CA2195560A1 - Procede de production d'acides gras ou derives a partir de plantes oleagineuses - Google Patents
Procede de production d'acides gras ou derives a partir de plantes oleagineusesInfo
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Abstract
L'invention concerne un procédé de production d'acides gras ou de dérivés d'acides gras à partir de plantes oléagineuses. Ce procédé est caractérisé en ce qu'on produit des plantes oléagineuses transgéniques possédant, d'une part, au moins un gène codant pour une enzyme lipase, dit gène de lipase, d'autre part, associé à ce gène de lipase, un promoteur permettant une expression dudit gène soit dans des compartiments différents des compartiments d'accumulation des lipides, soit sur induction exogène, on recueille les graines ou fruits contenant les lipides des plantes, on les broie le cas échéant après traitement inducteur de façon à mettre en contact lipides et lipase, on laisse incuber l'ensemble pour engendrer une hydrolyse enzymatique des lipides et on extrait les acides gras ou dérivés.
Description
~ WO96/03511 2 1 9 5 5 6 0 ~.. . . . 1 PROCEDE DE PRODUCTION D'ACIDES GRAS OU DERIVES
' A PARTIR DE PLANTES OLEAGI~EUSES
L'invention concerne un procédé de production d'acides gras ou dérivés d'acides gras (esters ou autres dérivés) à partir de plantes oléagineuses. Le procédé de l'invention s'applique en particulier à des plantes oléoprotéagineuses telles que colza, tournesol, so~a, crambé... L'invention peut notamment être utilisée pour fabriquer des bio-carburants (diester), lubrifiants, ad~uvants phytosanitaires, détergents... par transformation des acides gras~proauits.
On a tenté depuis 1970 de substituer aux produits dérivés du pétrole (notamment carburants~ des produits obtenus à partir de matière végétale afin de réduire la dépendance vis-à-vis des pays producteurs de pétrole et d'élargir les débouchés des produits agricoles.
La filière utilisant les plantes oléagineuses comme matière première passe par la production d'acides gras libres qui constituent la matière première pour les industries de transformation vers les carburants, lubrifiants... Les lipides accumulés par les plantes oléagineuses peuvent être transformés en acide gras par hydrolyse : deux procédés sont actuellement exploités industriellement pour opérer cette transformation.
Un premier procédé consiste à hydrolyser les lipides après extr~ction en mettant en contact à chaud et sous pression les lipides extraits avec du méthanol sulfurique ou ae la potasse méthanolique. ~n autre procédé
consiste à opérer l'hydrolyse dans des conditions similaires directement sur le broyat de graines sans extraction préalable. On pourra par exemple se reporter à
la référence suivante pour plus de détails sur ces procédés qui sont les seuls exploités dans l'industrie pour hydrolyser les huiles végétales : K.J. Harrington et C. a'Arcy-Evans, Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Dev. 1985, 24, 314-318. Les défauts bien connus de ces procédés sont les suivants : coût de mise en oeuvre élevé, infrastructure -- , .
~ C~ 2 Z 1 9 ~ 5 ~ ~
~,~ ... .....
industrielle lo~rde, caractère polluant des effluents, production de glycerol comme sous-produit sans marché
act~ t. Ces procédés sont mis en oeuvre faute de techniques de remplacement.
Par ailleurs, des expérimentations ont été
conduites en laboratoire pour réaliser l'hydrolyse des lipides par voie enzymatique en melangeant une lipase avec les lipides ex~raits des graines (G.P. McNeill et al., JAOCS, Vol. 68 n~ 1 janvier 1991, p. 1-5 ; S.M. Kim et J.S.
Rhee, JAOCS Vol. 68 n~ 7 juillet 1991, p. 499-503 ; C.
Gancet, In Heterogeneous Catalysis And Fine Chemicals II
1991, Guisnet Editors, p. 93-104). Toutefois, ces essais sont restés au. stade ~ laboratoire car la technique est incompatible avec une exploitation industrielle en raison des quantités d'enzyme nécessaires et du coût de celle-ci Il convient de souligner que sont déjà
connus en tant que tels des procédés permettant de faire produire des en=zymes par des plantes (brevet WO-A-92/01042 et EP-A-0.449.376). Ces procédés conduisent à une production à bon marché des enzymes qui sont ensuite utilisées dans divers processus de transformation industrielle ou alimentaire, soit après isolement, soit sans les isoler.
Toutefois, cet enseignement est totalement étranger au problème concerné visant la production d'acides -- gras directement à partir de plantes oléagineuses.
La présente invention se propose de fournir une nouvelle solution au problème de la production d'acide gras à partir de plantes oléagineuses. Elle vise à fournir une solution dont les coûts de mise en oeuvre sont considérablement abaissés par rapport aux procédés connus (aussi bien procédés chimiques industriels que procédé
enzymatique de laboratoire).
Un objectif de l'invention est ainsi de fournir un procedé exploitable sur le plan industriel dans des conditions douces de température et de pression, qui bénéficie d'une mise en oeuvre simple et non polluante, utilise une infrastructure légère et ne conduit à aucun f ~ 214 ~1 95560 sous-p-rodult genant.
Un autre objectif, lié au précédent, est de permettre de multiplier les installations de production d'acides gras en vue de les rapproc~er des lieux de culture des plantes oléagineuses et de réaliser ainsi des économies de transport de la matière première.
A cet effet, le procédé conforme à
l'invention pour la production d'acides gras ou dérivés d'acides gras à partir de plantes oléagineuses se caractérise en ce que :
on prod~it des p ~ _ _ _ _ ~ s /
, WO96~3511 r~l, 3 2 ~ 955 60 transgéniques possédant, d'une part, au moins un gène codant pour une enzyme lipase, dit gène de lipase, d'autre part, associé à ce gène de lipase, un promoteur permettant une éxpression dudit gène soit dans des compartiments , 5 cellulaires, extracellulaires ou tissulaires differents de ceux où s'accumulent les lipides de la plante, soit sur induction exogène, - on recueille les graines ou fruits contenant les lipides desdites plantes, - on broie lesdites graines ou fruits, le cas échéant après traitement inducteur, de facon à mettre en contact les lipides et la lipase contenue dans lesdites graines ou fruits, - on laisse incuber l'ensemble pour engendrer une hydrolyse enzymatlque des lipides du broyat sous l'action catalytique de la lipase contenue dans ledit broyat, - on extrait les acides gras issus de l'hydrolyse ou on les transforme pour obtenir les dérivés d'acides gras recherchés.
Ainsi le procédé de l'invention est un procédé d'hydrolyse enzymatique qui bénéficie des avantages de ce type de procédé (conditions douces de mise en oeuvre, absence de pollution, installations légères et peu coûteuses, absence de sous-produits gênants). Dans ce procédé, on amène la plante à produire elle-même l'enzyme nécessaire à la transformation ultérlèure des lipides, en évitant gue cette enzyme ne vienne prématurément au contact des lipides de façon à écarter tout risque d'auto-dégradation de la plante avant la récolte. L'hydrolyse estensuite obtenue sans addition d'enzyme exogène en opérant la mise en contact des lipides et des enzymes produits par la plante. Un tel procédé presonte un coût glo~al de mise en oeuvre particulièrement réduit. Les installations de broyage et d'incubation sont légères et courantes dans lo miliou agricole, de sorte que ces opérations peuvent êtro oxécutées sur les sites de récolte des plantes.
La production des plantes transgéniques est WO96~3511 F~l/rl_5. 5/
~ 4 ~ 1 9 5 5 6 ~ ~
obtenue en réalisant in$tialement la transformation génétique d'une plante oléagineuse naturelle, en amenant la plante génétiquement transformée à se multiplier par la voie sexuée pour la production de semences transgéniques et en utilisant ensuite ces semences pour l'obtention de plantes transgéniques descendantes.
La transformation génétique initiale consiste, selon un processus act~ nt bien connu, à
réaliser une cassette d'expression comprenant le gène de lipase et le promoteur d'expression de ce gène et à
introduire cette cassette d'expression dans le génome de la plante.
Une des caractéristiques essentielles du procédé de l'invention est que le promoteur associé au gène de lipase est adapté pour éviter une mise en contact prématurée de l'enzyme et des lipides ; ce promoteur peut être de plusieurs types : il peut soit (1) diriger l'expression du gène dans des compartiments différents de ceux où s'accumulent les lipides, soit (2) initier l'expression du gène au moment opportun par induction exogène.
Dans le premier cas, deux types de cassettes d'expression peuvent être utilisés :
(1A) soit une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlant l'expression de ce gène dans un compartiment cellulaire ou tissulaire dii-férent du compartiment d'accumulation des lipides, (1B) soit une cassette d'expression comprenant un promoteur constitutif et un gène de lipase muni d'une séquence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou extracellulaires différents de ceux où
s'accumulent les lipides.
Dans le second cas (2), le promoteur utilisé dans la cassette d'expression est du type contrôlable de façon exogène par des 5ignaux physiques, chimiques ou biochimiques, en particulier promoteur de st~ess ~ ~n~nt l'expression sur application d'un WO96/03511 r~l,r. ~ 1 ~ ' 5 2 ~ 9 5 5 6 0 traumatisme physique sur les graines ou fruits.
Par exemple pour produire des acides gras à
partir de plantes o~éoprotéagineuses, on peut utiliser le ~ mode de mise en oeuvre 1A ci-dessus évoqué :
- la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlant l'expression d'une protéine déterminée de la graine, et en introduisant cette cassette d'expresslon dans le génome de la plante de facon à faire exprimer la lipase dans les compartiments de la graine où s'accumulent la protéine précitée, - la mise en contact des lipides et de la lipase est effectuée par simple broyage.
Pour le colza, le promoteur de la protéine utilisé est avantageusement le promoteur de la napine qui permet une ~c~ lation massive de lipase dans les corps protéiques de la graine, séparés des globules lipidiques.
Le mode de mise en oeuvre lB ci-dessus peut être utilisé quel que soit le type de plante oléagineuse, par exemple en choisissant le promoteur constitutif 35S du CaMV (Virus de la mosaïque du chou-fleur) et la séquence d'adressage PR-S du tabac afin de diriger l'excrétion des lipases produites vers les compartiments extracellulaires.
- 25 La mise en contact des lipides et des lipases est également effectuée dans ce cas par simple broyage.
Le mode de mise en oeuvre (2) ci-dessus peut être utilisé quel que soit le type de plante oléagineuse, par exemple en choisissant le promoteur inhibiteur de protéase isolé de la pomme de terre, qui Cl ~n~ 1 ' expression des gènes en cas de blessures. Le traitement inducteur qui provoque la synthèse des lipases peut être dans ce cas une action de décorticage des graines, réalisée avant le broyage.
De préférence, quel que soit le mode de mise en oeuvre choisi, on utilise un gène codant pour une lipase non spécifi~ue, c'est-à-dire caractérisée par une activité hydrolyti~ue non spécifique, afin d'obtenir une WO9~03511 I~l/rhv~l 5~
~ 6 2 1 9 5 5 6 0 hydrolyse totale des lipides accumulés par la plante et d'évlter les réactions parasites de saponification. Il est toutefois possible, pour certaines utilisations des acides gras, de faire produire à la plante des lipases à activité
hydrolytique spécifique afin de favoriser un type donné
d'hydrolyse (par exemple : monoacylglycérollipase du Penicyllium camembertii réalisant uniquement l'hydrolyse d'une des trois liaisons du glycérol avec les acides gras, en vue de la fabrication de diacylglycérols).
On peut en particulier utiliser des gènes de lipase non spéc$fique, caractérisé par les séquences suivantes ou par des séquences analogues aux séquences suivantes (les flèches délimitent la partie codante) :
SEQUENOE I
1 G~ATGACAACT TGGTTGGTGG CATGACTTTG GACTTACCCA GCGATGCTCC
W096103511 7 P~l/r sEQuENcE ~ ;i 2-1 9 5 5 6 0 Sl CTACCGCACA CTCCGTCGCT GGGCGTTGTG CGGGGAAGAT TCAAACGRGC
' ~
101 GTTTCGCGCC GTQACAACCC GCTCTCrTCC GCTCTGCCAC GCAGGTTATG
Z01 AGCTGGCAC:G GTTCCTGGCG CAAGGGACAG CGAAGCGGTT CTCCCGGAAG
301 ATGAGAACAA C~ATGAAGAAG AAGTCTCTGC TCCCC-CTCGG CCTGGCCATC
401 CCqGACCAAA TACCCCATCG TGCTGGCCCA CGGCATGCTC GGCTTCGACA
951 TACAAGGTCA ACGGCGTGAG CTATrACTCC TGGRGCGGTT CCTCGCCGCT
~ 1201 GCGTCTACCG CCAGCACGCC AACCGCCTGA AGAACGCCAG CCTGTAG~
FEUiLlE DE RElllPL~,CEMEUt ~REGLE 26~
W09~03511 iJ~ T~llr~'.'C,~/ ~
' ~ ~ 95560 SEQUENCE III
1 :GGGTGCATGC CAGCTCCCAC CGGACACCTG GCCCGTCGCT GAAQC',TGTT
51 TTCGCTTTCT CTACQAATCC QACQQCQGQG AGGCACTQCC~ATGGGTQTCT
101 TTGQCTRTAA QAQCCTTGGC Q:CCGQGGGTT CCAAAQCGTT GTTCGCCGQT
_ _ _ _ _ . . , , , .. , , ., . , .. , ., . . . ,, . , .. ,, ,, . , . ~ ,_ ~ .
W096/03511 ~ 2 ~ ~560 ~3 ~
1501 GAGGGCGTGG TGATCGGCTG A~TTACTCACG CAACCGATCA GTGCCAGTGC
SEQ~ENCE IV
101 CGCCTCTCTC GCTGCCAGCC CTCTGATCCA GGCC~AGCACC TACACCCAGA
~5i ACTTCCTCGA TCCGAGCGAC GCCTTCCTCG GCGCCTCGTC GCTGACCTTC
~Ol ~C~ c~ cGA CGGCCTGGTC G~C~CCTGCA GTTCG~ACCT
lOqL CCGGGGCCTC GGCCCCGGCC CTTTCCCGGA AGCCCCCTCG CGTGAAGAAA
~ . . ~
Wo96/03511 r~lrh~ J/
' A PARTIR DE PLANTES OLEAGI~EUSES
L'invention concerne un procédé de production d'acides gras ou dérivés d'acides gras (esters ou autres dérivés) à partir de plantes oléagineuses. Le procédé de l'invention s'applique en particulier à des plantes oléoprotéagineuses telles que colza, tournesol, so~a, crambé... L'invention peut notamment être utilisée pour fabriquer des bio-carburants (diester), lubrifiants, ad~uvants phytosanitaires, détergents... par transformation des acides gras~proauits.
On a tenté depuis 1970 de substituer aux produits dérivés du pétrole (notamment carburants~ des produits obtenus à partir de matière végétale afin de réduire la dépendance vis-à-vis des pays producteurs de pétrole et d'élargir les débouchés des produits agricoles.
La filière utilisant les plantes oléagineuses comme matière première passe par la production d'acides gras libres qui constituent la matière première pour les industries de transformation vers les carburants, lubrifiants... Les lipides accumulés par les plantes oléagineuses peuvent être transformés en acide gras par hydrolyse : deux procédés sont actuellement exploités industriellement pour opérer cette transformation.
Un premier procédé consiste à hydrolyser les lipides après extr~ction en mettant en contact à chaud et sous pression les lipides extraits avec du méthanol sulfurique ou ae la potasse méthanolique. ~n autre procédé
consiste à opérer l'hydrolyse dans des conditions similaires directement sur le broyat de graines sans extraction préalable. On pourra par exemple se reporter à
la référence suivante pour plus de détails sur ces procédés qui sont les seuls exploités dans l'industrie pour hydrolyser les huiles végétales : K.J. Harrington et C. a'Arcy-Evans, Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Dev. 1985, 24, 314-318. Les défauts bien connus de ces procédés sont les suivants : coût de mise en oeuvre élevé, infrastructure -- , .
~ C~ 2 Z 1 9 ~ 5 ~ ~
~,~ ... .....
industrielle lo~rde, caractère polluant des effluents, production de glycerol comme sous-produit sans marché
act~ t. Ces procédés sont mis en oeuvre faute de techniques de remplacement.
Par ailleurs, des expérimentations ont été
conduites en laboratoire pour réaliser l'hydrolyse des lipides par voie enzymatique en melangeant une lipase avec les lipides ex~raits des graines (G.P. McNeill et al., JAOCS, Vol. 68 n~ 1 janvier 1991, p. 1-5 ; S.M. Kim et J.S.
Rhee, JAOCS Vol. 68 n~ 7 juillet 1991, p. 499-503 ; C.
Gancet, In Heterogeneous Catalysis And Fine Chemicals II
1991, Guisnet Editors, p. 93-104). Toutefois, ces essais sont restés au. stade ~ laboratoire car la technique est incompatible avec une exploitation industrielle en raison des quantités d'enzyme nécessaires et du coût de celle-ci Il convient de souligner que sont déjà
connus en tant que tels des procédés permettant de faire produire des en=zymes par des plantes (brevet WO-A-92/01042 et EP-A-0.449.376). Ces procédés conduisent à une production à bon marché des enzymes qui sont ensuite utilisées dans divers processus de transformation industrielle ou alimentaire, soit après isolement, soit sans les isoler.
Toutefois, cet enseignement est totalement étranger au problème concerné visant la production d'acides -- gras directement à partir de plantes oléagineuses.
La présente invention se propose de fournir une nouvelle solution au problème de la production d'acide gras à partir de plantes oléagineuses. Elle vise à fournir une solution dont les coûts de mise en oeuvre sont considérablement abaissés par rapport aux procédés connus (aussi bien procédés chimiques industriels que procédé
enzymatique de laboratoire).
Un objectif de l'invention est ainsi de fournir un procedé exploitable sur le plan industriel dans des conditions douces de température et de pression, qui bénéficie d'une mise en oeuvre simple et non polluante, utilise une infrastructure légère et ne conduit à aucun f ~ 214 ~1 95560 sous-p-rodult genant.
Un autre objectif, lié au précédent, est de permettre de multiplier les installations de production d'acides gras en vue de les rapproc~er des lieux de culture des plantes oléagineuses et de réaliser ainsi des économies de transport de la matière première.
A cet effet, le procédé conforme à
l'invention pour la production d'acides gras ou dérivés d'acides gras à partir de plantes oléagineuses se caractérise en ce que :
on prod~it des p ~ _ _ _ _ ~ s /
, WO96~3511 r~l, 3 2 ~ 955 60 transgéniques possédant, d'une part, au moins un gène codant pour une enzyme lipase, dit gène de lipase, d'autre part, associé à ce gène de lipase, un promoteur permettant une éxpression dudit gène soit dans des compartiments , 5 cellulaires, extracellulaires ou tissulaires differents de ceux où s'accumulent les lipides de la plante, soit sur induction exogène, - on recueille les graines ou fruits contenant les lipides desdites plantes, - on broie lesdites graines ou fruits, le cas échéant après traitement inducteur, de facon à mettre en contact les lipides et la lipase contenue dans lesdites graines ou fruits, - on laisse incuber l'ensemble pour engendrer une hydrolyse enzymatlque des lipides du broyat sous l'action catalytique de la lipase contenue dans ledit broyat, - on extrait les acides gras issus de l'hydrolyse ou on les transforme pour obtenir les dérivés d'acides gras recherchés.
Ainsi le procédé de l'invention est un procédé d'hydrolyse enzymatique qui bénéficie des avantages de ce type de procédé (conditions douces de mise en oeuvre, absence de pollution, installations légères et peu coûteuses, absence de sous-produits gênants). Dans ce procédé, on amène la plante à produire elle-même l'enzyme nécessaire à la transformation ultérlèure des lipides, en évitant gue cette enzyme ne vienne prématurément au contact des lipides de façon à écarter tout risque d'auto-dégradation de la plante avant la récolte. L'hydrolyse estensuite obtenue sans addition d'enzyme exogène en opérant la mise en contact des lipides et des enzymes produits par la plante. Un tel procédé presonte un coût glo~al de mise en oeuvre particulièrement réduit. Les installations de broyage et d'incubation sont légères et courantes dans lo miliou agricole, de sorte que ces opérations peuvent êtro oxécutées sur les sites de récolte des plantes.
La production des plantes transgéniques est WO96~3511 F~l/rl_5. 5/
~ 4 ~ 1 9 5 5 6 ~ ~
obtenue en réalisant in$tialement la transformation génétique d'une plante oléagineuse naturelle, en amenant la plante génétiquement transformée à se multiplier par la voie sexuée pour la production de semences transgéniques et en utilisant ensuite ces semences pour l'obtention de plantes transgéniques descendantes.
La transformation génétique initiale consiste, selon un processus act~ nt bien connu, à
réaliser une cassette d'expression comprenant le gène de lipase et le promoteur d'expression de ce gène et à
introduire cette cassette d'expression dans le génome de la plante.
Une des caractéristiques essentielles du procédé de l'invention est que le promoteur associé au gène de lipase est adapté pour éviter une mise en contact prématurée de l'enzyme et des lipides ; ce promoteur peut être de plusieurs types : il peut soit (1) diriger l'expression du gène dans des compartiments différents de ceux où s'accumulent les lipides, soit (2) initier l'expression du gène au moment opportun par induction exogène.
Dans le premier cas, deux types de cassettes d'expression peuvent être utilisés :
(1A) soit une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlant l'expression de ce gène dans un compartiment cellulaire ou tissulaire dii-férent du compartiment d'accumulation des lipides, (1B) soit une cassette d'expression comprenant un promoteur constitutif et un gène de lipase muni d'une séquence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou extracellulaires différents de ceux où
s'accumulent les lipides.
Dans le second cas (2), le promoteur utilisé dans la cassette d'expression est du type contrôlable de façon exogène par des 5ignaux physiques, chimiques ou biochimiques, en particulier promoteur de st~ess ~ ~n~nt l'expression sur application d'un WO96/03511 r~l,r. ~ 1 ~ ' 5 2 ~ 9 5 5 6 0 traumatisme physique sur les graines ou fruits.
Par exemple pour produire des acides gras à
partir de plantes o~éoprotéagineuses, on peut utiliser le ~ mode de mise en oeuvre 1A ci-dessus évoqué :
- la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlant l'expression d'une protéine déterminée de la graine, et en introduisant cette cassette d'expresslon dans le génome de la plante de facon à faire exprimer la lipase dans les compartiments de la graine où s'accumulent la protéine précitée, - la mise en contact des lipides et de la lipase est effectuée par simple broyage.
Pour le colza, le promoteur de la protéine utilisé est avantageusement le promoteur de la napine qui permet une ~c~ lation massive de lipase dans les corps protéiques de la graine, séparés des globules lipidiques.
Le mode de mise en oeuvre lB ci-dessus peut être utilisé quel que soit le type de plante oléagineuse, par exemple en choisissant le promoteur constitutif 35S du CaMV (Virus de la mosaïque du chou-fleur) et la séquence d'adressage PR-S du tabac afin de diriger l'excrétion des lipases produites vers les compartiments extracellulaires.
- 25 La mise en contact des lipides et des lipases est également effectuée dans ce cas par simple broyage.
Le mode de mise en oeuvre (2) ci-dessus peut être utilisé quel que soit le type de plante oléagineuse, par exemple en choisissant le promoteur inhibiteur de protéase isolé de la pomme de terre, qui Cl ~n~ 1 ' expression des gènes en cas de blessures. Le traitement inducteur qui provoque la synthèse des lipases peut être dans ce cas une action de décorticage des graines, réalisée avant le broyage.
De préférence, quel que soit le mode de mise en oeuvre choisi, on utilise un gène codant pour une lipase non spécifi~ue, c'est-à-dire caractérisée par une activité hydrolyti~ue non spécifique, afin d'obtenir une WO9~03511 I~l/rhv~l 5~
~ 6 2 1 9 5 5 6 0 hydrolyse totale des lipides accumulés par la plante et d'évlter les réactions parasites de saponification. Il est toutefois possible, pour certaines utilisations des acides gras, de faire produire à la plante des lipases à activité
hydrolytique spécifique afin de favoriser un type donné
d'hydrolyse (par exemple : monoacylglycérollipase du Penicyllium camembertii réalisant uniquement l'hydrolyse d'une des trois liaisons du glycérol avec les acides gras, en vue de la fabrication de diacylglycérols).
On peut en particulier utiliser des gènes de lipase non spéc$fique, caractérisé par les séquences suivantes ou par des séquences analogues aux séquences suivantes (les flèches délimitent la partie codante) :
SEQUENOE I
1 G~ATGACAACT TGGTTGGTGG CATGACTTTG GACTTACCCA GCGATGCTCC
W096103511 7 P~l/r sEQuENcE ~ ;i 2-1 9 5 5 6 0 Sl CTACCGCACA CTCCGTCGCT GGGCGTTGTG CGGGGAAGAT TCAAACGRGC
' ~
101 GTTTCGCGCC GTQACAACCC GCTCTCrTCC GCTCTGCCAC GCAGGTTATG
Z01 AGCTGGCAC:G GTTCCTGGCG CAAGGGACAG CGAAGCGGTT CTCCCGGAAG
301 ATGAGAACAA C~ATGAAGAAG AAGTCTCTGC TCCCC-CTCGG CCTGGCCATC
401 CCqGACCAAA TACCCCATCG TGCTGGCCCA CGGCATGCTC GGCTTCGACA
951 TACAAGGTCA ACGGCGTGAG CTATrACTCC TGGRGCGGTT CCTCGCCGCT
~ 1201 GCGTCTACCG CCAGCACGCC AACCGCCTGA AGAACGCCAG CCTGTAG~
FEUiLlE DE RElllPL~,CEMEUt ~REGLE 26~
W09~03511 iJ~ T~llr~'.'C,~/ ~
' ~ ~ 95560 SEQUENCE III
1 :GGGTGCATGC CAGCTCCCAC CGGACACCTG GCCCGTCGCT GAAQC',TGTT
51 TTCGCTTTCT CTACQAATCC QACQQCQGQG AGGCACTQCC~ATGGGTQTCT
101 TTGQCTRTAA QAQCCTTGGC Q:CCGQGGGTT CCAAAQCGTT GTTCGCCGQT
_ _ _ _ _ . . , , , .. , , ., . , .. , ., . . . ,, . , .. ,, ,, . , . ~ ,_ ~ .
W096/03511 ~ 2 ~ ~560 ~3 ~
1501 GAGGGCGTGG TGATCGGCTG A~TTACTCACG CAACCGATCA GTGCCAGTGC
SEQ~ENCE IV
101 CGCCTCTCTC GCTGCCAGCC CTCTGATCCA GGCC~AGCACC TACACCCAGA
~5i ACTTCCTCGA TCCGAGCGAC GCCTTCCTCG GCGCCTCGTC GCTGACCTTC
~Ol ~C~ c~ cGA CGGCCTGGTC G~C~CCTGCA GTTCG~ACCT
lOqL CCGGGGCCTC GGCCCCGGCC CTTTCCCGGA AGCCCCCTCG CGTGAAGAAA
~ . . ~
Wo96/03511 r~lrh~ J/
2 1 9 5 5 6 0 SEQUE~CE V
1 ~CAGGCCCCCA CGGCCGTTCT TAATGGCAAC GAGGTCATCT CTGGTGTCCT
151 GGTCTTAAGG CCAACGACTT CAGCTCTGCT TGTATGCAGC TTGATccrGG
401 TGTTTGGTTC TTCTGCTTCT TACCCTGGTA ACGGCTACGT C~nCCnCnCT
701 ACACCTACAA CCCn~ACnnC CTTTTCCACT CTGCCATTCT TCAGTCTGGC
~ W096/U3511 P~l/rhv. ,~/
? ' 2195560 .,~ 11 1601 CGAACTTTGA GTCTGACGTT ACTCTCTTCG GTTAA~
SEQUENCE VI
251 ACCnCCACAn CCTCCCCAAG GCAGCGCTCG ACTTGGTGAT GCAGTCCAAG
601'''ATGCAGTGGG TGGCGGpCAA CATTG'CG'G'CG TTTGGCGGCG ACCCGACCAA
8;51 GCAGCGCCAG CGACAAGCTT GCGTGCTTGC GCGGTGTGCT GAGCGACACG
~ , 12 ~1 9 5 5 6 ~
= 1 .n 951 GCGGTTGCTG TRCCTCCCCC GGCCCGRCGG CGTGRACATC ~CCGQCGACA
1001 TGTACGCCTT'GGTGCGCGAG GGCAAGTRTG CCAACATCCC TGTGATCATC
1051 GGCGACC4G.4 ACGACGAGGG CACCTTCTTT GGCACCCTGC TGTTGRACGT
1201 ACCCAGGGCC TGCCGTTCGA CACGGGTATT CTCRACGCCC TCAC'CCCGC.4 1251 GTTCAAGAGA ATCCTGGCGG TGCTCGGC~ CCTTGGCTTT ACGCTTGCTC
1351 CTGAAGCAGC TCCTGGGCTT GCCGGTGCTC GGAACGTTCC RCTCCARCG.4 1401 CATTGTCTTC CRGGACTACT TGTTGGGCAG CGGCTCGCTC ATCTACRACP.
1451 ACGCGTTCAT TGCGTTTGCC ACGGACTTGG ACCCCRAC~C CGCGGGGTTG
1501 TTGGTGAAGr GGCCCGAGTA CRCCRGCAGC CTGCRGCTGG GC4ACRACTT
1551 GATGRTGRTC ARCGCCTTGG GCTTGTAC'.QC CGGCAAGGAC ARCTTCCGCA
1601 CCGCCGGCTA CGACGCGTTG TTCTCCAACC CGCCGCTGTT CTTTGTGTP, L'identification des six séquences ci-dessus uisées es.t ls suiuante dans la banque de données "EMBL" et "GENE BANK" :
ST~OUENCE r LOCUS: RC~LIP~.SE, 9'.r6bpss mR\~ PL~' 23/01/93 DEFL~TITION ~ opus niveus mR1\iA for lipase, pa~ial sequence ACCESSION: D 12 6bO
SE~OUI~?~CE rlT
LOC~iS:PALIPAG,121/bpDNABCT 2!/0//9' 25 DEFT~,l'rO~': P. a r.~oinosa lip A oe.-.e ror IIP2Se ACCESSION: :~; co 3~0 S '3 ~3 SEQUEi'iCE III
LOCUS: PSELIPASEE, 1~00 bp ds-DNA BCT 1~10 1l9' DEI-INITION: p~lld~ fluorescens lipase cene, com~lele cds
1 ~CAGGCCCCCA CGGCCGTTCT TAATGGCAAC GAGGTCATCT CTGGTGTCCT
151 GGTCTTAAGG CCAACGACTT CAGCTCTGCT TGTATGCAGC TTGATccrGG
401 TGTTTGGTTC TTCTGCTTCT TACCCTGGTA ACGGCTACGT C~nCCnCnCT
701 ACACCTACAA CCCn~ACnnC CTTTTCCACT CTGCCATTCT TCAGTCTGGC
~ W096/U3511 P~l/rhv. ,~/
? ' 2195560 .,~ 11 1601 CGAACTTTGA GTCTGACGTT ACTCTCTTCG GTTAA~
SEQUENCE VI
251 ACCnCCACAn CCTCCCCAAG GCAGCGCTCG ACTTGGTGAT GCAGTCCAAG
601'''ATGCAGTGGG TGGCGGpCAA CATTG'CG'G'CG TTTGGCGGCG ACCCGACCAA
8;51 GCAGCGCCAG CGACAAGCTT GCGTGCTTGC GCGGTGTGCT GAGCGACACG
~ , 12 ~1 9 5 5 6 ~
= 1 .n 951 GCGGTTGCTG TRCCTCCCCC GGCCCGRCGG CGTGRACATC ~CCGQCGACA
1001 TGTACGCCTT'GGTGCGCGAG GGCAAGTRTG CCAACATCCC TGTGATCATC
1051 GGCGACC4G.4 ACGACGAGGG CACCTTCTTT GGCACCCTGC TGTTGRACGT
1201 ACCCAGGGCC TGCCGTTCGA CACGGGTATT CTCRACGCCC TCAC'CCCGC.4 1251 GTTCAAGAGA ATCCTGGCGG TGCTCGGC~ CCTTGGCTTT ACGCTTGCTC
1351 CTGAAGCAGC TCCTGGGCTT GCCGGTGCTC GGAACGTTCC RCTCCARCG.4 1401 CATTGTCTTC CRGGACTACT TGTTGGGCAG CGGCTCGCTC ATCTACRACP.
1451 ACGCGTTCAT TGCGTTTGCC ACGGACTTGG ACCCCRAC~C CGCGGGGTTG
1501 TTGGTGAAGr GGCCCGAGTA CRCCRGCAGC CTGCRGCTGG GC4ACRACTT
1551 GATGRTGRTC ARCGCCTTGG GCTTGTAC'.QC CGGCAAGGAC ARCTTCCGCA
1601 CCGCCGGCTA CGACGCGTTG TTCTCCAACC CGCCGCTGTT CTTTGTGTP, L'identification des six séquences ci-dessus uisées es.t ls suiuante dans la banque de données "EMBL" et "GENE BANK" :
ST~OUENCE r LOCUS: RC~LIP~.SE, 9'.r6bpss mR\~ PL~' 23/01/93 DEFL~TITION ~ opus niveus mR1\iA for lipase, pa~ial sequence ACCESSION: D 12 6bO
SE~OUI~?~CE rlT
LOC~iS:PALIPAG,121/bpDNABCT 2!/0//9' 25 DEFT~,l'rO~': P. a r.~oinosa lip A oe.-.e ror IIP2Se ACCESSION: :~; co 3~0 S '3 ~3 SEQUEi'iCE III
LOCUS: PSELIPASEE, 1~00 bp ds-DNA BCT 1~10 1l9' DEI-INITION: p~lld~ fluorescens lipase cene, com~lele cds
3 0 ACCESSION: ~.36350 FEU~i_'L~ I,A9L;IFIEE
. ~ .
.. . .. . . . , .. _ .. . . _ . _ _ _ .
2 1 9 ~ 5 6 0 12~is ~,.
SEOUENCE IY
LOCUS: PSELIPL, 1282 bp ds-DNA BCT 1~/04l97 DEFIl~ITION: Ps~utlnm~n~c sp. Lipl gene for lipase s ACCESSION: D 10166 D 90398 SEOl~i\TcE ~
LOCUS: GC~' 02387, 1635 bp DNA PLN 0?110193 DEEINITION: Geotrichum candidum NRRL Y-5~3 Lipase gene, par~ial cds ACCESSIONT: UO 2387 1 0 SEOUF~1~C~ Yl .
LOCUS: CCLIP1, 1733 bp DNA PLN - 27/04193 DEFII~rITIONT: C. Cylindracea LIP1 gene for lipase /
n~!'ct WO 96/03511 ~ i 9 5 5 6 0 La séquence I correspon~ à un cDNA de ~hizopus niveus, la séquence II peut être isolée à partir du génome de pS~1r,7. -777;7C aeruginosa, la séquence III à
partir de Pse~ S fluorescens, la séquence IV à partir de Pse~ sp, la séquence V à partir de Geotrichum candidum, la sequence VI à partir de Candida cylindracea.
Par ailleurs, l'introduction de la cassette d'expression : gène de lipase/promoteur d'expression de ce gène, dans le génome de la plante oléagineuse peut être réalisée par tout protocole connu.
Par exemple, selon le protocole le plus courant actuellement, cette cassette d'expression peut être introduite dans le génome de cellules somatiques de la plante par un transfert à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaclens. Cette introduction dans lesdltes cellules somatiques de la plante peut également être réalisée par ~une autre technique connue, notamment par électroporation, par biolistique ou par microinjection.
Il est également possible d'introduire la cassette d'expression dans le génome de microspores de la plante par électroporation ou biolistique.
Dans le protocole fourni plus loin à titre d'exemple, on a décrit la technique d'électroporation pour l'introduction de la cassette dans les microspores du colza.
On pourra se reporter au document suivant "P.J.J. Hooykaas et R.A. Schilperoort, TIBS août 1985, p. 305-309" pour plus de détail sur la technique de transfert à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. On rappelle que cette technique consiste à
introduire la cassette d'expression concernée dans le plasmide Ti de la bactérie notamment par choc thermique, puis à mettre en contact la bactérie avec des disques de feuilles de la plante, à laisser incuber l'ensemble jusqu'à
obtenir le transfert de la cassette d'expression dans le génome des cellules des disques foliaires, et à cultiver ces disques foliaires sur une succession de milieux jusqu'à
régênération des plantes transgéniques.
WO96/03~ll P~l/rr 7_.1 .J/
On pourra se~rePo~te9r5a5u6Qdocument suivant "J.A. Russell et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 1992, 28P, p. 97-105" pour plus de détail sur la technique de biolistique. On rappelle que cette technique consiste à
fixer le plasmide contenant la cassette d'expression sur des microbilles d'or ou de tungstène, à pro~eter ces microbilles à l'aide d'un canon à particules sur les cellules de la plante à transformer, et à cultiver ces cellules ~usqu'à régénération des plantes transgéniques.
On pourra se reporter au document suivant "Crossway A et Al, 1986, Mol.~Gen. Genet 202, 179-185" pour plus de détail sur la technique de micro-in~ection. On rappelle que cette technique consiste à in~ecter dans des protoplastes ou de très ~eunes embryons le plasmide contenant la cassette d'expression à l'aide de micro-seringues, et à cultiver les protoplastes ~usqu'à
régénération des plantes transgéniques.
Après mise au contact par broyage de la lipase et des lipides, on laisse incuber l'ensemble pour réaliser l'hydrolyse enzymatique. Cette incubation est réalisée dans des conditions classiques, en particulier entre 20~ C et 60~ C, pendant le temps nécessaire à
l'obtention d'une hydrolyse totale ou quasi-totale.
L'extraction des acides gras issus de l'hydrolyse est ensuite opérée par tout procédé connu, en particulier par une extraction liquide/liquide utilisant un solvant apolaire tel que le chloroforme ou l'hexane.
Selon un autre mode de mise en oeuvre, il est possible de réaliser in situ une transformation des acides gras pour obtenir des dérivés d'acides gras qui sont ensuite extraits. Par exemple, les acides gras issus de l'hydrolyse peuvent être méthylés in situ par mise en contact avec du méthanol en catalyse acide sous ultrasons en vue de les transformer en esters~methyliques, ces derniers étant extraits par une extraction liquide/liquide utilisant un solvant apolaire. ~ ~
La présente demande vise, en tant que produit nouveau, toute plante oléagineuse ou semence de WO96103511 , }_I/r. _. ,.~1 5 ~ 1 9 ~ ~ 6 0 plante oléagineùse, d'une variété non protégeable par un certificat d'obtention végétale, qui comprend dans son génome une cassette d'expresslon possédant au moins un gène codant pour une enzyme lipase, associé à un promoteur permettant une expression dudit gène dans des compartiments reS, extracellulaires ou tissulaires différents des compartiments lipidiques de la plante ou de la semence.
Le promoteur associé au gène de lipase peut être un promoteur à expression cellulaire ou tissulaire spécifique. Ce promoteur peut également être un promoteur constitutif, auquel cas le gène de lipase est muni d'une sequence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou extracellulaires différents des compartiments d'accumulation des lipides.
La présente demande vise également toute plante oléagineuse ou semence de plante oléagineuse, d'une variété non protégeable par un certificat d'obtention végétale, qui comprend dans son qénome une cassette d'expression possédant au moins un gène codant pour une enzyme lipase, associé à un promoteur permettant une expression dudit gène sur induction exogène, en particulier par un stress.
La description qui suit en réference au dessin fournit à titre d'exemple un protocole de mise en oeuvre du procédé de l'invention ; la figure 1 du dessin schématise la préparation du matériel génétique à
transférer.
1/ pROTOCOL~ D'OBTENTION DE PLANTES TRANS~ TOUES DE
COT~ EXPRIMANT UN GENE DE LIPASE
a~ Matériel végétal On utilise des graines de colza (Brass~ca napus, Var Tapidor) qui sont obtenues dans le commerce.
Les qraines sont semées en serre et cultivées dans des conditions standard. L'état sanitaire des plantes est rigoureusement surveillé.
- Les ~eunes bourgeons (taille inférieure à 3,5 mm) sont prélevés, stérilisés dans l'hypochlorite de WO96/03511 P~/rl_ ~JI
-?~ ~irF~ 16 2~ 9556~
sodium pendant 30 minutes et Les microspores sont extraites des anthères par broyage au Waring Blendor dans le milieu de Huang et al (Huang et al 1990, Plant. Cell. Rep. 8, 594-597). Après filtration sur un tamis métallique de 50 um de vide de maille, les microspores sont récupérées par centrifugation 5 minutes à 100xg (Protocole décrit dans :
Jardinaud et al., 1993, Plant. Sci. 93, 177-184).
b) Construction génétique - La construction génétique retenue met en oeuvre le promoteur de la napine, le cDNA de la lipase de Rhizopus ni veus et le terminateur NOS. Le promoteur de la napine dirige l'expression de cette protéine dans un compartiment protéique de la graine différent de celui où
s'accumulent les lipides. L'ensemble est introduit dans le plasmide pRT1 contenant le gène de sélection pat utilisé
pour cribler les transformants en vue de former la construction pRT1L.
Le détail de la construction est donné à la figure 1 du dessin.
Le promoteur napine désigné "Prom. Nap" a été isolé par l'équipe du Professeur Rask (Stalberg K. et al, 1993, Plant Molecular Biology, 23 : 671-683). Le cDNA
de la lipase de Rhizopus niveus, désigné "Lip", a été isolé
par le Central Research Institute (Kugimiya et al., 1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716-719). Un codon d'initiation, désigné "start codon", compatible avec l'extrémité 5' du cDNA (disponible sur le marché) est greffé sur cette extrémité. Sur l'extrémité 3' de l'ensemble obtenu, désigné "lip", on greffe un terminateur désigné NOS extrait du plasmide pRT1 ci-après évoqué et, sur l'extrémité 5', le promoteur Nap.
La cassette d'expression ainsi obtenue est introduite dans un plasmide désigné. "Blue-Script" (nom commercial) en vue d'en réaliser:l'amplification.
La cassette d'expression amplifiée est ensuite extraite de "Blue-Script" et introduite d~ns un plasmide désigné pRT1 qui a été préparé en greffant le promoteur désigné CaMV35S sur l'extrémité 5' du gène "pat"
WO 96/03511 ~ rl~
/~ r~ , 17 ~ ~ 9 5 5 6 0 codant pour la phosphinothricine acétyl transférase (gène de sélection) et le terminateur NOS sur l'extrémlté 3'.
On obtient un plasmlde désigné pRT1L
r contenant la cassette d'expression visée.
c) Transfert de gène et production des plantes transgéniques Les microspores isolées en a) (1o6 microspores ml 1) sont mises en suspension dans le - milieu de Brewbaker et Kwack (J.L. Brewbaker et B.H. Kwack, 1963, Am. J. Bot. 50, p. 859-865) contenant 13 ~ de saccharose et a~usté à pH 5,9. 50~g par ml du plasmide pRTlL sont a~outés au milieu et des lmpulsions electriques de 400 V/cm pendant 10 ms sont appliquées à la suspension à l'aide d'un électroporateur "Jouan" (marque déposée) (TRX, GHT) délivrant des impulsions en vague carrée. Après 20 minutes de repos, le milieu de culture (Huang et al.) contenant 100 mg/l de phosphinothricine est ajouté aux microspores. Les microspores sont cultivées à
l'obscurité 24 h à 35~ C puis à 25~ C. Après 2 semaines de culture un volume égal de milieu neuf est a~outé et les microspores placées à la lumière sous photopériode 16 h ~our / 8 h obscurité.
Après environ 1 mois les embryons sont transférés~en milieu Bs (Gamborg et al., 1979, Exp. Cell.
Res. 50, 151-158) contenant G3A3 1 ml/g, 20g/l saccharose et solidifié par 8/l de gélifiant "Bacto Agar" (marque déposée).
Les plantes régénérées rasistantes à la phosphinothricine sont analysées en "southern" de façon à
vérifier la présence dans leur génome de la séquence codant pour la lipase. Le stock chromosomique des plantes retenues est doublé par la colchicine (0,1 g/l plus quelques gouttes de teepol) et les plantes diploïdes fertiles produites sont autofécondées.
--- -- Sur un nombre restreint de graines, on recherche l'activité de la lipase. Les plantes présentant des graines dont l'activité lipase est la plus élevée sont retenues et les graines utilisées pour la multiplication WO96/03511 ~ 18 2 1 9S5~O
des plantes jus~u'à obtention d'un stock de graines suffisant pour réaliser les expérlences d'hydrolyse des lipides de la graine par les lipases endogènes.
OBTENUES
Les ~raines sont broyées, le broyat placé
dans un incubateur malntenu à la température constante de 40~. Le broyat est soumis à une agitation permanente de façon à augmenter le contact entre les lipides et la lipase Après 48 h d'hydrolyse, les acides gras sont extraits par le chloroforme. Le chloroforme est évaporé et les acides~gras récupérés.
. ~ .
.. . .. . . . , .. _ .. . . _ . _ _ _ .
2 1 9 ~ 5 6 0 12~is ~,.
SEOUENCE IY
LOCUS: PSELIPL, 1282 bp ds-DNA BCT 1~/04l97 DEFIl~ITION: Ps~utlnm~n~c sp. Lipl gene for lipase s ACCESSION: D 10166 D 90398 SEOl~i\TcE ~
LOCUS: GC~' 02387, 1635 bp DNA PLN 0?110193 DEEINITION: Geotrichum candidum NRRL Y-5~3 Lipase gene, par~ial cds ACCESSIONT: UO 2387 1 0 SEOUF~1~C~ Yl .
LOCUS: CCLIP1, 1733 bp DNA PLN - 27/04193 DEFII~rITIONT: C. Cylindracea LIP1 gene for lipase /
n~!'ct WO 96/03511 ~ i 9 5 5 6 0 La séquence I correspon~ à un cDNA de ~hizopus niveus, la séquence II peut être isolée à partir du génome de pS~1r,7. -777;7C aeruginosa, la séquence III à
partir de Pse~ S fluorescens, la séquence IV à partir de Pse~ sp, la séquence V à partir de Geotrichum candidum, la sequence VI à partir de Candida cylindracea.
Par ailleurs, l'introduction de la cassette d'expression : gène de lipase/promoteur d'expression de ce gène, dans le génome de la plante oléagineuse peut être réalisée par tout protocole connu.
Par exemple, selon le protocole le plus courant actuellement, cette cassette d'expression peut être introduite dans le génome de cellules somatiques de la plante par un transfert à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaclens. Cette introduction dans lesdltes cellules somatiques de la plante peut également être réalisée par ~une autre technique connue, notamment par électroporation, par biolistique ou par microinjection.
Il est également possible d'introduire la cassette d'expression dans le génome de microspores de la plante par électroporation ou biolistique.
Dans le protocole fourni plus loin à titre d'exemple, on a décrit la technique d'électroporation pour l'introduction de la cassette dans les microspores du colza.
On pourra se reporter au document suivant "P.J.J. Hooykaas et R.A. Schilperoort, TIBS août 1985, p. 305-309" pour plus de détail sur la technique de transfert à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. On rappelle que cette technique consiste à
introduire la cassette d'expression concernée dans le plasmide Ti de la bactérie notamment par choc thermique, puis à mettre en contact la bactérie avec des disques de feuilles de la plante, à laisser incuber l'ensemble jusqu'à
obtenir le transfert de la cassette d'expression dans le génome des cellules des disques foliaires, et à cultiver ces disques foliaires sur une succession de milieux jusqu'à
régênération des plantes transgéniques.
WO96/03~ll P~l/rr 7_.1 .J/
On pourra se~rePo~te9r5a5u6Qdocument suivant "J.A. Russell et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 1992, 28P, p. 97-105" pour plus de détail sur la technique de biolistique. On rappelle que cette technique consiste à
fixer le plasmide contenant la cassette d'expression sur des microbilles d'or ou de tungstène, à pro~eter ces microbilles à l'aide d'un canon à particules sur les cellules de la plante à transformer, et à cultiver ces cellules ~usqu'à régénération des plantes transgéniques.
On pourra se reporter au document suivant "Crossway A et Al, 1986, Mol.~Gen. Genet 202, 179-185" pour plus de détail sur la technique de micro-in~ection. On rappelle que cette technique consiste à in~ecter dans des protoplastes ou de très ~eunes embryons le plasmide contenant la cassette d'expression à l'aide de micro-seringues, et à cultiver les protoplastes ~usqu'à
régénération des plantes transgéniques.
Après mise au contact par broyage de la lipase et des lipides, on laisse incuber l'ensemble pour réaliser l'hydrolyse enzymatique. Cette incubation est réalisée dans des conditions classiques, en particulier entre 20~ C et 60~ C, pendant le temps nécessaire à
l'obtention d'une hydrolyse totale ou quasi-totale.
L'extraction des acides gras issus de l'hydrolyse est ensuite opérée par tout procédé connu, en particulier par une extraction liquide/liquide utilisant un solvant apolaire tel que le chloroforme ou l'hexane.
Selon un autre mode de mise en oeuvre, il est possible de réaliser in situ une transformation des acides gras pour obtenir des dérivés d'acides gras qui sont ensuite extraits. Par exemple, les acides gras issus de l'hydrolyse peuvent être méthylés in situ par mise en contact avec du méthanol en catalyse acide sous ultrasons en vue de les transformer en esters~methyliques, ces derniers étant extraits par une extraction liquide/liquide utilisant un solvant apolaire. ~ ~
La présente demande vise, en tant que produit nouveau, toute plante oléagineuse ou semence de WO96103511 , }_I/r. _. ,.~1 5 ~ 1 9 ~ ~ 6 0 plante oléagineùse, d'une variété non protégeable par un certificat d'obtention végétale, qui comprend dans son génome une cassette d'expresslon possédant au moins un gène codant pour une enzyme lipase, associé à un promoteur permettant une expression dudit gène dans des compartiments reS, extracellulaires ou tissulaires différents des compartiments lipidiques de la plante ou de la semence.
Le promoteur associé au gène de lipase peut être un promoteur à expression cellulaire ou tissulaire spécifique. Ce promoteur peut également être un promoteur constitutif, auquel cas le gène de lipase est muni d'une sequence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou extracellulaires différents des compartiments d'accumulation des lipides.
La présente demande vise également toute plante oléagineuse ou semence de plante oléagineuse, d'une variété non protégeable par un certificat d'obtention végétale, qui comprend dans son qénome une cassette d'expression possédant au moins un gène codant pour une enzyme lipase, associé à un promoteur permettant une expression dudit gène sur induction exogène, en particulier par un stress.
La description qui suit en réference au dessin fournit à titre d'exemple un protocole de mise en oeuvre du procédé de l'invention ; la figure 1 du dessin schématise la préparation du matériel génétique à
transférer.
1/ pROTOCOL~ D'OBTENTION DE PLANTES TRANS~ TOUES DE
COT~ EXPRIMANT UN GENE DE LIPASE
a~ Matériel végétal On utilise des graines de colza (Brass~ca napus, Var Tapidor) qui sont obtenues dans le commerce.
Les qraines sont semées en serre et cultivées dans des conditions standard. L'état sanitaire des plantes est rigoureusement surveillé.
- Les ~eunes bourgeons (taille inférieure à 3,5 mm) sont prélevés, stérilisés dans l'hypochlorite de WO96/03511 P~/rl_ ~JI
-?~ ~irF~ 16 2~ 9556~
sodium pendant 30 minutes et Les microspores sont extraites des anthères par broyage au Waring Blendor dans le milieu de Huang et al (Huang et al 1990, Plant. Cell. Rep. 8, 594-597). Après filtration sur un tamis métallique de 50 um de vide de maille, les microspores sont récupérées par centrifugation 5 minutes à 100xg (Protocole décrit dans :
Jardinaud et al., 1993, Plant. Sci. 93, 177-184).
b) Construction génétique - La construction génétique retenue met en oeuvre le promoteur de la napine, le cDNA de la lipase de Rhizopus ni veus et le terminateur NOS. Le promoteur de la napine dirige l'expression de cette protéine dans un compartiment protéique de la graine différent de celui où
s'accumulent les lipides. L'ensemble est introduit dans le plasmide pRT1 contenant le gène de sélection pat utilisé
pour cribler les transformants en vue de former la construction pRT1L.
Le détail de la construction est donné à la figure 1 du dessin.
Le promoteur napine désigné "Prom. Nap" a été isolé par l'équipe du Professeur Rask (Stalberg K. et al, 1993, Plant Molecular Biology, 23 : 671-683). Le cDNA
de la lipase de Rhizopus niveus, désigné "Lip", a été isolé
par le Central Research Institute (Kugimiya et al., 1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716-719). Un codon d'initiation, désigné "start codon", compatible avec l'extrémité 5' du cDNA (disponible sur le marché) est greffé sur cette extrémité. Sur l'extrémité 3' de l'ensemble obtenu, désigné "lip", on greffe un terminateur désigné NOS extrait du plasmide pRT1 ci-après évoqué et, sur l'extrémité 5', le promoteur Nap.
La cassette d'expression ainsi obtenue est introduite dans un plasmide désigné. "Blue-Script" (nom commercial) en vue d'en réaliser:l'amplification.
La cassette d'expression amplifiée est ensuite extraite de "Blue-Script" et introduite d~ns un plasmide désigné pRT1 qui a été préparé en greffant le promoteur désigné CaMV35S sur l'extrémité 5' du gène "pat"
WO 96/03511 ~ rl~
/~ r~ , 17 ~ ~ 9 5 5 6 0 codant pour la phosphinothricine acétyl transférase (gène de sélection) et le terminateur NOS sur l'extrémlté 3'.
On obtient un plasmlde désigné pRT1L
r contenant la cassette d'expression visée.
c) Transfert de gène et production des plantes transgéniques Les microspores isolées en a) (1o6 microspores ml 1) sont mises en suspension dans le - milieu de Brewbaker et Kwack (J.L. Brewbaker et B.H. Kwack, 1963, Am. J. Bot. 50, p. 859-865) contenant 13 ~ de saccharose et a~usté à pH 5,9. 50~g par ml du plasmide pRTlL sont a~outés au milieu et des lmpulsions electriques de 400 V/cm pendant 10 ms sont appliquées à la suspension à l'aide d'un électroporateur "Jouan" (marque déposée) (TRX, GHT) délivrant des impulsions en vague carrée. Après 20 minutes de repos, le milieu de culture (Huang et al.) contenant 100 mg/l de phosphinothricine est ajouté aux microspores. Les microspores sont cultivées à
l'obscurité 24 h à 35~ C puis à 25~ C. Après 2 semaines de culture un volume égal de milieu neuf est a~outé et les microspores placées à la lumière sous photopériode 16 h ~our / 8 h obscurité.
Après environ 1 mois les embryons sont transférés~en milieu Bs (Gamborg et al., 1979, Exp. Cell.
Res. 50, 151-158) contenant G3A3 1 ml/g, 20g/l saccharose et solidifié par 8/l de gélifiant "Bacto Agar" (marque déposée).
Les plantes régénérées rasistantes à la phosphinothricine sont analysées en "southern" de façon à
vérifier la présence dans leur génome de la séquence codant pour la lipase. Le stock chromosomique des plantes retenues est doublé par la colchicine (0,1 g/l plus quelques gouttes de teepol) et les plantes diploïdes fertiles produites sont autofécondées.
--- -- Sur un nombre restreint de graines, on recherche l'activité de la lipase. Les plantes présentant des graines dont l'activité lipase est la plus élevée sont retenues et les graines utilisées pour la multiplication WO96/03511 ~ 18 2 1 9S5~O
des plantes jus~u'à obtention d'un stock de graines suffisant pour réaliser les expérlences d'hydrolyse des lipides de la graine par les lipases endogènes.
OBTENUES
Les ~raines sont broyées, le broyat placé
dans un incubateur malntenu à la température constante de 40~. Le broyat est soumis à une agitation permanente de façon à augmenter le contact entre les lipides et la lipase Après 48 h d'hydrolyse, les acides gras sont extraits par le chloroforme. Le chloroforme est évaporé et les acides~gras récupérés.
Claims (18)
1/ - Procédé de production d'acides gras ou de dérivés d'acides gras à partir de plantes oléagineuses, caractérisé en ce que :
- on produit des plantes oléagineuses transgéniques possédant, d'une part, au moins un gène codant pour une enzyme lipase, dit gène de lipase, d'autre part, associé à ce gène de lipase, un promoteur permettant une expression dudit gène soit dans des compartiments cellulaires, extracellulaires ou tissulaires différents de ceux où s'accumulent les lipides de la plante, soit sur induction exogène, - on recueille les graines ou fruits contenant les lipides desdites plantes, - on broie ledites graines ou fruits, le cas échéant après traitement inducteur, de façon à mettre en contact les lipides et la lipase contenue dans lesdites graines ou fruits, - on laisse incuber l'ensemble pour engendrer une hydrolyse enzymatique des lipides du broyat sous l'action catalytique de la lipase contenue dans ledit broyat, - on extrait les acides gras issus de l'hydrolyse ou on les transforme pour obtenir les dérivés d'acides gras recherchés.
- on produit des plantes oléagineuses transgéniques possédant, d'une part, au moins un gène codant pour une enzyme lipase, dit gène de lipase, d'autre part, associé à ce gène de lipase, un promoteur permettant une expression dudit gène soit dans des compartiments cellulaires, extracellulaires ou tissulaires différents de ceux où s'accumulent les lipides de la plante, soit sur induction exogène, - on recueille les graines ou fruits contenant les lipides desdites plantes, - on broie ledites graines ou fruits, le cas échéant après traitement inducteur, de façon à mettre en contact les lipides et la lipase contenue dans lesdites graines ou fruits, - on laisse incuber l'ensemble pour engendrer une hydrolyse enzymatique des lipides du broyat sous l'action catalytique de la lipase contenue dans ledit broyat, - on extrait les acides gras issus de l'hydrolyse ou on les transforme pour obtenir les dérivés d'acides gras recherchés.
2/ - Procédé selon la revendication 1, dans lequel on produit les plantes transgéniques en effectuant une transformation génétique d'une plante oléagineuse naturelle, en amenant la plante génétiquement transformée à
se multiplier par la voie sexuée pour la production de semences transgéniques et en utilisant lesdites semences pour l'obtention de plantes transgéniques descendantes.
se multiplier par la voie sexuée pour la production de semences transgéniques et en utilisant lesdites semences pour l'obtention de plantes transgéniques descendantes.
3/ - Procédé selon la revendication 2 pour la production d'acides gras à partir de plantes oléoprotéagineuses, caractérisé en ce que :
- la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlant l'expression d'une protéine déterminée de la graine, et en introduisant cette cassette d'expression dans le génome de la plante de façon à faire exprimer la lipase dans les compartiments de la graine où s'accumulent la protéine précitée, - la mise en contact des lipides et de la lipase est effectuée par simple broyage. _
- la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlant l'expression d'une protéine déterminée de la graine, et en introduisant cette cassette d'expression dans le génome de la plante de façon à faire exprimer la lipase dans les compartiments de la graine où s'accumulent la protéine précitée, - la mise en contact des lipides et de la lipase est effectuée par simple broyage. _
4/ - Procédé selon la revendication 3 pour la production d'acides gras à partir de colza, caractérisé
en ce que la transformation génétique est effectuée à
partir d'une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et le promoteur de la napine.
en ce que la transformation génétique est effectuée à
partir d'une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et le promoteur de la napine.
5/ - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que :
. la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlable de façon exogène, et en introduisant cette cassette d'expression dans le génome de la plante, un traitement inducteur est appliqué aux graines et fruits avant broyage de façon à provoquer la synthèse de la lipase.
. la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlable de façon exogène, et en introduisant cette cassette d'expression dans le génome de la plante, un traitement inducteur est appliqué aux graines et fruits avant broyage de façon à provoquer la synthèse de la lipase.
6/ - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que :
. la transformation génétique est effectuée à partir d'une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur de stress, . le traitement inducteur est constitué par un traumatisme physique appliqué sur les graines ou fruits avant le broyage.
. la transformation génétique est effectuée à partir d'une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur de stress, . le traitement inducteur est constitué par un traumatisme physique appliqué sur les graines ou fruits avant le broyage.
7/ - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que :
. la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un promoteur constitutif et un gène de lipase muni d'une séquence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou extracellulaires différents de ceux où
s'accumulent les lipides, la mise en contact des lipides et de la lipase est effectuée par simple broyage.
. la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un promoteur constitutif et un gène de lipase muni d'une séquence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou extracellulaires différents de ceux où
s'accumulent les lipides, la mise en contact des lipides et de la lipase est effectuée par simple broyage.
- 8/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on produit des plantes transgéniques possédant un gène de lipase caractérisée par une activité hydrolytique non spécifique.
9/ - Procédé selon la revendication 8, caractérise en ce qu'on produit des piantes transgéniques possédant un gène de lipase caractérisé par une séquence identique ou analogue à l'une des séquences suivantes (les flèches délimitent la partie codante) :
SEQUENCE I
1 'GATGACAACT TGGTTGGTGG CATGACTTTG GACTTACCCA GCGATGCTCC
SEQUENCE II.
SEQUENCE III
51 TTCGCTTTCT CTACAAATCC AACAACAGAG AGGCACTACC~ATGGGTATCT
~
SEQUENCE IV
~
SEQUENCE V
SEQUENCE VI
SEQUENCE I
1 'GATGACAACT TGGTTGGTGG CATGACTTTG GACTTACCCA GCGATGCTCC
SEQUENCE II.
SEQUENCE III
51 TTCGCTTTCT CTACAAATCC AACAACAGAG AGGCACTACC~ATGGGTATCT
~
SEQUENCE IV
~
SEQUENCE V
SEQUENCE VI
10/ - Procédé selon la revendication 2, dans lequel la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant le gène de lipase et le promoteur associé, et en introduisant cette cassette d'expression dans le génome de cellules somatiques de la plante par un transfert à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, ou par électroporation, ou par biolistique, ou par microinjection.
11/ - Procédé selon la revendication 2, dans lequel la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant le gène de lipase et le promoteur associé, et en introduisant cette cassette d'expression dans le génome de microspores de la plante par électroporation ou biolistique.
12/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel l'incubation pour engendrer l'hydrolyse enzymatique est réalisée à une température comprise entre 20° C et 60° C.
13/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel l'extraction des acides gras issus de l'hydrolyse est réalisée par une extraction liquide/liquide utilisant un solvant apolaire.
14/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel les acides gras issus de l'hydrolyse sont méthylés in situ par mise en contact avec du méthanol en catalyse acide sous ultrasons en vue de les transformer en esters méthyliques, ces derniers étant extraits par une extraction liquide/liquide utilisant un solvant apolaire.
15/ - Plante ou semence de plante d'une variété non protégeable par un certificat d'obtention végétale, comprenant dans son génome une cassette d'expression possédant au moins un gène codant pour une enzyme, associé à un promoteur permettant une expression dudit gène dans des compartiments cellulaires, extracellulaires ou tissulaires, caractérisée en ce que :
~ la plante ou la semence de plante est de type oléagineux capable de produire des lipides dans des compartiments spécifiques dits compartiments lipidiques, . le gène codant est un gène codant pour une enzyme lipase capable d'hydrolyser les lipides, . le promoteur associé audit gène est du type permettant une expression dudit gène dans des compartiments différents des compartiments lipidiques de la plante ou de la semence en vue d'éviter le contact entre lipides et lipases produits par la plante.
~ la plante ou la semence de plante est de type oléagineux capable de produire des lipides dans des compartiments spécifiques dits compartiments lipidiques, . le gène codant est un gène codant pour une enzyme lipase capable d'hydrolyser les lipides, . le promoteur associé audit gène est du type permettant une expression dudit gène dans des compartiments différents des compartiments lipidiques de la plante ou de la semence en vue d'éviter le contact entre lipides et lipases produits par la plante.
16/ - Plante ou semence selon la revendication 15, dans laquelle le promoteur associé au gène de lipase est un promoteur à expression cellulaire ou tissulaire spécifique
17/ - Plante ou semence selon la revendication 15, dans laquelle le gène de lipase est muni d'une séquence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou extracellulaires différents des compartiments d'accumulation des lipides, le promoteur étant un promoteur constitutif.
18/ - Plante ou semence de plante d'une variété non protégeable par un certificat d'obtention végétale, comprenant dans son génome une cassette d'expression possédant au moins un gène codant pour une enzyme associé à un promoteur permettant une expression dudit gène, caractérisée en ce que :
. la plante ou la semence de plante est de type oléagineux capable de produire des lipides dans des compartiments spécifiques dits compartiments lipidiques, . le gène codant est un gène codant pour une enzyme lipase capable d'hydrolyser les lipides, . le promoteur associé audit gène est du type à induction exogène, capable de commander la production de lipase sous l'action d'un signal exogène.
. la plante ou la semence de plante est de type oléagineux capable de produire des lipides dans des compartiments spécifiques dits compartiments lipidiques, . le gène codant est un gène codant pour une enzyme lipase capable d'hydrolyser les lipides, . le promoteur associé audit gène est du type à induction exogène, capable de commander la production de lipase sous l'action d'un signal exogène.
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