CA2317026A1 - Utilisation d'une sequence riche en proline pour augmenter le caractere fusogenique d'enveloppes de retrovirus - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, laquelle séquence riche en proline correspond: soit à la séquence riche en proline; de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope, ou, de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF; de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1; de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV; ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope; ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV; et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un .beta.-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline; soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

Description

WO 99/36561 PCTlFR99/00016 UTILISATION D'UNE SEQUENCE RICHE EN
PROLINE POUR AUGMENTER LE CARACTERE
FUSOGENIQUE D'ENVELOPPES DE RETROVIRUS
s L'invention a pour objet l'utilisation d'une séquence riche en proline pour augmenter le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus.
L'entrée d'un rétrovirus dans une cellule cible dépend de la reconnaissance d'une protéine de surface spécifique, appelé récepteur, par la sous unité de surface lo (SU) de l'enveloppe virale, suivi par la fusion des membranes qui est médiée par le peptide fusion localisé à l'extrémité amino terminale de la sous unité
transmembranaire {TM) (29). Une voie d'entrée dépendante du pH et une voie d'entrée indépendante ont l'une et l'autre été décrites pour les rétrovirus (13), mais les déterminants et Ie processus impliqués dans l'activation de la fusion suite à
la ls reconnaissance du récepteur restent inconnus. L'identification des ces étapes est essentielle pour la compréhension du mécanisme qui module l' infection ainsi que transfert de gènes par les rétrovirus.
Les glycoprotéines d'enveloppe rétrovirales qui s'assemblent en trimère, sont un complexe comprenant une sous unité de surface (SU) et une composante 2fl transmembranaire (TM) (10). Pour tous les virus enveloppés, les interactions initiales de cette glycoprotéine avec le(s) récepteurs) cellulaires) conduisent à des réarrângements conformationnels de l'enveloppe nécessaires à l'exposition du peptide fusion (30). Les déterminants de l'enveloppe et la séquence des événements causant ces changements conformationnels sont bien détaillés pour les orthomyxovirus qui 2s nécessitent l'environnement acide des vésicules d'endocytose pour leur entrée (24).
Pour les rétrovirus, pour lesquels une voie indépendante du pH a aussi été
décrite, les déterminants précis et les étapes, menant de la reconnaissànce du récepteur à
l'activation de la fusion, restent non élucidés. Le récepteur Pit-2 de l'enveloppe amphotrope des virus de leucémie murine (14, 28) est présent dans Ia plupart des 3o espèces incluant l'homme, alors que les récepteurs fonctionnels des enveloppes écotropes sont limités aux cellules de rat et de souris (19). La reconnaissance de l'un ou l'autre de ces récepteurs influence l'efficacité de fusion, mais l'enveloppe écotrope

2 PCTIFR99100016 induit plus facilement la fusion cellule-ceimle et la formation de syncytia, comme testé
avec les cellules de rat XC, que les enveloppes amphotropes (17).
Les domaines structuraux partagés par l'enveioppe écotrope de Moloney _ (MoMLV) et l'enveloppe amphotrope (MLV-4070A) comprennent : (i) un domaine amino-terminal de liaison au récepteur (noté BD) d'approximativement 200 acides aminés (a.a.) (3, 7); (ü) la région riche en proline de 45 à 59 a.a. de long, identifiée par PRO dans les constructions chimériques décrites ci-après (27) ; (iii) une séquence carboxy-terminale de la SU (noté C) de 160 a.a. impliquée dans l'interaction avec la TM; (iv) un ectodomaine de la TM de 134 a.a. désigné ici par TM, portant un peptide 1 o fusion amino-terminal potentiel identifié par analogie de séquences aux peptides fusions d'autres protéines d'enveloppe de virus enveloppés (11) ; (v) un peptide d'ancrage à la membrane de 28 a.a. et (vi) une queue.cytoplasmique contenant le petit peptide R carboxy-terminal dont le clivage tardif dans les virions, augmente la fusogénicité de l'enveloppe (20). Alors que les domaines amino-terminal BD et PRR
de l'enveloppe écotrope et amphotrope ne partagent que 33 % et 43 % a.a.
d'homologie, respectivement, tous les autres domaines ont plus de 80% de similitude (Fig. lA).
L'un des objets de l'invention est de fournir des séquences riches en prolines qui augmentent le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus.
2o L'un des objets de l'invention est de fournir des protéines chimères ou mutées dont le caractère fusogéaique est amélioré.
. L'invention a pour objet l'utilisation d'une séquence riche en proIine pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV lOAI ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
xénotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétroviraIe d'un MLV MCF ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, laquelle séquence riche en proline correspond o - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
amphotrope, ou

3 PCT/FR99/00016 de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF, de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV IOAl, de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV, ou de Ia glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
s xénotrope, ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétroviraIe d'un FeLV, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un (3-turn dans l'hélice poIyproline de la séquence riche en proline, - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe lo rétrovirale d'un MLV écotrope.
On a constaté de façon inattendue qu' il y a une augmentation du caractère fusogénique d'une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou d'un MLV MCF ou d'un MLV IOA1 ou d'un GALV ou d'un MLV
xénotrope ou d'un FeLV dans les cas suivants ls - soit par remplacement de leur séquence riche en proline par la séquence riche en proline homologue d'un MLV écotrope, - soit par mutation ponctuelle de la séquence riche en proline dudit MLV
amphotrope ou dudit MLV MCF ou dudit MLV IOA1 ou dudit GALV ou dudit MLV xénotrope ou dudit FeLV telle qu'il y ait suppression d'au moins un (3-20 turn.
La région riché en proline s' organise probablement en hélice poly-proline, uné~ structure secondaire constituée de « bêta-turns » qui sont des repliements de la chaîne peptique de 180°, incluant le plus souvent une proline. Ces courbures sont agencëes différemment entre les régions PRO (région riche en proline) des 2s enveloppes écotrope et amphotrope. Cette dernière contient 11 « béta-turns »
agencés régulièrement, dont 4 dans son extrémité N-terminaie et 7 dans son.
extrémité C-terminale. La région PRO de l'enveloppe écotrope ne contient que 7 « beta-turns », dont 2 seulement dans son extrémité N-terminale.
L'expression « mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un ~3-turn 3o dans l'hélice polyproline de la sêquence riche en proline » signifie - délétion des 4 acides aminés formant le ~3-turn, ou WO 99/36561 q PCT/FR99/00016 - mutations ponctuelles d'un ou plusieurs de ces 4 acides aminés, , notamment mutation de la proline responsable du repliement à 180° de la chaîne polypeptidique, telles que la probabilité d'avoir un ~3-turn est inférieure à
0.8 selon l'algorithme de Chou et Fassman.
s A titre d'exemple, Ia proline est avantageusement remplacée par l'isoleucine, Ia valine ou l'alanine.
Comme souches appropriêes de MLV écotrope, on peut citer la souche Moloney MLV, Friend MLV (23).
Comme souches appropriées de MLV amphotrope, on peut citer la souche to 4070A (16).
Comme souches appropriées de MLV MCF, on peut citer la souche MLF
MCF 247 (9).
Comme souches appropriées de GALV, on peut citer la souche Seato (Delassus et al., 1989, Virology 173 :205-213).
1 s Comme souches appropriées de MLV xénotrope, on peut citer la souche NZB.IU.6 (15).
Comme souches appropriées de FeLV, on peut citer FeLV-C-SARMA
FSC (21).
Comme souches appropriées de MLV IOA1, on peut citer (Ott et al., 1990 20 (16)).
L'expression "améliorer Ie caractère fusogénique" signifie que l'enveloppe rëti~ovirale ~ améliorée » de l'invention possède une capacité mesurable, par rapport à l'enveloppe parentale, à mieux accomplir les étapes post-liaison du processus d'entrée viral et consistant in fine à la fusion moléculaire des 2s membranes virales et cellulaires.
L'amélioration du caractère fusogénique peut se mesurer selon l'un ou l'autre des deux tests suivants - test de formation de syncytia après co-culture entre des cellules cibles, exprimant le récepteur rétroviral reconnu par le domaine de liaison de la 3o glycoprotéine mutée ou chimère, et des lignées cellulaires préalablement transfectées avec un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines, - test d'infection de cellules cibles, exprimant le récepteur rétroviral reconnu par le domaine de liaison de la glycoprotéine mutée ou chimère, dans des conditions limitantes où la densité de ces récepteurs (c'est-à-dire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant l'attachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale non mutée et par moins de 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale chimère ou mutée ; ces valeurs étant données comparativement au titre infectieux des virus comportant les enveloppes parentales et parentale chimère ou mutée sur des cellules XC
to dans des conditions définies dans Ie tableau IB de l'exemple.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope est celle représentée à la figure 7.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope est celle représentée à Ia figure 8.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF est celle représentée à Ia figure 9.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'envelogpe rétrovirale d'un GALV est celle représentée à la figure 10.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe 2o rétrovirale d'un MLV lOAI est celle représentée à la figure 11.
La séquence riche en proüne d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétcovirale d'un MLV xénotrope est celle représentée à la figure 12.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un FeLV est celle représentée à la figure 13.
2s Par séquence riche en proline d'une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, on entend également celle comportant des mutations, suppression ou addition d'acides aminés telle qu'il n'y ait pas modification de l'enchaînement des ø-burn Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention vise l'utilisation telle 3o que définie ci-dessus d'une séquence riche en proline en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV

WO 99136561 ~ PCT/FR99/00016 écotrope choisi parmi : le domaine âe liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire.
Par K domaine fonctionnel », on définit toute séquence polypeptidique individualisée sur le plan structural et capable d'accomplir une fonction s biologique déterminée.
Par K domaine de liaison », on définit le domaine fonctionnel porté par la partie N-terminale de la sous-unité SU de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable de se lier au récepteur rétroviral. II est représenté sur la figure 6 comme s'étendant de la position 31 à 23? de Ia séquence peptidique de la glycoprotéine Io d'enveloppe MLV amphotrope.
Par ~~ domaine C », on définit on définit le domaine fonctionnel porté par la partie C-terminale de la sous-unité SU de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable d'interagir avec. Ia sous-unité TM. Il est représenté sur la figure 6 comme s'étendant de la position 300 à 458 de Ia séquence peptidique de la 15 glycoprotéine d'enveloppe MLV amphotrope Par ~~ domaine TM », on définit le domaine porté par l'ectodomaine de la sous-unité TM de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable d'interagir avec la sous-unité SU et d'accomplir la fusion entre membranes virales et cellulaires lors du processus d'entrée rétroviral. II est représenté sur Ia figure 6 comme 2o s'étendant de la position 459 à 592 de Ia séquence peptidique de la glycoprotéine ,, d'enveloppe MLV amphotrope.
Le domaine de liaison, le domaine C, ou Ie domaine de la sous-unité
transmembranaire peuvent être modifiés de manière à altérer leurs capacités fonctionnelles en vue 25 - d'interagir avec d'autres molëcules, telles que des molécules de surface (antigènes, récepteurs de facteurs de croissance, etc.), par le biais de l'insertion de peptides ou de domaines protéiques présentant une affinité pour ces molécules, - de renforcer la stabilité de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale, 3o - d'augmenter la capacité fusiogène de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale.

L' invention concerne notamment iutilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence riche en proline correspondant à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : Ie domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'une sêquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV, lo laquelle séquence riche en proline correspond - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
amphotrope, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins ls un ~i-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline, - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.
L'invention concerne également, à titre de produit nouveau, une séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire 2o correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétr9virale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de layglycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétroviraie d'un MLV xénotrope ou de la 2s glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie C-terminale telle qu' il y ait suppression d'au moins 1 ~i-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.
On définit par « partie C-terminale » la séquence d'acides aminés correspondant à la deuxième moitié de la région riche en proline.
3o L'invention concerne également une séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV

amphotrope ou de la glycoprotéine d'envéloppe rétrovirale d'un MLV lOAI ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de Ia glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine . , d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de Ia glycoprotéine d'enveloppe s rétrovirale d' un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de Ia partie - ' N-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 ~3-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.
On définit par « partie N-terminale » la séquence d'acides -aminés correspondant à la première moitié de ta région riche en proline.
to L'invention concerne également les protéines mutées contenant une séquence riche en proline et dans l'enchainement desquelles. la séquence riche en proline est mutée de telle sorte qu'il y a suppression d'au moins un ~i-turn.
Plus précisément, l'invention concerne une protéine mutée correspondant à
la glycoprotéine , d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou 'à Ia 15 glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV lOAl ou à Ia glycoprotéine d'enveloppe rëtrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
xënotrope ou Ia glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu' il y ait 2o suppression d'au moins un (3-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.
Cette protéine mutée présente par rapport à la protëine non mutée correspondante la propriété d'induire plus facilement Ia formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs 25 rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.
L'invention concerne également les protéines chimères contenant une séquence riche en proline dans l'enchaînement desquelles la séquence riche en , proline est remplacée par la séquence riche en proline homologue de Ia glycoprotéine rétrovirale d'un MLV écotrope.
30 Plus précisément, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou . à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLJ lv~°CF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de Ia glycoprotëine d' enveloppe rétrovirale d' un MLV écotrope.
Cette protéine chimère présente par rapport à la protéine d'origine correspondante la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.
1 o Dans les groupes respectifs des protéines mutées ou chimères telles que définies ci-dessus, il peut également y avoir remplacement de l'un au moins de leurs domaines fonctionnels par le domaine fonctionnel homologue de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe 2o rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle * le domâine riche en proline est remplacé par le domaine riche en pt'oline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, * et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité
transmembranaire, est remplacé par Ie domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.
Cette protéine chimère présente la propriété d' induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les ceilules exprimant une quantité
limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle 3o est dérivée.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
lOAI ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine .
d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe s rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle * le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un ~3-turn (dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline), * et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le lo domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité
transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.
Cette protéine chimère présente la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité
1s limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.
Les protéines mutées ou ~ chimères de l'invention présentent avantageusement l'une au moins des propriétés suivantes - il y a formation de syncytia après cocultures entre des cellules 2o cibles exprimant une molécuie de surface servant de récepteur rétroviral par interaction avec le dôrnaine de liaison porté par une glycoprotéine d'enveloppe rétiovirale et des lignées cellulaires produisant ou non des particules Gag-Pol de MLV (ou de rétrovirus de mammiferes de type C ou des Ientivirus) préalablement transfectées avec un vecteur d'expression pour l'une des susdites 25 protéines de l'invention, - il y a infection de cellules cibles exprimant un récepteur rétroviral reconnu par le domâine de liaison d'une glycoprotéine mutée ou chimère de _ .
l'invention, dans des conditions limitantes où la densité de ce récepteur (c'est-à-dire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant 30 rattachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée et non chimère et par moins de 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe chimère WO 99136561 ~ 1 PCT/FR99/00016 ou mutée de l'invention, ces susdites valeurs appliquées au titre infectieux étant données par comparaison au titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée et non chimère ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles, telles que des cellules XC, dans les conditions d'infection telles que définies dans les exemples et notamment à propos du tableau 1B ci-après.
On dispose donc notamment de deux tests permettant de caractériser les protéines mutées ou chimères de i'invention.
L'un de ces tests est la formation de syncytia entre des cellules cibles et des lignées cellulaires préalablement transfectées par un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines chimères ou mutées de l'invention (et susceptibles de reconnaître un récepteur rétroviral situé sur lesdites cellules cibles).
Comme cellules cibles, on peut utiliser les cellules de souris SC1, Mus Durai, les cellules humaines TE67I, ainsi que les cellules de rat XC.
Les lignées cellulaires utilisées peuvent produire ou non des particules Gag-Pol de MLV.
Les lignées cellulaires peuvent produire ou non des particules Gal-Pol de MLV ou d'autres rétrovi~nis de mammifères de type C, notamment le virus MLV
de Moloney ou d'autres rétrovirus tels que des Ientivirus, par exemple HIV-1.
Un autre test de caractérisation dés protéines mutées ou chimères de l'invention consiste à infecter des cellules cibles exprimant un récepteur rétroviral susceptible d'être reconnu par une protéine chimère ou mutée de l'invention, par L'intermédiaire de particules virales contenant ces protéines chimères ou mutées.
Comme cellules cibles, on peut utiliser les cellules de rat XC et XC-A-ST, ces dernières étant dérivées des cellules XC par transfection d'un plasmide exprimant le domaine de liaison de l'enveloppe rétrovirale amphotrope capable d'occuper le récepteur rétroviral amphotrope.
Comme particules virales, on peut utiliser celles produites par les 3o rétrovirus MLV ou autres rétrovirus de mammifères de type C, notamment le virus MLV de Moloney ou d'autres rétrovirus tels que des lentivirus, par exemple HIV-I.

Cette infection est effectuée dans des conditions limitantes, c'est-à-dire telles que la densité du récepteur (c'est-à-dire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant l'attachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux de virus comportant une glycoprotéine d'enveloppe ni mutée, ni chimère et par moins de 100 fois Ie titre infectieux de virus comportant une enveloppe mutée ou chimère de l'invention correspondant à la susdite enveloppe ni mutêe, ni chimère.
La comparaison est effectuée par rapport au titre infectieux de virus comportant une enveloppe non chimère et non mutée ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles telles que des cellules XC.
Cette infection est comparativement effectuée sur deux types cellulaires, le deuxième étant directement dérivé du premier et a pour effet de réduire le nombre de récepteurs rétroviraux disponibles, c'est à dire telle que la diminution de l'expression de surface du récepteur diminue par au moins 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale ni mutée, ni chimère.
On compare alors cette valeur à celle obtenue pour des virus comportant l'enveloppe chimère ou mutée. Une diminution de moins de 100 des titres infectieux des virus comportant la susdite enveloppe chimère ou mutée entre lés deux types cellulaires indique donc une amélioration du caractère fusogénique de 2o cette dernière.
Des séquences.' riches en proline avantageuses selon l'invention côrrespondent à l'une des séquences suivantes Az 2s A3Mo s Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence AZ comporte la suppression du deuxième /3-turn qui a pour effet d'être plus fusogéniqué que l'enveloppe parentale en test de syncytia.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence A, comporte la suppression du troisième (3-turn s qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test de syncytia.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence A3Mo comporte la suppression du troisième ~3-turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test lo d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence A4 comporte la suppression du quatrième (3-turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
15 Par rapport à Ia région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence C2 comporte la délétion des ~3-turns 9 à 13 qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à Ia région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un 20 MLV amphotrope, Ia séquence C, comporte la délétion des, (3-turns 11 à 13 qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveioppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à la région riche en proline de Ia glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence C, comporte la délétion du dernier ~i-turn (13°) 25 qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la sêquence CS comporte la délétion des 11 ° et I2° ~3-turns qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test 3o d'infection teI que défini plus haut.

Des protéines chimères avantageusès selon l'invention, correspondent à
l'une des séquences suivantes PROMO
- PRO FR
s - BD PRO MO
- PRO C MO
- PRO TM MO
- PRO CTM MO
to La séquence PROMO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope (souche Moloney).
La séquence PRO FR correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline 15 homologue du MLV écotrope (souche Friend) La séquence BD PRO MO correspond à Ia séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en ~ proline est remplacée par Ia région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle Ie domaine de liaison a été
remplacé par le domaine de liaison homologue du MLV écotrope.
2o La séquence PRO CMO correspond à la séquence de MLV amphotrope J
dans laquelle la régiôn riche en proline est remplacée par la région riche en prOline homologue du MLV écotrope et dans laquelle le domaine C a ëté
remplacé par le domaine C homologue du MLV écotrope.
La séquence PRO TM MO correspond à la séquence de MLV amphotrope 25 dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle le domaine TM a été
remplacé par le domaine TM homologue du MLV écotrope.
La séquence PRO CTM MO correspond à Ia séquence de MLV
amphotrope dans laquelle la région riche en proliné est remplacée par Ia région -3o riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle les domaines respectifs C et TM ont été remplacés respectivement par les domaines C et TM
homologues du MLV écotrope.

WO 99/36561 1,5 PCT/FR99100016 Des protéines chimères avantageûses selon l'invention comportent l'une des sëquences riches en proline correspondant à l'une des séquences suivantes Az As A3Mo IO Cs et sont telles que l'un au moins de leurs domaines fonctionnels suivants domaine de liaison, domaine. C, domaine transmembranaire, est remplacé par le domaine homologue de MLV écotrope.
15 On montre dans le cadre de la' présente invention que Ia région riche en proline (PRR) de l'enveloppe des virus de leucémie murine (MLV), localisée entre Ie domaine de liaison au récepteur de la partie amino terminale de Ia SU
et le domaine d' interaction avec la TM de la partie carboxy-terminale de la SU, sert d'intermédiaire dans les changements de conformation de l'enveloppe et 2o dans l' activation de la fusion. Dé plus, on montre que les beta-turn potentiels de ,>
la région riche en proline déterminent la stabilité de l'association SU-TM et le séuil d'activation de la fusion cellule-cellule et de la fusion virus-cellule.
Afin d'identifier la (ou ies) régions) responsables) de la plus grande fusogénicité de l'enveloppe écotrope des MLVs, on a généré une série 2s d'enveloppes chimères dans lesquelles les domaines d'enveloppes amphotropes BD, PRO, C et TM sont échangés avec leur homologue de l'enveloppe écotrope (Fig 1B). Les enveloppes résultantes sont alors identifiées selon le(s) domaines) écotrope(s) substitué(s). La fusion cellule à cellule est évaluée par Ia formation de syncytia après une coculture de 24 heures entre différentes cellules cibles 30 (indicatrices) et des lignées cellulaires, produisant ou non des particules Gag-Pol de MLV (5), préalablement transfectées avec l'une ou l'autre des enveloppes.
Bien que le niveau d'expression à la surface cellulaire des enveloppes parentales WO 99/36561 1 ~ PCTIFR99/00016 et chimères soient similaires (Fig. 4ä), deux phénotypes différents de fusion cellules-cellules sont observés. Les enveloppes CMO et TMMO, tout comme l'enveloppe sauvage MLV-4070A, induisent faiblement des syncytia.
Cependant, les enveloppes BDMO, PROMO et PROFR induisent fortement la formation de syncytia, similaires â ceux induits par l'enveloppe écotrope.
(Fig 2)_ La formation de syncytia n'est pas affectée par la présence ou le manque de particules Gag-Pol (données non montrées), montrant que la fusion mesurée dans ce test se produit par des contacts directs cellules-cellules plutôt que des contacts cellulaires médiés par les particules virales. Des comptes rendus antérieurs indiquent que Ia fusogénicité élevée de l'enveloppe BDMO est due principalement à sa capacité à interagir avec le récçpteur écotrope (18) .
Cependant, une importante fusogénicité est également observée avec les chimères portant le domaine BD amphotrope (Figs. I et 2) avec tous les types cellulaires utilisés, incluant les cellules cibles de rat, de souris et d'homme, is présentant en plus ou non le récepteur écotrope {données non montrées).
Ainsi, les différences observées, lors de Ia formation de syncytia, entre les enveloppes amphotropes parentales et chimériques sont dues à des nouvelles propriétés, différentes de l'interaction du BD avec le récepteur.
Comme décrite pour les virus de leucémie féline (8) et comme suggérée par l'étroite apparenté avec les MLV, la répétition régulière de proline dans la PRR
,.
entraîne peut-être son repli en hélice poly-proline à "beta-turn » (27), une structure secondaire qui exerce des forces "élastomériques", pouvant remplir Ia fonction de "ressort moléculaire" (26). A cause de la localisation critique dé la PRR, entre les domaines BD et C qui influencent tous deux la fusion, son rôle dans la fusion a été
évaluë directement. Des différences dans le nombre et l'arrangement des "beta-turn"
prédits dans Ia PRR des enveloppes 4070A, par rapport à celle du MoMLV, laissent prévoir un ressort plus réactif pour ce dernier ce qui pourrait expliquer la fusogénicité
accrue du PROMO. Les mutants ponctuels ou de délétion, C2, C3, C4 et C5, conçus pour supprimer certains des sept "beta-turn" carboxy-terminaux de la PRR
3o amphotrope, ont été testés dans le test de fusion cellule-cellule XC. Ils se sont avérés faiblement fusogéniques comme l'enveloppe parentale amphotrope (Fig. 3B). Les "beta-turn" induits par les prolines de la PRR sont moins entremélés dans la partie WO 99/36561 I ~ PCT/FR99/00016 amino-terminale que dans l'extrémité carboxy terminale. Ainsi, chacun des quatre "beta-turn" potentiel de l'enveloppe 4070A ont pu ëtre supprimés individuellement par substitution d'une proline par une valine, une alanine ou une isoleucine, donnant les mutants AI, A2, A3, A3M0 et A4 (Fig. 3C). Un second acide aminé a été
substitué
dans les mutants A2 et A3 afin d'éviter la formation d'hélice alpha ou de feuillet beta potentiels, absent à l'origine dans les prédictions de structure de Ia PRR des MLV
(non montré). Les enveloppes AI et A4, pour lesquelles, respectivement, le premier ou le quatrième "beta-turn" amino terminal a été muté, conservent une répétition régulière de trois "beta-turn" contigus et elles n'induisent pas une formation de 1o syncytia augmentée {Table 1). Par opposition, les enveloppes A2 et A3 dans lesquelies la continuité de ces "beta-turn" est interrompue {Figs. 3C et 3D), sont très fusogéniques (Tableau 1), démontrant ainsi l'importance critique des "beta-turn"
contigus de la PRR dans la "médiation" de ia fusion suite à la reconnaissance du récepteur. Dans le but de tester si cette fusogénicité accrue était due à un besoin inférieur en molécule Pit-2, on a comparé la fusion cellule-cellule en utilisant des cellules XC ou XC-A-ST. Dans ces dernières, l'expression constitutive de BD
amphotrope réduit la quantité de récepteur Pit-2 fonctionnel (Tableau 1).
L'interférence est efficace envers l'enveloppe MLV-4070A alors qu'une fusogénicité
élevée est toujours observée avec les enveloppes PROMO, PROFR, A2 et A3.
2o Néanmoins, la fusion est toujours dépendante de Pit-2 puisque des cellules CHO
,.
n'exprimant pas Pit-2 fusionnent seulement après l'expression de novo de Pit-2 (non mbntré). Ainsi, des mutations dans les "beta-turn" de la PRR semblent abaisser le seuil d'activation de la fusion prenant part après la reconnaissance du récepteur.
Après la fusion cellule-cellule, on a examiné la fusion cellule-virus en comparant l'infectivité des virions portant l'enveloppe parentale ou chimère.
Les titres sont équivalents sur les cellules de rat XC (Tableau 1), de souris, d'homme et sur les CHO transfectées avec le gène d'expression du récepteur Pit-2. De manière surprenante, les chimères hautement fusogéniques PROMO et PROFR, ainsi que les mutants ponctuels A2 et A3 ont conduit à des titres indétectables ou significativement rëduits sur toutes les cellules testées. Les autres enveloppes, confèrent des titres dans une gamme de.l0e6-10e7 unités infectieuses par ml (u.i./ml) sur les cellules XC, similaires à ceux obtenus avec les deux enveloppes parentales 4070A et MO.
Bien que WO 99/365b1 18 PCTIFR99/00016 I'infectivité des virions générés avec' l'enveloppe amphotrope parentale soit dramatiquement réduite sur les cellules XC-A-ST, tous les mutants de la PRR
infectieux, à l'exception du Al, sont significativement moins sensibles à
l'interférence (Tableau I). Le fait que les mutants de Ia partie carboxy-terminal de la PRR
n'exhibent pas de modifcation dans la fusogénicité cellule-cellule mais montrent néanmoins une augmentation de I' infectivité (fusion virus-cellule), démontre que les motifs amino, mais aussi carboxy terminaux, influencent la fusogénicité. Les tests de liaisons aux récepteurs, effectués en utilisant un anticorps dirigé contre la SU, montrent que l'affinité Pit-2/SU n'est pas significativement altérée pour ces 1o enveloppes (non montré). L'infection de CHO transfectées exprimant Pit-2, par opposition au défaut d'infection des CHO parentales, confirme la nécessité de Pit-2 pour l'entrée des virions.
Puisque la faible infectivité des virions portant les enveloppes mutantes fusogènes en tests cellules-cellules est due à une perte de SU accrue (Fig.

4), la PRR
paraît jouer un rôle critique dans l'association SU/TM et la conformation de l'enveloppe. Le relargage accru de SU, pour les mutants PROMO, PROFR, A2 et A3, suggère que la PRR exerce sa fonction de régulation de la fusion en interagissant avec des régions adjacentes, et que la destruction de ces interactions stimule la fusion. La combinaison de PRR écotropique avec des régions homologues avales, comme dans les chimères PROCMO, PROTMMO et PROCTMMO, ou avec Ie domaine amont BD, comme pour 1'énveloppe BDPROMO (Fig. IC), augmente ia stabilité, comme estimé avec Ia perte de SU (non montré) (Fig. I).
Finalement,. on démontre qu'après Ia reconnaissance du récepteur, PRR est un déterminant clef des changements de conformation de l'enveloppe et de la fusion membranaire. De plus, l'arrangement caractéristique des "beta-turn" de la PRR
en association avec les domaines avals C et TM, confère des propriétés distinctes entre ces enveloppes MLV.
Les applications potentielles de l'invention sont les suivantes - thérapie génique ex vivo ou in vivo pour le transfert de gène dans des -3o cellules exprimant un nombre limité de récepteurs rétroviraux, par les vecteurs rétroviraux dérivés des rétrovirus de type C, mammifères ou des tentivirus comportant des glycoprotéines d'enveloppe mutées ou chimères comme décrites dans l' invention, . des glycoprotéines d'enveioppe mutées ou chimères comme décrites dans l'invention, ainsi qu'un peptide ou un domaine protéique capable de s rediriger la liaison du vecteur rétroviral vers une cible moléculaire spécifique.
I. Légendes des figures 1o Figs. lA, 1B, 1C et 1D : Représentation schématique des enveloppes chimères et de leurs propriétés.
Fig, lA. Les boites vides sont des séquences dérivées du MLV amphotrope, les boites remplies sont des séquences issus du MLV écotrope de Moloney (noire) ou MLV écotrope de Friend (grise) et les boites hachurées sont des séquences communes 15 à ces deux MLV. BD, domaine de liaison au récepteur; PRO, région riche en proline;
C, domaine carboxy terminal de Ia SU; TM, ectodomaine et domaine d' ancrage de la sous unité TM. Pour chaque domaine, leur pourcentage d'identité, ainsi que les quatre premiers acides aminés N-terminaux, sont indiqués. Un codon stop prématuré
(flèche verticale) est introduit dans la queue cytoplasmique de la sous unité TM du MLV
2o amphotrope pour générer la glycoprotéine d'enveloppe mutante fusogénic ARIess.
,.
Fig. 1B. Les-mutants de simple substitution.
Fig. 1C. Les mutants de substitution combinés.
Fig. 1D. Les résultats des tests de fusion cellule-cellule: (-), absence de syncytia; (+), présence de syncytia seulement dans une coculture avec les cellules 2s XC; (+ +), présence de syncytia à la fois dans une coculture avec des cellules de rat XC mais aussi avec des cellules interférentes XC A-ST. Les résultats des tests d'infection: (-), moins de 10e2 lacZ u.i.lml; (+) et (++), plus de IOe2 lacZ
u.i./m1;
(++); enveloppes avec un seuil d'activation de la fusion réduit, capables .
d'efficacement infecter les cellules interférentes XC-A-ST aveç un titre supérieur à
3o IOe2 lacZ u.i./ml.

WO 99136561 20 PCTlFR99/00016 Fig. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I : Tests de fusion des mutants de simple substitution avec des cellules XC.
Des cellules TE671 transfectées avec les vecteurs d'expression des glycoprotéines d'enveloppe chimères indiquées (Fig 1) sont cocultivées avec des cellules indicatrices XC pendant 24 heures. Grossissement x250.
Figs. 3A, 3B, 3C et 3D : Mutagenèse de la région riche en proline amphotrope 4070A.
Fig. 3A : Alignement de la PRR du MLV de Moloney (Mo), de Friend (Fr) lo et 4070A (A).
Fig. 3B : Mutants ponctuels (acides aminés en petits caractères gras) ou de délétion (tirets) de l'extrémité C-terminale de la PRR du MLV 4070A.
Fig. 3C : Mutants ponctuels de l'extrémité C-terminale de la PRR du MLV
4070A. Les acides aminés changés ou insérés sont mis en évidence ~en petits ls caractères gras.
Fig. 3D, 3E, 3F, 3G : Proills de probabilité des "beta-turn" des PRR des MLV 4070A (4070A), Moloney (Moloney) et des mutants ponctuels de la PRR du MLV 4070A dont le deuxième (A2) ou troisième (A3) bêta turn a été supprimé.
Les valeurs de l'axe y représente la probabilité de beta-turn p(turn)*l0e-4 pour chaque 2o résidus du peptide (sur l'axe x). L'analyse des beta-turn a été effectué
grâce au J, logiciel PC/Gene (Version 6.26, InteiliGenetics, Belgium).
Fig. 4 : In~munoblots des glycoprotéines d'enveloppe amphotrope dont la fusogénicité est augmentée. Les cellules ont été transfectées avec les enveloppes 2s indiquëes dans les Figs 1 et 3 et l'expression de leur SU et de leur précurseur d'enveloppe (PR) est estimée (cell lysates). L'instabilité de l'enveloppe est montrée par l'expression de surface diminuée de Ia SU relativement au PR (préparations de membrane), son relargage de la SU (shedding) accru dans le milieu de culture (surnageant) et dans les virions. Les transferts de protéine (western blots) ont été
3Q révélés avec les anticorps indiqués.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Fig. 5 : elle représente la'~ séquence de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale de MLV écotrope (domaine BD, PRO, C et TM) (souche Moloney).
Fig. 6: elle représente la séquence de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale de MLV amphotrope (domaine BD, PRO, C et TM) (souche 4070A).
Fig. 7 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de Mo MLV (Moloney MLV).
1 o Fig. 8 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV-4070A.
Fig. 9 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV-MCF (souche 247).
IS
Fig. 10 : elle représente la région riche en proline de Ia glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de GALV, souche Seato.
Fig, lI : elle représente ia région riche en proline de la glycoprotéine de 20 l'enveloppe rétrovirale de MLV 10A1.
Fig. 12 : elle représente la région riche en proline de Ia glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV xénotrope, souche NZB.1.V6.
2s Fig. I3 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de FeLV A.
Fig. 14 : elle représente la séquence de A2.
3o Fig. IS : elle représente Ia séquence de A3.
Fig. 16 : elle représente la séquence de A,Mo.

Fig. 17 : elle représente la séquerice de A4.
Fig. 18 : elle représente la séquence de C2.
Fig. 19 : elle représente Ia séquence de C3.
Fig. 20 : elle représente la séquence de C4.
Fig. 21 : elle représente la séquence de C5.
lo Fig. 22 : elle représente la séquence de PROMO.
Fig. 23 : elle représente la séquence de PRO FR.
Fig. 24 : elle représente la séquence de BD PRO CMO.
Fig. 25 : elle représente la séquence de PRO CMO.
Fig. 26 : elle représente ta séquence de PRO CTM MO.
Fig. 27 : e11~ représente la séquence de PRO TM MO.

Tableau 1 A. Résultats des tests de fusion cellule-cellule.
enveloppe index de fusionaexprimée à Ia surface XC XC-A-ST
0,0210,01 0,0210 MO' 1512 1411 lo Ad 0,2 f0,1 0,0510,02 ARixss' 7414 0,8510,03 PROMO' 1713 1613 PROFR' 18 t 3 23 t 6 A2' 1311 17 f 1 A3' 1411 1713 a : index de fusion calculé selon la formule (N-S)/T (N, nombre de noyaux dans les syncytia ; S, nombre de syncytia ;
T nombre total de noyaux) 2o b : cellules non transfectée.
c : syncytia contenant plus de 20 noyaux !A .
d : syncytia contenant moins de 4 noyaux e: syncytia contenant plus de 40 noyaux avec les cellules XC et moins de 10 noyaux avec les cellules XC A-ST.

WO 99/36561 24 PCTlFR99/00016 B. Résultats des tests d'infectiôn.
enveloppe Titres infectieux' exprime sur niveau les virions XCXC-A-ST d'interfrence MO 7.1x106 6.1x106 1 A lxl0' 6.4x103 1,369 PROMO 2.2x10' 1x10' na 1o PROFR < 1x10' < 1x10' na A1 8.4x106 2.3x/03 3,138 A2 < 1x10' < 1x10' na A3 7.8x10' 3x10' na A3M0 1.2x10' 3.3x104 302 A4 5.7x/06 8./x10' 605 C2 7.6x106 5.7x105 11 C3 5 4x106 4.7x105 10 C4 2.4x 106 I .7x15 12 CS 9.4x106 2.7x10' 299 a : lacZ unités infectieuses par ml (u.i./ml) b : les niveaux d' interférence sont calculés selon la formule (titretxc~/titre ~xc-a-s,~) X (titre MO ~xc-w-sr~~ titre MO ~xc~) na : non appliçable II. MATERIEL ET METHODES
IL I. Lignées cellulaires.
Les cellules TELacZ contiennent le vecteur rétroviral MFGnlsLacZ (25~
responsable de l'expression d'une Beta-galactosidase nucléaire. La lignée cellulaire TELCeB6 (S) dérive de la lignée TELacZ et a été obtenue par transfection d'un plasmide exprimant les protéines gag et pol de MoMLV. Ces cellules produisent donc des particules rétrovirales non infectieuses, car dépourvues d'enveloppes, véhiculant le gène marqueur nlsLacZ.
lo Les cellules TELCEB6, XC, RD et CEAR13 (12) sont cultivées en milieu DMEM (Life-Technologies) supplémenté par 10 % de sérilm de veau foetal (FCS, Life-Technologies). Le milieu de culture des CEAR13 est de plus supplémenté
avec de la proline (Sigma) à 10 ~.g/~,1. La lignée NIH3T3 (ATCC CRL 1658) est cultivée en milieu DMEM (Life-Technologies) supplémenté par 10% de sérum de veau nouveau-ls né (Life-Technologies).
Les cellules XC-A-ST ont été obtenues par transfection stable dans les cellules XC du plasmide pA-ST (5) exprimant le fragment N-terminal de la SU du virus MLV-4070A capable de lier et bloquer le rëcepteur amphotrope.
2o IL2. Plasmides et construction des mutants.
Les plasmides codant pour les enveloppes amphotrope 4070A (FBASALF)

(5), écotrope de Moloney (FBMOSALF) et écotrope de Friend C57 (FB3) permettent l'expression de l'enveloppe. Les gènes d'enveloppe sont sous le contrôle du LTR (5~
du MLV de Friend FB29. De plus ces plasmides contiennent te gène marqueur phléo, 25 permettant la sëlection par la phléomycine.
Pour générer les diverses constructions d'enveloppes mutantes, une technique de mutagenèse par PCR a été utilisé.
Pour la construction Rless (20), un fragment d'ADN a été obtenu par PCR
(amplification par polymérase en chaîne) sur l'enveloppe MOMLV (23) au moyen des oligonucléotides OURLess 5'-TTC TAT GCG GAC CAC ACA GGA et OLRLess 5'-ATC TCA GTA GTC CAG GCT TTA TGA TAG TCG ACA TGC AT. Après WO 99136561 2~ PCT/FR99/00016 digestion par les enzymes SpeI et AccI, ce fragment a été sous-cioné entre les sites SpeI et C(aI du plasmide FBMOSALF. Un fragment NdeI/CIaI a alors été retiré de ce dernier plasmide, et a été remplacé par NdeI/CIaI provenant du vecteur FBASALF. Il en résulte un vecteur d'expression pour une enveloppe amphotrope contenant un codon stop prématuré quelques nucléotide en amont du codon stop normal. Cette modification réduit Ia longueur de la partie cytoplasmique de la glycoprotéine amphotrope et suffit à la rendre très fusogénique et inductrice de syncytia en culture cellulaire (20).
Pour la construction des enveloppes chimères PROMO et PROFR, un.
1 o fragment PCR correspondant à la région riche en proline des enveloppes des virus Moloney-MLV (MO) et Friend-MLV (FR), avec un site Ap~I et un site KpnI créés au début et à Ia fin de cette région ont été généré grâce aux nucléotides : Up MO
ApaI
5'-CCA ATA GGG CCC AAC CCC GTT CTG et Low MO KpnI 5'-AAC GTG GTA
ÇCC GCC GGT GGA AGT TGG G pour la PCR sur le plasmide FBMOSALF; Up ls FRA pal GTC CCG ATA GGG CCC AAC CCC GTC CTG et Low FR KpnI GAA
TGC GGT ACC TGC TGG CGG GGG CTG AGT GGG pour Ia PCR sur le plasmide FB3. Les fragments digérés ApaI/KpnI sont clonés entre les sites ApaI
(position 653) et BamHI (position 802) de l'enveloppe 4070A à l'aide d'un fragment adaptateur KpnIlBamHI généré par PCR sur le plasmide FBASALF à l'aide des oligonucléotides 2o Up A Kpnï 5'-TATGCGGTACCGGAGATAGACTACTAGCTC et Low A BamHI
S'-GGTAGTAGGATCCTGAGCCGG. Les autres enveloppes chimères ont été
générées à l'aide des enveloppes décrites ci dessus par sous clonage de différents fragments. Le plasmide FBASALF a été ouvert en XhoI-CIaI et cet ADN a été
utilisé
pour cloner les fragments : (i) XhoI-DraIII de l'enveloppe PROMO et le fragment 25 DraIII-CIaI de l'enveloppe MO, générant l'enveloppe PROCTMMO; (ü) NcoI-CIaI
d~
l'enveloppe MO, co-liguê avec un fragment adaptateur Xhoï-NcoI de l'enveloppe A, générant l'enveloppe TM MO; (iii) Xhol-NcoI de l'enveloppe MO grâce à un fragment NcoI-CIaI de l' enveloppe A, générant la chimère PROCMO. La construction PROTMMO a été obtenue en sous clonant le fragment XhoI-BamHI de !'enveloppe 3o PROMO dans le vecteur portant l'enveloppe TMMO digéré par les mëmes enzymes.
Enfin, la chimère BDPROMO a êté faite en co-ligant le fragment DraIII-CIaI de l'enveloppe PROMO dans le plasmide FBMOSALF, digéré par les enzymes BamHI-CIaI, avec un fragment Baml-II-DraIII de l'enveloppe M0.
Les mutants de la région riche en proline amphotrope ont été générés par la méthode de mutagenèse par PCR. Un oligonucléotide codant ou « sens » (« upper ») 80S Fc (S'-TCC AAT TCC TTC CAA GGG GC), localisë juste en amont du site Xho I de l'enveloppe 4070A (à la position S94) (16) a été utilisé en combinaison avec des oligonucléotides fournissant divers sites de restriction (précisés entre parenthèse et dont le site est souligné dans la séquence de l'oligonucléotide) et insérant la mutation souhaitée (les nucléotides ne s'appariant pas sont indiqués par une lettre minuscule) to A2 UpA2 S'-CGA GTC CCC ATA GGG ATC CAA CCG GTA TTA CCC GAC C
(Agel;7, A3M0 LowA3M0 S'- GCCCAACCCAGTGCTAGCCGACCAAAGAC
(Nhe1), A3 P249I/Q2S1V S'-CCA GTA TTA atC GAC ~tc AGA CTC CCT TC (Aat I17; A4 P'2S4I S'-GAC CAA AGA CT~ ata TCC TCA CCA A (EcoRV); CS
P286I/P289L S'-CTC AAC CTC Cat TAC tAG TCt AAG TGT CCC AC (Spe1). Les Is oligonucléotides complémentaires de ces amorces (LowA2 GGT CGG GTA ATA
CCG GTT GGA TCC CTA TGG GGA CTC G; Low A3 GAA GGG AGT CT,g açG
TÇG atT AAT ACT GG; LowA3M0 GTC TTT GGT CGG CTA GCA CTG GGT
TGG GC; Low A4 TTG GTG AGG Ata tcA GTC TTT GGT C; Low CS GGC TGT
GGG ACA CTT aGA CTa GTA atG GAG GTT GAG GGT G) ont été utilisés avec 2o l'amorce Low ABamHI s'hybridant au niveau du site BamFiI (position 802) de l'enveloppe 4070A. ixs deux fragments générés pour chaque mutant sont digérés avec les enzymes adéquates et ils sont ligaturés dans le plasmide FBASALF, digéré
en XhoT-BamHI.
La même stratégie a été utilisé pour les mutants de délétion C2, C3 et C4.
25 L'oligonucléotide SOSFc, s'hybridant en amont du site XhoI, a étë utilisé
avec les oligonucléotides LowA-C4 Kpnl: ATC TCC GGT ACC GAC ACT TGG ACT TGT
AGG GGA GGT TGA GGG, LowA-C3 KpnI: ATC TCC GGT ACC TGG GGG
AGG GGA GGT TGA GGG TGT ACT GGT AGT GGA AGG, et LowA-C2 KpnI:, ATC TCC GGT ACC TGG GGG GGG TGT ACT GGT AGT GGA AGG GGG GTA
3o ACT GGT générant, après digestion, des fragments XhoI-KpnI. Chaque fragment est co-ligué avec un fragment KpnI-BamHI, issu de l'enveloppe PROMO, dans le vecteur FBASALF digéré en XhoI-BamHI.

Les plasmides exprimant les enveloppes sont transfectés par la méthode de précipité au phosphate de calcium (22) dans la lignée TELCeB6. Les cellules transfectées ont été sélectionnées avec de la phléomycine (50 ~cg/ml) et les clones résistants ont été trypsinés en masse. Les cellules à confluence ont été
utilisées pour d'une part récupérer des surnageants viraux après une nuit d'incubation dans du milieu ' normal, et d'autre part pour faire des lysats cellulaires. Les surnageants viraux sont utilisés pour des tests d' infection, des tests de liaison au récepteur, et le reste est soumis à une ultracentrifugation pour obtenir des culots de virus analysés par immunoblot.
IL3. Immunoblot.
Les cellules productrices de virus sont lysées pendant 10 minutes à
4°C dans un tampon Tris-HCI (pH ?,5), contenant du TritonX100 1 %a . SDS 0_OS % _ deoxycholate Smg/ml, NaCI 150 mM et un cocktail d'inhibiteur de protéases (PMSF
I mM, Leupeptin 6 mM, Aprotinin 0,3 mM). Ces Iysats sont centrifugés 10 minutes à
10 000 g afin de culotter tous les orgaaites, et les surnageants sont congelés à -80°C
jusqu'à l'analyse. Les échantillons viraux sont obtenus par ultracentrifugation de surnageants viraux (6 ml) dans un rotor SW4I Beckman (30000 rpm, 1 heure, 4°C).
Les culots sont resuspendus dans 80 ld de PBS froid (Phosphate Buffered Saline) 2o (tampon phosphate câlin), Life-Technologies) et congelés à -80°C.
Les échantillons (30 ~.g de lysats cellulaires ou 20 ~,I de virus purifiés) sont mélangés dans rapport de 5:1 (vlv) à du tampon 375 mM Tris-HCl (pH 6,8) contenant 6 % de SDS (sodium dodécyl sulfate), 30 % beta-mercaptoéthanol, I O % glycérol et 0, 06 % de bleu de bromophénol, puis dénaturés 3 minutes à 95°C et analysés sur gel dénaturant d'acrylamide 10%/SDS. Après transfert des protéines sur membrane de nitrocelIulose, le marquage immunologique est effectué dans du TBS (Tris Base Saline (tampon Tris), pH 7,4) en présence de lait écrémé (S %a) et de Tween 0,1 %. Les anticorps (Quality Biotech Inc., U.S.A.) provenant d'antisérum de chèvre dirigés contre la gp70-SU de Rausher Leukemia Virus (RLV) ou la p30-CA de RLV ont été utilisés aux dilutions de 1:2000 et 1:/0000 respectivement. Un anticorps provenant d'un antisérurn de lapin dirigé contre la pISE-TM a été utilisé à la dilution de 1:1000. Les "Mots" ônt été

révélés par utilisation d'un anticorps conjugué, couplé à la peroxydase, d'origine lapin ou chèvre dirigé contre les immunoglobulines de chèvre ou de lapin, respectivement (Dako, U.K.), grâce à un kit de chimioluminescence (Amersham Life Science).
s IL4. Tests de liaison au récepteur.
Les cellules cibles sont rincées au PBS et décollées par une incubation de 10 minutes à 37°C dans du versène 0,02% dans PBS. Les cellules sont rincées dans du PBA (PBS contçnant 2 % de FCS (sérum de veau foetal) et 0,1 % de sodium d'azide qui permet de bloquer l'endocytose membranaire). 106 cellules sont alors incubées 1o pendant 1 heure à 37°C avec les différents surnageants viraux (2 ml) contenant la SU
soluble. Ces surnageants sont déchargés des particules virales précipitées par ultracentrifugation ou non. Après deux rinçages par du PBA, les cellules sont incubëes en présence d'anticorps monoclonal, de rat ou de souris, dirigés contre la SU
(83A25)

(6) ou contre la TM (MAb2), respectivement, pendant 45 minutes à 4°C.
Les cellules 15 subissent deux lavages dans du PBA puis sont. incubées en présence d'anticorps conjugués, fluorescents, dirigés contre les immunoglobulines de rat (Cayla, F) ou de souris (Dako, U.K.), pendant 45 minutes à 4°C. Les cellules mortes sont ensuite contre colorées avec de l'iodure de propidium (20 p,glml) 5 minutes à
4°C. Après deux rinçages dans du PBA, la fluorescence des cellules vivantes est analysée par 2o fluorométrie, FACSÇalibur, Beckton Dickinson).
ILS. Test de marquage cellulaire.
Les cellulés portant les enveloppes sont lavées, décollées et rincées de Ia même manière que les cellules cibles du test de binding. 106 cellules sont alors 25 incubées directement avec l'anticorps de rat anti SU (83A25) pendant 1 heure à 4°C.
Les étapes de lavages, d'incubation avec l'anticorps secondaire couplé au FITC
et d'analyse au FACS sont identiques au test de binding.
ILG. Tests d'infection.
3o Les cellules cibles NIH3T3 sont ensemencées la veille dans des plaques, 24 puits à une densité de 5.10' cellules par puits. Les cellules sont incubées avec I ml y !
WO 99!36561 30 PCTlFR99l00016 de différentes dilutions du stock viral én présence de polybrène à 8 ug/ml (un polycation, inhibiteur des répulsions électrostatiques entre les particules virales et les cellules). Après 3 à 5 heures d'incubation à 37°C, les surnageants sont remplacés par _ du milieu frais et les cellules sont incubées 2 jours à 37°C. Une fois les cellules fixées avec une solution de glutaraldhéhyde, agent pontant, à 0,5 % dans du PBS, elles sont colorées à l'aide d'un substrat, le 5-bromo-4-chioro-3-indolyl-Beta-D-galactopyranoside ou X-Gal, pendant 12 heures. Les titres viraux sont rapportés en nombre de colonies positives par ml de surnageant viral (LacZ i.u./ml).
1 o IL7. Immunoprécipitation.
Une boite de cellules confluantes de diamètre 35 mm est rincé une fois âvec du milieu DMEM (milieu de Eagle modifié par Dubelcco) sans méthionine, ni cystéine, supplémenté par 10% de sérum de veau foetal dialysé afin d'enlever les acides aminés, puis incubée I h 30 à 37°C dans ce mëme milieu. Après un marquage ~s de 45 minutes grâce à Ia méthionine et la cystéine S35 (100 mCilml; TranS35-Label, ICN Pharmaceuticals), les cellules sont lavées, puis incubées à 37°C
dans du milieu de culture (chasse). Les cellules sont Iysées à différents temps dans une solution à
0,5 % NP40, 150 mM NaCI, 20 mM HEPES supplémenté avec 1 mM PMSF pendant 20 minutes à 4°C. Ix lysat est centrifugé à 10 000 g et le surnageant congelé à -80°C.
20 Ces surnageants sont çlarifiés grâce à du sérum de chèvre non immun (1/100) et de la ProtéineA-Sepharose (6MB, Pharmacia) à 4°C pendant 2 heures ou sur la nuit. Après centrifugation, les surnageants sont incubés avec un antisérum de chèvre dirigé contre la gp70-SU de Raucher Leukemia Virus (RLV) à 1/100 ième pendant 1 heure à
4°C.
La protéine A-Sepharose 40% dans du tampon RIPA (150 mM NaCI, 50 mM Tris, 2s 1 % Deoxycholate, 1 % Triton100X, 0,1 % SDS) est ajouté pour 1 heure à
4°C et les complexes sont précipités par centrifugation à 10 000 g pendant 5 minutes.
Après trois lavages dans du tampon RIPA, les immunoprécipitats sont sëparés sur gel d'acrylamide-12%/SDS. Les protéines sont fixées dans une solution à 25%
d' isopropanol et 10 % d' acide acétique dans de l' eau et la révélation se fait grâce à un 3o écran P32 PhosphoImager (Biorad).

ILB. Tests de Fusion.
Deux jours après leur transfection, les cellules effectrices portant l'enveloppe sont ensemencées à 20% de confluence. Trois à quatre heures après, trois fois plus de cellules cibles sont ajoutées. La cocuIture est incubée 24 heures à
37°C puis fixée s avec une solution de gIutaraldhéhyde à 0,5 % dans du PBS. Les noyaux sont tout d'abord colorés grâce à une solution de May-Grünwald (Sigma diagnostics, USA) puis les cytoplasmes avec du Giemsa (Merk, D) dilué au I/20ème. Le nombre de syncytia sur un centimètre carré est rapporté ou relativisé entre les enveloppes.
y,:

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Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus.

2. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, laquelle séquence riche en proline correspond:
- soit à la séquence riche en proline . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
amphotrope, ou . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF, . de la glycoprotéiné d'enveloppe rétrovirale d'un MLV10A1, . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV, ou . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
xénotrope, ou . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un .beta.-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline, - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

3. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire.

4. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline correspondant à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité
transmembranaire.

5. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV, laquelle séquence riche en proline correspond:
- soit à la séquence riche en proline . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
amphotrope, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un .beta.-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline, - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

6. Séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie C-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 .beta.-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.

7. Séquence riche en praline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie N-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 .beta.-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.

8. Protéine mutée correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF
ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glyçoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un .beta.-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.

9. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à'la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF
ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline est remplacé
par le domaine riche en praline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.

10. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF

ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle:
* le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, * et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité
transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.

11. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF
ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle:
* le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un .beta.-turn (dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline), * et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité
transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.

12. Protéine mutée ou chimère selon l'une des revendications 8 à 11, possédant l'une au moins des propriétés suivantes:
- il y a formation de syncytia après cocultures entre des cellules cibles exprimant une molécule de surface servant de récepteur rétroviral par interaction avec le domaine de liaison porté par une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale et des lignées cellulaires produisant ou non des particules Gag-Pol de MLV (ou de rétrovirus de mammifères de type C ou de lentivirus) préalablement transfectées avec un vecteur d expression pour l'une des susdites protéines, - il y a infection de cellules cibles exprimant un récepteur rétroviral reconnu par le domaine de liaison d'une glycoprotéine mutée ou chimère, dans des conditions limitantes où la densité de ce récepteur diminue par au moins fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée ou non chimère et par moins de 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe chimère ou mutée, ces susdites valeurs appliquées au titre infectieux étant données par comparaison au titre infectieux de virus comportant une enveloppe ni mutée, ni chimère ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles, telles que des cellules XC.

13. Séquence riche en proline selon la revendication 6 ou 7, correspondant à l'une des séquences suivantes :

A3Mo

14. Protéines mutées en chimère selon l'une des revendications 8, 9, ou 10, correspondant à l'une des séquences suivantes :
- PROMO
- PRO FR
- BD PRO MO
- PRO C MO
- PRO TM MO
- PRO CTM MO