CA2823030A1 - Procede d'immobilisation de ligands nucleiques - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé d'immobilisation de ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive, par greffage sur un support solide activé, comprenant une étape de couplage desdits acides nucléiques sur ledit support solide activé à un pH inférieur à 6.
Description
Procédé d'immobilisation de ligands nucléiques DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention se rapporte au domaine de la purification de substances d'intérêt à
l'aide de supports d'affinité utilisables à l'échelle industrielle, en particulier pour l'obtention de substances purifiées d'intérêt médical.
ART ANTERIEUR
Il existe un besoin récurrent de supports pour chromatographie d'affinité qui permettent l'enrichissement sélectif d'un produit de départ en une substance d'intérêt.
Dans le domaine médical, des supports de chromatographie d'affinité sont utilisés pour purifier des substances ultérieurement utilisées comme principes actifs de médicament.
Principalement, sont utilisés des supports de chromatographie d'immuno-affinité sur lesquels sont immobilisés des anticorps. Les supports d'inununo-affinité sont adaptés à
une purification de substances d'intérêt médical à l'échelle industrielle car ils possèdent une bonne capacité de rétention et une sélectivité élevée vis-à-vis de leur molécule cible.
De tels supports d'immuno-affinité peuvent être régénérés à l'issue des procédés de purification sans altération substantielle de leur capacité de rétention ou de leur sélectivité, ce qui permet leur utilisation sur une longue période de temps. De plus, du fait de leur capacité de rétention élevée, les supports d'irnmuno-affinité permettent la purification de grandes quantités de la substance cible, ce qui rend leur utilisation compatible avec les exigences techniques et économiques de la fabrication des médicaments. Les supports d'imrnuno-affinité présentent toutefois des inconvénients lorsqu'ils sont utilisés pour la purification de substances d'intérêt médical, en raison notamment (0 du relarguage de fragments protéiques immunogènes dérivés des anticorps immobilisés durant la phase d'élution de la substance cible préalablement retenue et (ii) de la fragilité
des anticorps vis-à-vis des conditions d'élution et des traitements périodiques de sanitisation anti-bactérienne et anti-virale.
Diverses études ont été entreprises afin de trouver des alternatives aux supports d'immuno-affinité connus. Un nombre limité d'études concerne l'utilisation des aptamères en tant que ligands d'affinité pour la purification de substances cibles, y compris de protéines cibles. On pourra ainsi citer à titre d'exemple les travaux de Romig
L'invention se rapporte au domaine de la purification de substances d'intérêt à
l'aide de supports d'affinité utilisables à l'échelle industrielle, en particulier pour l'obtention de substances purifiées d'intérêt médical.
ART ANTERIEUR
Il existe un besoin récurrent de supports pour chromatographie d'affinité qui permettent l'enrichissement sélectif d'un produit de départ en une substance d'intérêt.
Dans le domaine médical, des supports de chromatographie d'affinité sont utilisés pour purifier des substances ultérieurement utilisées comme principes actifs de médicament.
Principalement, sont utilisés des supports de chromatographie d'immuno-affinité sur lesquels sont immobilisés des anticorps. Les supports d'inununo-affinité sont adaptés à
une purification de substances d'intérêt médical à l'échelle industrielle car ils possèdent une bonne capacité de rétention et une sélectivité élevée vis-à-vis de leur molécule cible.
De tels supports d'immuno-affinité peuvent être régénérés à l'issue des procédés de purification sans altération substantielle de leur capacité de rétention ou de leur sélectivité, ce qui permet leur utilisation sur une longue période de temps. De plus, du fait de leur capacité de rétention élevée, les supports d'irnmuno-affinité permettent la purification de grandes quantités de la substance cible, ce qui rend leur utilisation compatible avec les exigences techniques et économiques de la fabrication des médicaments. Les supports d'imrnuno-affinité présentent toutefois des inconvénients lorsqu'ils sont utilisés pour la purification de substances d'intérêt médical, en raison notamment (0 du relarguage de fragments protéiques immunogènes dérivés des anticorps immobilisés durant la phase d'élution de la substance cible préalablement retenue et (ii) de la fragilité
des anticorps vis-à-vis des conditions d'élution et des traitements périodiques de sanitisation anti-bactérienne et anti-virale.
Diverses études ont été entreprises afin de trouver des alternatives aux supports d'immuno-affinité connus. Un nombre limité d'études concerne l'utilisation des aptamères en tant que ligands d'affinité pour la purification de substances cibles, y compris de protéines cibles. On pourra ainsi citer à titre d'exemple les travaux de Romig
2 et al. (I Chromatogra. B Biomed Sei Appl, 1999, 731(2) :275-84) qui concernent la purification de la L-sélectine sur un support de chromatographie sur lequel des aptamères d'ADN anti-L-sélectine ont été immobilisés via le couple streptavidine-biotine.
11 est connu de longue date que l'affinité et la spécificité des aptamères pour leur molécule cible peuvent être aussi élevées que celles des anticorps. Par ailleurs, les aptamères pouvant être obtenus par synthèse chimique, leur coût de fabrication est beaucoup plus faible que celui des anticorps. Néanmoins, l'utilisation de supports d'affinité d'aptamères pour la purification de substances cibles est à l'heure actuelle marginale en dépit des nombreux avantages économiques et techniques que présentent les aptamères en tant que ligands d'affinité. A la connaissance de la Demanderesse, à l'heure actuelle, aucun procédé industriel de purification d'une substance cible, y compris d'une protéine cible, ne comprend une étape basée sur l'utilisation d'un support d'affinité
d' aptamères.
Une raison qui peut être avancée pour expliquer ce défaut d'utilisation des aptamères dans les procédés de purification à l'échelle industrielle est la difficulté à
obtenir des supports d'affinité sur lesquels sont fixés de manière stable et quantitative les aptamères.
La principale technique d'immobilisation des aptamères décrite dans l'état de la technique est basée sur l'utilisation du couple biotine-streptavidine ou biotine-avidine.
Cette technique tire parti de la sélectivité et de la forte affinité de la biotine pour son ligand avidine ou streptavidine ainsi que de la stabilité du complexe non-covalent résultant de leur association. Ce type de support d'affinité présente toutefois des limitations techniques résultant du caractère protéique des agents de couplage utilisés et du caractère non-covalent de la liaison formée entre le support et les aptamères. En effet, la biotine et l'avidine ou streptavidine sont sensibles aux traitements susceptibles d'induire une dénaturation protéique Par ailleurs, Le complexe biotine/streptavidine se dissocie à faible température, notamment dans des solutions aqueuses non ioniques ou à faible concentration saline. Pour ces différentes raisons, les supports d'affinité
sur lesquels des aptamères nucléiques immobilisés en tant que ligands par l'intermédiaire du complexe biotine/streptavidine ne sont pas adaptés à une utilisation dans des procédés de purification, en particulier industriels, pour lesquels la possibilité de régénérer et de sanitiser les supports d'affinité entre chaque cycle de purification est primordiale.
11 est connu de longue date que l'affinité et la spécificité des aptamères pour leur molécule cible peuvent être aussi élevées que celles des anticorps. Par ailleurs, les aptamères pouvant être obtenus par synthèse chimique, leur coût de fabrication est beaucoup plus faible que celui des anticorps. Néanmoins, l'utilisation de supports d'affinité d'aptamères pour la purification de substances cibles est à l'heure actuelle marginale en dépit des nombreux avantages économiques et techniques que présentent les aptamères en tant que ligands d'affinité. A la connaissance de la Demanderesse, à l'heure actuelle, aucun procédé industriel de purification d'une substance cible, y compris d'une protéine cible, ne comprend une étape basée sur l'utilisation d'un support d'affinité
d' aptamères.
Une raison qui peut être avancée pour expliquer ce défaut d'utilisation des aptamères dans les procédés de purification à l'échelle industrielle est la difficulté à
obtenir des supports d'affinité sur lesquels sont fixés de manière stable et quantitative les aptamères.
La principale technique d'immobilisation des aptamères décrite dans l'état de la technique est basée sur l'utilisation du couple biotine-streptavidine ou biotine-avidine.
Cette technique tire parti de la sélectivité et de la forte affinité de la biotine pour son ligand avidine ou streptavidine ainsi que de la stabilité du complexe non-covalent résultant de leur association. Ce type de support d'affinité présente toutefois des limitations techniques résultant du caractère protéique des agents de couplage utilisés et du caractère non-covalent de la liaison formée entre le support et les aptamères. En effet, la biotine et l'avidine ou streptavidine sont sensibles aux traitements susceptibles d'induire une dénaturation protéique Par ailleurs, Le complexe biotine/streptavidine se dissocie à faible température, notamment dans des solutions aqueuses non ioniques ou à faible concentration saline. Pour ces différentes raisons, les supports d'affinité
sur lesquels des aptamères nucléiques immobilisés en tant que ligands par l'intermédiaire du complexe biotine/streptavidine ne sont pas adaptés à une utilisation dans des procédés de purification, en particulier industriels, pour lesquels la possibilité de régénérer et de sanitiser les supports d'affinité entre chaque cycle de purification est primordiale.
3 L'état de la technique décrit également plusieurs techniques permettant le greffage covalent d'acides nucléiques sur des supports solides, essentiellement dans l'objectif de disposer de nouveaux outils destinés à la mise en oeuvre de méthodes analytiques. On a ainsi décrit le greffage d'aptamères nucléiques possédant un groupe amine réactif sur un support de sépharose activé par le bromure de cyanogène (Madru et al., 2009, Anal. Chem., Vol. 81: 7081-7086). On a aussi décrit le greffage d'aptamères ARNs oxydés par du periodate sur un support d'agarose activé par des groupes dihydrazide d'acide adipique (Caputi et al., 1999, The EMBO Journal, Vol.
18(14) : 4060-4067). On connait également des techniques de greffage d'aptamères nucléiques par l'inteimédiaire d'agents de couplage bi-fonctionnels comme le SIAB (Rehder et al., Electrophoresis, Vol. 22(17) : 3759) L'état de la technique divulgue également des techniques de couplage covalent d'acides nucléiques, entre autres d'aptamères, sur des supports solides de type silice ou agarose comprenant des groupes acide carboxylique pré-activés par le N-hydroxysuccinimide (NHS) (Goss et al., 1990, J Chromatogr, Vol. 508 : 279-287 ; Larson et al.,1992, Nucleic Acids research, Vol. 20(13) : 3525, Allerson et al., 2003, RNA, Vol. 9 : 364-374). Ces techniques de couplage ont consisté en une application directe des techniques utilisées conventionnellement pour le couplage des protéines sur des supports solides.
Goss et al. (1990, J Chromatogr, Vol. 508 : 279-287) ont ainsi décrit le greffage d'un oligonucléotide 5'-aminoéthyl-poly(dT)18 sur un support macroporeux de silice pré-activé par le NHS dans un tampon de phosphate de sodium à pH=7,4.
Le support d'affinité obtenu par Goss et al. présente un taux de greffage de poly(dT)18 de 0,5 faim' par g de silice, ce qui est très faible compte tenu du nombre de groupements carboxylates par g de gel de silice (500 j_tmol par g de silice). En d'autres termes, seulement 0.1% des groupements carboxylates présents à la surface du support sont liés via une liaison amidique à un oligonucléotide poly(dT)18. Goss et al. sont parvenus à
capturer une faible quantité d'un mélange d'acides nucléiques modèles de oligo-(dA)12-18 avec le support d'affinité ainsi obtenu, puis à les éluer successivement dans un tampon d'élution à gradient de salinité.
Dans leur article publié en 2003, Allerson et al. (2003, RNA, Vol. 9 : 364-374) ont déploré que la chromatographie basée sur l'utilisation d'acides nucléiques en tant que
18(14) : 4060-4067). On connait également des techniques de greffage d'aptamères nucléiques par l'inteimédiaire d'agents de couplage bi-fonctionnels comme le SIAB (Rehder et al., Electrophoresis, Vol. 22(17) : 3759) L'état de la technique divulgue également des techniques de couplage covalent d'acides nucléiques, entre autres d'aptamères, sur des supports solides de type silice ou agarose comprenant des groupes acide carboxylique pré-activés par le N-hydroxysuccinimide (NHS) (Goss et al., 1990, J Chromatogr, Vol. 508 : 279-287 ; Larson et al.,1992, Nucleic Acids research, Vol. 20(13) : 3525, Allerson et al., 2003, RNA, Vol. 9 : 364-374). Ces techniques de couplage ont consisté en une application directe des techniques utilisées conventionnellement pour le couplage des protéines sur des supports solides.
Goss et al. (1990, J Chromatogr, Vol. 508 : 279-287) ont ainsi décrit le greffage d'un oligonucléotide 5'-aminoéthyl-poly(dT)18 sur un support macroporeux de silice pré-activé par le NHS dans un tampon de phosphate de sodium à pH=7,4.
Le support d'affinité obtenu par Goss et al. présente un taux de greffage de poly(dT)18 de 0,5 faim' par g de silice, ce qui est très faible compte tenu du nombre de groupements carboxylates par g de gel de silice (500 j_tmol par g de silice). En d'autres termes, seulement 0.1% des groupements carboxylates présents à la surface du support sont liés via une liaison amidique à un oligonucléotide poly(dT)18. Goss et al. sont parvenus à
capturer une faible quantité d'un mélange d'acides nucléiques modèles de oligo-(dA)12-18 avec le support d'affinité ainsi obtenu, puis à les éluer successivement dans un tampon d'élution à gradient de salinité.
Dans leur article publié en 2003, Allerson et al. (2003, RNA, Vol. 9 : 364-374) ont déploré que la chromatographie basée sur l'utilisation d'acides nucléiques en tant que
4 ligand d'affinité est rarement utilisée pour la purification de protéine à
l'échelle industrielle en raison de la faible capacité et/ou de la faible stabilité des supports d'affinité
obtenus jusqu'à ce jour. A la connaissance de ces auteurs, les méthodes de couplage connues permettent tout au plus de n'immobiliser que quelques nanomoles d'ARN
par millilitre de support. Selon un procédé analogue à celui de Goss et al., Allerson et al.
(2003, RNA, Vol. 9 : 364-374) ont décrit une tentative de couplage d' aptamères nucléiques, dirigés contre une protéine régulatrice 1RP1 ou IRP2, sur un support d'agarose pré-activé par le NHS. Allerson et al. se sont référés aux recommandations du fabricant du support d'agarose pour la mise en uvre de ce couplage et ont donc réalisé
la réaction de couplage à un pH basique égal à 8,3. On précise que le fabricant recommande, encore aujourd'hui, de réaliser le couplage d'un ligand sur un support pré-activé par le NHS à un pH compris entre 6 et 9 (voir par exemple le document d'instructions n 71-de GE Healthcare concernant le gel NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow)).
Allerson et al. ont eux-mêmes constaté que la réaction de couplage d' aptamères d'ARN
présentant une fonction amine primaire avec un support préactivé par le NHS fournit un rendement de couplage très faible, de l'ordre de 2%, quels que soient la durée de la réaction de couplage ou le type de solutions tampon utilisées, sans parvenir à surmonter cet inconvénient technique. Allerson et al. (2003, Supra) se sont finalement détournés de cette technique de greffage au profit d'une technique de greffage multi-étape comprenant (i) l'introduction de fonctions alkyl-thiol sur le support, (ii) l'introduction du groupe 5'-iodoacétamide en position 5' des aptamères par l'intermédiaire de l'agent bifonetionnel Sulfo-SIAB et (iii) une étape de couplage proprement dite entre les fonctions thiol du support et les groupes iodo-acétamide des aptamères de manière à créer une liaison thiol.
De la même manière, Ruta et al. (2008, Anal. Bioanal. Chem., Vol. 390: 1051-1057) ont montré que la phase stationnaire résultant du greffage d' aptamères d'ADN
dirigés contre la D-adénosine sur un support de silice activé par le NHS présentait une capacité de liaison pour la D-adénosine très faible.
11 existe donc un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux procédés de préparation de supports d'affinité, notamment de supports d'affinité
adaptés à la purification àl'échelle industrielle de substances d'intérêt médical.
RESUIVIE DE L'INVENTION
La présente invention est relative à un procédé d'immobilisation d'acides nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive, par greffage sur un support solide présentant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, ledit procédé
l'échelle industrielle en raison de la faible capacité et/ou de la faible stabilité des supports d'affinité
obtenus jusqu'à ce jour. A la connaissance de ces auteurs, les méthodes de couplage connues permettent tout au plus de n'immobiliser que quelques nanomoles d'ARN
par millilitre de support. Selon un procédé analogue à celui de Goss et al., Allerson et al.
(2003, RNA, Vol. 9 : 364-374) ont décrit une tentative de couplage d' aptamères nucléiques, dirigés contre une protéine régulatrice 1RP1 ou IRP2, sur un support d'agarose pré-activé par le NHS. Allerson et al. se sont référés aux recommandations du fabricant du support d'agarose pour la mise en uvre de ce couplage et ont donc réalisé
la réaction de couplage à un pH basique égal à 8,3. On précise que le fabricant recommande, encore aujourd'hui, de réaliser le couplage d'un ligand sur un support pré-activé par le NHS à un pH compris entre 6 et 9 (voir par exemple le document d'instructions n 71-de GE Healthcare concernant le gel NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow)).
Allerson et al. ont eux-mêmes constaté que la réaction de couplage d' aptamères d'ARN
présentant une fonction amine primaire avec un support préactivé par le NHS fournit un rendement de couplage très faible, de l'ordre de 2%, quels que soient la durée de la réaction de couplage ou le type de solutions tampon utilisées, sans parvenir à surmonter cet inconvénient technique. Allerson et al. (2003, Supra) se sont finalement détournés de cette technique de greffage au profit d'une technique de greffage multi-étape comprenant (i) l'introduction de fonctions alkyl-thiol sur le support, (ii) l'introduction du groupe 5'-iodoacétamide en position 5' des aptamères par l'intermédiaire de l'agent bifonetionnel Sulfo-SIAB et (iii) une étape de couplage proprement dite entre les fonctions thiol du support et les groupes iodo-acétamide des aptamères de manière à créer une liaison thiol.
De la même manière, Ruta et al. (2008, Anal. Bioanal. Chem., Vol. 390: 1051-1057) ont montré que la phase stationnaire résultant du greffage d' aptamères d'ADN
dirigés contre la D-adénosine sur un support de silice activé par le NHS présentait une capacité de liaison pour la D-adénosine très faible.
11 existe donc un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux procédés de préparation de supports d'affinité, notamment de supports d'affinité
adaptés à la purification àl'échelle industrielle de substances d'intérêt médical.
RESUIVIE DE L'INVENTION
La présente invention est relative à un procédé d'immobilisation d'acides nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive, par greffage sur un support solide présentant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, ledit procédé
5 comprenant une étape de couplage desdits acides nucléiques sur ledit support solide activé
à un pH inférieur à 6.
Selon une définition alternative, la présente invention concerne un procédé
d'immobilisation des ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine primaire sur un support solide comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine primaire, et c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à 6 étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
Dans un mode de réalisation préféré, les groupes acides carboxyliques activés sont obtenus par réaction avec le N-hydroxysuecinirnide ou l'un de ses dérivés.
L'invention concerne également une méthode de préparation d'un support d'affinité comprenant la mise en oeuvre du procédé d'immobilisation telle que défini ci-dessus.
Un autre objet de l'invention est un support solide d'affinité pouvant être obtenu par la méthode de préparation telle que définie précédemment ainsi que son utilisation dans des procédés de purification ou de détection d'une protéine cible.
Un objet supplémentaire est un complexe résultant de l'interaction d'un ligand nucléique et d'une molécule cible, ledit complexe étant formé à la surface d'un support solide tel que défini précédemment.
Enfin, la présente invention a également trait à un procédé de purification d'un ligand cible avec un support d'affinité, comprenant les étapes suivantes :
à un pH inférieur à 6.
Selon une définition alternative, la présente invention concerne un procédé
d'immobilisation des ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine primaire sur un support solide comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine primaire, et c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à 6 étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
Dans un mode de réalisation préféré, les groupes acides carboxyliques activés sont obtenus par réaction avec le N-hydroxysuecinirnide ou l'un de ses dérivés.
L'invention concerne également une méthode de préparation d'un support d'affinité comprenant la mise en oeuvre du procédé d'immobilisation telle que défini ci-dessus.
Un autre objet de l'invention est un support solide d'affinité pouvant être obtenu par la méthode de préparation telle que définie précédemment ainsi que son utilisation dans des procédés de purification ou de détection d'une protéine cible.
Un objet supplémentaire est un complexe résultant de l'interaction d'un ligand nucléique et d'une molécule cible, ledit complexe étant formé à la surface d'un support solide tel que défini précédemment.
Enfin, la présente invention a également trait à un procédé de purification d'un ligand cible avec un support d'affinité, comprenant les étapes suivantes :
6 a) mettre en contact une composition à purifier comprenant un ligand cible d'intérêt avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus, afin de former un complexe entre (i) les acides nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ledit ligand cible et b) libérer ledit ligand cible à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer ledit ligand cible purifié.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 100 tag de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain.
Le pic n 1 correspond à une fraction de FVII humain non retenu sur le support d'affinité.
Le pic n 2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n 3 correspond au FVII humain contenu dans l'éluant de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées: l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à
la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 2 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 200 g de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain.
Le pie n 2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à
la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 3 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 1000 tag de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII
humain. Le pic n 2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité
Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 4 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 200 !_ig de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain, ledit
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 100 tag de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain.
Le pic n 1 correspond à une fraction de FVII humain non retenu sur le support d'affinité.
Le pic n 2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n 3 correspond au FVII humain contenu dans l'éluant de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées: l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à
la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 2 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 200 g de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain.
Le pie n 2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à
la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 3 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 1000 tag de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII
humain. Le pic n 2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité
Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 4 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 200 !_ig de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain, ledit
7 support ayant été préalablement soumis à un traitement par une solution de sanitisation comprenant 0,5 M de NaOH. Le pic n 2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées :
l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 5 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 1000 j.ig de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII
humain, ledit support ayant été préalablement soumis à un traitement par une solution de sanitisation comprenant 0,5 M de NaOH. Le pic n 2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées :
l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 6 illustre un profil ehrornatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur Vil humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les conditions de couplage suivantes : 48h, 5 C, pH 4,2. Le point n 1 (à environ 45 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n 2 (à environ 70 min) correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité
Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 7 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les conditions de couplage suivantes : 48h, 5 C, pH 3,8. Le point n 1 (à environ 35 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n 2 (à environ 70 min) correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité
Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 8 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les
l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 5 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 1000 j.ig de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII
humain, ledit support ayant été préalablement soumis à un traitement par une solution de sanitisation comprenant 0,5 M de NaOH. Le pic n 2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées :
l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 6 illustre un profil ehrornatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur Vil humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les conditions de couplage suivantes : 48h, 5 C, pH 4,2. Le point n 1 (à environ 45 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n 2 (à environ 70 min) correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité
Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 7 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les conditions de couplage suivantes : 48h, 5 C, pH 3,8. Le point n 1 (à environ 35 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n 2 (à environ 70 min) correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité
Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 8 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les
8 conditions de couplage suivantes : 2h, 5 C, pH 4,2. Le point n 1 (à environ 35 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n 2 (à environ 70 min) correspond au EVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité
Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 9 illustre un profil chromatop-aphique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les conditions de couplage suivantes : lh, TA (température ambiante), pH 4,2. Le point n 1 (à environ 40 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n 2 (à
environ 75 min) correspond au EVII humain contenu dans la fraction d'élution.
En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention fournit de nouveaux supports d'affinité comprenant des acides nucléiques immobilisés, ainsi que des procédés pour les préparer.
Un premier objet de l'invention est un procédé d'immobilisation d'acides nucléiques présentant au moins une fonction amine réactive sur un support solide présentant des fonctions acides carboxyliques activées.
Par acide nucléique ou ligand nucléique , on entend selon l'invention un composé comprenant un polymère de nucléotides ou polynucléotide, c'est-à-dire de ribonucléotides et/ou de désoxyribonucléotides éventuellement modifiés chimiquement, ayant une longueur allant de 5 à 10 000 nucléotides de longueur, de préférence une longueur allant de 5 à 1000 nucléotides de longueur, et encore mieux de 5 à
nucléotides de longueur. Un acide nucléique englobe classiquement les polpibonucléotides (ARN) et les polydésoxyribonucléotides (ADN), le cas échéant chimiquement modifiés.
Un nucléotide est composé (i) d'un groupement phosphate (mono-, di- ou tri-) ou un analogue, (ii) d'un sucre choisi parmi le ribose, le désoxyribose et leurs analogues chimiques et (iii) une base azotée choisie parmi l'adénine, la guanine, la thymine, la cytosine, l'uracile et leurs analogues chimiques. Au sens de l'invention, un nucléotide peut
Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 9 illustre un profil chromatop-aphique obtenu par passage d'une composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain dans les conditions de couplage suivantes : lh, TA (température ambiante), pH 4,2. Le point n 1 (à environ 40 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n 2 (à
environ 75 min) correspond au EVII humain contenu dans la fraction d'élution.
En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention fournit de nouveaux supports d'affinité comprenant des acides nucléiques immobilisés, ainsi que des procédés pour les préparer.
Un premier objet de l'invention est un procédé d'immobilisation d'acides nucléiques présentant au moins une fonction amine réactive sur un support solide présentant des fonctions acides carboxyliques activées.
Par acide nucléique ou ligand nucléique , on entend selon l'invention un composé comprenant un polymère de nucléotides ou polynucléotide, c'est-à-dire de ribonucléotides et/ou de désoxyribonucléotides éventuellement modifiés chimiquement, ayant une longueur allant de 5 à 10 000 nucléotides de longueur, de préférence une longueur allant de 5 à 1000 nucléotides de longueur, et encore mieux de 5 à
nucléotides de longueur. Un acide nucléique englobe classiquement les polpibonucléotides (ARN) et les polydésoxyribonucléotides (ADN), le cas échéant chimiquement modifiés.
Un nucléotide est composé (i) d'un groupement phosphate (mono-, di- ou tri-) ou un analogue, (ii) d'un sucre choisi parmi le ribose, le désoxyribose et leurs analogues chimiques et (iii) une base azotée choisie parmi l'adénine, la guanine, la thymine, la cytosine, l'uracile et leurs analogues chimiques. Au sens de l'invention, un nucléotide peut
9 être modifié aussi bien sur sa partie osidique que sur sa base azotée par des méthodes bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on pourra se référer au brevet US5958691 qui décrit des aptamères présentant une modification chimique au niveau d'un ou plusieurs nucléotides. Dans certains modes de réalisation, un acide nucléique consiste en un polymère de nucléotides, ribonucléotides ou désoxyribonucléotides.
Dans d'autres modes de réalisation, un acide nucléique consiste essentiellement en un polymère de nucléotides et comprend une partie non-nucléotidique, ladite partie non-nucléotidique étant préférentiellement de longueur réduite, comparée à la longueur de la partie nucléotidique, par exemple une longueur linéaire inférieure à la longueur occupée par une chaîne de cinq nucléotides, ribonucléotides ou désoxyribonueléotides.
Selon l'invention, un acide nucléique comprend une fonction amine réactive lorsque ledit acide nucléique possède une fonction amine accessible au solvant et apte à
réagir avec un groupe réactif approprié porté par une autre entité
moléculaire. Les fonctions amines réactives englobent en particulier les amines primaires.
Cette amine primaire est distincte des amines aromatiques portées par les noyaux puriques ou pyrimidiques des nuel éofi des.
De tels acides nucléiques sont bien connus dans l'état de la technique et sont classiquement utilisés pour leur couplage chimique à des supports ou à des substances marqueurs. Classiquement, il s'agit d'acides nucléiques qui ont été modifiés par l'ajout d'une fonction amine à leur extrémité 3' ou à leur extrémité 5'. Le plus fréquemment, la fonction amine est ajoutée à l'extrémité 5' de l'acide nucléique où son incorporation est plus aisée comme étape finale d'un procédé de synthèse d'un polynucléotide.
Dans certains modes de réalisation, la fonction amine réactive et l'extrémité 5' ou 3' de l'acide nucléique sont séparées par une chaîne espaceur.
Selon l'invention, un acide nucléique peut comprendre une fonction amine réactive à son extrémité 3' ou 5', ce qui signifie que la fonction amine réactive est couplée sur la partie nucléotidique dudit acide nucléique.
Selon d'autres modes de réalisation, un acide nucléique peut comprendre une fonction amine réactive du côté de son extrémité 3' ou 5', ce qui signifie que ladite fonction amine n'est pas couplée directement sur la partie nucléotidique dudit acide nucléique, mais est liée de manière covalente à une partie non-nucléotidique dudit acide nucléotidique, par exemple une chaîne espaceur non-nucléotidique qui est interposée entre ladite fonction amine réactive et ladite extrémité de la partie nucléotidique dudit acide nucléique.
Pour résumer, au sens de l'invention, un acide nucléique , également 5 désigné dans ce qui suit par ligand nucléique comprend :
^ un polynucléotide, ledit polynucléotide consistant en un enchaînement de ribonueléotides et/ou de désoxyribonucléotides éventuellement chimiquement modifiés, et ^ en option, une partie non-nucléotidique de préférence une chaîne
Dans d'autres modes de réalisation, un acide nucléique consiste essentiellement en un polymère de nucléotides et comprend une partie non-nucléotidique, ladite partie non-nucléotidique étant préférentiellement de longueur réduite, comparée à la longueur de la partie nucléotidique, par exemple une longueur linéaire inférieure à la longueur occupée par une chaîne de cinq nucléotides, ribonucléotides ou désoxyribonueléotides.
Selon l'invention, un acide nucléique comprend une fonction amine réactive lorsque ledit acide nucléique possède une fonction amine accessible au solvant et apte à
réagir avec un groupe réactif approprié porté par une autre entité
moléculaire. Les fonctions amines réactives englobent en particulier les amines primaires.
Cette amine primaire est distincte des amines aromatiques portées par les noyaux puriques ou pyrimidiques des nuel éofi des.
De tels acides nucléiques sont bien connus dans l'état de la technique et sont classiquement utilisés pour leur couplage chimique à des supports ou à des substances marqueurs. Classiquement, il s'agit d'acides nucléiques qui ont été modifiés par l'ajout d'une fonction amine à leur extrémité 3' ou à leur extrémité 5'. Le plus fréquemment, la fonction amine est ajoutée à l'extrémité 5' de l'acide nucléique où son incorporation est plus aisée comme étape finale d'un procédé de synthèse d'un polynucléotide.
Dans certains modes de réalisation, la fonction amine réactive et l'extrémité 5' ou 3' de l'acide nucléique sont séparées par une chaîne espaceur.
Selon l'invention, un acide nucléique peut comprendre une fonction amine réactive à son extrémité 3' ou 5', ce qui signifie que la fonction amine réactive est couplée sur la partie nucléotidique dudit acide nucléique.
Selon d'autres modes de réalisation, un acide nucléique peut comprendre une fonction amine réactive du côté de son extrémité 3' ou 5', ce qui signifie que ladite fonction amine n'est pas couplée directement sur la partie nucléotidique dudit acide nucléique, mais est liée de manière covalente à une partie non-nucléotidique dudit acide nucléotidique, par exemple une chaîne espaceur non-nucléotidique qui est interposée entre ladite fonction amine réactive et ladite extrémité de la partie nucléotidique dudit acide nucléique.
Pour résumer, au sens de l'invention, un acide nucléique , également 5 désigné dans ce qui suit par ligand nucléique comprend :
^ un polynucléotide, ledit polynucléotide consistant en un enchaînement de ribonueléotides et/ou de désoxyribonucléotides éventuellement chimiquement modifiés, et ^ en option, une partie non-nucléotidique de préférence une chaîne
10 espaceur, Ledit ligand ou acide nucléique comprend, en outre, une fonction amine réactive, ladite fonction amine réactive pouvant être fixée soit à une extrémité 3' ou 5' du polynucléotide ou le cas échéant sur la chaîne espaceur.
De manière générale, le polynucléotide est au moins modifié au niveau du nucléotide en 3' ou 5' pour introduire la fonction amine réactive directement ou par l'intermédiaire d'une partie non-nucléotide, en particulier, une chaîne espaceur.
L'acide nucléique peut comprendre une entité chimique supplémentaire à
celles précédemment citées par exemple un fluorophore ou un chromophore.
De manière générale, l'acide nucléique selon l'invention est un ligand c'est-à-dire qu'il est capable de se lier spécifiquement à une ou plusieurs molécules cibles. On parlera donc indifféremment dans ce qui suit de ligand nucléique ou d' acide nucléique . Les molécules cibles englobent des molécules d'ARN, d'ADN, des molécules chimiques de nature organique ou minérale, des peptides et des protéines qu'elles soient humaines, animales, végétales, virales ou bactériennes.
La demanderesse a montré qu'il était possible de préparer des supports d'affinité sur lesquels sont immobilisés des acides nucléiques (ou ligands nucléiques), lesdits supports d'affinité étant utilisables dans des techniques préparatives de purification de substances d'intérêt thérapeutique, car ils possèdent à la fois une bonne capacité de rétention sélective des substances cibles, une excellente résistance aux traitements de régénération et leur utilisation n'entraîne pas de risque d'introduction de substances potentiellement toxiques ou immunogènes dans la préparation purifiée résultante.
De manière générale, le polynucléotide est au moins modifié au niveau du nucléotide en 3' ou 5' pour introduire la fonction amine réactive directement ou par l'intermédiaire d'une partie non-nucléotide, en particulier, une chaîne espaceur.
L'acide nucléique peut comprendre une entité chimique supplémentaire à
celles précédemment citées par exemple un fluorophore ou un chromophore.
De manière générale, l'acide nucléique selon l'invention est un ligand c'est-à-dire qu'il est capable de se lier spécifiquement à une ou plusieurs molécules cibles. On parlera donc indifféremment dans ce qui suit de ligand nucléique ou d' acide nucléique . Les molécules cibles englobent des molécules d'ARN, d'ADN, des molécules chimiques de nature organique ou minérale, des peptides et des protéines qu'elles soient humaines, animales, végétales, virales ou bactériennes.
La demanderesse a montré qu'il était possible de préparer des supports d'affinité sur lesquels sont immobilisés des acides nucléiques (ou ligands nucléiques), lesdits supports d'affinité étant utilisables dans des techniques préparatives de purification de substances d'intérêt thérapeutique, car ils possèdent à la fois une bonne capacité de rétention sélective des substances cibles, une excellente résistance aux traitements de régénération et leur utilisation n'entraîne pas de risque d'introduction de substances potentiellement toxiques ou immunogènes dans la préparation purifiée résultante.
11 Plus précisément, il a été montré selon l'invention que des supports d'affinité à
base d'acides nucléiques peuvent être préparés par greffage chimique desdits acides nucléiques sur un support solide comprenant des fonctions acides carboxyliques activées, dans des conditions spécifiques de greffage permettant à la fois un haut rendement de La demanderesse a montré que, contrairement à ce qu'indiquait l'article de Goss et al. (1990, Supra) la technique de couplage d'un ligand comprenant une fonction amine réactive sur un support pré-activé par NHS, qui est couramment utilisée pour le Les résultats des exemples montrent notamment qu'en utilisant la méthode classique de couplage réalisée à un pH compris entre 6 et 9 avec une variété
d'acides nucléiques distincts, on obtient un rendement de greffage variant de 0% à 10%
au Dans l'objectif de rechercher des méthodes de couplage alternatives aux méthodes connues, la demanderesse a testé des conditions de couplage sur support activé
par NUS dans lesquelles les charges anioniques portées par les acides nucléiques sont Egalement, la demanderesse a testé l'efficacité d'un couplage mettant en oeuvre des acides nucléiques dans lesquels la fonction amine réactive et l'extrémité 5' du 30 polynucléotide sont séparées l'une de l'autre par une chaîne espaceur chargée positivement. La chaîne espaceur consistait en un polyamide comprenant au moins une fonction amine tertiaire. Les résultats, non présentés dans les exemples, ont montré
base d'acides nucléiques peuvent être préparés par greffage chimique desdits acides nucléiques sur un support solide comprenant des fonctions acides carboxyliques activées, dans des conditions spécifiques de greffage permettant à la fois un haut rendement de La demanderesse a montré que, contrairement à ce qu'indiquait l'article de Goss et al. (1990, Supra) la technique de couplage d'un ligand comprenant une fonction amine réactive sur un support pré-activé par NHS, qui est couramment utilisée pour le Les résultats des exemples montrent notamment qu'en utilisant la méthode classique de couplage réalisée à un pH compris entre 6 et 9 avec une variété
d'acides nucléiques distincts, on obtient un rendement de greffage variant de 0% à 10%
au Dans l'objectif de rechercher des méthodes de couplage alternatives aux méthodes connues, la demanderesse a testé des conditions de couplage sur support activé
par NUS dans lesquelles les charges anioniques portées par les acides nucléiques sont Egalement, la demanderesse a testé l'efficacité d'un couplage mettant en oeuvre des acides nucléiques dans lesquels la fonction amine réactive et l'extrémité 5' du 30 polynucléotide sont séparées l'une de l'autre par une chaîne espaceur chargée positivement. La chaîne espaceur consistait en un polyamide comprenant au moins une fonction amine tertiaire. Les résultats, non présentés dans les exemples, ont montré
12 l'obtention d'un excellent rendement de greffage, proche de 100%, sur le support pré-activé avec NHS. En revanche, la demanderesse a montré que la mise en contact du support ainsi greffé avec une solution à un pH alcalin d'environ 9-10 altérait la structure de la chaîne espaceur et entraînait le décrochement des acides nucléiques du support. Une telle technique de couplage, qui permet un excellent rendement de couplage, fournit donc un support (l'affinité qui s'est révélé inadapté à une mise en uvre dans des procédés industriels de purification, lesdits procédés comprenant généralement des étapes drastiques de lavage et/ou d'inactivation microbienne.
La solution technique qui a été finalement mise au point selon l'invention a consisté à réaliser la réaction de couplage des acides nucléiques sur le support pré-activé
par le N-hydroxysuccinimide, dans des conditions de pH inférieur à 6.
La solution technique de l'invention est tout à fait surprenante car à un pH
acide, l'homme du métier se serait nomialement attendu à ce que la réaction de couplage n'ait pas lieu du tout, ou à tout le moins ait lieu dans une si faible proportion qu'un très faible rendement de greffage soit obtenu en raison de la faible réactivité des amines primaires et à la dégradation par hydrolyse des acides nucléiques généralement observées aux pH acides Or, on a montré dans les exemples que la réalisation de l'étape de couplage d'un acide nucléique sur un support pré-activé par le NHS, dans des conditions de pH
inférieur à 5, permet l'obtention d'un support greffé avec un rendement de greffage d'au moins 70%. Le rendement de greffage est même d'environ 100% lorsque la réaction de couplage est conduite à pH inférieur à 4,5.
C'est de manière tout aussi surprenante qu'il est montré que la réalisation de l'étape de couplage à un pH acide n'affecte pas l'intégrité fonctionnelle des acides nucléiques, alors que la grande sensibilité des acides nucléiques aux conditions de pH
acide est bien connue par l'homme du métier.
De manière encore plus surprenante, la Demanderesse a montré que cette réaction de couplage ¨ qui conduit à la formation d'une liaison amidique entre le support solide et l'acide nucléique ¨ est très rapide, cette réaction étant généralement achevée en moins d'une heure, indépendamment de la température de réaction. Par ailleurs, la Demanderesse a montré que la mise en oeuvre de la réaction à basse température n'est pas une condition requise pour préserver l'intégrité fonctionnelle des ligands greffés. En
La solution technique qui a été finalement mise au point selon l'invention a consisté à réaliser la réaction de couplage des acides nucléiques sur le support pré-activé
par le N-hydroxysuccinimide, dans des conditions de pH inférieur à 6.
La solution technique de l'invention est tout à fait surprenante car à un pH
acide, l'homme du métier se serait nomialement attendu à ce que la réaction de couplage n'ait pas lieu du tout, ou à tout le moins ait lieu dans une si faible proportion qu'un très faible rendement de greffage soit obtenu en raison de la faible réactivité des amines primaires et à la dégradation par hydrolyse des acides nucléiques généralement observées aux pH acides Or, on a montré dans les exemples que la réalisation de l'étape de couplage d'un acide nucléique sur un support pré-activé par le NHS, dans des conditions de pH
inférieur à 5, permet l'obtention d'un support greffé avec un rendement de greffage d'au moins 70%. Le rendement de greffage est même d'environ 100% lorsque la réaction de couplage est conduite à pH inférieur à 4,5.
C'est de manière tout aussi surprenante qu'il est montré que la réalisation de l'étape de couplage à un pH acide n'affecte pas l'intégrité fonctionnelle des acides nucléiques, alors que la grande sensibilité des acides nucléiques aux conditions de pH
acide est bien connue par l'homme du métier.
De manière encore plus surprenante, la Demanderesse a montré que cette réaction de couplage ¨ qui conduit à la formation d'une liaison amidique entre le support solide et l'acide nucléique ¨ est très rapide, cette réaction étant généralement achevée en moins d'une heure, indépendamment de la température de réaction. Par ailleurs, la Demanderesse a montré que la mise en oeuvre de la réaction à basse température n'est pas une condition requise pour préserver l'intégrité fonctionnelle des ligands greffés. En
13 d'autres termes, le procédé d'immobilisation des ligands nucléiques selon l'invention peut être effectué indépendamment à basse température ou à température ambiante.
On a aussi montré dans les exemples que les acides nucléiques greffés sur le support conservent leur intégrité chimique et physique, du fait que leur fonctionnalité est intacte. Cet aspect est illustré dans les exemples par un support greffé avec des aptamères nucléiques aptes à se lier au Facteur VII humain (FVIIh). On montre que l'aptitude desdits aptamères nucléiques anti-FVIlh est intacte après leur greffage dans des conditions de pH
acide, à basse température ou à température ambiante, sur le support pré-activé par le NHS. La demanderesse a aussi montré que lorsqu'on utilise pour le greffage un aptamère nucléique apte à se lier sélectivement à des formes de Facteur VII humain actif comprenant un domaine Gla correctement gamma-carboxylé, l'aptarnère greffé
conserve l'aptitude de Paptamère non-greffé à discriminer (0 les formes actives du Facteur VII
humain à domaine Gia correctement gamma-carboxylé des (ii) formes non actives du Facteur VII humain.
On a aussi montré que les conditions de couplage spécifiques divulguées dans la présente description étaient adaptées au greffage de tout type d'acide nucléique, c'est-à-dire à la fois d'acides nucléiques ADN et d'acides nucléiques ARN.
De plus, les exemples montrent que le procédé de l'invention aboutit à
l'obtention de supports d'affinité possédant une forte densité d'acides nucléiques greffés et peiniet en conséquence la préparation de supports d'affinité possédant une grande capacité de capture de ligands cibles, utilisables à l'échelle industrielle. A
la connaissance de la Demanderesse, de tels supports n'ont jamais été décrits dans l'état de la technique.
Les caractéristiques combinées de haute sélectivité vis-à-vis d'un ligand cible et de grande capacité de capture dudit ligand cible illustrent la compatibilité d'un support d'affinité obtenu selon le procédé de l'invention avec une utilisation dans une étape de purification de ligands cibles à l'échelle industrielle. Il va de soi que le procédé selon la présente invention permet également la préparation de supports d'affinité
destinés à la détection d'une molécule cible.
La présente invention a plus précisément pour objet un procédé
d'immobilisation de ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive, par greffage sur un support solide présentant des groupes acides carboxyliques activés,
On a aussi montré dans les exemples que les acides nucléiques greffés sur le support conservent leur intégrité chimique et physique, du fait que leur fonctionnalité est intacte. Cet aspect est illustré dans les exemples par un support greffé avec des aptamères nucléiques aptes à se lier au Facteur VII humain (FVIIh). On montre que l'aptitude desdits aptamères nucléiques anti-FVIlh est intacte après leur greffage dans des conditions de pH
acide, à basse température ou à température ambiante, sur le support pré-activé par le NHS. La demanderesse a aussi montré que lorsqu'on utilise pour le greffage un aptamère nucléique apte à se lier sélectivement à des formes de Facteur VII humain actif comprenant un domaine Gla correctement gamma-carboxylé, l'aptarnère greffé
conserve l'aptitude de Paptamère non-greffé à discriminer (0 les formes actives du Facteur VII
humain à domaine Gia correctement gamma-carboxylé des (ii) formes non actives du Facteur VII humain.
On a aussi montré que les conditions de couplage spécifiques divulguées dans la présente description étaient adaptées au greffage de tout type d'acide nucléique, c'est-à-dire à la fois d'acides nucléiques ADN et d'acides nucléiques ARN.
De plus, les exemples montrent que le procédé de l'invention aboutit à
l'obtention de supports d'affinité possédant une forte densité d'acides nucléiques greffés et peiniet en conséquence la préparation de supports d'affinité possédant une grande capacité de capture de ligands cibles, utilisables à l'échelle industrielle. A
la connaissance de la Demanderesse, de tels supports n'ont jamais été décrits dans l'état de la technique.
Les caractéristiques combinées de haute sélectivité vis-à-vis d'un ligand cible et de grande capacité de capture dudit ligand cible illustrent la compatibilité d'un support d'affinité obtenu selon le procédé de l'invention avec une utilisation dans une étape de purification de ligands cibles à l'échelle industrielle. Il va de soi que le procédé selon la présente invention permet également la préparation de supports d'affinité
destinés à la détection d'une molécule cible.
La présente invention a plus précisément pour objet un procédé
d'immobilisation de ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive, par greffage sur un support solide présentant des groupes acides carboxyliques activés,
14 ledit procédé comprenant une étape de couplage covalent desdits acides nucléiques sur ledit support solide à un pH inférieur à 6.
Selon une autre définition, le procédé d'immobilisation des ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive sur un support solide selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides CarbOXY1,44CS 0.411VéS, . _ .
uri ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine réactive, et c) réaliser le couplage dudit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à 6.
étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
Il va de soi que l'étape de couplage c) permet la création de liaisons amidiques entre le support solide et les ligands nucléiques, chaque liaison amidique résultant de la réaction entre une fonction acide carboxylique activée du support et une fonction amine primaire présente au niveau du ligand nucléique.
Selon l'invention, les conditions de couplage à un pH inférieur à 6 englobent des conditions de couplage à un pH inférieur à 5,5, inférieur à 5, inférieur à
4,9, inférieur à
4,8, inférieur à 4,7, inférieur à 4,6, inférieur à 4,5, inférieur à 4,3.
Dans certains modes de réalisation, le pH de l'étape de couplage est compris dans une gamme allant de 3 à 6, ce qui englobe un pH de 3,0, un pH de 3,1, un pH de 3,2, un pH de 3,3, un pH de 3,4, un pH de 3,5, un pH de 3,6, un pH de 3,7, un pH de 3,8, un pH de 3,9, un pH de 4,0, un pH de 4,1, un pH de 4,2, un pH de 4,3, un pH de 4,4, un pH
de 4,5, un pH de 4,6 un pH de 4,7, un pH de 4,8, un pH de 4,9, un pH de 5,0, un pH de 5,1, un pH de 5,2, un pH de 5,3, un pH de 5,4, un pH de 5,5, un pH de 5,6, un pH de 5,7, un pH de 5,8 et un pH de 5,9.
De préférence, le pH de l'étape de couplage est inférieur à 4,5. Dans certains modes de réalisation, le pH de la réaction de couplage est compris dans une gamme allant 3,5 à 4,5.
Comme cela est illustré dans les exemples, l'étape de couplage peut être réalisée à un pH d'environ 4,2.
De préférence, le couplage est réalisé en présence d'un milieu tamponné
aqueux présentant un pH inférieur à 6. Le milieu tamponné peut être préparé à
partir de tout type d'acides et/ou de bases faibles, dans la mesure ou le ou les acides et bases faibles utilisées ne sont pas susceptibles de réagir au cours de la réaction de couplage. Comme 5 cela est illustré dans les exemples, il peut s'agir d'une solution aqueuse d'acétate de sodium.
Sans vouloir être liée par une quelconque théorie, la demanderesse pense qu'aux conditions de pH acide utilisées pour la réaction de couplage, les acides nucléiques à greffer sont sous forme linéaire, ce qui favorise l'accessibilité de leur groupe amine 10 réactif au solvant, et en particulier favorise la réaction dudit groupe amine réactif avec un groupe acide carboxylique activé accessible à la surface du support solide.
Par fonction acide carboxylique activée ou groupe acide carboxylique activé , on entend une fonction chimique dérivée de la fonction acide carboxylique apte à réagir avec un nucléophile. De manière plus spécifique, on entend par fonction
Selon une autre définition, le procédé d'immobilisation des ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive sur un support solide selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides CarbOXY1,44CS 0.411VéS, . _ .
uri ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine réactive, et c) réaliser le couplage dudit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à 6.
étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
Il va de soi que l'étape de couplage c) permet la création de liaisons amidiques entre le support solide et les ligands nucléiques, chaque liaison amidique résultant de la réaction entre une fonction acide carboxylique activée du support et une fonction amine primaire présente au niveau du ligand nucléique.
Selon l'invention, les conditions de couplage à un pH inférieur à 6 englobent des conditions de couplage à un pH inférieur à 5,5, inférieur à 5, inférieur à
4,9, inférieur à
4,8, inférieur à 4,7, inférieur à 4,6, inférieur à 4,5, inférieur à 4,3.
Dans certains modes de réalisation, le pH de l'étape de couplage est compris dans une gamme allant de 3 à 6, ce qui englobe un pH de 3,0, un pH de 3,1, un pH de 3,2, un pH de 3,3, un pH de 3,4, un pH de 3,5, un pH de 3,6, un pH de 3,7, un pH de 3,8, un pH de 3,9, un pH de 4,0, un pH de 4,1, un pH de 4,2, un pH de 4,3, un pH de 4,4, un pH
de 4,5, un pH de 4,6 un pH de 4,7, un pH de 4,8, un pH de 4,9, un pH de 5,0, un pH de 5,1, un pH de 5,2, un pH de 5,3, un pH de 5,4, un pH de 5,5, un pH de 5,6, un pH de 5,7, un pH de 5,8 et un pH de 5,9.
De préférence, le pH de l'étape de couplage est inférieur à 4,5. Dans certains modes de réalisation, le pH de la réaction de couplage est compris dans une gamme allant 3,5 à 4,5.
Comme cela est illustré dans les exemples, l'étape de couplage peut être réalisée à un pH d'environ 4,2.
De préférence, le couplage est réalisé en présence d'un milieu tamponné
aqueux présentant un pH inférieur à 6. Le milieu tamponné peut être préparé à
partir de tout type d'acides et/ou de bases faibles, dans la mesure ou le ou les acides et bases faibles utilisées ne sont pas susceptibles de réagir au cours de la réaction de couplage. Comme 5 cela est illustré dans les exemples, il peut s'agir d'une solution aqueuse d'acétate de sodium.
Sans vouloir être liée par une quelconque théorie, la demanderesse pense qu'aux conditions de pH acide utilisées pour la réaction de couplage, les acides nucléiques à greffer sont sous forme linéaire, ce qui favorise l'accessibilité de leur groupe amine 10 réactif au solvant, et en particulier favorise la réaction dudit groupe amine réactif avec un groupe acide carboxylique activé accessible à la surface du support solide.
Par fonction acide carboxylique activée ou groupe acide carboxylique activé , on entend une fonction chimique dérivée de la fonction acide carboxylique apte à réagir avec un nucléophile. De manière plus spécifique, on entend par fonction
15 acide carboxylique activée une fonction chimique dérivée de la fonction acide carboxylique apte à réagir avec une amine primaire de manière à foiiiier une liaison amidique. Les fonctions acides carboxyliques activées sont bien connues de l'homme du métier et englobent les fonctions chlorures d'acide, anhydrides mixtes et esters.
Dans certains modes de réalisation, les fonctions acides carboxyliques activées sont sous foinie d'esters résultant de la réaction desdites fonctions acides carboxyliques avec un composé choisi parmi le groupe constitué par le l-hydroxybenzotriazole (HOBt), le HOAt, le N-hydroxysuccinimide ou l'un de leurs dérivés.
Dans un mode de réalisation préféré, les groupes acides carboxyliques du support ont été activés par réaction avec le N-hydroxysuccinimide ou l'un de ses dérivés tels que le N-hydroxysulfosuccinimide.
Ceci signifie que les groupes acides carboxyliques activés du support solide correspondent à des groupes esters de N-succinimidyle , ou encore appelés esters de succinimidyle ou esters de N-hydroxysuccinimide , de formule suivante (I) où R représente la ramification du support solide à laquelle la fonction ester est fixée:
Dans certains modes de réalisation, les fonctions acides carboxyliques activées sont sous foinie d'esters résultant de la réaction desdites fonctions acides carboxyliques avec un composé choisi parmi le groupe constitué par le l-hydroxybenzotriazole (HOBt), le HOAt, le N-hydroxysuccinimide ou l'un de leurs dérivés.
Dans un mode de réalisation préféré, les groupes acides carboxyliques du support ont été activés par réaction avec le N-hydroxysuccinimide ou l'un de ses dérivés tels que le N-hydroxysulfosuccinimide.
Ceci signifie que les groupes acides carboxyliques activés du support solide correspondent à des groupes esters de N-succinimidyle , ou encore appelés esters de succinimidyle ou esters de N-hydroxysuccinimide , de formule suivante (I) où R représente la ramification du support solide à laquelle la fonction ester est fixée:
16 o o Ro/N
o L'activation par le NHS ou le sulfo-NFIS présente l'avantage de générer des esters activés réactifs vis-à-vis des amines primaires mais également suffisamment stables pour permettre le conditionnement et le stockage du support pré-activé obtenu.
Les supports solides présentant des fonctions acides carboxyliques activées sont bien connus dans l'état de la technique et nombre d'entre eux sont commercialisés.
Les supports solides peuvent être également préparés selon des méthodologies bien connues de l'homme du métier, par exemple en faisant réagir un support présentant initialement des fonctions acides carboxyliques à sa surface avec un agent chimique adapté permettant l'activation des fonctions acides carboxyliques en vue de la formation subséquente d'une liaison amidique. On pourra, en particulier, se référer aux méthodes classiques d'activation des fonctions acides carboxyliques utilisées en synthèse peptidique, en particulier par voie solide. A titre illustratif, on peut aussi utiliser, dans les conditions spécifiques de couplage prescrites par l'invention, la méthodologie d'activation par une combinaison de EDC (chlorhydrate de 1-Ethy1-343-dimethylaminopropyl]carbodiimide) et de NHS, bien connue de l'homme du métier.
Les supports solides présentant des fonctions acides carboxyliques activées peuvent être de tout type. Ces supports englobent les supports classiquement utilisés pour la chromatographie, y compris les supports de silice etd'agarose, et qui ont été traités afin de présenter à leur surface des groupes acides carboxyliquesactivés. Les supports solides pré-activés englobent des gels de dextrane, d'agarose, d'amidon, des dérivés cellulosiques, ou encore des polymères synthétiques tels que des polyamides, du trisacryle, du sephaeryle des dérivés de méthacrylate, des dérivés du polystyrène et des polyacrylamides, ou encore des supports minéraux tels que des supports de silice (notamment des supports de verre poreux) ou d'alumine, sur la surface desquels sont présents des groupes acides carboxyliques activés. De manière générale, les supports solides sur lesquels peuvent être immobilisés les ligands nucléiques selon l'invention englobent tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée communément pour les supports de filtre, des membranes, etc. Les supports solides
o L'activation par le NHS ou le sulfo-NFIS présente l'avantage de générer des esters activés réactifs vis-à-vis des amines primaires mais également suffisamment stables pour permettre le conditionnement et le stockage du support pré-activé obtenu.
Les supports solides présentant des fonctions acides carboxyliques activées sont bien connus dans l'état de la technique et nombre d'entre eux sont commercialisés.
Les supports solides peuvent être également préparés selon des méthodologies bien connues de l'homme du métier, par exemple en faisant réagir un support présentant initialement des fonctions acides carboxyliques à sa surface avec un agent chimique adapté permettant l'activation des fonctions acides carboxyliques en vue de la formation subséquente d'une liaison amidique. On pourra, en particulier, se référer aux méthodes classiques d'activation des fonctions acides carboxyliques utilisées en synthèse peptidique, en particulier par voie solide. A titre illustratif, on peut aussi utiliser, dans les conditions spécifiques de couplage prescrites par l'invention, la méthodologie d'activation par une combinaison de EDC (chlorhydrate de 1-Ethy1-343-dimethylaminopropyl]carbodiimide) et de NHS, bien connue de l'homme du métier.
Les supports solides présentant des fonctions acides carboxyliques activées peuvent être de tout type. Ces supports englobent les supports classiquement utilisés pour la chromatographie, y compris les supports de silice etd'agarose, et qui ont été traités afin de présenter à leur surface des groupes acides carboxyliquesactivés. Les supports solides pré-activés englobent des gels de dextrane, d'agarose, d'amidon, des dérivés cellulosiques, ou encore des polymères synthétiques tels que des polyamides, du trisacryle, du sephaeryle des dérivés de méthacrylate, des dérivés du polystyrène et des polyacrylamides, ou encore des supports minéraux tels que des supports de silice (notamment des supports de verre poreux) ou d'alumine, sur la surface desquels sont présents des groupes acides carboxyliques activés. De manière générale, les supports solides sur lesquels peuvent être immobilisés les ligands nucléiques selon l'invention englobent tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée communément pour les supports de filtre, des membranes, etc. Les supports solides
17 englobent notamment les résines, les résines ou gels pour colonne de chromatographie d'affinité, les billes de polymères, les billes magnétiques, les billes paramagnétiques, les matériaux supports de membrane filtrante, etc. Les supports solides englobent aussi notamment les matériaux à base de verre ou de métal, tels que l'acier, l'or, l'argent, l'aluminium, le cuivre, le silicium, le verre, la céramique. Les supports solides englobent aussi notamment des matériaux polymères, tels qu'un polyéthylène, un polypropylène, un polyamide, un fluorure de polyvinylidène, des dérivés de polyacrylamide et des combinaisons de ceux-ci.
Dans les modes de réalisation particuliers pour lesquels les fonctions acides carboxyliques du support solide sont activées par le NHS, ledit support solide peut être obtenu en faisant réagir un gel commercial présentant des fonctions acides carboxyliques libres avec le N-hydroxysuccinimide (NHS), éventuellement en présence d'un carbodiimide tel que le 1-éthy1-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) .
On peut également utiliser un support solide commercial pré-activé par le NHS comme par exemple un gel NEIS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) commercialisé par la société General Electric Healthcare (Etats-Unis), un gel HiTrapTm NHS-activated commercialisé par la société General Electric Healthcare (Etats-Unis) ou encore un gel NHS-Activated Agarose commercialisé par la société Therrno Scientific Pierce.
Comme cela est expliqué ci-avant, un ligand nucléique selon l'invention comprend un polynucléotide c'est-à-dire en un polymère de nucléotides. Le polynucléotide du ligand nucléique est responsable en grande partie des propriétés de liaison spécifique dudit ligand vis-à-vis de sa ou ses molécules cibles. II
comprend généralement de 5 à 120 nucléotides de longueur.
Le ligand nucléique peut comprendre, en outre, une partie non-nucléotidique.
Ladite partie non-nucléotidique étant de préférence lié au polynucléotide. On entend par une partie non-nueléotidique un motif chimique qui ne consiste pas essentiellement à
un polynucléotide. Cette partie non-nucléotide est de préférence une chaîne espaceur.
L'amine réactive dudit ligand nucléique est de préférence une amine primaire présente à
l'extrémité 3' ou 5' du polynucléotide ou le cas échéant une amine primaire présente au niveau de la partie non-nucléotidique.
Dans les modes de réalisation particuliers pour lesquels les fonctions acides carboxyliques du support solide sont activées par le NHS, ledit support solide peut être obtenu en faisant réagir un gel commercial présentant des fonctions acides carboxyliques libres avec le N-hydroxysuccinimide (NHS), éventuellement en présence d'un carbodiimide tel que le 1-éthy1-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) .
On peut également utiliser un support solide commercial pré-activé par le NHS comme par exemple un gel NEIS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) commercialisé par la société General Electric Healthcare (Etats-Unis), un gel HiTrapTm NHS-activated commercialisé par la société General Electric Healthcare (Etats-Unis) ou encore un gel NHS-Activated Agarose commercialisé par la société Therrno Scientific Pierce.
Comme cela est expliqué ci-avant, un ligand nucléique selon l'invention comprend un polynucléotide c'est-à-dire en un polymère de nucléotides. Le polynucléotide du ligand nucléique est responsable en grande partie des propriétés de liaison spécifique dudit ligand vis-à-vis de sa ou ses molécules cibles. II
comprend généralement de 5 à 120 nucléotides de longueur.
Le ligand nucléique peut comprendre, en outre, une partie non-nucléotidique.
Ladite partie non-nucléotidique étant de préférence lié au polynucléotide. On entend par une partie non-nueléotidique un motif chimique qui ne consiste pas essentiellement à
un polynucléotide. Cette partie non-nucléotide est de préférence une chaîne espaceur.
L'amine réactive dudit ligand nucléique est de préférence une amine primaire présente à
l'extrémité 3' ou 5' du polynucléotide ou le cas échéant une amine primaire présente au niveau de la partie non-nucléotidique.
18 De manière préférée, l'amine réactive est une amine primaire aliphatique, ce qui signifie que la fonction amine n'est pas directement liée à un groupe aromatique.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides de longueur comprenant au moins une fonction amine réactive à son extrémité 3' ou 5'.
Dans d'autres modes de réalisation, le ligand nucléique comprend (i) un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides de longueur et (ii) une chaîne espaceur liée audit polynucléotide, la fonction amine réactive étant fixée à une extrémité 3' ou 5' dudit polynucléotide ou à la chaîne espaceur.
La chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à
l'extrémité
3' de l'acide nucléique.
Dans certain mode de réalisation selon l'invention, le ligand nucléique comprend un polynucléotide et une chaîne espaceur, ladite chaîne espaceur comprenant à
l'une de ces extrémités une fonction amine et étant lié par sa deuxième extrémité à
l'extrémité 5' du polynucléotide.
Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement le polynucléotide de la surface du support solide ce qui permet d'augmenter la mobilité
relative de la partie nueléotidique du ligand nucléique et de diminuer l'encombrement stérique.
La chaîne espaceur peut être de tout type. Les exemples illustrent en particulier la mise en uvre du procédé selon l'invention pour une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé d'une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3 , C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol, par exemple Hexaéthylène glycol (FLEG) ou un 11-amino-3,6,9-trioxaundécan- I yl appelé
dans la suite C11 hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique De préférence, la chaîne espaceur ne comprend pas de groupements ionisables autres que des fonctions amines primaires ou des fonctions amines secondaires. De manière générale, la chaîne espaceur ne comprend pas de groupements ou de liaisons sensibles au pH alcalin ou aux réactions d'oxydation ou de réduction. En particulier, la chaîne espaceur ne contient pas de liaison disulfide ou des groupements thiols. La chaîne espaceur contient essentiellement des liaisons de type carbone-carbone, carbone-oxygène et carbone-azote. La chaîne espaceur est de préférence
Ainsi, dans certains modes de réalisation, le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides de longueur comprenant au moins une fonction amine réactive à son extrémité 3' ou 5'.
Dans d'autres modes de réalisation, le ligand nucléique comprend (i) un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides de longueur et (ii) une chaîne espaceur liée audit polynucléotide, la fonction amine réactive étant fixée à une extrémité 3' ou 5' dudit polynucléotide ou à la chaîne espaceur.
La chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à
l'extrémité
3' de l'acide nucléique.
Dans certain mode de réalisation selon l'invention, le ligand nucléique comprend un polynucléotide et une chaîne espaceur, ladite chaîne espaceur comprenant à
l'une de ces extrémités une fonction amine et étant lié par sa deuxième extrémité à
l'extrémité 5' du polynucléotide.
Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement le polynucléotide de la surface du support solide ce qui permet d'augmenter la mobilité
relative de la partie nueléotidique du ligand nucléique et de diminuer l'encombrement stérique.
La chaîne espaceur peut être de tout type. Les exemples illustrent en particulier la mise en uvre du procédé selon l'invention pour une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé d'une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3 , C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol, par exemple Hexaéthylène glycol (FLEG) ou un 11-amino-3,6,9-trioxaundécan- I yl appelé
dans la suite C11 hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique De préférence, la chaîne espaceur ne comprend pas de groupements ionisables autres que des fonctions amines primaires ou des fonctions amines secondaires. De manière générale, la chaîne espaceur ne comprend pas de groupements ou de liaisons sensibles au pH alcalin ou aux réactions d'oxydation ou de réduction. En particulier, la chaîne espaceur ne contient pas de liaison disulfide ou des groupements thiols. La chaîne espaceur contient essentiellement des liaisons de type carbone-carbone, carbone-oxygène et carbone-azote. La chaîne espaceur est de préférence
19 choisie parmi le groupe constitué par: une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3, C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol, par exemple Hexaéthylène glycol (HEG) ou un 11-amino-3,6,9-trioxaundécan-1y1 appelé dans la suite Ci 1 hydrophile ou un oligonucléotide non spécifiquesubstitués par une fonction amine primaire La chaîne espaceur peut être introduite selon des méthodes bien connues de l'homme du métier, en particulier en tant qu'étape finale de la synthèse chimique du polynucléotide. Dans ce cas particulier on pourra introduire la chaîne espaceur à
l'extrémité 5' du polynucléotide à l'aide d'un dérivé comprenant une fonction phosphoramidite comme cela est décrit dans les exemples. Le principe général de cette réaction est présenté à la figure 2 de Greco et Tor, Nature Protocols, 2007, 2, 305-316 intitulée Key steps in solid DNA phospharimidite synthesis cycle . H est également possible d'introduire une molécule contenant une amine primaire en position 5' du polynucléotide par couplage d'une diamine telle que l'éthylènediamine en présence d'EDC et d'imidazole (voir Fiche technique n'TR0030.5 éditée par Thermo scientific).
On pourra se référer à l'ouvrage de référence de Hennanson (Bioconjugate Techniques, 2008, 2nd Edition, Academie Press, San Diego) et en particulier au chapitre 27, p.970.
Comme cela est illustré dans les exemples de la présente demande, l'étape de couplage peut être effectuée indifféremment à basse température et à
température ambiante. De manière remarquable, la mise en uvre de la réaction à
température ambiante n'induit pas une diminution du rendement de la réaction. De la même manière, la mise en oeuvre de la réaction à basse température ¨ typiquement à une température de 5 C
¨ n'induit pas une diminution substantielle de la vitesse de réaction.
Ainsi dans certains modes de réaction l'étape de couplage est effectuée à une température comprise dans une gamme allant de 0 C à 50 C.
De manière préférée, l'étape de couplage peut être réalisée à une température allant de 0 C à 35 C.
De manière pratique, la réaction de couplage pourra être réalisée à
température ambiante, c'est-à-dire à une température allant de 15 C à 35 C, de préférence à une température allant de 15 C à 25 C. Néanmoins, l'étape de couplage pourra être réalisée à
basse température, typiquement à une température allant de 0 C à 8 C, si les réactifs mis en jeu ¨ en particulier les ligands nucléiques ¨ présentent des groupements chimiques sensibles, en particulier, à l'hydrolyse.
La réaction de couplage étant particulièrement rapide, un avancement satisfaisant de la réaction est généralement obtenu au bout d'environ d'une heure, voire au 5 bout de quelques minutes. En utilisant des techniques de suivi cinétiques adaptées, l'homme du métier sera à même de déterminer la durée optimale de la réaction.
Il en est de même pour la température de réaction.
De manière générale, comme cela est illustré dans les exemples, l'étape de couplage peut être effectuée à un pH allant de 3,5 à 4,5, à température ambiante et sur une 10 durée d'environ une heure.
Bien entendu, l'homme du métier peut, sur la base des conditions générales ci-dessus, adapter les conditions de la réaction de couplage afin de détenniner les conditions optimales adaptées dans chaque cas précis, sur la base de ses connaissances générales en chimie. A titre illustratif, l'homme du métier peut facilement prévoir que, pour l'obtention 15 d'un rendement de couplage donné, l'abaissement de la température de réaction est susceptible de nécessiter une augmentation de la durée de l'étape de couplage.
Dans certains modes de réalisation du procédé d'immobilisation selon = l'invention, la réaction de couplage peut être achevée en plaçant la combinaison support pré-activé/acides nucléiques dans des conditions de pH alcalin pendant une durée donnée.
l'extrémité 5' du polynucléotide à l'aide d'un dérivé comprenant une fonction phosphoramidite comme cela est décrit dans les exemples. Le principe général de cette réaction est présenté à la figure 2 de Greco et Tor, Nature Protocols, 2007, 2, 305-316 intitulée Key steps in solid DNA phospharimidite synthesis cycle . H est également possible d'introduire une molécule contenant une amine primaire en position 5' du polynucléotide par couplage d'une diamine telle que l'éthylènediamine en présence d'EDC et d'imidazole (voir Fiche technique n'TR0030.5 éditée par Thermo scientific).
On pourra se référer à l'ouvrage de référence de Hennanson (Bioconjugate Techniques, 2008, 2nd Edition, Academie Press, San Diego) et en particulier au chapitre 27, p.970.
Comme cela est illustré dans les exemples de la présente demande, l'étape de couplage peut être effectuée indifféremment à basse température et à
température ambiante. De manière remarquable, la mise en uvre de la réaction à
température ambiante n'induit pas une diminution du rendement de la réaction. De la même manière, la mise en oeuvre de la réaction à basse température ¨ typiquement à une température de 5 C
¨ n'induit pas une diminution substantielle de la vitesse de réaction.
Ainsi dans certains modes de réaction l'étape de couplage est effectuée à une température comprise dans une gamme allant de 0 C à 50 C.
De manière préférée, l'étape de couplage peut être réalisée à une température allant de 0 C à 35 C.
De manière pratique, la réaction de couplage pourra être réalisée à
température ambiante, c'est-à-dire à une température allant de 15 C à 35 C, de préférence à une température allant de 15 C à 25 C. Néanmoins, l'étape de couplage pourra être réalisée à
basse température, typiquement à une température allant de 0 C à 8 C, si les réactifs mis en jeu ¨ en particulier les ligands nucléiques ¨ présentent des groupements chimiques sensibles, en particulier, à l'hydrolyse.
La réaction de couplage étant particulièrement rapide, un avancement satisfaisant de la réaction est généralement obtenu au bout d'environ d'une heure, voire au 5 bout de quelques minutes. En utilisant des techniques de suivi cinétiques adaptées, l'homme du métier sera à même de déterminer la durée optimale de la réaction.
Il en est de même pour la température de réaction.
De manière générale, comme cela est illustré dans les exemples, l'étape de couplage peut être effectuée à un pH allant de 3,5 à 4,5, à température ambiante et sur une 10 durée d'environ une heure.
Bien entendu, l'homme du métier peut, sur la base des conditions générales ci-dessus, adapter les conditions de la réaction de couplage afin de détenniner les conditions optimales adaptées dans chaque cas précis, sur la base de ses connaissances générales en chimie. A titre illustratif, l'homme du métier peut facilement prévoir que, pour l'obtention 15 d'un rendement de couplage donné, l'abaissement de la température de réaction est susceptible de nécessiter une augmentation de la durée de l'étape de couplage.
Dans certains modes de réalisation du procédé d'immobilisation selon = l'invention, la réaction de couplage peut être achevée en plaçant la combinaison support pré-activé/acides nucléiques dans des conditions de pH alcalin pendant une durée donnée.
20 Dans ces modes de réalisation, l'étape de couplage du procédé de l'invention comprend elle-même les deux étapes suivantes :
cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH
inférieur à 6 et c2) poursuivre la réaction de couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH supérieur à 7,5 Sans vouloir être liée par une quelconque théorie, la demanderesse pense que, la mise en oeuvre de la sous-étape c2) peut, dans certains cas spécifiques, induire les acides nucléiques immobilisés sur le support à adopter une conformation adaptée. La demanderesse est d'avis que cette étape est facultative.
cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH
inférieur à 6 et c2) poursuivre la réaction de couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH supérieur à 7,5 Sans vouloir être liée par une quelconque théorie, la demanderesse pense que, la mise en oeuvre de la sous-étape c2) peut, dans certains cas spécifiques, induire les acides nucléiques immobilisés sur le support à adopter une conformation adaptée. La demanderesse est d'avis que cette étape est facultative.
21 Avantageusement, la phase finale de couplage à pH alcalin est réalisée à un pH
d'au moins 7,5, ce qui englobe les pH d'au moins 8, et d'au moins 8,5. Les exemples illustrent la réalisation de l'étape c2) à un pH d'environ 9 L'étape c2)) peut être réalisée à température ambiante ou à une température basse. Par température basse pour l'étape finale de la réaction de couplage, on entend une température inférieure à 15 C, y compris une température inférieure à 14 C, 13 C, 12 C, 11 C, 10 C, 9 C, 8 C, 7 C, 6 C ou 5 C.
La durée de la phase finale de l'étape de couplage est variable. Elle est comprise entre quelques minutes et quelques heures. De manière générale, la durée de l'étape c2) est inférieure à 9 heure ce qui englobe une durée inférieure à 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 et 1 heures. La durée l'étape c2) peut être d'environ 8 heures ou d'environ 3 heures, comme cela est illustré dans les exemples.
Pour ladite phase finale de l'étape de couplage, l'homme du métier peut aisément, sur la base des indications ci-dessus, déteiniiner les conditions optimales de combinaison de pH, température et durée, au cas-par-cas.
Dans des modes de réalisation avantageux, la réaction de couplage est suivie par une étape de neutralisation d) ou de blocage des groupes acides carboxyliques activés n'ayant pas réagi au cours de l'étape de couplage proprement dit. A titre illustratif, le blocage des fonctions acides carboxyliques activées et n'ayant pas réagi peut être réalisé
par incubation du support greffé avec une solution de blocage comprenant 0,5 M
d'éthanolamine, 0,5M de NaC1 à pH 8,3 ou bien avec une solution de blocage à
0,1M Tris-HC1 à pH 8,5, comme cela est recommandé notamment par le fabricant et décrit par ailleurs dans les exemples. La durée de l'étape de neutralisation ou de blocage est avantageusement d'au moins une heure à température basse. Elle peut être réalisée par exemple pendant une durée de 2h30 à la température de 4 C, comme décrit dans les exemples.
En dernier lieu, le procédé selon l'invention comprend à l'issue de l'étape de couplage c) et/ou à l'issue de l'étape de blocage ou de neutralisation d) une ou plusieurs étapes de lavage e) dudit support dans des conditions classiques de manière à
obtenir un support d'affinité prêt à l'emploi. A titre illustratif, la ou les étapes de lavage peuvent être réalisées avec une solution tampon de 0,1M Tris-HC1 à un pH allant de 8 à 9, ou bien avec une solution tampon de 0,1M acétate, 0,5M NaCI à un pH allant de 4 à 5, comme cela est
d'au moins 7,5, ce qui englobe les pH d'au moins 8, et d'au moins 8,5. Les exemples illustrent la réalisation de l'étape c2) à un pH d'environ 9 L'étape c2)) peut être réalisée à température ambiante ou à une température basse. Par température basse pour l'étape finale de la réaction de couplage, on entend une température inférieure à 15 C, y compris une température inférieure à 14 C, 13 C, 12 C, 11 C, 10 C, 9 C, 8 C, 7 C, 6 C ou 5 C.
La durée de la phase finale de l'étape de couplage est variable. Elle est comprise entre quelques minutes et quelques heures. De manière générale, la durée de l'étape c2) est inférieure à 9 heure ce qui englobe une durée inférieure à 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 et 1 heures. La durée l'étape c2) peut être d'environ 8 heures ou d'environ 3 heures, comme cela est illustré dans les exemples.
Pour ladite phase finale de l'étape de couplage, l'homme du métier peut aisément, sur la base des indications ci-dessus, déteiniiner les conditions optimales de combinaison de pH, température et durée, au cas-par-cas.
Dans des modes de réalisation avantageux, la réaction de couplage est suivie par une étape de neutralisation d) ou de blocage des groupes acides carboxyliques activés n'ayant pas réagi au cours de l'étape de couplage proprement dit. A titre illustratif, le blocage des fonctions acides carboxyliques activées et n'ayant pas réagi peut être réalisé
par incubation du support greffé avec une solution de blocage comprenant 0,5 M
d'éthanolamine, 0,5M de NaC1 à pH 8,3 ou bien avec une solution de blocage à
0,1M Tris-HC1 à pH 8,5, comme cela est recommandé notamment par le fabricant et décrit par ailleurs dans les exemples. La durée de l'étape de neutralisation ou de blocage est avantageusement d'au moins une heure à température basse. Elle peut être réalisée par exemple pendant une durée de 2h30 à la température de 4 C, comme décrit dans les exemples.
En dernier lieu, le procédé selon l'invention comprend à l'issue de l'étape de couplage c) et/ou à l'issue de l'étape de blocage ou de neutralisation d) une ou plusieurs étapes de lavage e) dudit support dans des conditions classiques de manière à
obtenir un support d'affinité prêt à l'emploi. A titre illustratif, la ou les étapes de lavage peuvent être réalisées avec une solution tampon de 0,1M Tris-HC1 à un pH allant de 8 à 9, ou bien avec une solution tampon de 0,1M acétate, 0,5M NaCI à un pH allant de 4 à 5, comme cela est
22 illustré dans les exemples. Dans certains modes de réalisation, une étape de lavage comprend successivement (i) un lavage par une solution tampon de 0,1M Tris-HC1 à un pH allant de 8 à 9, suivi de (ii) un lavage par une solution tampon de 0,1M
acétate, 0,5M
NaCl à un pH allant de 4 à 5. Classiquement, on réalise une pluralité d'étapes de lavage, par exemple 3 étapes de lavage, comme cela est illustré dans les exemples.
Au vu de la description qui précède, le procédé d'immobilisation d'acides nucléiques selon l'invention peut être aussi défini comme un procédé
comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide, b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction amine primaire, c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à 6, et d) bloquer la réaction de couplage.
Le procédé d'immobilisation d'acides nucléiques selon l'invention peut être aussi défini comme un procédé comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide, b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction amine primaire, c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à6, d) bloquer la réaction de couplage, et e) réaliser une ou plusieurs étapes de lavage du support.
Comme cela a déjà été précisé précédemment, dans certains modes de réalisation, l'étape c) comprend elle-même les deux étapes suivantes :
cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide, présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 6, et
acétate, 0,5M
NaCl à un pH allant de 4 à 5. Classiquement, on réalise une pluralité d'étapes de lavage, par exemple 3 étapes de lavage, comme cela est illustré dans les exemples.
Au vu de la description qui précède, le procédé d'immobilisation d'acides nucléiques selon l'invention peut être aussi défini comme un procédé
comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide, b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction amine primaire, c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à 6, et d) bloquer la réaction de couplage.
Le procédé d'immobilisation d'acides nucléiques selon l'invention peut être aussi défini comme un procédé comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide, b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction amine primaire, c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à6, d) bloquer la réaction de couplage, et e) réaliser une ou plusieurs étapes de lavage du support.
Comme cela a déjà été précisé précédemment, dans certains modes de réalisation, l'étape c) comprend elle-même les deux étapes suivantes :
cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide, présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 6, et
23 c2) poursuivre la réaction de couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH supérieur à 7,5 Le procédé d'immobilisation des ligands nucléiques selon l'invention trouve une application directe pour la fabrication de supports d'affinité destinés à
la purification ou à la détection de molécules cibles, y compris de protéines cibles.
Ainsi, de manière plus générale, la présente invention concerne une méthode de préparation d'un support d'affinité comprenant la mise en oeuvre du procédé
d'immobilisation de ligands nucléiques tel que défini ci-avant. Ainsi, la méthode de préparation d'un support d'affinité selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine primaire, et c) réaliser le couplage dudit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à 6 étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
L'étape c) de la méthode peut comprendre les étapes cl) et c2) telles que définies précédemment. De la même manière, la méthode peut comprendre en outre les étapes d) et e) décrites précédemment.
Comme cela est illustré dans les exemples, la méthode et le procédé selon l'invention sont particulièrement adaptés pour la préparation d'un support d'affinité
destiné à la purification d'une ou plusieurs molécules cibles, en particulier par chromatographie.
Ainsi dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, le support solide est un support adapté à la mise en uvre d'un procédé de chromatographie, de filtration ou d'extraction en phase solide. En d'autres termes le support solide est adapté pour une utilisation en tant que phase stationnaire dans un procédé de chromatographie, ou de filtration ou d'extraction en phase solide. Pour la mise en oeuvre d'un support solide d'affinité pour l'extraction en phase solide, on pourra se référer à
Madru et al., (Analytical Chemistry, 2009, 81, 7081-7086). Un tel support solide peut être
la purification ou à la détection de molécules cibles, y compris de protéines cibles.
Ainsi, de manière plus générale, la présente invention concerne une méthode de préparation d'un support d'affinité comprenant la mise en oeuvre du procédé
d'immobilisation de ligands nucléiques tel que défini ci-avant. Ainsi, la méthode de préparation d'un support d'affinité selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine primaire, et c) réaliser le couplage dudit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à 6 étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
L'étape c) de la méthode peut comprendre les étapes cl) et c2) telles que définies précédemment. De la même manière, la méthode peut comprendre en outre les étapes d) et e) décrites précédemment.
Comme cela est illustré dans les exemples, la méthode et le procédé selon l'invention sont particulièrement adaptés pour la préparation d'un support d'affinité
destiné à la purification d'une ou plusieurs molécules cibles, en particulier par chromatographie.
Ainsi dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, le support solide est un support adapté à la mise en uvre d'un procédé de chromatographie, de filtration ou d'extraction en phase solide. En d'autres termes le support solide est adapté pour une utilisation en tant que phase stationnaire dans un procédé de chromatographie, ou de filtration ou d'extraction en phase solide. Pour la mise en oeuvre d'un support solide d'affinité pour l'extraction en phase solide, on pourra se référer à
Madru et al., (Analytical Chemistry, 2009, 81, 7081-7086). Un tel support solide peut être
24 choisi parmi le groupe constitué par les gels de silice et les gels de polysaccharide tels que les gels d'agarose, les gels de dextrane et leurs dérivés et également les gels acrylamide et leurs dérives, les géls methacrylate et leurs dérivés et les surfaces polystyrene et leurs dérivés.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier du procédé ou de la méthode d'immobilisation l'invention, (i) le support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés est un support choisi parmi le groupe constitué par les gels de silice, les gels d'agarose, les gels de dextrane et leurs dérivés et (ii) le ligand acide nucléique comprenant au moins une amine réactive est choisi parmi le groupe des polynucléotides de 5 à 120 acides aminés comprenant éventuellement en leur extrémité 3' ou 5' une chaîne espaceur pouvant être choisie parmi le groupe constitué par une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé
de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3 ,C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol, par exemple Hexaéthylène glycol (HEG) ou un 11-arnino-3,6,9-trioxaundécan-ly1 appelé dans la suite C11 hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique Dans un autre mode de réalisation particulier du procédé ou de la méthode selon l'invention, (i) le support solide est choisi parmi les gels d'agarose et leurs dérivés, et (ii) le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides lié par son extrémité 5' à une chaine espaceur choisie panai les polyéthylèneglyeol en C4-C20, la fonction amine réactive étant de préférence portée par la chaine espaceur.
Dans un mode de réalisation supplémentaire du procédé ou de la méthode selon l'invention, (i) le support solide est choisi parmi les gels d'agarose et leurs dérivés et (ii) le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides lié par son extrémité 5' à une chaine espaceur choisie parmi les alkyles linaires en C4-C20, la fonction amine réactive étant de préférence portée par la chaine espaceur.
Les exemples montrent que les supports d'affinité obtenus selon le procédé de l'invention peimettent la purification quantitative d'un ligand cible de manière extrêmement sélective.
Egalement, les résultats des exemples montrent qu'un support d'affinité
obtenu selon le procédé de l'invention peut être utilisé sur une très longue période de temps, notamment selon un grand nombre de cycles de capture/lavage/élution/lavage sans perte significative de ses propriétés de rétention sélective et quantitative du ligand cible.
5 On montre aussi, qu'un support d'affinité selon l'invention conserve ses propriétés de rétention sélective et quantitative du ligand cible, même après avoir subi les étapes drastiques de régénération ou de sanitisation antibactérienne, anti-fongique ou anti-virale.
On a montré, en particulier, dans les exemples que la capacité de rétention d'un support d'affinité selon l'invention pour sa protéine cible ne sont pas altérées par un traitement par 10 une solution ayant une concentration finale de NaOH de 0,5 M, ni même par un traitement par une solution de NaOH ayant une concentration finale de I M, c'est-à-dire à
une concentration finale de NaOH bien supérieure à celle qui est usuellement employée lors des étapes de sanitisation, et ceci pendant une très longue période de temps (100 heures) également bien supérieure à la durée d'une étape conventionnelle de sanitisation qui est en 15 générale de quelques minutes. On a également montré que les propriétés chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention ne sont pas altérées par un traitement par une solution ayant une concentration finale de propylène glycol de 50 %
(vol/vol).
Les résultats des exemples montrent aussi que les propriétés 20 chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention ne sont pas altérées, même après une incubation de longue durée dudit support avec le milieu biologique de départ contenant la molécule à purifier.
Il est également montré dans les exemples que les propriétés chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention sont inchangées, même après
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier du procédé ou de la méthode d'immobilisation l'invention, (i) le support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés est un support choisi parmi le groupe constitué par les gels de silice, les gels d'agarose, les gels de dextrane et leurs dérivés et (ii) le ligand acide nucléique comprenant au moins une amine réactive est choisi parmi le groupe des polynucléotides de 5 à 120 acides aminés comprenant éventuellement en leur extrémité 3' ou 5' une chaîne espaceur pouvant être choisie parmi le groupe constitué par une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé
de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3 ,C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol, par exemple Hexaéthylène glycol (HEG) ou un 11-arnino-3,6,9-trioxaundécan-ly1 appelé dans la suite C11 hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique Dans un autre mode de réalisation particulier du procédé ou de la méthode selon l'invention, (i) le support solide est choisi parmi les gels d'agarose et leurs dérivés, et (ii) le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides lié par son extrémité 5' à une chaine espaceur choisie panai les polyéthylèneglyeol en C4-C20, la fonction amine réactive étant de préférence portée par la chaine espaceur.
Dans un mode de réalisation supplémentaire du procédé ou de la méthode selon l'invention, (i) le support solide est choisi parmi les gels d'agarose et leurs dérivés et (ii) le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides lié par son extrémité 5' à une chaine espaceur choisie parmi les alkyles linaires en C4-C20, la fonction amine réactive étant de préférence portée par la chaine espaceur.
Les exemples montrent que les supports d'affinité obtenus selon le procédé de l'invention peimettent la purification quantitative d'un ligand cible de manière extrêmement sélective.
Egalement, les résultats des exemples montrent qu'un support d'affinité
obtenu selon le procédé de l'invention peut être utilisé sur une très longue période de temps, notamment selon un grand nombre de cycles de capture/lavage/élution/lavage sans perte significative de ses propriétés de rétention sélective et quantitative du ligand cible.
5 On montre aussi, qu'un support d'affinité selon l'invention conserve ses propriétés de rétention sélective et quantitative du ligand cible, même après avoir subi les étapes drastiques de régénération ou de sanitisation antibactérienne, anti-fongique ou anti-virale.
On a montré, en particulier, dans les exemples que la capacité de rétention d'un support d'affinité selon l'invention pour sa protéine cible ne sont pas altérées par un traitement par 10 une solution ayant une concentration finale de NaOH de 0,5 M, ni même par un traitement par une solution de NaOH ayant une concentration finale de I M, c'est-à-dire à
une concentration finale de NaOH bien supérieure à celle qui est usuellement employée lors des étapes de sanitisation, et ceci pendant une très longue période de temps (100 heures) également bien supérieure à la durée d'une étape conventionnelle de sanitisation qui est en 15 générale de quelques minutes. On a également montré que les propriétés chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention ne sont pas altérées par un traitement par une solution ayant une concentration finale de propylène glycol de 50 %
(vol/vol).
Les résultats des exemples montrent aussi que les propriétés 20 chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention ne sont pas altérées, même après une incubation de longue durée dudit support avec le milieu biologique de départ contenant la molécule à purifier.
Il est également montré dans les exemples que les propriétés chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention sont inchangées, même après
25 de nombreux cycles d'utilisation.
En d'autres termes, les résultats des exemples illustrent la capacité d'un support d'affinité selon l'invention a réaliser de manière parfaitement reproductible des étapes de purification quantitatives d'un ligand cible, et ceci dans des conditions d'utilisation industrielles classiques, qui sont en général délétères pour les supports d'affinité connus, y compris pour les supports d'immuno-affinité. Les caractéristiques techniques de chacune des étapes du procédé de l'invention, selon les différentes définitions ci-dessus, ont déjà été précisées précédemment dans la présente description.
En d'autres termes, les résultats des exemples illustrent la capacité d'un support d'affinité selon l'invention a réaliser de manière parfaitement reproductible des étapes de purification quantitatives d'un ligand cible, et ceci dans des conditions d'utilisation industrielles classiques, qui sont en général délétères pour les supports d'affinité connus, y compris pour les supports d'immuno-affinité. Les caractéristiques techniques de chacune des étapes du procédé de l'invention, selon les différentes définitions ci-dessus, ont déjà été précisées précédemment dans la présente description.
26 Les supports d'affinité selon l'invention constituent donc des outils de purification qui sont à la fois fiables et reproductibles, stables dans le temps, et ne nécessitant pas d'opérations de maintenance répétées. Les supports d'affinité
de l'invention, du fait des nombreux avantages techniques qu'ils procurent, permettent la mise en ceuvre de procédés de purification d'une molécule cible à des coûts modérés.
Les exemples décrivent l'obtention d'un support d'affinité de l'invention par greffage d'aptamères nucléiques, et de manière illustrative par greffage d'aptamères d'ADN.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré du procédé ou de la méthode selon la présente invention, le ligand nucléique est un aptamère nucléique.
Par aptamère nucléique ou par aptamère, on entend selon l'invention un acide nucléique simple brin se liant spécifiquement à un ou plusieurs ligands cibles. Les aptamères englobent ceux pour lesquels on peut détecter des complexes avec un seul ligand cible ou avec une variété de ligands cibles donnés, après une étape préalable de mise en contact des partenaires respectivement nucléique et ligand cible. Les aptamères englobent les aptamères d'ARN et les aptamères d'ADN.
Le terme aptamère tel qu'utilisé ici désigne une molécule d'acide nucléique monobrin, ADN ou ARN, capable de se lier de manière spécifique à un ou plusieurs ligands cibles, telle qu'une protéine. Les aptamères se lient à
leurs molécules cibles par des mécanismes essentiellement distincts de l'hybridation. Les aptamères sont généralement caractérisés par une structure secondaire comprenant des boucles et des tiges. En d'autres termes, la conformation active des aptamères (c'est-à-dire la conformation dans laquelle les aptamères sont capables de se lier à leur protéine cible) est non Hilaire.
Les aptamères comprennent généralement entre 5 et 120 nucléotides et peuvent être sélectionnés in vitro selon un procédé connu sous le nom de SELEX
(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Les aptamères présentent de nombreux avantages. De par leur nature oligonucléotidique, les aptamères possèdent une faible immunogénicité et une résistance importante à des conditions physico-chimiques stringentes (présence d'urée, de DMSO, d'un pH très acide ou très basique, utilisation de solvants organiques ou de température élevée) permettant des stratégies de sanitisation variées dans le cadre d'un usage en tant que ligand d'affinité.
De plus leur
de l'invention, du fait des nombreux avantages techniques qu'ils procurent, permettent la mise en ceuvre de procédés de purification d'une molécule cible à des coûts modérés.
Les exemples décrivent l'obtention d'un support d'affinité de l'invention par greffage d'aptamères nucléiques, et de manière illustrative par greffage d'aptamères d'ADN.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré du procédé ou de la méthode selon la présente invention, le ligand nucléique est un aptamère nucléique.
Par aptamère nucléique ou par aptamère, on entend selon l'invention un acide nucléique simple brin se liant spécifiquement à un ou plusieurs ligands cibles. Les aptamères englobent ceux pour lesquels on peut détecter des complexes avec un seul ligand cible ou avec une variété de ligands cibles donnés, après une étape préalable de mise en contact des partenaires respectivement nucléique et ligand cible. Les aptamères englobent les aptamères d'ARN et les aptamères d'ADN.
Le terme aptamère tel qu'utilisé ici désigne une molécule d'acide nucléique monobrin, ADN ou ARN, capable de se lier de manière spécifique à un ou plusieurs ligands cibles, telle qu'une protéine. Les aptamères se lient à
leurs molécules cibles par des mécanismes essentiellement distincts de l'hybridation. Les aptamères sont généralement caractérisés par une structure secondaire comprenant des boucles et des tiges. En d'autres termes, la conformation active des aptamères (c'est-à-dire la conformation dans laquelle les aptamères sont capables de se lier à leur protéine cible) est non Hilaire.
Les aptamères comprennent généralement entre 5 et 120 nucléotides et peuvent être sélectionnés in vitro selon un procédé connu sous le nom de SELEX
(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Les aptamères présentent de nombreux avantages. De par leur nature oligonucléotidique, les aptamères possèdent une faible immunogénicité et une résistance importante à des conditions physico-chimiques stringentes (présence d'urée, de DMSO, d'un pH très acide ou très basique, utilisation de solvants organiques ou de température élevée) permettant des stratégies de sanitisation variées dans le cadre d'un usage en tant que ligand d'affinité.
De plus leur
27 sélectivité est importante. Enfin la production d'aptamères implique des coûts relativement limités.
Dans certains modes de réalisation, un aptamère nucléique utilisé pour le greffage au support solide pré-activé, selon le procédé ou la méthode définie ci-dessus, peut comprendre, par définition, une partie non nucléotidique ou nucléotidique, par exemple une chaîne espaceur non nucléotidique, qui relie l'une des extrémités 5' ou 3' de la partie nucléique dudit aptamère et la fonction amine réactive utilisée pour le greffage chimique dudit support pré-activé. Dans ces modes de réalisation, un aptamère nucléique peut être de fouaille (I) suivante :
NH2-[SPAC]11- [NUCL] (I), dans laquelle :
- n étant indice valant 1 ou 0, 0 signifiant que l'aptamère ne comprend pas une chaîne espaceur libre et 1 signifiant que l'aptamère comprend une chaîne espaceur.
- NR2 signifie la fonction amine réactive utilisée pour le greffage sur le support solide pré-activé par des groupes NHS, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL1 signifie un acide nucléique se liant spécifiquement à un molécule cible, ledit acide nucléique comprenant de 5 à 120 nucléotides.
De préférence, l'acide nucléique [NUCL] comprend de 10 à 80 nucléotides et de manière encore plus préférée de 20 à 60 nucléotides.
La chaîne espaceur désignée [SPAC] dans le composé de formule (I) peut être de tout type connu. Il peut s'agir d'un composé non-nucléotidique, d'un oligonucléotide ou d'un composé comprenant une ou plusieurs parties non-nucléotidiques et une ou plusieurs parties nucléotidiques. La chaîne espaceur ne participe pas, en général, à la liaison du ligand cible sur le support.
Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide nucléique [NUCL] de la surface du support solide sur lequel ledit composé de formule (1) est greffé chimiquement ce qui permet une mobilité relative de l'acide nucléique [NUCIA, par rapport à la surface dudit support solide. La chaîne espaceur limite ou évite que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support solide avec la partie nucléique de l'aptamère, gênent les évènements de liaison entre ledit acide
Dans certains modes de réalisation, un aptamère nucléique utilisé pour le greffage au support solide pré-activé, selon le procédé ou la méthode définie ci-dessus, peut comprendre, par définition, une partie non nucléotidique ou nucléotidique, par exemple une chaîne espaceur non nucléotidique, qui relie l'une des extrémités 5' ou 3' de la partie nucléique dudit aptamère et la fonction amine réactive utilisée pour le greffage chimique dudit support pré-activé. Dans ces modes de réalisation, un aptamère nucléique peut être de fouaille (I) suivante :
NH2-[SPAC]11- [NUCL] (I), dans laquelle :
- n étant indice valant 1 ou 0, 0 signifiant que l'aptamère ne comprend pas une chaîne espaceur libre et 1 signifiant que l'aptamère comprend une chaîne espaceur.
- NR2 signifie la fonction amine réactive utilisée pour le greffage sur le support solide pré-activé par des groupes NHS, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL1 signifie un acide nucléique se liant spécifiquement à un molécule cible, ledit acide nucléique comprenant de 5 à 120 nucléotides.
De préférence, l'acide nucléique [NUCL] comprend de 10 à 80 nucléotides et de manière encore plus préférée de 20 à 60 nucléotides.
La chaîne espaceur désignée [SPAC] dans le composé de formule (I) peut être de tout type connu. Il peut s'agir d'un composé non-nucléotidique, d'un oligonucléotide ou d'un composé comprenant une ou plusieurs parties non-nucléotidiques et une ou plusieurs parties nucléotidiques. La chaîne espaceur ne participe pas, en général, à la liaison du ligand cible sur le support.
Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide nucléique [NUCL] de la surface du support solide sur lequel ledit composé de formule (1) est greffé chimiquement ce qui permet une mobilité relative de l'acide nucléique [NUCIA, par rapport à la surface dudit support solide. La chaîne espaceur limite ou évite que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support solide avec la partie nucléique de l'aptamère, gênent les évènements de liaison entre ledit acide
28 nucléique et des molécules du ligand cible susceptibles d'être mises en contact avec celui-ci.
Dans le composé de formule (II), la chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique [NUCL].
Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser directement l'aptamère sur le support solide. De préférence, comme cela a été
indiqué ci-avant, la chaîne espaceur peut être une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3 , C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol, par exemple Hexaéthylène glycol (HEG) ou un 11-amino-3,6,9-trioxaundécan-ly1 appelé dans la suite Cl 1 hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique. Lorsque la chaîne espaceur consiste en un oligonucléotide non spécifique, ledit oligonucléotide comprend avantageusement au moins 5 nucléotides de longueur, de préférence entre 5 et 15 nucléotides de longueur.
Dans certains modes de réalisation, la chaîne espaceur peut être composite et comprendre la succession d'HEG et d'un oligonucléotide, par exemple d'un oligo(dT).
On rappelle que les exemples illustrent l'obtention de supports d'affinité
tels que définis ci-dessus par greffage du support pré-activé par le NHS avec trois aptamères nucléiques distincts anti-FV1I comprenant des chaines espaceur de nature également distincte, à savoir, une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne alkyle en C6 une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne alkyle en C12, et une chaîne hydrophile Cl 1-TFA
Ainsi, les résultats des exemples montrent que le procédé d'obtention d'un support d'affinité qui est décrit dans la présente description peut être utilisé, quel que soit l'identité
ou le type d'acide nucléique d'intérêt à greffer.
Comme cela a été évoqué ci-avant, les procédés et méthode selon l'invention pennettent la préparation de supports d'affinité qui se distinguent des supports d'affinité
connus par leur densité élevée en ligands nucléiques immobilisés à leur surface. Cette densité élevée de ligands nucléiques découle directement du procédé spécifique d'obtention des supports d'affinité.
De manière remarquable, les supports d'affinité selon l'invention se caractérisent également par une capacité élevée de rétention de la ou les molécules cibles contre lesquels sont dirigés les acides nucléiques greffés. En particulier, le procédé selon l'invention permet de préparer des gels de chromatographie d'affinité
présentant une
Dans le composé de formule (II), la chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique [NUCL].
Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser directement l'aptamère sur le support solide. De préférence, comme cela a été
indiqué ci-avant, la chaîne espaceur peut être une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3 , C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol, par exemple Hexaéthylène glycol (HEG) ou un 11-amino-3,6,9-trioxaundécan-ly1 appelé dans la suite Cl 1 hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique. Lorsque la chaîne espaceur consiste en un oligonucléotide non spécifique, ledit oligonucléotide comprend avantageusement au moins 5 nucléotides de longueur, de préférence entre 5 et 15 nucléotides de longueur.
Dans certains modes de réalisation, la chaîne espaceur peut être composite et comprendre la succession d'HEG et d'un oligonucléotide, par exemple d'un oligo(dT).
On rappelle que les exemples illustrent l'obtention de supports d'affinité
tels que définis ci-dessus par greffage du support pré-activé par le NHS avec trois aptamères nucléiques distincts anti-FV1I comprenant des chaines espaceur de nature également distincte, à savoir, une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne alkyle en C6 une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne alkyle en C12, et une chaîne hydrophile Cl 1-TFA
Ainsi, les résultats des exemples montrent que le procédé d'obtention d'un support d'affinité qui est décrit dans la présente description peut être utilisé, quel que soit l'identité
ou le type d'acide nucléique d'intérêt à greffer.
Comme cela a été évoqué ci-avant, les procédés et méthode selon l'invention pennettent la préparation de supports d'affinité qui se distinguent des supports d'affinité
connus par leur densité élevée en ligands nucléiques immobilisés à leur surface. Cette densité élevée de ligands nucléiques découle directement du procédé spécifique d'obtention des supports d'affinité.
De manière remarquable, les supports d'affinité selon l'invention se caractérisent également par une capacité élevée de rétention de la ou les molécules cibles contre lesquels sont dirigés les acides nucléiques greffés. En particulier, le procédé selon l'invention permet de préparer des gels de chromatographie d'affinité
présentant une
29 densité élevée en ligands nucléiques. Il a été ainsi observé que des gels de chromatographie obtenus par le procédé selon l'invention présentent une densité en ligands nucléiques 0.2 Innol/m1 à 0.5 Innol/m1 alors que la densité initiale en fonctions acides carboxyliques activées des gels de chromatographie que l'on trouve dans le commerce est généralement comprise entre 5 jamol/m1 à 25 umol/m1 de gel.
Ainsi, selon le procédé de couplage de l'invention, il est possible de dérivatiser selon le procédé de l'invention au moins 0,01% des fonctions carboxyliques activées initialement présentes à
la surface du support solide, avantageusement au moins 0,1%, mieux au moins 1%
et encore mieux au moins 2% desdites fonctions carboxyliques activées. A titre de comparaison les taux greffage en chromatographie d'affinité avec les anticorps comme ligand sont souvent inférieurs à lmenl, c'est-à-dire inférieure à 0.06 umol/ml, soit moins de 0,2% de fonctions carboxyliques dérivatisées.
Une dérivatisation d'au moins 0,01% des fonctions carboxyliques activées englobe une dérivatisation d'au moins 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9% et au moins 2%
desdites fonctions carboxyliques activées.
Dans certains modes de réalisation, le pourcentage de fonctions carboxyliques dérivatisées est d'au plus 100%, ce qui englobe au plus 50%, 40%, 30%, et au plus 25%
desdites fonctions carboxyliques activées.
Ainsi, un autre objet de la présente invention, un support d'affinité pouvant être obtenu conformément au procédé et à la méthode décrits ci-avant dans la présente description.
De manière plus générale, la présente invention concerne un support solide d'affinité sur lequel des ligands nucléiques sont immobilisés par une liaison amidique et dans lequel au moins des fonctions carboxyles présentes initialement à sa surface sont dérivatisées par à un ligand nucléique.
Il va de soi que la liaison amidique liant un ligand nucléique au support résulte de la réaction d'une fonction carboxyle présente initialement à la surface du support avec une fonction amine primaire présente au niveau du ligand nucléique.
Dans un mode de réalisation préféré, le support solide d'affinité est un gel de chromatographie.
Un autre objet de la présente invention est un support solide d'affinité sur lequel des ligands nucléiques sont immobilisés par une liaison amidique, ledit support d'affinité étant un gel de chromatographie présentant une densité en ligands nucléiques d'au moins 0,005 urnol/m1 de gel, ce qui englobe au moins 0,01 umol/ml, 0,05 umol/ml, 5 0,1 limai/mi, 0,15 tmol/ml, 0,2 Funol/ml, 0,25 umol/ml, 0,3 umol/ml, 0,35 umo1/m1 et au moins 0,38 umol/m1 de gel.
Dans certains modes de réalisation, la densité en ligands nucléiques est d'au plus 10 umol/ml, ce qui englobe au plus 5 umol/ml, au plus 1 umol/m1 et au plus 0,5 p.mol/ml.
10 Les supports d'affinité selon l'invention peuvent présenter l'une quelconque des propriétes décrites ci-avant pour les supports solides ou les supports d'affinité.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, le support d'affinité peut être un gel utilisable en chromatographie, en filtration ou en extraction en phase solide choisi parmi le groupe constitué par les gels d'agarose, de dextrane, de silice et leurs dérivés.
15 Comme cela est illustré dans les exemples, le support d'affinité peut être un gel d'agarose hautement réticulé sur lequel sont immobilisés les ligands nucléiques. De préférence, le support d'affinité est un gel (autrement dit une phase stationnaire) utilisable dans des procédés de chromatographie d'affinité.
Les supports d'affinité selon l'invention peuvent comprendre à leur surface 20 tout type de ligands nucléiques tels que décrits ci-avant dans la présente description.
Dans certains modes de réalisation, le support d'affinité selon l'invention est caractérisé en ce que les ligands nucléiques sont des aptamères de formule (II) présentés ci-avant.
Dans des modes de réalisation particuliers, le support solide d'affinité selon 25 l'invention peut être représenté par la formule suivante (III) :
CI) N
H
dans laquelle :
- [SUI)] représente le support solide du support d'affinité
[SPAC]n et [NUCL] répondent aux définitions précédemment indiquées. En d'autres termes, -NH-(SPAC)õ-NUCL représente un aptamère nucléique dans lequel :
= n est indice valant 0 ou 1, = SPAC représente une chaîne espaceur, et = NUCL représente un acide nucléique se liant spécifiquement à une molécule cible, ledit acide nucléique comprenant de 5 à 120 nucléotides.
Un autre objet selon l'invention est un complexe formé entre un ligand nucléique et une molécule cible, ledit complexe étant formé à la surface d'un support solide tel que défini précédemment. Ledit complexe résulte essentiellement d'interactions no-covalentes entre la molécule cible et le ligand nucléique.
Un objet supplémentaire de l'invention concerne l'utilisation d'un support d'affinité tel que décrit précédemment pour la purification ou la détection d'une molécule cible. Dans le contexte de la purification d'une molécule cible, le support selon l'invention peut être utilisé comme phase stationnaire dans des étapes de filtration, de chromatographie ou d'extraction en phase solide.
La présente invention est également relative à un procédé de purification d'une molécule cible avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact une composition à purifier comprenant une molécule cible d'intérêt avec un support d'affinité tel que défini dans la présente description, afin de foluier un complexe entre (i) les acides nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ledit ligand cible et b) libérer ladite molécule cible à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer ladite molécule cible purifiée.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape a'), l'étape a' suivant l'étape a) et précédant l'étape b), qui consiste en une étape de lavage du support d'affinité avec un tampon de lavage.
On a également montré dans les exemples que l'utilisation à l'étape a') d'un tampon de lavage ayant une hydrophobicité élevée, en particulier une concentration élevée en propylène glycol, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non-spécifique au support d'affinité sans simultanément affecter de manière détectable la liaison du ligand cible au support d'affinité.
A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% en volume, par rapport au volume total de la solution tampon.
Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% englobe les tampons de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 25% M, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, ou au moins 60%.en volume, par rapport au volume total de la solution tampon.
De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol d'au plus 50%. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol comprise entre 20%
et 50%, de préférence entre 30% et 50%.
Selon un mode de réalisation particulier, le tampon de lavage utilisé à
l'étape a') contient à la fois du NaCl et du propylène glycol comme décrit dans les exemples.
De plus, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'étape b) est réalisée par la mise en contact du support d'affinité
avec un tampon d' élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l'EDTA.
A titre illustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration finale d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 30 mM.
L'expression au moins 1 mM englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou IO rriM.
L'expression au plus 30 mM englobe au plus 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 11 mM.
Avantageusement, on utilise, pour la régénération du support d'affinité, un tampon comprenant un mélange de NaC1 et de propylène glycol, qui peut être du même type que celui décrit ci-dessus pour l'étape de lavage.
Au sens de la présente invention et pour les différents objets décrits ci-avant compris dans l'invention, le terme molécule cible (ou substance cible ou encore ligand cible ) tel qu'utilisé ici désigne une molécule capable de se lier de manière spécifique à l'aptamère. 11 peut s'agir de d'acides nucléiques, de protéines ou de substances organiques ou minérales. Les protéines peuvent être tout type de protéines, et en particulier, les protéines plasmatiques.
Par protéine plasmatique , on entend selon l'invention toute protéine, spécialement toute protéine d'intérêt industriel ou thérapeutique, contenue dans le plasma sanguin. Les protéines du plasma sanguin englobent les anticorps, l'albumine, alpha/macroglobuline, antichymotrypsine, antithrombine, antitrypsine, Apo A, Apo B, Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, beta XIIa, C 1-inhibiteur, protéine C-réactive, C7, C 1r, Cl s, C2 C3, C4, C4bP, C5, C6, Cl q, C8, C9, carboxypeptidase N, céruloplasmine, Facteur B, Facteur D, Facteur H, Facteur I, Facteur IX, Facteur V, Facteur VII, Facteur \Ma, Facteur VIII, Facteur X, Facteur XI, Facteur XII, Facteur XIII, Fibrinogène, Fibronectine, Haptoglobine, Hemopexine, Héparine cofacteur II, Histidine rich GP, IgA, IgD, IgE, IgG, III, IgM, Kininase II, Kininogène IIPM, Lysozyme, PAI 2, PAT I, PC1, Plasrnine, Inhibiteur de la plasmine, Plasminogène, Préalbumine, Prokallicréine, Properdine, Protéase Nexine INH, Protéine C, Protéine S, Protéine Z, Prothrombine, TFPI, Thiol-protéinase, Thrornbomoduline, Facteur tissulaire (TF), TPA, Transcolabamine II, Transcortine, Transferrine, Vitronectine, et le Facteur de Willebrand.
Notamment, les protéines plasmatiques englobent les protéines de la coagulation, c'est-à-dire les protéines plasmatiques impliquées dans la chaîne de réactions en cascade aboutissant à la formation d'un caillot sanguin. Les protéines de la coagulation englobent le Facteur I (fibrinogène), le Facteur II (prothrombine), le Facteur V
(proaecélérine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur VIII (facteur anti-hémophilique A), le Facteur IX (facteur anti-hémophilique B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII
(Facteur stabilisant la fibrine ou FSF), la PK (Prékalicrine) le KHPM
(kininogène de haut poids moléculaire), la thromboplastine tissulaire, le cofacteur II de l'héparine (HC1I), la protéine C (PC), la thrombomoduline (TM), la protéine S (PS), le facteur de Willebrand (Wt) et l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI), ou encore les facteurs tissulaires.
Dans certains modes de réalisation, la protéine plasmatique consiste en une protéine de la coagulation à activité enzymatique.
Les protéines de la coagulation à activité enzymatique englobent le Facteur II
(prothrombine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur IX (facteur anti-hémophilique B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII (Facteur stabilisant la fibrine ou FSF) et la PK
(Prékalicrine).
Dans certains modes de réalisation préférés, la protéine plasmatique consiste en une protéine plasmatique humaine, naturelle ou recombinante.
Dans des modes de réalisation préférés, la protéine plasmatique est le Facteur VII humain, naturel ou recombinant.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple I : Obtention d'un support d'affinité
- Tampon de greffage : Acétate de sodium 100mM, pH = 4,2 - Préparation de 1595 pl d'aptamère à 2,5 g/1 dans tampon de greffage soit : 4 mg d' aptamère.
- Pour le greffage, on a utilisé respectivement :
a) pour la réalisation d'un premier support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2CS de séquence SEQ ID N 1 comprenant à son extrémité
5' une chaîne C 11 hydrophile (11-amino-3,6,9-trioxaundécan-ly1) b) pour la réalisation d'un second support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 1.2 de séquence SEQ ID N 2 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaceur composée de 12 méthylènes (CH2) (espaceur C12) et lié à son extrémité
3' à un oligo-dT
c) cpour la réalisation d'un troisième support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2 CS de séquence SEQ ID N 1 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaceur composée de 6 méthylènes (CH2) (espaceur C6) - Préparation d' lml de gel comprenant des groupes acides carboxyliques activés par le NHS à savoir le gel pré-activé NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) en réalisant un lavage avec HC1 1mM, puis un lavage avec le tampon de greffage.
- On a vérifié que le pH dans la préparation d'aptamère dans la solution tampon était de 4,2 - On a mélangé la préparation d'aptamère avec lml de gel pré-activé. Le gel pré-activé
a été incubé en présence des aptameres sous agitation pendant 48h (+/- 2H) à 4 C
- On a ajouté un demi volume réactionnel (7970) de Tampon borate 200mM pH=9 en agitant, puis on a incubé pendant 8h sous agitation à 4 C
5 - On a récupéré le surnageant et on a dosé la quantité d' aptamères non greffés - On a ajouté 2m1 de Tris-U CL 0,1M pH = 8.5 sous agitation pendant 2h30 à 4 C
pour bloquer la réaction de couplage.
- On a réalisé 3 cycles d'ajout /agitation /élimination du surnageant comprenant : 1) lml de Tris-FIC1 0,1M pH = 8.5 puis 2) 1ml d'acétate de sodium à 0,1M NaC1 0,5 M, 10 pH = 4,0, afin d'obtenir un support d'affinité prêt à l'emploi.
A toute fin utile, on indique que le gel NFIS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) est un gel d'agarose réticulé présentant à sa surface des fonctions acides carboxyliques activés par le NHS. Les fonctions acides carboxyliques ont été
introduites à
la surface du gel par greffage de l'acide 6-aminohexanoique. Ce gel d'agarose pré-activé
15 est décrit dans le manuel d'instructions techniques N 71-5000-14 AD daté
de mars 2011 et édité par GE Healthcare. Le gel NHS activated Sepharose 4 Fast Flow présente une densité en fonctions acides carboxyliques activées allant de 16 à 23 ..tino1/m1 de gel.
Les résultats montrent qu'à l'issue de la réaction de couplage, le surnageant du milieu réactionnel ne comprend pas de quantité détectable d'aptamère nucléique, c'est-à-20 dire, dans les conditions d'analyse utilisées, comprend une quantité
d'aptamère inférieure 0,08rrigiml Il peut être déduit de ces résultats que le rendement de greffage est de 100%, ou très proche de 100%.
25 Exemple 2: Utilisation d'un support d'affinité pour la purification de Facteur VII
humain recombinant produit dans le tait de lapines transgéniques.
- Gel : 1ml greffé avec Mapt 2CS- PEG(C11) préparé comme décrit à l'exemple 1, à
4mg/m1 paeké dans une colonne XK-16 (GE)
Ainsi, selon le procédé de couplage de l'invention, il est possible de dérivatiser selon le procédé de l'invention au moins 0,01% des fonctions carboxyliques activées initialement présentes à
la surface du support solide, avantageusement au moins 0,1%, mieux au moins 1%
et encore mieux au moins 2% desdites fonctions carboxyliques activées. A titre de comparaison les taux greffage en chromatographie d'affinité avec les anticorps comme ligand sont souvent inférieurs à lmenl, c'est-à-dire inférieure à 0.06 umol/ml, soit moins de 0,2% de fonctions carboxyliques dérivatisées.
Une dérivatisation d'au moins 0,01% des fonctions carboxyliques activées englobe une dérivatisation d'au moins 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9% et au moins 2%
desdites fonctions carboxyliques activées.
Dans certains modes de réalisation, le pourcentage de fonctions carboxyliques dérivatisées est d'au plus 100%, ce qui englobe au plus 50%, 40%, 30%, et au plus 25%
desdites fonctions carboxyliques activées.
Ainsi, un autre objet de la présente invention, un support d'affinité pouvant être obtenu conformément au procédé et à la méthode décrits ci-avant dans la présente description.
De manière plus générale, la présente invention concerne un support solide d'affinité sur lequel des ligands nucléiques sont immobilisés par une liaison amidique et dans lequel au moins des fonctions carboxyles présentes initialement à sa surface sont dérivatisées par à un ligand nucléique.
Il va de soi que la liaison amidique liant un ligand nucléique au support résulte de la réaction d'une fonction carboxyle présente initialement à la surface du support avec une fonction amine primaire présente au niveau du ligand nucléique.
Dans un mode de réalisation préféré, le support solide d'affinité est un gel de chromatographie.
Un autre objet de la présente invention est un support solide d'affinité sur lequel des ligands nucléiques sont immobilisés par une liaison amidique, ledit support d'affinité étant un gel de chromatographie présentant une densité en ligands nucléiques d'au moins 0,005 urnol/m1 de gel, ce qui englobe au moins 0,01 umol/ml, 0,05 umol/ml, 5 0,1 limai/mi, 0,15 tmol/ml, 0,2 Funol/ml, 0,25 umol/ml, 0,3 umol/ml, 0,35 umo1/m1 et au moins 0,38 umol/m1 de gel.
Dans certains modes de réalisation, la densité en ligands nucléiques est d'au plus 10 umol/ml, ce qui englobe au plus 5 umol/ml, au plus 1 umol/m1 et au plus 0,5 p.mol/ml.
10 Les supports d'affinité selon l'invention peuvent présenter l'une quelconque des propriétes décrites ci-avant pour les supports solides ou les supports d'affinité.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, le support d'affinité peut être un gel utilisable en chromatographie, en filtration ou en extraction en phase solide choisi parmi le groupe constitué par les gels d'agarose, de dextrane, de silice et leurs dérivés.
15 Comme cela est illustré dans les exemples, le support d'affinité peut être un gel d'agarose hautement réticulé sur lequel sont immobilisés les ligands nucléiques. De préférence, le support d'affinité est un gel (autrement dit une phase stationnaire) utilisable dans des procédés de chromatographie d'affinité.
Les supports d'affinité selon l'invention peuvent comprendre à leur surface 20 tout type de ligands nucléiques tels que décrits ci-avant dans la présente description.
Dans certains modes de réalisation, le support d'affinité selon l'invention est caractérisé en ce que les ligands nucléiques sont des aptamères de formule (II) présentés ci-avant.
Dans des modes de réalisation particuliers, le support solide d'affinité selon 25 l'invention peut être représenté par la formule suivante (III) :
CI) N
H
dans laquelle :
- [SUI)] représente le support solide du support d'affinité
[SPAC]n et [NUCL] répondent aux définitions précédemment indiquées. En d'autres termes, -NH-(SPAC)õ-NUCL représente un aptamère nucléique dans lequel :
= n est indice valant 0 ou 1, = SPAC représente une chaîne espaceur, et = NUCL représente un acide nucléique se liant spécifiquement à une molécule cible, ledit acide nucléique comprenant de 5 à 120 nucléotides.
Un autre objet selon l'invention est un complexe formé entre un ligand nucléique et une molécule cible, ledit complexe étant formé à la surface d'un support solide tel que défini précédemment. Ledit complexe résulte essentiellement d'interactions no-covalentes entre la molécule cible et le ligand nucléique.
Un objet supplémentaire de l'invention concerne l'utilisation d'un support d'affinité tel que décrit précédemment pour la purification ou la détection d'une molécule cible. Dans le contexte de la purification d'une molécule cible, le support selon l'invention peut être utilisé comme phase stationnaire dans des étapes de filtration, de chromatographie ou d'extraction en phase solide.
La présente invention est également relative à un procédé de purification d'une molécule cible avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact une composition à purifier comprenant une molécule cible d'intérêt avec un support d'affinité tel que défini dans la présente description, afin de foluier un complexe entre (i) les acides nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ledit ligand cible et b) libérer ladite molécule cible à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer ladite molécule cible purifiée.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape a'), l'étape a' suivant l'étape a) et précédant l'étape b), qui consiste en une étape de lavage du support d'affinité avec un tampon de lavage.
On a également montré dans les exemples que l'utilisation à l'étape a') d'un tampon de lavage ayant une hydrophobicité élevée, en particulier une concentration élevée en propylène glycol, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non-spécifique au support d'affinité sans simultanément affecter de manière détectable la liaison du ligand cible au support d'affinité.
A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% en volume, par rapport au volume total de la solution tampon.
Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% englobe les tampons de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 25% M, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, ou au moins 60%.en volume, par rapport au volume total de la solution tampon.
De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol d'au plus 50%. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol comprise entre 20%
et 50%, de préférence entre 30% et 50%.
Selon un mode de réalisation particulier, le tampon de lavage utilisé à
l'étape a') contient à la fois du NaCl et du propylène glycol comme décrit dans les exemples.
De plus, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'étape b) est réalisée par la mise en contact du support d'affinité
avec un tampon d' élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l'EDTA.
A titre illustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration finale d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 30 mM.
L'expression au moins 1 mM englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou IO rriM.
L'expression au plus 30 mM englobe au plus 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 11 mM.
Avantageusement, on utilise, pour la régénération du support d'affinité, un tampon comprenant un mélange de NaC1 et de propylène glycol, qui peut être du même type que celui décrit ci-dessus pour l'étape de lavage.
Au sens de la présente invention et pour les différents objets décrits ci-avant compris dans l'invention, le terme molécule cible (ou substance cible ou encore ligand cible ) tel qu'utilisé ici désigne une molécule capable de se lier de manière spécifique à l'aptamère. 11 peut s'agir de d'acides nucléiques, de protéines ou de substances organiques ou minérales. Les protéines peuvent être tout type de protéines, et en particulier, les protéines plasmatiques.
Par protéine plasmatique , on entend selon l'invention toute protéine, spécialement toute protéine d'intérêt industriel ou thérapeutique, contenue dans le plasma sanguin. Les protéines du plasma sanguin englobent les anticorps, l'albumine, alpha/macroglobuline, antichymotrypsine, antithrombine, antitrypsine, Apo A, Apo B, Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, beta XIIa, C 1-inhibiteur, protéine C-réactive, C7, C 1r, Cl s, C2 C3, C4, C4bP, C5, C6, Cl q, C8, C9, carboxypeptidase N, céruloplasmine, Facteur B, Facteur D, Facteur H, Facteur I, Facteur IX, Facteur V, Facteur VII, Facteur \Ma, Facteur VIII, Facteur X, Facteur XI, Facteur XII, Facteur XIII, Fibrinogène, Fibronectine, Haptoglobine, Hemopexine, Héparine cofacteur II, Histidine rich GP, IgA, IgD, IgE, IgG, III, IgM, Kininase II, Kininogène IIPM, Lysozyme, PAI 2, PAT I, PC1, Plasrnine, Inhibiteur de la plasmine, Plasminogène, Préalbumine, Prokallicréine, Properdine, Protéase Nexine INH, Protéine C, Protéine S, Protéine Z, Prothrombine, TFPI, Thiol-protéinase, Thrornbomoduline, Facteur tissulaire (TF), TPA, Transcolabamine II, Transcortine, Transferrine, Vitronectine, et le Facteur de Willebrand.
Notamment, les protéines plasmatiques englobent les protéines de la coagulation, c'est-à-dire les protéines plasmatiques impliquées dans la chaîne de réactions en cascade aboutissant à la formation d'un caillot sanguin. Les protéines de la coagulation englobent le Facteur I (fibrinogène), le Facteur II (prothrombine), le Facteur V
(proaecélérine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur VIII (facteur anti-hémophilique A), le Facteur IX (facteur anti-hémophilique B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII
(Facteur stabilisant la fibrine ou FSF), la PK (Prékalicrine) le KHPM
(kininogène de haut poids moléculaire), la thromboplastine tissulaire, le cofacteur II de l'héparine (HC1I), la protéine C (PC), la thrombomoduline (TM), la protéine S (PS), le facteur de Willebrand (Wt) et l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI), ou encore les facteurs tissulaires.
Dans certains modes de réalisation, la protéine plasmatique consiste en une protéine de la coagulation à activité enzymatique.
Les protéines de la coagulation à activité enzymatique englobent le Facteur II
(prothrombine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur IX (facteur anti-hémophilique B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII (Facteur stabilisant la fibrine ou FSF) et la PK
(Prékalicrine).
Dans certains modes de réalisation préférés, la protéine plasmatique consiste en une protéine plasmatique humaine, naturelle ou recombinante.
Dans des modes de réalisation préférés, la protéine plasmatique est le Facteur VII humain, naturel ou recombinant.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple I : Obtention d'un support d'affinité
- Tampon de greffage : Acétate de sodium 100mM, pH = 4,2 - Préparation de 1595 pl d'aptamère à 2,5 g/1 dans tampon de greffage soit : 4 mg d' aptamère.
- Pour le greffage, on a utilisé respectivement :
a) pour la réalisation d'un premier support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2CS de séquence SEQ ID N 1 comprenant à son extrémité
5' une chaîne C 11 hydrophile (11-amino-3,6,9-trioxaundécan-ly1) b) pour la réalisation d'un second support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 1.2 de séquence SEQ ID N 2 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaceur composée de 12 méthylènes (CH2) (espaceur C12) et lié à son extrémité
3' à un oligo-dT
c) cpour la réalisation d'un troisième support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2 CS de séquence SEQ ID N 1 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaceur composée de 6 méthylènes (CH2) (espaceur C6) - Préparation d' lml de gel comprenant des groupes acides carboxyliques activés par le NHS à savoir le gel pré-activé NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) en réalisant un lavage avec HC1 1mM, puis un lavage avec le tampon de greffage.
- On a vérifié que le pH dans la préparation d'aptamère dans la solution tampon était de 4,2 - On a mélangé la préparation d'aptamère avec lml de gel pré-activé. Le gel pré-activé
a été incubé en présence des aptameres sous agitation pendant 48h (+/- 2H) à 4 C
- On a ajouté un demi volume réactionnel (7970) de Tampon borate 200mM pH=9 en agitant, puis on a incubé pendant 8h sous agitation à 4 C
5 - On a récupéré le surnageant et on a dosé la quantité d' aptamères non greffés - On a ajouté 2m1 de Tris-U CL 0,1M pH = 8.5 sous agitation pendant 2h30 à 4 C
pour bloquer la réaction de couplage.
- On a réalisé 3 cycles d'ajout /agitation /élimination du surnageant comprenant : 1) lml de Tris-FIC1 0,1M pH = 8.5 puis 2) 1ml d'acétate de sodium à 0,1M NaC1 0,5 M, 10 pH = 4,0, afin d'obtenir un support d'affinité prêt à l'emploi.
A toute fin utile, on indique que le gel NFIS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) est un gel d'agarose réticulé présentant à sa surface des fonctions acides carboxyliques activés par le NHS. Les fonctions acides carboxyliques ont été
introduites à
la surface du gel par greffage de l'acide 6-aminohexanoique. Ce gel d'agarose pré-activé
15 est décrit dans le manuel d'instructions techniques N 71-5000-14 AD daté
de mars 2011 et édité par GE Healthcare. Le gel NHS activated Sepharose 4 Fast Flow présente une densité en fonctions acides carboxyliques activées allant de 16 à 23 ..tino1/m1 de gel.
Les résultats montrent qu'à l'issue de la réaction de couplage, le surnageant du milieu réactionnel ne comprend pas de quantité détectable d'aptamère nucléique, c'est-à-20 dire, dans les conditions d'analyse utilisées, comprend une quantité
d'aptamère inférieure 0,08rrigiml Il peut être déduit de ces résultats que le rendement de greffage est de 100%, ou très proche de 100%.
25 Exemple 2: Utilisation d'un support d'affinité pour la purification de Facteur VII
humain recombinant produit dans le tait de lapines transgéniques.
- Gel : 1ml greffé avec Mapt 2CS- PEG(C11) préparé comme décrit à l'exemple 1, à
4mg/m1 paeké dans une colonne XK-16 (GE)
30 - Injection d'une composition de facteur FVII humain recombinant purifié, produit dans le lait de lapines transgéniques (FVII-TG) : 100 ou 200 ou 100Oug de FVII-TG
La composition de FVII-TG utilisée pour l'injection est préparée par neutralisation du citrate contenu initialement dans la foiniulation par du CaC12 et modification du tampon de formulation pour obtenir : entre 35 et 40 mM de NaCl et entre 3,2 et 4 rnM de MgC12 - Tampon utilisé pour la chromatographie :Tris 50mM / NaCl 50mM / CaC12 10rnM
/
MgC124-mM
- Débit : 0,5m1/min - Tampon d'Elution : Tris 50mM, EDTA 10mM, pH = 7.4 - Tampon de lavage ou régénération : NaCI1MfPropylène glycol 50%
- Solution de sanitisation utilisée entre chaque essai : 0,1 ou 0,5 M NaOH
(1m1) +
NaCl 1M/Propylène glycol 50% (2x 1m1) Les résultats sont représentés sur les figures 1 à 5.
Les figures 1 et 2 montrent que la presque totalité du facteur VII humain est retenu sur le support d'affinité au moment du passage de la composition à
purifier, quelle que soit la quantité de Facteur VII contenue dans la composition de départ. On a estimé, pour les deux quantités de facteur VII à purifier (100 g et 200 lag) que moins de 10% du Facteur VII contenu dans la composition de départ n'est pas retenu sur le support d'affinité. Les figures 1 et 2 montrent aussi un pic d'élution étroit, ce qui illustre les excellentes propriétés chronaatographiques du support d'affinité de l'invention.
La Figure 3 illustre le profil chromatographique obtenu avec une composition de départ contenant 1 mg de Facteur VII humain. Le profil chromatographique de la Figure 3 est très similaire à ceux représentés sur les figures I et 2, ce qui illustre la très grande capacité de rétention d'un ligand cible du support d'affinité de l'invention.
Les figures 4 et 5 illustrent les profils chromatographiques obtenus par purification d'une quantité de Facteur VII humain de 200 ug (Figure 4) et 1000 g (Figure 5) sur un support d'affinité préparé comme décrit à l'exemple 1 et ayant subi des étapes de traitement drastique de sanitisation avec une solution de sanitisation comprenant un mélange de 0,5 M NaOH et de 504)/0 de propylène glycol. Les profils chrornatographiques obtenus montrent la capacité de résistance d'un support d'affinité selon l'invention à des traitements délétères de sanitisation.
On précise que le même profil chromatographique est obtenu lorsqu'on réalise une succession de purifications de Facteur VII humain transgénique et d'étapes de lavage et de sanitisation. Ceci démontre l'excellente stabilité du support d'affinité, qui permet de réaliser la purification de ligands cibles d'intérêt de manière extrêmement reproductible.
Exemple 3 : rendement de greffage en fonction de la quantité d'aptamères utilisés et capacité de charge des supports d'affinités obtenus L'influence de la quantité d'aptamères sur le rendement de greffage et la capacité de charge des supports d'affinité a été étudiée pour les aptamères Mapt 2CS-(C11 hydrophile) et Mapt 2.2CS-(C1 I hydrophile). Le protocole de greffage utilisé
est identique à celui décrit dans l'exemple 1. L'aptamère Mapt 2.2CS-(C11-hydrophile) résulte du couplage de Mapt 2.2CS de séquence SEQ ID N 3 et du 11-(tiifluoroacétamido)-3,6,9-trioxaundécan-l-y1-[(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)1-phosphoramidite (Link Technologies) suivie de la génération du groupe phosphodiester par oxydation et élimination du groupe cyanoéthyle et de la déprotection subséquente de la fonction amine primaire présente à l'extrémité de la chaîne espaceur. Mapt 2.2Cs est dirigé
contre le facteur VII.
La capacité de charge (ou autrement dit la capacité de rétention) des supports d'affinité, exprimée en mg de FVII par ml de gel, a été évaluée par injection d'une composition de FVII humain recombinant dans le tampon "Tp5" (Tris 50 mM, CaC12 10mM, pH" 7,5).
Les tableaux 1 et 2 ci-dessous présentent le rendement de la réaction de greffage des aptamères Mapt 2CS-PEG(C11) et Mapt 2.2CS-PEG(C11) sur le gel pré-activé NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) en fonction de la quantité
d'aptamères engagée dans la réaction par ml de gel. Le rendement a été
déterminé par quantification de la quantité d'aptamères présents dans le surnageant à
l'issue de la réaction de couplage par PCR quantitative.
La quantité finale d'aptamères greffés par ml de gel est également indiquée dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous.
Tableau 1 : Influence de la quantité d'aptamère Mapt 2CS par ml de gel sur le rendement de la réaction de couplage et les caractéristiques du support d'affinité
obtenu Quantité Rendement Quantité Quantité Pourcentage des d'aptamères de la réaction d'aptamères d'aptamères sites acides engagée en de couplage greffés en greffés en carboxyliques du mg/mi de gel mg/m1 de gel fflol/m1 de gel gel couplés à
un aptamère 0.1 99,97 % 0,1 0,007 0.04 %
0.2 99,96% 0,2 0,014 0.07 %
0.6 99,95% 0,6 0,042 0.21%
....
0.8 99,94% 0,8 0,056 0.29%
1,0 100% 1,0 0,07 0.36%
2,0 100% 2,0 0,12 0.6%
3,5 100% 3.5 0,23 1.2%
6,0 97% 5.8 0.39 2%
_ Tableau 2: influence de la quantité d'aptamère Mapt 2.2 CS par ml de gel sur le rendement de la réaction de couplage et les caractéristiques du support d'affinité obtenu Quantité Rendement Quantité Quantité Pourcentage des d'aptamères de la réaction d'aptamères d'aptamères sites acides engagée en de couplage greffés en greffés en carboxyliques du mg/mi de gel mg/mi de gel ginol/m1 de gel gel couplés à
un aptamère 0.1 100% 0,1 0,007 0.04 %
3,5 100% 3,5 0,23 1.2%
6,0 92,6% 5,55 0.37 1.9%
_ Les rendements de couplage obtenus pour les aptamères Mapt 2.2Cs-PEG(C11) et Mapt2Cs-PEG(C11) sont compris entre 90% et 100% pour toutes les quantités d'aptamères testées. De manière remarquable, il est possible de greffer jusqu'à
0.4 urnol par ml de gel, ce qui correspond à un pourcentage de fonctionnalisation des fonctions acides carboxyliques activées présents à la surface du gel de 2%.
La capacité de charge des supports d'affinité pour le FVII humain recombinant varie de manière linéaire avec la quantité d'aptamères greffés par ml de gel.
On n'observe donc pas d'effet de saturation de la capacité de charge du support et donc de perte de fonctionnalité des aptamères pour les quantités élevées d'aptamères greffés.
Au vu de ces résultats, il pourrait être possible d'obtenir des supports d'affinité
présentant une densité d'aptamères greffés supérieure à 6mg/m1 et ayant une capacité de charge pour le FVII supérieure à 8 mg de FVII recombinant humain par mL de gel.
Le tableau 3 ci-dessous présente la capacité de charge des supports d'affinité
en fonction du nombre d' aptamères greffés à leur surface.
Tableau 3: Capacité de charge des supports d'affinité obtenus Mapt 2CS-PEG(C11) Mapt 2.2CS-PEG(C11) Quantité d'aptamères 0,1 1,00 3,50 5,80 1,00 3 ,50 5,60 greffés en mg/m1 de gel Quantité d'aptamères 0.007 0.07 0.23 0.39 0.07 0.23 0.37 greffés en umol/m1 de gel Capacité de charge en 0,05 1,00 3,60 5,40 1,6 5,2 8,0 FVII humain exprimée en mg de FVII/ml de gel Exemple 4 : Essais comparatifs de greffage chimique d'acides nucléiques sur un support solide pré-activé par des groupes NHS
4.1. Essais comparatifs en utilisant différentes conditions de pH
On a réalisé des essais comparatifs de greffage du support pré-activé de départ utilisé à l'exemple 1, dans des conditions de pH neutre ou légèrement alcalin, comme décrit dans le Tableau 4 présenté ci-après :
5 Tableau 4 Modification Mapt2 Quantité Conditions:
(nature de Essai CS d'aptamère Tampon de greffage l'espaceur) Oligo I Essai 1 6,5mg MOPS 100mM, CaC12 10mM, Oligo 1 Essai 2 6,5mg 'pH7,0 (Condition 1) 5' amine espaceur C6 MOPS 100mM, CaC12 10mM NaC1 Oligo 1 Essai 3 6,5mg 0,5M , pH7,0 (Condition 2) NaFIC03 0,2M, NaC1 0,5M, pH 8.3 5' amine Essai 4 3,5mg = (Condition 3) Oligo 4 espaceur C12 NaHCO3 0,2M, NaC1 2 M, pH 8.3 3'dT Essai 5 3,5mg (Condition 4) 5' amine MOPS 100mM, CaC12 10mM, Oligo 5 espaceur C11 Essai 5 6,5mg Na.CI 0,5M pH7,0 (Condition 2) hydrophile On a utilisé le protocole suivant :
1m! de gel rincé avec 15m! HClImM puis 7m1 de tampon de greffage. Ajout des 6,5 ml (ou 3,5m1) de Mapt2CS à 1g/1 et incubation du gel avec Mapt2CS pendant 4 heures 10 à température ambiante - Neutralisation des sites activés par un tampon Tris 50mM pH = 7.4 On a mesuré la quantité d'aptamères non greffés en sortie de colonne après l'étape de greffage. Les résultats montrent que le rendement de greffage varie de 0%
à 10% au maximum, quelles que soient les conditions de greffage décrites dans le Tableau 1 qui ont été utilisées. Contrairement à ce qu'ont observé Goss et al.
(supra), une salinité
élevée n'est pas suffisante pour augmenter le rendement de couplage.
4.2. Essais comparatifs en neutralisant les charges négatives des acides nucléiques à
greffer par l'ajout de cations divalents ou par l'ajout de NaCI.
On a utilisé le protocole suivant :
- 1000. de gel rincé avec 15ml HC1 imM puis 700p1 de tampon de greffage /
Ajout des 650 ul de Mapt2CS (oligo 5) à 130mg,/1 et incubation du gel avec Mapt2CS
pendant 4 heures à température ambiante - Conditions mises en oeuvre :
^ Condition 1: Tampon MOPS 92mM pH = 7,0, CaCl2 200mM, MgC12 200mM
it Condition 2: Tampon MOPS 92mM pH ¨ 7,0, CaC12 200mM, MgC12 200mM
= Condition 3 : NaHCO3 0,2M, NaC10,5M, pH 8.3 ^ Condition 4 : NaHCO3 0,2M, NaC12 M, pH 8.3 On a mesuré la quantité d'aptamère non greffé en sortie de colonne après l'étape de greffage. Les résultats montrent que le rendement de greffage, quelles que soient les conditions de greffage décrites ci-dessus, varie de 0% à 10% au maximum.
Il résulte de l'ensemble des expériences ci-dessus présentées que la mise en uvre de l'étape de couplage en présence d'un pH basique ou neutre tel que recommandé
dans l'état de la technique ou dans les notices d'utilisation des gels pré-activés fournit un rendement de couplage des aptamères sur le gel pré-activé très faible c'est-à-dire inférieur à 10% .
L'augmentation de la force ionique par utilisation d'une solution de NaCl à
une concentration allant jusqu'à 2M ou l'utilisation de sels de cations divalents susceptibles de masquer les charges négatives des aptamères ne permettent pas d'augmenter le rendement de couplage.
Contrairement à ce qu'aurait pu attendre l'homme du métier, la mise en oeuvre de l'étape de couplage en présence d'un pH acide permet d'augmenter de manière significative le couplage des aptamères sur le support pré-activé sans nuire à
la capacité de liaison desdits aptamères à leur protéine cible.
Exemple 5 Modulation des paramètres de mise en oeuvre de mise en uvre de la réaction de couplage selon la présente invention L'influence du pH, de la température et de la durée de réaction a été évaluée afin de déterminer les paramètres contrôlant la réaction de couplage des fonctions acides carboxyliques activées du gel ( NHS-activated Sepharose 4 fast Flow) avec les fonctions amines primaires aliphatiques présentes sur les chaînes espaceurs des aptamère Mapt 2CS-PEG (C11).
Le protocole suivant a été suivi :
- Le tampon de greffage a été préparé à l'aide partir d'acétate de sodium 100 mM avec ajustement au pH désiré sauf pour la mise en uvre de la réaction à un pH =
8,3 où un tampon de NaHCO3 a été préparé.
- Une solution d'aptamères Mapt 2CS-PEG (C11) à une concentration de 2 g/L
dans le tampon de greffage a été préparée.
-1 mL de la solution d'aptamère a été mélangé à 1 mL de gel et incubé à la température désirée, sous agitation. L'avancement de la réaction de couplage est suivi par quantification des aptamères présents dans le surnageant.
- A l'issue du suivi cinétique de la réaction, le milieu réactionnel a été
additionné de 1 mL
de tampon borate à 200 mM à pH 9 sous agitation puis incubé pendant 3h sous agitation à
4 C. Le surnageant a été prélevé pour le dosage final du surnageant. La neutralisation des fonctions acides carboxyliques résiduelles du gel a été effectuée par ajout de 2 mL de tampon Tris-HC1 à 0,1 M et à pH = 8,5 sous agitation pendant 2h30 à 4 C.
- 3 cycles d'ajout /agitation /élimination du surnageant comprenant : 1) iml de Tris-HC1 0,1M pH = 8.5 puis 2) lml d'acétate de sodium à 0,1M NaC1 0,5 M, pH = 4,0 ont été
effectués.
- Le surnageant a été éliminé. Le gel ainsi obtenu est stocké dans du tampon Tpl additionné de 0,2% d'azide pour stockage à 4 C.
Les résultats du suivi cinétique de la réaction de couplage en fonction de la température, de la durée de réaction et du pH sont présentés dans le tableau 5 ci-après :
Tableau 5 : Influence de la température de réaction (TA: température ambiante), du pH et de la durée de réaction pH T C Durée Rdt de réaction (%) Influence du 3,8 5 C 48h 99,8 pH 4,3 5 C 48 h 98,4 4,8 5 C 48 h 75,9 5,6 5 C 48 h 64,9 8,3 5 C 481i 10 Influence de la 4,3 5 C 24h 99,5 température et 4,3 5 C 2h 100 de la durée de 4,3 5 C 4h 100 réaction 4,3 5 C 6h 100 4,3 5 C 8h 100 4,3 5 C 24h 100 4,3 5 C 48 h 97,8 4,3 TA* lh 100 4,3 TA* 2h 100 4,3 TA* 3h 100 4,3 TA* 3h 99,8 Comme cela est illustré dans le tableau 5 ci-dessus, le pH est un paramètre crucial pour la mise en oeuvre de la réaction de couplage selon l'invention.
La mise en oeuvre de la réaction selon les conditions décrites dans l'état de la technique, c'est-à-dire à un pH basique de 8,3, offre un rendement de couplage très faible d'au plus 10%. La diminution du pH permet d'améliorer de manière significative le rendement de la réaction. On observe en particulier un rendement d'au moins 98% pour un pH d'environ 3,8 à 4,3. Un tel résultat est tout à fait surprenant : l'homme du métier s'attendrait à un faible rendement de couplage à ces pH en raison de la dégradation des acides nucléiques par hydrolyse acide et de la diminution de la réactivité des amines primaires. Au vu de ces résultats expérimentaux, il apparaît que la réaction de couplage peut être conduite indifféremment à basse température ou à température ambiante.
De manière remarquable, les supports d'affinité obtenus à pH = 3,8 ou à
température ambiante à pH = 4,3 présentent une capacité de charge (c'est-à-dire une capacité de rétention) du Facteur VII recombinant humain équivalent aux supports obtenus à pH = 4,2 et à 5 C. De manière générale, les capacités de charge obtenues sont particulièrement élevées ce qui traduit non seulement un haut taux de greffage des aptamères mais aussi le maintien de la capacité des aptamères à se lier spécifiquement à
leur protéine cible. En d'autres ternies, la mise en uvre à température ambiante et à un pH inférieur à 4,5 de la réaction de couplage entre les fonctions acides carboxyliques activées du support et les fonctions amines primaires présentes au niveau de I' espaceur des aptamères pefinet non seulement d'obtenir un rendement de greffage proche de 100%
mais également un maintien de l'intégrité fonctionnelle des aptamères.
Exemple 6 : modes de réalisation additionnels d'un support d'affinité
D'autres supports d'affinité ont été préparés en faisant varier (i) les conditions de greffage ainsi que (ii) les types d'aptamères utilisés.
6.1. Types d'aptamères greffés Concernant les types d'aptamères, on a utilisé respectivement des aptamères comprenant un polynucléotide ADN et des aptamères comprenant un polynucléotide ARN. De plus, pour certains aptamères, le polynucléotide est lié à une chaîne espaceur par son extrémité 5' alors que pour les autres aptamères, le polynucléotide est lié à une chaîne espaceur par son extrémité 3'. Egalement, on a utilisé des aptamères comprenant une chaine espaceur hydrophile ou une chaîne espaceur hydrophobe.
Les aptamères utilisés à l'exemple 6 sont les suivants :
Paptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt 2 CS" de séquence SEQ ID N
1 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C11 hydrophile décrite pour la préparation du premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo5 (5'Amine C11 hydrophile)" dans le Tableau 6;
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt 2 CS" de séquence SEQ
comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C6 hydrophobe décrite pour la préparation du troisième support d'affinité divulgué au paragraphe "c" de l'exemple 1 et comprenant à son extrémité 3' un résidu de désoxyribothymidine inversé (3'-dT-5`), ledit 5 aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo2 (S'Amine C6 et 3' dT) dans le Tableau 6;
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt2 CS" de séquence SEQ ID
comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C12 hydrophobe décrite pour la préparation du second support d'affinité divulgué au paragraphe "b" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo3 (5' Amine C12)" dans le Tableau 6;
10 - l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt2 CS" de séquence SEQ
comprenant à son extrémité 3' la chaîne espaceur C6 hydrophobe décrite pour la préparation du troisième support d'affinité divulgué au paragraphe "c" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo7 (3' Amine C6)" dans le Tableau 6;
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ARN "Mapt ARN Anti FIXa" de séquence 15 SEQ ID N 4 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C11 hydrophile décrite pour la préparation du premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)"
de l'exemple 1 et comprenant à son extrémité 3' un résidu de désoxyribothymidine inversé
(3'-dT-5'), ledit aptamère étant désigné "Mapt ARN Anti Ma 5' Amine C11 hydrophile" dans le Tableau 6.
20 On a aussi préparé un support d'affinité sur lequel a été greffé un aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt1.2 CSO" de séquence SEQ ID N 5 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur Cl 1 hydrophile décrite pour la préparation du premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt1.2CSO oligo5 (S'Amine C11 hydrophile)". Les résultats concernant ce 6.2. Conditions de greffage de l'aptamère ARN
L'aptamère ARN de séquence SEQ ID N 5 a été greffé dans les conditions - 300 ig d'aptamère ARN ont été incubés avec 500 uL de gel, à la concentration finale de gel de 0,6 g/L.
- la réaction de greffage a été réalisée pendant 2,5 heures à 17 C (TA) et à
pH 4,2.
- puis la réaction a été stoppée par neutralisation avec un tampon borate 200 rnM
pendant 2,5 heures à 17 C et à pH 9.
- on a mesuré la quantité résiduelle d'aptamères non greffés dans le surnageant afin de déterminer le rendement de greffage, par électrophorèse en gel d'agarose et coloration au GelRed (à 3,5%), puis comparaison avec une gamme étalon de quantités connues de l'aptamère ARN chargées sur d'autres pistes du même gel d'électrophorèse.
Les résultats montrent que le rendement de greffage était supérieur à 99%. Ces résultats montrent que le procédé de greffage à un pH inférieur à 5 est efficace pour le greffage de tous les types de ligands nucléiques, que ces ligands nucléiques comprennent un polynucléotide ADN ou un polynucléotide ARN (et donc également les ligands nucléiques comprenant un polynucléotide hybride ADN/ARN), y compris les ligands comprenant un polynucléotide à bases modifiées, y compris un polynucléotide ARN à
bases modifiées.
6.3. Efficacité de la réaction de greffage La réaction de couplage a été réalisée comme décrit à l'exemple 5, sauf indication spécifique concernant la durée, la température et le pH. Les résultats sont présentés dans le Tableau 6 ci-après.
Tableau 6 Taux de greffage Conditions de visé Rdt de greffage Aptamère greffage*
(mg/mL de (%)**
(durée; Temps; pH) gel)**
48h; 5 C; pH 4,3 4,4 r---f100 48h; 5 C; pH 3,8 4,4 100 Mapt2CS oligo5 2h; 5 C; pH4,3 4,4 Fr, 100 (5' Amine Cil lh; TA; p114,3 4,4 100 Hydrophile) 2h; 5 C; sans 4,4 100 neutralisation pH
Mapt2CS oligo2 (5' Amine C6 et 3'2h; TA; pH4,3 0,7 100 dT) Mapt2CS oligo3 (5' 2h; TA; pH4,3 0,7 7--=, 100 Amine C12) Mapt2CS oligo7 (3' 2h; TA; pH4,3 0,8 100 Amine C6) Mapt1.2CSO oligo5 (5' Amine Ci 1 2h; 5 C; pH4,3 ND*** 100 Hydrophile) Mapt ARN Anti FIXa 5'Amine C11 2h; TA; pH4,2 0,6 100 Hydrophile et 3'dT5' Durée de la réaction de couplage exprimée' en heures; Température exprimée en degrés Celsius ¨ TA= température ambiante (18 C-25 C) ** Le taux de greffage visé est atteint pour un rendement de greffage de 100%.
Le rendement de greffage a été mesuré comme décrit à l'exemple 3 *** ND= Non Déterminé
Les résultats du tableau 6 montrent que, pour un aptamère donné, un rendement de greffage de 100% est obtenu quelles que soient les conditions testées.
En particulier, ces résultats confirment ceux de l'exemple 4, et plus spécifiquement les résultats du Tableau 5, qui montrent qu'un rendement de greffage maximal est obtenu, même au pH très acide de 3,8. Ces résultats confirment aussi la cinétique rapide de la réaction de couplage réalisée à température ambiante.
Il est également montré que l'étape de neutralisation à pH 9, subséquente à la réaction de couplage, n'est pas essentielle pour l'obtention d'un rendement de greffage maximal, puisque le taux et le rendement de greffage dans ces conditions sont identiques à
ceux observés lorsque l'étape de neutralisation est réalisée (voir Tableau 6 ci-dessus).
Les résultats du Tableau 6 montrent aussi que la nature hydrophile ou hydrophobe de la chaîne espaceur de Paptamère n'a pas d'influence sur l'efficacité du greffage. Il est également montré que le greffage est aussi efficace lorsque la chaîne espaceur, hydrophile ou hydrophobe, est liée à l'extrémité 5' ou à l'extrémité
3' du polynucléotide ADN ou ARN.
On ajoute que la neutralisation préalable des charges du polynucléotide ADN
par incubation de celui avec un Polybrenee (Hexamethrine bromide, 1,5-Dimethy1-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide) rend impossible la réalisation de la réaction de couplage.
6.4. Fonctionnalité des supports d'affinité.
On a testé la fonctionnalité de supports d'affinité sur lesquels a été
immobilisé
Paptamère "Mapt2CS oligo5" décrit au 6.1. ci-dessus, respectivement dans les conditions de température, durée et pH de la réaction de couplage suivantes :
- Conditions n 1 : 48h, 5 C, pH 4,2;
- Conditions n 2 : 48h, 5 C, pH 3,8;
- Conditions n 3 : 2h, 5 C, pH 4,2; et = - Conditions n 4: lh, TA (Température Ambiante), pH 4,2.
Pour le test, on a utilisé 500 Fil de gel greffé avec les aptamères dans chacune des conditions n 1 à 4 ci-dessus, à la concentration finale de 4,4 mg/mL.
Pour chacun des supports de chromatographie, on a injecté 2,7 mg d'une composition de FVII humain recombinant purifié, produit dans le lait de lapines tyransgéniques (FVII-TG).
La composition de FVII-TG utilisée pour l'injection est préparée par neutralisation du citrate contenu initialement dans la formulation par du CaC12 et modification du tampon de foimulation pour obtenir : entre 35 et 40 naM de NaCl et entre 3,2 et 4 mM de MgC12 - Tampon utilisé pour la chromatographie : Tris 50mM / CaC12 10mM, pH 7,5 - Débit : 0,5m1/min - Tampon d'Elution : Tris 50mM, EDTA 10mM, pH = 7,5 Les résultats sont représentés sur les figures 6 à 9, respectivement pour les conditions de couplage n 1 à 4 décrites ci-dessus. Les résultats sont aussi réprésentés dans le Tableau 7 ci-dessous.
Tableau 7 Conditions de couplage fraction de FMI non fraction de FVH éluée (durée; Température; pH) retenue sur la colonne (1)/0) (%) n 1 : 48h; 5 C; pH 4,2 5 95 n 2 : 48h; 5 C; pH 3,8 24 76 n 3 : 2h; 5 C; pH 4,2 15 85 n 4 : lh; TA; pH 4,2 5 95 5 Les résultats des figures 6 à 9 et du Tableau 7 ci-dessus montrent que la presque totalité du facteur VII humain est retenu sur le support d'affinité au moment du passage de la composition à purifier, à l'exception du support d'affinité
préparé par greffage selon les conditions n 2 (4814 5 C, pH 3,8) pour lequel on observe un taux de rétention du facteur VII qui est substantiel mais pas maximal.
10 Les résultats montrent aussi que la totalité du facteur VII humain retenu sur le support d'affinité est libéré lors de l'étape d'élution.
Ces résultats montrent que des supports d'affinité totalement fonctionnels peuvent être préparés en utilisant les conditions de greffage n 1 et n 3-4, ce qui signifie que les conditions de température et de durée du greffage ne sont pas absolument En particulier, on oberve que les conditions de couplage des aptamères pendant une durée courte (1 heure) et à température élevée (température ambiante) (i) permet un taux de greffage de 100% des aptamères et (ii) n'entraîne aucune altération dans En revanche, les résultats moins bons obtenus avec le support d'affinité
préparé par couplage des aptamères à pH 3,8 montrent que les conditions de pH
sont importantes pour le maintien de l'intégrité des aptamères gerffés, et en partculier pour le maintien de l'aptitude des aptamères greffés à se lier au facteur VII humain cible. Lorsque 25 la réaction de couplage est réalisée à pH 3,8, on obtient un support d'affinité qui reste fonctionnel pour enrichir sélectivement un échantillon de départ en facteur VII humain.
Toutefois, un tel support d'affinité ne peut être valablement utilisé dans le cadre d'un procédé industriel de purification du facteur VII humain, en raison de la perte importante de facteur VII (plus de 20%) et donc du caractère économiquement désavantageux d'un tel procédé.
Exemple 7 : Maintien de Pintergrité du support d'affinité dans des conditions d'uilisation indutrielle impliquant des contacts en milieux biologiques et une étape de sanitisation puissante (soude à la concentration 1M) Dans l'exemple 7, on montre que des supports d'affinité tels que définis dans la présente description conservent leur capacité de rétention et d'élution de la protéine cible, même après de nombreux cycles d'utilisation, dans des conditions de mise en oeuvre industrielles 7.1. Préparation des supports de greffage Trois supports de greffage ont été préparés comme décrit à l'exemple 1, en utilisant respectivement chacun des trois a.ptamères suivants :
- support de greffage n 1 : un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2CS
de séquence SEQ ID N 1 comprenant à son extrémité 5' une chaîne C11 hydrophile (11-amino-3,6,9-trioxaundécan- I yl), - support de greffage n 2 : un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2.2CS de séquence SEQ ID N 3 comprenant à son extrémité 5' une chaîne C11 hydrophile (11-amino-3,6,9-trioxaundécan-ly1), et - support de greffage n 3 : un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2.2 CS de séquence SEQ ID N 3 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaeeur composée de 6 méthylènes (CH2) (espaceur C6) Les rendements de greffage ont été respectivement de 100% (support de greffage n 1), de 93% (support de greffage d 2) et de 87% (support de greffage n 3).
La capacité statique théorique des supports d'affinité préparés, c'est-à-dire la quantité de FVII humain qui devrait être retenue sur les supports d'affinité
si chacun des aptamères greffés liait une molécule de FVII humain, était respectivement de 18.7 mg par mililitre de support (support n 1), 17,3 mg/m1 (support n 2) et 16,3 mg/mi (support n 3).
7.2. Conditions opératoires du procédé de purification de FVII humain.
On a utilisé une composition de FVII-TG enrichie en FVII humain, la concentration finale de FVII-TG étant d'environ 50 000 ppm, ladite composition comprenant une forte proportion de formes des-gla de FVII (foimes inactives de FVII) et ladite composition possédant une activité spécifique FVII d'environ 0,4 (activité exprimée en activité amidolytique/antigène).
Le protocole général est le suivant :
- équilibrage du support dans le tampon TP4 (Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, MgC12 4 mM, pH 7,5), en utilisant un volume de tampon de cinq fois le volume du support greffé, - injection de la matière première (composition de FVII-TG), préalablement dialysée contre un tampon Tris 50 mM, CaC12 10 mM, MgC12 4 mM, - lavage avec le tampon de lavage (huit fois le volume du support greffé), et - équilibrage avec le tampon d'équilibrage Tris 50 mM, EDTA I 0 mM à pH 7,5 (trois fois le volume du support greffé) 7.3. Propriétés des supports pour la purification du FVII humain_ On a testé la capacité des trois supports préparés comme décrit au paragraphe 7.1.
ci-dessus à retenir sélectivement le FVlla humain actif On a déterminé que les trois supports avaient une capacité dynamique de rétention du FVIIa humain d'environ 10 mg de FVIIa humain par mililitre de support greffé, ce qui représente entre 53% et 58% de la capacité statique maximale théorique calculée au pragraphe 7.1. ci-dessus. Ces résultats montrent que les aptamères respectifs greffés sur les trois supports sont largement accessibles et fonctionnels.
On a aussi montré que chacun des trois supports d'affinité préparés comme décrit au paragraphe 7.1. ci-dessus était capable de retenir sélectivement les molécules de FVII
humain ayant un domaine GLA actif, comme cela est exposé dans le Tableau 8 ci-dessous.
Tableau 8 Support Support Support d'affinité n 1 d'affinité n 2 d'affinité n 3 Départ FVII (D0280) mg 17 17 15 FVIIam UI 13906 139060 12270 Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,41 0,41 0,41 Non retenu FVII (D0280) mg 7,7 9,7 7,8 FVflam UI 94 273 134 Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,006 0,014 0,009 Rendement FVII (DO) % 45,5 56,9 52,1 'Rendement FVIlam % 0,7 2,0 1,1 Eluat FVII (D0280) mg 7,7 7,3 6,3 FVIIam UI 12270 10675 9055 Ratio FVIIam / FVII:Ag 080 0 71 0,72 Rendement FVII (DO) % 45,3 42,9 42,0 Rendement FVIIam % 88,2 76,8 73,8 Les résultats du Tableau 8 montrent que, à partir d'une composition comprenant seulement 41% de FVII humain à domaine GLA actif par rapport à la quantité
totale de FVII humain présente dans ladite composition, on obtient une composition finale enrichie en FVII humain qui comprend de 70% à 80% de FVII humain à domaine GLA actif par rapport à la quantité totale de FVII humain présente dans ladite composition enrichie. Ces résultats montrent que les trois supports d'affinité (i) petniettent la purification de FVII
humain et (ii) permettent d'obtenir une composition de FVII purifié qui est enrichie en forme active de FVII humain, par élimination des foi mes inactives de FVII
humain.
7.4. Résistance des supports d'affinité vis-à-vis d'un traitement par la soude.
On a testé la résistance des trois supports d'affinité à un traitement prolongé par une solution de soude à 1M.
Les supports préparés comme décrit au paragraphe 7.1. ont été mis en contact avec une solution de soude à 1M pendant une durée de 100 heures. Après lavage pour éliminer la soude, la capacité de chacun des trois supports d'affinité à purifier le FVII humain a été
mesurée. Les résultats sont présentés dans le Tableau 9 ci-dessous.
Tableau 9 Support d'affinité Support Support n 1 d'affinité n 2 d'affinité n 3 Départ FVI1 (D0280) mg 17 17 15 FVIIam UI 13906 13906 12270 Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,41 0,41 0,41 Non retenu FVII (D0280) mg 8,1 9,2 7,9 FVIIam UI 156 434 163 Ratio FVIIam / FV1I:Ag 0,010 0,024 0,010 'Rendement FVII (DO) % 47,7 53,9 52,5 Rendement FVIIam % 1,1 3,1 1,3 ,Eluat FVII (D0280) mg 7,9 7,1 6,9 FVIIam UI 13560 11500 12215 Ratio FVIIam / FV11:Ag 0,9 0,82 0,89 Rendement FVII (DO) % 46,5 41,5 45,7 Rendement FVIIam % 97,5 82,7 99,6 Les résultats du Tableau 9 montrent qu'un traitement par de la soude à 1M
pendant une très longue durée (100 heures) n'entraîne aucun changement significatif dans la capacité des supports n 1, n 2 et n 3 à purifier le FVII humain.
7.5. Résistance des supports d'affinité vis-àvis d'un contact prolongé avec divers milieux biologiques.
On a testé la résistance des trois supports d'affinité à un traitement prolongé avec 5 divers milieux biologiques, qui peuvent être utilisés comme produits de départ dans des procédés de purification de FVII humain. On a testé en particulier les deux milieux biologiques suivants : (i) un cryosurnageant de plasma sanguin humain et (ii) une solution de lait clarifié, le lait pouvant constituer une source de FVII humain, par exemple lorsque le FVII humain est produit dans le lait d'animaux transgéniques pour le gène codant le 10 FVII humain, Le support d'affinité n 1 préparé comme décrit au paragraphe 7.1. a été mis en contact avec (i) un cryosurnageant plasmatique humain ou (ii) un lait clarifié, pendant une durée de 100 heures, Après lavage pour éliminer le milieu biologique testé, la capacité de chacun des trois supports d'affinité à purifier le FVII humain a été mesurée.
Les résultats 15 sont présentés dans le Tableau 10 ci-dessous.
Tableau 10 Support n 1 après Support n 1 après 100 100 heures heures d'incubation en d'incubation en cryo lait clarifié
surnageant Départ FVII (D0280) mg 17 17 FVIIam Ul 13906 13906 Non retenu FVII (D0280) mg 9,3 10,2 FVIIam UI 496 192 Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,027 0,009 Rendement FVII (DO) % 54,6 60,2 Rendement FV1Iam % 3,6 1,4 Eluat FVII (D0280) mg 7,3 7,1 FVIIam UI 12605 13180 Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,87 0,93 Rendement FVII (DO) % 42,6 41,8 rendement FVIIam % 90,6 94,8 Les résultats du Tableau 10 montrent que l'incubation d'un support d'affinité
tel que défini dans la présente description avec des milieux biologiques qui représentent des produits de départ pour la purification de FVII humain, pendant une très longue durée (100 heures), n'entraîne aucun changement significatif dans la capacité dudit support à
purifier le FVII humain.
7.6. Résistance de supports d'affinité à la réalisation de cycles de purification successifs On a testé la résistance du support d'affinité n 3 préparé comme décrit au paragraphe 7.1 ci-dessus à subir des cycles successifs de purification de FVII
humain.
Chaque cycle de purification comprenait les étapes suivantes :
- équilibrage du support d'affinité en tampon TP4 (5 fois le volume du support d'affinité), - simulation de mise en contact avec la composition à purifier: injection de tampon TP4 (5 fois le volume du dupport d'affinité), élution avec le tampon d'élution (5 fois le volume du support d'affinité), sanifisation avec une solution de NaOH 1 M durant 10 minutes (5 fois le volume du support d'affinité), et - ré-équilibrage du support d'affinité avec le tampon TP4 (10 fois le volume du support d'affinité).
On a réalisé respectivement 15 ou 30 cycles de purification ci-dessus avec le support d'affinité n 3 et on a déterminé la capacité dudit support à l'issue des 15 ou 30 cycles à purifier le FVII humain. Les résultats sont réprésentés sur le Tableau 11 ci-dessous.
Tableau 11 Support d'affinité n 3 -Support d'affnité n 3 -15 cycles 30 cycles Départ FVII (D0280) mg 15 15 >Non retenu FVII (D0280) mg 7,2 6,5 Rendement FVII (DO) % 48,3 43,1 Eluat FVII (D0280) mg 6,5 6,2 Rendement FVII (DO) % 43,0 41,0 Les résultats du Tableau 11 montrent que la capacité d'un support d'affinité
tel défini dans la présente description à purifier le FVII humain est inchangée, même après au moins 30 cycles de réalisation d'un procédé mimant la purification d'une protéine cible.
Tableau 12 liste des séquences N SEQ ID Description SEQ ID N 1 Aptamère Mapt 2 CS
SEQ ID N 2 Aptamère Mapt 1.2 SEO ID N 3 Aptamère Mapt 2.2 CS
SEQ ID N 4 Aptamère Mapt ARN Anti FIXa SEQ ID N 5 Aptamère Mapt 1.2 CSO
La composition de FVII-TG utilisée pour l'injection est préparée par neutralisation du citrate contenu initialement dans la foiniulation par du CaC12 et modification du tampon de formulation pour obtenir : entre 35 et 40 mM de NaCl et entre 3,2 et 4 rnM de MgC12 - Tampon utilisé pour la chromatographie :Tris 50mM / NaCl 50mM / CaC12 10rnM
/
MgC124-mM
- Débit : 0,5m1/min - Tampon d'Elution : Tris 50mM, EDTA 10mM, pH = 7.4 - Tampon de lavage ou régénération : NaCI1MfPropylène glycol 50%
- Solution de sanitisation utilisée entre chaque essai : 0,1 ou 0,5 M NaOH
(1m1) +
NaCl 1M/Propylène glycol 50% (2x 1m1) Les résultats sont représentés sur les figures 1 à 5.
Les figures 1 et 2 montrent que la presque totalité du facteur VII humain est retenu sur le support d'affinité au moment du passage de la composition à
purifier, quelle que soit la quantité de Facteur VII contenue dans la composition de départ. On a estimé, pour les deux quantités de facteur VII à purifier (100 g et 200 lag) que moins de 10% du Facteur VII contenu dans la composition de départ n'est pas retenu sur le support d'affinité. Les figures 1 et 2 montrent aussi un pic d'élution étroit, ce qui illustre les excellentes propriétés chronaatographiques du support d'affinité de l'invention.
La Figure 3 illustre le profil chromatographique obtenu avec une composition de départ contenant 1 mg de Facteur VII humain. Le profil chromatographique de la Figure 3 est très similaire à ceux représentés sur les figures I et 2, ce qui illustre la très grande capacité de rétention d'un ligand cible du support d'affinité de l'invention.
Les figures 4 et 5 illustrent les profils chromatographiques obtenus par purification d'une quantité de Facteur VII humain de 200 ug (Figure 4) et 1000 g (Figure 5) sur un support d'affinité préparé comme décrit à l'exemple 1 et ayant subi des étapes de traitement drastique de sanitisation avec une solution de sanitisation comprenant un mélange de 0,5 M NaOH et de 504)/0 de propylène glycol. Les profils chrornatographiques obtenus montrent la capacité de résistance d'un support d'affinité selon l'invention à des traitements délétères de sanitisation.
On précise que le même profil chromatographique est obtenu lorsqu'on réalise une succession de purifications de Facteur VII humain transgénique et d'étapes de lavage et de sanitisation. Ceci démontre l'excellente stabilité du support d'affinité, qui permet de réaliser la purification de ligands cibles d'intérêt de manière extrêmement reproductible.
Exemple 3 : rendement de greffage en fonction de la quantité d'aptamères utilisés et capacité de charge des supports d'affinités obtenus L'influence de la quantité d'aptamères sur le rendement de greffage et la capacité de charge des supports d'affinité a été étudiée pour les aptamères Mapt 2CS-(C11 hydrophile) et Mapt 2.2CS-(C1 I hydrophile). Le protocole de greffage utilisé
est identique à celui décrit dans l'exemple 1. L'aptamère Mapt 2.2CS-(C11-hydrophile) résulte du couplage de Mapt 2.2CS de séquence SEQ ID N 3 et du 11-(tiifluoroacétamido)-3,6,9-trioxaundécan-l-y1-[(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)1-phosphoramidite (Link Technologies) suivie de la génération du groupe phosphodiester par oxydation et élimination du groupe cyanoéthyle et de la déprotection subséquente de la fonction amine primaire présente à l'extrémité de la chaîne espaceur. Mapt 2.2Cs est dirigé
contre le facteur VII.
La capacité de charge (ou autrement dit la capacité de rétention) des supports d'affinité, exprimée en mg de FVII par ml de gel, a été évaluée par injection d'une composition de FVII humain recombinant dans le tampon "Tp5" (Tris 50 mM, CaC12 10mM, pH" 7,5).
Les tableaux 1 et 2 ci-dessous présentent le rendement de la réaction de greffage des aptamères Mapt 2CS-PEG(C11) et Mapt 2.2CS-PEG(C11) sur le gel pré-activé NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) en fonction de la quantité
d'aptamères engagée dans la réaction par ml de gel. Le rendement a été
déterminé par quantification de la quantité d'aptamères présents dans le surnageant à
l'issue de la réaction de couplage par PCR quantitative.
La quantité finale d'aptamères greffés par ml de gel est également indiquée dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous.
Tableau 1 : Influence de la quantité d'aptamère Mapt 2CS par ml de gel sur le rendement de la réaction de couplage et les caractéristiques du support d'affinité
obtenu Quantité Rendement Quantité Quantité Pourcentage des d'aptamères de la réaction d'aptamères d'aptamères sites acides engagée en de couplage greffés en greffés en carboxyliques du mg/mi de gel mg/m1 de gel fflol/m1 de gel gel couplés à
un aptamère 0.1 99,97 % 0,1 0,007 0.04 %
0.2 99,96% 0,2 0,014 0.07 %
0.6 99,95% 0,6 0,042 0.21%
....
0.8 99,94% 0,8 0,056 0.29%
1,0 100% 1,0 0,07 0.36%
2,0 100% 2,0 0,12 0.6%
3,5 100% 3.5 0,23 1.2%
6,0 97% 5.8 0.39 2%
_ Tableau 2: influence de la quantité d'aptamère Mapt 2.2 CS par ml de gel sur le rendement de la réaction de couplage et les caractéristiques du support d'affinité obtenu Quantité Rendement Quantité Quantité Pourcentage des d'aptamères de la réaction d'aptamères d'aptamères sites acides engagée en de couplage greffés en greffés en carboxyliques du mg/mi de gel mg/mi de gel ginol/m1 de gel gel couplés à
un aptamère 0.1 100% 0,1 0,007 0.04 %
3,5 100% 3,5 0,23 1.2%
6,0 92,6% 5,55 0.37 1.9%
_ Les rendements de couplage obtenus pour les aptamères Mapt 2.2Cs-PEG(C11) et Mapt2Cs-PEG(C11) sont compris entre 90% et 100% pour toutes les quantités d'aptamères testées. De manière remarquable, il est possible de greffer jusqu'à
0.4 urnol par ml de gel, ce qui correspond à un pourcentage de fonctionnalisation des fonctions acides carboxyliques activées présents à la surface du gel de 2%.
La capacité de charge des supports d'affinité pour le FVII humain recombinant varie de manière linéaire avec la quantité d'aptamères greffés par ml de gel.
On n'observe donc pas d'effet de saturation de la capacité de charge du support et donc de perte de fonctionnalité des aptamères pour les quantités élevées d'aptamères greffés.
Au vu de ces résultats, il pourrait être possible d'obtenir des supports d'affinité
présentant une densité d'aptamères greffés supérieure à 6mg/m1 et ayant une capacité de charge pour le FVII supérieure à 8 mg de FVII recombinant humain par mL de gel.
Le tableau 3 ci-dessous présente la capacité de charge des supports d'affinité
en fonction du nombre d' aptamères greffés à leur surface.
Tableau 3: Capacité de charge des supports d'affinité obtenus Mapt 2CS-PEG(C11) Mapt 2.2CS-PEG(C11) Quantité d'aptamères 0,1 1,00 3,50 5,80 1,00 3 ,50 5,60 greffés en mg/m1 de gel Quantité d'aptamères 0.007 0.07 0.23 0.39 0.07 0.23 0.37 greffés en umol/m1 de gel Capacité de charge en 0,05 1,00 3,60 5,40 1,6 5,2 8,0 FVII humain exprimée en mg de FVII/ml de gel Exemple 4 : Essais comparatifs de greffage chimique d'acides nucléiques sur un support solide pré-activé par des groupes NHS
4.1. Essais comparatifs en utilisant différentes conditions de pH
On a réalisé des essais comparatifs de greffage du support pré-activé de départ utilisé à l'exemple 1, dans des conditions de pH neutre ou légèrement alcalin, comme décrit dans le Tableau 4 présenté ci-après :
5 Tableau 4 Modification Mapt2 Quantité Conditions:
(nature de Essai CS d'aptamère Tampon de greffage l'espaceur) Oligo I Essai 1 6,5mg MOPS 100mM, CaC12 10mM, Oligo 1 Essai 2 6,5mg 'pH7,0 (Condition 1) 5' amine espaceur C6 MOPS 100mM, CaC12 10mM NaC1 Oligo 1 Essai 3 6,5mg 0,5M , pH7,0 (Condition 2) NaFIC03 0,2M, NaC1 0,5M, pH 8.3 5' amine Essai 4 3,5mg = (Condition 3) Oligo 4 espaceur C12 NaHCO3 0,2M, NaC1 2 M, pH 8.3 3'dT Essai 5 3,5mg (Condition 4) 5' amine MOPS 100mM, CaC12 10mM, Oligo 5 espaceur C11 Essai 5 6,5mg Na.CI 0,5M pH7,0 (Condition 2) hydrophile On a utilisé le protocole suivant :
1m! de gel rincé avec 15m! HClImM puis 7m1 de tampon de greffage. Ajout des 6,5 ml (ou 3,5m1) de Mapt2CS à 1g/1 et incubation du gel avec Mapt2CS pendant 4 heures 10 à température ambiante - Neutralisation des sites activés par un tampon Tris 50mM pH = 7.4 On a mesuré la quantité d'aptamères non greffés en sortie de colonne après l'étape de greffage. Les résultats montrent que le rendement de greffage varie de 0%
à 10% au maximum, quelles que soient les conditions de greffage décrites dans le Tableau 1 qui ont été utilisées. Contrairement à ce qu'ont observé Goss et al.
(supra), une salinité
élevée n'est pas suffisante pour augmenter le rendement de couplage.
4.2. Essais comparatifs en neutralisant les charges négatives des acides nucléiques à
greffer par l'ajout de cations divalents ou par l'ajout de NaCI.
On a utilisé le protocole suivant :
- 1000. de gel rincé avec 15ml HC1 imM puis 700p1 de tampon de greffage /
Ajout des 650 ul de Mapt2CS (oligo 5) à 130mg,/1 et incubation du gel avec Mapt2CS
pendant 4 heures à température ambiante - Conditions mises en oeuvre :
^ Condition 1: Tampon MOPS 92mM pH = 7,0, CaCl2 200mM, MgC12 200mM
it Condition 2: Tampon MOPS 92mM pH ¨ 7,0, CaC12 200mM, MgC12 200mM
= Condition 3 : NaHCO3 0,2M, NaC10,5M, pH 8.3 ^ Condition 4 : NaHCO3 0,2M, NaC12 M, pH 8.3 On a mesuré la quantité d'aptamère non greffé en sortie de colonne après l'étape de greffage. Les résultats montrent que le rendement de greffage, quelles que soient les conditions de greffage décrites ci-dessus, varie de 0% à 10% au maximum.
Il résulte de l'ensemble des expériences ci-dessus présentées que la mise en uvre de l'étape de couplage en présence d'un pH basique ou neutre tel que recommandé
dans l'état de la technique ou dans les notices d'utilisation des gels pré-activés fournit un rendement de couplage des aptamères sur le gel pré-activé très faible c'est-à-dire inférieur à 10% .
L'augmentation de la force ionique par utilisation d'une solution de NaCl à
une concentration allant jusqu'à 2M ou l'utilisation de sels de cations divalents susceptibles de masquer les charges négatives des aptamères ne permettent pas d'augmenter le rendement de couplage.
Contrairement à ce qu'aurait pu attendre l'homme du métier, la mise en oeuvre de l'étape de couplage en présence d'un pH acide permet d'augmenter de manière significative le couplage des aptamères sur le support pré-activé sans nuire à
la capacité de liaison desdits aptamères à leur protéine cible.
Exemple 5 Modulation des paramètres de mise en oeuvre de mise en uvre de la réaction de couplage selon la présente invention L'influence du pH, de la température et de la durée de réaction a été évaluée afin de déterminer les paramètres contrôlant la réaction de couplage des fonctions acides carboxyliques activées du gel ( NHS-activated Sepharose 4 fast Flow) avec les fonctions amines primaires aliphatiques présentes sur les chaînes espaceurs des aptamère Mapt 2CS-PEG (C11).
Le protocole suivant a été suivi :
- Le tampon de greffage a été préparé à l'aide partir d'acétate de sodium 100 mM avec ajustement au pH désiré sauf pour la mise en uvre de la réaction à un pH =
8,3 où un tampon de NaHCO3 a été préparé.
- Une solution d'aptamères Mapt 2CS-PEG (C11) à une concentration de 2 g/L
dans le tampon de greffage a été préparée.
-1 mL de la solution d'aptamère a été mélangé à 1 mL de gel et incubé à la température désirée, sous agitation. L'avancement de la réaction de couplage est suivi par quantification des aptamères présents dans le surnageant.
- A l'issue du suivi cinétique de la réaction, le milieu réactionnel a été
additionné de 1 mL
de tampon borate à 200 mM à pH 9 sous agitation puis incubé pendant 3h sous agitation à
4 C. Le surnageant a été prélevé pour le dosage final du surnageant. La neutralisation des fonctions acides carboxyliques résiduelles du gel a été effectuée par ajout de 2 mL de tampon Tris-HC1 à 0,1 M et à pH = 8,5 sous agitation pendant 2h30 à 4 C.
- 3 cycles d'ajout /agitation /élimination du surnageant comprenant : 1) iml de Tris-HC1 0,1M pH = 8.5 puis 2) lml d'acétate de sodium à 0,1M NaC1 0,5 M, pH = 4,0 ont été
effectués.
- Le surnageant a été éliminé. Le gel ainsi obtenu est stocké dans du tampon Tpl additionné de 0,2% d'azide pour stockage à 4 C.
Les résultats du suivi cinétique de la réaction de couplage en fonction de la température, de la durée de réaction et du pH sont présentés dans le tableau 5 ci-après :
Tableau 5 : Influence de la température de réaction (TA: température ambiante), du pH et de la durée de réaction pH T C Durée Rdt de réaction (%) Influence du 3,8 5 C 48h 99,8 pH 4,3 5 C 48 h 98,4 4,8 5 C 48 h 75,9 5,6 5 C 48 h 64,9 8,3 5 C 481i 10 Influence de la 4,3 5 C 24h 99,5 température et 4,3 5 C 2h 100 de la durée de 4,3 5 C 4h 100 réaction 4,3 5 C 6h 100 4,3 5 C 8h 100 4,3 5 C 24h 100 4,3 5 C 48 h 97,8 4,3 TA* lh 100 4,3 TA* 2h 100 4,3 TA* 3h 100 4,3 TA* 3h 99,8 Comme cela est illustré dans le tableau 5 ci-dessus, le pH est un paramètre crucial pour la mise en oeuvre de la réaction de couplage selon l'invention.
La mise en oeuvre de la réaction selon les conditions décrites dans l'état de la technique, c'est-à-dire à un pH basique de 8,3, offre un rendement de couplage très faible d'au plus 10%. La diminution du pH permet d'améliorer de manière significative le rendement de la réaction. On observe en particulier un rendement d'au moins 98% pour un pH d'environ 3,8 à 4,3. Un tel résultat est tout à fait surprenant : l'homme du métier s'attendrait à un faible rendement de couplage à ces pH en raison de la dégradation des acides nucléiques par hydrolyse acide et de la diminution de la réactivité des amines primaires. Au vu de ces résultats expérimentaux, il apparaît que la réaction de couplage peut être conduite indifféremment à basse température ou à température ambiante.
De manière remarquable, les supports d'affinité obtenus à pH = 3,8 ou à
température ambiante à pH = 4,3 présentent une capacité de charge (c'est-à-dire une capacité de rétention) du Facteur VII recombinant humain équivalent aux supports obtenus à pH = 4,2 et à 5 C. De manière générale, les capacités de charge obtenues sont particulièrement élevées ce qui traduit non seulement un haut taux de greffage des aptamères mais aussi le maintien de la capacité des aptamères à se lier spécifiquement à
leur protéine cible. En d'autres ternies, la mise en uvre à température ambiante et à un pH inférieur à 4,5 de la réaction de couplage entre les fonctions acides carboxyliques activées du support et les fonctions amines primaires présentes au niveau de I' espaceur des aptamères pefinet non seulement d'obtenir un rendement de greffage proche de 100%
mais également un maintien de l'intégrité fonctionnelle des aptamères.
Exemple 6 : modes de réalisation additionnels d'un support d'affinité
D'autres supports d'affinité ont été préparés en faisant varier (i) les conditions de greffage ainsi que (ii) les types d'aptamères utilisés.
6.1. Types d'aptamères greffés Concernant les types d'aptamères, on a utilisé respectivement des aptamères comprenant un polynucléotide ADN et des aptamères comprenant un polynucléotide ARN. De plus, pour certains aptamères, le polynucléotide est lié à une chaîne espaceur par son extrémité 5' alors que pour les autres aptamères, le polynucléotide est lié à une chaîne espaceur par son extrémité 3'. Egalement, on a utilisé des aptamères comprenant une chaine espaceur hydrophile ou une chaîne espaceur hydrophobe.
Les aptamères utilisés à l'exemple 6 sont les suivants :
Paptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt 2 CS" de séquence SEQ ID N
1 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C11 hydrophile décrite pour la préparation du premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo5 (5'Amine C11 hydrophile)" dans le Tableau 6;
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt 2 CS" de séquence SEQ
comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C6 hydrophobe décrite pour la préparation du troisième support d'affinité divulgué au paragraphe "c" de l'exemple 1 et comprenant à son extrémité 3' un résidu de désoxyribothymidine inversé (3'-dT-5`), ledit 5 aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo2 (S'Amine C6 et 3' dT) dans le Tableau 6;
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt2 CS" de séquence SEQ ID
comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C12 hydrophobe décrite pour la préparation du second support d'affinité divulgué au paragraphe "b" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo3 (5' Amine C12)" dans le Tableau 6;
10 - l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt2 CS" de séquence SEQ
comprenant à son extrémité 3' la chaîne espaceur C6 hydrophobe décrite pour la préparation du troisième support d'affinité divulgué au paragraphe "c" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo7 (3' Amine C6)" dans le Tableau 6;
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ARN "Mapt ARN Anti FIXa" de séquence 15 SEQ ID N 4 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C11 hydrophile décrite pour la préparation du premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)"
de l'exemple 1 et comprenant à son extrémité 3' un résidu de désoxyribothymidine inversé
(3'-dT-5'), ledit aptamère étant désigné "Mapt ARN Anti Ma 5' Amine C11 hydrophile" dans le Tableau 6.
20 On a aussi préparé un support d'affinité sur lequel a été greffé un aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt1.2 CSO" de séquence SEQ ID N 5 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur Cl 1 hydrophile décrite pour la préparation du premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)" de l'exemple 1, ledit aptamère étant désigné "Mapt1.2CSO oligo5 (S'Amine C11 hydrophile)". Les résultats concernant ce 6.2. Conditions de greffage de l'aptamère ARN
L'aptamère ARN de séquence SEQ ID N 5 a été greffé dans les conditions - 300 ig d'aptamère ARN ont été incubés avec 500 uL de gel, à la concentration finale de gel de 0,6 g/L.
- la réaction de greffage a été réalisée pendant 2,5 heures à 17 C (TA) et à
pH 4,2.
- puis la réaction a été stoppée par neutralisation avec un tampon borate 200 rnM
pendant 2,5 heures à 17 C et à pH 9.
- on a mesuré la quantité résiduelle d'aptamères non greffés dans le surnageant afin de déterminer le rendement de greffage, par électrophorèse en gel d'agarose et coloration au GelRed (à 3,5%), puis comparaison avec une gamme étalon de quantités connues de l'aptamère ARN chargées sur d'autres pistes du même gel d'électrophorèse.
Les résultats montrent que le rendement de greffage était supérieur à 99%. Ces résultats montrent que le procédé de greffage à un pH inférieur à 5 est efficace pour le greffage de tous les types de ligands nucléiques, que ces ligands nucléiques comprennent un polynucléotide ADN ou un polynucléotide ARN (et donc également les ligands nucléiques comprenant un polynucléotide hybride ADN/ARN), y compris les ligands comprenant un polynucléotide à bases modifiées, y compris un polynucléotide ARN à
bases modifiées.
6.3. Efficacité de la réaction de greffage La réaction de couplage a été réalisée comme décrit à l'exemple 5, sauf indication spécifique concernant la durée, la température et le pH. Les résultats sont présentés dans le Tableau 6 ci-après.
Tableau 6 Taux de greffage Conditions de visé Rdt de greffage Aptamère greffage*
(mg/mL de (%)**
(durée; Temps; pH) gel)**
48h; 5 C; pH 4,3 4,4 r---f100 48h; 5 C; pH 3,8 4,4 100 Mapt2CS oligo5 2h; 5 C; pH4,3 4,4 Fr, 100 (5' Amine Cil lh; TA; p114,3 4,4 100 Hydrophile) 2h; 5 C; sans 4,4 100 neutralisation pH
Mapt2CS oligo2 (5' Amine C6 et 3'2h; TA; pH4,3 0,7 100 dT) Mapt2CS oligo3 (5' 2h; TA; pH4,3 0,7 7--=, 100 Amine C12) Mapt2CS oligo7 (3' 2h; TA; pH4,3 0,8 100 Amine C6) Mapt1.2CSO oligo5 (5' Amine Ci 1 2h; 5 C; pH4,3 ND*** 100 Hydrophile) Mapt ARN Anti FIXa 5'Amine C11 2h; TA; pH4,2 0,6 100 Hydrophile et 3'dT5' Durée de la réaction de couplage exprimée' en heures; Température exprimée en degrés Celsius ¨ TA= température ambiante (18 C-25 C) ** Le taux de greffage visé est atteint pour un rendement de greffage de 100%.
Le rendement de greffage a été mesuré comme décrit à l'exemple 3 *** ND= Non Déterminé
Les résultats du tableau 6 montrent que, pour un aptamère donné, un rendement de greffage de 100% est obtenu quelles que soient les conditions testées.
En particulier, ces résultats confirment ceux de l'exemple 4, et plus spécifiquement les résultats du Tableau 5, qui montrent qu'un rendement de greffage maximal est obtenu, même au pH très acide de 3,8. Ces résultats confirment aussi la cinétique rapide de la réaction de couplage réalisée à température ambiante.
Il est également montré que l'étape de neutralisation à pH 9, subséquente à la réaction de couplage, n'est pas essentielle pour l'obtention d'un rendement de greffage maximal, puisque le taux et le rendement de greffage dans ces conditions sont identiques à
ceux observés lorsque l'étape de neutralisation est réalisée (voir Tableau 6 ci-dessus).
Les résultats du Tableau 6 montrent aussi que la nature hydrophile ou hydrophobe de la chaîne espaceur de Paptamère n'a pas d'influence sur l'efficacité du greffage. Il est également montré que le greffage est aussi efficace lorsque la chaîne espaceur, hydrophile ou hydrophobe, est liée à l'extrémité 5' ou à l'extrémité
3' du polynucléotide ADN ou ARN.
On ajoute que la neutralisation préalable des charges du polynucléotide ADN
par incubation de celui avec un Polybrenee (Hexamethrine bromide, 1,5-Dimethy1-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide) rend impossible la réalisation de la réaction de couplage.
6.4. Fonctionnalité des supports d'affinité.
On a testé la fonctionnalité de supports d'affinité sur lesquels a été
immobilisé
Paptamère "Mapt2CS oligo5" décrit au 6.1. ci-dessus, respectivement dans les conditions de température, durée et pH de la réaction de couplage suivantes :
- Conditions n 1 : 48h, 5 C, pH 4,2;
- Conditions n 2 : 48h, 5 C, pH 3,8;
- Conditions n 3 : 2h, 5 C, pH 4,2; et = - Conditions n 4: lh, TA (Température Ambiante), pH 4,2.
Pour le test, on a utilisé 500 Fil de gel greffé avec les aptamères dans chacune des conditions n 1 à 4 ci-dessus, à la concentration finale de 4,4 mg/mL.
Pour chacun des supports de chromatographie, on a injecté 2,7 mg d'une composition de FVII humain recombinant purifié, produit dans le lait de lapines tyransgéniques (FVII-TG).
La composition de FVII-TG utilisée pour l'injection est préparée par neutralisation du citrate contenu initialement dans la formulation par du CaC12 et modification du tampon de foimulation pour obtenir : entre 35 et 40 naM de NaCl et entre 3,2 et 4 mM de MgC12 - Tampon utilisé pour la chromatographie : Tris 50mM / CaC12 10mM, pH 7,5 - Débit : 0,5m1/min - Tampon d'Elution : Tris 50mM, EDTA 10mM, pH = 7,5 Les résultats sont représentés sur les figures 6 à 9, respectivement pour les conditions de couplage n 1 à 4 décrites ci-dessus. Les résultats sont aussi réprésentés dans le Tableau 7 ci-dessous.
Tableau 7 Conditions de couplage fraction de FMI non fraction de FVH éluée (durée; Température; pH) retenue sur la colonne (1)/0) (%) n 1 : 48h; 5 C; pH 4,2 5 95 n 2 : 48h; 5 C; pH 3,8 24 76 n 3 : 2h; 5 C; pH 4,2 15 85 n 4 : lh; TA; pH 4,2 5 95 5 Les résultats des figures 6 à 9 et du Tableau 7 ci-dessus montrent que la presque totalité du facteur VII humain est retenu sur le support d'affinité au moment du passage de la composition à purifier, à l'exception du support d'affinité
préparé par greffage selon les conditions n 2 (4814 5 C, pH 3,8) pour lequel on observe un taux de rétention du facteur VII qui est substantiel mais pas maximal.
10 Les résultats montrent aussi que la totalité du facteur VII humain retenu sur le support d'affinité est libéré lors de l'étape d'élution.
Ces résultats montrent que des supports d'affinité totalement fonctionnels peuvent être préparés en utilisant les conditions de greffage n 1 et n 3-4, ce qui signifie que les conditions de température et de durée du greffage ne sont pas absolument En particulier, on oberve que les conditions de couplage des aptamères pendant une durée courte (1 heure) et à température élevée (température ambiante) (i) permet un taux de greffage de 100% des aptamères et (ii) n'entraîne aucune altération dans En revanche, les résultats moins bons obtenus avec le support d'affinité
préparé par couplage des aptamères à pH 3,8 montrent que les conditions de pH
sont importantes pour le maintien de l'intégrité des aptamères gerffés, et en partculier pour le maintien de l'aptitude des aptamères greffés à se lier au facteur VII humain cible. Lorsque 25 la réaction de couplage est réalisée à pH 3,8, on obtient un support d'affinité qui reste fonctionnel pour enrichir sélectivement un échantillon de départ en facteur VII humain.
Toutefois, un tel support d'affinité ne peut être valablement utilisé dans le cadre d'un procédé industriel de purification du facteur VII humain, en raison de la perte importante de facteur VII (plus de 20%) et donc du caractère économiquement désavantageux d'un tel procédé.
Exemple 7 : Maintien de Pintergrité du support d'affinité dans des conditions d'uilisation indutrielle impliquant des contacts en milieux biologiques et une étape de sanitisation puissante (soude à la concentration 1M) Dans l'exemple 7, on montre que des supports d'affinité tels que définis dans la présente description conservent leur capacité de rétention et d'élution de la protéine cible, même après de nombreux cycles d'utilisation, dans des conditions de mise en oeuvre industrielles 7.1. Préparation des supports de greffage Trois supports de greffage ont été préparés comme décrit à l'exemple 1, en utilisant respectivement chacun des trois a.ptamères suivants :
- support de greffage n 1 : un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2CS
de séquence SEQ ID N 1 comprenant à son extrémité 5' une chaîne C11 hydrophile (11-amino-3,6,9-trioxaundécan- I yl), - support de greffage n 2 : un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2.2CS de séquence SEQ ID N 3 comprenant à son extrémité 5' une chaîne C11 hydrophile (11-amino-3,6,9-trioxaundécan-ly1), et - support de greffage n 3 : un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2.2 CS de séquence SEQ ID N 3 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaeeur composée de 6 méthylènes (CH2) (espaceur C6) Les rendements de greffage ont été respectivement de 100% (support de greffage n 1), de 93% (support de greffage d 2) et de 87% (support de greffage n 3).
La capacité statique théorique des supports d'affinité préparés, c'est-à-dire la quantité de FVII humain qui devrait être retenue sur les supports d'affinité
si chacun des aptamères greffés liait une molécule de FVII humain, était respectivement de 18.7 mg par mililitre de support (support n 1), 17,3 mg/m1 (support n 2) et 16,3 mg/mi (support n 3).
7.2. Conditions opératoires du procédé de purification de FVII humain.
On a utilisé une composition de FVII-TG enrichie en FVII humain, la concentration finale de FVII-TG étant d'environ 50 000 ppm, ladite composition comprenant une forte proportion de formes des-gla de FVII (foimes inactives de FVII) et ladite composition possédant une activité spécifique FVII d'environ 0,4 (activité exprimée en activité amidolytique/antigène).
Le protocole général est le suivant :
- équilibrage du support dans le tampon TP4 (Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, MgC12 4 mM, pH 7,5), en utilisant un volume de tampon de cinq fois le volume du support greffé, - injection de la matière première (composition de FVII-TG), préalablement dialysée contre un tampon Tris 50 mM, CaC12 10 mM, MgC12 4 mM, - lavage avec le tampon de lavage (huit fois le volume du support greffé), et - équilibrage avec le tampon d'équilibrage Tris 50 mM, EDTA I 0 mM à pH 7,5 (trois fois le volume du support greffé) 7.3. Propriétés des supports pour la purification du FVII humain_ On a testé la capacité des trois supports préparés comme décrit au paragraphe 7.1.
ci-dessus à retenir sélectivement le FVlla humain actif On a déterminé que les trois supports avaient une capacité dynamique de rétention du FVIIa humain d'environ 10 mg de FVIIa humain par mililitre de support greffé, ce qui représente entre 53% et 58% de la capacité statique maximale théorique calculée au pragraphe 7.1. ci-dessus. Ces résultats montrent que les aptamères respectifs greffés sur les trois supports sont largement accessibles et fonctionnels.
On a aussi montré que chacun des trois supports d'affinité préparés comme décrit au paragraphe 7.1. ci-dessus était capable de retenir sélectivement les molécules de FVII
humain ayant un domaine GLA actif, comme cela est exposé dans le Tableau 8 ci-dessous.
Tableau 8 Support Support Support d'affinité n 1 d'affinité n 2 d'affinité n 3 Départ FVII (D0280) mg 17 17 15 FVIIam UI 13906 139060 12270 Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,41 0,41 0,41 Non retenu FVII (D0280) mg 7,7 9,7 7,8 FVflam UI 94 273 134 Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,006 0,014 0,009 Rendement FVII (DO) % 45,5 56,9 52,1 'Rendement FVIlam % 0,7 2,0 1,1 Eluat FVII (D0280) mg 7,7 7,3 6,3 FVIIam UI 12270 10675 9055 Ratio FVIIam / FVII:Ag 080 0 71 0,72 Rendement FVII (DO) % 45,3 42,9 42,0 Rendement FVIIam % 88,2 76,8 73,8 Les résultats du Tableau 8 montrent que, à partir d'une composition comprenant seulement 41% de FVII humain à domaine GLA actif par rapport à la quantité
totale de FVII humain présente dans ladite composition, on obtient une composition finale enrichie en FVII humain qui comprend de 70% à 80% de FVII humain à domaine GLA actif par rapport à la quantité totale de FVII humain présente dans ladite composition enrichie. Ces résultats montrent que les trois supports d'affinité (i) petniettent la purification de FVII
humain et (ii) permettent d'obtenir une composition de FVII purifié qui est enrichie en forme active de FVII humain, par élimination des foi mes inactives de FVII
humain.
7.4. Résistance des supports d'affinité vis-à-vis d'un traitement par la soude.
On a testé la résistance des trois supports d'affinité à un traitement prolongé par une solution de soude à 1M.
Les supports préparés comme décrit au paragraphe 7.1. ont été mis en contact avec une solution de soude à 1M pendant une durée de 100 heures. Après lavage pour éliminer la soude, la capacité de chacun des trois supports d'affinité à purifier le FVII humain a été
mesurée. Les résultats sont présentés dans le Tableau 9 ci-dessous.
Tableau 9 Support d'affinité Support Support n 1 d'affinité n 2 d'affinité n 3 Départ FVI1 (D0280) mg 17 17 15 FVIIam UI 13906 13906 12270 Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,41 0,41 0,41 Non retenu FVII (D0280) mg 8,1 9,2 7,9 FVIIam UI 156 434 163 Ratio FVIIam / FV1I:Ag 0,010 0,024 0,010 'Rendement FVII (DO) % 47,7 53,9 52,5 Rendement FVIIam % 1,1 3,1 1,3 ,Eluat FVII (D0280) mg 7,9 7,1 6,9 FVIIam UI 13560 11500 12215 Ratio FVIIam / FV11:Ag 0,9 0,82 0,89 Rendement FVII (DO) % 46,5 41,5 45,7 Rendement FVIIam % 97,5 82,7 99,6 Les résultats du Tableau 9 montrent qu'un traitement par de la soude à 1M
pendant une très longue durée (100 heures) n'entraîne aucun changement significatif dans la capacité des supports n 1, n 2 et n 3 à purifier le FVII humain.
7.5. Résistance des supports d'affinité vis-àvis d'un contact prolongé avec divers milieux biologiques.
On a testé la résistance des trois supports d'affinité à un traitement prolongé avec 5 divers milieux biologiques, qui peuvent être utilisés comme produits de départ dans des procédés de purification de FVII humain. On a testé en particulier les deux milieux biologiques suivants : (i) un cryosurnageant de plasma sanguin humain et (ii) une solution de lait clarifié, le lait pouvant constituer une source de FVII humain, par exemple lorsque le FVII humain est produit dans le lait d'animaux transgéniques pour le gène codant le 10 FVII humain, Le support d'affinité n 1 préparé comme décrit au paragraphe 7.1. a été mis en contact avec (i) un cryosurnageant plasmatique humain ou (ii) un lait clarifié, pendant une durée de 100 heures, Après lavage pour éliminer le milieu biologique testé, la capacité de chacun des trois supports d'affinité à purifier le FVII humain a été mesurée.
Les résultats 15 sont présentés dans le Tableau 10 ci-dessous.
Tableau 10 Support n 1 après Support n 1 après 100 100 heures heures d'incubation en d'incubation en cryo lait clarifié
surnageant Départ FVII (D0280) mg 17 17 FVIIam Ul 13906 13906 Non retenu FVII (D0280) mg 9,3 10,2 FVIIam UI 496 192 Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,027 0,009 Rendement FVII (DO) % 54,6 60,2 Rendement FV1Iam % 3,6 1,4 Eluat FVII (D0280) mg 7,3 7,1 FVIIam UI 12605 13180 Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,87 0,93 Rendement FVII (DO) % 42,6 41,8 rendement FVIIam % 90,6 94,8 Les résultats du Tableau 10 montrent que l'incubation d'un support d'affinité
tel que défini dans la présente description avec des milieux biologiques qui représentent des produits de départ pour la purification de FVII humain, pendant une très longue durée (100 heures), n'entraîne aucun changement significatif dans la capacité dudit support à
purifier le FVII humain.
7.6. Résistance de supports d'affinité à la réalisation de cycles de purification successifs On a testé la résistance du support d'affinité n 3 préparé comme décrit au paragraphe 7.1 ci-dessus à subir des cycles successifs de purification de FVII
humain.
Chaque cycle de purification comprenait les étapes suivantes :
- équilibrage du support d'affinité en tampon TP4 (5 fois le volume du support d'affinité), - simulation de mise en contact avec la composition à purifier: injection de tampon TP4 (5 fois le volume du dupport d'affinité), élution avec le tampon d'élution (5 fois le volume du support d'affinité), sanifisation avec une solution de NaOH 1 M durant 10 minutes (5 fois le volume du support d'affinité), et - ré-équilibrage du support d'affinité avec le tampon TP4 (10 fois le volume du support d'affinité).
On a réalisé respectivement 15 ou 30 cycles de purification ci-dessus avec le support d'affinité n 3 et on a déterminé la capacité dudit support à l'issue des 15 ou 30 cycles à purifier le FVII humain. Les résultats sont réprésentés sur le Tableau 11 ci-dessous.
Tableau 11 Support d'affinité n 3 -Support d'affnité n 3 -15 cycles 30 cycles Départ FVII (D0280) mg 15 15 >Non retenu FVII (D0280) mg 7,2 6,5 Rendement FVII (DO) % 48,3 43,1 Eluat FVII (D0280) mg 6,5 6,2 Rendement FVII (DO) % 43,0 41,0 Les résultats du Tableau 11 montrent que la capacité d'un support d'affinité
tel défini dans la présente description à purifier le FVII humain est inchangée, même après au moins 30 cycles de réalisation d'un procédé mimant la purification d'une protéine cible.
Tableau 12 liste des séquences N SEQ ID Description SEQ ID N 1 Aptamère Mapt 2 CS
SEQ ID N 2 Aptamère Mapt 1.2 SEO ID N 3 Aptamère Mapt 2.2 CS
SEQ ID N 4 Aptamère Mapt ARN Anti FIXa SEQ ID N 5 Aptamère Mapt 1.2 CSO
Claims (23)
1. Procédé d'immobilisation de ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine primaire, par greffage sur un support solide présentant des groupes acides carboxyliques activés, comprenant une étape de couplage covalent desdits acides nucléiques sur ledit support solide à un pH inférieur à 6.
2. Procédé d'immobilisation des ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine primaire sur un support solide les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine primaire, et c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à 6 étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine primaire, et c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH
inférieur à 6 étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 caractérisé
en ce que les groupes acides carboxyliques activés sont obtenus par réaction avec le N-hydroxysuccinimide ou l'un de ses dérivés.
en ce que les groupes acides carboxyliques activés sont obtenus par réaction avec le N-hydroxysuccinimide ou l'un de ses dérivés.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé
en ce que le pH de l'étape de couplage est compris dans une gamme allant de 3,5 à
4,5.
en ce que le pH de l'étape de couplage est compris dans une gamme allant de 3,5 à
4,5.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé
en ce que l'étape de couplage est réalisée à une température allant de 0°C
à 35°C.
en ce que l'étape de couplage est réalisée à une température allant de 0°C
à 35°C.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé
en ce que le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides comprenant au moins une fonction amine primaire à son extrémité 3' ou 5'.
en ce que le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides comprenant au moins une fonction amine primaire à son extrémité 3' ou 5'.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé
en ce que le ligand nucléique comprend (i) un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides de longueur et (ii) une chaîne espaceur lié audit polynucléotide, la fonction amine primaire étant fixée à une extrémité 3' ou 5' dudit polynucléotide ou à la chaîne espaceur.
en ce que le ligand nucléique comprend (i) un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides de longueur et (ii) une chaîne espaceur lié audit polynucléotide, la fonction amine primaire étant fixée à une extrémité 3' ou 5' dudit polynucléotide ou à la chaîne espaceur.
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la chaîne espaceur est choisie parmi le groupe des alkyles linaires en C2-C20 et des polyéthylène glycols en C2-C20 substitués par une fonction amine primaire.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que le support solide est sélectionné parmi le groupe constitué par les gels de silice, les gels de dextrane, les gels d'agarose et leurs dérivés.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9 caractérisé en ce que l'étape de couplage c) comprend les deux étapes suivantes :
cl) faire réagir ledit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH
inférieur à 6 et c2) poursuivre la réaction de couplage dudit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH supérieur à 7,5.
cl) faire réagir ledit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH
inférieur à 6 et c2) poursuivre la réaction de couplage dudit ligand nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH supérieur à 7,5.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'étape de couplage est suivie d'une étape cl) de blocage de la réaction de couplage.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine primaire consiste en un aptamère nucléique.
13. Méthode de préparation d'un support d'affinité comprenant la mise en uvre du procédé d'immobilisation telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 12.
14. Support solide d'affinité obtenu par la méthode de préparation telle que définie dans la revendication 13.
15. Support solide d'affinité sur lequel des ligands nucléiques sont immobilisés par liaison amidique et dans lequel au moins 0,01% des fonctions carboxyles présentes initialement à sa surface sont dérivatisées par à un ligand nucléique.
16. Support solide d'affinité sur lequel des ligands nucléiques sont immobilisés par liaison amidique, ledit support d'affinité étant un gel de chromatographie présentant une densité en ligands nucléiques d'au moins 0,005 µmol/m à 0.4 µmol/ml de gel.
17.
Support solide d'affinité selon la revendication 16 caractérisé en ce que le support solide d'affinité est choisi parmi le groupe constitué par les gels d'agarose, les gels de dextrane, les gels de silice et leurs dérivés.
Support solide d'affinité selon la revendication 16 caractérisé en ce que le support solide d'affinité est choisi parmi le groupe constitué par les gels d'agarose, les gels de dextrane, les gels de silice et leurs dérivés.
18. Support solide d'affinité selon l'une des revendications 14 à 17 caractérisé en ce que les ligands nucléiques sont des aptamères nucléiques et en ce que ledit support solide présente à sa surface les structures suivantes de formule (III) dans laquelle :
SUP représente le support -NH-(SPAC)n-NUCL représente un aptamère nucléique dans lequel :
~ n est un indice valant 0 ou 1, ~ SPAC représente une chaîne espaceur, et ~ NUCL représente un acide nucléique se liant spécifiquement à une molécule cible, ledit acide nucléique comprenant de 5 à 120 nucléotides.
SUP représente le support -NH-(SPAC)n-NUCL représente un aptamère nucléique dans lequel :
~ n est un indice valant 0 ou 1, ~ SPAC représente une chaîne espaceur, et ~ NUCL représente un acide nucléique se liant spécifiquement à une molécule cible, ledit acide nucléique comprenant de 5 à 120 nucléotides.
19. Complexe résultant de l'interaction d'un ligand nucléique et une molécule cible, ledit complexe étant formé à la surface d'un support solide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 14 à 18.
20. Utilisation d'un support d'affinité tel que défini dans l'une quelconque des revendications 14 à 18 pour la purification d'une molécule cible.
21. Utilisation d'un support d'affinité tel que défini dans l'une quelconque des revendications 14 à 18 pour la détection d'une molécule cible
22. Procédé de purification d'une molécule cible avec un support d'affinité
tel que défini selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact une composition à purifier comprenant la molécule cible d'intérêt avec un support solide d'affinité tel que défini dans l'une des revendications 14 à 18, afin de former un complexe entre (i) ligands nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ladite molécule cible et b) libérer ladite molécule cible à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer ladite molécule cible purifié.
tel que défini selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact une composition à purifier comprenant la molécule cible d'intérêt avec un support solide d'affinité tel que défini dans l'une des revendications 14 à 18, afin de former un complexe entre (i) ligands nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ladite molécule cible et b) libérer ladite molécule cible à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer ladite molécule cible purifié.
23. Utilisation selon les revendications 20 et 21 ou procédé selon la revendication 22 caractérisé en ce que la molécule cible est une protéine plasmatique.
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