BRPI1014525B1

BRPI1014525B1 - Variante de um polipeptídeo precursor, composição farmacêutica e, uso de uma variante

Info

Publication number: BRPI1014525B1
Application number: BRPI1014525-7A
Authority: BR
Inventors: Abdelhakim Kharrat; Khalil Bouayadi; Philippe Mondon; Céline Monnet-Mars; Christian Behrens; Sylvie Jorieux
Original assignee: Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2021-11-23
Also published as: DK2805969T3; IL245050A0; EP2408813A2; JP2016014020A; KR20160105547A; EP3674318A1; JP5770710B2; IL215041A0; JP5951856B2; AU2010224800B2; US8742074B2; EP2805969A3; CA2755905C; CA2995516A1; EP3395831B1; KR20160145850A; EP2805969B1; BR122021019353B1; AU2010224800A1; JP2012524522A

Abstract

variante de um polipetídeo precursor, composição farmacêutica, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira método para produzir uma variante medicamentos, uso de uma variante. a invenção diz respeito a uma variante de um poliptídeo precursor que compreende uma região fc,cuja variante apresenta a ligação aumentada a fcrn em comparação com o dito poliptídeo precursor e compreende pelo menos uma modificação de aminoácido na região fc.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção diz respeito a uma variante de um polipeptídeo precursor que compreende uma região Fc. A dita variante apresenta ligação aumentada a FcRn em comparação com o polipeptídeo precursor e compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em sua região Fc.

Descrição da Técnica Relacionada

[002] Os anticorpos monoclonais são usados como terapêuticos, para tratar uma variedade de condições que incluem câncer, doenças autoimunes, doenças inflamatórias crônicas, rejeição a transplante, doenças infecciosas e doenças cardiovasculares. Correntemente, existem mais de vinte anticorpos monoclonais ou produtos de fragmento de anticorpos monoclonais aprovados no mercado e mais do que quatro centenas em desenvolvimento clínico. A despeito de tal aceitação e compromisso, existe necessidade significante para a otimização das propriedades estruturais e funcionais dos anticorpos.

[003] Um dos problemas críticos no uso de anticorpos monoclonais na terapia é a sua persistência na circulação sanguínea. A taxa de liberação de anticorpo afeta diretamente a eficácia na terapia e, consequentemente, a frequência e a quantidade de administração de medicamento que pode causar os efeitos adversos no paciente e também aumenta os custos médicos.

[004] O IgG é a classe de imunoglobulina mais prevalecente em seres humanos e também a mais utilizada em produtos terapêuticos. O mecanismo da homeostase de IgG foi elucidado através de estudos relacionados com a transferência de imunidade passiva da mãe para o feto ou neonato em roedores (Brambell, 1966, Lancet; 2(7473):1087-93.; Rodewald, 1976, J Cell Biol.;71(2):666-9; fones et al, 1972, J Clin Invest., 51(11):2916- 27). Em estudos recentes, Brambell postulou que houve um receptor para a transmissão matemofetal de IgG e que o mecanismo envolvido na transferência matemofetal de IgG e o catabolismo de IgG pode ser o mesmo ou, pelo menos, muito proximamente relacionado (Brambell, 1966, Lancet; 2(7473):1087-93).

[005] Observou-se que o transporte de IgG dentro e através das células polarizadas é mediado pela ligação da região de Fc a um receptor de Fc de afinidade alta, denominado receptor F neonatal (FcRn). O FcRn é um heterodímero que compreende uma cadeia a de transmembrana com homologia estrutural aos domínios extracelulares da cadeia a das moléculas de classe I de complexo de histocompatibilidade principal e uma cadeia leve solúvel que consiste de rmicroglobulin (2m) (Simister and Mostov, 1989, Cold Spring Harb Symp Quant Biol.:54 Pt 1:571-80). Em seres humanos, o FcRn é expressado em células placentais, em células epiteliais intestinais, renais e bronquiais, nas células endoteliais e em células hematopoéticas, tais como macrófagos intestinais pequenos, monócitos e células dendríticas derivadas de monócito (Zhu X et al, 2001, J Immunol.; 166:3266-76). O FcRn liga seus dois ligandos principais, IgG e albumina de soro, de uma maneira dependente de pH, com ligação eficiente em pH 6,0 a 6,5 e liberação em pH 7,0 a 7,5 (Raghavan et al., 1995, Biochemistry., 34:14649-57).

[006] O mecanismo proposto para a proteção de IgG a partir do catabolismo é que os IgGs são intemalizados pela pinocitose não específica nos endossomas das células endoteliais onde o pH baixo promove a ligação a FcRn (Ghetie and Ward, 1997, Nat. Biotechnol.,15: 637-40). Os complexos de IgG-FcRn ligados são reciclados de volta à superficie celular e dissociam no pH neutro do fluido extracelular, retomando à circulação no sangue. Os IgGs que não se ligam ao tráfego de FcRn nos lisossomas quando estes são degradados por proteases. De acordo com o mecanismo de catabolismo dependente de concentração para a sobrevivência do IgG, em concentrações de IgG de soro baixas, o receptor deve ligar-se a todos os IgG submetidos à endocitose e etoma eficazmente à circulação, produzindo uma vida média de IgG longa. Contrariamente, em concentrações de IgG altas o receptor é saturado por IgG e uma fração principal do IgG não é ligado pelo receptor e tráfegos a serem degradados, produzindo um catabolismo mais rápido do IgG não ligado.

[007] Vários experimentos de mutagênese específicos de local na região Fc de IgGs de camundongo levaram à identificação de certos resíduos de aminoácidos críticos na interação entre IgG e FcRn (Kim et al., 1994, Eur J Immunol.;24:2429-34; Kim et al.,1994, Eur J Immunol; 24:542-8; Medesan etal., 1996, Eur J Immunol.;26:2533-6; Medesan et al., 1997, J Immunol.;158: 22117). Estes estudos e estudos de comparação de sequência observaram que a isoleucina na posição 253, histidina na posição 310 e histidina na posição 435 (de acordo com a numeração de Kabat, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5° Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), são altamente conservados em IgGs humanos e de roedores, sugerindo sua importância na ligação de IgG-FcRn. Estes resíduos de aminoácido estão localizados na interface dos omínios CH2-CH3 e o mapeamento do local funcional a estes resíduos é consistente com a estrutura cristalográfica em raio X de FcRn de rato complexado com Fc de rato (Burmeister et al., 1994, Nature; 372(6504):379-83).

[008] Ghetie et al. (1997, Nat. Biotechnol; 15:637-40) posição 252, posição 254 e posição 256 aleatoriamente mutageniozadas em um fragmento de junta Fc de IgGl de camundongo. Um mutante mostrou uma afinidade de três vezes e meia mais alta para FcRn de camundongo e uma vida média de cerca de 23 % ou 65 % mais longas em duas cepas de camundongos, respectivamente, em comparação com aquela do tipo selvagem.

[009] Kim et al. (1999, Eur J Immunol; 29:2819-25) IgGl humano mutagenizado por substituições de aminoácido na posição 253, posição 310 ou posição 435 da região Fc. Estes observaram que os fragmentos de junta de Fc mutante reduziram as vidas médias de soro em camundongos em comparação com os camundongos em comparação com o fragmento de junta de Fc de lgG1 do tipo selvagem e concluiu que Ile253, His31O e His435 desempenham um papel central na regulação da vida média do soro de lgG.

[010] Homick et al. (2000, J Nucl Med., 41:355-62) mostrou que uma substituição de aminoácido simples na posição 253 na região Fc de um anticorpo de lgG1 humano quimérico acelera a liberação em camundongos e melhora a imunoscintigrafia de tumores sólidos.

[011] Shields et al. (2001, J Biol Chem; 276:6591-604) usaram a mutagênese de varredura de alanina para alterar os resíduos na região Fc de um anticorpo de lgGl humano e então estimada a ligação ao FcRn humano. As posições que anulam eficazmente a ligação a FcRn quando mudado para alanina incluem 1253, S254, H435 e Y436. Outras posições mostraram uma redução menos pronunciada na ligação como segue: E233-G236, R255, K288, L309, S415 e H433. Diversas posições de aminoácido apresentaram uma melhora na ligação de FcRn quando mudado a alanina; notáveis entre estes são P238, T256, E272, V305, T307, Q311, D312, K317, D376, E380, E382, S424 e N434. Muitas outras posições de aminoácido apresentaram uma melhora leve (D265, N286, V303, K360, Q362 e A378) ou nenhuma mudança (S239, K246, K248, D249, M252, E258, T260, S267, H268, S269, D270, K274, N276, Y278, D280, V282, E283, H285, T289, K290, R292, E293, E294, Q295, Y296, N297, S298, R301, N315, E318, K320, K322, S324, K326, A327, P329, P331, E333, K334, T335, S337, K338, K340, Q342, R344, E345, Q345, Q347, R356, M358, T359, K360, N361, Y373, S375, S383, N384, Q386, E388, N389, N390, K392, L398, S400, D401, K414, R416, Q418, Q419, N421, V422, E430, T437, K439, S440, S442, S444 e K447) na ligação de FcRn.

[012] A aditividade mais pronunciada foi observada para a combinação de variantes com ligação melhorada a FcRn. Em pH 6,0, a variante E380A/N434A mostrou ligação mais de 8 vezes melhor a FcRn, com relação ao IgGl natural, em comparação com 2 vezes para E380A e 3,5 vezes para N434A. A adição de T307A a este afetou uma melhora de 12 vezes na ligação com relação ao IgG1 natural.

[013] Dall'Acqua et al. (2002, J Immunol.;169:5171-80) descreveram a mutagênese aleatória e avaliação de bibliotecas de apresentação de fago de fragmento de Fc de junta de IgGl humano contra FcRn de camundongo. Estes descreveram a mutagênese aleatória de posições 251, 252, 254-256, 308, 309, 311, 312, 314, 385-387, 389, 428, 433, 434 e 436. As melhoras principais na estabilidade do complexo de FcRn humano de IgG1 ocorre na substituição dos resíduos localizados em uma faia através da interface de Fc-FcRn (M252, S254, T256, H433, N434 e Y436) e em uma extensão menor, as substituições dos resíduos na periferia como V308, L309, Q311, G385, Q386, P387 e N389. A variante com a afinidade mais alta ao FcRn humano foi obtida pela combinação das mutações M252Y/S254T/T256E e H433K/N434FN436H e apresentaram um aumento de 57 vezes na afinidade com relação ao IgG1 do tipo selvagem.

[014] Hinton et al. (2004, J Biol Chem.;279:6213-6) descreveram duas mutações, T250Q e M428L, que aumentaram a ligação de IgG2 humano a FcRn humano por certa de 3 e 7 vezes, respectivamente. Em combinação, estas duas mutações induziram uma capacidade de ligação aumentada 28 vezes de IgG2. Injetada a macacos resos para estudos farmacocinéticos, ambas as mutações IgG2, M428L e T250Q/M428L, apresentaram vidas médias de cerca de 2 vezes mais longas do que o anticorpo do tipo selvagem.

[015] Dall'Acqua et al. (2006, J. Biol. Chem.;281:23514-24) descreveram um IgG1 de vírus sincicial anti-respiratório humanizado cuja região Fc foi mutada na posição 252, 254 e 256 (M252Y/S254T/T256E). Estas mutações aumentam a ligação ao FcRn humano por cerca de 1O vezes em pH 6,0 enquanto permite-se a liberação eficiente em pH 7,4 (Dall'Acqua et al., 2002, J Immunol.;169:5171-80). O comportamento in vivo de um tal IgG1 humano mutado apresentaram um aumento de quase 4 vezes na vida média do soro em macaco cinomolgo em comparação com o IgGl do tipo selvagem.

[016] Adicionalmente, várias publicações descrevem métodos para obter moléculas fisiologicamente ativas cujas vidas médias são modificadas pela introdução de um polipeptídeo de ligação de FcRn nas moléculas (WO 97/43316; Patente U. S. N° 5,869,046; Patente U. S. N° 5,747,035; WO 96/32478; WO 91/14438) ou pela fusão das moléculas com os anticorpos cujas afinidades de ligação de FcRn são preservados mas as afinidades para outros receptores de Fc foram grandemente reduzidas (WO 99/43713) ou fusão com domínios de ligação de FcRn de anticorpos (WO 00/09560; Patente U. S. N° 4,703,039).

[017] A Patente U. S. N° 6,165,745 descreve um método de produzir um anticorpo com uma vida média biológica diminuída pela introdução de uma mutação no segmento de DNA que codifica o anticorpo. A mutação inclui uma substituição de aminoácido na posição 253, 310, 311, 433 ou 434 do domínio de junta Fc. A descrição total da Patente U. S. N° 6,165,745, bem como a descrição total de outras referências de patente U. S. Citadas neste, são, desse modo, incorporadas por referência.

[018] A publicação PCT N° WO 00/42072 descreve um polipeptídeo que compreende uma região variante de Fce com afinidade de ligação de FcRn alterada, cujo polipeptídeo compreende uma modificação de aminoácido em qualquer um ou mais de posições de aminoácido 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340,356,360,362,376,378,380,386,388,400,413,415,424,433,434,435,436,439 e 447 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU (Kabat et al., op. cit.).

[019] A Publicação PCT N° WO 02/060919 A2 descreve um IgG modificado que compreende um domínio constante de IgG que compreende uma ou mais modificações de aminoácido com relação a um domínio constante de IgG do tipo selvagem, em que o IgG modificado tem uma vida média aumentada em comparação com a vida média de um IgG tendo o domínio constante de IgG do tipo selvagem e em que a uma ou mais modificações de estão, em uma ou mais das posições 251,253,255, 285-290, 308-314, 385-389 e 428-435.

[020] Ainda existe uma necessidade na técnica quanto a novas variantes FC otimizadas.

Sumário da Invenção

[021] A presente invenção fornece uma variante de um polipeptídeo precursor com propriedades otimizadas. As propriedades otimizadas compreendem propriedade de ligação mais alta a FcRn do que ao polipeptídeo precursor correspondente. Em uma forma de realização preferida, a dita variante de um polipeptídeo precursor compreende uma região Fc, apresenta ligação aumentada a FcRn em comparação com o dito polipeptídeo precursor e compreende pelo menos uma modificação de aminoácido na região Fc do dito polipeptídeo precursor, em que a dita modificação é selecionada do grupo que consiste de 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252,256,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355, 356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389, 390,392,393,394,395,396,397,398,399,400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422,424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 e 447 da região Fcnem comparação com o dito polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[022] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende a variante da invenção.

[023] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um ácido nucleico isolado que codifica a variante da invenção.

[024] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um vetor que compreende o ácido nucleico descrito acima.

[025] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece uma célula hospedeira contendo um vetor descrito acima.

[026] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um método para produzir uma variante de polipeptídeo que compreende cultivar a célula hospedeira descrito acima de modo que o ácido nucleico é expressado.

[027] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um medicamento que compreende uma variante da invenção.

[028] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece o uso de uma variante da invenção para a fabricação de um medicamento.

[029] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um método para identificar variantes otimizadas por Fc. Breve descrição dos desenhos

[030] A Figura 1 mostra o vetor de fagomida pMG58 em que os resíduos de aminoácido que codificam o gene Fc humano 226-447 (índice EU como em Kabat) derivados de uma cadeia pesada de lgGl humana (Fc226, SEQ n°l) foram clonados.

[031] CVDE: parte de terminal C da endonuclease derivada de VMAl, VMA: subunidade de ATPase vacuolar (VMA), CPIII: parte de terminal C da proteína de capsídeo plll (ou p3) do fago M13.

[032] A Figura 2 mostra os métodos usados para a seleção de variantes Fc na fase sólida (2A) e na solução (2B). FcRn-biot refere-se a FcRn biotinilado e FcRn-p3 refere-se à proteína de fusão de FcRn-p3. O Fc-fago é bacteriofago M13 que expressa uma variante Fc em seu capsídeo. Na seleção de fase sólida, os reservatórios de imunoplacas são revestidos com proteína de fusão de FcRn-p3 (Fc-Rn-p3) ou com neutravidina seguido por FcRn-biot.

[033] A Figura 3 mostra o princípio de ensaio de fago-ELISA realizado em variantes Fc selecionadas. O Fc-fago é um bacteriofago M13 que expressa uma variante Fc em seu capsídeo. O FcRn-p3 é a proteína de fusão de FcRn-p3 revestida em reservatórios de imunoplacas. Anti-M13 refere-se a anticorpo anti-M13 de camundongo fundido a peroxidase de Horseradish (HRP) usado para a detecção de ELISA.

[034] A Figura 4 mostra um histograma que representa para cada posição de aminoácido de Fc IgG1, a porcentagem de mutantes que compreende uma modificação na dita posição. Coordenada X: número de aminoácido de acordo com índice EU como em Kabat da posição mutada. Coordenada Y: porcentagem de variantes Fe contendo a posição mutada.

[035] A Figura 5a mostra o princípio de ensaio de ELISA dedicada à medida da afinidade de ligação de variante Fc para FcRn. O FcRn-p3 é uma proteína de fusão de FcRn-p3 revestida nos reservatórios de imunoplacas. Fc é uma variante de Fe que compreende V5 tag para a detecção de ELISA. O Anti- V5 é um anticorpo anti-VS fundido a HRP. O anticorpo é usado para a detecção de ELISA.

[036] A Figura 5b mostra a curva de dose-efeito para Fc do tipo selvagem (séries) e variante Fc-H (quadrados) obtidos por ensaio ELISA realizado como descrito no Exemplo 1 em IV.1.a. coordenada X: Concentração do polipeptídeo Fc. coordenada Y: porcentagem de FcRn ligado ao polipeptídeo Fc.

[037] A Figura Se mostra as curvas de dose-efeito para o Fc do tipo selvagem (séries) e variante S3A_07 (quadrados) obtido pelo ensaio de ELISA realizado como descrito no Exemplo 1 em IV.1.a. coordenada X: Concentração do polipeptídeo Fc. coordenada Y: porcentagem de FcRn ligado ao polipeptídeo Fc.

[038] A Figura 5d mostra as curvas de dose-efeito para o Fc do tipo selvagem (séries) e variante S5A_41 (quadrados) obtido pelo ensaio de ELISA realizado como descrito no Exemplo 1 em IV.La. coordenada X: Concentração do polipeptídeo Fc. coordenada Y: porcentagem de FcRn ligado ao polipeptídeo Fc.

[039] A Figura 6 mostra alinhamentos de sequências de IgG1 humanos naturais que referem-se às posições 216-447 (de acordo com índice EU em Kabat) com as sequências correspondentes de IgG2 humano (SEQ ID N°: 14), IgG3 humano (SEQ ID N°: 15) e IgG4 humano (SEQ ID N°: 16). As sequências de IgG1 referem-se a alotipo G1ml,17 (SEQ ID N°: 12) e ao alotipo Glm3 (SEQ ID N°: 13). O domínio "junta-CH2-CH3 inferior" do IgG1 começa na posição 216 (ver seta).

[040] A Figura 7 mostra os resultados de ensaios ELISA que foram realizados para mostrar a afinidade de ligação de variante Fc a FcRn em pHs distintos (para mais detalhes ver Exemplo 2, parte IV.2). O histograma representa para cada variantes do valor OD450nm medido pelo ensaio ELISA realizado em pH = 6 (barras pretas), em pH = 6,5 (barras brancas) ou em pH = 7,4 (barras cinzas). O valor de OD450nm correlaciona-se com a quantidade de FcRn imobilizado ligado a variantes Fc.

[041] A Figura 8a ilustra um mapa esquemático do vetor de expressão que é usado para a expressão de anticorpos IgG1 recombinantes que carregam às variantes de Fc como descrito neste. Os anticorpos IgGln recombinante resultantes possuem especificidade de ligação para o antígeno de CD20. Como mostrado na Figura 8a, o ácido nucleico que codifica a região constante de cadeia pesada carrega as mutações descritas na especificação e nos exemplos são inseridos entre os locais de clonagem Apal e o Asei presentes no vetor HKCD20-Opti-GA.

[042] As Figuras 8b e 8c mostram SDS-PAGE de variantes de IgG sob condições não redutoras e condições redutoras, respectivamente.

[043] (1) refere-se a IgG que compreende Fc do tipo selvagem; (2) refere-se a IgG que compreende variante Fc-H; (3) refere-se a IgG que compreende variante C6A_69; (4) refere-se a IgG que compreende variante C6A_78; (5) refere-se a IgG que compreende variante T5A_74; (6) refere-se a IgG que compreende variante C6A_74, (7) refere-se a IgG que compreende C6A_60 variante (8) refere-se a que compreende C6A_66.

[044] A Figura 9 mostra a curva de dose-efeito para variantes de IgG da invenção ("l") e IgG tipo selvagem ("2") obtido pelo ensaio de ELISA realizado como descrito no Exemplo 2, III.1 para caracterizar a ligação de variantes de IgG a FcRn. coordenada X: Concentração de IgG. coordenada Y: porcentagem de FcRn ligado a IgG.

[045] A Figura 10 mostra as curvas de dose-efeito obtido pelo ensaio de ELISA para variantes de IgG da invenção a fim de caracterizar sua afinidade a FcyRIIIa. (1) refere-se à curva obtida para a variante C6A_66, (2) refere-se à curva obtida para Rituximab e (3) refere-se a curvas obtidas para variantes C6A_69; C6A_78; T5A_74; C6A_74; C6A_60 e IgG do tipo selvagem. O ensaio de ELISA foi realizado como descrito no Exemplo 2, na parte IV.La. coordenada X: Concentração de IgG. coordenada Y: porcentagem de FcyRIIIa ligado a IgG.

[046] A Figura 11 ilustra a ligação de vários IgG recombinante a Jurkat FcRn. A Figura 11 mostra a ligação ou Ritixan e de várias variantes de acordo com a invenção para Jurkat FcRn foi determinada como descrito na

[047] 25 Seção Materiais e Métodos acima e expressados como valores médios de intensidade de fluorescência (MFI).

[048] A Figura 12 mostra as curvas de dose-efeito obtidas em ensaio ADCC para variantes IgG da invenção. (1) refere-se à curva da variante C6A_66, (2) refere-se à curva de Rituximab e (3) refere-se à curvas de variantes de LFB-R603, WT-IgG e lgG da invenção (isto é variantes C6A_69; C6A_78; T5A_74; C6A_74; C6A_60). coordenada X: Concentração de IgG. coordenada Y: porcentagem de lise celular. Descrição detalhada da invenção

[049] De modo que o pedido pode ser mais completamente entendido, diversas definições são apresentadas abaixo. Tais definições são entendidas abranger equivalentes gramáticos.

[050] Por todo o presente relatório descrito e reivindicações, a numeração dos resíduos na região Fc é aquela da cadeia pesada de imunoglobulina de acordo com o índice EU como em Kabat et ai., Sequences of Proteins oflmmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), expressamente incorporados aqui por referência. O "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração do resíduo do anticorpo lgG1 EU humano.

[051] Por "polipeptídeo" ou "proteína" como usado neste é entendido pelo menos dois aminoácidos covalentemente ligados, que inclui proteínas, polipeptídeos, oligopeptídeos e peptídeos.

[052] Por "aminoácido" como usado neste é entendido um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural ou quaisquer análogos não naturais que podem estar presentes em uma posição definida específica.

[053] Os aminoácidos de ocorrência natural podem ser abreviados com o código de três letras ou com o código de uma letra:

[054] Por "posição" como usado neste é entendida uma localização na sequência de uma proteína. Para a região Fc, as posições são numeradas de acordo com the índice EU como em Kabat.

[055] Pela "modificação de aminoácido" neste, é entendida uma mudança na sequência de aminoácido de um polipeptídeo. "Modificações de aminoácido" que também podem ser denominadas "mudanças de aminoácido" aqui incluem substituição, inserção e/ou anulação em uma sequência de polipeptídeo. Por "substituição de aminoácido" ou "substituição" neste, é entendida a substituição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência precursora de polipeptídeo com um outro aminoácido. Por exemplo, a substituição N434S refere-se a um polipeptídeo variante, neste caso, uma variante Fc, em que a asparagina na posição 434 é substituída por serina. Por "inserção de aminoácido" ou "inserção" como usado neste é entendido a adição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência precursora de polipeptídeo. Por exemplo, a inserção G>235-236 indica uma inserção de glicina entre as posições 235 e 236. Por "anulação de aminoácido" ou "anulação" como usado neste é entendido a remoção de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de polipeptídeo precursor. Por exemplo, E294del indica a anulação de ácido glutâmico na posição 294.

[056] Por exemplo, o seguinte formato de modificações é preferivelmente usado: 434S ou N434S, significa que o aminoácido precursor na posição 434, isto é, asparagina, é substituída por serina.

[057] No caso de uma combinação de substituições, o formato preferido é o seguinte: 259I/315D/434Y ou V259I/N315D/N434Y. Aqueles meios que existem são três substituições na variante, um na posição 259, um na posição 315 e um na posição 434 e aquele aminoácido na posição 259 do polipeptídeo precursor, isto é, valina, é substituído por isoleucina, que o aminoácido na posição 315 do polipeptídeo precursor, isto é, asparagina, é substituído por ácido aspártico e que o aminoácido na posição 434 do polipeptídeo precursor, isto é, asparagina, é substituído por tirosina.

[058] Por "região variável" como usado neste é entendida a região de uma imunoglobulina que compreende um ou mais domínios de Ig substancialmente codificados por qualquer um dos genes VK, VÀ e/ou VH que formam os locais genéticos de imunoglobulina de cadeia capa, lambda e pesada respectivamente. As regiões variáveis compreendem Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) e Regiões de Estrutura (FR).

[059] Por "Fc" ou "região Fc", como usado neste é entendido o polipeptídeo que compreende a região constante de um anticorpo que exclui o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante. Desta maneira, Fc refere-se aos dois últimos domínios de imunoglobulina de região constante de IgA, IgD e IgG, os três últimos domínios de imunoglobulina de região constante de IgE e IgM e o terminal N de junta flexível para estes domínios.

[060] Para IgA e IgM, o Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, Fc compreende domínios de imunoglobulina Cgama2 e Cgama3 (Cy2 e Cy3 que são domínios CH2 e CH3, respectivamente para IgGs) e a região de junta inferior entre Cgamal (Cyl) e Cgama2 (Cy2). A região Fc de cadeia pesada de IgGl humano é definido neste para compreender os resíduos C226 a seu terminal carboxila, em que a numeração está de acordo com o índice EU como em Kabat. No contexto de IgG1 humano, a junta inferior refere-se a posições 226-236, o domínio CH2 refere-se a posições 237-340 e o domínio CH3 refere- se a posições 341-447 de acordo com o índice EU como em Kabat. A região Fc correspondente em outras imunoglobulinas pode ser identificada pelos alinhamentos de sequência.

[061] O Fc pode referir-se à sua região no isolamento ou esta região no contexto de um polipeptídeo de Fc, como descrito abaixo. Por "polipeptídeo de Fc" como usado neste é entendido um polipeptídeo que compreende toda ou parte de uma região Fc. Os polipeptídeos Fc incluem, mas não limitam-se a, anticorpos, fusões de Fc, Fcs isolados, conjugados de Fc e fragmentos de Fc.

[062] O termo "anticorpo" é usado aqui no sentido mais amplo. "Anticorpo" refere-se a qualquer polipeptídeo que pelo menos compreenda (i) uma região de Fc e (ii) um domínio de polipeptídeo de ligação derivado de' uma região variável de uma imunoglobulina. O dito domínio de polipeptídeo de ligação é capaz de ligar especificamente um dado antígeno alvo ou um grupo de antígenos alvo. Um domínio de polipeptídeo de ligação que deriva de uma região variável de uma imunoglobulina compreende um ou mais CDRs. Os anticorpos incluem, mas não limitam-se a, imunoglobulinas de comprimento total, anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos, proteína de fusão de Fc que compreende pelo menos uma região variável, anticorpos sintéticos (algumas vezes referido aqui como "miméticos de anticorpo"), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos totalmente humanos, proteínas de fusão de anticorpo, conjugados de anticorpo e fragmentos e cada um respectivamente.

[063] Por "anticorpo de comprimento total" ou por "imunoglobulina" como usado neste é entendido a estrutura que constitui a forma biológica natural de um anticorpo, incluindo regiões variáveis e constante. Os "anticorpos de comprimento total" abrangem os anticorpos de comprimento total monoclonais, anticorpos de comprimento total do tipo selvagem, anticorpos de comprimento total do tipo selvagem, anticorpos de comprimento total humanizados, a lista não sendo limitante.

[064] Na maioria dos mamíferos, incluindo seres humanos e camundongos, a estrutura dos anticorpos de comprimento total é, em geral, um tetrâmero. O dito tetrâmero é composto de dois pares idêncitocs de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 50-70 kDa). Em alguns mamíferos, por exemplo, em camelos e lhamas, os anticorpos de comprimento total podem consistir apenas de duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio variável ligado à região Fc.

[065] A porção de terminal amino de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Na região variável, três arcos são dobrados para cada um dos domínios V da cadeia pesada e da cadeia leve para formar um local de ligação de antígeno. Cada um dos arcos é referido como uma região determinadora de complementaridade (referido a seguir como um "CDR"), em que a variação na sequência de aminoácido é mais significante.

[066] A porção de terminal carbóxi de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função atuadora. Kabat et al. Sequências primárias numerosas coletadas das regiões variáveis de cadeias pesadas e de cadeias leves. Com base no grau de observação das sequências, estas classificaram sequências primárias individuais no CDR e na estrutura e feito uma lista destes (ver Sequences of Immunological Interest, 5° edição, NIH publication, No. 91-3242, E. A. Kabat et al., incorporado por referência neste em sua totalidade).

[067] No caso de imunoglobulinas humanas, as cadeias leves são classificadas como cadeias leves capa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon e definem o isotipo de anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. O IgG tem diversas subclasses, que incluem, mas não limitam-se a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. O IgM tem subclasses, que incluem mas não limitam-se a, IgMl e IgM2. Desta maneira, o "isotipo" como usado neste é entendido qualquer uma das subclasses de imunoglobulinas definidas pelas características químicas e antigênicas de suas regiões constantes. Os isotipos de imunoglobulina humanos conhecidos são IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgMl, IgM2, IgD e IgE.

[068] Por "IgG" como usado neste é entendido um polipeptídeo que pertence à classe de anticorpos que são substancialmente codificados por um gene gama de imunoglobulina reconhecido. Em seres humanos, o IgG compreende as subclasses ou isotipos IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em camundongos, o IgG compreende IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. Os IgGs de comprimento total são tetrâmeros e consiste de dois pares idênticos de duas cadeias de imunoglobulina, cada par tendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada que compreende domínios de imunoglobulina VL e CL e cada cadeia pesada compreendendo domínios de imunoglobulina VH, Cy1 (também denominados CHl), Cy2 (também denominados CH2) e Cy3 (também denominados CH3). No contexto de IgG1 humano, "CHl" refere-se a posições 118-220, o domínio CH2 refere-se a posições 237-340 e o domínio CH3 refere- se a posições 341-447 de acordo com o índice EU como em Kabat. A cadeia pesada de IgG também compreende um domínio de junta que refere-se a posições 221-236 no caso de IgG1.

[069] Por "polipeptídeo precursor" ou "polipeptídeo precursor" como usado neste é entendido um polipeptídeo não modificado que é subsequentemente modificado para gerar uma variante. O dito polipeptídeo precursor pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural, uma variante de um polipeptídeo de ocorrência natural, versão projetada de um polipeptídeo de ocorrência natural ou um polipeptídeo sintético. O polipeptídeo precursor pode referir-se ao polipeptídeo por si só ou a sequência de aminoácido que a codifica. No contexto da presente invenção, o polipeptídeo precursor compreende uma região Fc selecionada do grupo de regiões Fc do tipo selvagem, seus fragmentos e seus mutantes. Consequentemente, o polipeptídeo precursor pode compreender opcionalmente modificações de aminoácido pré-existentes em sua região Fc (isto é, um mutante Fc) em comparação com as regiões Fc do tipo selvagem.

[070] Vantajosamente, o polipeptídeo precursor é um anticorpo, uma imunoglobulina, um polipeptídeo de fusão de Fc, um conjugado de Fc, esta lista não sendo limitante. Consequentemente, por "imunoglobulina precursora" como usado neste é entendido polipeptídeo de imunoglobulina que é modificado para gerar uma^ variante de imunoglobulinae e por "anticorpo precursor" como usado neste é entendido anticorpo que é modificado para gerar um anticorpo variante. Deve ser observado que "anticorpo precursor" inclui, mas não limita-se a, anticorpos recombinantemente produzidos comerciais.

[071] Como usado neste, o termo "pelo menos um" é igual a "um ou mais".

[072] Por "polipeptídeo variante", "variante de polipeptídeo" ou "variante" como usado neste é entendido uma sequência de polipeptídeo que difere daquela de uma sequência de polipeptídeo precursor em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido.

[073] A variante pode referir-se à variante Fc, variante Fc de polipeptídeo, variante de proteína, variante de anticorpo, variante de imunoglobulina, variante de IgG, esta lista não sendo limitante.

[074] Por "variante de imunoglobulina" ou "imunoglobulina variante" como usado neste é entendido uma sequência de imunoglobulina que difere daquela de uma sequência de imunoglobulina precursora em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. O polipeptídeo precursor pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural ou do tipo selvagem (WT) ou pode ser uma versão modificada de um polipeptídeo WT.

[075] Os polipeptídeos precursores de interesse são polipeptídeos que compreendem uma região Fc como definido acima. Preferivelmente, a variante da invenção tem uma sequência de polipeptídeo que difere daquela de uma sequência de polipeptídeo precursor em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido na região Fc. Consequentemente, uma variante de interesse compreende uma variante de Fc.

[076] Consequentemente, por "variante de Fc" ou "Fc variante" como usado neste é entendido uma sequência de Fc que difere daquela de uma sequência Fc precursora em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Uma variante de Fc pode ser uma região Fc isolada e seus fragmentos ou pode existir no contexto de um anticorpo, a fusão de Fc e fragmentos portanto, a lista não sendo limitante.

[077] Por "variante de proteína" ou "proteína variante" como usado neste é entendido uma proteína que difere de uma proteína precursora em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Por "variante de anticorpo" ou "anticorpo variante" como usado neste é entendido um anticorpo que difere de um anticorpo precursor em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Por "variante de lgG" ou "IgG variante" como usado neste é entendido um anticorpo que difere de um lgG precursor em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Preferivelmente, a variante tem pelo menos uma modificação de aminoácido em comparação com o polipeptídeo precursor, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 45 modificações de aminoácido, preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 20 modificações de aminoácido e mais preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 10 modificações de aminoácido.

[078] A sequência variante neste, preferivelmente possuirá pelo menos cerca de 80 % de identidade com a sua sequência de polipeptídeo precursor e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % de identidade.

[079] Como pretendido aqui, um polipeptídeo determinado tendo pelo menos cerca de 90 % de identidade de aminoácido com um polipeptídeo de referência possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de aminoácido com o dito polipeptídeo de referência.

[080] Para determinar a porcentagem de identidade de duas sequências de aminoácido, as sequências são alinhadas para os propósitos de comparação ótimos. Por exemplo, fendas podem ser introduzidas em uma ou tanto na primeira quanto na segunda sequência de aminoácido para o alinhamento ótimo e as sequências não homólogas podem ser desconsideradas para os propósitos de comparação. Para os propósitos de comparação ótimos, o percentual de identidade de duas sequências de aminoácido podem ser atingidas com CLUSTAL W (versão 1.82) com os seguintes parâmetros : (1) CPU MODE = ClustalW mp; (2) ALIGNMENT = « full »; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers »; (4) OUTPUT ORDER = « aligned »; (5) COLOR ALIGNMENT = « no »; (6) KTUP (word size) = « default »; (7) WINDOW LENGTH = « default »; (8) SCORE TYPE = « percent »; (9) TOPDIAG = « default »; (10) PAIRGAP = « default »; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none »; (12) MATRIX = « default »; (13) GAP OPEN = « default »; (14) END GAPS = « default »; (15) GAP EXTENSION = « default »; (16) GAP DISTANCES = « default »; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ».

[081] Por "tipo selvagem ou WT" aqui é entendido uma sequência de aminoácido ou uma sequência de nucleotídeo que é encontrada em estado natural, incluindo as variações alélicas. Uma proteína WT, polipeptídeo, anticorpo, imunoglobulina, lgG, etc. têm uma sequência de aminoácido ou uma sequência de nucleotídeo que não foi intensionalmente modificada.

[082] Por "FcRn" ou "Receptor de Fc neonatal" como usado neste é entendido uma proteína que liga a região Fc do anticorpo de lgG e é codificado pelo menos em parte por um gene FCRN. O FcRn pode ser de qualquer organismo, que inclui mas não limita-se a humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. Como é conhecido na técnica, a proteína FcRn funcional compreende dois polipeptídeos, frequentemente referido como a cadeia pesada e a cadeia leve. A cadeia leve é beta-2-microglobulina e a cadeia pesada é codificada pelo gene FCRN. A não ser que observado de outra maneira neste, FcRn ou proteína de FcRn refere-se ao complexo de cadeia a com beta-2-microglobulina. No ser humano, o gene que codifica quanto a FcRn e denominado FCGRT.

[083] Por "ligação de FcRn aumentada" como usado neste é 10 entendido o aumento na afinidade de ligação, in vivo ou in vitro, da variante da invenção ao FcRn, em comparação com o polipeptídeo precursor. A capacidade da variante de polipeptídeo ligar um FcRn pode ser avaliada in vitro por ELISA (Exemplo 1 parte IV.La ) ou tecnologia SPR (Exemplo 1 parte IV.l.b. ). As variantes que têm uma propriedade de ligação intensificada para FcRn mais frequentemente têm uma retenção de soro intensificada in vivo e, desta maneira, uma vida média aumentada.

[084] A fim de aumentar a retenção da região Fc in vivo, o aumento na afinidade de ligação para FcRn deve ocorrer em tomo do pH 6, enquanto mantém a afinidade menor em tomo do pH 7,4.

[085] Embora ainda sob exame, as regiões Fc são acreditadas ter uma vida média mais longa, porque a ligação a FcRn em pH 6 permite o sequestro das regiões Fc em endossomas (Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598, incorporado por referência neste em sua totalidade). O compartimento endossômico então recicla as regiões Fc à superficie celular. Uma vez que o compartimento abre ao espaço extracelular, o pH mais alto, quase 7,4, induz a liberação de regiões Fc de volta no sangue. Portanto, as modificações de aminoácido na região Fc que aumentarão a vida média das regiões de Fc in vivo aumentarão idealmente a ligação de FcRn no pH menor enquanto ainda permite-se a liberação da região de Fc em pH mais alto.

[086] O termo "vida média in vivo" como usado neste refere-se a uma vida média biológica de um polipeptídeo de interesse na circulação de um dado mamífero e é representado pelo tempo requerido para a metade da quantidade presente na circulação do animal a ser retirada da circulação e/ou outros tecidos do animal.

[087] A presente invenção é fundamentada na identificação de modificações de aminoácido da região de Fc cujas modificações aumentam a afinidade de ligação da região Fc para FcRn. As modificações de aminoácido de interesse foram determinadas pela geração de duas bibliotecas de variantes de Fc pela mutagênese aleatória e pela medição da propriedade de ligação das ditas variantes para FcRn.

[088] Consequentemente, a presente invenção diz respeito a variantes de polipeptídeos precursores que compreendem uma região Fc que apresenta ligação aumentada a FcRn em comparação com os ditos polipeptídeos precursores.

[089] Um polipeptídeo precursor da invenção é um polipeptídeo que compreende uma região Fc. O dito polipeptídeo pode compreender uma cadeia de polipeptídeo simples ou diversas cadeias de polipeptídeo que não são covalentemente ligados juntos. Os polipeptídeos precursores incluem, mas não limitam-se a, anticorpos, proteínas de fusão de Fc, conjugados de Fc, polipeptídeos derivados de Fc, Fc isolado e seus fragmentos. Como uma consequência, o dito polipeptídeo precursor pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural, uma variante de um polipeptídeo de ocorrência natural, uma versão projetada de um polipeptídeo de ocorrência natural, um polipeptídeo sintético ou um polipeptídeo que compreende um fragmento não proteináceo. Uma versão projetada de um polipeptídeo de ocorrência natural é um polipeptídeo que não é codificado por um gene de ocorrência natural. Por exemplo, o polipeptídeo projetado pode ser um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado.

[090] A região Fc do polipeptídeo precursor é preferivelmente selecionada do grupo que consiste de regiões de Fc do tipo selvagem de IgGs, fragmento e seus mutantes. Aqui, a região Fc de IgG corresponde à domínio "junta inferior"-CH2-CH3 (Para lgGs, CH2 e CH3 também são denominados domínios Cy2 e Cy3). A sequência de domínio de "junta inferior"-CH2-CH3 do IgG1 humano do tipo selvagem é a sequência da SEQ 1D N°: 1. No contexto de lgG1 humano, a junta inferior refere-se às posições 226-236, o domínio CH2 refere-se às posições 237-340 e o domínio CH3 refere-se às posições 341-447 de acordo com o índice EU como em Kabat. Os domínios análogos para outras sub-classes de IgG podem ser determinados a partir do alinhamento de sequência de aminoácido de cadeias pesadas ou fragmentos de cadeia pesadas ditas sub-classes de IgG com aquela do IgG1 humano.

[091] Os fragmentos da região de Fc são definidos como polipeptídeos que compreendem um ou mais polipeptídeos derivados de uma região de Fc do tipo selvagem, preferivelmente do domínio de "junta inferior- CH2-CH3" de um IgG do tipo selvagem. Os ditos fragmentos têm uma constante de dissociação para FcRn menor do que 1 microM de acordo com o ensaio de SPR descrito no Exemplo 1 parte IV.1.).

[092] Como mencionado acima, o polipeptídeo precursor pode compreender um mutante de Fc do tipo selvagem isto é, uma região de Fc que já compreende modificações de aminoácido pré-existentes, tais como adições, inserções, e/ou substituições com a condição de que o dito mutante Fc tenha uma constante de dissociação para FcRn menor do que 1 microM de acordo com o ensaio de SPR descrito no Exemplo 1 part IV.l. e não seja um Fc da região do tipo selvagem.

[093] Por "polipeptídeo variante" ou "variante" como usado neste é entendido uma sequência de polipeptídeo que difere daquela de um polipeptídeo precursor em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido.

[094] O polipeptídeo variante de acordo com a presente invenção apresenta uma ligação aumentada a FcRn em comparação com o polipeptídeo precursor correspondente. Em outras palavras, a afinidade da variante para FcRn é mais alta do que aquela do polipeptídeo precursor. Tais variantes são otimizadas de acordo com a invenção.

[095] A afinidade dos ditos polipeptídeos para FcRn pode ser avaliada por métodos bem conhecidos da técnica anterior. Por exemplo, a pessoa habilitada na técnica pode determinar a constante de dissociação (Kd) usando-se os experimentos de Ressonância de Plasmon de Superficie (SPR) como ilustrado no Exemplo 1 parte IV.1.b. do presente pedido. Se a variante tiver um Kd de 1,1 vez menor do que aquela de seu precursor correspondente então a dita variante é uma variante otimizada de acordo com a invenção.

[096] Como uma alternativa, a pessoa habilitada na técnica pode realizar um ensaio de ELISA apropriado. Um ensaio de ELISA apropriado permite comparar a força da ligação da variante e aquela o precursor ao FcRn como ilustrado no Exemplo 1. Os sinais específicos detectados para a variante e o polipeptídeo precursor são comparados. A variante é uma variante otimizada da invenção se seu sinal específico for pelo menos 1,2 vezes mais forte, mais preferivelmente pelo menos 3,2 vezes mais forte do que aquela do polipeptídeo precursor (isto é, pelo menos tão bom quanto a variante de Fc tendo a modificação de aminoácido dupla T250Q/M428L).

[097] Os ensaios de ELISA apropriados são ilustrados no Exemplo 1 do presente pedido. A afinidade de ligação também pode ser diferentemente determinada pela avaliação dos polipeptídeos de comprimento total (ver Exemplo 2 parte III) ou pela avaliação das regiões Fc isoladas destes (ver Exemplo 1 parte IV).

[098] De acordo com a invenção, as variantes de polipeptídeo de interesse compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido em sua região Fc em comparação com o polipeptídeo precursor. As modificações de aminoácido são selecionadas do grupo que consiste de inserção, anulações e substituições de aminoácido.

[099] A fim de obter uma variante de polipeptídeo tendo ligação aumentada a FcRn em comparação com seu polipeptídeo precursor, foi mostrado que pelo menos uma modificação de aminoácido deveria ser introduzida em uma posição de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 25 264,265, 26 269, 27 276,284,285,288,289, 29 291,292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315,317, 320, 322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356, 359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400,401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424,426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 e 447 da região Fc em comparação com o dito polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[100] Aqui, o "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração do resíduo do anticorpo de IgG1 EU humano. Por exemplo, as posições análogas para outras regiões de Fc podem ser determinadas a partir do alinhamento de sequência de aminoácido das ditas regiões de Fc com o fragmento de cadeia pesada de IgG1 humano que compreende o polipetídeo de SEQ ID N°: 1. Para o propósito ilustrativo, a Fig. 6 descreve o alinhamento de sequência de fragmentos de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanos que compreende domínio de "junta inferior-CH2-CH3".

[101] Por "pelo menos uma modificação de aminoácido" como usado neste significa "uma ou mais modificações". É pretendido que a introdução de mais do que 20 modificações de aminoácido na região Fc pode prejudicar drasticamente suas atividades biológicas. Consequentemente, a variante de polipeptídeo preferivelmente tem de 1 a 20 e mais preferivelmente de 1 a 10 modificações de aminoácido, na posição selecionada da lista citada acima. Por "1 a 20 modificações de aminoácido" como usado neste abrange 1, 2,3,4,5,6, 7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 modificações de aminoácido. A dita sequência de polipeptídeo variante preferivelmente possui pelo menos cerca de 90 % de identidade com seu precursor de sequência de polipeptídeo.

[102] Como pretendido neste, um polipeptídeo determinado tendo pelo menos cerca de 90 % de aminoácidos com um polipeptídeo de referência possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de aminoácido com o dito polipeptídeo de referência.

[103] As variantes de Fc da presente invenção que apresentam uma afinidade de ligação mais alta para FcRn em geral compreendem mais do que uma modificação de aminoácido. Os resultados obtidos a partir do ensaio de ELISA de fago descrito no exemplo II mostra que as variantes otimizadas que compreendem mais do que uma modificação de aminoácido pode ter um sinal específico de cerca de 3,2 vezes a 30 vezes mais forte (ver tabela 2 e tabela 3) do que Fc do tipo selvagem visto que as variantes com uma modificação de aminoácido de ponto simples (ver tabela 1) pode ter um sinal de cerca de 1,2 vezes a 3,5 vezes mais forte do que o Fc do tipo selvagem. Como ilustrado na tabela 3, o sinal da variante otimizada pode ser de cerca de 1 ver a cerca de 10 vezes mais forte do que aquela do Fc-H que refere-se à variante de Fc tendo a modificação de aminoácido dupla T250Q/M428L.

[104] Consequentemente, em uma forma de realização específica, a dita variante compreende pelo menos duas modificações de aminoácido selecionadas da lista consistindo de 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241,243,246,250,252,256,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315,317, 320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355, 356,359,360,361,362,369,370,371,375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395,396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433,434,438,439,440,443, 444,445,446 e 447 da região Fc em comparação com o dito polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[105] Como descrito na tabela 5 do presente pedido, as variantes Fc que apresentam a afinidade de ligação mais alta para FcRn podem ter de 3 a 6 modificações de aminoácido.

[106] Consequentemente, em uma forma de realização adicional, os polipeptídeos variantes da invenção podem compreender de 3 a 6 modificações de aminoácido em posições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 226, 227,228,230,231,233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290,291, 292,294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311,315,317, 320, 322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356, 359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390, 392,393,394,395,396,397,398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415,416,418,419, 420,421,422,42 42 428,433,43 438,439,440,443,444,445,446 e 447 da região Fc em comparação com o dito polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[107] As modificações de aminoácido são preferivelmente selecionadas do grupo de anulações e substituições.

[108] Algumas posições de aminoácido da lista acima - isto é 226, 230, 241, 264,307,315, 330, 342, 362, 378,382,389, 396, 397, 421 e 434 - são posições chave. Em outras palavras, as variantes Fc que apresentam afinidade de ligação alta para FcRn são prováveis de compreender pelo menos uma modificação de aminoácido nas ditas posições de aminoácido.

[109] Em certas formas de realização, a variante de polipeptídeo de acordo com a invenção compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em posições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 226,230,241,264,307,315,330,342,362,378,382,389,396,397,421 e 434 da região Fc em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[110] Entre as posições chave acima, o sequenciamento das variantes Fc que apresentam a ligação mais forte para FcRn mostraram que as posições de aminoácido 230, 264, 307, 315, 330, 378 e 434 são as posições mais frequentemente mutadas. Consequentemente, em uma outra forma de realização, a pelo menos uma modificação ocorre em uma posição selecionada do grupo que consiste de 230, 264, 307, 315, 330, 378 e 434, mais preferivelmente do grupo que consiste de 264, 315, 378 e 434 da região Fc em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[111] Como mencionado acima, a introdução de pelo menos duas modificações de aminoácido podem intensificar perceptivelmente a afinidade de ligação de Variante Fc para FcRn em comparação com o precursor de Fc.

[112] Consequentemente, em uma forma de realização alternativa, a variante de polipeptídeo compreende pelo menos duas modificações de aminoácido, as ditas pelo menos duas modificações de aminoácido que compreendem:

[113] (i) uma modificação em uma posição de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421, e 434 e

[114] (ii) pelo menos uma modificação em uma posição de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 226, 227, 228, 230, 231,233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305,307, 308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345, 347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383, 384,385,386,387,389,390,392,393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414,415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440,443, 444, 445, 446 e 447,

[115] da região Fc em comparação com o polipeptídeo precursor em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificação (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[116] Por exemplo, de acordo com a dita condição, se a modificação de aminoácido (i) ocorre na posição 434, a pelo menos uma modificação de aminoácido (ii) pode ocorrer em qualquer posição da lista citada em (ii) exceto na posição 434.

[117] Em uma outra forma de realização, a variante de polipeptídeo compreende pelo menos duas modificações de aminoácido, as ditas pelo menos duas modificações de aminoácido que compreendem:

[118] (i) uma modificação em uma posição de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 264, 315, 378 e 434 e

[119] (ii) pelo menos uma modificação em uma posição de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 226, 227, 228, 230, 231, 233,234,239,241,243,246,250,252,256,259,264,265,267,269,270,276,284,285, 288,289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305, 307, 308, 309, 311, 315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352, 354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386, 387,389,390,392,393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414,415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440,443,444,445,446 e 447

[120] da região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificação (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[121] Em uma forma de realização adicional, a dita variante compreende pelo menos duas modificações de aminoácido, as ditas pelo menos duas modificações de aminoácido que compreendem:

[122] (i) uma modificação de aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste de 264,315,378 e 434 e

[123] (ii) pelo menos uma modificação de aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste de 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 e 434 da região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificação (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[124] Em uma outra forma de realização adicional a dita variante compreende pelo menos duas modificações de aminoácido que compreendem:

[125] (i) uma modificação de aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste de 378 e 434 e

[126] (ii) pelo menos uma modificação de aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste de 226,230,241,264,307,315,330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 e 434 da região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificação (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[127] Em uma forma de realização alternativa, a variante de polipeptídeo compreende pelo menos três modificações de aminoácido em sua região Fc. Consequentemente, as ditas pelo menos três modificações de aminoácido podem compreender:

[128] (i) duas modificações em duas posições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 e 434 e

[129] (ii) pelo menos uma modificação em uma posição de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298,299, 301, 302, 303, 305, 307, 308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342;343,345, 347,350,352,354,355, 356,359,360,361,362,369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392,393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440,443, 444, 445, 446 e 447

[130] da região Fc em comparação com o polipeptídeo precursor em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificação (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[131] Em uma forma de realização alternativa, a variante de polipeptídeo compreende pelo menos três modificações de aminoácido, as ditas pelo menos três modificações de aminoácido compreendendo:

[132] (i) uma modificação em uma posição de aminoácido 25 selecionada do grupo que consiste de 264, 315, 378 e 434;

[133] (ii) uma modificação em uma posição de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 226,230,241,264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 e 434 e

[134] (iii) pelo menos uma modificação em uma posição de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 227,228,230,231,233, 234,239,241,243,246,250,252,256,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288, 289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305,307,308,309,311, 315,317, 320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355, 356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389, 390,392,393,394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415,416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443,444, 445, 446 e 447 da região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na 10 região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificação (i), modificação (ii) e modificação (iii) não ocorre de maneira simultânea nas mesmas posições de aminoácido.

[135] Em outras formas de realização, a variante de polipeptídeo compreende pelo menos três modificações de aminoácido, as ditas pelo menos três modificações de aminoácido compreendendo:

[136] (i) uma modificação em uma posição de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 378 e 434;

[137] (ii) uma modificação em uma posição de aminoácido selecionada do grupo de 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 e 434 e

[138] (iii) pelo menos uma modificação em uma posição de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 227,228,230,231,233, 234,239,241,243,246,250,252,256,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288, 289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317, 320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355, 356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389, 390,392,393,394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415,416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443,444, 445, 446 e 447 da região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificação (i), modificação (ii) e modificação (iii) não ocorre de maneira simultânea nas mesmas posições de aminoácido.

[139] Em todas as formas de realização previamente citadas da presente invenção, as modificações de aminoácido são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste de aminoácido substituições e anulações.

[140] Um objetivo adicional da invenção diz respeito a uma variante de um polipeptídeo precursor que compreende uma região de Fc que apresenta ligação aumentada a FcRn em comparação com o dito polipeptídeo precursor e compreende pelo menos uma modificação de aminoácido na região Fc selecionadas do grupo que consiste de 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R,239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 2591, 264A,264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E, 276S,284L, 285Y, 288R, 2891, 290R, 290E, 291S, 291Q, 292W, 294del, 297D,298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 3031, 305A, 307P,307A, 307N, 3081, 309P, 311R, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S, 327V,327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q, 355G, 356N,359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R, 371D, 375A,375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N, 3841, 384T,385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E, 392R,393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N, 400P,401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 41lA, 412A, 414R, 415D, 415N, 416K,416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L,426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E e 447N da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[141] Em uma forma de realização alternativa, o dito polipeptídeo compreende pelo menos uma modificação selecionadas do grupo que consiste de 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 24lL, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D,322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R,378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A,396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y,434S e 439R da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[142] Preferivelmente, a dita variante tem de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10 modificações de aminoácido selecionadas das listas acima, em comparação com o polipeptídeo precursor. Como usado neste, por "1 a 20 modificações" é entendido 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19 e 20 modificações.

[143] Em algumas formas de realização, a dita variante compreende de 3 a 6 modificações de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A,252L, 256N, 2591, 264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D,269G, 270N, 270E, 276S, 284L, 285Y, 288R, 2891, 290R, 290E, 291S, 291Q,292W, 294del, 297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A,3031, 305A, 307P, 307A, 307N, 3081, 309P, 311R, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S, 327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R,340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P,355Q, 355G, 356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A,370R, 371D, 375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R,383N, 3841, 384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S,392E, 392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P,399N, 400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 41lA, 412A, 414R, 415D,415N, 416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L, 426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E e 447N da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[144] Em uma forma de realização alternativa, o dito polipeptídeo compreende de 3 a 6 modificações de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N,2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E,370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R,395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R,434Y, 434S e 439R da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[145] Tais modificações de aminoácido da lista acima são modificações chave. Em outras palavras, as variantes Fc que apresentam afinidade de ligação alta to FcRn são prováveis de compreender pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada das ditas modificações chave.

[146] Consequentemente, o dito polipeptídeo variante pode compreender pelo menos uma modificação selecionada do grupo que consiste de 226G, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 342R, 362R,362E, 378V, 378T, 382V, 389T, 389K, 396L, 397M, 421T, 434Y e 434S da região Fc em comparação com o dito polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[147] Em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 264E, 315D, 378V, 378T, 434Y e 434S da região Fc em comparação com o dito polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[148] Em uma forma de realização adicional, o dito polipeptídeo variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 378V, 378T, 434Y e 434S da região Fc em comparação com o dito polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[149] Como mencionado acima, a introdução de pelo menos duas modificações de aminoácido podem intensificar perceptivelmente a ligação de variantes de Fc a FcRn em comparação com os precursores. Pelo menos uma das ditas modificações podem ser selecionadas das modificações chave isto é, do grupo que consiste de 2260, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 342R, 362R, 362E, 378V, 378T, 382V, 389T, 389K, 396L, 397M,421T, 434Y e 434S.

[150] Em uma forma de realização alternativa, o dito polipeptídeo variante compreende pelo menos duas modificações de aminoácido, as ditas pelo menos duas modificações compreendendo

[151] (i) uma modificação selecionada do grupo que consiste de 2260, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 342R, 362R, 362E, 378V, 378T, 382V, 389T, 389K, 396L, 397M, 421T, 434Y e 434S e

[152] (ii) pelo menos uma modificação de aminoácido em uma posição de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 227, 228, 230,231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,297,298,299,301,302,303, 305, 307, 308, 309, 311, 315,317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369, 370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396, 397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439,440, 443, 444, 445, 446 e 447 da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificação (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[153] Em uma forma de realização adicional, a dita variante compreende pelo menos duas modificações de aminoácido, as ditas pelo menos duas modificações compreendendo

[154] (i) uma modificação de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 378V, 378T, 434Y e 434S e

[155] (ii) pelo menos uma modificação de aminoácido em uma posição de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 e 434 da região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificação (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[156] Em uma outra forma de realização, a dita variante compreende pelo menos duas modificações de aminoácido, as ditas pelo menos duas modificações compreendendo:

[157] (i) uma modificação de aminoácido selecionada de 378V, 378T, 434Y e 434S e

[158] (ii) pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada de 226G, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 342R, 362R, 362E, 378V, 378T, 382V, 389T, 389K, 396L, 397M, 421T, 434Y e 434S e mais preferivelmente, de 226G, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y e 434S da região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificação (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[159] Consequentemente, um objetivo adicional da invenção diz respeito a uma variante de um polipeptídeo precursor que compreende uma região Fc que apresenta ligação aumentada a FcRn em comparação com o dito polipeptídeo precursor e compreende pelo menos uma combinação de modificações de aminoácido na região Fc.

[160] A pelo menos uma combinação de modificações é selecionada do grupo que consiste de: 226G/330V, 230L/264E, 230L/378V, 230S/315D, 230S/434Y, 230T/378V, 241L/434S, 250A/434Y, 264E/378T, 305A/315D, 305A/330V, 305A/434Y, 307P/434Y, 315D/389T, 330V/382V, 330V/389T, 378V/421T, 389K/434Y, 389T/434Y, 396L/434S, 230T/264E, 230T/315D, 230T/434S, 230T/434Y, 241L/307P, 264E/307P, 264E/396L, 315D/362R, 315D/382V, 362R/434Y, 378V/434Y, 382V/434Y, 226G/315D, 226G/434Y, 241L/378V, 307P/378V, 241L/264E, 378V/434S, 264E/378V, 264E/434S, 315D/330V, 330V/434Y e 315D/434Y da região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[161] A dita variante ainda pode compreender pelo menos uma modificação selecionada do grupo de 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 2591, 264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E, 276S, 284L, 285Y, 288R, 2891, 290R, 290E, 291S, 291Q, 292W, 294del, 297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 3031, 305A, 307P, 307A, 307N, 3081, 309P, 31lR, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S, 327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q, 355G, 356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R, 371D, 375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N, 3841, 384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E, 392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N, 400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 41 lA, 412A, 414R, 415D, 415N, 416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L, 426T, 428L,433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E e 447N da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[162] Em uma outra forma de realização, uma variante de acordo com a presente invenção compreende:

[163] (i) pelo menos uma combinação de modificações de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de :226G/330V, 230L/264E, 230L/378V, 230S/315D, 230S/434Y, 230T/378V, 241L/434S, 250A/434Y, 264E/378T, 305A/315D, 305A/330V, 305A/434Y, 307P/434Y, 315D/389T, 330V/382V, 330V/389T, 378V/421T, 389K/434Y, 389T/434Y, 396L/434S, 230T/264E, 230T/315D, 230T/434S, 230T/434Y, 241L/307P, 264E/307P, 264E/396L, 315D/362R, 315D/382V, 362R/434Y, 378V/434Y, 382V/434Y, 226G/315D, 226G/434Y, 241L/378V, 307P/378V, 241L/264E, 378V/434S, 264E/378V, 264E/434S, 315D/330V, 330V/434Y e 315D/434Y; e

[164] (ii) pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 226G, 227L, 228L, 228R 230S, 230T, 230L, 231T, 24lL, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S,361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T,389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S e 439R da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificações (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[165] Em outras formas de realização, a dita variante compreende pelo menos uma combinação de modificações de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 250A/434Y, 307P/434Y, 230T/434S, 264E/396L, 378V/434Y, 378V/434S, 264E/378V, 264E/434S, 315D/330V e 315D/434Yda região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[166] A dita variante ainda pode compreender pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada do grupo de 226G, 226Y, 227S,227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 2591,264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E,276S, 284L, 285Y, 288R, 2891, 290R, 290E, 291S, 291Q, 292W, 294del,297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 3031, 305A,307P, 307A, 307N, 3081, 309P, 311R, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S,327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R,342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q, 355G,356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R, 371D,375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N, 3841,384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E,392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N,400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 41lA, 412A, 414R, 415D, 415N,416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A,424L, 426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E e 447N da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[167] Em uma outra forma de realização, uma variante de acordo com a presente invenção compreende:

[168] (i) pelo menos uma combinação de modificações de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de :

[169] 250A/434Y, 307P/434Y, 230T/434S, 264E/396L, 378V/434Y, 378V/434S, 264E/378V, 264E/434S, 315D/330V e 315D/434Y; e

[170] (ii) pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 226G, 227L, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S e 439R da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificações (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[171] Em algumas formas de realização, a dita variante compreende pelo menos uma combinação de aminoácido de modificações selecionadas do grupo que consiste de: 226G/315D/330V, 226G/330V/434Y, 230L/264E/378V, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 241L/264E/378V, 241L/264E/307P, 256N/378V/434Y, 294del/307P/434Y, 305A/315D/330V, 315D/330V/382V, 315D/362R/434Y, 330V/389T/434Y e 378V/383N/434Y da região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[172] A dita variante pode compreender pelo menos uma modificação adicional selecionada do grupo que consiste de 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 2591, 264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E, 276S, 284L, 285Y, 288R, 2891, 290R, 290E, 291S, 291Q, 292W, 294del, 297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 3031, 305A, 307P, 307A, 307N, 3081, 309P, 31lR, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S, 327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q,355G, 356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R, 371D, 375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N, 3841, 384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E, 392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N, 400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 41lA, 412A, 414R, 415D, 415N, 416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L, 426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E e 447N da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[173] Em uma outra forma de realização, uma variante de acordo com a presente invenção compreende:

[174] (i) pelo menos uma combinação de modificações de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de: 226G/315D/434Y, 226G/330V/434Y, 230T/264E/434S, 241L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 307P/378V/434Y, 315D/362R/434Y, 330V/382V/434Y, 330V/389T/434Y e 378V/383N/434Y e

[175] (ii) pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 226G, 227L, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S e 439R da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificações (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[176] Em outras formas de realização, a dita variante compreende pelo menos uma combinação de aminoácido de modificações selecionadas do grupo que consiste de: 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241L/264E/378V, 241L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 256N/378V/434Y, 2591/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264E/396L/434S, 294del/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/378V/434Y, 315D/382V/434Y e 378V/383N/434Y da região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[177] A dita variante ainda pode compreender pelo menos uma modificação adicional selecionada do grupo que consiste de 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 2591, 264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E, 276S, 284L, 285Y, 288R, 2891, 290R, 290E, 291S, 291Q, 292W, 294del, 297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 3031, 305A, 307P, 307A, 307N, 3081, 309P, 31 lR, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S, 327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q, 355G, 356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R,371D, 375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N,3841, 384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E,392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N, 400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 41lA, 412A, 414R, 415D, 415N, 416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L, 426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447E e 447N da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[178] Em uma outra forma de realização, uma variante de acordo com a presente invenção compreende:

[179] (i) pelo menos uma combinação de modificações de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de:

[180] 230T/264E/434S, 250A/389K/434Y, 264E/378V/416K, 264E/378V/434S, 264E/396L/434S, 294del/307P/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/378V/434Y, 315D/382V/434Y e 378V/383N/434Y e

[181] (ii) pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 226G, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S e 439R da região Fc, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat e com a condição de que a modificações (i) não ocorra na mesma posição de aminoácido como a modificação (ii).

[182] Em todas as formas de realização previamente citadas, a dita variante preferivelmente tem de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10 modificações de aminoácido em comparação com o polipeptídeo precursor.

[183] Em uma forma de realização alternativa, a dita variante compreende uma combinação de modificações de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 307A/3 315D/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 256N/378V/434Y,315D/330V/361D/378V/434Y, 315D/361D/378V/434Y, 259I/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 241L/264E/307P/378V/433R, 250A/389K/434Y, 305A/315D/330V/395A/434Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294del/307P/434Y, 305A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y, 230T/241L/264E/265G/378V/421T, 264E/396L/415N/434S, 227L/264E/378V/434S, 264E/378T/396L, 230T/315D/362R/426T/434Y, 230L/241L/243L/264E/307P/378V, 290E/315D/342R/382V/434Y,226G/315D/330V/434Y, 250A/315D/325S/330V/434Y,241L/315D/330V/392R/434Y, 241L/264E/307P/378V/434S,230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K, 230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y, 226G/264E/347R/370R/378V/434S,230T/264E/378V/434S, 230L/264E/378V/434S,226G/315D/330V/389T/434Y, 308I/315D/330V/382V/434Y,231T/241L/264E/378T/397M/434S, 230T/315D/330V/386K/434Y,267R/307P/378V/421T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S e 230T/303A/322R/389T/404L/434S da região, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

[184] Em outra forma de realização, a dita variante compreende uma combinação de modificações de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 256N/378V/434Y, 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 315D/330V/361D/378V/434Y, 259I/315D/434Y e 230S/315D/428L/434Y.

[185] Um objetivo adicional da invenção é fornecer variantes de peptídeo com ligação aumentada para FcRn em comparação com seus polipeptídeos precursores e que compreende a Variante de Fc selecionada do grupo que consiste de 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 307A/315D/382V/389T/434Y 256N/378V/383N/434Y, 315D/330V/361D/378V/434Y, 315D/361D/378V/434Y 259I/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 241L/264E/307P/378V/433R, 250A/389K/434Y, 256N/378V/434Y, 305A/315D/330V/395A/434Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294del/307P/434Y, 305A/315D/330V/389K/434Y, 230T/241L/264E/265G/378V/421T, 315D/327V/330V/397M/434Y, 264E/396L/415N/434S, 227L/264E/378V/434S, 264E/378T/396L, 230T/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y, 250A/315D/325S/330V/434Y, 241L/315D/330V/392R/434Y, 230L/241L/243L/264E/307P/378V, 290E/315D/342R/382V /434Y, 241L/264E/307P/378V/434S, 230T/264E/403T/434S, 226G/315D/434Y, 264E/378V/416K, 230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/362R/434Y, 226G/264E/347R/370R/378V/434S, 230T/264E/378V/434S, 230L/264E/378V/434S, 226G/315D/330V/389T/434Y, 308I/315D/330V/382V/434Y, 231T/241L/264E/378T/397M/434S, 230T/315D/330V/386K/434Y, 267R/307P/378V/421T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S e 230T/303A/322R/389T/404L/434S, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Em algumas outras formas de realização, a variante de polipeptídeo com ligação aumentada para FcRn em comparação com seu polipeptídeo precursor compreende a Variante de Fc selecionada do grupo que consiste de 256N/378V/434Y,307A/315D/330V/382V/389T/434Y,256N/378V/383N/434Y, 315D/330V/361D/378V/434Y, 259l/315D/434Y e 230S/315D/428L/434Y.

[186] Para todas as variantes mencionadas acima de acordo com a invenção, a região Fc de seus polipeptídeos precursores pode derivar de uma região Fcs de lgGs tipo selvagem (por exemplo, "junta inferior-CH2-CH3") e fragmentos destes. Em uma forma de realização mais preferida, a região Fc de polipeptídeos precursores deriva das subclasses de IgG humanas isto é lgG1, lgG2, lgG3 e IgG4. Em uma outra forma de realização preferida, a região Fc do polipeptídeos precursores é selecionada do grupo que consiste da região IgGl Fc do tipo selvagem (SEQ ID N° :1), a região lgG2 Fc do tipo selvagem (SEQ ID N°: 2), a região de lgG3 Fc do tipo selvagem (SEQ ID N°: 3) e a região de IgG4 Fc do tipo selvagem (SEQ ID N°: 4).

[187] Neste contexto, um outro objetivo da invenção é um polipeptídeo que compreende uma variante de lgG1 de Fc em que a dita variante de Fc de lgG1 compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em comparação com a sequência do tipo selvagem de IgGl Fc (SEQ ID N°: 1) e apresenta uma ligação aumentada a FcRn em comparação com o lgG1 Fc do tipo selvagem com a condição de que a sequência do dito IgGl variante de Fc não é SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4.

[188] Um outro objetivo da invenção é um polipeptídeo que compreende um IgG2 variante de Fc em que o dito IgG2 variante de Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido corno em comparação com a sequência do tipo selvagem de lgG2 Fc (SEQ 1D N°: 2) e apresenta uma ligação aumentada a FcRn em comparação com o IgG2 Fc do tipo selvagem com a condição de que a sequência do dito lgG2 variante de Fc não é SEQ 1D N°: 1, SEQ 1D N°: 3 e SEQ 1D N°: 4.

[189] Um objetivo adicional da invenção é um polipeptídeo que compreende um IgG3 variante de Fc em que o dito IgG3 variante de Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em comparação com a sequência do tipo selvagem de lgG3 Fc (SEQ 1D N°: 3) e apresenta uma ligação aumentada a FcRn em comparação com o lgG3 Fc do tipo selvagem com a condição de que a sequência do dito IgG3 variante de Fc não seja SEQ 1D N°: 1, SEQ 1D N°: 2 e SEQ 1D N°: 4.

[190] Um outro objetivo da invenção é um polipeptídeo que compreende um lgG4 variante de Fc em que o dito IgG4 variante de Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em comparação com a sequência do tipo selvagem de lgG4 Fc (SEQ 1D N°: 4) e apresenta uma ligação aumentada a FcRn em comparação com o lgG4 Fc do tipo selvagem com a condição de que a sequência do dito IgG2 variante de Fc não é SEQ 1D N°: 1, SEQ 1D N°: 3 e SEQ 1D N°: 2.

[191] Nas formas de realização preferidas, a pelo menos uma modificação de aminoácido compreendida nas variantes de polipeptídeo de Fc de lgG1, IgG2, lgG3 ou IgG4 é selecionada do grupo de modificações de aminoácido e combinações de modificações de aminoácido que são descritas acima no presente relatório descritivo quando, em geral, definem a variante de um polipeptídeo que compreende uma região Fc e tendo uma ligação aumentada a FcRn em comparação com o polipeptídeo precursor correspondente.

[192] Como descrito acima, uma variante de acordo com a invenção apresenta uma ligação aumentada a FcRn em comparação com o polipeptídeo precursor correspondente. Em uma forma de realização, as outras propriedades de ligação da dita variante são similares àquela do precursor correspondente. A dita variante pode, particularmente, não apresentar mudança significante na ligação aos receptores Fe-gama ou C1q em comparação com seu polipeptídeo precursor.

[193] Em uma outra forma de realização, a dita variante tem uma ligação aumentada a FcRn combinada com uma ou mais funções atuadoras alteradas e/ou ligação a ligandos de Fc (outros que não FcRn).

[194] Como ilustrado no Exemplo 2, a variante da invenção pode ter uma ligação aumentada a FcRn combinado com a ligação inalterada a um FcyR, em particular a FcyRIIIa, atividade de ADCC (Citotoxicidade mediada Celular Dependente de Anticorpo) e atividade de CDC (Citotoxicidade Dependente de Complemento) em comparação com uma variante de polipeptídeo. A variante da invenção também pode ter uma ligação aumentada a FcRn combinado com atividades de ADCC e CDC que são pelo menos similares àqueles de sua matriz de polipeptídeo. Em alguns outros casos, a variante da invenção pode ter uma ligação aumentada a FcRn combinado com pelo menos uma atividade redutora selecionada de ADCC e CDC em comparação com sua matriz de polipeptídeo.

[195] As atividades de ADCC e CDC podem ser estimadas por métodos bem conhecidos da técnica anterior, tais como aqueles descritos no Exemplo 2 partes IV.2 e IV.3 do presente relatório descritivo.

[196] A ligação a FcyR pode ser estimada por métodos convencionais, tais como ensaio de SPR ou ELISA.

[197] Um objetivo adicional da invenção é fornecer variantes que, opcionalmente, compreendem modificações adicionais de aminoácido que diferem daquelas citadas previamente com a condição de que as variantes resultantes tenham uma ligação aumentada a FcRn em comparação com o polipeptídeo precursor.

[198] Consequentemente, as modificações de Fc da presente invenção podem ser combinadas com as modificações de Fc que são conhecidas aumentar a afinidade de Fc para FcRn (ver, por exemplo, as referências citadas na parte do presente pedido dedicado à descrição da técnica relacionada).

[199] Alternativamente, as modificações de Fc podem ser combinadas com outras modificações de Fc que incluem mas não limitam-se a modificações que alteram a função atuadora ou a interação com um ou mais ligandos de Fc. Como uma consequência, tais variantes podem apresentar uma ligação aumentada a FcRn combinado com uma ligação alterada a um ligando de Fc (outro que não FcRn) e/ou uma função atuadora alterada em comparação com o polipeptídeo precursor.

[200] Os ligandos de Fc incluem mas não limitam-se a FcyRs (receptores Fcgama), Clq, C3, manano que liga lectina, receptor de manose, proteína A estafilocócica, proteína G estreptocócica e FcyRs virais. Os ligandos de Fc também incluem homólogos de receptores de Fc (FcRH), que são uma família de receptores de Fc que são homólogos ao FcgamaRs (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136).

[201] Por "função atuadora" como usado neste é entendido um evento bioquímico ou celular que resulta da interação de uma região Fc de anticorpo com um receptor Fc ou ligando. As funções atuadoras incluem mas não limitam-se a ADCC (Citotoxicidade mediada por Célula Dependente de Anticorpo), ADCP (Fagocitose mediada por Célula Dependente de Anticorpo) e CDC (Citotoxicidade Dependente de Complemento).

[202] As variantes da presente invenção abrangem qualquer polipeptídeo que compreende uma região Fc e que apresenta uma afinidade de ligação aumentada para FcRn em comparação com seu polipeptídeo precursor com a condição de que o dito polipeptídeo difere de seu polipeptídeo precursor em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido ou combinação de modificações de aminoácido na região Fc. As modificações e as combinações de modificações de aminoácido de interesse são aqueles descritos acima quando dá-se características gerais das variantes de acordo com a invenção.

[203] As variantes (e desta maneira os polipeptídeos precursores) incluem, mas não limitam-se a, anticorpos, proteínas de fusão de Fc, conjugados de Fc, Fc isolado e seus fragmentos respectivamente. Em particular, as variantes podem ser uma proteína de ligação contendo Fc. Em outras palavras, as variantes que compreendem (i) uma variante de Fc e (ii) um domínio de polipeptídeo de ligação que é capaz de ligar especificamente a uma dada molécula.

[204] Em uma forma de realização, a variante de polipeptídeos da invenção é selecionada do grupo que consiste de variante de proteínas de fusão de Fc e variantes conjugadas com Fc. A proteína de fusão de Fc e os conjugados de Fc consistem de uma região Fc ligada a um parceiro. A região Fc pode ser ligada a seu parceiro com ou sem um espaçador.

[205] De acordo com a presente invenção, uma proteína de fusão de Fc é uma proteína codificada por um gene simples e compreende uma proteína, um polipeptídeo ou um peptídeo pequeno ligado a uma região de Fc. Uma proteína de fusão de Fc opcionalmente compreende um espaçador de peptídeo. Virtualmente, qualquer proteína ou molécula pequena pode ser ligada a regiões de Fc para gerar uma fusão de Fc. Os parceiros de fusão de proteína podem incluir, mas não limita-se à região variável de qualquer anticorpo, um polipeptídeo derivado de um região variável de qualquer anticorpo, a região de ligação alvo de um receptor, uma molécula de adesão, um ligando, uma enzima, uma citocina, uma quimiocina ou alguma outra proteína ou domínio de proteína. Em particular, a proteína de fusão de Fc pode ser uma imunoadesina isto é, proteína semelhante a anticorpo que combina o domínio de ligação de uma proteína de uma proteína de "adesão" heteróloga (isto é, receptor, ligando ou enzima) com um fragmento de domínio constante de imunoglobulina (isto é, uma região Fc) (ver, para uma revisão sobre immunoadesinas, Ashkenazi A, Chamow SM. 1997, Curr Opin Immunol.;9(2):195-200).

[206] Os parceiros de fusão de peptídeo pequenos podem incluir, mas não limitar-se a qualquer agente terapêutico que direcione a fusão de Fc a um alvo terapêutico. Tais alvos podem ser qualquer molécula, preferivelmente, um receptor extracelular que está implicado na doença.

[207] De acordo com a presente invenção, um conjugado Fc resulta da ligação química de uma região de Fc com um parceiro conjugado. O parceiro conjugado pode ser proteináceo ou não proteínáceo. A reação de ligação em geral usa grupos funcionais em uma região Fc e no parceiro conjugado. Vários ligantes são conhecidos na técnica por serem apropriados para a síntese de conjugado; por exemplo, ligantes homo- ou hetero- bifuncionais são bem conhecidos na técnica (ver, Pierce Chemical Company catalog, 2005-2006, technical section on cross-linkers, págians 321-350, incorporados neste por referência.

[208] Os parceiros conjugados adequados incluem, mas não limitam- se a, polipeptídeos terapêuticos, rótulos (para o exemplo de rótulos, ver ainda abaixo), medicamentos, agentes citotóxicos, medicamentos citotóxicos (por exemplo, agentes quimioterapêuticos), toxinas e fragmentos ativos de tais toxinas. As toxinas adequadas e seus fragmentos correspondentes incluem, mas não limitam-se a, cadeia de dipfteria A, cadeia de exotoxina A, cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, curcina, crotina, fenomicina, enomicina e outros. Um agente citotóxico pode ser qualquer radionuclídeo que pode ser diretamente conjugado com a variante de Fc ou sequestrado por um agente quelante que é covalentemente ligado à variante de Fc. Nas formas de realização adicionais, os parceiros conjugados podem ser selecionados do grupo que consiste de caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina, maitansina e duocarmicinas e análogos; (para o último, ver U.S. 200310050331, incorporado desse modo por referência em sua totalidade).

[209] Tais variantes de interesse podem ter uma ligação aumentada a FcRn em pH diminuído (por exemplo, em tomo do pH 6) e substancialmente a ligação não modificada em pH mais alto (por exemplo, em tomo do pH 7,4). De interesse particular são proteína de fusão de Fc e variantes conjugadas de Fc que apresentam vidas médias in vivo aumentadas em comparação com os polipeptídeos precursores.

[210] Em uma forma de realização preferida, a variante de polipeptídeo da presente invenção é um anticorpo de variante de um anticorpo precursor. O termo "anticorpo" é usado neste no sentido mais amplo. De acordo com a presente invenção, "anticorpo" refere-se a qualquer polipeptídeo que pelo menos compreende (i) uma região de Fc e (ii) um domínio de polipeptídeo de ligação derivado de um domínio variável de uma imunoglobulina. O dito domínio de polipeptídeo de ligação é capaz de ligar especificamente um dado antígeno alvo ou um grupo de antígenos alvo. Um domínios de polipeptídeo de ligação que deriva-se de uma região variável de uma imunoglobulina compreende pelo menos um ou mais CDRs. Neste, os anticorpos incluem, mas não são limitados a, imunoglobulinas de comprimento total, anticorpos monoclonais, anticorpos multi-específicos, proteína de fusão Fc que compreende pelo menos uma região variável, anticorpos sintéticos (algumas vezes referido aqui como "miméticos de anticorpo"), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos totalmente humanos. Os anticorpos também abrangem as proteínas de fusão de anticorpo, conjugados de anticorpo e fragmentos e cada um respectivamente. Consequentemente um anticorpo da variante da invenção compreende, em sua região Fc, pelo menos uma modificação de aminoácido ou combinação de modificação citado acima que aumenta sua afinidade de ligação por FcRn em comparação com seu anticorpo precursor. De interesse particular são as variantes de anticorpos que apresentam a afinidade de ligação aumentada a FcRn no pH inferior (por exemplo a cerca de pH 6) e tem substancialmente ligação não modificada no pH maior (por exemplo, a cerca de pH 7,4). Além disso, de interesse particular são as variantes de anticorpos que tem aumentado as vidas médias in vivo como comparado aos polipeptídeos precursores.

[211] Em uma forma de realização, um anticorpo da variante da invenção é selecionado do grupo que consiste de variantes de anticorpos de comprimento total precursor. Para "anticorpos de comprimento total" neste é entendido a estrutura que constitui a forma biológica natural de um anticorpo, incluindo regiões variáveis e constante. O polipeptídeo precursor de um variante de anticorpo de comprimento total da presente invenção pode ser um anticorpo de tipo selvagem, um mutante de um anticorpo de tipo selvagem (por exemplo, que compreende as modificações pré-existentes), uma versão projetada de um anticorpo de tipo selvagem (por exemplo, por exemplo um anticorpo quimérico, humanizado ou um anticorpo totalmente humano, ver ainda abaixo), esta lista não sendo limitante. A estrutura de um anticorpo de comprimento total é geralmente um tetrâmero exceto para alguns mamíferos tal como lhamas e camelos em que algumas imunoglobulinas são dímeros. Cada tetrâmero é tipicamente composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 50 a 70 kDa).

[212] Exemplos de anticorpos de comprimento total são imunoglobulinas humanas que abrangem as classes IgM, IgD, IgG, lgA e lgE.

[213] Nas formas de realização preferidas, a dita variante de anticorpo de comprimento total é selecionado do grupo que consiste de variantes de IgGs.

[214] Em uma forma de realização preferida, a dita variante de anticorpo de comprimento total é selecionada do grupo que consiste de variantes de IgG1, IgG2, lgG3 e IgG4 humano com a condição de que a dita sequência de região Fc da dita variante não é SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4.

[215] A dita variante de IgG compreende uma ou mais modificações de aminoácido em comparação com seu IgG precursor, as ditas uma ou mais modificações ou combinações das modificações de aminoácido são aquelas previamente descritas na presente especificação quando geralmente definem as variantes de um polipeptídeo que compreende uma região de Fc e tendo uma ligação aumentada a FcRn em comparação com o polipeptídeo precursor correspondente.

[216] Em uma outra forma de realização, a dita variante de anticorpo é selecionada do grupo que consiste de proteína de fusão Fc que compreende um domínios de polipeptídeo de ligação derivado de um domínio variável de uma imunoglobulina. De interesse particular são os anticorpos que compreendem (a) uma variante de Fc das invenções e (b) um dos seguintes domínios de polipeptídeo de ligação derivados de um região variável de uma imunoglobulina (isto é, que compreende pelo menos um CDR): (i) o fragmento Fab que consiste de domínios VL, VH, CL e CHI, (ii) o fragmento Fd que consiste dos domínios VH e CHI, (iii) o fragmento que consiste dos domínios VL e VH de um anticorpo simples; (iv) regiões CDR isoladas, (v) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados (vi) moléculas Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL são ligados por um ligante de peptídeo que permite os dois domínios para associar para formar um local de ligação de antígeno, (vii) cadeia simples biespecífica Fv e (viii) "diacorpos" ou "triacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos pela fusão do gene, esta lista não sendo limitante.

[217] Em uma outra forma de realização, o anticorpo é um minicorpo. Os minicorpos são anticorpos minimizados semelhantes as proteínas que compreendem um scFv unido a um domínio CH3 (Hu et al., 1996, Câncer Res. 56:3055-3061, incorporado por referência neste em sua totalidade). Em alguns casos, o scFv pode ser unido a uma região Fc de comprimento total (De Lorenzo et ai., 2005, Carcinogenesis 26:1890-1895, incorporado por referência neste em sua totalidade) e também pode incluir a região de junta ou fragmento deste.

[218] Em uma forma de realização, os anticorpos da invenção são selecionados do grupo de anticorpos multiespecíficos e notavelmente a partir do grupo de anticorpos biespecíficos que são algumas vezes referidos como "diacorpos". Estes anticorpos ligam-se a dois (ou mais) antígenos diferentes. Os diacorpos podem ser fabricados em uma variedade. das maneiras conhecidas na técnica (Holliger e Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449, incorporado por referência neste em sua totalidade), por exemplo, quimicamente preparados ou derivados de hibridomas.

[219] Em algumas formas de realização, os componentes de estrutura das variantes de anticorpos podem ser uma mistura a partir das espécies diferentes. Tal variante de anticorpo pode ser um anticorpo quimérico e/ou um anticorpo humanizado. Em geral, ambos "anticorpos quiméricos" e "anticorpos humanizados" refere-se aos anticorpos que combinam as regiões de mais do que uma espécie. Por exemplo, os "anticorpos quiméricos" tradicionalmente compreendem as regiões variáveis de um animal não humano, geralmente o camundongo (ou rato, em alguns casos) e as regiões constantes de um humano. Para mais partes, os anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos que contém a sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Geralmente, em um anticorpo humanizado, o anticorpo inteiro, exceto os CDRs, é codificado por um polinucleotídeo de origem humana ou é idêntico a uma anticorpo humano exceto dentro de seus CDRs. Os CDRs, alguns ou todos de que são codificados pelos ácidos nucleicos originam-se em um organismo não humano, são enxertados na estrutura lâmina-beta de uma região variável de anticorpo humano para criar um anticorpo, a especificidade de que é determinado pelos CDRs enxertados. A criação de tais anticorpos é descrito em, por exemplo, WO 92/11018; fones, 1986, Nature 321:522-525; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536, todos incorporados por referência neste em sua totalidade. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, tipicamente aquele de uma imunoglobulina humana e deste modo compreenderá uma região humana Fe. Os anticorpos humanizados também podem ser gerados usando os camundongos com um sistema imune geneticamente projetado (Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654, incorporado por referência neste em sua totalidade). Uma variedade de técnicas e métodos para a humanização e reformação dos anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica (ver Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization ofMonoclonal Antibodies, Molecular Biology ofB Cells, 533- 545, Elsevier Science (USA) e referências citadas neste, todos incorporados por referência em sua totalidade). Os métodos de humanização incluem mas não são limitados aos métodos descritos em fones et ai., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sei, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sei USA 89:4285-9; Presta et ai., 1997, Câncer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4181- 4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8, todos incorporados por referência em sua totalidade. Humanização ou outros métodos de redução da imunogeneicidade das regiões variáveis não humanas podem incluir os métodos de formação de novas superficies, como descrito por exemplo em Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:969-973, incorporado por referência neste em sua totalidade.

[220] Em uma forma de realização, a dita variante de anticorpo é um anticorpo totalmente humano com pelo menos uma modificação de aminoácido como resumido neste. "Anticorpo totalmente humano" ou "anticorpo humano completo" refere-se a um anticorpo totalmente que compreende as sequências que originam-se a partir dos genes humanos. Em alguns casos este pode ser anticorpos humanos que tem a sequência do gene de um anticorpo derivado de um cromossomo humano com as modificações resumidas neste. Alternativamente, os componentes do anticorpo podem ser humanos mas não serão derivados de um gene simples. Deste modo, por exemplo, CDRs humanos a partir de um anticorpo pode ser combinado com as sequências, tal como sequências de estrutura, de um ou mais anticorpos humanos. Por exemplo, uma variedade das sequências das linhas germinativas podem ser combinadas para formar um anticorpo humano ou estrutura humana (por exemplo para uso nas sequências quiméricas ou humanizadas como resumido abaixo), bem como Pedido de Patente U.S. Ser. N° 11/022.289, incorporado neste por referência em sua totalidade.

[221] Em certas formas de realização, a variante de anticorpo da invenção é selecionada do grupo que consiste de IgGs quiméricos, IgGs humanizados e IgGs totalmente humanos.

[222] Modificações covalentes de anticorpos também são incluídas dentro do escopo desta invenção e são geralmente, mas não sempre, feito pós-tradução. Tais modificações incluem, mas não são limitados a, glicosilações, rotulação e conjugação.

[223] Consequentemente, em algumas formas de realização, as variantes de polipeptídeo descritas neste pode ser modificadas para incluir um ou mais glicoformas projetadas. Pela "glicoforma projetada" como usado neste é significado uma composição de carboidrato que é covalentemente ligada ao polipeptídeo que compreende a variante Fc, em que a dita composição de carboidrato difere-se quimicamente daquele de uma origem de polipeptídeo. As glicoformas projetadas podem ser úteis por uma variedade de propósitos, incluindo mas não limitado a função efetiva de redução ou intensificação. As glicoformas projetadas podem ser ligadas em qualquer aminoácido da sequência de variante. Em uma forma de realização preferida, as ditas glicoformas são ligadas nos aminoácidos da região Fc.

[224] As glicoformas projetadas podem ser geradas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica (Umafía et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; Patente U.S. N°. 6.602.684; Ser. U.S. N°.10/277.370; 10/113.929; WO00/61739AI; WO 0I/29246AI; WO02/31140AI; WO 02/30954Al, WO 01/77181, todos os incorporados por referência em sua totaIidade; (PoteIIigent® technoIogy [Biowa, Inc., Princeton, N.J.]; tecnoIogia de projeção de gIicosiIação GIycoMAb® [GIycart BiotechnoIogy AG, Zuerich, SwitzerIand]). Muitas destas técnicas são baseadas no controIe do níveI de oIigossacarídeos fucosiIados e/ou de divisão que são covaIentemente Iigados à região Fc, por exempIo peIa expressão da variante de anticorpo em vários organismos ou Iinhas ceIuIares, projetadas ou de outra maneira (por exempIo céIuIas Lec-13 CHO ou céIuIas YB2/0 de hibridoma de rato), peIas reguIação das enzimas envoIvidas no caminho de gIicosiIação (por exempIo FUT8 [aI,6-fucosiItranserase] e/ou 1-4-N-acetiIgIucosaminiItransferase III [GnTIII]), ou peIa modificação de carboidratos após a variante de anticorpo ser expressada.

[225] AIternativamente, a gIicoforma projetada pode referir a variante de anticorpo que compreende o carboidrato diferente ou oIigossacarídeo. Como conhecido na técnica, as origens de gIicosiIação podem depender de ambas sequências de proteína (por exempIo, a presença ou ausência dos resíduos de aminoácidos de gIicosiIação particuIares, descrito abaixo), ou a céIuIa hospedeira ou organismo em que a proteína é produzida. Sistemas de expressão particuIares são descritos abaixo.

[226] GIicosiIação de poIipeptídeos é tipicamente Iigado por N ou Iigado por O. O Iigado por N refere-se ao Iigamento da porção de carboidrato a cadeia secundária de um resíduo de asparagina. As sequências de tri- peptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é quaIquer aminoácido exceto proIina, são as sequências de reconhecimento para Iigação enzimática da porção de carboidrato à cadeia secundária de asparagina. Deste modo, a presença destas sequências de tri-peptídeos em um poIipeptídeo cria um IocaI de gIicosiIação potenciaI. A gIicosiIação Iigado por O refere-se a Iigação de um dos açúcares de N-acetiIgaIactosamina, gaIactose, ou xiIose, a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5- hidroxiproIina ou 5-hidroxiIisina também pode ser usado.

[227] Adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente acompanhado pela alteração da sequência de aminoácido tal que este contém uma ou mais das sequências de tri-peptídeos descritas acima (pelos locais de glicosilação ligados por N). A alteração também pode ser feita pela adição de, ou substituição por, uma ou mais serina ou resíduos de treonina à sequência de partida (pelos locais de glicosilação ligados por O). Para facilitar, a sequência de aminoácido de anticorpo é preferivelmente alterado através das mudanças ao nível de DNA, particularmente pela mutação de DNA codificado pelo polipeptídeo alvo nas bases pré- selecionadas tal que os códons são gerados que traduzirão nos aminoácidos desejados.

[228] Outros meios de aumentar o número de porções de carboidrato no anticorpo é pela ligação enzimática ou química de glicosídeos da proteína. Estes procedimentos são vantajosos em que estes não requerem produção da proteína em uma célula hospedeira que tem capacidade de glicosilação ligada por N- e O. Dependendo do modo de ligação usado, os açúcares podem ser ligados a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livre, (c) grupos de sulfidrila livres tal como aqueles de cisteína, (d) grupos de hidroxila livres tal como aqueles de serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos tal como aqueles de fenilalanina, tirosina, ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos são descritos em WO 87/05330 publicado em 11 de Setembro de 1987 e em Aplin e Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306.

[229] A remoção das porções de carboidrato presente no anticorpo de partida pode ser acompanhado quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer a exposição da proteína ao composto do ácido trifluorometanossulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem de mais ou todos os açúcares exceto o açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixa o polipeptídeo intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 and by Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. A clivagem enzimática de porções de carboidrato em polipeptídeos pode ser atingida pelo uso de uma variedade das endo- e exo-glicosidases como descrito por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. A glicosilação no local de glicosilação potencial pode ser evitada pelo uso do composto de tunicamicina como descrito por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. A Tunicamicina bloqueia az formação de ligações de proteína-N-glicosídeo.

[230] Em algumas formas de realização, a variante de anticorpo da invenção é selecionada do grupo que consiste de IgGs quiméricos, IgGs humanizados e IgGs totalmente humanos que compreende as glicoformas projetadas.

[231] Em uma forma de realização alternativa, a modificação covalente da variante de anticorpo da invenção compreende a adição de um ou mais rótulos. Em alguns casos, estes são considerados as fusões de anticorpo. O termo "grupo de rotulação" significa qualquer rótulo detectável. Em algumas formas de realização, o grupo de rotulação é ligado ao anticorpo por intermédio dos membros espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para as proteínas de rotulação são conhecidos na técnica e podem ser usados na realização da presente invenção.

[232] Em geral, os rótulos divergem em uma variedade das classes, dependendo do ensaio ou no procedimento diagnóstico em que estes serão detectados: a) rótulos isotópicos, que podem ser isótopos radioativos ou pesados; b) rótulos magnéticos (por exemplo, partículas magnéticas); c) porções ativas redox; d) pigmentos ópticos; grupos enzimáticos (por exemplo peroxidase de rábano silvestre, B-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina); e) grupos biotinilados; e f) epítopos de polipeptídeo pré-determinado reconhecidos por repórter secundário (por exemplo, sequências de pares de zíper de leucina, locais de ligação para os anticorpos secundários, domínios de ligação metálico, rótulos de epítopo, etc.).

[233] Os rótulos específicos incluem pigmentos ópticos, incluindo, mas não limitado a, cromofóros, fósforos e fluorofóros, com o último sendo específico em muitos exemplos. Os fluorofóros podem ser "moléculas menores" fluorescentes, ou proteínas fluorescentes.

[234] Em outra forma de realização, a variante de anticorpo da presente invenção pode ser fundido a ou conjugado a uma proteína ou uma molécula menor que não são usados como um grupo de rotulação como descrito acima. Virtualmente qualquer proteína ou molécula menor pode ser ligada a um anticorpo. Parceiros de fusão de proteína podem incluir, mas não são limitados a, a região de ligação alvo de um receptor, uma molécula de adesão, um ligando, uma enzima, uma citocina, uma quimiocina, ou alguma outra proteína ou domínio de proteína. As moléculas menores incluem, mas não são limitados a medicamentos, agentes citotóxicos (por exemplo, agentes quimioterapêuticos), toxinas ou fragmentos ativos de tais toxinas.

[235] Como descrito acima, a variante de anticorpo da invenção é capaz de ligar-se especificamente a um antígeno alvo ou um grupo de antígenos alvos. Pelo "antígeno alvo" como usado neste é significado a molécula que é ligada especificamente pela região variável de um anticorpo dado ou imunoglobulina. Um antígeno alvo pode ser uma proteína, um carboidrato, um lipídeo, ou outro composto químico.

[236] A escolha do antígeno adequado depende da aplicação desejada. Virtualmente, qualquer antígeno pode ser alvejado, por exemplo proteínas de membrana que compreende mas não limitado ao antígeno RhD, CD3, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD32B, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD71 (receptor de transferrina), CD80, CD86, CTLA-4, CD147, CD160, CD224, receptores de fator de desenvolvimento semelhantes aquele que pertence à família ErbB de receptores ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4 (EGFR, HER2/neu, HER3, HER4), VEGF-Rl, VEGF-R2, IGF-Rl, PlGF-R, moléculas MHC classe I e MHC classe II, por exemplo HLA-DR, receptores de interleucina semelhante a IL-lR, IL-2R alfa, IL-2R beta e IL-2R gama, IL-6R, receptores de hormônio semelhantes ao receptor de tipo II de substância inibidora Müllerian, receptor LDL, NKp44L, receptores de quimiocina semelhantes a CXCR4 e CCR5, integrinas, moléculas de adesão semelhantes CD2, ICAM, EpCAM. As proteínas de membrana também incluem marcadores de tumor semelhantes a GD2, GD3, CA125, MUC-1, MUC-16, antígeno carcinoembriônico (CEA), Tn, glicoproteína 72, PSMA, HMW-MAA. Os anticorpos da invenção também podem alvejar as proteínas solúveis, incluindo mas não limitado a citocinas (por exemplo IL-1 beta, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23, TGF beta, TNF alfa, IFN gama), quimiocinas, fatores de desenvolvimento semelhantes a VEGF-A, EGF, PlGF, PDGF, IGF, hormônios, toxinas bacterianas e toxinas de outra origem semelhante a toxina botulinus, ricina, antígeno protetor B. anthracis, fator letal B. anthracis, fator edema B. anthacis, shigatoxinas 1 e 2, antígenos virais de vírus diferentes, por exemplo vírus patogênicos, um anticorpo inibidor, incluindo um anticorpo inibidor FVIIL.

[237] Em uma forma de realização preferida, a variante da presente invenção pode alvejar CD20. Neste caso, o polipeptídeo de origem pode ser selecionado de: EMAB6 ou EMAB603 (ver WO2006064121), RITUXIMAB (Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche) (ver por exemplo Patente U.S. N°.5.736.137, incorporado por referência em sua totalidade), HUMAX®- CD20, descrito na Patente U.S. N° 5.500.362 incorporado por referência em sua totalidade, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel) e PRO70769 (PCT/US2003/040426, intitulado "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof', incorporado por referência em sua totalidade).

[238] Em outra forma de realização, a variante da presente invenção pode alvejar o antígeno RhD. Neste caso, o polipeptídeo de origem pode ser selecionado de EMAB2 (ver FR 03 12 229), Sym00l (Symphogen AIS) ou MonoRho (ZLB, Zurich).

[239] O polipeptídeo de origem também pode ser Avastin® (anti- VEGF), Remicade® (anti-TNF-a), Erbitux®, Vectibix® (anti-EGFR), Tysabri® (cadeia anti-alfa4 de integrina), Herceptin® (anti-HER2/neu), a lista não sendo limitante.

[240] A presente aplicação também fornece as variantes que apresentam uma ligação aumentada a FcRn combinado com outra propriedade otimizada selecionada de uma variedade das propriedades relevantes terapeuticamente bem conhecidas. A propriedade mais preferida que pode ser otimizada é a vida-média in vivo. Para apresentar uma vida- média in vivo aumentada, a variante deve exibir a afinidade de ligação aumentada a FcRn no pH inferior, tal como o pH associado com endossomos, por exemplo pH 6,0, enquanto mantém a afinidade reduzida no pH maior, tal como 7,4., para permitir a ligação aumentada a FcRn nos endossomos mas as taxas de liberação normais (Dall'Acqua et al., 2002, J. Immunol. 169: 5171-5180; Gurbaxani et al., 2006, Mol Immunol. 43(9):1462- 73).

[241] Similarmente, estas variantes com tal ligação FcRn modulada pode ser opcionalmente tem outras propriedades desejadas, tal como ligação FcyR modulada. Em uma forma de realização adicional, as variantes são otimizadas para possuir a afinidade intensificada por um FcyR de ativação humana, preferivelmente FcyRIIIa em adição do perfil de ligação FcRn. Em uma forma de realização alternativa, as variantes são otimizadas para ter a afinidade aumentada por FcRn e afinidade aumentada ou diminuída por FcyR humano, incluindo mas não limitado a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc e FcyRIIIb incluindo suas variações alélicas. Nas formas de realização alternativas, as variantes da presente invenção pode ter opcionalmente funções efetivas aumentadas (ou diminuídas) bem como uma vida-média de soro aumentado. Em formas de realização particularmente preferidos, uma variante da invenção pode ter a atividade ADCC aumentada e/ou ligação aumentada a um FcyR bem como vida média de soro aumentada como comparado a sua origem de polipeptídeo. Em outras formas de realização, a variante da invenção ainda pode ter uma atividade CDC aumentada como comparado a sua origem de polipeptídeo.

[242] As variantes podem observar os usos em uma ampla faixa de produtos. Em uma forma de realização a variante é um terapêutico, um diagnóstico, ou um reagente de pesquisa, preferivelmente um terapêutico.

[243] Visto que a ligação de apresentação aumentada a FcRn, a variante da invenção é antecipada para ter vida média in vivo mais longa, mais precisamente vida média de soro in vivo mais longa do que seus polipeptídeos de origem. Como uma consequência, tais variantes tem aplicações úteis como substitutos de polipeptídeo de origem quando o polipeptídeo de origem é tão rapidamente limpo a partir da circulação sanguínea ou para uso no tratamento de doenças crônicas ou de termo longo que requer os princípios ativos de vida média longa.

[244] Quando as variantes são selecionadas do grupo de anticorpos, este pode observar o uso na composição de anticorpo que é monoclonal ou policlonal. Em uma forma de realização preferida, a dita variante de anticorpo são usadas para manter as células alvos que conduzem o antígeno alvo, por exemplo células cancerígenas. Em uma forma de realização alternativa, as variantes são usadas para bloquear, antagonizar ou agonizar o antígeno alvo, por exemplo para antagonizar um receptor de citocina ou citocina, para neutralizar um agente infeccioso semelhante a bactéria ou um vírus ou uma toxina, por exemplo, uma toxina bacteriana. Em uma forma de realização alternativamente preferida, as variantes são usadas para bloquear, antagonizar ou agonizar o antígeno alvo e matar as células alvos que conduzem^o antígeno alvo.

[245] Em uma forma de realização preferida, um anticorpo variante é administrado a um paciente para tratar um distúrbio relacionado ao anticorpo. Um "paciente" para os propósitos da presente invenção incluí humanos e outros animais, preferivelmente mamíferos e mais preferivelmente humanos. Pelo "distúrbio relacionado ao anticorpo" ou "distúrbio responsivo de anticorpo" ou "condição" ou "doença" neste são para significa um distúrbio que pode ser melhorado pela administração de uma composição farmacêutica que compreende uma variante da presente invenção. Os distúrbios relacionados ao anticorpo incluem mas não são limitados a doenças autoimunes, doenças imunológicas, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, distúrbios neurológicos, dor, doenças pulmonares, condições hematológicas, condições fibróticas ou doenças oncológicas e neoplásticas incluindo câncer. Para "câncer" e "cancerígeno" neste refere-se ou descreve a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo desenvolvimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem mas não são limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluindo liposarcoma), tumores neuroendocrina, mesotelioma, schwanoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma e leucemia e nocividades linfóide.

[246] Outras condições que podem ser tratadas incluem mas não são limitados a artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença de Sjorgren, esclerose múltipla, espondilite anquilosante, asma, alergia e condições alergênicas, doença hospedeira versus enxerto e outros.

[247] Um objetivo adicional da invenção é para fornecer tais composições farmacêuticas que compreendem uma dita variante. As ditas formulações são preparadas pela mistura de variante de polipeptídeo tendo o grau desejado de pureza com carregador farmaceuticamente aceitável, fisiologicamente aceitável opcional, excipientes ou estabilizadores na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. (Remington's Pharmaceutical Sciences 16° edição, Osol, A. Ed., 1980, incorporado por referência neste em sua totalidade). Tais composições farmacêuticas são destinadas para tratamento de um paciente em necessidade.

[248] A fim de tratar um paciente em necessidade, uma dosagem terapeuticamente efetiva de uma variante pode ser administrada. Para "dosagem terapeuticamente efetiva" neste é significado uma dose que produz os efeitos pelo qual este é administrado. A dosagem exata dependerá do propósito do tratamento e será determinado por uma pessoa habilitada na técnica usando as técnicas conhecidas. As dosagens podem variar de 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal ou mais, por exemplo 0,1, 1,0, 10, ou 50 mg/kg de peso corporal, com 1 a 1O mg/kg sendo preferido. Como conhecido na técnica, os ajustes para a degradação de proteína, liberação localizada versus sistêmica e taxa de nova síntese de protease, bem como a idade, peso corporal, sáude geral, sexo, dieta, tempo de administração, interação de medicamento ou a gravidade da condição pode ser necessária e será determinada com a experimentação de rotina por aquela pessoa habilitada na técnica.

[249] A administração da composição farmacêutica que compreende uma variante pode ser feita em uma variedade de maneiras, incluindo, mas não limitado a, oralmente, subcutaneamente, intravenosamente, parenteralmente, intranasalmente, intraaorticamente, intraocularmente,retalmente, vaginalmente, transdermalmente, topicamente (por exemplo, géis, unguentos, loções, cremes, etc.), intraperitonealmente, intramuscularmente, intrapulmonar.

[250] O terapêutico descrito neste pode ser administrado com outros terapêuticos concomitantemente, isto é, os terapêuticos descritos neste podem ser co-administrados com outras terapias ou terapêuticos, incluindo por exemplo, molécula menores, outros biológicos, terapia de radiação, cirurgia, etc.

[251] Outro objetivo da presente invenção é para fornecer os ácidos nucleicos isolados que codificam as variantes de acordo com a invenção. Mais frequentemente, o DNA que codifica o polipeptídeo de origem é disponível ou pode ser obtido. Consequentemente, o DNA que codifica uma variante de interesse pode ser gerado por alterar o DNA que codifica o polipeptídeo de origem graças a uma variedade de métodos conhecidos na técnica anterior. Estes métodos incluem, mas não são limitados a mutagênese direcionada ao local, mutagênese aleatória, mutagênese PCR e mutagênese de cassete. As substituições de aminoácidos são preferivelmente feitas pela mutagênese direcionada ao local (ver, por exemplo, Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sei USA 82:488, que são neste incorporados por referência em sua totalidade).

[252] Alternativamente ou adicionalmente, a sequência de aminoácido desejada que codifica uma variante de polipeptídeo pode ser determinada e deste modo pode ser gerada sinteticamente prlos métodos bem conhecidos antes da técnica.

[253] Uma vez que os ácidos nucleicos codificados são obtidos, as variantes da presente invenção podem ser feitas por qualquer método conhecido na técnica. Em uma forma de realização, as sequências da variante (por exemplo sequências de variante lgG) são usadas para criar os ácidos nuclécidos que codificam as sequências membros e que então podem ser clonadas nas células hospedeiras, expressadas e analisadas, se desejado. Estas práticas são realizadas usando procedimentos bem conhecidos e uma variedade de métodos que podem observar o uso e são descritas em Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3° Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001) e Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons), ambos incorporados por referência em sua totalidade.

[254] Os ácidos nucleicos que codificam uma variante podem ser incorporados em um vetor de expressão a fim de expressar a proteína. Os vetores de expressão tipicamente incluem uma proteína operavelmente ligada, que é, colocada em uma relação funcional, com sequência reguladoras ou de controle, marcadores selecionáveis, qualquer parceiro de fusão e/ou elementos adicionais. Uma variante (por exemplo variantes lgG) da presente invenção pode ser produzida pela cultura de uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico, preferivelmente um vetor de expressão, contendo ácido nucleico que codifica uma variante, sob as condições apropriadas para induzir ou causar a expressão da proteína. Uma ampla variedade de linhas celulares hospedeiras apropriadas podem ser usadas, incluindo mas não limitado a células de mamíferos, bactéria, células de inseto e levedura. Por exemplo, uma variedade das linhas celulares de mamíferos que podem observar o uso são descritas no catálogo de linha celular ATCC, disponível de American Type Culture Collection. As células hospedeiras podem ser, mas não limitado a, YB2/0 (célula YB2/3HL.P2.Gll.lGAg.20, depósito ao American Type Culture Collection, ATCC n°CRL-1662), SP2/0, YE2/0, 1R983F, Namalwa, PERC6, linhas celulares CHO, particularmente CHO-K-1, CHO-Lecl0, CHO- Lecl, CHO- Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293- HEK, BHK, KGH6, NSO, SP2/0-Ag 14, P3X63Ag8.653, C127, JC, LA7, ZR-45-30, hTERT, NM2C5, UACC-812 e outros. Os métodos de introdução do ácido nucleico exógeno nas células hospedeiras são bem conhecidos na técnica e variarão com a célula hospedeira usada. Em uma forma de realização preferida da invenção, a variante é expressada na célula YB2/0 e é um anticorpo anti-CD20, ou um anticorpo anti-RhD.

[255] Além disso, uma variante de acordo com a presente invenção pode ser produzida por um animal não humano transgênico ou planta transgênica. Também, um animal não humano transgênico pode ser obtido pela injeção direta de um gene desejado em um ovo fertilizado (Gordon et al.,1980 Proc Natl Acad Sei U S A.;77:7380-4). Os animais não humanos transgênicos incluem camundongo, coelho, rato, cabra, vaca, gado ou ave e outros. Um animal não humano transgênico tendo um gene desejado pode ser obtido pela introdução do gene desejado em uma célula embriônica e preparação do animal por um método de quimera de agregação ou método de injeção de quimera (Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)). Exemplos de célula de haste embriônica incluem células de haste embriônicas de camundongo (Evans and Kaufman, 1981, Nature; 292:154-156), rato, cabra, coelho, macaco, ave, gado e outros. Além disso, um animal não humano transgênico também pode ser preparado usando uma técnica clonai no qual um núcleo em que um gene desejado é introduzido e é transplantado em um ovo enucleado (Ryan et ai., 1997 Science; 278: 873 - 876 ; Cibelli et ai., 1998 Science, 280 : 1256-1258). A variante de polipeptídeo pode ser produzida pela introdução de DNA que codifica uma molécula variante em um animal preparado pelo método acima e portanto para formar e acumular uma molécula variante no animal e então coletar uma variante de polipeptídeo a partir do animal. A variante de polipeptídeo pode ser feita a ser formado e acumulada no leito, ovo ou outros de animais.

[256] Outro objetivo da invenção é fornecer um método para a identificação de variantes Fc são variantes otimizadas isto é que tem uma ligação aumentada por um ligando Fc como comparado a uma região Fc de tipo selvagem correspondente. O dito método que compreende as etapas de:

[257] (i) geração de uma biblioteca de ácido nucleico que consiste de uma série de ácidos nucleicos que codifica as variantes Fe

[258] (ii) produção de uma variante Fcs pela expressão dos ácidos nucleicos compreendidos em uma dita biblioteca

[259] (iii) seleção entre uma variante Fcs produzida na etapa (ii), aqueles que são capazes de ligar-se ao ligando Fe

[260] (iv) medindo a propriedade de ligação de uma variante Fcs selecionada na etapa (iii) e aquele de um controle Fc para o ligando Fc e

[261] (v) seleção de uma variante Fcs que apresenta uma ligação aumentada para o ligando Fc como comparado ao dito controle Fc.

[262] As sequências de ácido nucleico compreendidas em uma dita biblioteca de ácido nucleico podem ser RNA ou DNA. Em uma forma de realização preferida, a dita biblioteca compreende as sequências de DNA que codificam as variantes Fc.

[263] O controle Fc é selecionado do grupo que consiste de regiões Fc de tipo selvagem e variantes Fc conhecidas que tem a propriedade de ligação para o ligando Fc igual ou maior do que aquele Fc de tipo selvagem.

[264] O ligando Fc pode ser selecionado de FcRn e Fe.gama.receptores, a lista não sendo limitante.

[265] Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos da biblioteca que codificam as variantes Fc podem ser gerados pela alteração da sequência de DNA codificada por Fc de tipo selvagem. Como usado neste, para "alterar a sequência de ácido nucleico" é significado uma introdução de mutações tal como inserções, anulações ou substituições de nucleotídeos em uma dada sequência de ácido nucleico. Tais mutações podem ser realizadas por método bem conhecidos antes da técnica. Estes métodos incluem, mas não são limitados a, mutagênese aleatória, mutagênese direcionada ao local, mutagênese PCR e mutagênese de cassete.

[266] Em uma forma de realização preferida, a biblioteca é gerada pela mutagênese aleatória com base no uso de uma ou mais polimerases de DNA de fidelidade inferior. Tal mutagênese aleatória é descrita no pedido PCT WO0238756 incorporado por referência em sua totalidade. Consequentemente, a biblioteca pode ser gerada pela mistura das sub- bibliotecas geradas com uma polimerase ou uma combinação especificada de polimerase como descrito no material e parte dos métodos para o exemplo da presente aplicação.

[267] Em outra forma de realização, a dita biblioteca de ácido nucleico é geradas pela alteração das sequências de DNA codificadas por um grupo de pré-variantes FC otimizadas usando um dos métodos mencionados acima. A mutagênese aleatória é preferivelmente usada. As variantes FC pré- otimizadas são variantes Fc que compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido e apresentam uma ligação aumentada para o ligando Fc como comparado ao Fc de tipo selvagem. As variantes FC pré-otimizadas tem preferivelmente 1 a 4 modificações de aminoácidos como comparado ao Fc de tipo selvagem. Tais variantes FC pré-otimizadas podem ser obtidos a partir da avaliação de uma biblioteca gerada pela mutação de um Fc de tipo selvagem. Este também refere-se às variantes Fc descritas antes da técnica (por exemplos ver acima da primeira parte da presente aplicação dedicada à descrição da técnica relatada). O grupo de variantes FC pré-otimizadas compreendem diversos polipeptídeos, mais preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 100 variantes pré-otimizadas.

[268] As bibliotecas geradas a partir das variantes pré-otimizadas capazes de selecionar mais variantes FC otimizadas. Para ilustração ver tabela da presente aplicação que mostra a afinidade de ligação das melhores variantes Fc selecionadas da avaliação de uma tal biblioteca.

[269] Etapa (ii) isto é a expressão dos variantes Fc podem ser realizados pelos métodos bem conhecidos usando as célula hospedeiras como previamente descritos. Em uma forma de realização preferida a biblioteca Fc é expressada na superficie de bacteriofagos (apresentação de fago) usando os procedimentos padrões (ver Smith, Science, 1985, 228: 1315).

[270] Etapa (iii) pode ser realizada pela geração de variantes Fc- complexos de ligando Fc e então separando as variantes ligadas Fc das variantes não ligadas Fc. A fim de realizar esta etapa de separação, o ligando Fc pode ser vantajosamente imobilizado em um suporte sólida ou deve ser capaz de ser imobilizado em um suporte sólido durante o processo da etapa (iii). Exemplos de tais procedimentos são descritos no Exemplo 1 da presente aplicação. A etapa (iii) preferivelmente compreende diversos ciclos de seleção que capacita identificar os ligandos Fc mais efetivos (para ilustração ver Exemplo 2).

[271] Na etapa (iv), as propriedades de ligação de variantes Fc para ligando Fc podem ser avaliadas pelos métodos bem conhecidos da técnica anterior. Por exemplo, uma pessoa habilitada na técnica pode realizar uma ELISA apropriada. A variante é selecionada se este sinal específico é pelo menos 1,2 vezes maior do que aquele de origem Fc. Os ensaios ELISA apropriados podem ser realizados no Fc isolado ou no Fc apresentado no fago como ilustrado no exemplo II e no exemplo IV da presente aplicação.

[272] Como uma alternativa ou para o propósito de confirmação, a pessoa habilitada na técnica pode determinar a dissociação constante usando os experimentos de ressonância de plasmon de superficie (SPR) como ilustrado no exemplo IV da presente aplicação. Se uma variante tem um dissociação constante 3 vezes menor do que aquela de origem Fc então a dita variante é selecionada na etapa (v).

[273] A presente invenção ainda é ilustrada sem ser limitada de maneira alguma pelos exemplos abaixo. EXEMPLOS EXEMPLO 1:

[274] Identificação de variantes Fc com ligação aumentada a FcRn como comparado ao Fc de tipo selvagem e caracterização de ligação das ditas variantes 1. Material e métodos 1.1. Expressão e purificação de FcRn humano

[275] A expressão .de FcRn humano solúvel usando o sistema de baculovírus foi realizado por GTP Technology (Labege, France) como previamente descrito (Popov et al., Mol. Immunol. 33:521-530 (1996)). A cDNA de cadeia a que codifica o peptídeo líder e domínios extracelulares (códons 1-290) foi rotulado, com uma sequência TEV e um rótulo de poliistidina 6 x. A cadeia a derivada e a cadeia de microglobulina J32 foram clonadas em pFastBacDual sob os promotores de poliedrina PIO e, respectivamente. Uma versão biotinilada de FcRn (FcRn-biot) foi preparada pela ligação química com o kit de rotulação de proteína FluoReporter® Biotin- XX, F2610 (Molecular Probes) de acordo com o protocolo do fabricante. Uma proteína de fusão também foi produzida contendo a cadeia de microglobulina J32 e a cadeia a fundida a parte do terminal amino da proteína de bacteriofago p3 e a proteína CVDE (FcRn-p3). Mais do que 90 % pura foram obtidas após sefarose IgG e etapas de purificação IMAC. 275.1. Construção de bibliotecas Fc

[276] O gene Fc humano que codifica os resíduos de aminoácidos 226-447 (índice EU como em Kabat) isto é polipeptídeo Fc, derivado de uma cadeia pesada IgGl humana (SEQ n° 1), (Poul MA et al., Eur. J. Immunol. 25(7): 2005-2009 (1995) foi clonado no vetor de fagomídeo pMG58 (pMG58_Fc226, Fig. 1) como um fragmento BamHI/EcoRI usando os protocolos PCR padrões. Um dito vetor é descrito na figura 1. diversas bibliotecas totalmente aleatórias foram geradas usando o procedimento MUTAGEN™ (WO0238756) que usa polimerase de DNA humano de fidelidade inferior (mutase) para introduzir as mutações aleatórias homogeneamente na sequência alvo total. Três mutases distintas (pol p, pol r e pol -e) foram usadas nas condições diferentes para criar as origens mutacionais complementares. Estas polimerases humanas foram produzidas e purificadas como previamente descrito (Mondon et al., Biotechnol J. 2: 76-82 (2007), Emond et al. Protein Eng. Des. Sel. 21: 267-274(2008)). 276.1. Mutagênese com o processo mutagen™

[277] O gene Fc humano (gene Fc) foi replicado duplo com as mutases usando o iniciador 5' MG 619: 5'-AGTACTGACTCTACCTAGGAT CCTGCCCACCGTGC-3' (SEQ ID N°5) e o iniciador 3' MG_621 5'- ACTGCTCGATGTCCGTACTATGCGGCCGCGAATTÇ-3' (SEQ ID N°6) (locais de restrição BamHI e EcoRJ são sublinhados e caracteres itálicos correspondem as caudas não específicas). Uma mistura contendo 0,6 μg do plasmídeo pMG58_Fc226 como modelo (Fc de tipo selvagem pela biblioteca Mutl ou variantes Fc para biblioteca Mut2), iniciadores MG_619 e MG_621 (250 nM cada) e o tampão de replicação apropriado (detalhado abaixo) foi tratado por 5 minutos a 95°C e imediatamente esfriado abaixo de 4°C para desnaturar os filamentos de DNA. Para pol p, o tampão de replicação foi de 50 mM de Tris HCl pH 8,8, 10 mM de MgCh, 10 mM de KCl, 1 mM de DTT e 1 % de glicerol (v/v). O tampão de replicação para pol f] (ou pol f] e pol t) foi 25 mM de Tris HCl pH 7,2, 5 mM de MgCh, 10 mM de KCl, 1 mM de DTT e 2,5 % de glicerol (v/v). Após a etapa de desnaturação, as replicações mutagênicas foram realizadas pela adição de 50 μM de dATP/dCTP, 100 μM de dTTP/dGTP e 1 μg de pol p ou 100 μM de dNTPs e 1 μg de pol f1 ( ou pol r, e pol t, 1 μg de cada mutase). A reação de replicação foi realizada a 37°C por duas horas. Os produtos de replicação foram então dessalinizados e concentrados nas colunas de microcon (Millipore). 277.1. Amplificação seletiva e clonagem e fragmentos mutados

[278] Os produtos de replicação previamente obtidos foram amplificados através de um PCR seletivo com iniciadores de cauda. Os iniciadores (MG_619 e MG_621) foram projetados com uma cauda que não é complementar ao modelo permitindo a amplificação específica dos fragmentos de DNA sintetizados pelas mutases. Uma fração dos produtos de replicação foi adicionada a uma mistura contendo o tampão PCR (20 mM de Tris-HCl pH 8,4, 50 mM de KCl), 1,5 mM de MgCh, 10 pmol dos iniciadores 5' e 3', 200 μM de dNTPs e 1,25 U de polimerase de DNA Platinum Taq (InvitroGen). Os ciclos PCR foram como seguem, primeiro ciclo: 2 minutos a 94°C, 10 segundos a 64°C, 30 segundos a 75°C, 1 minuto a 94°C e então 30 ciclos seletivos: 20 segundos a 94°C e 30 segundos a 75°C.

[279] Os produtos de replicação amplificados foram purificados em 1 % de gel de agarose (p/v), digeridos com enzimas de restrição BamHI e EcoRJ e clonados no vetor pMG58. As misturas de ligação foram transformadas nas células E. coli XLl-Blue eletrocompetentes e subsequentemente colocadas no meio sólido 2YT (16g/l peptonas, lOg/1 estrato de levedura, 5g/l de NaCl, 15g/l de ágar) suplementado com 100 μg/ml de ainpicilina e 1 % de glicose (p/v). Após o desenvolvimento, o número de colônias foi determinado para estimar o tamanho das bibliotecas e 96 clones por biblioteca foram aleatoriamente submetidos ao PCR e sequenciamento de DNA de rendimento alto. As células foram fragmentadas no meio 2YT com 15 % de glicerol, congeladas e mantidas a -80°C.

[280] Para o primeiro ciclo de mutagênese e avaliação (MS1), quatro bibliotecas diferentes foram construídas. Uma primeira biblioteca foi obtida usando pol no gene Fc de tipo selvagem e contendo clones 3,2 x 106 (denominado Mutl .1). O DNA destas primeira biblioteca foi usada para gerar a segunda e a terceira biblioteca, usando respectivamente pol (3,8 x 106 clones, Mutl.2) e pol 11 e -e ( clones 3,0 x 106 Mutl.3). Esta estratégia em duas etapas crescentes permitem aumentar a taxa de mutação. A quarta biblioteca foi gerada com polimerase I1 sozinha no gene Fc de tipo selvagem (clones 1,0 x 106 Mutl.4). Finalmente, estas quatro bibliotecas foram proporcionalmente misturas para obter a biblioteca final denominada Mutl, representando clones diferentes 1,1 x 107.

[281] Para o segundo ciclo de mutagênese e avaliação (MS2), duas bibliotecas diferentes foram construídas usando um grupo de DNA de 42 mutantes simples e duplos isolados durante MSl e tendo ligação FcRn melhorada por fogo-ELISA. Uma primeira biblioteca foi obtida usando pol β (clones 1,9 x 107, Mut2.1) e uma segunda biblioteca com pol 11 (clones 1 x 106 Mut2.2). Finalmente, estas duas bibliotecas foram proporcionalmente misturadas para obter a biblioteca final denominada Mut2, representando os clones diferentes 2 x 107. 281.1. Controle de qualidade das bibliotecas Fc pelo sequenciamento

[282] A qualidade das bibliotecas diferentes previamente geradas foi avaliada por PCR nas células para amplificar o gene Fc (com o iniciador 5' 5'- CAGGAAACAGCTATGACC-3' (SEQ 1D N°: 7) e o iniciador 3' 5'- TCACGTGCAAAAGCAGCGGC -3' (SEQ 1D N°:8) e sequenciamento de rendimento alto (com o iniciador 5' 5'- TGATTACGCCAAGCTTGC -3' (SEQ 1D N°:9). As sequências de 96 clones aleatoriamente selecionados em cada biblioteca (Mutl.1 a Mutl.4 e Mut2. l a Mut2.2) foram portanto determinadas. Finalmente, 35 clones da biblioteca unidos Mutl e 86 clones da biblioteca unida Mut2 também foram sequenciados para controlar a qualidade da biblioteca final antes do processo de seleção.

[283] As modificações das sequências mutadas foram analisadas usando o software proprietário MilleGen Mutanalyse4Fc adaptado pela molécula Fc de software Mutanalyse 2.5 previamente descrito (Mondon et al., Biotechnol J. 2: 76-82 (2007)). Esta análise confirma que as mutações são aleatoriamente distribuídas junto com o gene total, sem qualquer "ponto quente"

[284] Análise Mut1: a frequência de mutações da biblioteca Mutl é de 6,3 mutações por quilo base (kb), que significa 4,2 mutações por gene (666 nt). Entre estas mutações, 81,4 % são substituições, 16,8 % são anulações e 1,8 % de adições, estas duas últimas categorias introduzem a mudança de estrutura no gene. Quando considerando apenas as sequências na estrutura, a frequência de mutação é de 4,0 mutações por kb, isto é 2,7 mutações por gene (1 a 6 nucleotídeo mutados por gene). A análise de mutação também foi realizada no nível de proteína para determinar a parte ativa da biblioteca. Finalmente, a biblioteca Mutl contém 28,6 % de clones que expressam o fragmento de tipo selvagem (não mutados ou com mutações selecionadas), 40,0 % de clones contendo uma sequência fora da estrutura ou com um códon de interrupção (não expressado) e 31,4 % de clones com uma sequência mutada (variantes Fc). Estes últimos clones representam a parte ativa da biblioteca, que compreende 3,5 x 106 clones diferentes com a média de 2,3 aminoácidos mutados por molécula.

[285] Análise Mut2: a frequência de mutações da biblioteca Mut2 é de 4,5 mutações por quilo bases (kb), que significa 3,0 mutações por gene. Entre estas mutações, 96,3 % são substituições, 3,2 % são anulações e 0,5 % de adições. Quando considerando apenas as sequências na estrutura, a frequência de mutação é de 4,3 mutações por kb, isto é 2,9 mutações por gene (1 a 7 nucleotídeos mutados por gene). No nível de proteína, a biblioteca Mut2 contém 17,4 % dos clones expressando o fragmento de tipo selvagem (não mutado ou com mutações silenciosas), 9,3 % de clones contendo uma sequência fora da estrutura ou com um códon de interrupção (não expressado) e 73,3 % de clones com uma sequência mutada (variantes Fc). Estes últimos clones representam a parte ativa da biblioteca, que compreendem clones 1,5 x 107 diferentes com a média de 1,9 mutados aa por molécula. 11. Apresentação de expressão de fago das bibliotecas Fc e seleção de ligantes melhorados FcRn

[286] A biblioteca Fc foi expressada na superficie do bacteriofago M13 usando os procedimentos padrões (Smith GP, Science 228: 1315 (1985)). Bactéria E. coli XLl-Blue contendo a biblioteca Mutl (vetor pMG58) foi desenvolvida em 60 ml de 2YT suplementado com 100 μg/ml de ampicilina, 15 μg/ml de tetraciclina e 1 % de glicose (p/v) a 30°C, 230 rpm até OD600 nm = 0,6 é atingido. As células foram então infectadas com fago auxiliar M13 (M13KO7, Biolabs, razão de bactéria/fogo= 1/3) a 37°C por 20 minutos e produção Fc de fago foi continuado durante a noite a 26°C, 230 rpm em 2YT/Ampicilina/Glicose com IPTG 0,5 mM e canamicina 30 μg/ml. O dia seguinte, os fagos foram precipitados com PEG6000 usando protocolos padrões, recolocados em suspensão em 1 ml de tampão de fosfato pH6 (fosfato de sódio 100 mM, cloreto de sódio 50 mM pH6,0, denominado P6) e titulado pela infecção das células XLl-Blue. Três estratégias de seleção foram aplicadas usando as condições diferentes (Fig. 2) e 3 a 8 ciclos de seleção foram realizadas por estratégia (ver abaixo). 286.1. Seleções na fase sólida (estratégias 1 e 2) (ver figura 2A):

[287] Para as seleções de fase sólida, fagos 4 x 1011 em P6/5 % de leite desnatado/O, 1 % de Tween 20 foram incubadas em 8 reservatórios de imunoplacas Maxisorp previamente revestidas com 0,5 μg de neutravidina e 0,5 μg de FcRn biotinilado (estratégia 1) ou 0,5 μg de FcRn-p3 (estratégia 2) e bloqueado com 5 % de leite desnatado em P6. Após a incubação por 2 horas a 37°C, os reservatórios foram lavados 20 vezes com P6/0,1 % de Tween 20 e eluídos pela incubação em 100 μl de tampão de fosfato pH7,4 (fosfato de sódio 100 mM, cloreto de sódio 50 mM pH7,4)/reservatório por 2 horas a 37°C. Após titulação, os fagos eluídos foram usados para reinfectar 1O ml de bactéria exponencialmente de desenvolvimento XLl-Blue e subsequentemente colocado no meio 2YT sólido/ampicilina/glicose. O seguinte dia, as células foram fragmentadas no meio 2YT com 15 % de glicerol, congeladas e mantidas a -80°C até o próximo ciclo de seleção. II.2. Seleção na fase líquida (estratégia 3) (ver figura 2B):

[288] Para a seleção de fase líquida, os fagos 4 x 1011 foram primeiro incubados com 250 nM ou 100 nM de FcRn biotinilado em 1 ml de P6/5 % de leite desnatado/O, 1 % de Tween 20 por 1 hora em temperatura ambiente sob agitação baixa. As pérolas magnéticas revestidas por estreptavidina (Dynal), previamente bloqueada com 5 % de leite desnatado em P6 foram então adicionadas aos fagos por 30 minutos em temperatura ambiente. Os complexos de pérola-fago foram lavados 15 vezes com P6/0,1 % de Tween 20 usando um magneto (concentrador de partícula magnética, Dynal). Os fagos foram eluídos pela incubação em 500 μl de tampão de fosfato pH7,4 (fosfato de sódio 100 mM, cloreto de sódio 50 mM, pH 7,4) por 2 horas a temperatura ambiente. As pérolas foram descartadas usando o magneto e os fagos eluídos nos sobrenadantes foram coletados. Após titulação, os fagos eluídos foram usados para reinfectar 10 ml de bactéria exponencialmente desenvolvido XLl-Blue e subsequentemente colocado no meio/ampicilina/glicose 2YT sólido. O seguinte dia, as células foram fragmentadas no meio 2YT com 15 % de glicerol, congeladas e mantidas a - 80°C até o próximo ciclo de seleção. 288.3. Análise de sequência:

[289] Durante os processos de avaliação (MSl e MS2), para cada estratégia, de ciclo 3 a ciclo 8, 48 a 96 clones foram sequenciados após PCR nas células (como descrito em I.2-c.). A análise de sequência foi realizada usando o software proprietário MilleGen AnalyseFc intemalmente desenvolvido rapidamente para analisar as variantes Fc selecionadas. As variantes Fc foram nomeadas de acordo com o ciclo de seleção de que estes fdoram isolados (pela avaliação Mutl: B3A a B6A pela estratégia 1, S3A a S6A pela estratégia 2 e L3A/B a L6A-F pela estratégia 3, pela avaliação Mut2: C3A a C8A pela estratégia 1, T3A a T8A pela estratégia 2 e M3A/B pela estratégia 3). Os números (1 a 96) refere-se a localização na placa PCR para o sequenciamento. Finalmente durante os processos de seleção total, 227 clones mutados diferentes foram isolados pelos clones mutados diferentes Mutl e 223 por Mut2. Todos estes clones foram caracterizados usandos os ensaios fago- ELISA. 289.3. Mutagênese direcionada

[290] A análise de sequência das variantes Fc melhoradas isoladas durante MS1 mostra que um grande número de clones contendo mutações similares (N434Y, N434S, P230S, P230T...). A mutagênese direcionada foi realizada para remover estas mutações a fim de revelar o efeito das mutações associadas. Estes novos mutantes foram baseados no clone parental com um A ou B adicionado no final do nome. 61 novos mutantes foram testados. Alguns destes mutantes são ilustrados na tabela 1. Os mutantes considerados como positivo tendo um sinal específico entre 1,2 e 2,6 vezes mais do que aquele de Fc-WT no ensaio de fago ELISA (ver abaixo). Após MS2, diversos novos mutantes foram construídos pela mutagênese direcionada pela adição de uma ou duas mutações na região de junta (P230S ou P228L ou P228R ou P228L/P230S ou P228R/P230S). Estes mutantes foram nomeados baseado no clone parental com urna letra (A a G) adicionado ao final do nome. 24 novos mutantes foram testados e são ilustrados na tabela 5. 290.3. Ensaios de fago-ELISA das variantes selecionadas (Figura 3)

[291] As características de ligação das variantes isoladas durante MS1 e MS2 apresentadas no fago foram determinadas usando um teste ELISA a pH6,0 com FcRn-p3 revestidos nos reservatórios (Fig. 3).

[292] Brevemente, fogo-variantes Fc foram produzidos como clones isolados em uma placa de 96 reservatórios nas culturas 800 μl no 2YT/ampicilina/glicose infectado com o fago auxiliar Ml3K07 (como descrito no parágrafo 3). Os fagos produzidos durante a noite a 26°C foram recuperados nos sobrenadantes após 30 minutos de centrifugação a 3000 g. Estes sobrenadantes foram diretamente diluídos (1/2 e 1/4) em P6/5 % de leite desnatado/0,1% de Tween 20 e testados em imunoplacas Maxisorp previamente revestidas com 0,25 μg de FcRn-p3/reservatório e bloqueada com 5 % de leite desnatado em P6. Após incubação por 2 horas a 37°C, os reservatórios foram lavados 3 vezes com P6/0,1 % de Tween-20 e gados ligados foram detectados com um anticorpo HRP anti-M13 (GE Healthcare).

[293] Usando este teste ELISA, as variantes Fc 227 selecionadas durante MS1 foram testadas em comparação com o Fc de tipo selvagem (Fc- WT) e um controle positivo. Este controle positivo (denominado a variante Fc- H) é o mutante duplo T250Q/M428L e foi descrito como tendo uma afinidade melhorada por FcRn (x28, Hinton PR et ai., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004)). Esta variante foi gerada pelos protocolos PCR padrões com dois oligonucleotídeos longos que compreendem os códons mutados e os locais de restrição: iniciador 5' 5'- CGGGATCCTGCCCACCGTGCCCAGC ACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACCAACTCATGATCTCCCGGAC -3' (SEQ ID N°:10) e iniciador 3' 5'- GCGAATTCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTT GTGCAGAGCCTCATGCAGCACGGAGCATGAGA AG -3' (SEQ 1D N°:11) (locais de restrição BamHI e EcoRI são sublinhados e os caracteres em cinza correspondem aos códons mutados). No ensaio de fago-ELISA, a variante Fc- H tem um sinal específico no média 3,2 vezes mais forte do que o Fc de tipo selvagem, isto é Fc-WT (razão variante/Fc- WT) e entre as variantes 227 Fc testadas, 73 variantes tem uma razão/Fc- WT>3,2, que significa que estes tem uma ligação melhor ao FcRn do que a variante Fc-H (tabela 2). As variantes positivas de MSl e tendo uma modificação de aminoácido de ponto simples tendo um sinal específico de cerca de 1,2 vezes a 3,5 vezes mais forte do que o Fc de tipo selvagem (ver tabela 1).

Tabela 1: Variantes tendo uma modificação de aminoácido simples identificado durante MS1 ou obtido pela mutagênese direcionada

Tabela 2: Variantes selecionadas durante MS1

[294] As variantes 223 selecionadas durante MS2 foram testadas usando o mesmo protocolo ELISA mas em comparação com a variante Fc-H e a melhor variante Fc isolada durante MSl (SSA_41), por causa da diferença entre o sinal Fc-WT e o sinal de urna variante Fcs foi muito maior a ser comparado na mesma placa de ELISA. Entre as variantes 223 Fc testadas, 209 variantes Fc foram melhores do que Fc-H (razão/Fc-H>l,1) e 39 variantes Fc foram melhores do que a melhor variante Fc isolada durante MS1. Para comparar as variantes com o Fc-WT, uma razão estimada /Fc-WT foi calculada pela multiplicação da razão/Fc-H das variantes pela razão/Fc-WT de Fc-H (= 3,2) determinada durante MSl (razão/Fc-WT = 3,2 x razão/Fc-H) (tabela 3)

Tabela 3: variantes de MS2

[295] Todos, 282 variantes Fc tendo a melhor ligação para FcRn do que Fc-H foram isoladas durante os processos MSl e MS2. A análise das sequências destas variantes 282 Fc revelam que estas incluem as mutações todas na molécula nas 115 posições diferentes (tabela 4).

Tabela 4: mutações das variantes MSI e MS2

[296] Além disso, 16 posições são preferencialmente mutadas e consideradas como posições chaves: C226, P230, F241, V264, T307, N315, A330, Q342, Q362, A378, E382, N389, P396, V397, N421 e N434.

[297] Particularmente, 4 posições são mais preferivelmente mutadas e são consideradas como posições chaves mais preferidas: V264, N315, A378 e N434 (Figura 4).

[298] As variantes Fc de MS2 tendo a melhor ligação por FcRn comparado a melhor variante de MSl (SSA_41), são mostradas na Tabela 5.

Tabela 5: Melhores variantes de MS2 III. Expressão E. coli das variantes Fc

[299] A sequência Fc-WT bem como a variante Fc-H e as variantes Fc isoladas durante MSl e MS2 foram subclonadas a partir do vetor de fagomídeo pMG58 no vetor pMG62, usando locais de restrição BamHI e EcoRJ, permitindo a expressão periplásmica solúvel com um rótulo de termina C 6 x His para purificação e um rótulo V5 para a detecção dos ensaios ELISA. A produção de polipeptídeos Fc recombinantes foi realizado na cepa de HB2151 E. coli (indução com 0,5 mM de IPTG por 16 horas a 20°C). A purificação foi realizada em Ni-NTA usando protocolos padrões e cerca de 200 a 500 μg de cada polipeptídeo foram obtidos. IV.Caracterização de ligação FcRn das variantes Fc usando ELISA e ressonância de plasmou de superfície (SPR) IV.1. Caracterização de ligação FcRn de variantes S5A 41, S3A 07 e Fc- H como comparado ao Fc WT IV.I.a. Ensaios ELISA

[300] As características de ligação das variantes Fc produzidas em um formato solúvel foram determinadas em comparação com o Fc-WT usando um teste ELISA no pH6,0 com FcRn-p3 revestido nos reservatórios. As variantes Fc purificadas (como descrito em III) periodicamente diluído em P6/5 % de leite desnatado/0,1 % de Tween-20 foram testados nas imunoplacas Maxisorp previamente revestidas com 0,25 μg de FcRn- p3/reservatório e bloqueadas com 5 % de leite desnatado em P6. Após incubação por 2 horas a 37°C, os reservatórios foram lavados 3 vezes com P6/0,1 % de Tween-20 e variantes Fc ligadas foram detectadas com um anticorpo HRP anti-V5 (invitroGen) (medição de OD450 nm) (Figura 5a). O teste ELISA foi realizado em S5A_41, a melhor variante de MSl e S3A_07, uma variante equivalente a variante Fc-H e variante Fc-H. Estes testes ELISA confirmam que Fc-H, S5A_41 e S3A_07 tem ligação melhorada ao FcRn comparado com o Fc-WT (Figura 5b, Figura 5c e Figura 5d). Para cada curva de ligação, a medição da concentração Fc a 50 % de saturação da curva (EC50) foi usada para caracterizar as propriedades de ligação das variantes Fc comparadas ao Fc- WT. As razões portanto obtidas confirmam que o S5A_41 é um melhor ligante do que a variante Fc-H e S3A_07 é equivalente a variante Fc-H (Tabela 6). IV.I.b. Ensaios SPR (Resonância de plasmon de superfície)

[301] A interação de variantes Fc com FcRn imobilizado foi monitorado realizado em um instrumento BIAcore XlOO usando um sensor chip CM5 (Biacore, GE Healthcare). A metodologia foi similar aquela previamente descrita para analisar as interações Fc-FcRn (Popov S. et al., Mol Immunol. 33(6):521-530 (1996)). O FcRn solúvel recombinante foi ligado para fluir a célula 2 do sensor chip usando química de ligação amina. As células de fluxo foram ativadas por 3 minutos com uma mistura 1:1 de O,1 M de N- hidroxisuccinimida e 0,1 M de 3-(N,N-dimetilamino)propil-N- etilcarbodiimidâ em uma taxa de fluxo de 30 μ1/min. O FcRn humano recombinante (5 μg/ml em 1O mM de acetato de sódio, pH 5,0) foi injetado na célula de fluxo 2 por 8 minutos a 1O μ1/min, que resulta em uma densidade de superficie de 1200 a 1300 unidades de resposta (RU). As superficies foram bloqueadas com uma injeção de 3-min de 1 M etanolamina-HCl, pH 8,5. A célula de fluxo 1 foi usada como a superficie de controle sem FcRn e foi preparada similarmente para amostra da célula de fluxo. Os dados desta célula de fluxo vazia foram a partir dos dados de amostra.

[302] Os fragmentos Fc foram diluídos em PBS/Tween-20 (50 mM de tampão de fosfato, pH 6,0, 150 mM de NaCl, 0,02 % de NaN3, 0,01 % de Tween-20) que é usado como o tampão de realização nos experimentos de ligação de equilíbrio. Todas as medições foram realizadas a 25°C com as concentrações de fragmento Fc tipicamente variando de 1 a 200 nM em uma taxa de fluxo de 1O μ1/min.

[303] Os dados foram coletados por 1O minutos e pulso de 1-min de PBS, pH 8 contendo 0,05 % de Tween-20 foi usado para regenerar as superficies.

[304] Os Sensorgramas foram gerados e analisados pelo uso o software de BIAevaluation versão 3.1. O equilíbrio RU observou que cada injeção foi plotada contra a concentração de Fc. Os valores de equilíbrio Kd foram derivados pela análise das plotagens usando o modelo de afinidade de estado fixo incluído no software BIAevaluation.

[305] As razões Kd portanto obtidas confirmam que o S5A_41 é um melhor ligante do que a variante Fc-H e S3A 07 é equivalente ao Fc-H (Tabela 6). IV.I.c. Resumo dos resultados obtidos

[306] A tabela 6 abaixo mostra a caracterização de ligação FcRn das variantes S5A 41, S3A 07 e Fc-H como comparado ao Fc WT por (i) fago ELISA, (ii) ELISA e (iii) SPR. Em todos os casos, a variante S5A 41 apresentou unia capacidade significantemente maior para ligar O FcRn do que Fc WT.

[307] Tabela 6: Caracterização de ligação FcRn de uma variante Fcs usando ELISA e ressonância de plasmon de superficie (SPR). Para fago- ELISA e Fc-rec- ELISA, a razão refere-se ao sinal específico pela variante dividido pelo sinal específico Fc-WT. Para SPR, a razão refere-se ao Fc-WT Kd dividido pela variante Kd. IV.2. Caracterização de ligação FcRn de outras variantes MS2 como comparado ao Fc WT por SPR e ELISA

[308] Diversas variantes Fc de MS2 foram produzidas como descrito acima em parte III. A capacidade de cada variante ligar o FcRn foi submetido ao ensaio por (i) SPR e por (ii) ELISA como descrito acima na parte IV.2.b e na parte IV.2.c, respectivamente.

[309] Diversos resultados são mostrados na figura 7.

[310] A Tabela 7 abaixo mostra os resultados obtidos para cada variante MS2 testada por (i) SPR e (ii) ELISA. Os resultados prévios obtidos por fago-ELISA também são indicados.

[311] Os ensaios ELISA e SPR mostraram que todas as variantes Fc são melhores ligantes do que Fc de tipo selvagem para FcRn, que correlacionam com os resultados previamente obtidos pelos ensaios ELISA no fogo-variantes Fc.

[312] Os valores Kd das variantes MS2 no pH = 6 variou de 5,2 a 22,7 nM, que correspondem a um aumento na afinidade de 1,3 a 5,8 vezes como comparado ao Fc-WT.

[313] Tabela 7: Caracterização de ligação FcRn da variante Fcs usando ELISA e ressonância de plasmon de superficie (SPR). Para fago- ELISA, a razão refere-se ao sinal específico pela variante dividido por sinal específico Fc-WT. Para ELISA, a razão refere-se a Fc-WT EC50 dividida pela variante EC50. Para SPR, a razão refere-se a Fc-WT Kd dividido pela variante Kd.

[314] A capacidade das variantes Fc ligar-se a FcRn em pHs diferentes também foi avaliada pelo ensaio ELISA.

[315] Para cada variante Fc previamente testada, os ensaios ELISA foram realizados em uma concentração fornecendo um OD450 nm variando de 0,8 e 1,0 quando realizado no ensaio ELISA ao pH=6. As condições experimentais são aquelas descritas previamente em parte IV.1.a. Tabela 8 abaixo indica a concentração de cada variante Fc usada para realização dos ensaios de ELISA.

Tabela 8: Concentração de cada variante Fc usada para mostrar as afinidades de ligação distintas ao FcRn em pHs diferentes.

[316] A Figura 7 mostra os resultados dos ensaios de ELISA obtidos de cada variante. OD450 nm correlaciona com a quantidade de variantes Fc ligadas ao FcRn imobilizado (detecção de variantes Fc ligadas com anticorpo HRP anti-VS). O sinal específico maior a OD450 nm foi, o maior da ligação da variante Fc- ao FcRn.

[317] A Figura 7 claramente mostra que a ligação das variantes Fc com FcRn variam no pH. Como esperado, a ligação das variantes Fc a FcRn no pH 7,4 é significante como comparado a ligado no pH 6,0.

[318] Pode ser concluído que as modificações de aminoácidos introduzidas para obter as variantes Fc da presente invenção podem significantemente aumentar a ligação ao FcRn no pH 6,0 como comparado aquele de Fc-WT mas não pode significantemente modificar a ligação no pH 7,4 que permanece muito baixo. EXEMPLO 2: Produção de variantes lgG com base nas variantes Fc e caracterização biológica do dito lgG. 1. Expressão das variantes IgG 1.1. Construção do vetor

[319] As variantes Fc C6A_69; C6A_78; TSA_74; C6A_74; C6A 60 e C6-A66 foram preparadas em um formato lgG com uma especificidade anti-CD20 na linha celular YB2/0. Para o propósito comparativo, IgG com base em Fc de tipo selvagem (IgG-WT) também foi produzido.

[320] A fim de maximizar a produtividade na linha celular YB2/0, o cDNA de cadeias leves e pesadas de comprimento total bem como fragmento Fc que codifica as variantes foram neo-sintetizadas com a otimização de códon por Rattus norvegicus. As características indesejadas tal como locais de união secretos ou locais de restrição foram removidos. Apenas um local de restrição (ApaI) está presente na região constante/junção variável.

[321] Em uma primeira etapa, a cadeia pesada de tipo selvagem foi clonada entre NheI e Ascl no vetor de expressão CHK.622-08, otimizado pela expressão em YB2/0, resultando na construção intermediária HCD20- Opti-GA. A cadeia leve otimizada foi então clonada entre os locais de restrição Spel e XbaI resultando na construção final HKCD20-Opti-GA para expressão do anticorpo anti-CD20 de tipo selvagem (denominado IgG- WT abaixo).

[322] As variantes Fc foram preparadas pela substituição do fragmento IgG1 Fc selvagem presente em HKCD20-Opti-GA por sua versão apropriada. Esta foi clonada entre os locais de restrição Apal e AscI (Figura 8a).

[323] A cada clonagem de fragmento foi feita pelos procedimentos de ligação/digestão clássica, antes da transformação bacteriana. As construções de expressão foram avaliadas pela digestão enzimática mais PCR e validado pelo sequenciamento. 323.2. Produção de cultura celular

[324] As células 5.106 da linha celular YB2/0 (ATCC, CRL-1662) foram eletroporadas com cada vetor linearizado pela expressão, então diluído a 25.000 células/mL no meio RPMI 1640 + 5 % de v/v FCS dializado (InvitroGen) e dispensado sob 1 mL/reservatório nas placas de 24 reservatórios. Após 3 dias de recuperação celular, a pressão de seleção foi aplicada pela adição a geneticina concentrada (Invitrogen) a 0,5 g/L de metotrexato concentrado e final (Sigma) a 25 mM de final, 2 mL/reservatório. Após 11 dias de incubação, as células resistentes foram unidas para cada uma das 8 construções (codificadas pelas variantes IgG MS2 selecionadas e IgG-WT) e progressivamente diluídas com o meio DMEM + 5% v/v de Ultra-low IgG FCS (InvitroGen) até dois (2) 2 L-frascos cilíndricos contendo 0,9 L da suspensão celular cada um pode ser incubado em 2 rotação/minuto. As células foram deixadas desenvolver e morrer (4 a 5 dias) antes da coleta do sobrenadante, a clarificação pela centrifugação de velocidade baixa e redução de volume pela ultra-filtração em filtro Pellicon XL (Millipore). 11. Purificação e caracterização de variantes lgG

[325] Os sobrenadantes de cultura concentrados foram injetados em uma coluna FF de proteína A HiTrap (GE Healthcare). Os anticorpos ligados foram eluídos com tampão de citrato de sódio 0,1 M, pH 3,0 e frações foram neutralizadas usando 100 μl de 1 M de Tris pH 7,5 por ml de tampão de eluição. As frações contendo os anticorpos foram unidas e dializadas em PBS pH 6,0 e as amostras foram filtradas estéreis (0,22 nm) e armazenadas a 4°C.

[326] Os IgGs purificados foram caracterizados por SDS-PAGE sob as condições de redução e não redução. Os géis tingidos por Coomassie Blue indicam que os IgGs, qualquer que as mutações, foram purificados mais do que 95 % de homogeneicidade e apresentaram a característica de grupos de cadeia leve e pesada para cada IgG (Figura 8b e Figura 8c). 111. Caracterização de ligação FcRn das variantes IgG

[327] As propriedades de ligação das variantes IgG ao FcRn foram determinadas por três testes distintos: (i) pelo ensaio ELISA, (ii) pelo SPR e (iii) por um ensaio de ligação de competição realizado em uma linha celular Jurkat que expressa um FcRn truncado na presença de Rituximab rotulado fluorescente (um anti-CD20 IgG). III.1. ELISA lll.l.a. Material e método

[328] As propriedades de ligação das variantes lgG produzidas em Y2B/O foram determinadas usando um teste ELISA no pH6,0 com FcRn-p3 revestido nos reservatórios. Para o propósito comparativo, o ensaio de ELISA também foi realizado em IgG-WT.

[329] As variantes IgG purificadas periodicamente diluídas em P6/5 % de leite desnatado/0,1 % de Tween-20 foram testadas nas imunoplacas Maxisorp previamente revestidas com 0,1 μg de FcRn-p3/reservatório e bloqueadas com 5 % de leite desnatado em P6. Após incubação por 2 horas a 37°C, reservatórios foram lavados 3 vezes com P6/0,1 % de Tween-20 e variantes lgG ligadas foram detectadas com um Fab'2 anti-humano de cabra HRP Fab'2 (Interchim).

[330] Para cada uma das variantes lgG, a porcentagem do FcRn ligado foi plotado versus o log da concentração da variante IgG. Para cada curva de ligação resultante, a medição da concentração IgG relacionada a 50 % de saturação da curva (EC50) foi determinada e comparada ao EC50 de WT-IgG. 330.1. b. Resultados ELISA

[331] Os testes ELISA mostraram que as variantes IgG produzidas tem uma ligação aumentada ao FcRn como comparado aquela de WT-lgG. Este fato é claramente ilustrado pela curva de ligação (ver figura 9) e pelos valores EC50.

[332] Como ilustrado na tabela 9 abaixo, o EC50 das variantes lgG são pelo menos 5,8 vezes menor do que aquela do lgG de tipo selvagem. O melhor EC50 é obtido pela variante C6A_69.

[333] Tabela 9: Concentração a 50 % de saturação (EC50) obtida da curva de ligação ELISA de cada variante IgG. A razão refere-se a WT EC50 dividido pela variante EC50. 111.2. Medições de afinidade de ligação lgG/FcRn com SPR 111.3. a. Material e método

[334] A interação das variantes IgG-WT e IgG com FcRn humano imobilizado, recombinante foi monitorada pela detecção da ressonância de plasmon de superficie (SPR) usando um instrumento BIAcore Xl 00 (GE Healthcare). O protocolo experimental foi similar aquele usado para a determinação da afinidade das variantes Fc (ver parágrafo IV.2.b. acima).

[335] O equilíbrio RU observado para cada injeção foi plotado contra a concentração de Fc. O equilíbrio dos valores Kd foi derivado pela análise das plotagens pelo uso de um modelo de afinidade de estado fixo incluído no software BIAevaluation. Os parâmetros cinéticos foram determinados pelo ajuste global de associação e dados de fase de dissociação com um modelo 1 : 2. 335.2. b. Resultados SPR

[336] A afinidade de ligação (valores Kd) de IgG-WT para FcRn humano foi 78,3 nM. Como ilustrado na tabela 1O, os valores Kd das variantes 6 IgG foram variados de 10,5 a 18,8 nM que mostrou um aumento na afinidade por FcRn a pH 6,0 de 4 a 7 vezes como comparado aquele de IgG-WT.

[337] Tabela 10: Os valores Kd obtidos por SPR. A razão refere-se ao WT-Kd dividido pela variante Kd. A fim de determinar os parâmetros cinéticos, a série dos dados para a interação de IgG WT e variantes com FcRn humano foram ajustadas com modelo 1:2 incluído no software BIAevaluation. As curvas obtidas com IgG WT não ajustam-se com o modelo 1:2 considerando as curvas obtidas com a variante IgG C6A_66 e todas as outras variantes ajustam-se bem com o modelo 1:2 (dados não mostrados).

[338] Como ilustrado na tabela 11 abaixo, a afinidade intensificada das variantes IgG por FcRn humano relativo ao WT foram predominantemente conduzidas pelos cinéticos de associação aumentados (valores kon). Deste modo, a razão refere-se às variantes kon divididas por WT-kon variada de 13 a 23, indicando um aumento significante na afinidade das variantes a FcRn. Os valores aumentados de variantes KoffoflgG relativo ao WT foram variados de 2 a 4, apresentando um impacto fraco da dissociação como comparado a associação.

Tabela 11: Taxas de dissociação (koff) e associação (kon) determinados por SPR 111.3. Ligação por Jurkat-FcRn 111.4. a. Material e método

[339] Os ensaios de imunofluorescência de competição foram realizados para avaliar a capacidade de IgG WT e variantes interagir com FcRn por um método adaptado daquele descrito por Dall'Ozzo et al. (Dall'Ozzo S, Tartas S, Paintaud G, Cartron G, Colombat P, Bardos P, Watier H, Thibault G, Câncer Res., 2004 Jul 1;64(13):4664-9).

[340] Brevemente, IgG WT e variantes foram diluídas em PBS pH6 em uma concentração final que varia de 0,06 a 2 mg/ml e incubadas com Jurkat FcRn (célula 150000) na presença de Rituximab conjugado por Alexa (Rituximab rotulado) em uma concentração de 50 μg/ml. Após 20 minutos, as células foram analisadas pela citometria de fluxo a fim de quantificar a ligação Alexa-Rituximab.

[341] Os resultados foram expressados como uma porcentagem da intensidade de fluorescência média (MFI), 100 % refere-se a intensidade de fluorescência média (MFI) obtida com Rituximab conjugado por Alexa sozinho (isto é sem competidor) e 0% refere-se ao valor MFI medido quando Jurkat FcRn não foi incubado com Rituximab conjugado por Alexa. Cada experimento foi feito em triplicata.

[342] Os controles compreendem a incubação de (i) Rituximab não rotulado ou (ii) IgG-WT.

[343] Para cada IgG testado, o MFI foi plotado versus o log da concentração IgG. A concentração (IC50) de cada IgG testado que fornece uma inibição de 50 % do sinal MFI foi determinado.

[344] Uma descrição geral deste ensaio também pode ser observado no Pedido de Patente Francês publicado como FR 2 894 983. 344.3. b. Resultados experimentais

[345] Diversos resultados são mostrados na figura 11 onde a ligação ou Ritixan e de várias variantes de acordo com a invenção ao Jurkat FcRn foram determinadas como descrito em na seção de materiais e métodos acima e expressado como valores de intensidade de fluorescência média (MFI).

[346] Como ilustrado na tabela 12 abaixo, o IC50 obtidos pelas variantes da invenção são significantemente inferiores do que aqueles obtidos por WT-IgG. A diminuição em IC50 pelas variantes IgG da invenção foi de 40 a 60 vezes exceto por C6A_66.

[347] Tabela 12: IC50 obtida pelo ensaio de competição de ligação realizado nas células Jurkat que expressam FcRn na presença de Rituximab rotulado fluorescente. Os valores "50 % RTX=l" consistem de valores IC50 que também são expressados em μg/ml. 347.3. Conclusão

[348] Os três testes distintos realizados para caracterizar as propriedades de ligação das variantes IgG ao FcRn fornecem resultados consistentes. Em todos os casos, as variantes IgG da invenção apresentaram uma ligação aumentada significante de um FcRn como comparado aquele IgG de tipo selvagem. IV.Caracterização funcional de variantes IgG e comparação com IgG- WT e LFB-R603

[349] A capacidade das variantes IgG ligar-se aos receptor Fcy e suas atividades ADCC e CDC foram avaliadas a fim de caracterizar totalmente suas funções biológicas. IV.1. Ligação de variantes IgG ao hFcyRIIIA IV.La. ensaio ELISA: ligação de variante IgG ao hFcyRIIIA recombinante imobilizado

[350] O FcyRIIIA recombinante humano (alotipo F158) foi biotinilado com kit EZ-link NHS-PEO (Pierce), diluído a 1 μg/ml no tampão de ensaio (Tris 25 mM, NaCl de 150 mM, pH 7,35, 0,05 % de Tween-20, 0,1% de BSA) e revestido nas placas ELISA de estreptavidina react-bind™ (Pierce) por 2 horas em temperatura ambiente. Durante este tempo de incubação, os complexos IgG-F(ab')2 anti-F(ab')2 foram preparados no tampão de ensaio pela mistura de 5 μg/ml de IgG e 2 μg/ml F(ab')2 anti- humano F(ab')2 rotulado com peroxidase de rábano silvestre (Jackson ImmunoResearch) por 2 horas em temperatura ambiente. As diluições periódicas dos complexos foram adicionadas as placas e incubadas por 2 horas em temperatura ambiente sob agitação gentil. Após as placas de lavagem com tampão de ensaio, complexos ligados por hFcyRIIIA foram detectados com TMB (Pierce). A absorbância a 450 nm foi lida usando um leitor de placa (Tecan).

[351] Para cada uma das variantes lgG, a porcentagen de FcyRIIIA ligada (que é obtida de OD450 nm) foi plotada versus a concentração de variante lgG.

[352] Como mostrado na figura 1O, a ligação de variantes IgG a hFcyRIIIA é similar aquela de IgG WT, exceto pela variante C6A_66 que falha em ligar hFcyRIIIA. IV.2. Atividade ADCC

[353] As células matadoras naturais (células NK) foram purificadas a partir do sangue periférico dos doadores saudáveis pela técnica de depleção negativa desenvolvida pela companhia Miltenyi. O teste ADCC compreende a incubação das células NK com as células alvos da linha Raji que expressam o receptor CD20, na presença de concentrações diferentes de anticorpos anti- CD20. Após 16 horas de incubação, a citotoxicidade induzida pelos anticorpos anti-CD20 é cromogeniticamente medida pelos sobrenadantes celulares no nível de uma enzima intracelular denominada desidrogenase de lactato (LDH) que é liberada pelas células alvos lisadas.

[354] Os resultados são mostrados na figura 12.

[355] Os resultados de líse específicos são expressados como á porcentagem de líse como uma função da concentração de anticorpo. EC50 (quantidade de anticorpo que induz 50 % de líse máxima) foram calculados usando software PRISM. Os experimentos de controle foram realizados com (i) Rituximab, (ii) WT-IgG produzidos nas células Y2/0 e LFB-R603 que é um anticorpo anti-CD20 conhecido por ter a função ADDC que foi descrita por de Romeuf et al. Em 2004 (de Romeuf C, Dutertre CA, Le Garff- Tavemier M, Foumier N, Gaucher C, Glacet A, Jorieux S, Bihoreau N, Behrens CK, Béliard R, Vieillard V, Cazin B, Bourel D, Prost JF, Teillaud JL, Merle-Béral H.Chronic lymphocytic leukaemia cells are efficiently killed by an anti-CD20 monoclonal antibody selected for improved engagement of FcgamaRIIIA/CD16. Br J Haematol. 2008 Mar;140(6):635-43). bem como no Pedido PCT n°. WO 2006/064121.

[356] A Tabela 13 abaixo mostra o EC50 para cada variante e compara a função ADCC das variantes lgG com aquela de LFB-R603 e WT- IgG.

[357] Todas as variantes lgG apresentam a atividade ADCC exceto a variante C6A_66. Esta variante não tem ADCC que é consistente com sua afinidade muito baixa por FcyRIII.

[358] Deve ser observado que C6A_69, C6A_60 e C6A_74 tem uma atividade ADCC aumentada como comparado ao lgG-WT. As outras variantes (denominadas C6A_78 e T5A_75) tem uma atividade similar ADCC aquela do lgG-WT.

[359] Tabela 13: EC50 (quantidade do anticorpo que induz 50 % de líse máxima) obtida do ensaio ADCC. A razão refere-se a variante EC50 dividida por LFB-R603 EC50. IV.3. Atividade CDC

[360] Nesta técnica, as células CD20+ alvos de linha Raji foram incubadas com concentrações diferentes de anticorpos anti-CD20 (O a 5000 ng/ml) na presença de soro de coelho filhote como uma fonte de complemento (Cedarlane ref.: CL3441, dilução a 1/10). Após 1 hora de incubação a 37°C, a quantidade de LDH liberada no sobrenadante pelas células alvos lisadas é medida cromogenicamente (Roche Applied Sciences Cytotoxicity Detection Kit) e é usada para quantificar a citotoxicidade dependendo do complemento mediada pelos anticorpos. Os resultados são expressados como uma porcentagem de líse. EC50 (quantidade de anticorpo que induz 50 % de líse máxima) e Emax (porcentagem de líse máxima) fdoram calculadas usando o software PRJSM.

[361] Tabela 14 abaixo mostra o Emax e EC50 obtido para cada variante. O nível de atividade CDC varia nas variantes IgG.

[362] C6A_78 e C6A_60 tem uma atividade CDC significantemente maior daquele de IgG-WT em que C6A_69, T5_74 e C6A_66 apresentam atividade CDC baixa.

[363] A atividade CDC da variante C6A_74 é similar aquela de IgG-WT.

[364] Tabela 14: EC50 (quantidade de anticorpo que induz 50 % de líse máxima) obtida do ensaio CDC. IV.3. Conclusão

[365] As seis variantes IgG da invenção recombinantemente produzidas na linha celuilar Y2B/0 tem uma ligação aumentada ao receptor FcRn como comparado ao IgG-WT (produzido na mesma célula hospedeira e na mesma condição).

[366] As variantes IgG da invenção tem pelo menos a mesma afinidade de ligação ao FcgRlII e pelo menos a mesma atividade ADCC do que IgG-WT, exceto C6AA_66 que mostra a afinidade fraca por FcgRlII.

[367] As variantes IgG apresentam atividades CDC distintas.

[368] Para concluir, em alguns aspectos, modificações de aminoácidos de acordo com a invenção capazes de obter as variantes lgG que tem uma ligação aumentada por FcRn combinado com uma ou mais atividades efetivas Fc que são pelo menos similares aquelas do lgG de origem correspondente (isto é lgG-WT).

[369] Em outro aspecto, as modificações de aminoácidos de acordo com a invenção capazes de obter as variantes lgG que tem uma ligação aumentada por FcRn combinada com pelo menos uma atividade efetiva Fc diminuída tal como CDC ou ADCC.

[370] A Tabela 15 abaixo mostra as conclusões principais relaticas as variantes do presente estudo.

[371] Tabela 15: resultados principais obtidos pelas variantes lgG da invenção como comparado ao lgG-WT ; ++: Ligação aumentada a FcRn como comparado ao WT-lgG; $ atividade aumentada como comparado ao WT- lgG; |: atividade diminuída como comparado ao WT-lgG; V : Atividade similar aquela de WT-lgG.

Tabela 7: Sequências incluídas na listagem de sequência

Claims

1. Variante de um polipeptídeo precursor que compreende uma região de Fc, caracterizada pelo fato de que a região Fc do referido polipeptídeo parental é escolhida a partir de IgG1 Fc da SED ID NO: 1, IgG2 Fc da SEQ ID NO: 2, IgG3 Fc da SEQ ID NO: 3 e IgG4 Fc da SEQ ID NO: 4, em que variante apresenta ligação aumentada a FcRn em comparação com o dito polipeptídeo precursor e compreende pelo menos duas modificações de aminoácido, as ditas pelo menos duas modificações de aminoácido compreendendo: (i) uma modificação de aminoácido que é 434Y e (ii) pelo menos uma modificação de aminoácido que é 315D, ou 378V, da região Fc, em que a numeração dos aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

2. Variante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma combinação de modificações de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 259I/315D/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/434Y, 315D/382V/434Y e 378V/383N/434Y da região Fe em comparação com o dito polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na região Fe é aquela do índice EU como em Kabat.

3. Variante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita variante compreende adicionalmente pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada do grupo que consiste de 226G, , 230S, 230T, 241L, 250A, 256N, 2591, 267R, 290E, 305A, 307P, 307A, 308I, 325S, 327V, 330V, 342R, 361D, 362R, 362E, 378V, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 421T, 426T, e 439R da região Fe, em comparação com o polipeptídeo precursor, em que a numeração dos aminoácidos na regiao Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

4. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a dita variante compreende uma combinação de modificações de aminoácido que selecionam o grupo que consiste de 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 259l/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 315D/330V/362R/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y, 226G/315D/330V/434Y, 290E/315D/342R/382V/434Y, 230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 308I/315D/330V/382V/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, da região Fc comparação com o dito polipeptideo precursor, em que a numeração aminoácidos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

5. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, caracterizada pelo fato de que a dita variante é um anticorpo.

6. Variante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo e um anticorpo lgG.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma variante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em um veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Uso de uma variante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento.