DE957160C - Process for the production of biologically active preparations - Google Patents

Description

Verfahren zur Hersteilung von biologisch aktiven Zubereitungen Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von biologisch aktiven Zubereitungen mit einem Bestandteil, der in freiem Zustand ein Bindungsvermögen; für Vitamin B12 oder eine Intrinsic-Faktor-Aktivität aufweist und die aus Lösungen einer Kombination dieses Vitamins und dem aktiven Bestandteil hergestellt werden. Diese Lö sungen können aus tierischen Organen, wie dem Pylorus, dem Duodenum oder anderen Teilen des Verdauungstraktes, insbesondere aus deren Schleimen, in an sich bekannter Weise hergestellt werden.Process for the production of biologically active preparations the Invention relates to the production of biologically active preparations with a component which in the free state has a binding capacity; for vitamin B12 or has intrinsic factor activity and that of solutions of a combination of this vitamin and active ingredient. These solutions can come from animal organs, such as the pylorus, the duodenum, or other parts of the digestive tract, in particular from their mucus, in a manner known per se getting produced.

Diese Ausgangsstoffe enthalten einen biologisch aktiven Stoff, der imstande ist, mit Vitamin B12 eine Kombination zu bilden (s. Spiess, es s, Referat in Chem. Abstracts, 44, I950, Spalten 9015 i und 9o16a), worin das Vitamin nicht weiter als Wachstumsfaktor für gewisse Bakterien, wie Lactobazillus lactis Dorner und Lactobazillus Leichmannii, dienen kann. These raw materials contain a biologically active substance that is able to form a combination with vitamin B12 (see Spiess, es, Referat in Chem. Abstracts, 44, 1950, columns 9015i and 9o16a), in which the vitamin is not further as a growth factor for certain bacteria, such as Lactobacillus lactis Dorner and Lactobazillus Leichmannii.

Im Journal American Chemical Society, Bd. 7I, S. 3858 (I949), beschreiben J. L. Ternberg und und R. E. Eakin einen biologisch aktiven Faktor, der korrespondierende Eigenschaften aufweist und den sie »Apoerythein« nennen. Sie vermuten, daß dieser Faktor entweder der sogenannte Castlesche Intrinsic-Faktor selbst oder ein wichtiger Bestand- teil davon ist. In der britischen patentschrift4II I79 wird die Herstellung von oral wirksamen Präparaten durch Extraktion eines Verdauungsgemisches von Leber- und Magengeweben beschrieben. Described in the Journal American Chemical Society, Vol. 7I, p. 3858 (1949) J. L. Ternberg and and R. E. Eakin a biologically active factor, the corresponding Has properties and which they call "Apoerythein". You suspect this one Factor either the so-called Castle intrinsic factor itself or an important one Duration- is part of it. In British patent specification 4II I79 is the production of orally active preparations by extraction of a digestive mixture of liver and stomach tissues.

Die Natur der Kombination von Vitamin B12 und dem aktiven Bestandteil ist bisher nicht bekannt. In dieser Kombination wird das Vitamin B12 höchst wahrscheinlich durch die im Verdauungstrakt anwesenden Bakterien nicht angegriffen. Die Endprodukte des Verfahrens nach der Erfindung, welche diese Kombination enthalten, üben, wie aus klinischen Versuchen hervorgeht, bei oraler Applikation bei Patienten mit perniziöser Anämie eine günstige Wirkung aus. The nature of the combination of vitamin B12 and the active ingredient is not yet known. In this combination, the vitamin B12 becomes very likely not attacked by the bacteria present in the digestive tract. The end products of the method according to the invention, which contain this combination, practice how is evident from clinical trials, when administered orally in patients with pernicious Anemia has a beneficial effect.

Es wurde gefunden, daß die Herstellung der genannten biologisch aktiven Zubereitungen aus den wäßrigen Lösungen von Vitamin B12 und dem aktiven Bestandteil erfolgt, indem man die wäßrige Lösung mit einer auf unter oO abgekühlten organischen Flüssigkeit versetzt. Man gießt z. B. die wäßrige Lösung in diese organische Flüssigkeit, die mit Wasser mischbar, gegen die genannte Kombination indifferent, jedoch imstande ist, sie aus der wäßrigen Lösung zu fällen, wobei man die Temperatur des Gemisches unterhalb oO hält. Aus dem Niederschlag kann nach dem Zentrifugieren und Nachbehandeln mit einem Gemisch der verwendeten organischen Flüssigkeit und Äther (Volumenverhältnis z. B. I: I) , einer weiteren Behandlung mit getrocknetem Äther und Verdampfern des Äthers ein trockenes, pulverförmiges Endprodukt erhalten werden, das den größeren Teil der ursprünglich vorhandenen aktiven Bestandteile enthält. Um die Gefahr einer Zersetzung der obenerwähnten Kombination zu vermeiden, arbeitet man bei einer Temperatur unterhalb oO. It has been found that the production of said biologically active Preparations from the aqueous solutions of vitamin B12 and the active ingredient takes place by the aqueous solution with an organic cooled to below oO Liquid added. One pours z. B. the aqueous solution in this organic liquid, which are miscible with water, indifferent to the combination mentioned, but capable is to precipitate them from the aqueous solution, taking the temperature of the mixture below oO holds. After centrifugation and post-treatment, the precipitate can be used with a mixture of the organic liquid and ether used (volume ratio z. B. I: I), a further treatment with dried ether and evaporators of the Ether a dry, powdery end product can be obtained, which is the larger Contains part of the originally present active ingredients. To the danger of a To avoid decomposition of the above-mentioned combination, one works at one temperature below oO.

Als geeignete organische Flüssigkeiten seien erwähnt die niederen Alkanole, wie Methanol und Äthanol, die niederen Alkanone, wie Dimethylketon, Diäthylketon, oder Gemische dieser Flüssigkelte. Ausgezeichnete Ergebnisse werden bei Verwendung der Alkanone erhalten. The lower ones may be mentioned as suitable organic liquids Alkanols, such as methanol and ethanol, the lower alkanones, such as dimethyl ketone, diethyl ketone, or mixtures of these liquids. Excellent results will be achieved with use the alkanones obtained.

Vorzugsweise wendet man z. B. einen drei- bis zehnfachen Überschuß dieser Flüssigkeiten an, wodurch, sofern bei der Vereinigung der Flüssigkeiten eine Temperatur von - 200 aufrechterhalten wird, äußerst günstige Ausbeuten erhalten werden. Eine Fällung bei höherer Temperatur ist weniger vollständig. Preferably one uses z. B. a three to ten fold excess of these liquids, whereby, provided that when the liquids are combined, a Temperature of -200 is maintained, extremely favorable yields are obtained will. Precipitation at a higher temperature is less complete.

Dieses Fällungsverfahren ist außerdem für die Trennung des aktiven Bestandteiles von den begleitenden, in der Lösung anwesenden Verunreinigungen sehr geeignet, und zwar vor der Fällung der Kombination. Zu diesem Zweck setzt man einer Lösung der Kombination eine kleine Menge der zur Fällung der Kombination zu verwendenden Alkanole oder Alkanone zu. Es werden nur die Verunreinigungen gefällt; diese werden durch Filtrieren von der Lösung getrennt. This precipitation process is also used for the separation of the active Of the accompanying impurities present in the solution suitable before the combination is precipitated. For this purpose you put one Solution of the combination a small amount of that to be used to precipitate the combination Alkanols or alkanones too. Only the impurities are felled; these will separated from the solution by filtration.

Durch eine geeignete Konzentration an z. B. By a suitable concentration of z. B.

Äthanol oder Aceton, die unter anderem von der Art und Menge der begleitenden Vereinigungen abhängig zu wählen ist, ist man imstande, alle diese Verunreinigungen zu entfernen. Bei der obenerwähnten Arbeitsweise ist man natürlich an den pE-Bereich gebunden, innerhalb dessen der aktive Bestandteil beständig ist. Vorzugsweise finden diese Arbeitsgänge bei einem pH-Wert statt, der von etwa 3 bis 9 reicht.Ethanol or acetone, among other things, on the type and amount of accompanying Depending on which associations you choose, one is able to remove all of these impurities to remove. In the above-mentioned working method, one is of course in the pE area bound within which the active ingredient is persistent. Preferably find these operations take place at a pH ranging from about 3 to 9.

Zum Vergleich der Intrinsic-Faktor-Aktivität der ursprünglichen Lösung mit der der Endprodukte wird der Begriff Einheit des aktiven Bestandteiles (E) eingeführt. Diese Einheit E ist die Menge in Milligramm, die gerade imstande ist, ein Gamma-Vitamin-B12 zu binden oder in Anwesenheit eines Uberschusses an Vitamin B12 gerade ein Gamma-Vitamin-Bl2 gebunden hat. To compare the intrinsic factor activity of the original solution with that of the end products the term unit of the active ingredient (E) is introduced. This unit E is the amount in milligrams that is just able to produce a gamma vitamin B12 to bind or in the presence of an excess of vitamin B12 just a gamma vitamin Bl2 has bound.

Das gebundene Vitamin B12 kann z. B. wie folgt bestimmt werden. Zuerst wird das freie Vitamin B12 in normaler Weise, z. B. im dritten Nachtrag auf USP XIV, S. 15 ff., wie beschrieben bestimmt. Sodann wird in einem anderen Teil des Präparates der Gesamtgehalt an Vitamin B12 bestimmt, dadurch, daß man das Muster in einem geeigneten Lösungsmittel löst, die Lösung während einiger Minuten auf Ie50 im Autoklav behandelt und dann den Vitamin-Bl2;Gehalt der Lösung mikrobiologisch bestimmt. Die während der Behandlung im Autoklav in Freiheit gesetzte Menge Vitamin B12 läßt sich aus der Differenz der vorher und nachher bestimmten Vitamin-Bl2^Mengen berechnen. Soll man die Aktivität einer Ausgangslösung bestimmen, zu der noch kein Vitamin B12 zugesetzt worden ist, so fügt man einer bekannten Menge dieser Lösung eine bekannte Menge Vitamin B12 hinzu (Überschuß) und bestimmt nachher das nicht gebundene Vitamin B12. Die Differenz der hinzugefügten und der freien Menge Vitamin B, ist die gebundene Menge Vitamin B12. Aus dieser Differenz läßt sich die Intrinsic-Faktor-Aktivität der Ausgangslösung berechnen. The bound vitamin B12 can, for. B. can be determined as follows. First the free vitamin B12 is used in the normal way, e.g. B. in the third addendum to USP XIV, p. 15 ff., Determined as described. Then in another part of the The total vitamin B12 content of the preparation is determined by following the sample dissolves in a suitable solvent, the solution to Ie50 for a few minutes treated in the autoclave and then the vitamin Bl2; content of the solution microbiologically certainly. The amount of vitamin released during treatment in the autoclave B12 can be calculated from the difference between the vitamin B12 ^ quantities determined before and afterwards to calculate. Should one determine the activity of a starting solution for which no Vitamin B12 has been added, a known amount of this solution is added add a known amount of vitamin B12 (excess) and does not determine that afterwards bound vitamin B12. The difference between the added and the free amount of vitamin B, is the bound amount of vitamin B12. The intrinsic factor activity can be determined from this difference of the starting solution.

In den folgenden Beispielen wird ein Konzentrat des Intrinsic-Faktor-aktiven Bestandteiles, dessen Bindungsvermögen für Vitamin B12 ganz abgesättigt ist, als Ausgangsprodukt benutzt. In the following examples a concentrate of the intrinsic factor active Ingredient whose binding capacity for vitamin B12 is completely saturated, as Base product used.

Beispiel I I20 ccm Lösung mit I68 Einheiten E des aktiven Bestandteiles werden in das zehnfache Volumen 960/obigen Äthanols mit einer Temperatur von - 200 gegossen. Es entsteht eine Fällung, die nach dem Zentrifugieren bei Raumtemperatur nacheinander mit einer AlkoholAther-Mischung (I:I) und mit getrocknetem Äther behandelt wird, worauf das Produkt in einem Vakuumtrockner über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet wird. Es werden 3,405 g Pulver mit insgesamt} I53 E des aktiven Bestandteiles erhalten. Die vereinigten Flüssigkeiten ergeben eine Menge von 1130 ccm und enthalten noch weitere 9,1 E des aktiven Bestandteiles. Example I 20 cc solution with 168 units of U of the active ingredient are in ten times the volume of 960 / above ethanol with a temperature of - 200 poured. A precipitate results after centrifugation at room temperature treated successively with an alcohol-ether mixture (I: I) and with dried ether whereupon the product is placed in a vacuum dryer over concentrated sulfuric acid is dried. There are 3.405 g of powder with a total of} 153 U of the active ingredient obtain. The combined liquids make a quantity of 1130 cc and contain another 9.1 U of the active ingredient.

Beispiel II 4 gleiche Lösungen mit dem aktiven Bestandteil werden in verschiedener Weise der Fällung unterworfen und auf pulverförmige Zubereitungen ver- arbeitet. Aus der ersten Lösung wird der aktive Bestandteil durch Gefriertrocknung gewonnen, was 1,91 g trockene Substanz mit einer Aktivität von 360 E ergibt. Example II 4 identical solutions with the active ingredient subjected to precipitation in various ways and to powdered preparations ver is working. The first solution becomes the active ingredient obtained by freeze-drying, giving 1.91 g of dry substance with an activity of 360 E.

Die übrigen drei Lösungen werden in den zehnfachen Überschuß von 960/obigem Äthanol bei -5, -Io und 200 gegossen. The remaining three solutions are in ten times the excess of 960 / above ethanol poured at -5, -Io and 200.

Die Niederschläge werden zentrifugiert und bei Raumtemperatur mit 50 ccm Äthanol-Äther-Gemisch (I: I) und anschließend mit 50 ccm getrocknetem Äther gewaschen. Nach dem Trocknen werden Endprodukte in einer Gewichtsmenge von I,58g bzw. I,62g g und I,68g mit 3I2 bzw. 3I5 und 329 E erhalten. The precipitates are centrifuged and kept at room temperature 50 cc of ethanol-ether mixture (I: I) and then with 50 cc of dried ether washed. After drying, end products in an amount by weight of 1.58 g and I, 62g g and I, 68g with 3I2 and 3I5 and 329 E, respectively.

Beispiel III 200 ccm wäßrige Lösung mit 400 E aktivem Bestandteil werden unter Rühren in den zwölffachen Uberschuß Propanol von einer Temperatur von 200 gegossen. Es entsteht eine Fällung. Man läßt das Gemisch I5 Minuten bei 200 stehen und zentrifugiert den Niederschlag. Man wäscht diesen mit einer Propanol-Ather-Mischung (1 : 2), darauf mit getrocknetem Äther und erhält nach weiterem Trocknen eine Menge pulverförmiger Substanz mit dem Gewicht 2,46 g bei einer Gesamtaktivität von 374 E. Example III 200 cc aqueous solution with 400 U of active ingredient are stirred in a twelve-fold excess of propanol from a temperature of 200 cast. A precipitation occurs. The mixture is left at 200 for 15 minutes stand and centrifuge the precipitate. This is washed with a propanol-ether mixture (1: 2), then with dried ether and gets a lot after further drying powdery substance weighing 2.46 g with a total activity of 374 E.

BeispielIV 120 ccm Lösung mit I68 E aktivem Bestandteil werden in das zehnfache Volumen Aceton mit einer Temperatur von - 200 gegossen. Die entstehende Fällung wird nach dem Zentrifugieren nacheinander mit einem Gemisch. aus Aceton und Ather (I: I) und getrocknetem Äther gewaschen, worauf sie weiter getrocknet wird. Es werden so 4,167 g gepulvertes Produkt mit I6I E aktivem Bestandteil erhalten. Die vereinigten Flüssigkeiten, die insgesamt 1112 ccm betragen, enthalten weitere 2,4es Beispiel V 100 ccm rohes wäßriges Konzentrat mit 260 E aktivem Bestandteil werden unter starkem Rühren in das fünfzehnfache Volumen Methyläthylketon mit einer Temperatur von 200 gegossen. Man läßt das Gemisch bei dieser Temperatur I Stunde unter Rühren stehen. Es bildet sich ein Niederschlag der abzentrifugiert mit einem Gemisch aus Methyläthylketon und Äther (I:I) und anschließend mit getrocknetem Äther gewaschen wird. Example IV 120 cc solution with 168 E active ingredient are in poured ten times the volume of acetone at a temperature of - 200. The emerging Precipitation is carried out after centrifugation one after the other with a mixture. from acetone and ether (I: I) and dried ether washed, after which they are further dried will. 4.167 g of powdered product with 16I E active ingredient are obtained in this way. The combined fluids, which total 1112 cc, contain more 2.4 Example V 100 ccm of crude aqueous concentrate with 260 U of active ingredient are with vigorous stirring in fifteen times the volume of methyl ethyl ketone with a Poured temperature of 200. The mixture is left at this temperature for 1 hour stand under stirring. A precipitate forms which is centrifuged off with a Mixture of methyl ethyl ketone and ether (I: I) and then with dried ether is washed.

Nach dem Trocknen im Vakuum bei Raumtemperatur werden 5,I3 g gepulverte Substanz erhalten, dessen Gesamtaktivität mikrobiologisch gemessen 265 E betrug.After drying in vacuo at room temperature, 5.13 g are powdered Substance obtained, the total activity of which, measured microbiologically, was 265 U.

Beispiel VI 1,32 1 wäßriges Konzentrat Intrinsic-Faktoraktiven Bestandteiles mit I4 I00 E (mikrobiologisch bestimmt) werden unter starkem Rühren in 4 1 960/oigem Alkohol eingetragen, der auf - 50 abgekühlt ist. Durch wirksame Kühlung mit einem Gemisch aus Eis und Kochsalz und weiterem Rühren sorgt man dafür, daß die Temperatur nicht über oO ansteigt. Wenn das gesamte Konzentrat eingegossen ist, wird eine weitere Stunde geriihrt. Example VI 1.32 liter aqueous concentrate of intrinsic factor active ingredient with I4 I00 E (microbiologically determined) are mixed with vigorous stirring in 4 1,960 / oigem Entered alcohol that has cooled to -50. By effective cooling with a Mixture of ice and table salt and further stirring ensures that the temperature does not rise above oO. When all of the concentrate has been poured in, another one is made Hour.

Darauf läßt man den Ansatz weitere 3 Stunden bei oO stehen, hebert dann 3,3 1 überstehende Flüssigkeit ab, und gibt zur Restmasse, die bei oO gehalten wird, das gleiche Volumen Äther zu. Nach dem Aufrühren läßt man das Gemisch wiederum I Stunde stehen, vorauf die Masse durch einen Büchnertrichter filtriert wird. Der Niederschlag wird in trockenem Äther dispergiert und nochmals nach einigen Stunden Rühren filtriert. Den Niederschlag trocknet man dann in einem Vakuumtrockner. Die Ausbeute beträgt 34,5 g Pulver mit insgesamt I5 300 E (mikrobiologisch gemessen) aktivem Bestandteil, was bedeutet, daß 2,25 mg eine Aktivität von 1 E aufweisen. Das scheinbare Ansteigen in der Gesamtzahl der Einheiten gegenüber dem Ausgangsmaterial ist nicht von Bedeutung.The batch is then left to stand at 00 for a further 3 hours then 3.3 1 supernatant liquid from, and gives to the residual mass, which is kept at oO will, the same volume of ether too. After stirring, the mixture is left again Stand for 1 hour before filtering the mass through a Buchner funnel. Of the Precipitate is dispersed in dry ether and again after a few hours Stirring filtered. The precipitate is then dried in a vacuum dryer. the Yield is 34.5 g powder with a total of I5 300 U (measured microbiologically) active ingredient, which means that 2.25 mg has an activity of 1 U. The apparent increase in the total number of units from the parent material does not matter.

Das anfallende Pulver wurde klinisch an drei Patienten mit perniziöser Anämie erprobt. Es wurden täglich 23 mg dieses Pulvers oral in Tabletten verabreicht. Der mittlere Anstieg der Erythrocytenzahl betrug nach 14 Tagen I,OI Millionen je mm3 und nach 3 Wochen I,4I Millionen je mm3. The resulting powder was clinically given to three patients with perniciousness Tried anemia. 23 mg of this powder was administered orally in tablets daily. The mean increase in the number of erythrocytes after 14 days was 1.01 million each mm3 and after 3 weeks I, 4I million per mm3.

Das Reticulocytenmaximum betrug am achtenTage 7,70/0 bzw. 9,3 am siebenten Tage und 9,1 0/o am achten Tage.The reticulocyte maximum was 7.70 / 0 on the eighth day and 9.3 on the seventh Days and 9.1% on the eighth day.

Eine tägliche Dosis von 34,5 mg des Produktes gab bei einem Patienten ein sehr gutes Ansteigen der Erythrocyfenzahl, nämlich nach 14 Tagen I,30 Millionen je mm3, und nach 20 Tagen 2,12 Millionen je mms. Das Reticulocytenmaximum wurde bereits am vierten Tag erreicht und betrug 21,70/0. A daily dose of 34.5 mg of the product was given to one patient a very good increase in the number of erythrocytes, namely I, 30 million after 14 days per mm3, and after 20 days 2.12 million per mms. The reticulocyte maximum was reached on the fourth day and was 21.70 / 0.

BeispielVII 9,68 1 Konzentrat des Intrinsic-Faktor-aktiven Bestandteiles mit insgesamt Io3 500 E (mikrobiologisch bestimmt) wurden in die zehnfache Menge 960/oigem Alkohol bei einer Temperatur unter 120 unter starkem Rühren eingetragen. Das Gemisch wurde zentrifugiert, der Niederschlag gewaschen und in 20 1 getrocknetem Ather aufgenommen. Nach Rühren und 24 Stunden Stehenlassen wird das Gemisch zentrifugiert und der Niederschlag getrocknet. Die Ausbeute beträgt 269 g Pulver, das 365 E je g enthält. Somit entsprechen 2,74 mg einer Einheit E. Das Pulver enthält insgesamt 98 zoo E. Example VII 9.68 1 concentrate of intrinsic factor active ingredient with a total of Io3 500 U (determined microbiologically) were ten times the amount 960% alcohol entered at a temperature below 120 with vigorous stirring. The mixture was centrifuged, the precipitate washed and dried in 20 l Ather added. After stirring and standing for 24 hours, the mixture is centrifuged and the precipitate dried. The yield is 269 g of powder, the 365 E each g contains. Thus, 2.74 mg correspond to one unit of E. The powder contains a total 98 zoo E.

Es wurde oral an vier Patienten mit perniziöser Anämie in einer täglichen Dosis von 24,44 mg verabreicht. Der mittlere Anstieg der Erythrocytenzahl betrug nach 14 Tagen 0,92 Millionen je mm3 und nach 3 Wochen 1,39 Millionen je mm3. It was administered orally to four patients with pernicious anemia in one day Dose of 24.44 mg administered. The mean increase in erythrocyte count was after 14 days 0.92 million per mm3 and after 3 weeks 1.39 million per mm3.

Nach Verabreichung einer täglichen Dosis von 36,66 mg an zwei Patienten betrug der mittlere Anstieg nach 14 Tagen 1,13 Millionen je mm3 und nach 3 Wochen I,87 Millionen je mm3. After a daily dose of 36.66 mg was administered to two patients the mean increase after 14 days was 1.13 million per mm3 and after 3 weeks I, 87 million per mm3.

Beispiel VIII 230 ccm eines Gemisches eines hochgereinigten Konzentrates des Intrinsic-Faktor-aktiven Bestandteiles, das 2240 E enthält, werden unter starkem Rühren langsam in eine dreifache Menge 960/oigem Alkohol, der auf - 50 eingekühlt war, eingegossen. Die Temperatur wird dabei unter oO gehalten. Dann wird das Gemisch noch 3 Stunden gerührt und der Niederschlag in derselben Weise, wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben, verarbeitet. Die Ausbeute beträgt 959 mg. Die Zubereitung enthält insgesamt 2033 gammagebundenes Vitamin B12, was bedeutet, daß 0,472 mg einer Einheit E entsprechen. Example VIII 230 cc of a mixture of a highly purified concentrate of the intrinsic factor active ingredient, which contains 2240 E, are under potent Stir slowly in a three-fold amount 960 per cent alcohol, which is on - 50 had cooled down, poured. The temperature is kept below 0O. then the mixture is stirred for another 3 hours and the precipitate in the same way, processed as described in the previous example. The yield is 959 mg. The preparation contains a total of 2033 gamma-bound vitamin B12, which means that 0.472 mg of a unit E corresponds.

Diese Zubereitung wurde bei einer täglichen Dosis von 4,72 mg bei vier Patienten mit perniziöser Anämie erprobt. Der mittlere Anstieg der Erythrocytenzahl betrug nach 14 Tagen o,go Millionen je mm3 und nach 3 Wochen I,34 Millionen je mm3. This preparation was applied at a daily dose of 4.72 mg tried four patients with pernicious anemia. The mean increase in erythrocyte count after 14 days was 0.2 million per mm3 and after 3 weeks 1.34 million per mm3.

Claims (4)

PATENTANSPRÜCHE: I. Verfahren zur Herstellung von biologisch wirksamen Zubereitungen, die einen Wirkstoff enthalten, der in freiem Zustande ein Bindungsvermögen für Vitamin Bl2 oder eine Intrinsic-Faktor-Aktivität aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man wäßrige Lösungen einer Kombination dieses Wirkstoffes und Vitamin B12 mit einer auf unter oO abgekühlten organischen Flüssigkeit versetzt, die mit Wasser mischbar, gegen die Kombination indifferent und imstande ist, diese aus wäßriger Lösung zu fällen, wobei man die Temperatur des Gemisches unterhalb oO hält. PATENT CLAIMS: I. Process for the production of biologically active substances Preparations which contain an active ingredient which in the free state has a binding capacity for vitamin Bl2 or an intrinsic factor activity, characterized in that that one aqueous solutions of a combination of this active ingredient and vitamin B12 with to an organic liquid cooled to below oO, which is mixed with water miscible, indifferent to the combination and capable of this from aqueous To precipitate solution, keeping the temperature of the mixture below oO. 2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man niedere Alkanone als organische Flüssigkeit verwendet. 2. The method according to claim I, characterized in that one lower Alkanones used as an organic liquid. 3. Verfahren. nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man niedere Alkanole als organische Flüssigkeit verwendet. 3. Procedure. according to claim I, characterized in that lower Alkanols used as an organic liquid. 4. Verfahren nach Anspruch I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Lösung in eine mindestens dreifache Menge der organischen Flüssigkeit eingießt. 4. The method according to claim I to 3, characterized in that one the aqueous solution in at least three times the amount of the organic liquid pours.