.
<SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 45.4 <SEP> 63.3 <SEP> 50.3 <SEP> 60.0
<tb> 2 <SEP> 51.2 <SEP> 55.6 <SEP> 46.8 <SEP> 62.3
<tb> 4 <SEP> 93.3 <SEP> 65.8 <SEP> 82.1 <SEP> 65.8
<tb> 6 <SEP> 103.5 <SEP> 90.2 <SEP> 97.8 <SEP> 76.1
<tb> time <SEP> in <SEP> hours <SEP> standard insulin <SEP> 7b <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 51.8 <SEP> 57.6 <SEP> 66.4
<tb> 2 <SEP> 58.3 <SEP> 58.2 <SEP> 57.2
<tb> 4 <SEP> 96.1 <SEP> 73.5 <SEP> 76.7
<tb> 6 <SEP> 98.5 <SEP> 86.8 <SEP> 89.3
Clinical trials ball I: The solution contained 40 units of insulin per cm3 and 1.7 mg of polylysine and 0.6 mg of zinc per 100 units of insulin.
It was prepared as follows: 2.6 g of insulin with a content of 23 units / mng were dissolved in a mixture of 2.6 cm3 of n-HCl and 500 cm3 of water and the solution was 3.75 g of phenol, 24 g of glycerol and a A solution of 0.45 g of zinc oxide in 114 cm3 of n / 10 HCl was added. 1.02 g of dissolved polylysine hydrochloride (isophanic value 0.95 mg / 10 mg insulin) were added to this solution and the pH was adjusted to 3.2 by adding n-HCl. The volume was brought to 1500 cm3 by adding water and the product was sterile filtered.
The dose was 1.5 cm3. For comparison, protamine-zinc-insulin was used another time in the same patient. The blood sugar determinations carried out at the specified times gave the following values, expressed in mg sugar / 100 ein3 blood
<Desc / Clms Page number 10>
EMI10.1
Polylysine-insulin blood sugar P rotamine-zinc-insulin blood sugar 6o units / cm3 in mg% units / cms in mg / o fasting 1 217 fasting 1 \ 308 2 2.10 2 245 insulin - @ - insulin standing 240 hours 1 248 1 217 2 202 2 208 3 188 3 210 4 172 4 196 24 163 24 210 25 268 25 204 26 286 26 226 27 268 27 230 28 244 28 283 Case II: The preparation was prepared as in Case I.
It contained 80 units of insulin in the em3 and, per 100 units of insulin, 1.7 mg polysin and 0.7 mg zinc. The dose was 1.0 cm3. The resulting numbers indicate the values obtained with the polvsin preparation alone and with a mixture of the preparation with an equal volume of usual soluble insulin in comparison to the values obtained with protamine-zinc-insulin and soluble insulin.
EMI10.7
Polylysine-insulin Mixture of polylysine-insulin with protamine-zinc-insulin Soluble insulin 8o units / em3 8o units / em3 8o units / cm3 blood sugar mg% soluble insulin blood sugar m '' blood sugar mg% g io blood sugar mg;
o Fasting 1 490 536 160 250 2 490 556 200 260 3 254 insulin -3. -Hours 1/2 480 574 266 258 1 476 456 306 190 2 436 364 404 312 21/2 155 3 400 262--36 314 31/078 4 344 178 258 310 24 284 080 360 25 268 127 360 26 400 153 400 27 388 165 400 28 388 204 400
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