CA2317026A1 - Use of a proline-rich sequence to improve the fusogenic character of retroviral envelopes - Google Patents

Abstract

The invention relates to the use of a proline-rich sequence to improve the fusogenic character of a protein comprising a retroviral envelope glycoprotein of an amphotropic MLV or a retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or a retroviral envelope glycoprotein of a GALV or a retroviral envelope glycoprotein of a xenotropic MLV or a retroviral envelope glycoprotein of a MLV MCF or a retroviral envelope glycoprotein of a FeLV. Said proline-rich sequence corresponds either to the proline-rich sequence of the retroviral envelope glycoprotein of an amphotropic MLV, the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF, the retroviral envelope glycoprotein of a GALV, the retroviral envelope glycoprotein of a xenotropic MLV or the retroviral envelope glycoprotein of a FeLV, and contains at least one mutation which suppresses at least one .beta.-turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence, or to the proline-rich sequence of the retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV.

Description

WO 99/36561 PCTlFR99/00016 UTILISATION D'UNE SEQUENCE RICHE EN
PROLINE POUR AUGMENTER LE CARACTERE
FUSOGENIQUE D'ENVELOPPES DE RETROVIRUS
s L'invention a pour objet l'utilisation d'une séquence riche en proline pour augmenter le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus.
L'entrée d'un rétrovirus dans une cellule cible dépend de la reconnaissance d'une protéine de surface spécifique, appelé récepteur, par la sous unité de surface lo (SU) de l'enveloppe virale, suivi par la fusion des membranes qui est médiée par le peptide fusion localisé à l'extrémité amino terminale de la sous unité
transmembranaire {TM) (29). Une voie d'entrée dépendante du pH et une voie d'entrée indépendante ont l'une et l'autre été décrites pour les rétrovirus (13), mais les déterminants et Ie processus impliqués dans l'activation de la fusion suite à
la ls reconnaissance du récepteur restent inconnus. L'identification des ces étapes est essentielle pour la compréhension du mécanisme qui module l' infection ainsi que transfert de gènes par les rétrovirus.
Les glycoprotéines d'enveloppe rétrovirales qui s'assemblent en trimère, sont un complexe comprenant une sous unité de surface (SU) et une composante 2fl transmembranaire (TM) (10). Pour tous les virus enveloppés, les interactions initiales de cette glycoprotéine avec le(s) récepteurs) cellulaires) conduisent à des réarrângements conformationnels de l'enveloppe nécessaires à l'exposition du peptide fusion (30). Les déterminants de l'enveloppe et la séquence des événements causant ces changements conformationnels sont bien détaillés pour les orthomyxovirus qui 2s nécessitent l'environnement acide des vésicules d'endocytose pour leur entrée (24).
Pour les rétrovirus, pour lesquels une voie indépendante du pH a aussi été
décrite, les déterminants précis et les étapes, menant de la reconnaissànce du récepteur à
l'activation de la fusion, restent non élucidés. Le récepteur Pit-2 de l'enveloppe amphotrope des virus de leucémie murine (14, 28) est présent dans Ia plupart des 3o espèces incluant l'homme, alors que les récepteurs fonctionnels des enveloppes écotropes sont limités aux cellules de rat et de souris (19). La reconnaissance de l'un ou l'autre de ces récepteurs influence l'efficacité de fusion, mais l'enveloppe écotrope WO 99/36561 WO 99/36561 PCTlFR99 / 00016 USE OF A SEQUENCE RICH IN
PROLINE TO INCREASE THE CHARACTER
FUSOGENICS OF RETROVIRUS ENVELOPES
s The subject of the invention is the use of a proline-rich sequence for increase the fusogenic character of retrovirus envelopes.
Entry of a retrovirus into a target cell depends on recognition of a specific surface protein, called a receptor, by the subunit of area lo (SU) of the viral envelope, followed by fusion of the membranes which is mediated by the fusion peptide located at the amino terminal end of the subunit transmembrane {TM) (29). One pH-dependent entry route and one both have been described for retroviruses (13), but the determinants and the process involved in the activation of the fusion following the Receiver recognition remains unknown. The identification of these steps is essential for understanding the mechanism that modulates infection as well than gene transfer by retroviruses.
The retroviral envelope glycoproteins which assemble in trimer are a complex comprising a surface unit (SU) and a component 2fl transmembrane (TM) (10). For all enveloped viruses, the initial interactions of this glycoprotein with the cellular receptor (s) lead to conformational rearrangements of the envelope necessary for the exposure of the peptide fusion (30). Determinants of the envelope and the sequence of events causing these conformational changes are well detailed for orthomyxoviruses who 2s require the acidic environment of the endocytosis vesicles for their entrance (24).
For retroviruses, for which a path independent of pH has also been described, the specific determinants and steps, leading from receiver recognition to activation of the merger, remain unclear. The Pit-2 receiver the envelope amphotropic murine leukemia virus (14, 28) is present in most of 3o species including man, while the functional receptors of envelopes ecotropes are limited to rat and mouse cells (19). The recognition of one either of these receptors influences the fusion efficiency but the ecotropic envelope WO 99/36561

2 PCTIFR99100016 induit plus facilement la fusion cellule-ceimle et la formation de syncytia, comme testé
avec les cellules de rat XC, que les enveloppes amphotropes (17).
Les domaines structuraux partagés par l'enveioppe écotrope de Moloney _ (MoMLV) et l'enveloppe amphotrope (MLV-4070A) comprennent : (i) un domaine amino-terminal de liaison au récepteur (noté BD) d'approximativement 200 acides aminés (a.a.) (3, 7); (ü) la région riche en proline de 45 à 59 a.a. de long, identifiée par PRO dans les constructions chimériques décrites ci-après (27) ; (iii) une séquence carboxy-terminale de la SU (noté C) de 160 a.a. impliquée dans l'interaction avec la TM; (iv) un ectodomaine de la TM de 134 a.a. désigné ici par TM, portant un peptide 1 o fusion amino-terminal potentiel identifié par analogie de séquences aux peptides fusions d'autres protéines d'enveloppe de virus enveloppés (11) ; (v) un peptide d'ancrage à la membrane de 28 a.a. et (vi) une queue.cytoplasmique contenant le petit peptide R carboxy-terminal dont le clivage tardif dans les virions, augmente la fusogénicité de l'enveloppe (20). Alors que les domaines amino-terminal BD et PRR
de l'enveloppe écotrope et amphotrope ne partagent que 33 % et 43 % a.a.
d'homologie, respectivement, tous les autres domaines ont plus de 80% de similitude (Fig. lA).
L'un des objets de l'invention est de fournir des séquences riches en prolines qui augmentent le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus.
2o L'un des objets de l'invention est de fournir des protéines chimères ou mutées dont le caractère fusogéaique est amélioré.
. L'invention a pour objet l'utilisation d'une séquence riche en proIine pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV lOAI ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
xénotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétroviraIe d'un MLV MCF ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, laquelle séquence riche en proline correspond o - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
amphotrope, ou WO 99/36561 2 PCTIFR99100016 more easily induces cell-ceimle fusion and syncytia formation, as tested with XC rat cells, as amphotropic envelopes (17).
The structural domains shared by the Moloney ecotropic envelope _ (MoMLV) and the amphotropic envelope (MLV-4070A) include: (i) a domain receptor binding amino terminal (denoted BD) of approximately 200 acids amines (aa) (3, 7); (ü) the proline-rich region 45 to 59 aa long, identified by PRO in the chimeric constructions described below (27); (iii) a sequence carboxy-terminal of the SU (denoted C) of 160 aa involved in the interaction with the TM; (iv) an ectodomain of the TM of 134 aa designated here by TM, carrying a peptide 1 o potential amino-terminal fusion identified by analogy of sequences to peptides fusions of other envelope proteins from enveloped viruses (11); (v) a peptide anchor to the 28 aa membrane and (vi) a cytoplasmic tail containing the little carboxy-terminal R-peptide whose late cleavage in virions, increases the fusogenicity of the envelope (20). While the amino-terminal domains BD and PRR
of the ecotropic and amphotropic envelope share only 33% and 43% aa of homology, respectively, all other areas have more than 80% of similarity (Fig. LA).
One of the objects of the invention is to provide sequences rich in prolines which enhance the fusogenic character of retrovirus envelopes.
2o One of the objects of the invention is to provide chimeric proteins or mutated whose fusogearic character is improved.
. The subject of the invention is the use of a proIine-rich sequence for improve the fusogenic character of a protein comprising a glycoprotein envelope retroviral of an amphotropic MLV or a glycoprotein of an MLV lOAI retroviral envelope or an envelope glycoprotein retroviral of a GALV or a retroviral envelope glycoprotein of an MLV
xenotropic or retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF or a FeLV retroviral envelope glycoprotein, which proline-rich sequence corresponds o - either with the proline-rich sequence of an MLV retroviral envelope glycoprotein amphotropic, or WO 99/36561

3 PCT/FR99/00016 de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF, de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV IOAl, de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV, ou de Ia glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
s xénotrope, ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétroviraIe d'un FeLV, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un (3-turn dans l'hélice poIyproline de la séquence riche en proline, - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe lo rétrovirale d'un MLV écotrope.
On a constaté de façon inattendue qu' il y a une augmentation du caractère fusogénique d'une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou d'un MLV MCF ou d'un MLV IOA1 ou d'un GALV ou d'un MLV
xénotrope ou d'un FeLV dans les cas suivants ls - soit par remplacement de leur séquence riche en proline par la séquence riche en proline homologue d'un MLV écotrope, - soit par mutation ponctuelle de la séquence riche en proline dudit MLV
amphotrope ou dudit MLV MCF ou dudit MLV IOA1 ou dudit GALV ou dudit MLV xénotrope ou dudit FeLV telle qu'il y ait suppression d'au moins un (3-20 turn.
La région riché en proline s' organise probablement en hélice poly-proline, uné~ structure secondaire constituée de « bêta-turns » qui sont des repliements de la chaîne peptique de 180°, incluant le plus souvent une proline. Ces courbures sont agencëes différemment entre les régions PRO (région riche en proline) des 2s enveloppes écotrope et amphotrope. Cette dernière contient 11 « béta-turns »
agencés régulièrement, dont 4 dans son extrémité N-terminaie et 7 dans son.
extrémité C-terminale. La région PRO de l'enveloppe écotrope ne contient que 7 « beta-turns », dont 2 seulement dans son extrémité N-terminale.
L'expression « mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un ~3-turn 3o dans l'hélice polyproline de la sêquence riche en proline » signifie - délétion des 4 acides aminés formant le ~3-turn, ou WO 99/36561 q PCT/FR99/00016 - mutations ponctuelles d'un ou plusieurs de ces 4 acides aminés, , notamment mutation de la proline responsable du repliement à 180° de la chaîne polypeptidique, telles que la probabilité d'avoir un ~3-turn est inférieure à
0.8 selon l'algorithme de Chou et Fassman.
s A titre d'exemple, Ia proline est avantageusement remplacée par l'isoleucine, Ia valine ou l'alanine.
Comme souches appropriêes de MLV écotrope, on peut citer la souche Moloney MLV, Friend MLV (23).
Comme souches appropriées de MLV amphotrope, on peut citer la souche to 4070A (16).
Comme souches appropriées de MLV MCF, on peut citer la souche MLF
MCF 247 (9).
Comme souches appropriées de GALV, on peut citer la souche Seato (Delassus et al., 1989, Virology 173 :205-213).
1 s Comme souches appropriées de MLV xénotrope, on peut citer la souche NZB.IU.6 (15).
Comme souches appropriées de FeLV, on peut citer FeLV-C-SARMA
FSC (21).
Comme souches appropriées de MLV IOA1, on peut citer (Ott et al., 1990 20 (16)).
L'expression "améliorer Ie caractère fusogénique" signifie que l'enveloppe rëti~ovirale ~ améliorée » de l'invention possède une capacité mesurable, par rapport à l'enveloppe parentale, à mieux accomplir les étapes post-liaison du processus d'entrée viral et consistant in fine à la fusion moléculaire des 2s membranes virales et cellulaires.
L'amélioration du caractère fusogénique peut se mesurer selon l'un ou l'autre des deux tests suivants - test de formation de syncytia après co-culture entre des cellules cibles, exprimant le récepteur rétroviral reconnu par le domaine de liaison de la 3o glycoprotéine mutée ou chimère, et des lignées cellulaires préalablement transfectées avec un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines, - test d'infection de cellules cibles, exprimant le récepteur rétroviral reconnu par le domaine de liaison de la glycoprotéine mutée ou chimère, dans des conditions limitantes où la densité de ces récepteurs (c'est-à-dire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant l'attachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale non mutée et par moins de 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale chimère ou mutée ; ces valeurs étant données comparativement au titre infectieux des virus comportant les enveloppes parentales et parentale chimère ou mutée sur des cellules XC
to dans des conditions définies dans Ie tableau IB de l'exemple.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope est celle représentée à la figure 7.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope est celle représentée à Ia figure 8.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF est celle représentée à Ia figure 9.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'envelogpe rétrovirale d'un GALV est celle représentée à la figure 10.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe 2o rétrovirale d'un MLV lOAI est celle représentée à la figure 11.
La séquence riche en proüne d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétcovirale d'un MLV xénotrope est celle représentée à la figure 12.
La séquence riche en proline d'une glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale d'un FeLV est celle représentée à la figure 13.
2s Par séquence riche en proline d'une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, on entend également celle comportant des mutations, suppression ou addition d'acides aminés telle qu'il n'y ait pas modification de l'enchaînement des ø-burn Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention vise l'utilisation telle 3o que définie ci-dessus d'une séquence riche en proline en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV

WO 99136561 ~ PCT/FR99/00016 écotrope choisi parmi : le domaine âe liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire.
Par K domaine fonctionnel », on définit toute séquence polypeptidique individualisée sur le plan structural et capable d'accomplir une fonction s biologique déterminée.
Par K domaine de liaison », on définit le domaine fonctionnel porté par la partie N-terminale de la sous-unité SU de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable de se lier au récepteur rétroviral. II est représenté sur la figure 6 comme s'étendant de la position 31 à 23? de Ia séquence peptidique de la glycoprotéine Io d'enveloppe MLV amphotrope.
Par ~~ domaine C », on définit on définit le domaine fonctionnel porté par la partie C-terminale de la sous-unité SU de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable d'interagir avec. Ia sous-unité TM. Il est représenté sur la figure 6 comme s'étendant de la position 300 à 458 de Ia séquence peptidique de la 15 glycoprotéine d'enveloppe MLV amphotrope Par ~~ domaine TM », on définit le domaine porté par l'ectodomaine de la sous-unité TM de l'enveloppe rétrovirale MLV et capable d'interagir avec la sous-unité SU et d'accomplir la fusion entre membranes virales et cellulaires lors du processus d'entrée rétroviral. II est représenté sur Ia figure 6 comme 2o s'étendant de la position 459 à 592 de Ia séquence peptidique de la glycoprotéine ,, d'enveloppe MLV amphotrope.
Le domaine de liaison, le domaine C, ou Ie domaine de la sous-unité
transmembranaire peuvent être modifiés de manière à altérer leurs capacités fonctionnelles en vue 25 - d'interagir avec d'autres molëcules, telles que des molécules de surface (antigènes, récepteurs de facteurs de croissance, etc.), par le biais de l'insertion de peptides ou de domaines protéiques présentant une affinité pour ces molécules, - de renforcer la stabilité de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale, 3o - d'augmenter la capacité fusiogène de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale.

L' invention concerne notamment iutilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence riche en proline correspondant à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : Ie domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'une sêquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV, lo laquelle séquence riche en proline correspond - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
amphotrope, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins ls un ~i-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline, - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.
L'invention concerne également, à titre de produit nouveau, une séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire 2o correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétr9virale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de layglycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétroviraie d'un MLV xénotrope ou de la 2s glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie C-terminale telle qu' il y ait suppression d'au moins 1 ~i-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.
On définit par « partie C-terminale » la séquence d'acides aminés correspondant à la deuxième moitié de la région riche en proline.
3o L'invention concerne également une séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV

amphotrope ou de la glycoprotéine d'envéloppe rétrovirale d'un MLV lOAI ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de Ia glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine . , d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de Ia glycoprotéine d'enveloppe s rétrovirale d' un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de Ia partie - ' N-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 ~3-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.
On définit par « partie N-terminale » la séquence d'acides -aminés correspondant à la première moitié de ta région riche en proline.
to L'invention concerne également les protéines mutées contenant une séquence riche en proline et dans l'enchainement desquelles. la séquence riche en proline est mutée de telle sorte qu'il y a suppression d'au moins un ~i-turn.
Plus précisément, l'invention concerne une protéine mutée correspondant à
la glycoprotéine , d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou 'à Ia 15 glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV lOAl ou à Ia glycoprotéine d'enveloppe rëtrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
xënotrope ou Ia glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu' il y ait 2o suppression d'au moins un (3-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline.
Cette protéine mutée présente par rapport à la protëine non mutée correspondante la propriété d'induire plus facilement Ia formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs 25 rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.
L'invention concerne également les protéines chimères contenant une séquence riche en proline dans l'enchaînement desquelles la séquence riche en , proline est remplacée par la séquence riche en proline homologue de Ia glycoprotéine rétrovirale d'un MLV écotrope.
30 Plus précisément, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou . à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLJ lv~°CF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de Ia glycoprotëine d' enveloppe rétrovirale d' un MLV écotrope.
Cette protéine chimère présente par rapport à la protéine d'origine correspondante la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.
1 o Dans les groupes respectifs des protéines mutées ou chimères telles que définies ci-dessus, il peut également y avoir remplacement de l'un au moins de leurs domaines fonctionnels par le domaine fonctionnel homologue de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe 2o rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle * le domâine riche en proline est remplacé par le domaine riche en pt'oline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, * et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité
transmembranaire, est remplacé par Ie domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.
Cette protéine chimère présente la propriété d' induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les ceilules exprimant une quantité
limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle 3o est dérivée.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
lOAI ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine .
d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe s rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle * le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un ~3-turn (dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline), * et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le lo domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité
transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope.
Cette protéine chimère présente la propriété d'induire plus facilement la formation de syncytia ou de mieux infecter les cellules exprimant une quantité
1s limitante de récepteurs rétroviraux, par rapport à l'enveloppe parentale dont elle est dérivée.
Les protéines mutées ou ~ chimères de l'invention présentent avantageusement l'une au moins des propriétés suivantes - il y a formation de syncytia après cocultures entre des cellules 2o cibles exprimant une molécuie de surface servant de récepteur rétroviral par interaction avec le dôrnaine de liaison porté par une glycoprotéine d'enveloppe rétiovirale et des lignées cellulaires produisant ou non des particules Gag-Pol de MLV (ou de rétrovirus de mammiferes de type C ou des Ientivirus) préalablement transfectées avec un vecteur d'expression pour l'une des susdites 25 protéines de l'invention, - il y a infection de cellules cibles exprimant un récepteur rétroviral reconnu par le domâine de liaison d'une glycoprotéine mutée ou chimère de _ .
l'invention, dans des conditions limitantes où la densité de ce récepteur (c'est-à-dire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant 30 rattachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée et non chimère et par moins de 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe chimère WO 99136561 ~ 1 PCT/FR99/00016 ou mutée de l'invention, ces susdites valeurs appliquées au titre infectieux étant données par comparaison au titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée et non chimère ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles, telles que des cellules XC, dans les conditions d'infection telles que définies dans les exemples et notamment à propos du tableau 1B ci-après.
On dispose donc notamment de deux tests permettant de caractériser les protéines mutées ou chimères de i'invention.
L'un de ces tests est la formation de syncytia entre des cellules cibles et des lignées cellulaires préalablement transfectées par un vecteur d'expression pour l'une des susdites protéines chimères ou mutées de l'invention (et susceptibles de reconnaître un récepteur rétroviral situé sur lesdites cellules cibles).
Comme cellules cibles, on peut utiliser les cellules de souris SC1, Mus Durai, les cellules humaines TE67I, ainsi que les cellules de rat XC.
Les lignées cellulaires utilisées peuvent produire ou non des particules Gag-Pol de MLV.
Les lignées cellulaires peuvent produire ou non des particules Gal-Pol de MLV ou d'autres rétrovi~nis de mammifères de type C, notamment le virus MLV
de Moloney ou d'autres rétrovirus tels que des Ientivirus, par exemple HIV-1.
Un autre test de caractérisation dés protéines mutées ou chimères de l'invention consiste à infecter des cellules cibles exprimant un récepteur rétroviral susceptible d'être reconnu par une protéine chimère ou mutée de l'invention, par L'intermédiaire de particules virales contenant ces protéines chimères ou mutées.
Comme cellules cibles, on peut utiliser les cellules de rat XC et XC-A-ST, ces dernières étant dérivées des cellules XC par transfection d'un plasmide exprimant le domaine de liaison de l'enveloppe rétrovirale amphotrope capable d'occuper le récepteur rétroviral amphotrope.
Comme particules virales, on peut utiliser celles produites par les 3o rétrovirus MLV ou autres rétrovirus de mammifères de type C, notamment le virus MLV de Moloney ou d'autres rétrovirus tels que des lentivirus, par exemple HIV-I.

Cette infection est effectuée dans des conditions limitantes, c'est-à-dire telles que la densité du récepteur (c'est-à-dire le nombre de récepteurs disponibles à la surface cellulaire permettant l'attachement de la particule virale) diminue par au moins 100 fois le titre infectieux de virus comportant une glycoprotéine d'enveloppe ni mutée, ni chimère et par moins de 100 fois Ie titre infectieux de virus comportant une enveloppe mutée ou chimère de l'invention correspondant à la susdite enveloppe ni mutêe, ni chimère.
La comparaison est effectuée par rapport au titre infectieux de virus comportant une enveloppe non chimère et non mutée ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles telles que des cellules XC.
Cette infection est comparativement effectuée sur deux types cellulaires, le deuxième étant directement dérivé du premier et a pour effet de réduire le nombre de récepteurs rétroviraux disponibles, c'est à dire telle que la diminution de l'expression de surface du récepteur diminue par au moins 100 fois le titre infectieux du virus comportant l'enveloppe parentale ni mutée, ni chimère.
On compare alors cette valeur à celle obtenue pour des virus comportant l'enveloppe chimère ou mutée. Une diminution de moins de 100 des titres infectieux des virus comportant la susdite enveloppe chimère ou mutée entre lés deux types cellulaires indique donc une amélioration du caractère fusogénique de 2o cette dernière.
Des séquences.' riches en proline avantageuses selon l'invention côrrespondent à l'une des séquences suivantes Az 2s A3Mo s Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence AZ comporte la suppression du deuxième /3-turn qui a pour effet d'être plus fusogéniqué que l'enveloppe parentale en test de syncytia.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence A, comporte la suppression du troisième (3-turn s qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test de syncytia.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence A3Mo comporte la suppression du troisième ~3-turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test lo d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence A4 comporte la suppression du quatrième (3-turn qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
15 Par rapport à Ia région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence C2 comporte la délétion des ~3-turns 9 à 13 qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à Ia région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un 20 MLV amphotrope, Ia séquence C, comporte la délétion des, (3-turns 11 à 13 qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveioppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à la région riche en proline de Ia glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la séquence C, comporte la délétion du dernier ~i-turn (13°) 25 qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test d'infection tel que défini plus haut.
Par rapport à la région riche en proline de la glycoprotéine rétrovirale d'un MLV amphotrope, la sêquence CS comporte la délétion des 11 ° et I2° ~3-turns qui a pour effet d'être plus fusogénique que l'enveloppe parentale en test 3o d'infection teI que défini plus haut.

Des protéines chimères avantageusès selon l'invention, correspondent à
l'une des séquences suivantes PROMO
- PRO FR
s - BD PRO MO
- PRO C MO
- PRO TM MO
- PRO CTM MO
to La séquence PROMO correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope (souche Moloney).
La séquence PRO FR correspond à la séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline 15 homologue du MLV écotrope (souche Friend) La séquence BD PRO MO correspond à Ia séquence de MLV amphotrope dans laquelle la région riche en ~ proline est remplacée par Ia région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle Ie domaine de liaison a été
remplacé par le domaine de liaison homologue du MLV écotrope.
2o La séquence PRO CMO correspond à la séquence de MLV amphotrope J
dans laquelle la régiôn riche en proline est remplacée par la région riche en prOline homologue du MLV écotrope et dans laquelle le domaine C a ëté
remplacé par le domaine C homologue du MLV écotrope.
La séquence PRO TM MO correspond à la séquence de MLV amphotrope 25 dans laquelle la région riche en proline est remplacée par la région riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle le domaine TM a été
remplacé par le domaine TM homologue du MLV écotrope.
La séquence PRO CTM MO correspond à Ia séquence de MLV
amphotrope dans laquelle la région riche en proliné est remplacée par Ia région -3o riche en proline homologue du MLV écotrope et dans laquelle les domaines respectifs C et TM ont été remplacés respectivement par les domaines C et TM
homologues du MLV écotrope.

WO 99/36561 1,5 PCT/FR99100016 Des protéines chimères avantageûses selon l'invention comportent l'une des sëquences riches en proline correspondant à l'une des séquences suivantes Az As A3Mo IO Cs et sont telles que l'un au moins de leurs domaines fonctionnels suivants domaine de liaison, domaine. C, domaine transmembranaire, est remplacé par le domaine homologue de MLV écotrope.
15 On montre dans le cadre de la' présente invention que Ia région riche en proline (PRR) de l'enveloppe des virus de leucémie murine (MLV), localisée entre Ie domaine de liaison au récepteur de la partie amino terminale de Ia SU
et le domaine d' interaction avec la TM de la partie carboxy-terminale de la SU, sert d'intermédiaire dans les changements de conformation de l'enveloppe et 2o dans l' activation de la fusion. Dé plus, on montre que les beta-turn potentiels de ,>
la région riche en proline déterminent la stabilité de l'association SU-TM et le séuil d'activation de la fusion cellule-cellule et de la fusion virus-cellule.
Afin d'identifier la (ou ies) régions) responsables) de la plus grande fusogénicité de l'enveloppe écotrope des MLVs, on a généré une série 2s d'enveloppes chimères dans lesquelles les domaines d'enveloppes amphotropes BD, PRO, C et TM sont échangés avec leur homologue de l'enveloppe écotrope (Fig 1B). Les enveloppes résultantes sont alors identifiées selon le(s) domaines) écotrope(s) substitué(s). La fusion cellule à cellule est évaluée par Ia formation de syncytia après une coculture de 24 heures entre différentes cellules cibles 30 (indicatrices) et des lignées cellulaires, produisant ou non des particules Gag-Pol de MLV (5), préalablement transfectées avec l'une ou l'autre des enveloppes.
Bien que le niveau d'expression à la surface cellulaire des enveloppes parentales WO 99/36561 1 ~ PCTIFR99/00016 et chimères soient similaires (Fig. 4ä), deux phénotypes différents de fusion cellules-cellules sont observés. Les enveloppes CMO et TMMO, tout comme l'enveloppe sauvage MLV-4070A, induisent faiblement des syncytia.
Cependant, les enveloppes BDMO, PROMO et PROFR induisent fortement la formation de syncytia, similaires â ceux induits par l'enveloppe écotrope.
(Fig 2)_ La formation de syncytia n'est pas affectée par la présence ou le manque de particules Gag-Pol (données non montrées), montrant que la fusion mesurée dans ce test se produit par des contacts directs cellules-cellules plutôt que des contacts cellulaires médiés par les particules virales. Des comptes rendus antérieurs indiquent que Ia fusogénicité élevée de l'enveloppe BDMO est due principalement à sa capacité à interagir avec le récçpteur écotrope (18) .
Cependant, une importante fusogénicité est également observée avec les chimères portant le domaine BD amphotrope (Figs. I et 2) avec tous les types cellulaires utilisés, incluant les cellules cibles de rat, de souris et d'homme, is présentant en plus ou non le récepteur écotrope {données non montrées).
Ainsi, les différences observées, lors de Ia formation de syncytia, entre les enveloppes amphotropes parentales et chimériques sont dues à des nouvelles propriétés, différentes de l'interaction du BD avec le récepteur.
Comme décrite pour les virus de leucémie féline (8) et comme suggérée par l'étroite apparenté avec les MLV, la répétition régulière de proline dans la PRR
,.
entraîne peut-être son repli en hélice poly-proline à "beta-turn » (27), une structure secondaire qui exerce des forces "élastomériques", pouvant remplir Ia fonction de "ressort moléculaire" (26). A cause de la localisation critique dé la PRR, entre les domaines BD et C qui influencent tous deux la fusion, son rôle dans la fusion a été
évaluë directement. Des différences dans le nombre et l'arrangement des "beta-turn"
prédits dans Ia PRR des enveloppes 4070A, par rapport à celle du MoMLV, laissent prévoir un ressort plus réactif pour ce dernier ce qui pourrait expliquer la fusogénicité
accrue du PROMO. Les mutants ponctuels ou de délétion, C2, C3, C4 et C5, conçus pour supprimer certains des sept "beta-turn" carboxy-terminaux de la PRR
3o amphotrope, ont été testés dans le test de fusion cellule-cellule XC. Ils se sont avérés faiblement fusogéniques comme l'enveloppe parentale amphotrope (Fig. 3B). Les "beta-turn" induits par les prolines de la PRR sont moins entremélés dans la partie WO 99/36561 I ~ PCT/FR99/00016 amino-terminale que dans l'extrémité carboxy terminale. Ainsi, chacun des quatre "beta-turn" potentiel de l'enveloppe 4070A ont pu ëtre supprimés individuellement par substitution d'une proline par une valine, une alanine ou une isoleucine, donnant les mutants AI, A2, A3, A3M0 et A4 (Fig. 3C). Un second acide aminé a été
substitué
dans les mutants A2 et A3 afin d'éviter la formation d'hélice alpha ou de feuillet beta potentiels, absent à l'origine dans les prédictions de structure de Ia PRR des MLV
(non montré). Les enveloppes AI et A4, pour lesquelles, respectivement, le premier ou le quatrième "beta-turn" amino terminal a été muté, conservent une répétition régulière de trois "beta-turn" contigus et elles n'induisent pas une formation de 1o syncytia augmentée {Table 1). Par opposition, les enveloppes A2 et A3 dans lesquelies la continuité de ces "beta-turn" est interrompue {Figs. 3C et 3D), sont très fusogéniques (Tableau 1), démontrant ainsi l'importance critique des "beta-turn"
contigus de la PRR dans la "médiation" de ia fusion suite à la reconnaissance du récepteur. Dans le but de tester si cette fusogénicité accrue était due à un besoin inférieur en molécule Pit-2, on a comparé la fusion cellule-cellule en utilisant des cellules XC ou XC-A-ST. Dans ces dernières, l'expression constitutive de BD
amphotrope réduit la quantité de récepteur Pit-2 fonctionnel (Tableau 1).
L'interférence est efficace envers l'enveloppe MLV-4070A alors qu'une fusogénicité
élevée est toujours observée avec les enveloppes PROMO, PROFR, A2 et A3.
2o Néanmoins, la fusion est toujours dépendante de Pit-2 puisque des cellules CHO
,.
n'exprimant pas Pit-2 fusionnent seulement après l'expression de novo de Pit-2 (non mbntré). Ainsi, des mutations dans les "beta-turn" de la PRR semblent abaisser le seuil d'activation de la fusion prenant part après la reconnaissance du récepteur.
Après la fusion cellule-cellule, on a examiné la fusion cellule-virus en comparant l'infectivité des virions portant l'enveloppe parentale ou chimère.
Les titres sont équivalents sur les cellules de rat XC (Tableau 1), de souris, d'homme et sur les CHO transfectées avec le gène d'expression du récepteur Pit-2. De manière surprenante, les chimères hautement fusogéniques PROMO et PROFR, ainsi que les mutants ponctuels A2 et A3 ont conduit à des titres indétectables ou significativement rëduits sur toutes les cellules testées. Les autres enveloppes, confèrent des titres dans une gamme de.l0e6-10e7 unités infectieuses par ml (u.i./ml) sur les cellules XC, similaires à ceux obtenus avec les deux enveloppes parentales 4070A et MO.
Bien que WO 99/365b1 18 PCTIFR99/00016 I'infectivité des virions générés avec' l'enveloppe amphotrope parentale soit dramatiquement réduite sur les cellules XC-A-ST, tous les mutants de la PRR
infectieux, à l'exception du Al, sont significativement moins sensibles à
l'interférence (Tableau I). Le fait que les mutants de Ia partie carboxy-terminal de la PRR
n'exhibent pas de modifcation dans la fusogénicité cellule-cellule mais montrent néanmoins une augmentation de I' infectivité (fusion virus-cellule), démontre que les motifs amino, mais aussi carboxy terminaux, influencent la fusogénicité. Les tests de liaisons aux récepteurs, effectués en utilisant un anticorps dirigé contre la SU, montrent que l'affinité Pit-2/SU n'est pas significativement altérée pour ces 1o enveloppes (non montré). L'infection de CHO transfectées exprimant Pit-2, par opposition au défaut d'infection des CHO parentales, confirme la nécessité de Pit-2 pour l'entrée des virions.
Puisque la faible infectivité des virions portant les enveloppes mutantes fusogènes en tests cellules-cellules est due à une perte de SU accrue (Fig. 3 PCT / FR99 / 00016 of the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF, of the retroviral envelope glycoprotein of an MLV IOAl, retroviral envelope glycoprotein from a GALV, or of the retroviral envelope glycoprotein of an MLV
xenotropic, or of the retroviral envelope glycoprotein of an FeLV, and includes at least one mutation such that there is suppression of at least a (3-turn in the poIyproline helix of the proline-rich sequence, - either to the proline-rich sequence of the envelope glycoprotein lo retroviral of an ecotropic MLV.
It was unexpectedly found that there is an increase in character fusogenic of a retroviral envelope glycoprotein of an amphotropic MLV
or an MLV MCF or an MLV IOA1 or a GALV or an MLV
xenotropic or FeLV in the following cases ls - either by replacing their proline-rich sequence with the sequence rich in proline homologous to an ecotropic MLV, - either by point mutation of the proline-rich sequence of said MLV
amphotropic or said MLV MCF or said MLV IOA1 or said GALV or said Xenotropic MLV or said FeLV such that there is suppression of at least one (3-20 turn.
The proline-rich region is probably organized into a poly-proline helix, uné ~ secondary structure made up of “beta-turns” which are folds of the 180 ° peptide chain, most often including a proline. These curvatures are arranged differently between the PRO (proline-rich region) regions 2s ecotropic and amphotropic envelopes. The latter contains 11 "beta-turns "
arranged regularly, including 4 in its N-terminus end and 7 in its.
C-terminal end. The PRO region of the ecotropic envelope contains only 7 "Beta-turns", including only 2 at its N-terminal end.
The expression "mutation such that there is suppression of at least one ~ 3-turn 3o in the polyproline helix of the proline-rich sequence ”means - deletion of the 4 amino acids forming the ~ 3-turn, or WO 99/36561 q PCT / FR99 / 00016 - point mutations of one or more of these 4 amino acids,, including mutation of the proline responsible for the 180 ° folding of the chain polypeptide, such that the probability of having a ~ 3-turn is less than 0.8 according to the algorithm of Chou and Fassman.
s As an example, proline is advantageously replaced by isoleucine, valine or alanine.
As suitable strains of ecotropic MLV, mention may be made of the strain Moloney MLV, Friend MLV (23).
As suitable strains of amphotropic MLV, mention may be made of the strain to 4070A (16).
As suitable strains of MLV MCF, mention may be made of the strain MLF
MCF 247 (9).
As suitable strains of GALV, mention may be made of the Seato strain (Delassus et al., 1989, Virology 173: 205-213).
1 s As suitable strains of xenotropic MLV, mention may be made of the strain NZB.IU.6 (15).
As suitable strains of FeLV, mention may be made of FeLV-C-SARMA
FSC (21).
As suitable strains of MLV IOA1, there may be mentioned (Ott et al., 1990 20 (16)).
The expression "improve fusogenic character" means that the envelope rëti ~ oviral ~ improved "of the invention has a measurable capacity, by relation to the parental envelope, to better accomplish the post-link stages of the viral entry process and ultimately consisting in the molecular fusion of 2s viral and cell membranes.
The improvement in fusogenic character can be measured according to one or the other of the following two tests - syncytia formation test after co-culture between target cells, expressing the retroviral receptor recognized by the binding domain of the 3o mutated or chimeric glycoprotein, and cell lines beforehand transfected with an expression vector for one of the above proteins, - target cell infection test, expressing the retroviral receptor recognized by the binding domain of the mutated or chimeric glycoprotein, in limiting conditions where the density of these receptors (i.e. the number of receptors available on the cell surface allowing the attachment of the virus particle) decreases the infectious titer of the virus by at least 100 times with the parental envelope not mutated and by less than 100 times the title infectious to the virus comprising the chimeric or mutated parental envelope; these values given compared to the infectious titer of viruses containing the parental and chimeric or mutated parental envelopes on XC cells to under conditions defined in Table IB of the example.
The proline-rich sequence of an envelope glycoprotein The retroviral of an ecotropic MLV is that shown in Figure 7.
The proline-rich sequence of an envelope glycoprotein retroviral of an amphotropic MLV is that shown in FIG. 8.
The proline-rich sequence of an envelope glycoprotein retroviral of an MCF MLV is that shown in FIG. 9.
The proline-rich sequence of an envelope glycoprotein The retroviral of a GALV is that shown in Figure 10.
The proline-rich sequence of an envelope glycoprotein 2o retroviral of a MLV lOAI is that shown in FIG. 11.
The protein-rich sequence of an envelope glycoprotein The retroviral of a xenotropic MLV is that shown in FIG. 12.
The proline-rich sequence of an envelope glycoprotein retroviral of an FeLV is that shown in Figure 13.
2s By proline-rich sequence of a retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV, one also understands that comprising mutations, deletion or addition of amino acids such that there is no modification of the sequence of ø-burns According to an advantageous embodiment, the invention aims to use such 3o as defined above of a proline-rich sequence in association with a functional area of the retroviral envelope glycoprotein of an MLV

WO 99136561 ~ PCT / FR99 / 00016 ecotrope chosen from: the binding domain, the C domain, or the the under transmembrane unit.
By “functional domain”, we define any polypeptide sequence structurally individualized and capable of performing a function s biological determined.
By “binding domain”, we define the functional domain carried by the N-terminal part of the SU subunit of the MLV retroviral envelope and able to bind to the retroviral receptor. It is shown in Figure 6 as extending from position 31 to 23? of the peptide sequence of the glycoprotein Amphotropic MLV envelope Io.
By ~~ domain C ", we define we define the functional domain carried by the C-terminal part of the SU subunit of the MLV retroviral envelope and able to interact with. The TM subunit. It is shown in figure 6 as extending from position 300 to 458 of the peptide sequence of the 15 amphotropic MLV envelope glycoprotein By ~~ TM domain ", we define the domain carried by the ectodomain of the TM subunit of the MLV retroviral envelope and capable of interacting with the SU subunit and accomplish fusion between viral and cellular membranes during the retroviral entry process. It is represented in FIG. 6 as 2o extending from position 459 to 592 of the peptide sequence of the glycoprotein ,, amphotropic MLV envelope.
The binding domain, domain C, or the domain of the subunit transmembrane can be changed to alter their capabilities functional in sight 25 - to interact with other molecules, such as surface molecules (antigens, growth factor receptors, etc.), through insertion of peptides or protein domains with an affinity for these molecules, - to reinforce the stability of the retroviral envelope glycoprotein, 3o - to increase the fusiogenic capacity of the envelope glycoprotein retroviral.

The invention relates in particular to the use as defined above, of a proline-rich sequence corresponding to the proline-rich sequence of the retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV, in combination with a functional domain of the retroviral envelope glycoprotein of a Ecotropic MLV chosen from: the binding domain, the C domain, or the domain of the transmembrane subunit.
According to an advantageous embodiment, the invention relates to the use a proline-rich sequence to improve the fusogenic character of a protein comprising an MLV retroviral envelope glycoprotein, where the proline-rich sequence corresponds - either with the proline-rich sequence of an MLV retroviral envelope glycoprotein amphotropic, and includes at least one mutation such that there is suppression of at least ls a ~ i-turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence, - either to the proline-rich sequence of the envelope glycoprotein retroviral of an ecotropic MLV.
The invention also relates, as a new product, to a sequence rich in proline including amino acid sequence and secondary structure 2o correspond to that of the proline-rich sequence of the glycoprotein envelope of an amphotropic MLV or envelope glycoprotein retroviral of an MLV 10A1 or retroviral envelope glycoprotein of MLV MCF or retroviral envelope layglycoprotein of a GALV or retroviral envelope glycoprotein of a xenotropic MLV or 2s retroviral envelope glycoprotein of an FeLV, and comprising at least one mutation on the C-terminal side such that there is suppression of at less 1 ~ i-turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence.
The amino acid sequence is defined by “C-terminal part”
corresponding to the second half of the proline-rich region.
3o The invention also relates to a proline-rich sequence whose amino acid sequence and the secondary structure correspond to that of the proline-rich sequence of the envelope glycoprotein of an MLV

amphotropic or retroviral envelope glycoprotein of an MLV lOAI or retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF or Ia retroviral envelope glycoprotein of a GALV or glycoprotein. , of the retroviral envelope of a xenotropic MLV or of the envelope glycoprotein s retroviral of an FeLV, and comprising at least one mutation on the side of Ia part - ' N-terminal such that there is suppression of at least 1 ~ 3-turn in the propeller polyproline of the proline-rich sequence.
We define by “N-terminal part” the sequence of amino acids corresponding to the first half of your proline-rich region.
to The invention also relates to the mutated proteins containing a sequence rich in proline and in the sequence of which. the rich sequence in proline is mutated so that at least one ~ i-turn is suppressed.
More specifically, the invention relates to a mutated protein corresponding to glycoprotein, from the retroviral envelope of an amphotropic MLV or 'to Ia 15 retroviral envelope glycoprotein of MLV 10Al or glycoprotein of the retroviral envelope of an MLV MCF or to the envelope glycoprotein GVL retroviral or MLV retroviral envelope glycoprotein xenotropic or retroviral envelope glycoprotein of an FeLV, in which the proline-rich domain has at least one mutation such that there is 2o deletion of at least one (3-turn in the polyproline propeller of the sequence rich in proline.
This mutated protein present compared to the non-mutated protein corresponding property to induce more easily the formation of syncytia or better infect cells expressing a limiting amount of receptors 25 retroviral, relative to the parental envelope from which it is derived.
The invention also relates to the chimeric proteins containing a sequence rich in proline in the sequence of which the sequence rich in , proline is replaced by the proline-rich sequence homologous to Ia retroviral glycoprotein of an ecotropic MLV.
More specifically, the invention relates to a corresponding chimeric protein to the retroviral envelope glycoprotein of an amphotropic MLV or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or. with glycoprotein retroviral envelope of an MLJ lv ~ ° CF or with glycoprotein envelope GVL retroviral or MLV retroviral envelope glycoprotein xenotropic or the retroviral envelope glycoprotein of an FeLV, in which the proline-rich domain is replaced by the proline-rich domain of Ia retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV.
This chimeric protein present compared to the original protein corresponding property of inducing more easily the formation of syncytia or better infect cells expressing a limiting amount of receptors retroviral, relative to the parental envelope from which it is derived.
1 o In the respective groups of mutated or chimeric proteins such as defined above, there can also be replacement of at least one of their functional areas by the homologous functional area of the retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV.
According to an advantageous embodiment, the invention relates to a chimeric protein corresponding to the retroviral envelope glycoprotein of a Amphotropic MLV or retroviral envelope glycoprotein of an MLV
10A1 or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF or to the retroviral envelope glycoprotein from a GALV or glycoprotein of the retroviral envelope of a xenotropic MLV or the envelope glycoprotein 2o retroviral of an FeLV, in which * the domine rich in proline is replaced by the domain rich in pt'oline of the retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV, * and at least one of the functional areas chosen from:
binding domain, domain C, or the subunit domain transmembrane, is replaced by the corresponding domain of the envelope of an ecotropic MLV.
This chimeric protein has the property of more easily inducing formation of syncytia or better infect cells expressing a quantity limiting of retroviral receptors, compared to the parental envelope of which she 3o is derived.
According to another advantageous embodiment, the invention relates to a chimeric protein corresponding to the retroviral envelope glycoprotein of a Amphotropic MLV or retroviral envelope glycoprotein of an MLV
lAI or the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF or the retroviral envelope glycoprotein of a GALV or glycoprotein.
of the retroviral envelope of a xenotropic MLV or the envelope glycoprotein s retroviral of an FeLV, in which * the proline-rich domain contains at least one mutation such that there is suppression of at least one ~ 3-turn (in the polyproline propeller of the proline-rich sequence), * and at least one of the functional areas chosen from:
lo binding domain, domain C, or the subunit domain transmembrane, is replaced by the corresponding domain of the envelope of an ecotropic MLV.
This chimeric protein has the property of more easily inducing formation of syncytia or better infect cells expressing a quantity 1s limiting retroviral receptors, compared to the parental envelope including her is derived.
The mutated or chimeric proteins of the invention have advantageously at least one of the following properties - there is formation of syncytia after cocultures between cells 2o targets expressing a surface molecule serving as a retroviral receptor through interaction with the linkage domain carried by a glycoprotein envelope retioviral and cell lines producing or not Gag- particles Pol of MLV (or type C mammalian retroviruses or Ientiviruses) previously transfected with an expression vector for one of the above 25 proteins of the invention, - there is infection of target cells expressing a retroviral receptor recognized by the binding domain of a mutated or chimeric glycoprotein of _.
the invention, under limiting conditions where the density of this receptor (that is tell the number of receptors available on the cell surface allowing 30 attachment of the viral particle) decreases by at least 100 times the titer infectious with viruses comprising a non-mutated and non-chimeric envelope and by less than 100 times the infectious titer of virus with an envelope chimera WO 99136561 ~ 1 PCT / FR99 / 00016 or mutated from the invention, these above values applied to the infectious title being data by comparison to infectious titer of virus with envelope non-mutated and non-chimeric or a chimeric or mutated envelope on cells targets, such as XC cells, under infection conditions such as defined in the examples and in particular with regard to table 1B below.
We therefore have in particular two tests to characterize the mutated proteins or chimeras of the invention.
One of these tests is the formation of syncytia between target cells and cell lines previously transfected with an expression vector for one of the above chimeric or mutated proteins of the invention (and likely to recognize a retroviral receptor located on said cells targets).
SC1, Mus mouse cells can be used as target cells.
Durai, human TE67I cells, as well as XC rat cells.
The cell lines used may or may not produce particles Gag-Pol from MLV.
Cell lines may or may not produce Gal-Pol particles of MLV or other retrov ~ nis of type C mammals, including the MLV virus Moloney or other retroviruses such as Ientiviruses, for example HIV-1.
Another characterization test of mutated proteins or chimeras of the invention consists in infecting target cells expressing a receptor retroviral capable of being recognized by a chimeric protein or mutated from the invention, via viral particles containing these proteins chimeras or mutated.
As target cells, the XC and XC-A-ST rat cells can be used, the latter being derived from XC cells by transfection of a plasmid expressing the binding domain of the amphotropic retroviral envelope capable occupy the amphotropic retroviral receptor.
As viral particles, it is possible to use those produced by 3o MLV retroviruses or other mammalian type C retroviruses, in particular the Moloney MLV virus or other retroviruses such as lentiviruses, such as HIV-I example.

This infection is carried out under limiting conditions, that is to say such as the density of the receptor (i.e. the number of receptors available on the cell surface allowing the attachment of the particle viral) decreases the infectious titer of viruses with envelope glycoprotein neither mutated nor chimeric and by less than 100 times Ie title infectious to viruses comprising a mutated or chimeric envelope of the invention corresponding to the above envelope neither mutated nor chimerical.
The comparison is made with respect to the infectious titer of virus comprising a non-chimeric and non-mutated envelope or a chimeric envelope or mutated on target cells such as XC cells.
This infection is comparatively carried out on two cell types, the second being directly derived from the first and has the effect of reducing the number of retroviral receptors available, i.e. such that the decrease of receptor surface expression decreases by at least 100 times the titer infectious virus containing the parental envelope neither mutated nor chimeric.
This value is then compared to that obtained for viruses comprising the chimera or mutated envelope. A decrease of less than 100 titles infectious of viruses comprising the above-mentioned chimera envelope or mutated between the two cell types therefore indicates an improvement in fusogenic character of 2o the latter.
Sequences. ' rich in proline advantageous according to the invention correspond to one of the following sequences Az 2s A3MB

s Compared to the proline-rich region of the retroviral glycoprotein of a Amphotropic MLV, AZ sequence suppresses second / 3-turn which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope in the syncytia.
Compared to the proline-rich region of the retroviral glycoprotein of a Amphotropic MLV, sequence A, involves the removal of the third (3-turn s which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope under test of syncytia.
Compared to the proline-rich region of the retroviral glycoprotein of a Amphotropic MLV, the A3Mo sequence involves the removal of the third ~ 3-turn which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope in test lo infection as defined above.
Compared to the proline-rich region of the retroviral glycoprotein of a Amphotropic MLV, A4 sequence suppresses fourth (3-turn which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope under test infection as defined above.
15 Compared to the proline-rich region of the retroviral glycoprotein of a Amphotropic MLV, sequence C2 includes the deletion of ~ 3-turns 9 to 13 which has has the effect of being more fusogenic than the parental envelope under test infection as defined above.
Compared to the proline-rich region of the retroviral glycoprotein of a 20 amphotropic MLV, Ia sequence C, includes the deletion of, (3-turns 11 to 13 who has has the effect of being more fusogenic than the parental envelope under test infection as defined above.
Compared to the proline-rich region of the retroviral glycoprotein of a Amphotropic MLV, sequence C, includes the deletion of the last ~ i-turn (13 °) 25 which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope under test infection as defined above.
Compared to the proline-rich region of the retroviral glycoprotein of a Amphotropic MLV, the CS sequence includes the deletion of the 11 ° and I2 ° ~ 3-turns which has the effect of being more fusogenic than the parental envelope under test 3o of teI infection as defined above.

Advantageous chimeric proteins according to the invention correspond to one of the following sequences PROMO
- PRO FR
s - BD PRO MO
- PRO C MO
- PRO TM MO
- PRO CTM MO
to The PROMO sequence corresponds to the amphotropic MLV sequence in which the proline-rich region is replaced by the region rich in proline homologous to the ecotropic MLV (Moloney strain).
The PRO FR sequence corresponds to the amphotropic MLV sequence in which the proline-rich region is replaced by the region rich in proline 15 counterpart of ecotropic MLV (Friend strain) BD PRO MO sequence corresponds to amphotropic MLV sequence in which the proline-rich region is replaced by the rich region in proline homologous to the ecotropic MLV and in which the binding domain has been replaced by the homologous binding domain of the ecotropic MLV.
2o The sequence PRO CMO corresponds to the sequence of amphotropic MLV
J
in which the proline-rich region is replaced by the region rich in prOline homologous to the ecotropic MLV and in which domain C has been replaced by the C domain homologous to the ecotropic MLV.
The PRO TM MO sequence corresponds to the amphotropic MLV sequence In which the proline-rich region is replaced by the rich region in proline homologous to the ecotropic MLV and in which the TM domain has been replaced by the TM domain homologous to the ecotropic MLV.
The PRO CTM MO sequence corresponds to the MLV sequence amphotropic in which the proline-rich region is replaced by Ia region -3o rich in proline homologous to the ecotropic MLV and in which the domains respectively C and TM have been replaced by domains C and TM respectively counterparts of the ecotropic MLV.

WO 99/36561 1.5 PCT / FR99100016 Advantageous chimeric proteins according to the invention comprise one proline-rich sequences corresponding to one of the following sequences Az Ace IO Cs and are such that at least one of their following functional areas binding domain, domain. C, transmembrane domain, is replaced by the homologous domain of ecotropic MLV.
It is shown in the context of the present invention that the region rich in proline (PRR) from the murine leukemia virus (MLV) envelope, localized between the receptor binding domain of the amino terminal part of the SU
and the domain of interaction with the TM of the carboxy-terminal part of the SU, acts as an intermediary in the changes in conformation of the envelope and 2o in the activation of the fusion. More, we show that the beta-turns potentials of ,>
the proline-rich region determines the stability of the SU-TM association and the activation cell of cell-cell fusion and virus-cell fusion.
In order to identify the (or ies) regions) responsible for the largest fusogenicity of the ecotropic envelope of MLVs, we generated a series 2s of chimeric envelopes in which the amphotropic envelope domains BD, PRO, C and TM are exchanged with their counterpart of the ecotropic envelope (Fig 1B). The resulting envelopes are then identified according to the (s) areas) substituted ecotrope (s). Cell-to-cell fusion is evaluated by Ia training syncytia after 24 hour coculture between different target cells 30 (indicator) and cell lines, whether or not producing particles Gag-Pol of MLV (5), previously transfected with one or other of the envelopes.
Although the level of expression on the cell surface of the envelopes parenting WO 99/36561 1 ~ PCTIFR99 / 00016 and chimeras are similar (Fig. 4ä), two different fusion phenotypes cells-cells are observed. CMO and TMMO envelopes, just like the wild envelope MLV-4070A, weakly induce syncytia.
However, the BDMO, PROMO and PROFR envelopes strongly induce the syncytia formation, similar to those induced by the ecotropic envelope.
(Fig 2) _ The formation of syncytia is not affected by the presence or lack of Gag-Pol particles (data not shown), showing that the measured fusion in this test occurs by direct cell-cell contact rather than of cell contacts mediated by viral particles. Reports previous reports indicate that the high fusogenicity of the BDMO envelope is due mainly to its ability to interact with the ecotropic receptor (18).
However, significant fusogenicity is also observed with chimeras carrying the amphotropic BD domain (Figs. I and 2) with all types cells used, including target cells from rats, mice and of man, is with or without the ecotropic receptor (data not shown).
So, the differences observed, during syncytia formation, between the envelopes parental and chimeric amphotropes are due to new properties, different from the interaction of BD with the receptor.
As described for feline leukemia viruses (8) and as suggested by the close related with MLV, the regular repetition of proline in the PRR
,.
perhaps causes it to fold into a poly-proline helix at "beta-turn" (27), a structure secondary which exerts "elastomeric" forces, capable of fulfilling the function of "molecular spring" (26). Because of the critical location of the PRR, between the BD and C fields which both influence fusion, its role in fusion has been evaluated directly. Differences in the number and arrangement of "beta-turn "
predicted in the PRR of 4070A envelopes, compared to that of MoMLV, leave provide a more reactive spring for the latter which could explain the fusogenicity PROMO increased. Point or deletion mutants, C2, C3, C4 and C5, designed to remove some of the seven carboxy-terminal "beta-turn" from the PRR
3o amphotropic, were tested in the cell-cell XC fusion test. They turned out weakly fusogenic like the amphotropic parental envelope (Fig. 3B). The Proline proline-induced "beta-turn" is less intermingled in the part WO 99/36561 I ~ PCT / FR99 / 00016 amino-terminal than in the carboxy-terminal end. So each of four Potential "beta-turn" of envelope 4070A could be removed individually by substitution of a proline by a valine, an alanine or an isoleucine, giving them mutants AI, A2, A3, A3M0 and A4 (Fig. 3C). A second amino acid has been substituted in mutants A2 and A3 in order to avoid the formation of alpha helix or beta sheet potential, originally absent in the structural predictions of the PRR of MLV
(not shown). AI and A4 envelopes, for which, respectively, the first or the fourth amino beta "turn" has been mutated, keep a repetition regular three contiguous "beta-turn" and they do not induce a formation of 1o augmented syncytia (Table 1). In contrast, the A2 and A3 envelopes in which ones the continuity of these beta-turns is interrupted {Figs. 3C and 3D), are very fusogenic (Table 1), thus demonstrating the critical importance of "beta-turn "
contiguous PRR in ia "mediation" of merger following recognition of receiver. In order to test whether this increased fusogenicity was due to a need lower in Pit-2 molecule, we compared cell-cell fusion in using XC or XC-A-ST cells. In the latter, the constitutive expression of BD
amphotrope reduces the amount of functional Pit-2 receptor (Table 1).
Interference is effective against the MLV-4070A envelope while a fusogenicity high is always observed with the PROMO, PROFR, A2 and A3 envelopes.
2o Nevertheless, the fusion is still dependent on Pit-2 since cells CHO
,.
not expressing Pit-2 merge only after de novo expression of Pit-2 (no mbntré). Thus, mutations in the PRR "beta-turn" seem to lower the activation threshold of the merger taking part after the recognition of the receiver.
After cell-cell fusion, cell-virus fusion was examined by comparing the infectivity of virions carrying the parental or chimeric envelope.
The titles are equivalent on XC rat (Table 1), mouse, human and on the CHO transfected with the Pit-2 receptor expression gene. So surprisingly, the highly fusogenic PROMO and PROFR chimeras, as well as the point mutants A2 and A3 led to undetectable titers or significantly reduced on all cells tested. The other envelopes give titles in a range of.l0e6-10e7 infectious units per ml (ui / ml) on cells XC, similar to those obtained with the two parental envelopes 4070A and MO.
Although WO 99 / 365b1 18 PCTIFR99 / 00016 The infectivity of the virions generated with the parental amphotropic envelope either dramatically reduced on XC-A-ST cells, all PRR mutants infectious, with the exception of Al, are significantly less susceptible to interference (Table I). The fact that the mutants of the carboxy-terminal part of the PRR
do not exhibit changes in cell-cell fusogenicity but show nevertheless an increase in infectivity (virus-cell fusion), demonstrates that amino, but also carboxy, units influence fusogenicity. The tests receptor binding, performed using an antibody to SU, show that the Pit-2 / SU affinity is not significantly altered for these 1o envelopes (not shown). Infection of transfected CHO expressing Pit-2, through opposition to the lack of parental CHO infection, confirms the need to Pit-2 for the entry of virions.
Since the low infectivity of virions carrying the mutant envelopes fusogenic in cell-cell tests is due to increased SU loss (Fig.

4), la PRR
paraît jouer un rôle critique dans l'association SU/TM et la conformation de l'enveloppe. Le relargage accru de SU, pour les mutants PROMO, PROFR, A2 et A3, suggère que la PRR exerce sa fonction de régulation de la fusion en interagissant avec des régions adjacentes, et que la destruction de ces interactions stimule la fusion. La combinaison de PRR écotropique avec des régions homologues avales, comme dans les chimères PROCMO, PROTMMO et PROCTMMO, ou avec Ie domaine amont BD, comme pour 1'énveloppe BDPROMO (Fig. IC), augmente ia stabilité, comme estimé avec Ia perte de SU (non montré) (Fig. I).
Finalement,. on démontre qu'après Ia reconnaissance du récepteur, PRR est un déterminant clef des changements de conformation de l'enveloppe et de la fusion membranaire. De plus, l'arrangement caractéristique des "beta-turn" de la PRR
en association avec les domaines avals C et TM, confère des propriétés distinctes entre ces enveloppes MLV.
Les applications potentielles de l'invention sont les suivantes - thérapie génique ex vivo ou in vivo pour le transfert de gène dans des -3o cellules exprimant un nombre limité de récepteurs rétroviraux, par les vecteurs rétroviraux dérivés des rétrovirus de type C, mammifères ou des tentivirus comportant des glycoprotéines d'enveloppe mutées ou chimères comme décrites dans l' invention, . des glycoprotéines d'enveioppe mutées ou chimères comme décrites dans l'invention, ainsi qu'un peptide ou un domaine protéique capable de s rediriger la liaison du vecteur rétroviral vers une cible moléculaire spécifique.
I. Légendes des figures 1o Figs. lA, 1B, 1C et 1D : Représentation schématique des enveloppes chimères et de leurs propriétés.
Fig, lA. Les boites vides sont des séquences dérivées du MLV amphotrope, les boites remplies sont des séquences issus du MLV écotrope de Moloney (noire) ou MLV écotrope de Friend (grise) et les boites hachurées sont des séquences communes 15 à ces deux MLV. BD, domaine de liaison au récepteur; PRO, région riche en proline;
C, domaine carboxy terminal de Ia SU; TM, ectodomaine et domaine d' ancrage de la sous unité TM. Pour chaque domaine, leur pourcentage d'identité, ainsi que les quatre premiers acides aminés N-terminaux, sont indiqués. Un codon stop prématuré
(flèche verticale) est introduit dans la queue cytoplasmique de la sous unité TM du MLV
2o amphotrope pour générer la glycoprotéine d'enveloppe mutante fusogénic ARIess.
,.
Fig. 1B. Les-mutants de simple substitution.
Fig. 1C. Les mutants de substitution combinés.
Fig. 1D. Les résultats des tests de fusion cellule-cellule: (-), absence de syncytia; (+), présence de syncytia seulement dans une coculture avec les cellules 2s XC; (+ +), présence de syncytia à la fois dans une coculture avec des cellules de rat XC mais aussi avec des cellules interférentes XC A-ST. Les résultats des tests d'infection: (-), moins de 10e2 lacZ u.i.lml; (+) et (++), plus de IOe2 lacZ
u.i./m1;
(++); enveloppes avec un seuil d'activation de la fusion réduit, capables .
d'efficacement infecter les cellules interférentes XC-A-ST aveç un titre supérieur à
3o IOe2 lacZ u.i./ml.

WO 99136561 20 PCTlFR99/00016 Fig. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I : Tests de fusion des mutants de simple substitution avec des cellules XC.
Des cellules TE671 transfectées avec les vecteurs d'expression des glycoprotéines d'enveloppe chimères indiquées (Fig 1) sont cocultivées avec des cellules indicatrices XC pendant 24 heures. Grossissement x250.
Figs. 3A, 3B, 3C et 3D : Mutagenèse de la région riche en proline amphotrope 4070A.
Fig. 3A : Alignement de la PRR du MLV de Moloney (Mo), de Friend (Fr) lo et 4070A (A).
Fig. 3B : Mutants ponctuels (acides aminés en petits caractères gras) ou de délétion (tirets) de l'extrémité C-terminale de la PRR du MLV 4070A.
Fig. 3C : Mutants ponctuels de l'extrémité C-terminale de la PRR du MLV
4070A. Les acides aminés changés ou insérés sont mis en évidence ~en petits ls caractères gras.
Fig. 3D, 3E, 3F, 3G : Proills de probabilité des "beta-turn" des PRR des MLV 4070A (4070A), Moloney (Moloney) et des mutants ponctuels de la PRR du MLV 4070A dont le deuxième (A2) ou troisième (A3) bêta turn a été supprimé.
Les valeurs de l'axe y représente la probabilité de beta-turn p(turn)*l0e-4 pour chaque 2o résidus du peptide (sur l'axe x). L'analyse des beta-turn a été effectué
grâce au J, logiciel PC/Gene (Version 6.26, InteiliGenetics, Belgium).
Fig. 4 : In~munoblots des glycoprotéines d'enveloppe amphotrope dont la fusogénicité est augmentée. Les cellules ont été transfectées avec les enveloppes 2s indiquëes dans les Figs 1 et 3 et l'expression de leur SU et de leur précurseur d'enveloppe (PR) est estimée (cell lysates). L'instabilité de l'enveloppe est montrée par l'expression de surface diminuée de Ia SU relativement au PR (préparations de membrane), son relargage de la SU (shedding) accru dans le milieu de culture (surnageant) et dans les virions. Les transferts de protéine (western blots) ont été
3Q révélés avec les anticorps indiqués.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Fig. 5 : elle représente la'~ séquence de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale de MLV écotrope (domaine BD, PRO, C et TM) (souche Moloney).
Fig. 6: elle représente la séquence de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale de MLV amphotrope (domaine BD, PRO, C et TM) (souche 4070A).
Fig. 7 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de Mo MLV (Moloney MLV).
1 o Fig. 8 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV-4070A.
Fig. 9 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV-MCF (souche 247).
IS
Fig. 10 : elle représente la région riche en proline de Ia glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de GALV, souche Seato.
Fig, lI : elle représente ia région riche en proline de la glycoprotéine de 20 l'enveloppe rétrovirale de MLV 10A1.
Fig. 12 : elle représente la région riche en proline de Ia glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de MLV xénotrope, souche NZB.1.V6.
2s Fig. I3 : elle représente la région riche en proline de la glycoprotéine de l'enveloppe rétrovirale de FeLV A.
Fig. 14 : elle représente la séquence de A2.
3o Fig. IS : elle représente Ia séquence de A3.
Fig. 16 : elle représente la séquence de A,Mo.

Fig. 17 : elle représente la séquerice de A4.
Fig. 18 : elle représente la séquence de C2.
Fig. 19 : elle représente Ia séquence de C3.
Fig. 20 : elle représente la séquence de C4.
Fig. 21 : elle représente la séquence de C5.
lo Fig. 22 : elle représente la séquence de PROMO.
Fig. 23 : elle représente la séquence de PRO FR.
Fig. 24 : elle représente la séquence de BD PRO CMO.
Fig. 25 : elle représente la séquence de PRO CMO.
Fig. 26 : elle représente ta séquence de PRO CTM MO.
Fig. 27 : e11~ représente la séquence de PRO TM MO.

Tableau 1 A. Résultats des tests de fusion cellule-cellule.
enveloppe index de fusionaexprimée à Ia surface XC XC-A-ST
0,0210,01 0,0210 MO' 1512 1411 lo Ad 0,2 f0,1 0,0510,02 ARixss' 7414 0,8510,03 PROMO' 1713 1613 PROFR' 18 t 3 23 t 6 A2' 1311 17 f 1 A3' 1411 1713 a : index de fusion calculé selon la formule (N-S)/T (N, nombre de noyaux dans les syncytia ; S, nombre de syncytia ;
T nombre total de noyaux) 2o b : cellules non transfectée.
c : syncytia contenant plus de 20 noyaux !A .
d : syncytia contenant moins de 4 noyaux e: syncytia contenant plus de 40 noyaux avec les cellules XC et moins de 10 noyaux avec les cellules XC A-ST.

WO 99/36561 24 PCTlFR99/00016 B. Résultats des tests d'infectiôn.
enveloppe Titres infectieux' exprime sur niveau les virions XCXC-A-ST d'interfrence MO 7.1x106 6.1x106 1 A lxl0' 6.4x103 1,369 PROMO 2.2x10' 1x10' na 1o PROFR < 1x10' < 1x10' na A1 8.4x106 2.3x/03 3,138 A2 < 1x10' < 1x10' na A3 7.8x10' 3x10' na A3M0 1.2x10' 3.3x104 302 A4 5.7x/06 8./x10' 605 C2 7.6x106 5.7x105 11 C3 5 4x106 4.7x105 10 C4 2.4x 106 I .7x15 12 CS 9.4x106 2.7x10' 299 a : lacZ unités infectieuses par ml (u.i./ml) b : les niveaux d' interférence sont calculés selon la formule (titretxc~/titre ~xc-a-s,~) X (titre MO ~xc-w-sr~~ titre MO ~xc~) na : non appliçable II. MATERIEL ET METHODES
IL I. Lignées cellulaires.
Les cellules TELacZ contiennent le vecteur rétroviral MFGnlsLacZ (25~
responsable de l'expression d'une Beta-galactosidase nucléaire. La lignée cellulaire TELCeB6 (S) dérive de la lignée TELacZ et a été obtenue par transfection d'un plasmide exprimant les protéines gag et pol de MoMLV. Ces cellules produisent donc des particules rétrovirales non infectieuses, car dépourvues d'enveloppes, véhiculant le gène marqueur nlsLacZ.
lo Les cellules TELCEB6, XC, RD et CEAR13 (12) sont cultivées en milieu DMEM (Life-Technologies) supplémenté par 10 % de sérilm de veau foetal (FCS, Life-Technologies). Le milieu de culture des CEAR13 est de plus supplémenté
avec de la proline (Sigma) à 10 ~.g/~,1. La lignée NIH3T3 (ATCC CRL 1658) est cultivée en milieu DMEM (Life-Technologies) supplémenté par 10% de sérum de veau nouveau-ls né (Life-Technologies).
Les cellules XC-A-ST ont été obtenues par transfection stable dans les cellules XC du plasmide pA-ST (5) exprimant le fragment N-terminal de la SU du virus MLV-4070A capable de lier et bloquer le rëcepteur amphotrope.
2o IL2. Plasmides et construction des mutants.
Les plasmides codant pour les enveloppes amphotrope 4070A (FBASALF) 4), the PRR
seems to play a critical role in the SU / TM association and the conformation of the envelope. The increased release of SU, for the PROMO, PROFR, A2 and A3, suggests that PRR performs its function of regulating fusion by interacting with adjacent regions, and that the destruction of these interactions stimulates the fusion. The combination of ecotropic PRR with downstream homologous regions, as in PROCMO, PROTMMO and PROCTMMO chimeras, or with the upstream domain BD, as for the BDPROMO envelope (Fig. IC), increases stability, as estimated with loss of SU (not shown) (Fig. I).
Finally,. it is demonstrated that after recognition of the receptor, PRR is a key determinant of changes in conformation of the envelope and fusion membrane. In addition, the characteristic arrangement of the PRR "beta-turns"
in association with downstream domains C and TM, confers distinct properties Between these MLV envelopes.
The potential applications of the invention are as follows - ex vivo or in vivo gene therapy for gene transfer in -3o cells expressing a limited number of retroviral receptors, by vectors retrovirals derived from type C retroviruses, mammals or tentiviruses comprising mutated or chimeric envelope glycoproteins as described in the invention, . mutated or chimeric envelope glycoproteins as described in the invention, as well as a peptide or a protein domain capable of s redirect the binding of the retroviral vector to a molecular target specific.
I. Legends of the figures 1o Figs. lA, 1B, 1C and 1D: Schematic representation of the envelopes chimeras and their properties.
Fig, lA. Empty boxes are sequences derived from amphotropic MLV, the filled boxes are sequences from the Moloney Ecotropic MLV
(black) or Friend's green MLV (gray) and hatched boxes are sequences common 15 to these two MLVs. BD, receptor binding domain; PRO, a region rich in proline;
C, carboxy terminal domain of Ia SU; TM, ectodomain and anchoring domain of the under TM unit. For each domain, their percentage of identity, as well as the four first N-terminal amino acids, are indicated. A premature stop codon (arrow vertical) is introduced into the cytoplasmic tail of the TM subunit of the MLV
2o amphotropic to generate the fusogenic mutant envelope glycoprotein ARIess.
,.
Fig. 1B. Simple substitution mutants.
Fig. 1 C. The substitution mutants combined.
Fig. 1D. The results of the cell-cell fusion tests: (-), absence of syncytia; (+), presence of syncytia only in a coculture with the cells 2s XC; (+ +), presence of syncytia both in a coculture with rat cells XC but also with XC A-ST interfering cells. Test results infection: (-), less than 10e2 lacZ uilml; (+) and (++), more than IOe2 lacZ
ui / m1;
(++); envelopes with a reduced fusion activation threshold, capable.
to effectively infect XC-A-ST interfering cells with a titer better than 3o IOe2 lacZ ui / ml.

WO 99136561 20 PCTlFR99 / 00016 Fig. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I: Mutant fusion tests simple substitution with XC cells.
TE671 cells transfected with the expression vectors of chimeric envelope glycoproteins indicated (Fig 1) are cocultivated with of XC indicator cells for 24 hours. Magnification x250.
Figs. 3A, 3B, 3C and 3D: Mutagenesis of the proline-rich region amphotrope 4070A.
Fig. 3A: Alignment of the PRR of the MLV of Moloney (Mo), of Friend (Fr) lo and 4070A (A).
Fig. 3B: Point mutants (amino acids in small bold type) or deletion (dashes) of the C-terminal end of the PRR of MLV 4070A.
Fig. 3C: Point mutants of the C-terminal end of the PRR of MLV
4070A. Amino acids changed or inserted are highlighted ~ in small The bold type.
Fig. 3D, 3E, 3F, 3G: Proillions of probability of the beta-turn of the PRRs of MLV 4070A (4070A), Moloney (Moloney) and point mutants of PRR du MLV 4070A with the second (A2) or third (A3) beta turn removed.
The y-axis values represents the probability of beta-turn p (turn) * l0e-4 for each 2o residues of the peptide (on the x axis). The beta-turn analysis has been carried out thanks to J, PC / Gene software (Version 6.26, InteiliGenetics, Belgium).
Fig. 4: In ~ munoblots of amphotropic envelope glycoproteins including fusogenicity is increased. The cells were transfected with envelopes 2s indicated in Figs 1 and 3 and the expression of their SU and their precursor envelope (PR) is estimated (cell lysates). The instability of the envelope is shown by the reduced surface expression of the SU relative to the PR (preparations of membrane), its release of SU (shedding) increased in the culture medium (supernatant) and in virions. Protein transfers (western blots) have been 3Q revealed with the indicated antibodies.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Fig. 5: it represents the '~ sequence of the envelope glycoprotein retroviral ecotropic MLV (BD, PRO, C and TM domain) (Moloney strain).
Fig. 6: it represents the sequence of the envelope glycoprotein retroviral of amphotropic MLV (BD, PRO, C and TM domain) (strain 4070A).
Fig. 7: it represents the proline-rich region of the glycoprotein of the Mo MLV retroviral envelope (Moloney MLV).
1 o Fig. 8: it represents the proline-rich region of the glycoprotein of the retroviral envelope of MLV-4070A.
Fig. 9: it represents the proline-rich region of the glycoprotein of the retroviral envelope of MLV-MCF (strain 247).
IS
Fig. 10: it represents the proline-rich region of the glycoprotein of GALV retroviral envelope, Seato strain.
FIG. 11: it represents the proline-rich region of the glycoprotein of 20 the retroviral envelope of MLV 10A1.
Fig. 12: it represents the proline-rich region of the glycoprotein of the retroviral envelope of xenotropic MLV, strain NZB.1.V6.
2s Fig. I3: it represents the proline-rich region of the glycoprotein of the retroviral envelope of FeLV A.
Fig. 14: it represents the sequence of A2.
3o Fig. IS: it represents the sequence of A3.
Fig. 16: it represents the sequence of A, Mo.

Fig. 17: it represents the sequence of A4.
Fig. 18: it represents the sequence of C2.
Fig. 19: it represents the sequence of C3.
Fig. 20: it represents the sequence of C4.
Fig. 21: it represents the sequence of C5.
lo Fig. 22: it represents the sequence of PROMO.
Fig. 23: it represents the sequence of PRO FR.
Fig. 24: it represents the BD PRO CMO sequence.
Fig. 25: it represents the sequence of PRO CMO.
Fig. 26: it represents your sequence of PRO CTM MO.
Fig. 27: e11 ~ represents the sequence of PRO TM MO.

Table 1 A. Results of cell-cell fusion tests.
fusion index envelope expressed at the surface XC XC-A-ST
0.0210.01 0.0210 MO '1512 1411 lo Ad 0.2 f0.1 0.0510.02 ARixss' 7414 0.8510.03 PROMO '1713 1613 PROFR '18 t 3 23 t 6 A2 '1311 17 f 1 A3 '1411 1713 a: fusion index calculated according to the formula (NS) / T (N, number of nuclei in syncytia; S, number of syncytia;
T total number of nuclei) 2o b: cells not transfected.
c: syncytia containing more than 20 nuclei !AT .
d: syncytia containing less than 4 nuclei e: syncytia containing more than 40 nuclei with XC cells and less than 10 nuclei with XC A-ST cells.

WO 99/36561 24 PCTlFR99 / 00016 B. Results of infection tests.
Infectious Titles envelope express on level XCXC-A-ST interference virions MO 7.1x106 6.1x106 1 At lxl0 '6.4x103 1.369 PROMO 2.2x10 '1x10' na 1o PROFR <1x10 '<1x10' na A1 8.4x106 2.3x / 03 3.138 A2 <1x10 '<1x10' na A3 7.8x10 '3x10' na A3M0 1.2x10 '3.3x104 302 A4 5.7x / 06 8./x10 '605 C2 7.6x106 5.7x105 11 C3 5 4x106 4.7x105 10 C4 2.4x 106 I .7x15 12 CS 9.4x106 2.7x10 '299 a: lacZ infectious units per ml (ui / ml) b: the interference levels are calculated according to the formula (titretxc ~ / title ~ xc-as, ~) X (title MO ~ xc-w-sr ~~ title MO ~ xc ~) na: not applicable II. MATERIAL AND METHODS
IL I. Cell lines.
TELacZ cells contain the retroviral vector MFGnlsLacZ (25 ~
responsible for the expression of a nuclear beta-galactosidase. Line cellular TELCeB6 (S) is derived from the TELacZ line and was obtained by transfection of a plasmid expressing the gag and pol proteins of MoMLV. These cells produce therefore non-infectious retroviral particles, since they lack envelopes, conveying the nlsLacZ marker gene.
lo TELCEB6, XC, RD and CEAR13 cells (12) are cultured in medium DMEM (Life-Technologies) supplemented with 10% fetal calf serilm (FCS, Life-Technologies). The CEAR13 culture medium is additionally supplemented with proline (Sigma) at 10 ~ .g / ~, 1. The NIH3T3 line (ATCC CRL 1658) is cultivated in DMEM medium (Life-Technologies) supplemented with 10% new calf serum-ls born (Life-Technologies).
XC-A-ST cells were obtained by stable transfection in plasmid pA-ST (5) XC cells expressing the N-terminal fragment of the SU of the MLV-4070A virus capable of binding and blocking the amphotropic receptor.
2o IL2. Plasmids and construction of mutants.
Plasmids encoding amphotropic envelopes 4070A (FBASALF)

(5), écotrope de Moloney (FBMOSALF) et écotrope de Friend C57 (FB3) permettent l'expression de l'enveloppe. Les gènes d'enveloppe sont sous le contrôle du LTR (5~
du MLV de Friend FB29. De plus ces plasmides contiennent te gène marqueur phléo, 25 permettant la sëlection par la phléomycine.
Pour générer les diverses constructions d'enveloppes mutantes, une technique de mutagenèse par PCR a été utilisé.
Pour la construction Rless (20), un fragment d'ADN a été obtenu par PCR
(amplification par polymérase en chaîne) sur l'enveloppe MOMLV (23) au moyen des oligonucléotides OURLess 5'-TTC TAT GCG GAC CAC ACA GGA et OLRLess 5'-ATC TCA GTA GTC CAG GCT TTA TGA TAG TCG ACA TGC AT. Après WO 99136561 2~ PCT/FR99/00016 digestion par les enzymes SpeI et AccI, ce fragment a été sous-cioné entre les sites SpeI et C(aI du plasmide FBMOSALF. Un fragment NdeI/CIaI a alors été retiré de ce dernier plasmide, et a été remplacé par NdeI/CIaI provenant du vecteur FBASALF. Il en résulte un vecteur d'expression pour une enveloppe amphotrope contenant un codon stop prématuré quelques nucléotide en amont du codon stop normal. Cette modification réduit Ia longueur de la partie cytoplasmique de la glycoprotéine amphotrope et suffit à la rendre très fusogénique et inductrice de syncytia en culture cellulaire (20).
Pour la construction des enveloppes chimères PROMO et PROFR, un.
1 o fragment PCR correspondant à la région riche en proline des enveloppes des virus Moloney-MLV (MO) et Friend-MLV (FR), avec un site Ap~I et un site KpnI créés au début et à Ia fin de cette région ont été généré grâce aux nucléotides : Up MO
ApaI
5'-CCA ATA GGG CCC AAC CCC GTT CTG et Low MO KpnI 5'-AAC GTG GTA
ÇCC GCC GGT GGA AGT TGG G pour la PCR sur le plasmide FBMOSALF; Up ls FRA pal GTC CCG ATA GGG CCC AAC CCC GTC CTG et Low FR KpnI GAA
TGC GGT ACC TGC TGG CGG GGG CTG AGT GGG pour Ia PCR sur le plasmide FB3. Les fragments digérés ApaI/KpnI sont clonés entre les sites ApaI
(position 653) et BamHI (position 802) de l'enveloppe 4070A à l'aide d'un fragment adaptateur KpnIlBamHI généré par PCR sur le plasmide FBASALF à l'aide des oligonucléotides 2o Up A Kpnï 5'-TATGCGGTACCGGAGATAGACTACTAGCTC et Low A BamHI
S'-GGTAGTAGGATCCTGAGCCGG. Les autres enveloppes chimères ont été
générées à l'aide des enveloppes décrites ci dessus par sous clonage de différents fragments. Le plasmide FBASALF a été ouvert en XhoI-CIaI et cet ADN a été
utilisé
pour cloner les fragments : (i) XhoI-DraIII de l'enveloppe PROMO et le fragment 25 DraIII-CIaI de l'enveloppe MO, générant l'enveloppe PROCTMMO; (ü) NcoI-CIaI
d~
l'enveloppe MO, co-liguê avec un fragment adaptateur Xhoï-NcoI de l'enveloppe A, générant l'enveloppe TM MO; (iii) Xhol-NcoI de l'enveloppe MO grâce à un fragment NcoI-CIaI de l' enveloppe A, générant la chimère PROCMO. La construction PROTMMO a été obtenue en sous clonant le fragment XhoI-BamHI de !'enveloppe 3o PROMO dans le vecteur portant l'enveloppe TMMO digéré par les mëmes enzymes.
Enfin, la chimère BDPROMO a êté faite en co-ligant le fragment DraIII-CIaI de l'enveloppe PROMO dans le plasmide FBMOSALF, digéré par les enzymes BamHI-CIaI, avec un fragment Baml-II-DraIII de l'enveloppe M0.
Les mutants de la région riche en proline amphotrope ont été générés par la méthode de mutagenèse par PCR. Un oligonucléotide codant ou « sens » (« upper ») 80S Fc (S'-TCC AAT TCC TTC CAA GGG GC), localisë juste en amont du site Xho I de l'enveloppe 4070A (à la position S94) (16) a été utilisé en combinaison avec des oligonucléotides fournissant divers sites de restriction (précisés entre parenthèse et dont le site est souligné dans la séquence de l'oligonucléotide) et insérant la mutation souhaitée (les nucléotides ne s'appariant pas sont indiqués par une lettre minuscule) to A2 UpA2 S'-CGA GTC CCC ATA GGG ATC CAA CCG GTA TTA CCC GAC C
(Agel;7, A3M0 LowA3M0 S'- GCCCAACCCAGTGCTAGCCGACCAAAGAC
(Nhe1), A3 P249I/Q2S1V S'-CCA GTA TTA atC GAC ~tc AGA CTC CCT TC (Aat I17; A4 P'2S4I S'-GAC CAA AGA CT~ ata TCC TCA CCA A (EcoRV); CS
P286I/P289L S'-CTC AAC CTC Cat TAC tAG TCt AAG TGT CCC AC (Spe1). Les Is oligonucléotides complémentaires de ces amorces (LowA2 GGT CGG GTA ATA
CCG GTT GGA TCC CTA TGG GGA CTC G; Low A3 GAA GGG AGT CT,g açG
TÇG atT AAT ACT GG; LowA3M0 GTC TTT GGT CGG CTA GCA CTG GGT
TGG GC; Low A4 TTG GTG AGG Ata tcA GTC TTT GGT C; Low CS GGC TGT
GGG ACA CTT aGA CTa GTA atG GAG GTT GAG GGT G) ont été utilisés avec 2o l'amorce Low ABamHI s'hybridant au niveau du site BamFiI (position 802) de l'enveloppe 4070A. ixs deux fragments générés pour chaque mutant sont digérés avec les enzymes adéquates et ils sont ligaturés dans le plasmide FBASALF, digéré
en XhoT-BamHI.
La même stratégie a été utilisé pour les mutants de délétion C2, C3 et C4.
25 L'oligonucléotide SOSFc, s'hybridant en amont du site XhoI, a étë utilisé
avec les oligonucléotides LowA-C4 Kpnl: ATC TCC GGT ACC GAC ACT TGG ACT TGT
AGG GGA GGT TGA GGG, LowA-C3 KpnI: ATC TCC GGT ACC TGG GGG
AGG GGA GGT TGA GGG TGT ACT GGT AGT GGA AGG, et LowA-C2 KpnI:, ATC TCC GGT ACC TGG GGG GGG TGT ACT GGT AGT GGA AGG GGG GTA
3o ACT GGT générant, après digestion, des fragments XhoI-KpnI. Chaque fragment est co-ligué avec un fragment KpnI-BamHI, issu de l'enveloppe PROMO, dans le vecteur FBASALF digéré en XhoI-BamHI.

Les plasmides exprimant les enveloppes sont transfectés par la méthode de précipité au phosphate de calcium (22) dans la lignée TELCeB6. Les cellules transfectées ont été sélectionnées avec de la phléomycine (50 ~cg/ml) et les clones résistants ont été trypsinés en masse. Les cellules à confluence ont été
utilisées pour d'une part récupérer des surnageants viraux après une nuit d'incubation dans du milieu ' normal, et d'autre part pour faire des lysats cellulaires. Les surnageants viraux sont utilisés pour des tests d' infection, des tests de liaison au récepteur, et le reste est soumis à une ultracentrifugation pour obtenir des culots de virus analysés par immunoblot.
IL3. Immunoblot.
Les cellules productrices de virus sont lysées pendant 10 minutes à
4°C dans un tampon Tris-HCI (pH ?,5), contenant du TritonX100 1 %a . SDS 0_OS % _ deoxycholate Smg/ml, NaCI 150 mM et un cocktail d'inhibiteur de protéases (PMSF
I mM, Leupeptin 6 mM, Aprotinin 0,3 mM). Ces Iysats sont centrifugés 10 minutes à
10 000 g afin de culotter tous les orgaaites, et les surnageants sont congelés à -80°C
jusqu'à l'analyse. Les échantillons viraux sont obtenus par ultracentrifugation de surnageants viraux (6 ml) dans un rotor SW4I Beckman (30000 rpm, 1 heure, 4°C).
Les culots sont resuspendus dans 80 ld de PBS froid (Phosphate Buffered Saline) 2o (tampon phosphate câlin), Life-Technologies) et congelés à -80°C.
Les échantillons (30 ~.g de lysats cellulaires ou 20 ~,I de virus purifiés) sont mélangés dans rapport de 5:1 (vlv) à du tampon 375 mM Tris-HCl (pH 6,8) contenant 6 % de SDS (sodium dodécyl sulfate), 30 % beta-mercaptoéthanol, I O % glycérol et 0, 06 % de bleu de bromophénol, puis dénaturés 3 minutes à 95°C et analysés sur gel dénaturant d'acrylamide 10%/SDS. Après transfert des protéines sur membrane de nitrocelIulose, le marquage immunologique est effectué dans du TBS (Tris Base Saline (tampon Tris), pH 7,4) en présence de lait écrémé (S %a) et de Tween 0,1 %. Les anticorps (Quality Biotech Inc., U.S.A.) provenant d'antisérum de chèvre dirigés contre la gp70-SU de Rausher Leukemia Virus (RLV) ou la p30-CA de RLV ont été utilisés aux dilutions de 1:2000 et 1:/0000 respectivement. Un anticorps provenant d'un antisérurn de lapin dirigé contre la pISE-TM a été utilisé à la dilution de 1:1000. Les "Mots" ônt été

révélés par utilisation d'un anticorps conjugué, couplé à la peroxydase, d'origine lapin ou chèvre dirigé contre les immunoglobulines de chèvre ou de lapin, respectivement (Dako, U.K.), grâce à un kit de chimioluminescence (Amersham Life Science).
s IL4. Tests de liaison au récepteur.
Les cellules cibles sont rincées au PBS et décollées par une incubation de 10 minutes à 37°C dans du versène 0,02% dans PBS. Les cellules sont rincées dans du PBA (PBS contçnant 2 % de FCS (sérum de veau foetal) et 0,1 % de sodium d'azide qui permet de bloquer l'endocytose membranaire). 106 cellules sont alors incubées 1o pendant 1 heure à 37°C avec les différents surnageants viraux (2 ml) contenant la SU
soluble. Ces surnageants sont déchargés des particules virales précipitées par ultracentrifugation ou non. Après deux rinçages par du PBA, les cellules sont incubëes en présence d'anticorps monoclonal, de rat ou de souris, dirigés contre la SU
(83A25) (5), Moloney ecotrope (FBMOSALF) and Friend C57 ecotrope (FB3) allow the expression of the envelope. The envelope genes are under the control of the LTR (5 ~
of Friend FB29's MLV. In addition, these plasmids contain the marker gene.
phleo, 25 allowing selection with phleomycin.
To generate the various constructions of mutant envelopes, a technique PCR mutagenesis was used.
For the Rless construct (20), a DNA fragment was obtained by PCR
(polymerase chain reaction) on the MOMLV envelope (23) using of oligonucleotides OURLess 5'-TTC TAT GCG GAC CAC ACA GGA and OLRLess 5'-ATC TCA GTA GTC CAG GCT TTA TGA TAG TCG ACA TGC AT. After WO 99136561 2 ~ PCT / FR99 / 00016 digestion with the enzymes SpeI and AccI, this fragment was sub-cloned between the Site (s SpeI and C (aI of the plasmid FBMOSALF. An NdeI / CIaI fragment was then removed from this last plasmid, and was replaced by NdeI / CIaI from the vector FBASALF. he the result is an expression vector for an amphotropic envelope containing a premature stop codon a few nucleotides upstream of the normal stop codon. This modification reduces the length of the cytoplasmic part of the glycoprotein amphotropic and suffices to make it very fusogenic and induces syncytia in culture cell (20).
For the construction of PROMO and PROFR chimeric envelopes, one.
1 o PCR fragment corresponding to the proline-rich region of the envelopes of virus Moloney-MLV (MO) and Friend-MLV (FR), with an Ap ~ I site and a KpnI site created at start and end of this region were generated by nucleotides: Up MO
ApaI
5'-CCA ATA GGG CCC AAC CCC GTT CTG and Low MO KpnI 5'-AAC GTG GTA
ÇCC GCC GGT GGA AGT TGG G for PCR on the plasmid FBMOSALF; Up ls FRA pal GTC CCG ATA GGG CCC AAC CCC GTC CTG and Low FR KpnI GAA
TGC GGT ACC TGC TGG CGG GGG CTG AGT GGG for plasmid PCR
FB3. ApaI / KpnI digested fragments are cloned between ApaI sites (position 653) and BamHI (position 802) of the 4070A envelope using an adapter fragment KpnIlBamHI generated by PCR on the plasmid FBASALF using the oligonucleotides 2o Up A Kpnï 5'-TATGCGGTACCGGAGATAGACTACTAGCTC and Low A BamHI
S'-GGTAGTAGGATCCTGAGCCGG. The other chimeric envelopes have been generated using the envelopes described above by sub-cloning of different fragments. The plasmid FBASALF was opened in XhoI-CIaI and this DNA was used to clone the fragments: (i) XhoI-DraIII of the PROMO envelope and the fragment 25 DraIII-CIaI of the MO envelope, generating the PROCTMMO envelope; (ü) NcoI-CIaI
d ~
the MO envelope, co-ligated with an Xhoï-NcoI adapter fragment of the envelope AT, generating the TM MO envelope; (iii) Xhol-NcoI of the MO envelope thanks to a NcoI-CIaI fragment of envelope A, generating the PROCMO chimera. The construction PROTMMO was obtained by subcloning the XhoI-BamHI fragment of the envelope 3o PROMO in the vector carrying the TMMO envelope digested by the same enzymes.
Finally, the chimera BDPROMO was made by co-ligating the DraIII-CIaI fragment of the PROMO envelope in the plasmid FBMOSALF, digested with the enzymes BamHI-CIaI, with a Baml-II-DraIII fragment of the M0 envelope.
Mutants of the amphotropic proline-rich region were generated by mutagenesis method by PCR. An oligonucleotide encoding or "sense"("upper ") 80S Fc (S'-TCC AAT TCC TTC CAA GGG GC), located just upstream from the Xho site Envelope 4070A (at position S94) (16) was used in combination with some oligonucleotides providing various restriction sites (specified between parenthesis and whose site is underlined in the sequence of the oligonucleotide) and inserting the mutation desired (non-pairing nucleotides are indicated by a letter tiny) to A2 UpA2 S'-CGA GTC CCC ATA GGG ATC CAA CCG GTA TTA CCC GAC C
(Agel; 7, A3M0 LowA3M0 S'- GCCCAACCCAGTGCTAGCCGACCAAAGAC
(Nhe1), A3 P249I / Q2S1V S'-CCA GTA TTA atC GAC ~ tc AGA CTC CCT TC (Aat I17; A4 P'2S4I S'-GAC CAA AGA CT ~ ata TCC TCA CCA A (EcoRV); CS
P286I / P289L S'-CTC AAC CTC Cat TAC tAG TCt AAG TGT CCC AC (Spe1). The Is oligonucleotides complementary to these primers (LowA2 GGT CGG GTA ATA
CCG GTT GGA TCC CTA TGG GGA CTC G; Low A3 GAA GGG AGT CT, g açG
TÇG atT AAT ACT GG; LowA3M0 GTC TTT GGT CGG CTA GCA CTG GGT
TGG GC; Low A4 TTG GTG AGG Ata tcA GTC TTT GGT C; Low CS GGC TGT
GGG ACA CTT aGA CTa GTA atG GAG GTT GAG GGT G) were used with 2o the Low ABamHI primer hybridizing at the BamFiI site (position 802) of envelope 4070A. ix two fragments generated for each mutant are digested with the appropriate enzymes and they are ligated into the digested plasmid FBASALF
in XhoT-BamHI.
The same strategy was used for the C2, C3 and C4 deletion mutants.
The SOSFc oligonucleotide, hybridizing upstream of the XhoI site, was used with the LowA-C4 Kpnl oligonucleotides: ATC TCC GGT ACC GAC ACT TGG ACT TGT
AGG GGA GGT TGA GGG, LowA-C3 KpnI: ATC TCC GGT ACC TGG GGG
AGG GGA GGT TGA GGG TGT ACT GGT AGT GGA AGG, and LowA-C2 KpnI :, ATC TCC GGT ACC TGG GGG GGG TGT ACT GGT AGT GGA AGG GGG GTA
3o ACT GGT generating, after digestion, XhoI-KpnI fragments. Each fragment East co-ligated with a KpnI-BamHI fragment, from the PROMO envelope, in the vector FBASALF digested in XhoI-BamHI.

The plasmids expressing the envelopes are transfected by the method of precipitated with calcium phosphate (22) in the TELCeB6 line. Cells transfected were selected with phleomycin (50 ~ cg / ml) and the clones resistant were mass trypsinized. The confluence cells were used for on the one hand recovering viral supernatants after a night of incubation in middle ' normal, and on the other hand to make cell lysates. Supernatants viral are used for infection tests, receptor binding tests, and the rest is subjected to ultracentrifugation to obtain virus pellets analyzed by immunoblot.
IL3. Immunoblot.
The virus-producing cells are lysed for 10 minutes at 4 ° C in a Tris-HCl buffer (pH?, 5), containing 1% TritonX100 a. SDS 0_OS% _ deoxycholate Smg / ml, 150 mM NaCI and a protease inhibitor cocktail (PMSF
I mM, Leupeptin 6 mM, Aprotinin 0.3 mM). These Iysates are centrifuged 10 minutes to 10,000 g to pellet all the orgaaites, and the supernatants are frozen at -80 ° C
until analysis. Viral samples are obtained by ultracentrifugation of viral supernatants (6 ml) in a Beckman SW4I rotor (30,000 rpm, 1 hour, 4 ° C).
The pellets are resuspended in 80 ld of cold PBS (Phosphate Buffered Saline) 2o (cuddly phosphate buffer), Life-Technologies) and frozen at -80 ° C.
The samples (30 ~ .g of cell lysates or 20 ~, I of purified viruses) are mixed in report of 5: 1 (vlv) in 375 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8) containing 6% SDS (sodium dodecyl sulfate), 30% beta-mercaptoethanol, IO% glycerol and 0.06% blue of bromophenol, then denatured for 3 minutes at 95 ° C and analyzed on gel denaturing 10% acrylamide / SDS. After transfer of the proteins to the membrane of nitrocelIulose, the immunological labeling is carried out in TBS (Tris Base Saline (buffer Tris), pH 7.4) in the presence of skimmed milk (S% a) and Tween 0.1%. Antibodies (Quality Biotech Inc., USA) from goat antiserum directed against gp70-SU of Rausher Leukemia Virus (RLV) or RLV p30-CA have been used in dilutions of 1: 2000 and 1: / 0000 respectively. An antibody from an antiserum of rabbit directed against pISE-TM was used at a dilution of 1: 1000. The "Words" are removed summer revealed by the use of a conjugated antibody, coupled to peroxidase, original rabbit or goat directed against goat or rabbit immunoglobulins, respectively (Dako, UK), using a chemiluminescence kit (Amersham Life Science).
s IL4. Receptor binding tests.
The target cells are rinsed with PBS and detached by an incubation of 10 minutes at 37 ° C in 0.02% versene in PBS. The cells are rinsed in PBA (PBS containing 2% FCS (fetal calf serum) and 0.1% sodium azide which blocks membrane endocytosis). 106 cells are then incubated 1o for 1 hour at 37 ° C with the various viral supernatants (2 ml) containing SU
soluble. These supernatants are released from the viral particles precipitated by ultracentrifugation or not. After two rinses with PBA, the cells are incubated in the presence of monoclonal antibody, rat or mouse, directed against SU
(83A25)

(6) ou contre la TM (MAb2), respectivement, pendant 45 minutes à 4°C.
Les cellules 15 subissent deux lavages dans du PBA puis sont. incubées en présence d'anticorps conjugués, fluorescents, dirigés contre les immunoglobulines de rat (Cayla, F) ou de souris (Dako, U.K.), pendant 45 minutes à 4°C. Les cellules mortes sont ensuite contre colorées avec de l'iodure de propidium (20 p,glml) 5 minutes à
4°C. Après deux rinçages dans du PBA, la fluorescence des cellules vivantes est analysée par 2o fluorométrie, FACSÇalibur, Beckton Dickinson).
ILS. Test de marquage cellulaire.
Les cellulés portant les enveloppes sont lavées, décollées et rincées de Ia même manière que les cellules cibles du test de binding. 106 cellules sont alors 25 incubées directement avec l'anticorps de rat anti SU (83A25) pendant 1 heure à 4°C.
Les étapes de lavages, d'incubation avec l'anticorps secondaire couplé au FITC
et d'analyse au FACS sont identiques au test de binding.
ILG. Tests d'infection.
3o Les cellules cibles NIH3T3 sont ensemencées la veille dans des plaques, 24 puits à une densité de 5.10' cellules par puits. Les cellules sont incubées avec I ml y !
WO 99!36561 30 PCTlFR99l00016 de différentes dilutions du stock viral én présence de polybrène à 8 ug/ml (un polycation, inhibiteur des répulsions électrostatiques entre les particules virales et les cellules). Après 3 à 5 heures d'incubation à 37°C, les surnageants sont remplacés par _ du milieu frais et les cellules sont incubées 2 jours à 37°C. Une fois les cellules fixées avec une solution de glutaraldhéhyde, agent pontant, à 0,5 % dans du PBS, elles sont colorées à l'aide d'un substrat, le 5-bromo-4-chioro-3-indolyl-Beta-D-galactopyranoside ou X-Gal, pendant 12 heures. Les titres viraux sont rapportés en nombre de colonies positives par ml de surnageant viral (LacZ i.u./ml).
1 o IL7. Immunoprécipitation.
Une boite de cellules confluantes de diamètre 35 mm est rincé une fois âvec du milieu DMEM (milieu de Eagle modifié par Dubelcco) sans méthionine, ni cystéine, supplémenté par 10% de sérum de veau foetal dialysé afin d'enlever les acides aminés, puis incubée I h 30 à 37°C dans ce mëme milieu. Après un marquage ~s de 45 minutes grâce à Ia méthionine et la cystéine S35 (100 mCilml; TranS35-Label, ICN Pharmaceuticals), les cellules sont lavées, puis incubées à 37°C
dans du milieu de culture (chasse). Les cellules sont Iysées à différents temps dans une solution à
0,5 % NP40, 150 mM NaCI, 20 mM HEPES supplémenté avec 1 mM PMSF pendant 20 minutes à 4°C. Ix lysat est centrifugé à 10 000 g et le surnageant congelé à -80°C.
20 Ces surnageants sont çlarifiés grâce à du sérum de chèvre non immun (1/100) et de la ProtéineA-Sepharose (6MB, Pharmacia) à 4°C pendant 2 heures ou sur la nuit. Après centrifugation, les surnageants sont incubés avec un antisérum de chèvre dirigé contre la gp70-SU de Raucher Leukemia Virus (RLV) à 1/100 ième pendant 1 heure à
4°C.
La protéine A-Sepharose 40% dans du tampon RIPA (150 mM NaCI, 50 mM Tris, 2s 1 % Deoxycholate, 1 % Triton100X, 0,1 % SDS) est ajouté pour 1 heure à
4°C et les complexes sont précipités par centrifugation à 10 000 g pendant 5 minutes.
Après trois lavages dans du tampon RIPA, les immunoprécipitats sont sëparés sur gel d'acrylamide-12%/SDS. Les protéines sont fixées dans une solution à 25%
d' isopropanol et 10 % d' acide acétique dans de l' eau et la révélation se fait grâce à un 3o écran P32 PhosphoImager (Biorad).

ILB. Tests de Fusion.
Deux jours après leur transfection, les cellules effectrices portant l'enveloppe sont ensemencées à 20% de confluence. Trois à quatre heures après, trois fois plus de cellules cibles sont ajoutées. La cocuIture est incubée 24 heures à
37°C puis fixée s avec une solution de gIutaraldhéhyde à 0,5 % dans du PBS. Les noyaux sont tout d'abord colorés grâce à une solution de May-Grünwald (Sigma diagnostics, USA) puis les cytoplasmes avec du Giemsa (Merk, D) dilué au I/20ème. Le nombre de syncytia sur un centimètre carré est rapporté ou relativisé entre les enveloppes.
y,:

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neutralizable epitope common to the envelope glycoproteins of ecotropic, polytropic, xenotropic and amphotropic mutine leukemia viroses. J. Virol. 64:6176-6183. (6) or against TM (MAb2), respectively, for 45 minutes at 4 ° C.
Cells 15 are washed twice in PBA and then are. incubated in the presence antibody conjugates, fluorescent, directed against rat immunoglobulins (Cayla, F) or from mouse (Dako, UK), for 45 minutes at 4 ° C. Dead cells are then counter stained with propidium iodide (20 p, glml) 5 minutes at 4 ° C. After two rinses in PBA, the fluorescence of living cells is analyzed through 2o fluorometry, FACSÇalibur, Beckton Dickinson).
THEY. Cell labeling test.
The cells carrying the envelopes are washed, peeled off and rinsed with Ia same as the target cells for the binding test. 106 cells are so 25 incubated directly with anti SU rat antibody (83A25) for 1 hour at 4 ° C.
The washing and incubation steps with the secondary antibody coupled to the FITC
and analysis at FACS are identical to the binding test.
ILG. Infection tests.
3o NIH3T3 target cells are seeded the day before in plates, 24 wells at a density of 5.10 'cells per well. Cells are incubated with I ml there!
WO 99! 36561 30 PCTlFR99l00016 different dilutions of the viral stock in the presence of polybrene at 8 ug / ml (one polycation, inhibitor of electrostatic repulsions between particles and cells). After 3 to 5 hours of incubation at 37 ° C., the supernatants are replaced by _ fresh medium and the cells are incubated for 2 days at 37 ° C. Once fixed cells with a solution of glutaraldhéhyde, bridging agent, at 0.5% in PBS, they are stained with a substrate, 5-bromo-4-chioro-3-indolyl-Beta-D-galactopyranoside or X-Gal, for 12 hours. Viral headings are reported in number of positive colonies per ml of viral supernatant (LacZ iu / ml).
1 o IL7. Immunoprecipitation.
A box of confluent cells with a diameter of 35 mm is rinsed once with DMEM medium (Eagle medium modified by Dubelcco) without methionine, nor cysteine, supplemented with 10% dialyzed fetal calf serum to remove the amino acids, then incubated for 1 h 30 at 37 ° C. in this same medium. After a marking ~ s of 45 minutes thanks to methionine and cysteine S35 (100 mCilml; TranS35-Label, ICN Pharmaceuticals), cells are washed and then incubated at 37 ° C
in the middle of culture (hunting). The cells are lyzed at different times in a solution to 0.5% NP40, 150 mM NaCI, 20 mM HEPES supplemented with 1 mM PMSF for 20 minutes at 4 ° C. Ix lysate is centrifuged at 10,000 g and the supernatant frozen at -80 ° C.
20 These supernatants are clarified using non-immune goat serum (1/100) and some Protein A-Sepharose (6MB, Pharmacia) at 4 ° C for 2 hours or on the night. After centrifugation, supernatants are incubated with goat antiserum directed against Raucher Leukemia Virus (RLV) gp70-SU at 1/100 th for 1 hour at 4 ° C.
Protein A-Sepharose 40% in RIPA buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 2s 1% Deoxycholate, 1% Triton100X, 0.1% SDS) is added for 1 hour at 4 ° C and complexes are precipitated by centrifugation at 10,000 g for 5 minutes.
After three washes in RIPA buffer, the immunoprecipitates are separated on gel acrylamide-12% / SDS. Proteins are fixed in a 25% solution isopropanol and 10% acetic acid in water and the development is made thanks to a 3rd screen P32 PhosphoImager (Biorad).

HE B. Fusion tests.
Two days after their transfection, the effector cells carrying the envelope are sown at 20% confluence. Three to four hours later, three times more than target cells are added. The cocuIture is incubated 24 hours at 37 ° C then fixed s with a 0.5% solution of gutaraldehyde in PBS. The nuclei are all first colored using a May-Grünwald solution (Sigma diagnostics, USA) then cytoplasms with Giemsa (Merk, D) diluted to 1/20. Number of syncytia on a square centimeter is reported or put into perspective between the envelopes.
y ,:

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Claims (14)

REVENDICATIONS 35 1. Utilisation d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'enveloppes de rétrovirus. 1. Use of a proline-rich sequence to improve the fusogenic character of retrovirus envelopes. 2. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, laquelle séquence riche en proline correspond:
- soit à la séquence riche en proline . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
amphotrope, ou . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF, . de la glycoprotéiné d'enveloppe rétrovirale d'un MLV10A1, . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV, ou . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
xénotrope, ou . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un .beta.-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline, - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope. 2. Use according to claim 1 of a sequence rich in proline for enhancing the fusogenicity of a protein comprising a retroviral envelope glycoprotein of an amphotropic MLV or a retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or a glycoprotein retroviral envelope of a GALV or an envelope glycoprotein retroviral protein of a xenotropic MLV or a retroviral envelope glycoprotein an MLV MCF or a retroviral envelope glycoprotein of a FeLV, which proline-rich sequence corresponds:
- either to the sequence rich in proline . retroviral envelope glycoprotein of an MLV
amphotropic, or . retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF, . the retroviral envelope glycoprotein of an MLV10A1, . retroviral envelope glycoprotein of a GALV, or . retroviral envelope glycoprotein of an MLV
xenotropic, or . the retroviral envelope glycoprotein of a FeLV, and comprises at least one mutation such that there is deletion of at least a .beta.-turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence, - either to the proline-rich sequence of the envelope glycoprotein retroviral of an ecotropic MLV. 3. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité transmembranaire. 3. Use according to claim 1 of a sequence rich in proline in association with a functional domain of the envelope glycoprotein retroviral of an ecotropic MLV chosen from: the binding domain, the domain C, or the transmembrane subunit domain. 4. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline correspondant à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, en association avec un domaine fonctionnel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope choisi parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité
transmembranaire. 4. Use according to claim 1 of a sequence rich in proline corresponding to the proline-rich sequence of the envelope glycoprotein retroviral activity of an ecotropic MLV, in association with a functional domain of the retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV chosen from:
binding domain, the C domain, or the subunit domain transmembrane. 5. Utilisation selon la revendication 1 d'une séquence riche en proline pour améliorer le caractère fusogénique d'une protéine comprenant une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV, laquelle séquence riche en proline correspond:
- soit à la séquence riche en proline . de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV
amphotrope, et comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un .beta.-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline, - soit à la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope. 5. Use according to claim 1 of a sequence rich in proline for enhancing the fusogenicity of a protein comprising a retroviral envelope glycoprotein of an MLV, which proline-rich sequence corresponds:
- either to the sequence rich in proline . retroviral envelope glycoprotein of an MLV
amphotropic, and comprises at least one mutation such that there is deletion of at least a .beta.-turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence, - either to the proline-rich sequence of the envelope glycoprotein retroviral of an ecotropic MLV. 6. Séquence riche en proline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie C-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 .beta.-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline. 6. Proline-rich sequence whose amino acid sequence and secondary structure correspond to that of the proline-rich sequence of the envelope glycoprotein of an amphotropic MLV or of the glycoprotein retroviral envelope of an MLV 10A1 or envelope glycoprotein retroviral protein of an MLV MCF or of the retroviral envelope glycoprotein of a GALV or the retroviral envelope glycoprotein of a xenotropic MLV or of the retroviral envelope glycoprotein of a FeLV, and comprising at least a mutation on the side of the C-terminal part such that there is deletion of at minus 1 .beta.-turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence. 7. Séquence riche en praline dont la séquence en acide aminés et la structure secondaire correspondent à celle de la séquence riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe d'un MLV amphotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, et comportant au moins une mutation du côté de la partie N-terminale telle qu'il y ait suppression d'au moins 1 .beta.-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline. 7. Praline-rich sequence whose amino acid sequence and secondary structure correspond to that of the proline-rich sequence of the envelope glycoprotein of an amphotropic MLV or of the glycoprotein retroviral envelope of an MLV 10A1 or envelope glycoprotein retroviral protein of an MLV MCF or of the retroviral envelope glycoprotein of a GALV or the retroviral envelope glycoprotein of a xenotropic MLV or of the retroviral envelope glycoprotein of a FeLV, and comprising at least a mutation on the side of the N-terminal part such that there is deletion of at minus 1 .beta.-turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence. 8. Protéine mutée correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF
ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glyçoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un .beta.-turn dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline. 8. Mutated protein corresponding to envelope glycoprotein retroviral from an amphotropic MLV or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF
or to the retroviral envelope glycoprotein of a GALV or to the glycoprotein retroviral envelope of a xenotropic MLV or the envelope glycoprotein retroviral of a FeLV, in which the proline-rich domain comprises at least one mutation such that there is deletion of at least one .beta.-turn in the polyproline helix of the proline-rich sequence. 9. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à'la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF
ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle le domaine riche en proline est remplacé
par le domaine riche en praline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope. 9. Chimeric protein corresponding to envelope glycoprotein retroviral from an amphotropic MLV or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF
or to the retroviral envelope glycoprotein of a GALV or to the glycoprotein retroviral envelope of a xenotropic MLV or the envelope glycoprotein retroviral of a FeLV, in which the proline-rich domain is replaced by the praline-rich domain of the retroviral envelope glycoprotein of one Ecotropic MLV. 10. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF

ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle:
* le domaine riche en proline est remplacé par le domaine riche en proline de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV écotrope, * et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité
transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope. 10. Chimeric protein corresponding to envelope glycoprotein retroviral from an amphotropic MLV or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF

or to the retroviral envelope glycoprotein of a GALV or to the glycoprotein retroviral envelope of a xenotropic MLV or the envelope glycoprotein retroviral infection of a FeLV, in which:
* the proline-rich domain is replaced by the proline-rich domain proline of the retroviral envelope glycoprotein of an ecotropic MLV, * and at least one of the functional domains chosen from:
binding domain, the C domain, or the subunit domain transmembrane, is replaced by the corresponding domain of the envelope of an ecotropic MLV. 11. Protéine chimère correspondant à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV amphotrope ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV 10A1 ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV MCF
ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un GALV ou à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un MLV xénotrope ou la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'un FeLV, dans laquelle:
* le domaine riche en proline comporte au moins une mutation telle qu'il y ait suppression d'au moins un .beta.-turn (dans l'hélice polyproline de la séquence riche en proline), * et l'un au moins des domaines fonctionnels choisis parmi : le domaine de liaison, le domaine C, ou le domaine de la sous unité
transmembranaire, est remplacé par le domaine correspondant de l'enveloppe d'un MLV écotrope. 11. Chimeric protein corresponding to envelope glycoprotein retroviral from an amphotropic MLV or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV 10A1 or to the retroviral envelope glycoprotein of an MLV MCF
or to the retroviral envelope glycoprotein of a GALV or to the glycoprotein retroviral envelope of a xenotropic MLV or the envelope glycoprotein retroviral infection of a FeLV, in which:
* the proline-rich domain contains at least one mutation such that there is deletion of at least one .beta.-turn (in the polyproline helix of the proline-rich sequence), * and at least one of the functional domains chosen from:
binding domain, the C domain, or the subunit domain transmembrane, is replaced by the corresponding domain of the envelope of an ecotropic MLV. 12. Protéine mutée ou chimère selon l'une des revendications 8 à 11, possédant l'une au moins des propriétés suivantes:
- il y a formation de syncytia après cocultures entre des cellules cibles exprimant une molécule de surface servant de récepteur rétroviral par interaction avec le domaine de liaison porté par une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale et des lignées cellulaires produisant ou non des particules Gag-Pol de MLV (ou de rétrovirus de mammifères de type C ou de lentivirus) préalablement transfectées avec un vecteur d expression pour l'une des susdites protéines, - il y a infection de cellules cibles exprimant un récepteur rétroviral reconnu par le domaine de liaison d'une glycoprotéine mutée ou chimère, dans des conditions limitantes où la densité de ce récepteur diminue par au moins fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe non mutée ou non chimère et par moins de 100 fois le titre infectieux de virus comportant une enveloppe chimère ou mutée, ces susdites valeurs appliquées au titre infectieux étant données par comparaison au titre infectieux de virus comportant une enveloppe ni mutée, ni chimère ou une enveloppe chimère ou mutée sur des cellules cibles, telles que des cellules XC. 12. Mutated or chimeric protein according to one of claims 8 to 11, having at least one of the following properties:
- there is formation of syncytia after cocultures between cells targets expressing a surface molecule serving as a retroviral receptor by interaction with the binding domain carried by an envelope glycoprotein retroviral and cell lines producing or not Gag-particles Pol of MLV (or mammalian retrovirus type C or lentivirus) previously transfected with an expression vector for one of the aforesaid protein, - there is infection of target cells expressing a retroviral receptor recognized by the binding domain of a mutated or chimeric glycoprotein, in limiting conditions where the density of this receptor decreases by at least times the infectious titer of virus comprising a non-mutated or non-mutated envelope chimera and by less than 100 times the infectious titer of virus comprising a chimeric or mutated envelope, these aforesaid values applied to the title infectious being given by comparison with the infectious titer of viruses comprising a neither mutated nor chimeric envelope or a chimeric or mutated envelope on target cells, such as XC cells. 13. Séquence riche en proline selon la revendication 6 ou 7, correspondant à l'une des séquences suivantes :

A3Mo 13. Proline-rich sequence according to claim 6 or 7, corresponding to one of the following sequences:

A3Mo 14. Protéines mutées en chimère selon l'une des revendications 8, 9, ou 10, correspondant à l'une des séquences suivantes :
- PROMO
- PRO FR
- BD PRO MO
- PRO C MO
- PRO TM MO
- PRO CTM MO 14. Proteins mutated into a chimera according to one of claims 8, 9, or 10, corresponding to one of the following sequences:
- PROMO
- PRO EN
- BD PRO MO
- PRO CMO
- PRO TM MO
- PRO CTM MO