BRPI1013085A2 - imunoglobulinas anti-cd52 humana - Google Patents

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BRPI1013085A2
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Bruce L. Roberts
Srinivas Shankara
William Harold Brondyk
William M. Siders
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Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD52 HUMANA OU PARTE DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DESTE E SEU USO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO O CODIFICANDO E SEU USO, BEM COMO CADEIA LEVE OU PARTE DESTA DE ANTICORPO, CADEIA PESADA OU PARTE DESTA DE ANTICORPO E CÉLULA HOSPEDEIRA. A presente invenção refere-se a imunoglobulinas humanizadas, anticorpos monoclonais de camundongo e anticorpos quiméricos que possuem especificidade de ligação por CD52 humana. A presente invenção refere-se ainda a uma cadeia leve e humanizada de imunoglobulina e a uma cadeia pesada humanizada de imunoglobulina. A invenção refere-se também a ácidos nucleicos isolados, vetores recombinantes e células hospedeiras que compreendem uma sequência que codifica uma imunoglobulina humanizada ou cadeia leve ou cadeia pesada de imunoglobulina e a um método para preparar uma imunoglobulina humanizada. As imunoglobulinas humanizadas podem ser usadas em aplicações terapêuticas para tratar, por exemplo, doença autoimune, câncer, linfoma não Hodgkin, esclerose múltiplas e leucemia linfocítica crônica.

Description

CCC—P["YYNYYY"P. 1/222 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO : MONOCLONAL ANTI-CD52 HUMANA OU PARTE DE LIGAÇÃO A ANTÍ- GENO DESTE E SEU USO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO O CODIFICAN- DO E SEU USO, BEM COMO CADEIA LEVE OU PARTE DESTA DE AN- —TICORPO, CADEIA PESADA OU PARTE DESTA DE ANTICORPO E CÉ- LULA HOSPEDEIRA". Este pedido de patente reivindica prioridade deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório 61/177 837, depositado em 13 de maio de 2009, cu- jo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pe- didode patente.
Antecedentes da invenção CD52 é uma proteína glicosilada, glicosilfosfatidilinositol (GPI), ancorada na superfície celular e encontrada em abundância (500.000 molé- culas/célula) em uma variedade de células linfoides normais e malignas (por exemplo, células T e B). Consultar, por exemplo, Hale et al., J Biol regul Homeost Agents 15:386-391 (2001); Huh et a/., Blood 92: Abstract 4199 (1998); Elsner et al., Blood 88:4684-4693 (1996); Gilleece et al., Blood 82:807-812 (1993); Rodig et al., Clin Cancer Res 12:7174-7179 (2006); Gi- naldi et al., Leuk Res 22:185-191 (1998). CD52 é expressa em níveis mais baixos em células mieloides, como monócitos, macrófagos e células dendrí- ticas, com pouca expressão encontrada em células natural killer (NK) madu- ras, neutrófilos e células-tronco hematológicas. /d. CD52 é produzida tam- bém por células epiteliais no epidídimo e duto deferente, e adquirida por es- perma durante a passagem através do trato genital (Hale ef a/., 2001, supra; Domagala et al, Med Sci Monit 7:325-331 (2001)). A função biológica exata de CD52 permanece incerta, porém algumas evidências sugerem que possa estar envolvida em migração e co-estimulação de células T (Rowan et al., Int Immuno!l 7:69-77 (1995); Masuyama et al., J Exp Med 189:979-989 (1999); | Watanabe et al., Clin Immunol 120:247-259 (2006)).
Campath-1Hº (alentuzumabe, Campathº, MabCampathº) é um anticorpo monoclonal humanizado anti-CD52 humana que exibe potentes efeitos citotóxicos in vitro (citotoxicidade mediada por células dependente de Segue-se folha 1a/222
CCCCr——— 1a/222 anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC)). Campath8 reconhece um epítopo, constituído pelos quatro aminoácidos na carboxila terminal da proteina CD52 madura e uma parte da âncora GPI car- regada negativamente.
Graças aos seus efeitos citotóxicos significativos, Segue-se folha 2/222
UV 2/222 ] Campath€O é capaz de depletar células CD52 positivas in vivo, sendo apro- vado para o tratamento de primeira linha e de terceira linha de leucemia lin- focítica crônica (CLL). CampathQ foi avaliado quanto à sua utilidade no tra- tamento de várias doenças autoimunes, incluindo artrite reumatoide, vasculi- te, miosite e doença de Wegener. No entanto, os estudos mais avançados de Campath€O são no tratamento de esclerose múltipla (MS) recidivante- remitente. Estes estudos mostraram melhora significativa em tempo para recidiva em relação a um comparador ativo (Rebif& (ou seja, interferon beta- 1a)).
Existe necessidade de agentes terapêuticos e abordagens adi- cionais direcionados para CD52. Sumário da invenção À Imunoglobulinas humanizadas W A invenção refere-se a imunoglobulinas humanizadas com espe- cificidade de ligação por CD52 humana (huCD52). Estas podem compreen- der as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de anticorpos de camundongo anti-CD52 humana. As imunoglobulinas humanizadas da invenção contêm sequências de aminoácidos que são diferentes de outras imunoglobulinas humanizadas e, especificamente, de outras imunoglobuli- nas humanizadas que compreendem CDRs de anticorpos murinos anti- CD52 humana. As imunoglobulinas humanizadas da invenção são diferentes da imunoglobulina humanizada Campathê. Em algumas concretizações, estas oferecem vantagens sobre anticorpos humanizados que compreendem as CDRs de Campath€O.
As imunoglobulinas humanizadas descritas neste relatório po- dem compreender uma cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve hu- manizada. Em uma concretização, a imunoglobulina humanizada compreen- de uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 3 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 16; uma cadeia leve in- cluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, to-
: 3/222 das as três CDRs) da SEQ ID NO: 17; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 5 e uma ca- deia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três C- DRs) da SEQ ID NO: 18; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 6 e uma cadeia pesada inclu- indo uma ou mais CDRs da SEQ ID NO: 19; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 20; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 8 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 21; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas i as três CDRs) da SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada incluindo uma ou - mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 22; uma ca- deialeve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 10 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por e- xemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 23; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 11 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 24; uma cadeia leve incluindo uma ou mais C- DRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 12 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 25; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 12 e uma cadeia pesada incluindo uma oumaisCDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 137; ou uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 13 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais C- DRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 26. As CDRs nas SEQ ID NOs citadas acima são indicadas pelas Figuras 2 e 3 e menciona-
dasnas Tabelas1- 6 apresentadas neste relatório descritivo.
Em outra concretização, a imunoglobulina humanizada com es- pecificidade de ligação por CD52 humana compreende uma cadeia leve in-
DP 4/222 K cluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três), selecionadas a par- tir do grupo constituído por SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQIDNO:39,SEQID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48; uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por e- xemplo, todas as três) selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID É NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, - SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 294; ou uma cadeialevee uma cadeia pesada de tal! modo que a imunoglobulina humani- zada não seja CampathO.
Em outra concretização, a imunoglobulina humanizada com es- pecificidade de ligação por CD52 humana compreende uma cadeia leve in- cluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO:3,SEQIDNO:4,SEQID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13; uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por e- xemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQIDNO:23,SEQID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 137; ou uma cadeia leve e uma cadeia pesada de tal modo que a imu- noglobulina humanizada não seja Campath€O.
Em algumas concretizações, a região framework (arcabouço) da imunoglobulina humanizada possui pelo menos 50% de homologia à região framework da imunoglobulina a partir da qual as CDRs da cadeia leve CDRs e as CDRs da cadeia pesada são obtidas. Por exemplo, a região framework da imunoglobulina humanizada pode ser pelo menos 50%, pelo menos 60%,
E 5/222 [| pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% idêntica a uma sequência da linhagem germinativa de imunoglobulina humana.
Em uma concretização, a região framework da imunoglobulina humanizada pode ser obtida ou deriva- dade uma região variável de um anticorpo IgG humano.
Em outra concreti- zação, a CD52 é CD52 humana do tipo selvagem.
Em ainda outra concreti- zação, a imunoglobulina humanizada pode competir com alentuzumabe pela ligação a CD52 humana, por exemplo, pode ligar-se a um epítopo que seja idêntico ou que se sobreponha ao epítopo ao qual o alentuzumabe se liga.
A invenção refere-se também a uma cadeia leve humanizada de uma imunoglobulina humanizada da invenção.
Em uma concretização, a ca- deia leve humanizada compreende uma ou mais CDRs selecionadas a partir ' do grupo constituído por SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, - SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48 ou uma combinação destas, em que a cadeia leve humani- zada não é a cadeia leve humanizada de Campath€O.
Em outra concretização, a cadeia leve humanizada compreende uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, em que a cadeia leve humanizada não é a cadeia leve humanizada deCampath€. A invenção refere-se também a uma cadeia pesada humanizada de uma imunoglobulina humanizada da invenção.
Em uma concretização, a cadeia pesada humanizada compreende uma ou mais CDRs de um domínio variável de lg, selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 49, SEQID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID
: 6/222 Í NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 294, ou uma combi- nação destas, em que a cadeia pesada humanizada não é a cadeia pesada humanizadade Campathe.
Em outras concretizações, a cadeia pesada humanizada com- preende uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25,SEQID NO: 26 ou SEQ ID NO: 137, em que a cadeia pesada hu- manizada não é a cadeia pesada humanizada de Campath€.
De preferência, as imunoglobulinas humanizadas da presente Ú invenção compreendem tanto uma cadeia leve humanizada da invenção - como uma cadeia pesada humanizada da invenção.
Em outras concretizações, a invenção provê uma imunoglobulina humanizada que se liga ao mesmo epítopo em CD52 humana, ou com o qual compete direta ou indiretamente, que um anticorpo monocional de ca- mundongo compreendendo uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 16; uma regi- ão variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 18; uma regi- ão variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 6 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:7euma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 20; uma regi- ão variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 8 e uma região variável! de cadeia pesada da SEQ ID NO: 21; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 22; uma regi- ão variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 e uma região variável de ca- deiapesadadaSEQ ID NO: 23; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 24; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 12 e uma região variável de y 7/222 cadeia pesada da SEQ ID NO: 25; ou uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 26. Em outras concretizações, a imunoglobulina humanizada liga-se a um epíto- po em CD52 humana que se sobrepõe ao epítopo ao qual tal anticorpo mo- —noclonalde camundongo se liga.
Em outras concretizações, a invenção provê uma imunoglobulina humanizada que se liga a um epítopo em CD52 humana (por exemplo, SEQ ID NO: 104), compreendendo pelo menos o resíduo 1 da sequência da CD52 humana madura (em que o resíduo 1 é o N-terminal da sequência da CD52 madura, ou seja, o resíduo de glicina [G] em N-terminal; consultar a Figura 4). A imunoglobulina humanizada pode ligar-se a um epítopo com- preendendo pelo menos os resíduos 1, 3, 4 e 5 da sequência da CDS52 hu- : mana madura (estes resíduos sendo de glicina [G], asparagina [N], aspartato : [D] e treonina [T], respectivamente). A imunoglobulina humanizada pode |i- gar-sea um epítopo compreendendo pelo menos os resíduos 1,2,3,4e5 da sequência da CD52 humana madura (estes resíduos sendo de glicina [G], glutamina [Q], asparagina [N], aspartato [D] e treonina [T], respectivamente). Em outras concretizações, a invenção provê uma imunoglobulina humaniza- da que se liga a um epítopo, em CD52 humana, compreendendo pelo menos osresíduos7,8e9da sequência da CDS52 humana madura (estes resíduos sendo de glutamina [Q], treonina [T] e serina [S], respectivamente). Em al- gumas concretizações, o epitopo compreende pelo menos os resíduos 7 (Q), 8 (T) e 11 (P) da sequência da CD52 humana madura. Em algumas concre- tizações, o epitopo compreende pelo menos os resíduos 4 (D) e 11 (P) da sequência da CD52 humana madura.
Em algumas concretizações, a invenção provê uma imunoglobu- lina humanizada que se liga a CD52 humana e que compreende uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 121 (por exemplo, to- dasastrêsdas referidas CDRs), ou uma cadeia pesada, incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 130 (por exemplo, todas as três das referi-
: 8/222 das CDRs) ou tal cadeia leve e tal cadeia pesada.
Em outras concretizações, a invenção provê uma imunoglobulina humanizada que se liga a CD52 hu- mana e que compreende uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs se- lecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119eSEQID NO: 122 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs), ou uma cadeia pesada, incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 131 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs), ou tal cadeia leve e tal ca- deia pesada.
Em ainda outras concretizações, a invenção provê uma imuno- —globulina humanizada que se liga a CD52 humana e que compreende uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 123 (por i exemplo, todas as três das referidas CDRs), ou uma cadeia pesada, incluin- - do uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ 1DNO: 126, SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 132 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs), ou tal cadeia leve e tais cadeias pesadas.
Em certas concretizações, a imunoglobulina humanizada com- preende uma cadeia leve incluindo as CDRs da SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 121 e uma cadeia pesada incluindo as CDRs da SEQID NO: 124, SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 130. Em outras concreti- zações, a imunoglobulina humanizada compreende uma cadeia leve incluin- do as CDRs da SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 122 e uma cadeia pesada incluindo as CDRs da SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 131. Em outras concretizações, a imunoglobulina humanizada compreende uma cadeia leve incluindo as CDRs da SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 123 e uma cadeia pesada incluindo as CDRs da SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 132. As imunoglobulinas humanizadas da presente invenção são dife- rentes da imunoglobulina humanizada Campath€. As sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 115-132 su- pracitadas são fornecidas abaixo e têm como base as sequências de amino- ácidos relatadas nas Tabelas 1 — 6, conforme fornecidas em outro lugar nes-
i te relatório descritivo.
Nestas sequências de aminoácidos, "X" representa qualquer aminoácido e o símbolo "/" indica que um dos (ou qualquer um) aminoácidos tratados adjacentes àquele símbolo pode estar presente na posição indicada (por exemplo, K/R indica que um resíduo de lisina ou argi- nina está presente na posição indicada e F/L/V indica que um resíduo de fenilalanina, leucina ou valina está presente na posição indicada). Sequências de CDR1 de cadeia leve: KRSSOQSLLN/IXS/TN/DGXS/TYLX (SEQ ID NO: 115) KWRSSOSLLNVIHS/TNGXS/TYLH (SEQ ID NO: 116) RSSQOSLVHTNGNS/TYLH (SEQ ID NO: 117) Sequências de CDR2 de cadeia leve: XVSXXXS (SEQ ID NO: 118) ] XVSXRXS (SEQ ID NO: 119) - MVSXRFS (SEQ ID NO: 120) Sequências de CDR3 de cadeia leve: XQXXH/R/KF/L/VIIXX (SEQ ID NO: 121) SQSXH/R/KF/LIVIPX (SEQ ID NO: 122) SQSXHVPF/P (SEQ ID NO: 123) Sequências de CDR1 de cadeia pesada: GFXFXXYW/YMX (SEQ ID NO: 124) GFTFXXYW/YMX (SEQ ID NO: 125) GFTFTDYW/YMS (SEQ ID NO: 126) Sequências de CDR2 de cadeia pesada: XIRXKXBXYXTXYXXSVKG (SEQ ID NO: 127) XIRXKXNXYTTEYXXSVKG (SEQ ID NO: 128) FIRNKANGYTTEYXXSVKG (SEQ ID NO: 129) Sequências de CDR3 de cadeia pesada: TXXXY/F/W (SEQ ID NO: 130) TRYXY/FANFDY (SEQ ID NO: 131) TRYIFWFDY (SEQ ID NO: 132) A invenção refere-se também a uma cadeia leve humanizada compreendendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constitu-
: 10/222 ído por SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 121 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); uma cadeia leve humanizada compreen- dendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 122 (por exemplo, todas astrêsdas referidas CDRs); ou uma cadeia leve humanizada compreenden- do uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 123 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs). A invenção refere-se também a uma cadeia pesada humanizada compreendendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constitu- ido por SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 130 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); uma cadeia pesada humanizada compre- ] endendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por : SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 131 (por exemplo, todas astrêsdas referidas CDRs); ou uma cadeia pesada humanizada compreen- dendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 132 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs). As cadeias leves humanizadas e as cadeias pesadas humaniza- das da presente invenção são diferentes da cadeia leve humanizada e das cadeias pesadas humanizadas da imunoglobulina humanizada CampathO.
Em algumas concretizações da presente invenção, as imunoglo- bulinas humanizadas da invenção (independentemente da maneira na qual possam ser de outra forma definidas, por exemplo, indiferentemente do fato de poderem ser definidas também em termos da sequência de uma ou mais de suas CDRs e/ou por sua reatividade cruzada com um anticorpo monocio- nal de camundongo ou outra imunoglobulina humanizada): (1) exibem liga- ção à CD52 glicosilada e desglicosilada sem preferência aparente; (2) exi- bem ligação específica por CD52 glicosilada; (3) exibem ligação específica por CDB52 desglicosilada; ou (4) exibem ligação preferencial por CD52 des- glicosilada sobre a glicosilada.
Em certas concretizações, as imunoglobuli- nas humanizadas da invenção possuem maior afinidade de ligação por
J 11/222 CD52 humana glicosilada do que por CD52 humana não glicosilada ou des- glicosilada. De fato, em certas concretizações da presente invenção, as imu- noglobulinas humanizadas da presente invenção exibem ligação que é es- pecífica por CD52 humana glicosilada. A afinidade de ligação por CD52 hu- mana não glicosilada ou desglicosilada pode ser determinada com o uso de CD52 humana madura que tenha sido desglicosilada usando uma glicosida- se, por exemplo, usando a endoglicosidase PNGase-F. Em certas concreti- zações da presente invenção, as imunoglobulinas humanizadas da invenção ligam-se a um epítopo em CD52 humana madura que compreende seu gru- po carboidrato N-ligado. Este grupo carboidrato é uma polilactosamina siali- lada contendo núcleo fucosilado de oligossacarídeo N-ligado com estrutura tetra-antenária (Treumann, A. et al., (1995) J. Biol. Chem. 270:6088-6099).
À Este epítopo pode compreender também pelo menos o resíduo 1 da se- r quência da CD52 humana madura, pelo menos o resíduo 3 da sequência da CD52 humana madura, pelo menos os resíduos 1, 3, 4 e 5 da sequência da CD52 humana madura ou pelo menos os resíduos 1, 2, 3, 4 e 5 da sequên- cia da CD52 humana madura. Em algumas concretizações, os anticorpos de camundongo ou quiméricos da presente invenção podem possuir qualquer uma dessas características de ligação.
Moléculas isoladas de ácido nucleico que codificam uma imuno- globulina humanizada, cadeia leve humanizada ou cadeia pesada humani- zada da invenção, conforme definidas em outro lugar neste relatório descriti- vo, são também providas. Em algumas concretizações, a invenção é uma (uma ou mais) molécula isolada de ácido nucleico, codificador de uma ca- deia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associ- am para formar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de |i- gação por CD52 humana, em que a cadeia leve humanizada compreende uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 3 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, to- dasastrêsCDRs)daSEQID NO: 16; uma cadeia leve compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as trêê CDRs) da SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as
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Í três CDRs) da SEQ ID NO: 17; uma cadeia leve compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 5 e uma ca- deia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 18; uma cadeia leve compreendendo uma ou maisCDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 6 e uma ca- deia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 19; uma cadeia leve compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 7 e uma ca- deia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 20; uma cadeia leve compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 8 e uma ca- deia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as ' três CDRs) da SEQ ID NO: 21; uma cadeia leve compreendendo uma ou 5 mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 9 e uma ca- deia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 22; uma cadeia leve compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 10 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 23; uma cadeia leve compreendendo uma ou maisCDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 11 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 24; uma cadeia leve compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 12 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 25; uma cadeia leve compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 12 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 137; ou uma cadeia leve compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 13 e uma cadeia pesada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) da SEQ ID NO: 26. Em algumas concretizações, a invenção é uma ou mais molécu-
- 13/222 las isoladas de ácido nucleico codificador de uma cadeia pesada humaniza- da e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma i- munoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 huma- na, em que a imunoglobulina humanizada liga-se ao mesmo epítopo em CD52 humana que um anticorpo monoclonal de camundongo, compreen- dendo uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 16; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 18; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 6 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 7 e uma região Á variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia " leve da SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 21; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 22; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23; uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 24; uma região variável de cadeia leveda SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 25; ou uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 13 e uma re- gião variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 26. Em outras concretiza- ções, a invenção é uma ou mais moléculas isoladas de ácido nucleico, codi- ficador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humaniza- da que se associam para formar uma imunoglobulina humanizada com es- pecificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina huma- nizada liga-se a um epítopo em CD52 humana que se sobrepõe ao epítopo ao qual tal anticorpo monoclonal de camundongo se liga.
Em outras concretizações, a invenção é uma ou mais moléculas isoladas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imuno- globulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em
' 14/222 que a imunoglobulina humanizada liga-se a um epítopo, compreendendo pelo menos o resíduo 1 da CD52 humana madura; a imunoglobulina huma- nizada liga-se a um epítopo, compreendendo pelo menos os resíduos 1, 3, 4 e 5 da CD52 humana madura; a imunoglobulina humanizada liga-se a um epítopo, compreendendo pelo menos os resíduos 1, 2, 3, 4 e 5 da CDS52 humana madura; ou a imunoglobulina humanizada liga-se a um epítopo, compreendendo pelo menos os resíduos 7, 8 e 9 da CD52 humana madura. Em algumas concretizações, o epitopo compreende pelo menos os resíduos 7, 8 e 11 da sequência da CD52 humana madura. Em algumas concretiza- ções,oepítopocompreende pelo menos os resíduos 4 e 11 da sequência da CD52 humana madura.
Em outras concretizações, a invenção é uma ou mais moléculas i isoladas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e - de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imuno- —globulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada compreende uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 121 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs), e/ou uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 130 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 122 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs), e/ou uma cadeia pesada inclu- indouma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 131 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); ou uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs sele- cionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 123 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs), e/ou uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 132 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs).
' 15/222 Em certas concretizações, a invenção é uma ou mais moléculas isoladas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imuno- globulina humanizada com especificidade de ligação por CDS52 humana, em queaimunoglobulina humanizada compreende uma cadeia leve incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 121 e uma ca- deia pesada incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 130; uma cadeia leve incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 122 e uma cadeia pesada incluindo as CDRs de SEQIDNO: 125, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 131; ou uma cadeia leve incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 123 e uma cadeia pesada incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 132. - O único ou mais ácidos nucleicos da invenção não codificam a imunoglobulina humanizada CampathO.
Em outras concretizações, a invenção é uma ou mais moléculas isoladas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imuno- globulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada possui maior afinidade de ligação por CD52 humana glicosilada ou desglicosilada, por exemplo, exibe ligação que é específica por CD52 humana glicosilada. A imunoglobulina humanizada pode ligar-se a um epítopo em CD52 humana madura que compreende seu grupo carboidrato A-ligado. Este epítopo pode compreender também pelo menos o resíduo 1 da sequência da CD52 humana madura, pelo menos o resíduo 3 da sequência da CD52 humana madura, pelo menos os resíduos 1,3, 4 e 5 da sequência da CD52 humana madura ou pelo menos os resí- duos 1, 2, 3, 4e 5 da sequência da CD52 humana madura. Em outras concretizações, a invenção é uma molécula isolada de ácido nucleico, codificador de uma cadeia leve humanizada, compreen- dendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID
' 16/222 NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, em que a cadeia leve humanizada não é a cadeia leve hu- manizada de CampathO.
Em outras concretizações, a invenção é uma molécula isolada deácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada, compre- endendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 137, em que a cadeia pesada hu- manizada não é a cadeia pesada humanizada de Campath€E.
Em outras concretizações, a invenção é uma molécula isolada de ácido nucleico, codificador de uma cadeia leve humanizada, compreen- À dendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por - SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ [ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48, ou uma combinação destas, em que a cadeia leve humanizada não é a cadeia leve humanizadade Campath€.
Em outras concretizações, a invenção é uma molécula isolada de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada, compre- endendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID —NO:53,SEQID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 294, ouuma combinação destas, em que a cadeia pesada humanizada não é a cadeia pesada humanizada de Campath€.
Em outras concretizações, a invenção é uma molécula isolada
- 17/222 | de ácido nucleico, codificador de uma cadeia leve humanizada, compreen- dendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 121 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); uma cadeia leve humanizada compreendendo uma oumaisCDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 122 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); ou uma cadeia leve humanizada compreendendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 123 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs).
Em outras concretizações, a invenção é uma molécula isolada de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada, compre- : endendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por : SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 130 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); uma cadeia pesada humanizada compreen- dendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 131 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); ou uma cadeia pesada humanizada compreen- dendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQID NO: 126, SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 132 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs).
A invenção refere-se também a vetores recombinantes (por e- xemplo, vetores de expressão, incluindo vetores de expressão em células de mamíferos) que compreendem um ácido nucleico codificador de uma imuno- —globulina humanizada (por exemplo, uma cadeia leve humanizada e uma cadeia pesada humanizada), uma cadeia leve humanizada ou uma cadeia pesada humanizada da invenção. Em algumas concretizações, a invenção é um vetor recombinante, compreendendo um ácido nucleico codificador de uma imunoglobulina humanizada que compreende uma cadeia leve, incluin- douma ou maisCDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 3 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 16; uma cadeia leve incluindo uma ou mais C-
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DRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pe- sada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 17; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 5 e uma cadeia pesada incluindo uma oumaisCDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 18; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 6 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 19; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 20; uma cadeia leve incluindo uma ou mais C- DRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 8 e uma cadeia pe- sada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de : SEQ ID NO: 21; a cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 22; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 10 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 23; uma cadeia leve incluindo uma oumaisCDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 11 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 24; uma cadeia leve incluindo uma ou mais C- DRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQIDNO: 25; uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as trêê CDRs) de SEQ ID NO: 137; ou uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 13 e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais C-
DRs (porexemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 26. Em outras concretizações, o vetor recombinante compreende um ácido nucleico codificador de uma cadeia leve humanizada, em que a
- 19/222 cadeia leve humanizada compreende uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38,SEQIDNO:39,SEQID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48, ou uma combinação destas, em que a cadeia leve huma- nizada não é a cadeia leve humanizada de Campath€O. Em outras concretizações o vetor recombinante compreende um ácido nucleico codificador de uma cadeia pesada humanizada, em que a cadeia pesada humanizada compreende uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: : 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ . ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 294, ou uma combinação destas, em que a cadeia leve humanizada não é a cadeia leve humanizada de Campath€.
Em algumas concretizações, a invenção provê um vetor recom- binante compreendendo uma molécula de ácido nucleico, ou um par de veto- res recombinantes compreendendo moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imunoglobulina humanizada com especificida- dedeligaçãoporCD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada liga- se ao mesmo epítopo em CD52 humana que um anticorpo monoclonal de camundongo compreendendo uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 16; uma regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18; uma regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6 e uma região variável de cadeia
- 20/222 i pesada de SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 20; uma regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO:9euma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 22; uma regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de ca- deia pesada de SEQ ID NO: 23; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 25; ou uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26. Em outras concretizações, a invenção provê um vetor recombinante com- Ú preendendo uma molécula de ácido nucleico, ou um par de vetores recombi- nantes compreendendo moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se asso- ciam para formar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada liga-se a um epítopo em CD52 humana que se sobrepõe ao epítopo ao qual tal anti- corpo monocional de camundongo se liga.
Em outras concretizações, o vetor recombinante compreende uma molécula de ácido nucleico, ou um par de vetores recombinantes com- preende moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada liga-se a um epítopo com- preendendo pelo menos o resíduo 1 de CD52 humana madura; liga-se a um epítopo compreendendo pelo menos os resíduos 1, 3, 4 e 5 de CD52 huma- na madura; liga-se a um epítopo compreendendo pelo menos os resíduos 1, 2,3,4 e 5 de CD52 humana madura; ou liga-se a um epítopo compreenden- do pelomenos os resíduos 7, 8 e 9 de CD52 humana madura. Em algumas concretizações, o epitopo compreende pelo menos os resíduos 7, 8 e 11 da sequência da CD52 humana madura. Em algumas concretizações, o epítopo
' 21/222 compreende pelo menos os resíduos 4 e 11 da sequência da CD52 humana madura. Em algumas concretizações, o vetor recombinante compreende uma molécula de ácido nucleico, ou um par de vetores recombinantes com- preende moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada compreende uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído porSEQID NO: 115, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 121 (por exemplo, to- das as três das referidas CDRs), e/ou uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 124, ' SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 130 (por exemplo, todas as três das referi- : das CDRs); uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 122 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs), e/ou uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constitu- ido por SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 131 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); ou uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 123 (por exemplo, todas as três das referi- das CDRs), e/ou uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs selecio- nadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 132 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs).
Em certas concretizações, o vetor recombinante compreende uma molécula de ácido nucleico, ou um par de vetores recombinantes com- preende moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada compreende uma cadeia leve, incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 121, e uma cadeia pesada incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 124, SEQ ID y 22/222 NO: 127 e SEQ ID NO: 130; uma cadeia leve, incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 122, e uma cadeia pesada incluin- do as CDRs de SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 131; ou uma cadeia leve, incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120 e SEQIDNO:123,e uma cadeia pesada incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 132.
O único ou mais ácidos nucleicos no vetor ou nos vetores re- combinantes da presente invenção não codificam a imunoglobulina humani- zada Campath€.
Em outras concretizações, o vetor recombinante compreende uma molécula de ácido nucleico, ou um par de vetores recombinantes com- preende moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada É humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar ' uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada possui maior afinidade de ligação por CD52 humana glicosilada do que por CD52 humana não glicosi- lada ou desglicosilada, por exemplo, exibe ligação que é específica por CD52 humana glicosilada. A imunoglobulina humanizada pode ligar-se a um epítopo em CD52 humana madura que compreende seu grupo carboidrato NHigado. Este epítopo pode compreender também pelo menos o resíduo 1 da sequência da CD52 humana madura, pelo menos o resíduo 3 da sequên- cia da CD52 humana madura, pelo menos os resíduos 1, 3, 4 e 5 da se- quência da CD52 humana madura ou pelo menos os resíduos 1,2,3,4e5 da sequência da CD52 humana madura.
Em outras concretizações, o vetor recombinante compreende uma molécula de ácido nucleico, codificador de uma cadeia leve humaniza- da compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:120uSEQID NO: 13, em que a cadeia leve humanizada não é a ca- deia leve humanizada de Campath€.
Em outras concretizações, o vetor recombinante compreende
' 23/222 í uma molécula de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humani- zada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três C- DRs) de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQIDNO:25,SEQID NO: 26 ou SEQ ID NO: 137, em que a ca- deia pesada humanizada não é a cadeia pesada humanizada de Campath€. Em outras concretizações, o vetor recombinante compreende uma molécula de ácido nucleico, codificador de uma cadeia leve humaniza- da compreendendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo cons- tituído por SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 121 (por exem- plo, todas as três das referidas CDRs); uma cadeia leve humanizada com- preendendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído ' por SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 122 (por exemplo, to- : das as três das referidas CDRs); ou uma cadeia leve humanizada compre- endendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEOQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 123 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs), em que a cadeia leve humanizada não é a ca- deia leve humanizada de Campath€.
Em outras concretizações o vetor recombinante compreende uma molécula de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humani- zada compreendendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 130 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); a cadeia pesada humanizada compreendendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constitu- íidopor SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 131 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); ou uma cadeia pesada humanizada com- preendendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 132 (por exemplo, to- das as três das referidas CDRs), em que a cadeia pesada humanizada não é acadeiapesada humanizada de Campath€. In particular concretizações, o vetor recombinante da invenção é um vetor de expressão, tal como vetor de expressão em célula de mamífe-
: 24/222 ros.
Em certas concretizações, o vetor é plasmídeo ou vetor viral (por exem-
plo, vetor adenoviral ou AAV). A invenção refere-se também a uma célula hospedeira que compreende um (um ou mais) ácido nucleico (por exemplo, recombinante), codificador de uma imunoglobulina humanizada (cadeia leve humanizada e cadeia pesada humanizada), uma cadeia leve humanizada ou de uma ca- deia pesada humanizada da invenção.
Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende um vetor recombinante (por exemplo, vetor de ex- pressão, incluindo vetores de expressão em células de mamíferos) da inven-
ção
Em uma concretização específica, a célula hospedeira compre- ende um ácido nucleico (um ou mais ácidos nucleicos), codificador de uma : cadeia leve humanizada e de uma cadeia pesada humanizada, em que a ' cadeia leve humanizada e a cadeia pesada humanizada se associam para formar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana e em que a imunoglobulina humanizada compreende uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 3, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 16; uma cadeia leve, incluindo uma oumaisCDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 4, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 17; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais C- DRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 5, e uma cadeia pe- sada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQIDNO: 18; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exem- plo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 6, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 19; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 7, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 20; uma cadeia leve, in- cluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 8, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo,
: 25/222 todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 21; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 9, e uma ca- deia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três C- DRs) de SEQ ID NO: 22; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 10, e uma cadeia pesada in- cluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 23; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 11, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 24; uma ca- deialeve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 12, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 25; uma cadeia leve, incluindo À uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 12, e EF uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 137; ou uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 13, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de
SEQ ID NO: 26. Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesa- da humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada liga-se ao mesmo epí- topo em CD52 humana que um anticorpo monoclonal de camundongo, com- —preendendo uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 3 e uma re- gião variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 16; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 20; uma região variável de
. 26/222 cadeia leve de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 22; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada de SEQID NO: 23; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24; uma região variá- vel de cadeia leve de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesa- da de SEQ ID NO: 25; ou uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26. Em outras concretizações, a célula hospedeira compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imunoglobulina ; humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a : imunoglobulina humanizada liga-se a um epítopo em CD52 humana que se sobrepõe ao epítopo ao qual tal anticorpo monoclonal de camundongo se liga.
Em outras concretizações, a célula hospedeira compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada liga-se a um epítopo com- preendendo pelo menos o resíduo 1 de CD52 humana madura; liga-se a um epítopo compreendendo pelo menos os resíduos 1, 3, 4 e 5 de CD52 huma- na madura; liga-se a um epítopo compreendendo pelo menos os resíduos 1, 2,3/46e5deCD52 humana madura; ou liga-se a um epítopo compreenden- do pelo menos os resíduos 7, 8 e 9 de CD52 humana madura. Em algumas concretizações, o epitopo compreende pelo menos os resíduos 7, 8 e 11 da sequência da CD52 humana madura. Em algumas concretizações, o epítopo compreende pelo menos os resíduos 4 e 11 da sequência da CD52 humana madura.
Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesa-
: 27/222 da humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada compreende uma ca- deia leve, incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo cons- tituído por SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 121 (por exem- plo, todas as três das referidas CDRs), e/ou uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 130 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs sele- cionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 122 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs), e/ou uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do ' grupo constituído por SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 131 ' (por exemplo, todas as três das referidas CDRs); ou uma cadeia leve, inclu- indo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ 1D NO: 117, SEQ 1D NO: 120 e SEQ ID NO: 123 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs), e/ou uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 132 (por exemplo, todas as três das referidas CDRs).
Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesa- da humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada compreende uma ca- deialeve, incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 121, e uma cadeia pesada incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 130; uma cadeia leve, incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 122, e uma cadeia pesada incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 131; ou uma cadeia leve, incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 123, e uma cadeia pesada incluindo as CDRs de SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 132.
. 28/222 Em outras concretizações, a célula hospedeira compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada e de uma cadeia leve humanizada que se associam para formar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a imunoglobulina humanizada possui maior afinidade de ligação por CD52 humana glicosilada do que por CD52 humana não glicosi- lada ou desglicosilada, por exemplo, exibe ligação que é específica por CD52 humana glicosilada. A imunoglobulina humanizada pode ligar-se a um epítopo em CD52 humana madura que compreende seu grupo carboidrato NHigado. Este epítopo pode compreender também pelo menos o resíduo 1 da sequência da CD52 humana madura, pelo menos o resíduo 3 da sequên- cia da CD52 humana madura, pelo menos os resíduos 1, 3, 4 e 5 da se- Ú quência da CD52 humana madura ou pelo menos os resíduos 1,2,3,4e5 . da sequência da CD52 humana madura.
Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende uma molécula de ácido nucleico, codificador de uma cadeia leve humaniza- da compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:120uSEQID NO: 13. A cadeia leve humanizada não é a cadeia leve humanizada de Campath€.
Em outras concretizações, a célula hospedeira compreende uma molécula de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada compreendendo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQIDNO:16,SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEOQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 137. A cadeia pesada hu- manizada não é a cadeia pesada humanizada de Campath€.
Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende uma molécula de ácido nucleico, codificador de uma cadeia leve humaniza- da, em que a cadeia leve humanizada compreende uma ou mais CDRs se- lecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28,
- 29/222 Í SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQIDNO:47eSEQID NO: 48 ou uma combinação destas, em que a ca- deia leve humanizada não é a cadeia leve humanizada de Campath€O.
Em outras concretizações, a célula compreende uma molécula de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada humanizada, em que a cadeia pesada humanizada compreende uma ou mais CDRs selecionadas a —partirdo grupo constituído por SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: : 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ 1 ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73,SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 294, ou uma combinação destas, em que a cadeia pesada humanizada não é a cadeia pesada humanizada de Campath€. A invenção refere-se também a um método para preparar uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 huma- na,compreendendo manter uma célula hospedeira a invenção (por exemplo, uma célula hospedeira que contenha um ou mais ácidos nucleicos recombi- nantes que codificam uma imunoglobulina humanizada da invenção (por e- xemplo, uma cadeia leve humanizada e uma cadeia pesada humanizada da invenção)) em condições apropriadas para expressão de uma imunoglobuli- na humanizada, pelo qual, cadeias da imunoglobulina humanizada são ex- pressas e uma imunoglobulina humanizada é produzida.
Em algumas con- cretizações, o método compreende ainda purificar ou isolar a imunoglobulina humanizada.
Em algumas concretizações, o método compreende ainda combinar a imunoglobulina humanizada purificada ou isolada a um veículo ou carreador fisiologicamente aceitável para produzir uma composição far- macêutica.
A invenção refere-se também a um método para preparar uma
- 30/222 cadeia leve humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana, compreendendo manter uma célula hospedeira da invenção (por exemplo, uma célula hospedeira que contenha um ou mais ácidos nucleicos recombi- nantes que codificam uma cadeia leve humanizada da invenção) em condi- ções apropriadas para expressão de uma cadeia leve humanizada, pelo qual, uma cadeia leve humanizada é expressa e uma cadeia leve humaniza- da é produzida.
Em algumas concretizações, o método compreende ainda purificar ou isolar a cadeia leve humanizada.
A invenção refere-se também a um método para preparar uma cadeia pesada humanizada com especificidade de ligação por CD52 huma- na, compreendendo manter uma célula hospedeira da invenção (por exem- plo, uma célula hospedeira que contenha um ou mais ácidos nucleicos re- Ú combinantes que codificam uma cadeia pesada humanizada da invenção) - em condições apropriadas para expressão de cadeia pesada humanizada, —peloqual, uma cadeia pesada humanizada é expressa e uma cadeia pesada humanizada é produzida.
Em algumas concretizações, o método compreen- de ainda purificar ou isolar a cadeia pesada humanizada.
A invenção refere-se ainda a uma composição farmacêutica, contendo uma imunoglobulina humanizada da invenção (por exemplo, com- —preendendo uma cadeia leve humanizada da invenção e/ou uma cadeia pe- sada humanizada da invenção) e um veículo ou um carreador fisiologica- mente aceitável.
Em algumas concretizações, a composição farmacêutica compreende uma composição de dose unitária.
A invenção refere-se ainda a um método para produzir um hibri- —doma que secreta um anticorpo monoclonal com especificidade de ligação por CD52 humana, compreendendo administrar linfócitos a um camundongo transgênico para CD52 humana a um camundongo não transgênico da mesma linhagem, ou de semelhante (por exemplo, CD1) que o camundongo transgênico para a CD52 humana, produzindo, pelo mesmo, um camundon- go não transgênico imunizado.
Esplenócitos do camundongo não transgêni- co imunizado são fundidos com células imortalizadas, produzindo com isso um hibridoma.
O hibridoma é mantido em condições nas quais secretará um
' 31/222 i anticorpo monoclonal tendo especificidade de ligação por CD52 humana. Em algumas concretizações, a análise por FACS é utilizada para detectar um hibridoma que secrete um anticorpo monocional com especificidade de liga- ção por CD52 humana. Em outras concretizações, uma linhagem do camun- —dongo transgênico e a linhagem do camundongo não transgênico são idênti- cas. Em certas concretizações, a CD52 é CD52 humana do tipo selvagem. Em algumas concretizações, o camundongo transgênico para CD52 e o ca- mundongo não transgênico são camundongos CD1. Em algumas concreti- zações, os linfócitos usados para imunização são obtidos do baço do ca- —mundongo transgênico para CD52 humana. Em algumas concretizações, as células imortalizadas são selecionadas a partir do grupo constituído por célu- las SP2/0 Ag14 e células de mieloma NS1. A invenção refere-se também a : um hibridoma produzido pelos métodos da invenção. Opcionalmente, o anti- : corpo monoclonal secretado pelo hibridoma é coletado e pode ser ainda pu- rificado (por exemplo, substancialmente purificado, isolado). Em outras con- cretizações, o método compreende ainda determinar a sequência de nucleo- tídeos do anticorpo monoclonal secretado pelo hibridoma. A invenção refere-se também a um método para tratar uma do- ença autoimune (por exemplo, esclerose múltipla (MS), artrite reumatoide (RA) (Consultar, por exemplo, Nature Reviews Drug Discovery 6: 75-92 (2007)), vasculite (Consultar, por exemplo, Rheumatology 39:229-237 (2000)), doença de Behcet (BD) (Consultar, por exemplo, Rheumatology 42:1539-1544 (2003)), lúpus e doença celíaca (Vivas, S., et al., N. Engl. J. Med., 354(23):2514-2515 (2006)), vasculite, psoríase, miosite, esclerodermi- a, anemia aplásica e colite) em um paciente em necessidade deste, compre- endendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de uma imunoglo- bulina humanizada da invenção.
Em outro aspecto, uma quantidade eficaz de uma imunoglobuli- na humanizada da invenção pode ser administrada em conjunto com um ou mais agentes imunossupressores para preparar um paciente em necessida- de deste para transplante de órgão sólido (Agarwal et a/l., Transplant Immu- nol., 20:6-11 (2008)) ou transplante de células-tronco CD34+ (Burt et al., The
. 32/222 Lancet, publicação online de 30 de janeiro de 2009).
A invenção refere-se também a um método para tratar câncer em um paciente em necessidade deste, compreendendo administrar ao pa- ciente uma quantidade eficaz de uma imunoglobulina humanizada da inven- ção.
A invenção refere-se também a um método para tratar esclerose múltipla em um paciente em necessidade deste, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de uma imunoglobulina humanizada da invenção.
A invenção refere-se também a um método para tratar leucemia linfocítica crônica em um paciente em necessidade deste, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de uma imunogliobulina hu- ] manizada da invenção. . A administração de uma imunoglobulina humanizada da presen- te invenção pode compreender a administração da imunoglobulina humani- zada per se (por exemplo, em uma composição farmacêutica), a administra- ção de um ou mais vetores recombinantes codificadores da imunoglobulina humanizada ou a administração de uma célula hospedeira que compreenda um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, um ou mais vetores recombinan- tes) codificadores das imunoglobulinas humanizadas e que expresse a imu- noglobulina humanizada.
A invenção refere-se também a um método para diagnosticar uma doença selecionada a partir do grupo constituído por doenças autoimu- nes (por exemplo, esclerose múltipla, lúpus, vasculite), câncer (por exemplo, leucemias (por exemplo, leucemia linfocítica crônica) e linfomas (por exem- plo, linfoma não Hodgkin)), transplante (por exemplo, transplante de órgão sólido (por exemplo, transplante de rim) e transplante de células-tronco), compreendendo analisar a amostra de um paciente in vitro com uma imuno- globulina humanizada da invenção.
A invenção refere-se também a uma imunoglobulina humanizada da invenção (por exemplo, compreendendo uma cadeia leve humanizada da invenção e/ou cadeia pesada humanizada da invenção), um vetor recombi-
: 33/222 ' nante da invenção ou a uma célula hospedeira da invenção para uso em medicina, tal como para uso em terapia e/ou diagnóstico de uma doença, tal como para uso em tratar uma doença ou transtorno descrito neste relatório, tal como doença autoimune (por exemplo, esclerose múltipla, artrite reuma- toideelúpus), câncer, condições hiperproliferativa de linfócitos (por exemplo, neoplasias malignas de células T ou B, incluindo leucemia, como leucemia linfocítica crônica de células B, e linfomas como linfoma não Hodgkin. Con- sultar, por exemplo, Lundin, J., et al., Blood, 101:4267-4272 (2003); Rodig, SJ., et al., Clinical Cancer Research, 12(23):7174-7179 (2006). A invenção refere-se também ao uso de uma imunoglobulina humanizada, cadeia leve humanizada ou cadeia pesada humanizada da invenção, vetor recombinante da invenção ou de uma célula hospedeira da invenção para a produção de ] um medicamento destinado ao tratamento de uma doença ou transtorno . descrito neste relatório (por exemplo, doenças autoimunes (por exemplo, esclerose múltipla, lúpus, vasculite), câncer (por exemplo, leucemias (por exemplo, leucemia linfocítica crônica) e linfomas (por exemplo, linfoma não Hodgkin)) e transplante (por exemplo, transplante de órgão sólido (por e- xemplo, transplante de rim) e transplante de células-tronco)). A invenção provê ainda anticorpos humanizados anti-CD52 hu- mana, compreendendo regiões framework da cadeia leve humana, que utili- zam gene humano Vk2-A18b no qual os resíduos 36 (Y) e 46 (L) (numera- ção de Kabat) foram substituídos. Em algumas concretizações, o resíduo 36 . é VouL e o resíduo 46 é R. A invenção provê também anticorpos humani- > zados anti-CD52 humana, compreendendo regiões framework da cadeia Y 25 pesada humana, que utilizam gene humano VH 3-23 no qual o resíduo 47 (W) (numeração de Kabat) foi substituído. Em algumas concretizações, os resíduos 47 (W) e 49 (S) (numeração de Kabat) foram ambos substituídos. Em algumas concretizações, o resíduo 47 é L e o resíduo 49 é S. Em outras concretizações, o resíduo 47 é Le o resíduo 49 É A.
Em algumas concretizações, um anticorpo humanizado anti- CD52 humana da invenção possui valor de ECso, conforme determinado em ensaio de ligação celular, tal como o ensaio descrito no Exemplo 29, que é
: 34/222 duas vezes mais baixo do que o valor de ECs5 para o anticorpo Campath- 1H8. Em várias concretizações, o valor de ECs5o do anticorpo humanizado anti-CD52 humana é de 11 nM ou menos. Em algumas concretizações, um anticorpo humanizado anti- CD52 humana da invenção liga-se a CD52 em células na presença de anti- corpos anti-Campath-1HO do soro de um paciente humano que foi tratado com Campath-1HO. Ou seja, a ligação de um anticorpo humanizado anti- CD52 humana da invenção a CD52 em células não é reduzida na presença de tais anticorpos anti-Campath-1HO, quando comparada à ligação de Cam- path-1H8aCD52, ou é menos reduzida na presença de tais anticorpos anti- Campath-1H& quando comparado à ligação de Campath-1H8 a CD52.
A invenção provê ainda anticorpos humanizados anti-CD52 hu- i mana com perfil de depleção de linfócitos em sangue e/ou baço de um anti- i corpo humanizado anti-CD52 humana provido neste relatório descritivo.
Em algumas concretizações, um anticorpo humanizado anti- CD52 humana da invenção aumenta o nível circulante de um ou mais de TNF-alfa, IL-6 e MCP-1 no soro de um indivíduo.
Em algumas concretizações, um anticorpo humanizado anti- CD52 humana da invenção reduz níveis de linfócitos em um indivíduo por pelomenos 30 dias, pelo menos 50 dias, pelo menos 60 dias, pelo menos 70 dias, pelo menos 80 dias ou por mais de 80 dias.
Em algumas concretizações, um anticorpo humanizado anti- ' CD52 humana da invenção retarda o aparecimento de doença e/ou diminui a gravidade de doença, conforme medido por escore clínico em modelo de * 25 EAEdecamundongo.
Em algumas concretizações, um anticorpo humanizado anti- CD52 humana da invenção é menos imunogênico do que Campath-1H6 em ensaio de imunogenicidade, tal como o ensaio descrito no Exemplo 69 ou
70.
—Imunoglobulinas monocionais de camundongo A invenção refere-se também a anticorpos monoclonais de ca- mundongo (imunoglobulinas monoclonais de camundongo) com especifici-
' 35/222 ' dade de ligação por CD52 humana.
Em uma concretização, a invenção refe- re-se a um anticorpo monoclonal de camundongo com especificidade de li- gação por CD52 humana, compreendendo uma cadeia leve, incluindo SEQ ID NO: 3, e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 16; uma cadeia leve, incluindo SEQ ID NO: 4, e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 17; uma cadeia leve, incluindo SEQ ID NO: 5, e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 18; uma cadeia leve, incluindo SEQ ID NO: 6, e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 19; uma cadeia leve, incluindo SEQ ID NO: 7, e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 20; uma cadeia leve, incluindo SEQIDNO:38, e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 21; uma cadeia leve, incluindo SEQ ID NO: 9, e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 22; uma cadeia leve, incluindo SEQ ID NO: 10, e uma cadeia pesada inclu- É indo SEQ ID NO: 23; uma cadeia leve, incluindo SEQ ID NO: 11, e uma ca- ' deia pesada incluindo SEQ ID NO: 24; uma cadeia leve, incluindo SEQ ID NO:12,e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 25; ou uma cadeia leve, incluindo SEQ ID NO: 13, e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 26. Em uma concretização, o anticorpo monoclonal de camundongo com especificidade de ligação por CD52 humana compreende uma região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO:3,SEQID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, ou uma região variável de cadeia pesada selecionada a par- . tir do grupo constituído por SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID * 25 NO 23,SEQIDNO: 24, SEQID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, ou tanto tal regi- ão variável de cadeia leve como tal região variável de cadeia pesada.
A invenção refere-se também a uma cadeia leve de imunoglobu- lina de camundongo, compreendendo a região variável de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQIDNO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13. A invenção refere-se também a uma cadeia pesada de imuno-
- 36/222 ' globulina de camundongo, compreendendo a região variável de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26.
De preferência, os anticorpos monoclonais de camundongo da presente invenção compreendem tanto uma cadeia leve de anticorpo de ca- mundongo da invenção como uma cadeia pesada de anticorpo de camun- dongo da invenção. Em algumas concretizações, a invenção provê uma i- munoglobulina monoclonal de camundongo que se liga ao mesmo epítopo em CD52 humana que um anticorpo monoclonal de camundongo compreen- dendo uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 16; uma região variável de cadeia Í leve de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID E NO: 17; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 22; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID y NO: 23; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24; uma região variável de cadeia * 25 levedeSEQIDNO: 12 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 25; ou uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13 e uma re- gião variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26. Em outras concretiza- ções, a invenção provê uma imunoglobulina monoclonal de camundongo que se liga a um epitopo em CD52 humana que se sobrepõe ao epítopo ao — qualtalanticorpo monoclonal de camundongo se liga.
Em outras concretizações, a invenção provê uma imunoglobulina monoclonal de camundongo que se liga a um epítopo, em CD52 humana,
- 37/222 í compreendendo pelo menos o resíduo 1 da sequência da CD52 humana madura. A imunoglobulina monoclonal de camundongo pode ligar-se a um epítopo compreendendo pelo menos os resíduos 1, 3, 4 e 5 da sequência da CD52 humana madura, pode ligar-se a um epítopo compreendendo pelo menos os resíduos 1,2,3,4e5da sequência da CDS52 humana madura ou pode ligar-se a um epítopo compreendendo pelo menos os resíduos 7, 8 e 9 da sequência da CD52 humana madura. Em algumas concretizações, o epí- topo compreende pelo menos os resíduos 7, 8 e 11 da sequência da CD52 humana madura. Em algumas concretizações, o epítopo compreende pelo menos os resíduos 4 e 11da sequência da CD52 humana madura. A invenção refere-se também a moléculas isoladas de ácido nu- cleico que codificam as imunoglobulinas monoclonais de camundongo, ca- ' deias leves de imunoglobulina de camundongo ou cadeias pesadas de imu- . noglobulina de camundongo da invenção. Em algumas concretizações, a invenção é uma molécula isolada de ácido nucleico, codificador de uma ca- deia pesada de imunoglobulina de camundongo e de uma cadeia leve de imunoglobulina de camundongo que se associam para formar uma imuno- globulina monoclonal de camundongo com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a cadeia leve de imunoglobulina de camundongo compreende uma região variável selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ . ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, ou a cadeia pesada de imunoglobulina de ca- mundongo compreende uma região variável selecionada a partir do grupo * 25 constituído por SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, ou tanto tal cadeia leve e tal cadeia pesada.
Em algumas concretizações, o ácido nucleico isolado codifica uma cadeia leve de imunoglobulina de camundongo que compreende uma região variável selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQID NO: 8,
. 38/222 Á SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13. Em outras concretizações, o ácido nucleico isolado codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo que compreende uma região variável selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26. A invenção refere-se também a vetores recombinantes (por e- xemplo, vetores de expressão, incluindo vetores de expressão em célula de mamífero) que compreendem um ácido nucleico codificador da imunoglobu- lina monoclonal de camundongo (por exemplo, uma cadeia leve de imuno- ' globulina de camundongo e uma cadeia pesada de imunoglobulina de ca- BR mundongo), da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo ou da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo da invenção.
Em algumas con- cretizações, a invenção é um vetor recombinante compreendendo um ácido nucleico, ou um par de vetores recombinantes compreendendo ácidos nucle- icos codificadores de uma imunoglobulina monoclonal de camundongo que compreende uma região variável de cadeia leve selecionada a partir do gru- po constituído por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, ou uma região variável de cadeia . pesada selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: * 25 21,SEQIDNO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, ou tanto tal região variável de cadeia leve como ta! região variá- vel de cadeia pesada.
Em outras concretizações, o vetor recombinante compreende um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina de ca- —mundongo, em que a cadeia leve de imunoglobulina de camundongo com- preende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11,
. 39/222 i SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13.
Em outras concretizações, o vetor recombinante compreende um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, em que a cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo compreende SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26.
Em outras concretizações, o vetor recombinante compreende um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina de ca- mundongo e uma cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, em que a cadeia leve de imunoglobulina de camundongo e a cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo se associam para formar uma imunoglobuli- ] na monoclonal de camundongo com especificidade de ligação por CD52 : humana. Em uma concretização, a cadeia leve de imunoglobulina de ca- mundongo compreende uma região variável selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, e a cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo compreende uma região variável selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26. . Em concretizações específicas, o vetor recombinante da inven- ção é um vetor de expressão, tal como vetor de expressão em célula de * 25 mamífero. Em certas concretizações, o vetor é plasmídeo ou vetor viral (por exemplo, vetor adenoviral ou AAV).
A invenção refere-se também a uma célula hospedeira que compreende um ou mais ácidos nucleicos codificadores da imunoglobulina monoclonal de camundongo (cadeia leve de imunoglobulina de camundongo e cadeiapesada de imunogiobulina de camundongo), da cadeia leve de i- munoglobulina de camundongo ou da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo da invenção. Por exemplo, em algumas concretizações, a célu-
> 40/222 i la hospedeira compreende um vetor recombinante (por exemplo, vetor de expressão, vetor de expressão em célula de mamífero) da invenção. Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende ácido nucleico codificador de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo fede cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, em que a cadeia leve de imunoglobulina de camundongo e a cadeia pesada de imunoglobuli- na de camundongo se associam para formar uma imunoglobulina monoclo- nal de camundongo com especificidade de ligação por CD52 humana e em que a cadeia leve de imunoglobulina de camundongo compreende uma regi- ão variável, selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID ] NO: 13, e/ou a cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo compre- : ende uma região variável selecionada a partir do grupo constituído por SEQ IDNO:16,SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, ou ambas. Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende ácido nucleico codificador de cadeia leve de imunoglobulina de camundon- go,em que a cadeia leve de imunoglobulina de camundongo compreende uma região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13.
* 25 Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende ácido nucleico codificador de cadeia pesada de imunoglobulina de camun- dongo, em que a cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo com- preende uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19,SEQID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26. A invenção refere-se também a um método para preparar uma
. 41/222 < imunoglobulina monoclonal de camundongo, compreendendo manter uma célula hospedeira da invenção (por exemplo, célula hospedeira que conte- nha um ou mais ácidos nucleicos recombinantes (por exemplo, vetores re- combinantes) que codificam uma imunoglobulina monoclonal de camundon- go (por exemplo, cadeia leve de imunoglobulina de camundongo e cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo) da invenção) em condições a- propriadas para expressão de uma imunoglobulina monoclonal! de camun- dongo, pelo qual, cadeias de imunoglobulina monocional de camundongo são expressas e uma imunoglobulina monoclonal de camundongo é produ- zida Em algumas concretizações, o método compreende ainda purificar ou isolar a imunoglobulina monoclonal de camundongo.
A invenção refere-se também a um método para preparar uma ' cadeia leve de imunoglobulina monocilonal de camundongo, compreendendo : manter uma célula hospedeira da invenção, contendo ácido nucleico codifi- —cadorde uma cadeia leve de imunoglobulina de camundongo da invenção, em condições apropriadas para expressão da referida cadeia leve de imuno- globulina de camundongo, pelo qual uma cadeia leve é expressa. Em algu- mas concretizações, o método compreende ainda purificar ou isolar a cadeia leve.
The invenção refere-se também a um método para preparar uma cadeia pesada de imunoglobulina monoclonal de camundongo, compreen- dendo manter uma célula hospedeira da invenção, contendo ácido nucleico . codificador de uma cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo da invenção, em condições apropriadas para expressão da referida cadeia pe- * 25 sada de imunoglobulina de camundongo, pelo qual uma cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo é expressa. Em algumas concretizações, o método compreende ainda purificar ou isolar a cadeia pesada de imunoglo- bulina de camundongo. A invenção refere-se também a um método para diagnosticar uma doença (por exemplo, doenças autoimunes (por exemplo, esclerose múltipla, lúpus, vasculite), câncer (por exemplo, leucemias (por exemplo, leucemia linfocítica crônica) e linfomas (por exemplo, linfoma não Hodgkin))
+ 42/222 á e transplante (por exemplo, transplante de órgão sólido (por exemplo, trans- plante de rim) e transplante de células-tronco)), compreendendo analisar a amostra de um paciente in vitro, com a imunoglobulina monoclonal de ca- mundongo da invenção (por exemplo, Lundin, J., et al., Blood, 101:4267- 4272 (2003); Rodig, SJ, et al, Clin Cancer res., 12(23);1174-117179 (2006)). Imunoglobulinas quiméricas A invenção refere-se também a imunoglobulinas quiméricas que possuem especificidade de ligação por CD52 humana.
Tais imunoglobulinas quiméricas podem incluir as regiões variáveis de qualquer uma das imuno- globulinas monocionais de camundongo da presente invenção.
Em uma concretização, a imunoglobulina quimérica da invenção compreende a regi- ' ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 3 e a região variável de cadeia ' pesada de SEQ ID NO: 16; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: d4earegião variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 17; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 5 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 19; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 20;aregião variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 9 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 22; a região . variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e a região variável de cadeia pe- sada de SEQ ID NO: 23; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 * 25 earegião variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 25; ou a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26. A invenção refere-se também a um anticorpo quimérico que possui especificidade de ligação por CD52 humana, compreendendo uma sequência de região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo constituído por: a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 3, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 4, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 5, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 9, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13, e/ou uma sequência de região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo constituído por: a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 16, a região variável decadeiapesada de SEQ ID NO: 17, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 19, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 20, a região variável de Ú cadeia pesada de SEQ ID NO: 21, a região variável de cadeia pesada de , SEQ ID NO: 22, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 23, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 25 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26. A invenção refere-se também a uma cadeia leve quimérica com- preendendo uma região variável selecionada a partir do grupo constituído porSEQID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13. : A invenção refere-se também a uma cadeia pesada quimérica compreendendo uma região variável selecionada a partir do grupo constituí- * 25 doporSEQID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26. De preferência, as imunoglobulinas quiméricas da presente in- venção compreendem tanto uma cadeia leve quimérica da invenção como uma cadeia pesada quimérica da invenção.
Em algumas concretizações, a invenção provê uma imunoglobu- lina quimérica que se liga ao mesmo epítopo em CD52 humana que um anti-
corpo monoclonal de camundongo compreendendo uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 16; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 22; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e ' uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 23; uma região variá- . vel de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia pesa- dade SEQ ID NO: 24; uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 25; ou uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26. Em outras concretizações, a imunoglobulina quimérica liga-se a um epitopo em CD52 humana que se sobrepõe ao epíto-
poaoqualtal anticorpo monoclonal de camundongo se liga.
Em outras concretizações, a invenção provê uma imunoglobulina quimérica que se liga a um epítopo, em CD52 humana, compreendendo pelo ' menos o resíduo 1 da sequência da CD52 humana madura.
A imunoglobuli- na quimérica pode ligar-se a um epítopo compreendendo pelo menos os re- * 25 síduos1,3,4e5 da sequência da CD52 humana madura, pode ligar-se a um epítopo compreendendo pelo menos os resíduos 1, 2, 3, 4 e 5 da se- quência da CD52 humana madura, ou pode ligar-se a um epítopo em CD52 humana compreendendo pelo menos os resíduos 7, 8 e 9 da sequência da CD52 humana madura.
Em algumas concretizações, o epítopo compreende pelomenos os resíduos 7,8 e 11 da sequência da CD52 humana madura.
Em algumas concretizações, o epitopo compreende pelo menos os resíduos
4 e 11 da sequência da CD52 humana madura.
A invenção refere-se também a moléculas isoladas de ácido nu- cleico que codificam as imunoglobulinas quiméricas, as cadeias leves quimé- ricas ou as cadeias pesadas quiméricas da invenção. Em algumas concreti- zações, a invenção é uma molécula isolada de ácido nucleico (uma ou mais — moléculas de ácido nucleico), codificador de uma cadeia pesada quimérica e de uma cadeia leve quimérica que se associam para formar uma imunoglo- bulina quimérica com especificidade de ligação por CD52 humana, em que a cadeia leve quimérica compreende uma região variável selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO:6,SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13; e/ou a cadeia pesada quimérica compreende uma região variável selecionada a partir do grupo ' constituído por SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID ' NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQIDNO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26.
Em algumas concretizações, a invenção é uma molécula isolada de ácido nucleico, codificador de uma cadeia leve quimérica que compreen- de a região variável de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQIDNO:11, SEQID NO: 12 ou SEQID NO: 13.
Em algumas concretizações, a invenção é uma molécula isolada de ácido nucleico, codificador de uma cadeia pesada quimérica que compre- ' ende a região variável de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID * 25 NO:23, SEQID NO: 24, SEQID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26.
A invenção refere-se também a vetores recombinantes (por e- xemplo, vetores de expressão, vetores de expressão em célula de mamífero) que compreendem um ácido nucleico codificador da imunoglobulina quiméri- ca (cadeia leve quimérica e cadeia pesada quimérica), da cadeia leve quimé- rica ou da cadeia pesada quimérica da invenção. Em algumas concretiza- ções, a invenção é um vetor recombinante compreendendo um ácido nuclei- co (ou par de vetores recombinantes compreendendo ácidos nucleicos), co-
dificador de uma imunoglobulina quimérica que compreende uma região va- riável de cadeia leve selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQIDNO:13;ouuma região variável de cadeia pesada selecionada a par- tir do grupo constituído por SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26; ou tanto tal ca- deia leve e cadeia pesada. Em outras concretizações, o vetor recombinante compreende um ácido nucleico codificador de uma cadeia leve quimérica, em que a ca- deia leve quimérica compreende a região variável de SEQ ID NO: 3, SEQ ID ' NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID : NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13. Em outras concretizações, o vetor recombinante compreende um ácido nucleico codificador de uma cadeia pesada quimérica, em que a cadeia pesada quimérica compreende a região variável de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 ou SEQIDNO:26. Em concretizações específicas, o vetor recombinante da inven- ção é um vetor de expressão, tal como vetor de expressão em célula de . mamífero. Em certas concretizações, o vetor é plasmídeo ou vetor viral (por exemplo, vetor adenoviral ou AAV).
“25 A invenção refere-se também a uma célula hospedeira que compreende um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, um ou mais vetores recombinantes), codificadores da imunoglobulina quimérica (cadeia leve quimérica e cadeia pesada quimérica), da cadeia leve quimérica ou da ca- deia pesada quimérica da invenção. Por exemplo, em algumas concretiza- ções,acélulahospedeira compreende um vetor recombinante (por exemplo, vetor de expressão, vetor de expressão em célula de mamífero) da inven- ção.
Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico recombinante (ou par de ácidos nucleicos recombinantes), codificador de uma cadeia leve quimérica e de uma cadeia pesada quiméri- ca, em que a cadeia leve quimérica e a cadeia pesada quimérica associam- separa formar uma imunoglobulina quimérica com especificidade de ligação por CD52 humana e em que a cadeia leve quimérica compreende uma regi- ão variável selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13; e/oua cadeia pesada quimérica compreende uma região variável sele- cionada a partir do grupo constituído pela região variável de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID À NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25e LF SEQ ID NO: 26.
Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico recombinante, codificador de uma cadeia leve quimérica, em que a cadeia leve quimérica compreende uma região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9,SEQID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQID NO: 12 e SEQ ID NO: 13.
Em algumas concretizações, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico recombinante, codificador de uma cadeia pesada quiméri- h ca, em que a cadeia pesada quimérica compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 16, - 25 SEQIDNO:17,SEQID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25e SEQ ID NO: 26. A invenção refere-se também a um método para preparar uma imunoglobulina quimérica, compreendendo manter uma célula hospedeira da invenção (por exemplo, célula hospedeira que contenha um ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam uma imunoglobulina quimérica (por exem- plo, cadeia leve quimérica e cadeia pesada quimérica) da invenção) em con-
dições apropriadas para expressão de uma imunoglobulina quimérica, pelo qual, cadeias de imunoglobulina quimérica são expressas e uma imunoglo- bulina quimérica é produzida. Em algumas concretizações, o método com- preende ainda purificar ou isolar a imunoglobulina quimérica.
A invenção refere-se também a um método para preparar uma cadeia leve quimérica, compreendendo manter uma célula hospedeira da invenção (por exemplo, célula hospedeira que contenha um ácido nucleico codificador de uma cadeia leve quimérica da invenção) em condições apro- priadas para expressão da referida cadeia leve quimérica, pelo qual uma cadeia leve quimérica é expressa e uma cadeia leve quimérica é produzida. Em algumas concretizações, o método compreende ainda purificar ou isolar a cadeia leve quimérica. ' A invenção refere-se também a um método para preparar uma : cadeia pesada quimérica, compreendendo manter uma célula hospedeira da invenção (por exemplo, célula hospedeira que contenha um ácido nucleico codificador de uma cadeia pesada quimérica da invenção) em condições apropriadas para expressão da referida cadeia pesada quimérica, pelo qual uma cadeia pesada quimérica é expressa e uma cadeia pesada quimérica é produzida. Em algumas concretizações, o método compreende ainda purifi- carouisolara cadeia pesada quimérica. A invenção refere-se também a um método para diagnosticar uma doença selecionada a partir do grupo constituído por doenças autoimu- . nes (por exemplo, esclerose múltipla, lúpus, vasculite), câncer (por exemplo, leucemias (por exemplo, leucemia linfocítica crônica) e linfomas (por exem- + 25 plo, linfoma não Hodgkin)) e transplante (por exemplo, transplante de órgão sólido (por exemplo, transplante de rim) e transplante de células-tronco), compreendendo analisar a amostra de um paciente in vitro, com a imunoglo- bulina quimérica da invenção. Concretizações adicionais desta invenção são descritas como segue. Em um aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal an- ti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, em que a cadeia leve e a cadeia pesada do referido anticorpo compreendem as três regiões de-
terminantes de complementaridade (CDRs) encontradas em: SEQ ID NOs: 3 e 16, respectivamente; SEQ ID NOs: 4 e 17, respectivamente; SEQ ID NOs: e 18, respectivamente; SEQ ID NOs: 6 e 19, respectivamente; SEQ ID NOs: 7 e 20, respectivamente; SEQ ID NOs: 8 e 21, respectivamente; SEQ 5 IDNOs:9e 22, respectivamente; SEQ ID NOs: 10 e 23, respectivamente; SEQ ID NOs: 11 e 24, respectivamente; SEQ ID NOs: 12 e 25, respectiva- mente; SEQ ID NOs: 12 e 137, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 13 e 26, respectivamente. Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em CD52 humana que o anticorpo —monoclonal ou parte de ligação a antígeno acima. Em algumas concretiza- ções, a invenção refere-se a um anticorpo que compreende o anticorpo mo- noclonal ou parte de ligação a antígeno acima. Em algumas concretizações, , a invenção refere-se a um anticorpo que compete de modo cruzado com o . anticorpo monoclonal ou parte de ligação a antígeno acima.
Em algumas concretizações, qualguer um dos anticorpos ou de partes de ligação a antígeno acima se liga a uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 104. Em algumas concretizações correlatas, é possível reduzir a ligação do referido anticorpo, ou da parte, à SEQ ID NO: 104 por substituição de alanina em um ou mais dos resíduos 4, 7, 8 ou 11 da SEQIDNO: 104.
Em algumas concretizações, o anticorpo é anticorpo humaniza- do, anticorpo de camundongo ou anticorpo quimérico. Em certas concretiza- . ções, as regiões framework da cadeia pesada do referido anticorpo utilizam uma sequência de VH3-72 ou VH3-23 de linhagem germinativa humana, e - 25 asregiões framework da cadeia leve do referido anticorpo utilizam uma se- quência de VK2 A18b de linhagem germinativa humana.
Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um anticor- po monoclonal anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, em que o referido anticorpo compreende (H)-CDR1, H-CDR2, H-CDR3 de ca- deia pesada e (L)-CDR1,L-CDR2 e L-CDR3 de cadeia leve, cujas sequên- cias de aminoácidos são SEQ ID NOs: 51, 59, 69, 29, 36 e 43, respectiva- mente; SEQ ID NOs: 50, 60, 69, 29, 37 e 43, respectivamente; SEQ ID NOs:
50, 61, 68, 29, 38 e 43, respectivamente; SEQ ID NOs: 50, 61, 69, 29, 36 e 43, respectivamente; SEQ ID NOs: 50, 62, 69, 29, 39 e 43, respectivamente; SEQ ID NOs: 52, 61, 70, 30, 40 e 43, respectivamente; SEQ ID NOs: 53, 63, 71,31, 36 e 44, respectivamente; SEQ ID NOs: 54, 64, 71, 31, 36 e 45, res- pectivamente; SEQ ID NOs: 55, 63, 72, 31, 36 e 46, respectivamente; SEQ ID NOs: 56, 65, 73, 32, 41 e 47, respectivamente; SEQ ID NOs: 56, 65, 294, 32, 41 e 47, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 56, 66, 74, 33, 41 e 48, res- pectivamente.
Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um anticor- po monoclonal anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, em que a cadeia leve e a cadeia pesada do referido anticorpo compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3 e 16, respectivamente; SEQ R ID NOs: 4 e 17, respectivamente; SEQ ID NOs: 5 e 18, respectivamente; . SEQ ID NOs: 6 e 19, respectivamente; SEQ ID NOs: 7 e 20, respectivamen- te; SEQID NOs: 8 e 21, respectivamente; SEQ ID NOs: 9 e 22, respectiva- mente; SEQ ID NOs: 10 e 23, respectivamente; SEQ ID NOs: 11 e 24, res- pectivamente; SEQ ID NOs: 12 e 25, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 13 e 26, respectivamente. Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um anticor- —pomonoclonal ou parte de ligação a antígeno deste, em que a cadeia pesa- da e a cadeia leve do referido anticorpo compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 103 e 102, respectivamente; SEQ ID NOs: ' 136 e 138, respectivamente; SEQ ID NOs: 137 e 138, respectivamente; SEQ ID NOs: 139 e 147, respectivamente; SEQ ID NOs: 149 e 155, respectiva- + 25 mente; SEQID NOs: 149 e 156, respectivamente; SEQ ID NOs: 158 e 165, respectivamente; SEQ ID NOs: 158 e 166, respectivamente; SEQ ID NOs: 159 e 165, respectivamente; SEQ ID NOs: 159 e 166, respectivamente; SEQ ID NOs: 161 e 166, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 163 e 166, respecti- vamente. Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um anticorpo que se ligaao mesmo epítopo em CD52 humana que o anticorpo monocio- nal ou parte de ligação a antígeno acima. Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um anticorpo que compete com o anticorpo monocional ou parte de ligação a antígeno acima.
Em algumas concretizações, a inven- ção refere-se a um anticorpo de compete de modo cruzado com o anticorpo monoclional ou parte de ligação a antígeno acima.
Em certas concretizações, a invenção refere-se a um anticorpo —monocional humanizado anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, em que a cadeia pesada e a cadeia leve do referido anticorpo com- preendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 272 e 273, res- pectivamente, sem as sequências de sinalização.
Em certas concretizações, a invenção refere-se a um anticorpo monocional anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, em que a cadeia pesada e a cadeia leve do re- ferido anticorpo compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 274 e 275, respectivamente, sem as sequências de sinalização.
Em É certas concretizações, a invenção refere-se a um anticorpo monocional anti- . CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, em que a cadeia pesa- dae a cadeia leve do referido anticorpo compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 276 e 278, respectivamente, sem as sequên- cias de sinalização.
Em certas concretizações, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno des- te, em que a cadeia pesada e a cadeia leve do referido anticorpo compreen- demas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 277 e 278, respectiva- mente, sem as sequências de sinalização.
Em certas concretizações, a in- venção refere-se a um anticorpo monocilonal anti-CD52 humana ou parte de . ligação a antígeno deste, em que a cadeia pesada e a cadeia leve do referi- do anticorpo compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: - 25 279 e 280, respectivamente, sem as sequências de sinalização.
Em certas concretizações, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, em que a cadeia pesada e a cadeia leve do referido anticorpo compreendem as sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NOs: 281 e 282, respectivamente, sem as sequências de sinalização.
A invenção provê também anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo em CD52 que um destes anticorpos humanizados e anticorpos que competem ou competem de modo cruzado com um destes anticorpos hu-
manizados.
Em concretizações correlatas, a invenção provê composições contendo tal anticorpo humanizado e um carreador farmaceuticamente acei- tável.
Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um anticor- po monocilonal anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, em que a cadeia leve do referido anticorpo compreende uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 102, 138, 145-148, 153-157 e 164-168. Em certas concretizações, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, em que a cadeia leve do referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 273, 275, 278, 280 e 282, sem as sequências de sinalização. , Em certas concretizações, a invenção refere-se a uma cadeia leve de anti- ' corpo ou parte desta, compreendendo uma sequência de aminoácidos sele- cionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 102, 138, 145-148, 153-157, 164-168, 273, 275, 278, 280 e 282, sem as sequências de sinaliza- ção, se presentes.
Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um anticor- po monoclonal anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, em que a cadeia pesada do referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 103, 136, 137, 139-144, 149-152 e 158-163. Em certas concretizações, a inven- : ção refere-se a um anticorpo monoclonal anti-CD52 humana ou parte de |i- gação a antígeno deste, em que a cadeia pesada do referido anticorpo com- - 25 preende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo cons- tituído por SEQ ID NOs: 272, 274, 276, 277, 279 e 281, sem as sequências de sinalização.
Em certas concretizações, a invenção refere-se a uma ca- deia pesada de anticorpo ou parte desta, compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 103, 136,137,139-144,149-152,158-163, 272, 274, 276, 277, 279 e 281, sem as sequências de sinalização, se presentes.
Em algumas concretizações, qualquer um dos anticorpos acima pode ser uma molécula de IgG, IgM, IgA, 1gD ou IgE.
Em certas concretiza- ções, o referido IgG is IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas concretizações, qualquer uma das partes de liga- ção a antígeno acima pode ser anticorpo de cadeia única, Fv, Fab, Fab', F(ab)2,Fd, molécula Fv de cadeia única (scFv), dímero biespecífico de Fv de cadeia única, diabody, anticorpo com domínio deletado ou anticorpo de domínio único (dAb). A invenção refere-se também a qualquer um dos anticorpos ou partes de ligação a antígeno acima, em que o referido anticorpo ou parte de ligação a antígeno depleta linfócitos T ou B, ou ambos; de preferência, de- pleta linfócitos T, em comparação a linfócitos B; aumenta níveis séricos cir- culantes de TNF-alfa, IL-6 ou MCP-1 (por exemplo, em pelo menos 5%, pelo Í menos 10%, pelo menos 50%, pelo menos 100% ou pelo menos 200%); " media citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) de células que expressam CD52; media citotoxicidade dependente de com- plemento (CDC) de células que expressam CD52; liga-se a CD52 humana apesar de a presença de anticorpos neutralizantes contra alentuzumabe em paciente humano; e/ou promove a sinalização intracelular em células T e/ou B humanas (consultar, por exemplo, Hederer et al., International Immunology 12:505-616 (2000); Watanabe et al., Clinical Immunology 120: 247-259 (2006)). A invenção refere-se ainda a um ácido nucleico isolado, codifi- h cador da cadeia pesada ou de parte de ligação a antígeno desta, ou da ca- deia leve ou de parte de ligação a antígeno desta de qualquer um dos anti- - 25 corpos acima.
Em algumas concretizações, o referido ácido nucleico isolado compreende uma sequência de nucleotídeos de cadeia pesada selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 283, 285, 287, 288, 290 e 292, ou a referida sequência de nucleotídeos sem a sequência codificadora de um peptídeo de sinalização; uma sequência de nucleotídeos de cadeia leve selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 284, 286, 289, 291 e 293, ou a referida sequência de nucleotídeos sem a sequência codificadora de um peptídeo de sinalização; ou ambas as referidas sequên-
cias de nucleotídeos de cadeia pesada e de cadeia leve. Em certas concre- tizações, o referido ácido nucleico isolado compreende uma sequência de nucleotídeos de cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeos de cadeia leve, selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 283 e SEQ ID NO: 284, respectivamente, ambas sem as sequências codificadoras de peptídeos de sinalização; SEQ ID NO: 285 e SEQ ID NO: 286, respectiva- mente, ambas sem sequências codificadoras de peptídeos de sinalização; SEQ ID NO: 287 e SEQ ID NO: 289, respectivamente, ambas sem sequên- cias codificadoras de peptídeos de sinalização; SEQ ID NO: 288 e SEQ ID NO: 289, respectivamente, ambas sem sequências codificadoras de peptí- deos de sinalização; SEQ ID NO: 290 e SEQ ID NO: 291, respectivamente, ambas sem sequências codificadoras de peptídeos de sinalização; e SEQ ID í NO: 292 e SEQ ID NO: 293, respectivamente, ambas sem sequências codi- : ficadoras de peptídeos de sinalização.
A invenção refere-se também ao uso de um ácido nucleico iso- lado compreendendo uma sequência de nucleotídeos de cadeia pesada e de um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeos de cadeia leve para a produção de um medicamento para tratar um paciente em necessidade deste, em que a referida sequência de nucleotídeos de ca- deiapesadae a sequência de nucleotídeos de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 283 e SEQ ID NO: 284, respec- tivamente, ambas sem sequências codificadoras de peptídeos de sinaliza- : ção; SEQ ID NO: 285 e SEQ ID NO: 286, respectivamente, ambas sem se- quências codificadoras de peptídeos de sinalização; SEQ ID NO: 287 e SEQ - 25 1DNO: 289, respectivamente, ambas sem sequências codificadoras de pep- tídeos de sinalização; SEQ ID NO: 288 e SEQ ID NO: 289, respectivamente, ambas sem sequências codificadoras de peptídeos de sinalização; SEQ ID NO: 290 e SEQ ID NO: 291, ambas respectivamente, sem as sequências codificadoras de peptídeos de sinalização; e SEQ ID NO: 292 e SEQ ID NO: 293, ambas respectivamente, sem sequências codificadoras de peptídeos de sinalização.
A invenção refere-se também a um vetor recombinante compre-
endendo (1) uma sequência de ácido nucleico codificadora da cadeia pesa- da ou de parte de ligação a antígeno desta, (2) uma sequência de ácido nu- cleico codificadora da cadeia leve ou de parte de ligação a antígeno desta, ou (3) ambas, de qualquer um dos anticorpos acima. A invenção refere-se aindaa uma célula hospedeira compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico, codificadora da cadeia pesada ou de parte de ligação a antí- geno desta de qualquer um dos anticorpos acima, a referida primeira se- quência de ácido nucleico, ligada operacionalmente a um elemento de con- trole de expressão, e uma segunda sequência de ácido nucleico, codificado- rada cadeia leve ou de parte de ligação a antígeno desta do referido anti- corpo, a referida segunda sequência de ácido nucleico, ligada operacional- mente a um elemento de controle de expressão. A invenção refere-se a um í método para produzir um anticorpo anti-CD52 humana ou parte de ligação a y antígeno deste, compreendendo manter a referida célula hospedeira em condições apropriadas para expressão do anticorpo ou de parte, e refere-se também ao referido método compreendendo ainda a etapa de isolar o anti- corpo ou a parte.
A invenção refere-se a uma composição compreendendo o anti- corpo monoclonal ou parte de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações |- 24,e um veículo ou carreador farmaceuticamen- te aceitável.
Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um método M para tratar um paciente em necessidade deste, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos acima, ou - 25 de partes de ligação a antígeno, ou da composição acima. Em certas con- cretizações, o referido paciente está submetendo-se a um transplante.
Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um método para tratar uma doença autoimune em um paciente em necessidade deste, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos acima, ou de partes de ligação a antígeno, ou da compo- sição acima. Em certas concretizações, a doença autoimune é, por exemplo, esclerose múltipla, artrite reumatoide ou lúpus eritematoso sistêmico.
Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um método para tratar câncer em um paciente em necessidade deste, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticor- pos acima, ou de partes de ligação a antígeno, ou da composição acima. Em certas concretizações, o câncer é, por exemplo, linfoma como linfoma não Hodgkin; leucemia como leucemia linfocítica crônica de células B; neoplasia maligna de células T, em que o anticorpo ou parte depleta de preferência células B, em comparação a células B; ou tumor sólido.
Em algumas concretizações, qualguer um dos métodos de tra- tamento acima compreende ainda administrar ao paciente um agente esti- mulador de neutrófilos ou de células NK. Em certas concretizações, o referi- do agente é G-CSF ou GM-CSF. Em algumas concretizações, qualquer um : dos métodos de tratamento acima compreende ainda administrar ao pacien- . te um agente estimulador de células T reguladoras. Em certas concretiza- ções, ,oreferido agente é rapamíicina.
Em algumas concretizações, a invenção refere-se a um método para inibir angiogênese em um paciente em necessidade deste, compreen- dendo administrar uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos acima, ou partes de ligação a antígeno, ao paciente. Em certas concretiza- ções, o paciente é portador de tumor sólido. Em certas concretizações, o paciente apresenta neovascularização. Em certas concretizações, a referida neovascularização é no olho.
. A invenção refere-se também ao uso de qualquer um dos anti- corpos acima, ou partes de ligação a antígeno, para a produção de um me- - 25 dicamento para tratar doença autoimune em um paciente em necessidade deste. Além disso, a invenção refere-se ao uso de qualquer um dos anticor- pos acima, ou partes de ligação a antígeno, para a produção de um medi- camento para tratar câncer em um paciente em necessidade deste. A inven- ção refere-se ao uso de qualquer um dos anticorpos acima, ou partes de ligação a antígeno, para a produção de um medicamento para tratar um pa- ciente em necessidade de transplante. A invenção refere-se ao uso de qual- quer um dos anticorpos acima, ou partes de ligação a antígeno, para a pro-
dução de um medicamento para tratar neovascularização em um paciente em necessidade deste. A invenção refere-se também ao uso de qualquer um dos anti- corpos acima, ou partes de ligação a antígeno, como medicamento. —Descriçãoresumida dos desenhos A Figura 1A-1B é uma representação esquemática do desenvol- vimento de novos anticorpos monocionais anti-CD52. O esquema geral está retratado na Figura 1A, e os nomes dos clones de anticorpos de camundon- go anti-CD52 humana, bem como seus isotipos são mostrados na Figura 1B. A Figura 2 é um alinhamento das sequências de aminoácidos de várias sequências de cadeia leve kappa de anti-CD52 humana de camun- dongo (SEQ ID NOS:1-13). Campath-1G é o anticorpo monoclonal de rato a : partir do qual o anticorpo humanizado Campath-1H é derivado. ' A Figura 3 é um alinhamento das sequências de aminoácidos de várias sequências de cadeia pesada de anti-CD52 humana de camundongo (SEQ ID NOS:14-26). A Figura 4 é um alinhamento de CD52 do tipo selvagem e de 10 proteínas mutantes de CD52 (SEQ ID NOS: 104-114, de cima para baixo). A Figura 5A ilustra o perfil de ligação em N-terminal, com base emFACS, dos anticorpos 4B10 e 7F11 em células mutantes que expressam CDB52 por varredura de alanina. A Figura 5B ilustra o perfil de ligação em região mediana, com : base em FACS, dos anticorpos CF1D12, 3G7, 9D9, 5F7, 4G7 e 11011 em células mutantes que expressam CD52 por varredura de alanina.
- 25 A Figura 5C ilustra o perfil de ligação, com base em FACS, dos anticorpos Campath-1H8& ("Campath 1H"), 2C3, 12G6 e 23E6 em células mutantes que expressam CD52 por varredura de alanina.
A Figura 5D retrata immunoblots de glicosilação N-ligada +/- de CD52, sondada com o painel de anticorpos monocionais quiméricos. "C1H" representa Campath-1HO. A Figura 6 é um gráfico mostrando os resultados de um ensaio de CDC de 1,5 horas em vários anticorpos quiméricos anti-CD52, investiga-
dos em células CHO-K1 CD52 nº 67. Estes resultados demonstram que os anticorpos quiméricos 4B10 e 7F11 são comparáveis ou melhores do que Campath-1HO ("Campath 1H"). A Figura 7 é um gráfico mostrando os resultados de um ensaio de ADCC de 14 horas em vários anticorpos quiméricos IgG1 contra CD52, investigados em células CHO-K1 CD52 nº 67. Os resultados revelam que os anticorpos quiméricos 2C3 e 12G6 são comparáveis ou melhores do que Campath-1HO ("Campath 1-H”).
As Figuras 8A-8C ilustram a ligação comparativa de vários anti- corpos anti-CD52 e o anticorpo Campath-1H8& ("C-1H") a populações defini- das de linfócitos humanos. Estas figuras mostram a hierarquia da capacida- de de ligação dos anticorpos quiméricos investigados por ensaio FACS. Cur- " vas mais distantes à direita demonstram a capacidade mais alta de ligação, : enquanto que curvas à esquerda a ligação é com afinidade mais baixa.
As Figuras 9A-9C são gráficos ilustrando o nível de células T CDA4 (Figura 94), células T CD8 (Figura 9B) e de células B CD19 (Figura 9C) no sangue, após 72 horas da administração dos anticorpos quiméricos 7F11, 8G3, 23E6, 12G6, 4B10 ou 5F7, ou de Campath-1HO ("Cam").
As Figuras 10A-10C são gráficos ilustrando o nível de células T CD4 (Figura 10A), células T CD8 (Figura 10B) e de células B CD19 (Figura 10C) no baço, após 72 horas da administração dos anticorpos quiméricos 7F11, 8G3, 23E6, 12G6, 4B10 ou 5F7, ou de Campath-1H8 ("Cam").
: As Figuras 11A-11C são gráficos mostrando o nível de células T CDA (Figura 11A), células T CD8 (Figura 11B) e de células B CD19 (Figura - 25 11C) no sangue, após 72 horas da administração dos anticorpos quiméricos 2C3, 9D9, 4B10, 3G7 ou 11C11, ou de Campath-1H8 ("Cam").
A Figura 12 é um gráfico de Sobrevida de Kaplan Meier, ilus- trando o percentual de camundongos sobreviventes após o tratamento com os anticorpos monoclonais quiméricos 7F11, 4B10 ou 12G6 ou com Campa- th-1H80 ("Campath").
A Figura 13 é um gráfico de Sobrevida de Kaplan Meier, ilus- trando o percentual de camundongos sobreviventes após o tratamento com os anticorpos monoclonais quiméricos 203, 8G3 ou 23E6 ou com Campath- 1HO ("Campath").
A Figura 14 é um gráfico de Sobrevida de Kaplan Meier, ilus- trando o percentual de camundongos sobreviventes após o tratamento com os anticorpos monoclonais quiméricos 9D9 ou 4B10 ou com Campath-1HO ("Campath").
A Figura 15 é um gráfico de Sobrevida de Kaplan Meier, ilus- trando o percentual de camundongos sobreviventes após o tratamento com os anticorpos monoclonais quiméricos 2C3 ou 11C11 ou com Campath-1HGO ("Campath").
A Figura 16 é um alinhamento da sequência da região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 96) do anticorpo 4B10 anti-CD52 humana de ' camundongo com a sequência de pareamento mais próximo de linhagem : germinativa humana (SEQ ID NO: 97) e a sequência da região variável da cadeia pesada humanizada (SEQ ID NO: 98). Adicionalmente, é mostrado um alinhamento da sequência da região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 99) do anticorpo 4B10 anti-CD52 humana de camundongo com a se- quência de pareamento mais próximo de linhagem germinativa humana (SEQ ID NO: 100) e a sequência da região variável de cadeia leve humani- zada(SEQID NO: 101).
A Figura 17 mostra as sequências da região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 103) e da cadeia leve (SEQ ID NO: 102) de 4B10 hu- . manizado. A Figura 18 é um gráfico mostrando que o anticorpo humanizado - 25 4B10-H1/K1 ("4B10-Humanizado") e o anticorpo quimérico 4B10 se ligam de modo equivalente a células expressando CD52.
A Figura 19 é um gráfico mostrando que o anticorpo humanizado 4B10 -H1/K1 ('4B10 Humanizado") e o anticorpo quimérico 4B10 mediam atividade equivalente de ADCC em células expressando CD52.
A Figura 20 é um gráfico mostrando que o anticorpo humanizado 4B10 -H1/K1 ("r4B10-Humanizado") e o anticorpo quimérico 48310 mediam atividade equivalente de CDC em células expressando CD52.
A Figura 21 é um gráfico ilustrando o perfil farmacocinético de anticorpos quiméricos anti-CD52 (12G6, 7F11 e 4B10), Campath-1HO ("Campath") e do anticorpo humanizado 4B10-H1/K1 anti-CD52 ("4B10 hu- manizado (H1/K1)") em camundongos transgênicos heterozigotos huCD52.
As Figuras 22A-22C são gráficos mostrando os níveis de células T CDA4 (Figura 22A), células T CD8 (Figura 22B) e de células B CD19 (Figura 22C) no sangue, após 72 horas da administração do anticorpo quimérico 4B10 ou do anticorpo humanizado 4B10-H1/K1 ("4B10-Hu") ou de Campath- 1HO ("Campath").
A Figura 23 é um gráfico mostrando o sumário das afinidades de ligação relativa dos anticorpos monoclonais anti-CD52.
A Figura 24 mostra as sequências da região variável da cadeia ' pesada e da leve (kappa) do 7F11 humanizado. Resíduos de aminoácidos : com mutação reversa para resíduos de camundongos estão sublinhados, e as CDRs são mostradas em negrito.
A Figura 25 é um histograma mostrando que os anticorpos 7F11 quimérico e humanizado se ligam de modo equivalente a células expressan- do CD52. O eixo X representa a fluorescência emitida pelo anticorpo anti- CD52 ligado, enquanto a área de cada pico representa a população total de células.
A Figura 26A mostra as sequências da região variável de cadeia pesada do 2C3 humanizado. Resíduos de aminoácidos com mutação rever- : sa para resíduos de camundongo estão sublinhados, e as CDRs são mos- tradas em negrito. A Figura 26B mostra as sequências de região variável da - 25 cadeia leve (kappa) do 203 humanizado. Resíduos com mutação reversa para resíduos de camundongo estão sublinhados, e as CDRs são mostradas em neqgrito.
A Figura 27A é um histograma mostrando a ligação dos anticor- pos 2C3 quimérico e humanizado em células expressando CD52. O eixo X representa a fluorescência emitida pelo anticorpo anti-CD52 ligado, enquan- to a área de cada pico representa a população total de células. A Figura 27B é um histograma mostrando que o anticorpo quimérico e um subconjunto dos anticorpos 2C3 humanizados se ligam de modo equivalente a células expressando CD52. O eixo X representa a fluorescência emitida pelo anti- corpo anti-CD52 ligado, enquanto a área de cada pico representa a popula- ção total de células.
A Figura 28A mostra as sequências de região variável da cadeia pesada do 12G6 humanizado. Resíduos de aminoácidos com mutação re- versa para resíduos de camundongo estão sublinhados, e as CDRs são mostradas em negrito. A Figura 28B mostra as sequências de região variável da cadeia leve (kappa) do 12G6 humanizado. Resíduos de aminoácidos com mutação reversa para resíduos de camundongo estão sublinhados, e as CDRs são mostradas em negrito. A Figura 29 é um histograma mostrando que o anticorpo quimé- " rico e um subconjunto de anticorpos humanizados 12G6 se ligam de modo y equivalente a células expressando CD52. O eixo X representa a fluorescên- cia emitida pelo anticorpo anti-CD52 ligado, enquanto a área de cada pico representa a população total de células.
A Figura 30A mostra as sequências de região variável da cadeia pesada do 9D9 humanizado. Resíduos de aminoácidos com mutação rever- sa para resíduos de camundongo estão sublinhados, e as CDRs são mos- tradas em negrito. A Figura 30B mostra as sequências de região variável da cadeia leve (kappa) do 9D9 humanizado. Resíduos de aminoácidos com mu- tação reversa para resíduos de camundongo estão sublinhados, e as CDRs B são mostradas em negrito. A Figura 31 é um histograma mostrando que o anticorpo quimé- - 25 ricoe um subconjunto dos anticorpos 9D9 humanizados se ligam de modo equivalente a células expressando CD52. O eixo X representa a fluorescên- cia emitida pelo anticorpo anti-CD52 ligado, enquanto a área de cada pico representa a população total de células.
A Figura 32A mostra as curvas de ligação de Campath-1HO ("CCIH"), de um anticorpo quimérico 203 e de um anticorpo humanizado 2C3-SFD1/K12 a células T humanas primárias e células T de camundongo transgênico huCD52. A Figura 32B mostra as curvas de ligação de Campa-
th-1H8 ("C1H"), de um anticorpo quimérico 9D9 e de 9D9 humanizado a cé- lulas T humanas primárias e células T de camundongo transgênico huCD52. A Figura 32C mostra as curvas de ligação de Campath-1HO ("C1H"), de um anticorpo quimérico 12G6 e de anticorpos humanizados 12G6 a células T humanas primárias e células T de camundongo transgênico huCD52.
A Figura 33 é uma tabela mostrando a eficiência relativa de liga- ção de Campath-1HG, de anticorpos quiméricos 2C3 e 12G6 e de anticorpos humanizados 2C3 e 12G6 a huCD52 expressando células T humanas e de camundongo transgênico.
A Figura 34 ilustra os padrões comparativos de ligação de anti- corpos humanizados anti-CD52 Campath-1HO, 2C3, 12G6 e 9D9 a subcon- juntos definidos de populações de células mononucleares de sangue perifé- Ms rico humano por citometria de fluxo. Esses histogramas mostram que a liga- : ção do anticorpo humanizado anti-CD52 é equivalente àquela de Campath- 1HO para vários subconjuntos de PBMC humano que expressam CD52. O eixo X representa a fluorescência emitida pelo anticorpo anti-CD52 ligado, enquanto a área de cada pico representa a população total de células.
A Figura 35 é um gráfico mostrando que anticorpos quiméricos e humanizados 7F11 mediam atividade equivalente de ADCC em células ex- pressando CD52.
A Figura 36 é um gráfico mostrando que anticorpos quiméricos e humanizados 7F11 mediam atividade de CDC em células expressando : CD52. A Figura 37 é um gráfico mostrando que anticorpos quiméricos e - 25 humanizados 2C3 mediam atividade de ADCC em células expressando CDB52.
A Figura 38 é um gráfico mostrando que anticorpos quiméricos e humanizados 2C3 mediam atividade de CDC em células expressando CD52.
A Figura 39 é um gráfico mostrando que anticorpos quiméricos e humanizados 12G6 mediam atividade de ADCC em células expressando CD52.
A Figura 40 é um gráfico mostrando que anticorpos quiméricos e humanizados 12G6 mediam atividade de CDC em células expressando CDS52. A Figura é um gráfico mostrando que anticorpos quiméricos e humanizados 9D9 mediam atividade de ADCC em células expressando CD52. A Figura 42 é um gráfico mostrando que anticorpos quiméricos e humanizados 9D9 mediam atividade de CDC em células expressando CD52. A Figura 43 é um gráfico mostrando a atividade de ADCC de an- ticorpos humanizados anti-CD52 em células T primárias. A Figura 44 é um gráfico mostrando a atividade de CDC de anti- corpos humanizados anti-CD52 em células T primárias. A Figura 45 é um gráfico mostrando a neutralização de Campa- - th-1H, mas não de outros anticorpos anti-CD52 com amostras de soro hu- . mano do estudo CAMMS223 que contêm anticorpos neutralizantes anti- Campath-1HQ8. As amostras de soro foram coletadas de um paciente repre- sentativo (MS-1) no Mês 12 (M12) e no Mês 13 (M13). As Figuras 46A-46E mostram o nível de células T CD4+, células T CDB8+, células B B220+, células NK, células mieloides e de neutrófilos no sangue, após 72 horas da administração de Campath-1H8 ("Campath") e de anticorpos humanizados 4B10-H1/K1 ("4B10"). As Figuras 47A-47E mostram o nível de células T CD4+, células T CDê+, células B B220+, células NK, células mieloides neutrófilos e de ma- : crófagos no baço, após 72 horas da administração de Campath-1H8 ("Cam- path") e de anticorpos humanizados 4B10-H1/K1 ("4B10").
As Figuras 48A-48E mostram os níveis de citocinas circulantes, após 2 horas da administração de Campath-1HO ("Campath") e de anticor- pos humanizados 4B10-H1/K1 ("4B10").
As Figuras 49A e 49B mostram o repovoamento de linfócitos cir- culantes sobre um período de tempo após a administração de Campath-1H& ("Campath")e de anticorpos humanizados 4B10-H1/K1 ("4B10"), (mg/kg). As Figuras 50A-50E mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+, células NK, células mieloides e de neutrófilos no sangue, após 72 horas da administração dos anticorpos humanizados 7F11- SFD1/K2 ('7F11 SFD1") e 7F11-SFD2/K2 ("7F11 SFD2").
As Figuras 51A-51E mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+, células NK, células mieloides e de neutrófilos no baço, após 72 horas da administração dos anticorpos humanizados 7F11- SFD1/K2 ("'7F11 SFD1") e 7F11-SFD2/K2 ("'7F11 SFD2").
As Figuras 52A-52F mostram os níveis de citocinas circulantes, após 2 horas da administração dos anticorpos humanizados 7F11-SFD1/K2 ("7F11 SFD1") e 7F11-SFD2/K2 ("'7F11 SFD2").
As Figuras 53A e 53B mostram o repovoamento de linfócitos cir- culantes sobre um período de tempo após a administração dos anticorpos humanizados 7F11-SFD1/K2 ('7F11 SFD1") e 7F11-SFD2/K2 ("'7F11 Te SFD2"), (mg/kg). Ô As Figuras 54A e 54B mostram o nível de células T CD4+, célu- las T CD8+ e células B B220+ no sangue, após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Campath"), anticorpos quiméricos 7F11 e de anticorpos humanizados 7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2.
A Figura 55 mostra o nível de Campath-1H& ("Campath"), de an- ticorpos quiméricos 7F11 e humanizados 7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2 —nosangue sobre um período de tempo após a administração.
As Figuras 56A-56E mostram os níveis de células T CD4+, célu- las T CD8+, células B B220+, células NK e de neutrófilos no sangue, após Í 72 horas da administração de anticorpos 2C3-SFD1/K12. : As Figuras 57A-57E mostram os níveis de células T CD4+, célu- lasT CD8+, células B B220+, células NK e de neutrófilos no baço, após 72 horas da administração de anticorpos 2C3-SFD1/K12.
As Figuras 58A-58F mostram os níveis de citocinas circulantes, após 2 horas da administração de anticorpos 2C3-SFD1/K12 ("2C3").
A Figura 59 mostra o repovoamento de linfócitos circulantes so- bre um período de tempo após a administração de anticorpos 2C3- SFD1/K12, (mg/kg).
As Figuras 60A-60E mostram o nível de células T CD4+, células
T CDB8+, células B B220+, células NK, células mieloides, macrófagos e de neutrófilos no sangue, após 72 horas da administração de anticorpos 12G6- SFD1/K11. As Figuras 81A-61E mostram o nível de células T CD4+, células T CDB8+, células B B220+, células NK, macrófagos, neutrófilos e de células mieloides no baço, após 72 horas da administração de anticorpos 12G6- SFD1/K11.
As Figuras 62A-62F mostram os níveis de citocinas circulantes, após 2 horas da administração de anticorpos 12G6-SFD1/K11 ("12G6 hu").
A Figura 63 mostra o repovoamento de linfócitos circulantes so- bre um período de tempo após administração de anticorpos 12G6- SFD1/K11, (mg/kg).
& As Figuras 64A-64C mostram o nível de anticorpos quiméricos 2C3, 2C3-SFD1/K12, quiméricos 12G6, 12G6-SFD1/K11, quiméricos 9D9 e 5 9D9-H10/K12 no sangue sobre um período de tempo após a administração.
As Figuras 65A-65E mostram o nível de células T CD4+, células T CDB8+, células B B220+, células NK, células mieloides, macrófagos e de neutrófilos no sangue, após 72 horas da administração de anticorpos 9D9- H10/K12 ("9D9").
As Figuras 66A-66E mostram o nível de T CD4+, células T CDB8+, células B B220+, células NK, células mieloides, neutrófilos e de ma- crófagos no baço, após 72 horas da administração de anticorpos 9D9- ' H10/K12 ("9D9"). As Figuras 67A-67F mostram os níveis de citocinas circulantes após2 horas da administração de anticorpos 9D9-H10/K12 ("9D9").
A Figura 68 mostra o repovoamento de linfócitos circulantes so- bre um período de tempo após administração de anticorpos 9D9-H10/K12 ("9D9"), (mg/kg).
As Figuras 69A-69D mostram o nível de populações de linfócitos em massa (células TCD4+, células T CD8+ e células B) e de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e de células NK no san- gue, após 72 horas da administração de Campath-1H8 ("Campath") e de anticorpos 2C3-SFD1/K12 ("2C3"), 12G6-SFD1/K11 ("12G6") e 9D9- H10/K12 ("9D9").
As Figuras 70A-70D mostram o nível de populações de linfócitos em massa (células T CD4+, células T CD8+ e células B) e de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e de células NK no baço, após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Campath") e de anticor- pos 2C3-SFD1/K12 ("2C3"), 12G6-SFD1/K11 ("12G6") e 9D9-H10/K12 ("9D9").
As Figuras 71A-71F mostram os níveis de citocinas circulantes após 2 horas da administração de Campath-1H8 e de anticorpos 2C3- SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11 e 9D9-H10/K12.
A Figura 72 mostra o nível de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e de células NK no sangue, após 72 horas da administra- ção de anticorpos 9D9-H10/K12 e 9D9-H11/K12.
A Figura 73 mostra o nível de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e de células NK no baço após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H10/K12 e 9D9-H11/K12.
As Figuras 74A-74D mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+, células NK e de células mieloides no sangue, a- pós72 horasda administração de anticorpos 12G6-SFD1/K11 ("12G6 K11") e 12G6-SFD1/K12 ("12G6 K12").
As Figuras 75A-75D mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+, células NK e de células mieloides no baço, após 72 horas da administração de anticorpos 12G6-SFD1/K11 ("12G6 K11") e 12G6-SFD1/K12 ("12G6 K12").
A Figura 76 mostra o nível de populações de linfócitos em mas- sa (células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+) no sangue, após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H11/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9- H18/K13.
As Figuras 77A-77D mostram o nível de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+, células NK e células mieloides no sangue, após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H11/K12, 9D9-
H16/K13 e 9D9-H18/K13.
A Figura 78 mostra o nível de populações de linfócitos em mas- sa (células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+) no baço, após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H11/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9- HI8Ki3s.
As Figuras 79A-79D mostram o nível de de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+, células NK e células mieloides no baço, após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H11/K12, 9D9- H16/K13 e 9D9-H18/K13.
As Figuras 80A-80F mostram os níveis de citocinas circulantes após 2 horas da administração de anticorpos 9D9-H11/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13.
As Figuras 81A e 81B mostram o nível de anticorpos 2C3- SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-HI16/K138 e 9D9- HI1I8/K13no sangue sobre um período de tempo após a administração.
As Figuras 82A-82F mostram o nível de citocinas no sangue so- bre um período de tempo de 48 horas após a administração de Campath- 1HO ("Campath") e de anticorpos 2C3-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K11, 12G6- SFD1/K12, 9D9-H16/K13 ou 9D9-H18/K13.
As Figuras 83A-83E mostram o nível de linfócitos em massa, cé- lulas T CD4+, células T CD8+, células B B220+, células NK e de células mie- loides no baço, após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Campa- th") e de anticorpos 2C3-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 ou 9D9-H18/K13.
As Figuras 84A-84G mostram o repovoamento de células T CD4+ e CD8+, células T reguladoras, células B, células NK, neutrófilos e de macrófagos circulantes sobre um período de tempo após a administração de Campath-1HG6 ("Campath") e de anticorpos 2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12.
A Figura 85 mostra a capacidade de Campath-1H6 FITC- marcado ("Campath") e de anticorpos 2C3-SFD1/K12 ("203 K12"), 12G6- SFD1I/K11 ("12G6 K11"), 12G6-SFD1/K12 ("12G6 K12"), 9D9-H16/K13
("9D9 H16") e 9D9-H18/K13 ("9D9 H18") se ligarem especificamente a popu- lações celulares de linfócitos huCD52 no baço.
As Figuras 86A-86E mostram o nível de populações de linfócitos em massa (Células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+) e de subti- posde células T CD4+, células T CD8+, células B B220+, células NK e célu- las mieloides no sangue, após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Campath") e de anticorpos 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6- SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13. As Figuras 87A-87E mostram o nível de populações de linfócitos em massa (Células TCD4+, células T CD8+ e células B B220+) e de subti- pos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+, células NK e célu- las mieloides no baço, após 72 horas da administração de Campath-1HO " ("Campath") e de anticorpos 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6- SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13. “5 As Figuras 88A-88F mostram os níveis de citocinas circulantes após 2 horas da administração de Campath-1H8 ("Campath") e de anticor- pos 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13. As Figuras 89A-89D mostram o nível de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e células NK/mieloides no sangue, após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Campath") e de anticor- pos 2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12. ' As Figuras 90A-90D mostram o nível de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e células NK/mieloides no baço, após72 horas da administração de Campath-1HO& ("Campath") e de anticor- pos 2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12. As Figuras 91A-91D mostram o nível de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e células NK/mieloides no linfonodo, após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Campath") e de anticor- pos2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12. A Figura 92A mostra o nível de expressão de huCD52 em subti- pos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e células
NK/mieloides em camundongos huCD52-KI/KO e em não transgênicos de controle.
A Figura 92B mostra o nível de expressão de huCD52 em células T CD4+, células T CD8+ e células B em camundongos transgênicos CD1 hucD52-KI/KO e hucD52. A Figura 93 mostra a ligação a hucD52 de anticorpos 12G6- SFD1/K12 e 2C3-SFD1/K12 de várias fontes de produção ("pequena escala" e "grande escala"), em comparação a Campath-1HO de controle.
A Figura 94 mostra o nível de populações de linfócitos em mas- sa (células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e células NK) no san- gue, após 72 horas da administração de anticorpos 12G6-SFD1/K12 e 2C3- SFD1/K12 de várias fontes de produção ("pequena escala" e "grande esca- la"). - A Figura 95 mostra os níveis de anticorpos 2C3-SFD1/K12, 9D9- H16/K13 e 12G6-SFD1/K12 no sangue sobre um período de tempo após a as administração.
A Figura 96 demonstra o escore clínico de EAE de 2C3- SFD1/K12 e 12G6-SFD1/K12 sobre um período de tempo de progressão de doença.
As Figuras 97A e 97B demonstram a capacidade de Campa- th1HO ("Campath"), 2C3-SFD1/K12 ("203"), His435Ala 2C3-SFD1/K12 ("H435A 2C3") e His310Ala/His435GIn 2C3-SFD1/K12 ("H310A/H435Q 2C3") de ligarem-se a moléculas de FcRn de camundongo e humana. i.
A Figura 98 mostra a depuração in vivo de 2C3-SFD1/K12 ("2C3 não modificado"), 2C3-SFD1/K12-Modificado 1 ("2C3-Fc mutante 1") e 2C3- SFD1I/Ki2-Modificado 2 ("2C3-Fc mutante 2") em camundongos não trans- gênicos.
A Figura 99 mostra a depuração in vivo de 2C3-SFD1/K12 ("2C3"), 20C3-SFD1/K12-Modificado 1 ("2C3-Fc mutante 1") e 2C3-SFD1/ K12-Modificado 2 ("2C3-Fc mutante 2") em camundongos transgênicos hucD52. As Figuras 100A e 100B mostram o nível de populações de lin- fócito em massa (células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e células
NK) no sangue e no baço, após 72 horas da administração de anticorpos 2C3-SFD1/K12 ("2C3"), 203-SFD1/K12-Modificado 1 ("2C3 Fc mutante-1") e 2C3-SFD1/K12-Modificado 2 ("2C3 Fc mutante-2"). As Figuras 101A e 101B são sensorgramas representativos de ensaios Biacore T100 para determinar a especificidade por epítopo do anti- corpo humanizado 12G6-SFD1/K12 e peptídeos mutantes gerados por var- redura de alanina. A Figura 101A mostra a ausência de ligação entre 12G6- SFD1/K12 e o peptídeo MUT 8, enquanto a Figura 101B mostra a ligação entre 12G6-SFD1/K12 e o peptídeo MUT 9.
A Figura 102 mostra a análise de TOR V beta para o doador BMS486. Células T CD4+ educadas com o grupo peptídico 986-989 de Campath-1HQ& exibiram expansão preferencial de um único V beta (VB3).
: A Figura 103 mostra a análise de TOR V para o doador BMS928. Células T CD4+ educadas com grupos peptídicos 1066-67-68 e 1083-84-85 de 12G6-SFD1I/K12 exibiram expansão preferencial de um único V beta (VB20).
As Figuras 104A-104J mostram a avaliação de imunogenicidade de Campath-1HO. Respostas proliferativas são mostradas individualmente em CPM para os doadores A-J. O eixo X retrata os grupos de peptídeos u- sados para estimular três vezes células T CD4+ autólogas. Cada grupo de células T foi avaliado em triplicata com DCs autólogas pulsadas com o grupo educador de antigeno/peptídeo (resposta específica, barra à esquerda, : branca), peptídeo irrelevante de ligação a DR (barra do meio, listrada) ou meio (barra à direita, preta).
As Figuras 105A4-105J mostram a avaliação de imunogenicidade de 12G6-SFD1/K12. Respostas proliferativas são mostradas individualmente em CPM para os doadores A-J. O eixo X retrata os grupos de peptídeos u- sados para estimular três vezes células T CD4+ autólogas. Cada grupo de células T foi analisado em triplicata com DCs autólogas pulsadas com o gru- po peptídico educador (resposta específica, barra à esquerda, branca), pep- tídeo irrelevante de ligação a DR (barra do meio, listrada) ou meio (barra à direita, preta). Em grupos analisados sem o controle pelo meio, a barra à esquerda (branca) representa DCs pulsadas com o peptídeo educador e a barra à direita (listrada) representa DCs pulsadas com o peptídeo irrelevan- te.
A Figura 106 mostra a sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada humanizada de 2C3-SFD1 (SEQ ID NO: 272) e a sequência completa de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 2C3-K12 (SEQ ID NO: 273). As sequências de sinalização estão em negrito e itálico e as CDRs estão sublinhadas.
A Figura 107 mostra a sequência completa de aminoácidos da cadeiapesada humanizada de 7F11-SFD1 (SEQ ID NO: 274) e a sequência completa de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 7F11-K2 (SEQ ID NO: 275). As sequências de sinalização estão em negrito e itálico e as CDRs .: estão sublinhadas.
A Figura 108 mostra as sequências completas de aminoácidos dacadeia pesada humanizada de 9D9-H16 (SEQ ID NO: 276) e de 9D9-H18 (SEQ ID NO: 277) e a sequência completa de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 9D9-K13 (SEQ ID NO: 278). As sequências de sinalização estão em negrito e itálico e as CDRs estão sublinhadas.
A Figura 109 mostra a sequência completa de aminoácidos da cadeiapesada humanizada de 12G6-SFD1 (SEQ ID NO: 279) e a sequência completa de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 12G6-K12 (SEQ ID NO: 280). As sequências de sinalização estão em negrito e itálico e as CDRs í estão sublinhadas.
A Figura 110 mostra a sequência completa de aminoácidos da “25 cadeia pesada humanizada de 4B10-H1 (SEQ ID NO: 281) e a sequência completa de aminoácidos da cadeia leve humanizada de 4B10-K1 (SEQ ID NO: 282). As sequências de sinalização estão em negrito e itálico e as CDRs estão sublinhadas.
A Figura 111 mostra a sequência completa de ácido nucleico da cadeiapesada humanizada de 2C3-SFD1 (SEQ ID NO: 283) e a sequência completa de ácido nucleico da cadeia leve humanizada de 2C3-K12 (SEQ ID NO: 284). As sequências de sinalização estão sublinhadas, os domínios va-
riáveis estão em negrito e as regiões constantes estão em itálico.
A Figura 112 mostra a sequência completa de ácido nucleico da cadeia pesada humanizada de 7F11-SFD1 (SEQ ID NO: 285) e a sequência completa de ácido nucleico da cadeia leve humanizada de 7F11-K2 (SEQ ID —NO:286).As sequências de sinalização estão sublinhadas, os domínios va- riáveis estão em negrito e as regiões constantes estão em itálico.
A Figura 113 mostra as sequências completas de ácido nucleico da cadeia pesada humanizada de 9D9-H16 (SEQ ID NO: 287) e de 9D9-H18 (SEQ ID NO: 288). As sequências de sinalização estão sublinhadas, os do- mínios variáveis estão em negrito e as regiões constantes estão em itálico.
A Figura 114 mostra a sequência completa de ácido nucleico da cadeia leve humanizada de 9D9-K13 (SEQ ID NO: 289). A sequência de si- -: nalização está sublinhada, o domínio variável está em negrito e a região constante está em itálico.
“5 A Figura 115 mostra a sequência completa de ácido nucleico da cadeia pesada humanizada de 12G6-SFD1 (SEQ ID NO: 290) e a sequência completa de ácido nucleico da cadeia leve humanizada de 12G6-K12 (SEQ ID NO: 291). As sequências de sinalização estão sublinhadas, os domínios variáveis estão em negrito e as regiões constantes estão em itálico.
A Figura 116 mostra a sequência completa de ácido nucleico da cadeia pesada humanizada de 4B10-H1 (SEQ ID NO: 292) e a sequência completa de ácido nucleico da cadeia leve humanizada de 4B10-K1 (SEQ ID . NO: 293). As sequências de sinalização estão sublinhadas, os domínios va- riáveis estão em negrito e as regiões constantes estão em itálico. “25 Descrição detalhada da invenção CD52 é uma proteína GPI glicosilada abundante, ancorada na superfície celular (aproximadamente 5 x 10º sítios de ligação a anticorpo por célula), presente em pelo menos 95% de todos os linfócitos e monóci- tos/macrófagos do sangue periférico humano (Hale G, et al., "The CAMPA- TH-1antigen(CD52); Tissue Antigens, 35:178-327 (1990)), porém está au- sente de células-tronco hematopoiéticas. Esta invenção é direcionada a i- munoglobulinas (anti-CD52) que possuem especificidade de ligação (por exemplo, especificidade epitópica) ou são seletivas para ligação à CD52 humana ou parte desta. Estas imunoglobulinas ligam-se especificamente a uma CD52 e não se ligam a moléculas que não sejam CDB52. A ligação es- pecífica entre uma imunoglobulina anti-CD52 e CD52 pode ser determinada, por exemplo, pelo valor de ECs5o da ligação da imunoglobulina a células CD52+, medido por citometria de fluxo. A ligação específica pode ser indica- da por intervalo de ECs55 de, por exemplo, 0,5 — 10 ug/mL. As imunoglobuli- nas descritas neste pedido de patente podem ter especificidade de ligação por toda ou por parte de uma CD52 humana, em que a CD52 humana é CD52 humana isolada e/ou recombinante, ou sobre a superfície de uma cé- lula que expresse CD52 humana. Adicionalmente, as imunoglobulinas po- dem ter especificidade de ligação por uma ou mais formas de CD52 humana A (por exemplo, CD52 humana glicosilada; CD52 humana desglicosilada; CD52 humana não glicosilada; e variantes alélicas). Em uma concretização, as imunoglobulinas possuem especificidade de ligação por CD52 humana natural, endógena ou do tipo selvagem. A sequência de aminoácidos de CD52 humana do tipo selvagem é apresentada na Figura 4 (SEQ ID NO: 104).
As imunoglobulinas descritas neste pedido de patente podem ser purifcadas ou isoladas usando técnicas conhecidas. Imunoglobulinas que são "purificadas" ou "isoladas" foram separadas de moléculas (por e- xemplo, peptídeos) de sua fonte de origem (por exemplo, o sobrenadante de " células; em uma mistura tal como em mistura de imunoglobulinas em uma biblioteca), e incluem imunoglobulinas obtidas por métodos descritos neste À 25 relatório ou outros métodos adequados. Imunoglobulinas isoladas incluem imunoglobulinas substancialmente puras (essencialmente puras) e imuno- globulinas produzidas por síntese química, técnicas recombinantes e uma combinação destas. Mais especificamente, a invenção refere-se a imunoglobulinas ant-CD52 humana, fragmentos de ligação a antígeno (ou seja, partes) das imunoglobulinas, as cadeias leves das imunoglobulinas, as cadeias pesadas das imunoglobulinas e fragmentos destas cadeias leves ou cadeias pesadas.
A invenção refere-se também a imunoglobulinas maduras ou suas cadeias, tais como imunoglobulinas glicosiladas. A invenção refere-se também a imu- noglobulina imatura ou precursora (proteína). A invenção refere-se também a moléculas de ácido nucleico (por exemplo, vetores) que codificam ambas estas proteínas imaturas ou maduras, a vetores e células hospedeiras que compreendem tal ácido nucleico, a métodos para produzir proteínas imatu- ras e maduras e a métodos para usar as imunoglobulinas.
As imunoglobulinas desta invenção podem ser usadas para tra- tar um indivíduo em necessidade deste (por exemplo, paciente humano), paradepletar os linfócitos e outras células CD52+ do indivíduo (por exemplo, células cancerosas CD52+), conforme necessário. Neste relatório descritivo, "depleção de linfócitos" é um tipo de imunossupressão por redução da popu- W lação de linfócitos circulantes, por exemplo, células T e/ou células B, resul- tando em linfopenia. As imunoglobulinas desta invenção podem ser usadas também para inibir angiogênese como descrito mais detalhadamente abaixo. As imunoglobulinas desta invenção podem ser usadas também para enri- quecer células-tronco Hematopoiéticas, por exemplo, em aplicações ex vivo (consultar, por exemplo, Lim et al., J. Hematology & Oncology 1:19 (2008)). Imunoglobulinas naturais possuem uma estrutura central co- mum, na qual duas cadeias leves idênticas (em torno de 24 kD) e duas ca- deias pesadas idênticas (em torno de 55 ou 70 kD) formam um tetrâmero. A porção amino-terminal de cada cadeia é conhecida como a região variável 7 (V) e pode ser distinguida das regiões constantes (C) mais conservadas do restante de cada cadeia. Dentro da região variável da cadeia leve (também i 25 denominada o domínio V,) encontra-se uma porção C-terminal, conhecida como a região J. Dentro da região variável da cadeia pesada (também de- nominada o domínio V;), existe uma região D, além de a região J. A maior parte da variação de sequências de aminoácidos em imunoglobulinas está confinada a três localizações separadas nas regiões V, conhecidas como regiões hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (C- DRs), as quais estão diretamente envolvidas em ligação a antígenos. Partin- do do amino-terminal, estas regiões são designadas CDR1, CDR2 e CDR3,
respectivamente. As CDRs são mantidas em posição por regiões framework (arcabouço) (FRs) mais conservadas. Partindo do amino-terminal, estas re- giões são designadas FR1, FR2, FR3 e FRA, respectivamente. As localiza- ções de regiões CDR e FR e um sistema de numeração foram definidos por Kabatetal (Kabat E.A, et al, Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Go- vernment Printing Office (1991), Chothia & Lesk, Canonical Structures for the Hypervariable regions of Immunoglobulins, J. Mol. Biol, 196, 901-917 (1987), e o sistema de numeração IMGTG (The International ImnMunoGene- Tics linformation SsystemO, Lefranc, M.-P., The Immunologist 7, 132-136 (1999). A inspeção visual e a análise de sequências podem ser realizadas para identificar os limites de CDRs. Para esta invenção, as sequências de - CDRs são definidas usando o sistema de Kabat e o sistema IMGT; ou seja, quando as CDRs definidas pelos dois sistemas não se sobrepõem inteira- mente, foram incluídos todos os resíduos das sequências definidas por am- bos os sistemas.
As imunoglobulinas humanas podem ser divididas em classes e subclasses, dependendo do isotipo da cadeia pesada. As classes incluem IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, nas quais as cadeias pesadas são do tipo gama (y), mu (y), alfa (o), delta (5) ou epsilon (e), respectivamente. As subclasses in- cluem IgG1, IgG2, I19G3, IgG4, IgA1 e IgA2, nas quais as cadeias pesadas são do tipo y1, y2, y3, yv4, a1 e 02, respectivamente. As moléculas de imu- ' noglobulinas humanas de uma classe ou subclasse selecionada podem con- ter uma cadeia leve kappa (k) ou lambda (A). Consultar, por exemplo, Cellu- larand Molecular Immunology, Wonsiewicz, M.J., Ed., capítulo 45, pág. 41- 50, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA 91991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2º Ed., capítulo 4, pág. 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984). Neste relatório descritivo, os termos "imunoglobulina" e "anticor- po/'osquaissão usados alternadamente, referem-se a anticorpos inteiros e a fragmentos de ligação a antígenos (ou seja, "parte de ligação a antígenos" - os dois termos são usados alternadamente neste relatório descritivo, a me-
nos que indicado de outra forma). Fragmentos de ligação a antígenos de anticorpos podem estar no formato de, por exemplo, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fv, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, moléculas Fv de cadeia única (scFv), dímeros específicos de Fvde cadeia única (PCT/US92/09665), diabodies, anticorpos com domínio deletado e anticorpos de domínio único (dAbs). Consultar, por exemplo, Na- ture Biotechnology 22(9):1161-1165 (2004)). Adicionalmente, dentro da in- venção, estão moléculas de ligação a antígeno, compreendendo VH e/ou VL. No caso de VH, a molécula pode compreender também uma ou mais regiões CH1, hinge (articulação), CH2 e CH3. Estes anticorpos de cadeia única destinam-se também a ser abrangidos pelo termo "parte de ligação a antígeno" de um anticorpo. - Parte ou fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por clivagem enzimática ou por técnicas de recombinação. Por exemplo, cliva- gem por papaína ou pepsina pode utilizada para gerar fragmentos Fab ou F(ab'), respectivamente. Anticorpos podem ser produzidos também uma variedade de formas truncadas, usando genes de anticorpos nos quais um ou mais códons de parada foram introduzidos em sentido ascendente ao sítio natural de parada. Por exemplo, um construto recombinante codificador da cadeiapesada de um fragmento F(ab'), pode ser criado de modo a incluir sequências de DNA que codificam o domínio CH; e região hinge da cadeia pesada. Fragmentos preferidos de ligação a antígeno possuem especificida- " de de ligação por CD52 humana do tipo selvagem.
Em outro aspecto, a invenção provê uma variante de anticorpo | 25 ouparte deste, como descrita neste relatório, em que a referida variante liga- se especificamente à CD52 humana, porém é diferente do anticorpo de refe- rência, ou parte deste, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de ami- noácido (por exemplo, em região CDR, região FR ou domínio constante). Por exemplo, o anticorpo variante é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 93%, pelomenos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntico ao anticorpo de referência na cadeia pesada, no domínio variável da cadeia pesada, na cadeia leve ou no domínio variável da cadeia leve.
A similaridade de sequências ou identidade de polipeptídeos, a qual é referida também como identidade de sequência, é medida tipicamente usando software de análise de sequências. O software de análise de proteí- nas pareia sequências semelhantes, usando medidas de similaridade, atribu- ídas para várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservadoras de aminoácidos. Por exemplo, GCG contém programas como "Gap" e "Bestfit', os quais podem ser usados como parâ- metros padrão para determinar a homologia de sequências ou identidade de sequências entre polipeptídeos proximamente relacionados, tais como poli- peptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína desta. Consultar, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências de polipeptídeos podem ser comparadas - também usando FASTA, com parâmetros padrão ou recomendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) “15 fornece alinhamentos e percentual de identidade de sequências das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e de pesquisa (Pe- arson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Outro algoritmo preferido ao se comparar uma se- quência da invenção a um banco de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente blastp ou tblastn, usando parâmetros padrão. Consultar, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul ef al/., Nu- f cleic acids Res. 25:3389-402 (1997); aqui incorporados por referência neste pedido de patente.
De acordo com a invenção, um tipo de substituição de aminoáci- do que pode ser efetuado é trocar uma ou mais cisteínas no anticorpo, as quais podem ser quimicamente reativas, por outro resíduo, tais como, entre outros, alanina ou serina. Em uma concretização, há uma substituição de cisteina não canônica. A substituição pode ser efetuada em uma região CDR ou framework de um domínio variável ou no domínio constante de um anti- corpo. Em algumas concretizações, a cisteina é canônica. Outro tipo de substituição de aminoácido que pode ser efetuado é retirar sítios proteoliti-
cos potenciais no anticorpo. Tais sítios podem ocorrer em uma região CDR ou framework de um domínio variável ou no domínio constante de um anti- corpo. A substituição de resíduos de cisteína e a retirada de sítios proteolíti- cos podem diminuir o risco de heterogeneidade no anticorpo produzido e, dessa forma, aumentar sua homogeneidade. Outro tipo de substituição de aminoácido é eliminar pares de asparagina-glicina, que formam sítios poten- ciais de desamidação, alterando um ou ambos os resíduos. Em outro aspec- to da invenção, o anticorpo pode ser desimunizado para reduzir sua imuno- genicidade, usando as técnicas descritas em, por exemplo, a Publicação PCTWOS8/52976eWO00/34317.
Outro tipo de substituição de aminoácido que pode ser efetuada em uma das variantes de acordo com a invenção é uma substituição conser- - vadora de aminoácido. "Substituição conservadora de aminoácido" é aquela na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de amino- “15 ácidotendo grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas semelhan- tes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição conservadora de aminoácido não alterará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem entre si por substituições conservadoras, o percentual de identidade de sequência ou grau de similaridade pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. Meios para efe- tuar este ajuste são bem conhecidos por aqueles versados no estado da ' técnica. Consultar, por exemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994).
À 25 Exemplos de grupos de aminoácidos tendo cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais hidroxil- ; alifáticas: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina | e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano, 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais á- cidas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais contendo en- xofre: cisteina e metionina. Grupos preferidos para substituição conservado-
ra de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alter- nativamente, reposição conservadora é qualquer alteração tendo valor posi- tivo na matriz de probabilidade em logaritmo PAM250, descrita em Gonnet et al, Science 256:1443-45 (1992). Reposição "moderadamente conservadora" é qualquer alteração tendo valor não negativo na matriz de probabilidade em PAMZ250.
Em certas concretizações, substituições de aminoácidos a um anticorpo ou parte de ligação a antígeno da invenção são aquelas que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxi- dação, (3) alteram a afinidade de ligação ao serem formados complexos pro- teicos, por exemplo, para intensificar a atividade de ADCC e CDC do anti- - corpo, (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos, mas retendo ainda a ligação específica à CD52 “15 humana, (5)removem lisina em C-terminal e (6) adicionam ou removem sí- tios de glicosilação.
Em um aspecto, a invenção provê um novo e inovador polipepti- deo que seja a cadeia pesada ou a leve de um anticorpo desta invenção ou que seja uma parte contendo domínio variável da cadeia pesada ou da leve.
Este polipeptídeo é útil por poder ser o parceiro de uma cadeia oposta (leve ou pesada) do anticorpo para formar uma molécula de ligação à CD52. Imunoglobulinas humanizadas ' Neste relatório, são descritas imunoglobulinas humanizadas compreendendo as CDRs de novos anticorpos de camundongo anti-CD52 f 25 humana. Em uma concretização, a imunoglobulina humanizada compreende uma cadeia leve humanizada e uma cadeia pesada humanizada cujas se- quências de aminoácidos de CDRs diferem da sequência de aminoácidos de outras versões humanizadas de anticorpos anti-CD52 (por exemplo, Campa- thê).
O termo "imunoglobulina humanizada", neste relatório descritivo, refere-se a uma imunoglobulina compreendendo cadeias que incluem uma ou mais CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) da cadeia leve e uma ou mais CDRs
(CDR1, CDR2 e CDR3) da cadeia pesada de um anticorpo anti-CD52 de origem não humana, citado também neste relatório descritivo como o anti- corpo doador (por exemplo, anticorpo murino anti-CD52), e pelo menos parte de uma imunoglobulina de origem humana (por exemplo, regiões framework ouregiões framework e constante, derivadas de uma cadeia leve e/ou pesa- da de origem humana, tal como anticorpos com CDR enxertada com ou sem alterações na região framework). A imunoglobulina humanizada da invenção compreende pelo menos uma CDR que difere de pelo menos uma CDR (por exemplo, da CDR correspondente) presente em Campath8. Consultar, por exemplo, Cabilly ef al, Patente U.S. Nº 4 816 567; Cabilly et al., Patente Eu- ropeia Nº O 125 023 B1; Boss et al., Patente U.S. Nº 4 816 397; Boss ef al., Patente Europeia Nº 0 120 694 B1; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; - Neuberger, M.S. et al., Patente Europeia Nº 0 194 276 B1; Winter, Patente U.S. Nº 5,225,539; Winter, Patente Europeia Nº O 239 400 B1; Padlan, E.A. “15 etal, Pedido de Patente Europeia Nº. O 519 596 Al. Consultar também, Ladner et al., Patente U.S. Nº 4 946 778; Huston, Patente U.S. Nº 5 476 786; e Bird, RE. et al., Science, 242: 423-426 (1988)), referentes a anticorpos de cadeia única. Em algumas concretizações, imunoglobulinas humanizadas são anticorpos desimunizados. Consultar, por exemplo, Carr et al., Patente US. Nº7 264 806, referente a imunoglobulinas desimunizadas que foram modificadas para reduzir o número de epítopos potenciais em células T, re- duzindo com isso a propensão para a imunoglobulina induzir uma resposta ' imune ao ser administrada a um humano.
Em concretizações específicas, a imunoglobulina humanizada compreende uma ou mais CDRs de cadeia leve e uma ou mais CDRs de cadeia pesada de um ou mais dos seguintes anticorpos monoclonais muri- nos: 8G3.25.3.5 de camundongo, 4G7.F3 de camundongo, 9D9.A2 de ca- mundongo, 11C11.C5 de camundongo, 3G7.E9 de camundongo, 5F7.1.1.4 de camundongo, 12G6.15.1.2 de camundongo, 23E6.2.2.1 de camundongo, 2C3.3.8.1de camundongo, 7F11.1.9.7 de camundongo e 4B10.1.2.4 de ca- mundongo. Em outra concretização, as imunoglobulinas humanizadas ligam-
se à CD52 humana com afinidade semelhante ou melhor do que a de Cam- pathO.
Em uma concretização específica, a imunoglobulina humanizada da presente invenção possui a especificidade de ligação de um anticorpo muri- no anti-CD52 humana da invenção (por exemplo, tendo especificidade para CD52 humana, tendo a mesma ou semelhante especificidade epitópica) e/ou tendo a mesma função inibidora.
As imunoglobulinas humanizadas podem exibir a especificidade de ligação e/ou atividade inibidora de um anticorpo murino anti-CD52 humana ou anticorpo humanizado anti-CD52 humana descrito neste relatório, e/ou a especificidade epitópica de um anticorpo mu- rino ant-CD52 humana ou anticorpo humanizado anti-CD52 humana descri- to neste relatório (por exemplo, pode competir com o anticorpo murino anti- CD52 humana ou outro anticorpo humanizado anti-CD52 (por exemplo, - CampathO) pela ligação à CD52, e/ou pode ter a função inibidora do anticor- po murino ou humanizado anti-CD52 humana). Em uma concretização espe- “15 cífica, a imunoglobulina humanizada possui a especificidade de ligação, a especificidade epitópica e/ou a atividade inibidora de qualquer um dos anti- corpos de camundongo 8G3, 4G7, 9D9, 11C11, 3G7, 5F7, 12G6, 23E6, 2C3,
7F11 e 4B10. A parte da imunoglobulina humanizada ou da cadeia da imuno- —globulina que é de origem humana (por exemplo, região framework; região constante) pode ser derivada de qualquer imunoglobulina ou cadeia de imu- noglobulina humana adequada.
Por exemplo, uma região constante humana, À ou parte desta, em um anticorpo humanizado ou quimérico pode ser deriva- da de um gene da cadeia leve humana k« ou À cadeia leve, e/ou de um gene —dacadeiapesada humana y (por exemplo, y1, y2, v3, y4), u, a (por exemplo, a1, a2), 5 ou e, incluindo variações alélicas.
Uma região constante específica (por exemplo, IgG1), variante ou parte desta pode ser selecionada a fim de adaptar a função efetora.
Por exemplo, uma região constante mutante (vari- ante) pode ser incorporada na imunoglobulina ou cadeia da imunoglobulina de modo a minimizar a ligação a receptores Fc e/ou a capacidade de fixar complemento. (Consultar, por exemplo, Winter et al., GB 2 209 757 B; Morri- son et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, 22 de dezembro de
1994). Em uma concretização, a região framework humana não possui vari- ação ou mutação em sua estrutura ou sequência. Em uma concretização específica, a região framework é uma sequência de região framework de linhagem germinativa sem mutações ou variações em sua sequência.
Neste relatório descritivo, o termo "linhagem germinativa" refere- se às sequências de nucleotídeos e sequências de aminoácidos dos genes de anticorpos e de segmentos de genes que são transmitidos de pais para prole via as células germinativas. Esta sequência de linhagem germinativa é distinguida das sequências de nucleotídeos codificadoras de anticorpos em células B maduras que foram alteradas por eventos de recombinação e hi- permutação durante o transcorrer da maturação das células B. Um anticorpo que "utiliza" uma determinada linhagem germinativa possui uma sequência - de nucleotídeos ou de aminoácidos que mais proximamente se alinha àquela sequência de nucleotídeos ou à sequência de aminoácidos que esta especi- fica Tais anticorpos frequentemente são mutantes quando comparados à sequência da linhagem germinativa.
Em outras concretizações, o framework humano exibe variação ou mutação mínima da sequência de linhagem germinativa em sua estrutura ou sequência (por exemplo, menos de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos acei- tadores do framework foram substituídos por resíduos do framework doador para melhorar a afinidade de ligação, consultar Queen et a/., Patente U.S. Nº 5 530 101). Em uma concretização específica, um número limitado de ami- ã noácidos no framework de uma cadeia de imunoglobulina humanizada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos) é escolhido para ser i- 26 gual ao número dos aminoácidos naquelas posições na sequência doadora (ou seja, "mutação reversa"), em vez de na sequência aceitadora, para au- mentar a afinidade de um anticorpo compreendendo a cadeia de imunoglo- bulina humanizada para CD52 humana.
Regiões humanas framework (por exemplo, das regiões variá- veisda pesada e/ou da leve) são obtidas ou derivadas de preferência de uma região variável de anticorpo humano tendo similaridade de sequência à região análoga ou equivalente (por exemplo, regiões variáveis de cadeia pe-
sada ou leve) da região de ligação a antígeno da imunoglobulina doadora (anticorpo murino anti-CD52). Outras fontes de regiões framework para par- tes de origem humana de uma imunoglobulina humanizada incluem sequên- cias de consenso de região variável (Consultar, por exemplo, Kettleborough, CA etal, Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carter et al, WO 94/04679; Carter, Patente U.S. 6 407 213)). Por exemplo, a região da se- quência doadora do anticorpo (por exemplo, a sequência da região variável) usada para obter a parte não humana pode ser comparada a sequências humanas como descrito em Kabat, E. A. et al. Sequences of Proteins of Im- munological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991) para selecionar uma de- terminada fonte das partes humanas da imunoglobulina humanizada, por V exemplo, uma fonte das regiões framework.
Em uma concretização, as regiões framework de cadeias da i- munoglobulina humanizada são obtidas ou derivadas de uma região variável de lg humana tendo pelo menos em torno de 50%, pelo menos em torno de 55%, pelo menos em torno de 60%, pelo menos em torno de 65%, pelo me- nos em torno de 70%, pelo menos em torno de 75%, pelo menos em torno de 80%, pelo menos em torno de 85%, pelo menos em torno de 90% ou pelo menos em torno de 95% de identidade global de sequência com a região variável da doadora não humana. Em uma concretização específica, as regi- ões framework de cadeias da imunoglobulina humanizada são obtidas ou . derivadas de regiões humanas framework de região variável tendo pelo me- nos em torno de 50%, pelo menos em torno de 55%, pelo menos em torno i 25 —de60%, pelo menos em torno de 65%, pelo menos em torno de 70%, pelo menos em torno de 75%, pelo menos em torno de 80%, pelo menos em tor- no de 85%, pelo menos em torno de 90% ou pelo menos em torno de 95% de identidade global de sequência, com as regiões framework da região va- riável da imunoglobulina doadora não humana. Em uma concretização, pelo menos uma das regiões framework (FR) da imunoglobulina humanizada é obtida ou derivada de uma ou mais cadeias de um anticorpo de origem humana. Por conseguinte, a FR pode incluir FR1 e/ou FR2 e/ou FR3 e/ou FRA4, obtidas ou derivadas de um ou mais anticorpos de origem humana (por exemplo, de uma cadeia de imuno- globulina humana, de uma sequência de consenso humana). As partes de imunoglobulina para uso na presente invenção possuem sequências idênticas ou semelhantes à de imunoglobulinas a partir das quais são derivadas ou a de variantes destas.
Tais variantes incluem mutantes diferindo pela adição, deleção ou substituição (por exemplo, substi- tuição conservadora) de um ou mais resíduos, por exemplo, diferindo em até 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos da sequência precursora, por uma ou mais adições, deleções ou substituições.
Como indicado acima, a imunoglobulina humanizada da invenção compreende uma ou mais CDRs de um ou mais dos anticorpos murinos anti-CD52 (anticorpos doadores) descritos neste re- - latório.
É possível efetuar alterações na região framework, tais como aquelas que substituem um resíduo da região framework de origem humana por um “15 resíduo da posição correspondente do anticorpo doador.
Uma ou mais mu- tações, incluindo deleções, inserções e substituições de um ou mais amino- ácidos na região framework, podem ser efetuadas.
Se desejado, mutações no framework podem ser incluídas em um anticorpo ou cadeia humanizada, e sítios para mutação podem ser selecionados usando qualquer método a- dequado, por exemplo, como descrito em WO 98/06248, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência neste pedido de patente.
Será apreciado por aquele versado no estado da técnica que, . em alguns casos, resíduos flanqueando a única ou mais CDRs do(s) anti- corpo(s) murino(s) anti-CD52 podem contribuir e, às vezes, serem essenci- ais, direta ou indiretamente, para função (por exemplo, ligação). Por conse- guinte, em algumas concretizações, um ou mais aminoácidos flanqueando uma ou mais CDRs (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos flanqueadores) do framework murino estão incluídos também na imunoglo- bulina humanizada.
Em algumas concretizações, as regiões humanas framework da cadeia pesada dos anticorpos humanizados desta invenção utilizam a se- quência da linhagem germinativa humana de VH3-72 ou VH3-23. Em algu-
mas concretizações, as regiões humanas framework da cadeia leve dos an- ticorpos humanizados desta invenção utilizam a sequência da linhagem germinativa humana de Vk2-A18b. Mutações reversas podem ser opcional- mente efetuadas nestas regiões FR em um ou mais dos resíduos, conforme descrito nos Exemplos de Trabalho abaixo para melhorar a afinidade de |i- gação à CD52 do anticorpo humanizado.
"Afinidade" é um termo do estado da técnica que descreve a for- ça de interação de uma ligação e refere-se tipicamente à força global de li- gação da imunoglobulina à CD52 humana.
Em uma concretização específica, a imunoglobulina possui ativi- dade de ligação medida em valor de ECs9 de menos de 10 upg/mL (por e- xemplo, como determinado por citometria de fluxo). Em outra concretização, - a imunoglobulina possui atividade de ligação medida em valor de ECs,g de menos de 5,0 ug/mlL ou menos de 1,0 ug/mL (por exemplo, como determi- “15 nado por citometria de fluxo).
Em algumas concretizações, a imunoglobulina liga-se à CD52 humana com afinidade (Kp; Kp=Kotr (Ki)/Kon (ka)) de 300 nM a 1 pM (ou se- ja, 3 x 107 a 1 x 107º M), de preferência, de 50 nM a 1 pM, mais preferivel- mente de 5 nM a 1 pM e o mais preferível de 1 nM a 1 pM, por exemplo, Kp de1x10”M ou menos, de preferência 1 x 10º M ou menos, mais preferi- velmente 1 x 10º M ou menos, vantajosamente 1 x 10º M ou menos e o mais preferível 1 x 10 M ou 1x 10? ou menos; e/ou taxa de constante Korg i de 5x 10º s-1 a 1x 107 s-1, de preferência, de 1x 10? s-1 a 1x 10º s-1, mais preferivelmente de 5 x 10º s-1 a 1 x 10º s-1, por exemplo 5 x 10 s-1 “25 oumenos,de preferência 1 x 10? s-1 ou menos, vantajosamente 1 x 10º s-1 ou menos, mais preferivelmente 1 x 10º? s-1 ou menos, ainda mais preferi- velmente 1 x 10º s-1 ou menos, e o mais preferível 1 x 10º s-1 ou menos, conforme determinado por ressonância plasmônica de superfície.
Como é evidente para aquele versado no estado da técnica, uma variedade de métodos pode ser utilizada para confirmar se imunoglobu- linas produzidas de acordo com os métodos aqui providos e conhecidos no estado da técnica exibem a especificidade indispensável (por exemplo, es-
pecificidade de ligação, especificidade epitópica). Por exemplo, a função de ligação de uma imunoglobulina humanizada anti-CD52 da invenção tendo especificidade de ligação por CD52 humana pode ser detectada usando qualquer método adequando, por exemplo, ensaios que monitorem a forma- — çãodeum complexo entre imunoglobulina humanizada e CD52 humana (por exemplo, fração de membrana compreendendo CD52 humana; célula por- tando CD52 humana, tal como célula T humana, célula B humana; célula CHO ou célula hospedeira recombinante compreendendo e expressando ácido nucleico codificador de CD52 humana; peptídeo (por exemplo, peptí- | 10 deo sintético) tendo sequência de aminoácidos de CD52; suporte sólido con- tendo CD52 humana).
A capacidade de uma imunoglobulina da invenção (por exemplo, P imunoglobulina humanizada da invenção) de ligar-se ao mesmo epítopo em CD52 humana que um determinado anticorpo monoclonal murino, quimérico “15 ou humanizado, ou de ligar-se a um epítopo em CD52 humana que se so- breponha ao epítopo em CD52 humana ao qual um determinado anticorpo monoclonal murino, quimérico ou humanizado, pode ser rapidamente deter- minada usando uma variedade de técnicas conhecidas por aqueles versados no estado da técnica, incluindo, por exemplo, ensaios de ligação competitiva. Estes podem envolver o uso de uma forma marcada do referido determinado anticorpo e medição da ligação daquele anticorpo marcado à CD52 humana na presença e na ausência de uma imunoglobulina da invenção. ' "Epítopo", neste relatório descritivo, inclui qualquer determinante proteico capaz de ligar-se especificamente a uma imunoglobulina. Determi- i 25 nantes epitópicos consistem geralmente em agrupamentos quimicamente ativos de moléculas de superfície, tais como aminoácidos ou carboidratos ou cadeias laterais de açúcares, e em geral possuem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características específicas de carga. Um epítopo pode ser "linear" ou "conformacional", Em epítopo linear, todos os pontos de interação entre a proteina e a molécula interatuante (tal qual um anticorpo) ocorrem linearmente ao longo da sequência primária de ami- noácidos da proteína. Em epítopo conformacional, os pontos de interação ocorrem em aminoácidos na proteína que estão separados entre si. Uma vez determinado um epítopo ou antígeno desejado, é possível gerar anticorpos contra aquele epítopo, por exemplo, usando as técnicas descritas na presen- te invenção. Alternativamente, durante o processo de descoberta, a geração eacaracterização de anticorpos podem elucidar informações sobre epítopos desejáveis. A partir destas informações, é possível, então, rastrear competi- tivamente anticorpos para ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para tanto é conduzir estudos de competição para descobrir anticorpos que se ligam competitivamente um com o outro, ou seja, os anticorpos competem pelaligação ao antígeno.
Em uma concretização, a fim de determinar se um anticorpo em teste liga-se ao mesmo epítopo ou a sobreposto de um anticorpo humaniza- e do desta invenção, é permitido que o anticorpo anti-CD52 da invenção ligue- se à CD52 em condições de saturação e, em seguida, é medida a capacida- dedo anticorpo em teste de ligar-se à CD52. Se o anticorpo em teste for ca- paz de ligar-se à CD52 no mesmo tempo em que o anticorpo anti-CD52 de referência, o anticorpo em teste, nesse caso, liga-se a um epítopo diferente do anticorpo anti-CD52 de referência. No entanto, se o anticorpo em teste não for capaz de ligar-se à CD52 no mesmo tempo, o anticorpo em teste, nesse caso, liga-se ao mesmo epítopo, a um epítopo sobreposto ou a um epítopo em proximidade direta ao epítopo ligado pelo anticorpo anti-CD52 da invenção. Esse experimento pode ser realizado usando ELISA, RIA, BIA- fr CORE" ou citometria de fluxo. Para testar se um anticorpo anti-CD52 com- pete de modo cruzado com outro anticorpo anti-CD52, é possível usar o mé- “25 todode competição descrito acima em duas direções, ou seja, determinar se o anticorpo de referência bloqueia o anticorpo em teste e vice-versa. Em al- gumas concretizações, o experimento é realizado usando BIACORE"", O binning de epítopos pode ser útil também para caracterizar os anticorpos desta invenção. O termo "binning" refere-se a um método para agrupar anticorpos com base em suas características de ligação a antíge- nos. Um processo de alto rendimento para "binning" anticorpos com base em sua competição cruzada está descrito no Pedido de Patente Internacio-
nal Nº WO 03/48731. O "banning de epítopos" pode ser investigado permi- tindo que uma forma não marcada de um anticorpo anti-CD52 "A" ligue-se a um peptídeo sintético correspondente à sequência de CD52 ou a células CD52 positivas.
Subsequentemente, um segundo anticorpo anti-CD52 mar- cado"B"é adicionado, sendo possível avaliar a quantidade de anticorpo marcado que pode ligar-se em relação a uma amostra de controle, em que as células ou o peptídeo sintético não foram expostos previamente ao anti- corpo anti-CD52 "A". Alternativamente, anticorpos anti-CD52 "A" e "B" po- dem ser ambos marcados com diferentes fluorocromos ou substâncias qui- micas que possibilitam detecção, sendo possível medir as quantidades de ambos os anticorpos marcados que podem travar o peptídeo de CD52 ao mesmo tempo, usando um dispositivo capaz de detectar a marcação ou me- - dir as quantidades de ambos os anticorpos que travam simultaneamente células CD52 positivas por citometria de fluxo.
As tecnologias Biacore e Oc- “15 tet possibilitam investigar a ligação competitiva de formas não marcadas de anticorpos.
Esse uso de formas não marcadas de anticorpos é desejado já que a modificação química de alguns anticorpos pode comprometer a ativi- dade de ligação.
Consultar também a tecnologia descrita em Jia et al., J.
Immunol.
Methods 288:91-98 (2004), a qual é útil também para binning de epítopos.
A presente invenção provê também partes das imunoglobulinas humanizadas, tais como cadeias leves, cadeias pesadas e partes de cadeias ' leves e pesadas.
Estas partes de imunoglobulinas podem ser obtidas ou de- rivadas de imunoglobulinas (por exemplo, por redução e/ou clivagem), ou produzidas ou expressas por ácidos nucleicos codificadores de parte de uma imunoglobulina ou de sua cadeia tendo a propriedade desejada (por exem- plo, ligar-se à CD52 humana, similaridade de sequência). Estas partes po- dem ser preparadas, por exemplo, por síntese de novo da parte pertinente.
Imunoglobulinas humanizadas compreendendo as partes desejadas (por exemplo, região de ligação a antígeno, CDR, FR, região C) de origem hu- mana e não humana podem ser produzidas usando ácidos nucleicos sintéti- cos e/ou recombinantes para preparar construtos (por exemplo, cDNA) codi-
ficadores da cadeia humanizada desejada.
Por exemplo, para preparar parte de uma imunoglobulina (por exemplo, parte de uma cadeia), um ou mais có- dons de parada podem ser introduzidos na posição desejada.
Sequências de ácido nucleico (por exemplo, DNA), codificadoras de regiões variáveis hu- manizadas, podem ser construídas usando métodos de PCR mutagênica para alterar sequências existentes de DNA (consultar, por exemplo, Kam- man, M,, et al., Nucl.
Acids Res. 17:5404 (1989)). Iniciadores de PCR que codificam as novas CDRs podem ser hibridizados com um modelo de DNA de uma região variável previamente humanizada que tem como base a mesma região variável humana, ou muito semelhante (Sato, K., et al., Can- cer Research 53:851-856 (1993)). Se não houver disponível uma sequência semelhante de DNA para uso como modelo, um ácido nucleico, compreen- e dendo uma sequência codificadora de uma sequência de região variável, pode ser construído a partir de oligonucleotídeos sintéticos (consultar, por exemplo, Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993)). Uma se- quência codificadora de um peptídeo de sinalização pode ser também incor- porada no ácido nucleico (por exemplo, em síntese, mediante inserção em vetor). Se não houver disponível sequência de peptídeo de sinalização (por exemplo, não tipicamente presente), uma sequência de peptídeo de sinali- zação de outro anticorpo pode ser usada (consultar, por exemplo, Kettlebo- rough, C.A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)). Com o uso destes mé- todos, de métodos descritos neste relatório ou de outros métodos adequa-
dos, variantes podem ser rapidamente produzidas.
A invenção refere-se a uma imunoglobulina humanizada com especificidade de ligação por CD52 humana e que compreende uma cadeia leve humanizada e uma cadeia pesada humanizada e/ou partes destas.
Em uma concretização, a imunoglobulina humanizada compreende uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 3, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por e- —xemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 16; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 4, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 17; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais C- DRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 5, e uma cadeia pe- sada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 18; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exem- plo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 6, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 19; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 7, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 20; uma cadeia leve, in- —cluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 8, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 21; uma cadeia leve, incluindo uma ou . mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 9, e uma ca- deia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três C- DRs)deSEQID NO: 22; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 10, e uma cadeia pesada in- cluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 23; uma cadeia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 11, e uma cadeia pesada incluindo uma ou maisCDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 24; uma ca- deia leve, incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 12, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por : exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 25; ou uma cadeia leve, inclu- indo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: “25 13,euma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 26. Em uma concretização, uma imunoglobulina humanizada da in- venção compreende (H)-CDR1, H-CDR2, H-CDR3 de cadeia pesada, (L)- CDR1, L-CDR2 e L-CDR3 de cadeia leve, cujas sequências de aminoácidos são: a)SEQID NOs: 51, 59, 69, 29, 36 e 43, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 50, 60, 69, 29, 37 e 43, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 50, 61, 68, 29, 38 e 43, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 50, 61, 69, 29, 36 e 43, res-
pectivamente; e) SEQ ID NOs: 50, 62, 69, 29, 39 e 43, respectivamente; f) SEQ ID NOs: 52, 61, 70, 30, 40 e 43, respectivamente; g) SEQ ID NOs: 53, 63, 71, 31, 36 e 44, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 54, 64, 71, 31, 36 e 45, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 55, 63, 72, 31, 36 e 46, respectivamen- te;j SEQIDNOs: 56, 65,73, 32, 41 e 47, respectivamente; k) SEQ ID NOs: 56, 65, 294, 32, 41 e 47; ou |) SEQ ID NOs: 56, 66, 74, 33, 41 e 48, respecti- vamente.
Em outra concretização, uma imunoglobulina humanizada desta invenção compreende H-CDR3 e L-CDR3, cujas sequências são a) SEQ ID NOs:69 e 43, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 68 e 43, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 70 e 43, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 71 e 44, respec- tivamente; e) SEQ ID NOs: 71 e 45, respectivamente; f) SEQ ID NOs: 72 e : 46, respectivamente; g) SEQ ID NOs: 73 e 47, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 294 e 47, respectivamente; ou i) SEQ ID NOs: 74 e 48, respectivamen- te.
Em outra concretização, a imunoglobulina humanizada possui especificidade de ligação por CD52 humana e compreende uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:31,SEQID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, : SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48, ou uma combinação destas; e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs se- “25 lecionadasa partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 294, ou uma combinação destas; em que a imunoglobulina humanizada não é Campath€O.
Em outra concretização, a imunoglobulina humanizada que pos- sui especificidade de ligação por CD52 humana compreende uma cadeia leve incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQIDNO:8,SEQID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13, e uma cadeia pesada incluindo uma ou mais CDRs (por exemplo, todas as três CDRs) de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 ou SEQIDNO:137,em que a imunoglobulina humanizada não é Campath€. A invenção refere-se também a uma cadeia leve humanizada de imunoglobulina da imunoglobulina humanizada aqui descrita. Em uma con- p cretização, a cadeia leve imunizada de imunoglobulina compreende uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 27, SEQID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48, e uma combinação des- tas, em que a cadeia leve humanizada de imunoglobulina não é a cadeia leve de CampathO. Por exemplo, o anticorpo humanizado possui L-CDR1, L- CDR?2 e L-CDR3, cujas sequências de aminoácidos são: a) SEQ ID NOs: 29, . 36 e 43, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 29, 37 e 43, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 29, 38 e 43, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 29, 36 e 43, “25 respectivamente; e) SEQ ID NOs: 29, 39 e 43, respectivamente; f) SEQ ID NOs: 30, 40 e 43, respectivamente; g) SEQ ID NOs: 31, 36 e 44, respecti- vamente; h) SEQ ID NOs: 31, 36 e 45, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 31, 36 e 46, respectivamente; j) SEQ ID NOs: 32, 41 e 47, respectivamente; ou k) SEQ ID NOs: 33, 41 e 48, respectivamente.
A invenção refere-se também a uma cadeia pesada humanizada compreendendo uma ou mais CDRs selecionadas a partir do grupo constitu- ido por SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52,
SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQIDNO: 71, SEQID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 294, ou uma combinação destas, em que a cadeia pesada humanizada de imunoglobulina não é a cadeia pesada de Campath€. Por exemplo, o anticorpo humanizado possui H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3, cujas sequên- cias de aminoácidos são: a) SEQ ID NOs: 51, 59, e 69, respectivamente; b) SEQID NOs: 50,60 e 69, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 50, 61 e 68, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 50, 61 e 69, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 50, 62 e 69, respectivamente; f) SEQ ID NOs: 52, 61 e 70, respectiva- mente; g) SEQ ID NOs: 53, 63 e 71, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 54, 64 e 71, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 55, 63 e 72, respectivamente; j) SEQIDNOs: 56,65 e 73, respectivamente; k)y) SEQ ID NOs: 56, 65 e 294; ou |) SEQ ID NOs: 56, 66 e 74, respectivamente.
Em uma concretização, um anticorpo humanizado desta inven- ção compreende uma cadeia leve incluindo uma sequência de domínio vari- ável (V.) de uma das SEQ ID NOs: 102, 138, 145-148, 153-157 e 164-168. Em uma concretização correlata, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia leve cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste em uma das SEQ ID NOs: 273, 275, 278, 280 e 282. ' Em uma concretização, um anticorpo humanizado desta inven- ção compreende uma cadeia pesada incluindo uma sequência de domínio variável (Vs) de uma das SEQ ID NOs: 103, 136, 137, 139-144, 149-152 e 158-163. Em uma concretização correlata, o anticorpo humanizado compre- ende uma cadeia pesada cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste em uma das SEQ ID NOs: 272, 274, 276, 277, 279 e 281. Em algumas concretizações um anticorpo humanizado desta in- venção compreende uma V, e uma V, cujas sequências de aminoácidos compreendem ou consistem em: a) SEQID NOs: 103 e 102, respectivamente (4B10-H1/K1);
b) SEQID NOs: 136 e 138, respectivamente (7F11-SFD1/K2); c) SEQ ID NOs: 137 e 138, respectivamente (7F11-SFD2/K2) d) SEQID NO: 139 e uma das SEQ ID NOs: 145-148, respectivamente (por exemplo, SEQ ID NOs: 139 e 146, respectivamente (2C3-SFD1/K11); e SEQ ID NOs: 139 e 147, respectivamente (2C3-SFD1/K12)); e) SEQID NO: 140 e uma das SEQ ID NOs: 145-148, respectivamente; fl SEQIDNO: 141 e uma das SEQ ID NOs: 145-148, respectivamente; g) SEQID NO: 142 e uma das SEQ ID NOs: 145-148, respectivamente; h) SEQID NO: 143 e uma das SEQ ID NOs: 145-148, respectivamente; x 10 i) SEQIDNO:144e uma das SEQ ID NOs: 145-148, respectivamente; j) SEQIDNO: 149 e uma das SEQ ID NOs: 153-157, respectivamente (por exemplo, SEQ ID NOs: 149 e 155, respectivamente (12G6-SFD1/K11); SEQ ID NOs: 149 e 156, respectivamente (12G6-SFD1/K12); e SEQ ID NOs: 149 e 157, respectivamente (12G6-SFD1/K13)); k SEQIDNO:150e uma das SEQ ID NOs: 153-157, respectivamente; 1) SEQIDNO: 151 e uma das SEQ ID NOs: 153-157, respectivamente; m) SEQ ID NO: 152 e uma das SEQ ID NOs: 153-157, respectivamente; n) SEQID NO: 158 e uma das SEQ ID NOs: 164-168, respectivamente (por exemplo, SEQ ID NOs: 158 e 165, respectivamente (9D9-H10/K12); e SEQ ID NOs: 158 e 166, respectivamente (9D9-H10/K13)); ” o) SEQID NO: 159 e uma das SEQ ID NOs: 164-168, respectivamente (por exemplo, SEQ ID NOs: 159 e 165, respectivamente (9D9-H11/K12); e . SEQ ID NOs: 159 e 166, respectivamente (9D9-H11/K13)); p) SEQ ID NO: 160 e uma das SEQ ID NOs: 164-168, respectivamente; e q) SEQID NO: 161 e uma das SEQ ID NOs: 164-168, respectivamente (por exemplo, SEQ ID NOs: 161 e 166, respectivamente (9D9-H16/K13)); r) SEQID NO: 162 e uma das SEQ ID NOs: 164-168, respectivamente; ou s) SEQIDNO: 163 e uma das SEQ ID NOs: 164-168, respectivamente (por exemplo, SEQ ID NOs: 163 e 166, respectivamente (9D9-H18/K13)). Os anticorpos incluídos nos parênteses são descritos mais deta- lhadamente abaixo nos exemplos de trabalho.
Em uma concretização, um anticorpo humanizado desta inven-
' ção compreende uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC) cujas se- quências de aminoácidos compreendem ou consistem em a) SEQ ID NOs: 273 e 272, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 275 e 274, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 278 e 276, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 278 e 277, res- — pectivamente; e) SEQ ID NOs: 280 e 279, respectivamente; ou f) SEQ ID NOs: 282 e 281, respectivamente.
Esta invenção provê também anticorpos anti-CD52 humana (ex- ceto aqueles, se houver, conhecidos no estado da técnica anterior) que se ligam ao mesmo tempo ou que competem ou competem de modo cruzado com um anticorpo exemplificado no presente. Estes anticorpos podem ser, f por exemplo, anticorpos humanizados, quiméricos ou de camundongo. Por exemplo, a invenção provê anticorpos anti-CD52 humana que se ligam ao mesmo epítopo ou que competem ou competem de modo cruzado com um dos anticorpos de camundongo 8G3, 4F7, 9D9, 11011, 3G7, 5F7, 12G6, 23E6,2C3,7F11e4B10, e versões humanizadas e quiméricas destes anti- corpos de camundongo. A capacidade de um anticorpo ligar-se ao mesmo epítopo ou de competir ou de competir de modo cruzado com um anticorpo de referência pode ser determinada como descrito acima. Por exemplo, foi constatado que o epítopo de CD52 ligado pelos anticorpos humanizados 2C3-SFD1/K12 e 12G6-SFD1/K12 inclui os resíduos 7, 8 e 11 na SEQ ID NO: 104, e que o epítopo ligado pelo anticorpo humanizado 9D9-H16/K13 inclui os resíduos 4 e 11 na SEQ ID NO: 104. Portanto, em algumas concre- - tizações, esta invenção provê anticorpos anti-CD52 que se ligam ao mesmo epítopo ou que competem ou competem de modo cruzado com estes anti- corpos humanizados.
Se desejado, por exemplo, para fins diagnósticos ou de ensaio (por exemplo, imagens para permitir, por exemplo, monitorar terapias), a i- munoglobulina humanizada (por exemplo, seu fragmento de ligação a antí- geno) pode compreender um marcador detectável. Marcadores detectáveis adequados e métodos para marcar uma imunoglobulina humanizada ou seu fragmento de ligação a antígeno são bem conhecidos no estado da técnica. Marcadores detectáveis adequados incluem, por exemplo, radioisótopo (por
L 96/222 Ú exemplo, como Índio-111, Tecnécio-99m ou lodo-131), marcadores emisso- res de pósitrons (por exemplo, Flúor-19), íons paramagnéticos (por exemplo, Gadolínio (Ill), Manganês (1I)), marcador de epítopo (tag), marcador de afini- dade (por exemplo, biotina, avidina), marcador de spin, enzima, grupo fluo- rescente ou grupo quimioluminescente.
Quando marcadores não são em- pregados, a formação de complexo (por exemplo, entre imunoglobulina hu- manizada e CD52 humana) pode ser determinada por ressonância plasmô- nica de superfície, ELISA, FACS ou outros métodos adequados.
Anticorpos anti-CD52 usados na invenção pode ser também conjugados, por meio de, por exemplo, reações químicas ou modificações genéticas, a outros grupos (por exemplo, grupos de peguilação) que melho- ram a farmacocinética dos anticorpos, tais como meio-vida.
Em algumas . concretizações, os anticorpos anti-CD52 usados nesta invenção podem ser acoplados a uma citocina adequada por meio de, por exemplo, conjugação “15 química ou modificações genéticas (por exemplo, anexando a sequência de codificação da citocina em quadro (in frame) à sequência de codificação do anticorpo, criando com isso uma proteína de fusão anticorpo:citocina). A invenção refere-se também a imunoconjugados nos quais a imunoglobulina humanizada (por exemplo, seu fragmento de ligação a antí- geno)da invenção é acoplada a outro agente terapêutico, tal como compos- to bioativo (por exemplo, citocinas, superantígenos, agentes citotóxicos e toxinas). Por exemplo, a imunoglobulina humanizada com especificidade de . ligação por CD52 humana (por exemplo, seu fragmento de ligação a antíge- no) pode ser acoplada a uma proteína biológica, molécula de planta ou de “25 origem bacteriana (ou seu derivado), anticorpo interleucina-2 ou anticorpos contra toxina diftérica.
Imunoglobulinas monoclonais de camundongo Como descrito neste relatório, imunoglobulinas monocionais de camundongo tendo especificidade de ligação por CD52 humana foram pro- — duzidas.
Anticorpos humanizados e quiméricos desta invenção podem ser derivados dos anticorpos monoclonais de camundongo desta invenção.
Ou seja, em algumas concretizações, anticorpos humanizados e quiméricos an-
- 97/222 í ti-CD52 da invenção compreendem sequências obtidas de um anticorpo mo- noclonal de camundongo da invenção, tais como uma ou mais sequências de CDR. Uma imunoglobulina monoclonal de camundongo desta invenção compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada com sequências de a- —minoácidos de CDR que diferem das sequências de aminoácidos de CDR anti-CD52 anticorpos monoclonais de camundongo conhecidos (por exem- plo, de CF1D12).
Neste relatório descritivo, o termo "imunoglobulina monocional de camundongo" refere-se a uma imunoglobulina contendo CDRs de cadeia leve (L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3) e CDRs de cadeia pesada (H-CDR1, H- CDR2 e H-CDR3) de um anticorpo murino anti-CD52 humana, e regiões framework e constantes de origem murina. Imunoglobulinas monoclonais de R camundongo são anticorpos homogêneos de especificidade única, prepara- dos, por exemplo, pelo uso da tecnologia de hibridomas ou por métodos de “15 recombinação.
A invenção refere-se às imunoglobulinas monoclionais de ca- mundongo descritas neste relatório, incluindo fragmentos de ligação a antí- genos (ou seja, partes) das imunoglobulinas monoclonais de camundongo, as cadeias leves das imunoglobulinas monoclonais de camundongo, as ca- deias pesadas das imunoglobulinas monoclonais de camundongo e frag- mentos destas cadeias pesadas e leves. Em uma concretização específica, o anticorpo monoclonal de camundongo é o 8G3.25.3.5 de camundongo . (também denominado GENZ 8G3.25.3.5 ou 8G3), GMA 4G7.F3 de camun- dongo (também denominado 4G7.F3 ou 4G7), GMA 9D9.A2 de camundongo (também denominado 9D9.A2 ou 9D9), GMA 11C11.C5 de camundongo (também denominado 11C11.C5 ou 11011), GMA 3G7.E9 de camundongo (também denominado 3G7.E9 ou 3G7), 5F7.1.1.4 de camundongo (também denominado GENZ 5F7.1.1.4 ou 5F7), 12G6.15.1.2 de camundongo (tam- bém denominado GENZ 12G6.15.1.2 ou 2G6), 23E6.2.2.1 de camundongo (também denominado GENZ 23E6.2.2.1 ou 23E6), 2C3.3.8.1 de camundon- go (também denominado GENZ 2C3.3.8.1 ou 2C3), 7F11.1.9.7 de camun- dongo (também denominado GENZ 7F11.1.9.7 ou 7F11), ou 4B10.1.2.4 de
" camundongo (também denominado GENZ 4B10.1.2.4 ou 4B10). A invenção refere-se a uma imunoglobulina monoclonal madura de camundongo, tal como a imunoglobulina monocional de camundongo após processamento para retirada dos peptídeos de sinalização da cadeia pesada e da leve e/ou à imunoglobulina glicosilada. A invenção refere-se também a uma proteína imatura ou precursora, tal como uma cadeia leve de imunoglobulina de ca- mundongo ou uma cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo com- preendendo peptídeo de sinalização. A invenção refere-se também a molé- culas de ácido nucleico (por exemplo, vetores) que codificam estas proteínas imaturas ou maduras, a células hospedeiras que compreendem tais ácidos nucleicos e a métodos para produzir estas proteínas imaturas e maduras. A função de ligação de uma imunoglobulina monoclonal de ca- Ô mundongo tendo especificidade de ligação por CD52 humana pode ser de- tectada usando qualquer método adequado, por exemplo, usando ensaios "15 quemonitoram a formação de complexo entre imunoglobulina monoclonal de camundongo e CD52 humana (por exemplo, fração de membrana compre- endendo CD52 humana ou célula portando CD52 humana, tal como célula T humana, célula B humana, célula CHO ou célula hospedeira recombinante compreendendo um ácido nucleico codificador de CD52 humana; peptídeo (por exemplo, peptídeo sintético) tendo sequência de aminoácidos de CD52).
A presente invenção provê também partes das imunoglobulinas . marinas que incluem cadeias leves, cadeias pesadas e partes de cadeias leves e pesadas. Estas partes de imunoglobulinas podem ser obtidas ou de- “25 rivadas de imunoglobulinas (por exemplo, por redução e/ou clivagem); ou ácidos nucleicos que codificam parte de uma imunoglobulina ou sua cadeia tendo a propriedade desejada (por exemplo, ligar-se à CD52 humana, simila- ridade de sequência), podem ser produzidos e expressos. Estas podem ser preparadas, por exemplo, por síntese de novo de parte de imunoglobulinas —monoclonais de camundongo compreendendo as partes desejadas (por e- xemplo, região de ligação a antígeno, CDR, FR, e/ou região C) de origem murina e podem ser produzidas usando ácidos nucleicos sintéticos e/ou re-
É 99/222 í combinantes para preparar construtos (por exemplo, cDNA) que codificam a cadeia desejada de imunoglobulina monocional. Para preparar parte de uma cadeia, um ou mais códons de parada podem ser introduzidos na posição desejada. Uma sequência codificadora de peptídeo de sinalização pode ser também incorporada no ácido nucleico (por exemplo, durante a síntese, me- diante inserção em vetor). Se a sequência natural do peptídeo de sinalização não for disponível, uma sequência de peptídeo de sinalização de outro anti- corpo pode ser usada (consultar, por exemplo, Kettleborough, C.A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)). Com esses métodos, os métodos aqui des- critos ou outros métodos adequados, variantes podem ser rapidamente pro- duzidos.
Em uma concretização, uma imunoglobulina monoclional de ca- .: mundongo desta invenção compreende uma cadeia leve incluindo SEQ ID NO: 3 e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 16; a cadeia leve incluin- 715 doSEQIDNO:4 e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 17; uma ca- deia leve incluindo SEQ ID NO: 5 e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 18; uma cadeia leve incluindo SEQ ID NO: 6 e uma cadeia pesada in- cluindo SEQ ID NO: 19; uma cadeia leve incluindo SEQ ID NO: 7 e uma ca- deia pesada incluindo SEQ ID NO: 20; uma cadeia leve incluindo SEQ ID NO:8e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 21; uma cadeia leve in- cluindo SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 22; uma cadeia leve incluindo SEQ ID NO: 10 e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID . NO: 23; uma cadeia leve incluindo SEQ ID NO: 11 e uma cadeia pesada in- cluindo SEQ ID NO: 24; uma cadeia leve incluindo SEQ ID NO: 12 e uma “25 cadeiapesada incluindo SEQ ID NO: 25; ou uma cadeia leve incluindo SEQ ID NO: 13 e uma cadeia pesada incluindo SEQ ID NO: 26.
Em outra concretização, a invenção refere-se também a um an- ticorpo monoclonal de camundongo com especificidade de ligação por CD52 humana, compreendendo uma região variável de cadeia leve selecionada a —partirdo grupo constituído por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13; e uma região variável
: de cadeia pesada selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26.
Se desejado, por exemplo, para fins diagnósticos ou de ensaio (por exemplo, imagens para permitir, por exemplo, monitorar terapias), a i- munoglobulina monoclonal de camundongo (por exemplo, seu fragmento de ligação a antígeno) pode compreender um marcador detectável. Marcadores detectáveis adequados e métodos para marcar uma imunoglobulina mono- —clonalde camundongo são bem conhecidos no estado da técnica. Marcado- res detectáveis adequados incluem, por exemplo, radioisótopo (por exemplo, como Índio-111, Tecnécio-99m ou lodo-131), marcadores emissores de pósi- % trons (por exemplo, Flúor-19), íons paramagnéticos (por exemplo, Gadolínio (111), Manganês (11)), marcador de epítopo (tag), marcador de afinidade (por "15 exemplo, biotina, avidina), marcador de spin, enzima, grupo fluorescente ou grupo quimioluminescente. Quando marcadores não são empregados, a formação de complexo (por exemplo, entre imunoglobulina monoclonal de camundongo e CD52) pode ser determinada por ressonância plasmônica de superfície ou outros métodos adequados. Todos os métodos e técnicas des- critos para anticorpos humanizados desta invenção podem ser usados tam- bém no mesmo. Imunoglobulinas quiméricas Como descrito neste relatório, imunogiobulinas quiméricas tendo especificidade de ligação por CD52 humana foram produzidas. A imunoglo- —bulina quimérica compreende uma cadeia leve quimérica e/ou uma cadeia pesada quimérica com sequências de aminoácidos que diferem da sequên- cia de aminoácidos de anticorpos quiméricos conhecidos com especificidade de ligação por CD52 humana.
Neste relatório descritivo, o termo "imunoglobulina quimérica" re- fere-sea uma proteina recombinante que contém os domínios variáveis, in- cluindo regiões determinantes de complementaridade (CDRs), de um anti- corpo derivado de uma espécie, de preferência de um anticorpo monoclonal
. 101/222 s murino anti-CD52 humana, enquanto as regiões constantes da molécula do anticorpo são derivadas daquelas de uma espécie diferente, por exemplo, de um anticorpo humano.
A invenção refere-se às imunoglobulinas quiméricas aqui descri- tas, incluindo fragmentos de ligação a antígeno (ou seja, partes) das imuno- globulinas quiméricas, as cadeias leves quiméricas e as cadeias pesadas quiméricas das imunoglobulinas quiméricas e fragmentos destas cadeias leves e pesadas quiméricas. A invenção refere-se a uma imunoglobulina quimérica madura, tal como a imunoglobulina quimérica após processamen- ko 10 to para retirada dos peptídeos de sinalização da cadeia pesada e da leve e/ou à imunoglobulina glicosilada. A invenção refere-se também a uma pro- teina imatura ou precursora, tal como uma cadeia pesada quimérica com- Ss preendendo peptídeo de sinalização. A invenção refere-se também a molé- culas de ácido nucleico (por exemplo, vetores) que codificam estas proteínas "15 imaturas ou maduras, a células hospedeiras que compreendem tais ácidos nucleicos e a métodos para produzir estas proteinas imaturas e maduras.
A função de ligação de uma imunoglobulina quimérica tendo es- pecificidade de ligação por CD52 humana pode ser detectada usando qual- quer método adequado, por exemplo, usando ensaios que monitoram a for- mação de complexo entre imunoglobulina quimérica e CD52 humana (por O exemplo, fração de membrana compreendendo CD52 humana ou célula por- tando CD52 humana, tal como célula T humana, célula B humana, célula -. CHO ou célula hospedeira recombinante compreendendo um ácido nucleico codificador de CD52 humana; peptídeo (por exemplo, peptídeo sintético) tendo sequência de aminoácidos de CD52).
A presente invenção provê também partes das imunoglobulinas quiméricas que incluem cadeias leves, cadeias pesadas e partes de cadeias leves e pesadas. Estas partes de imunoglobulinas podem ser obtidas ou de- rivadas de imunoglobulinas (por exemplo, por redução e/ou clivagem), ou ácidos nucleicos que codificam parte de uma imunoglobulina ou sua cadeia tendo a propriedade desejada (por exemplo, ligar-se à CD52 humana, simila- ridade de sequência) podem ser produzidos e expressos. Estas podem ser
- 102/222 " preparadas, por exemplo, por síntese de novo de uma parte. Imunoglobuli- nas quiméricas compreendendo as partes desejadas (por exemplo, região de ligação a antígeno, CDR, FR, e/ou região C) de origem humana e não humana podem ser preparadas usando ácidos nucleicos sintéticos e/ou re- combinantes para preparar construtos (por exemplo, cDNA) que codificam a cadeia quimérica desejada. Para preparar parte de uma cadeia, um ou mais códons de parada podem ser introduzidos na posição desejada. Uma se- quência de codificação de peptídeo de sinalização pode ser também incor- porada no ácido nucleico (por exemplo, durante síntese, mediante inserção em vetor). Se a sequência natural do peptídeo de sinalização não for dispo- nível (por exemplo, tipicamente não presente), uma sequência de peptídeo de sinalização de outro anticorpo pode ser usada (consultar, por exemplo, : Kettleborough, C.A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)). Com estes mé- todos, os métodos aqui descritos ou outros métodos adequados, variantes podem ser rapidamente produzidos.
Em uma concretização, uma imunoglobulina quimérica desta in- venção compreende a região variável de cadeia leve de SEQID NO: 3 ea região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 16; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 4 e a região variável de cadeia pesada de SEQ IDNO:17;aregião variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 5 e a região vari- ável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 19; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 20; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8earegião variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 9 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 22; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e a regi- ão variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 23; a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 11 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24;aregião variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 25; ou a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13 e a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26.
O uE"-aà "0 º5%225 l m!* A“... .++jb+ PthULIiÍÓÂÔóAAGÔmm O A ss Osp««ÀKanassuprrqvssSSSSSSSSSSSSSSSSSEESSSSSCSSSEEEESSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSO.., = 103/222 A invenção refere-se também a um anticorpo quimérico com es- pecificidade de ligação por CD52 humana, compreendendo uma sequência de região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo constituído por: a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 3, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 4, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 5, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 6, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 9, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10, a região variável de cadeia leve de SEQ io 10 1DNO: 11, a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 12 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13, e uma sequência de região variá- vel de cadeia pesada selecionada a partir do grupo constituído por: a região s variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 16, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 17, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID “15 —NO:18,a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 19, a região va- riável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 20, a região variável de cadeia pe- sada de SEQ ID NO: 21, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 22, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 23, a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24, a região variável de cadeia pesada de SEQIDNO:25e aregião variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26. (O A invenção refere-se também a uma cadeia leve quimérica com- preendendo a região variável de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: - 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13. A invenção refere-se também a uma cadeia pesada quimérica compreendendo a região variável de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26 Se desejado, por exemplo, para fins diagnósticos ou de ensaio (por exemplo, imagens para permitir, por exemplo, monitorar terapias), a i- munoglobulina quimérica (por exemplo, seu fragmento de ligação a antige- no) pode compreender um marcador detectável.
Marcadores detectáveis p 104/222 : adequados e métodos para marcar uma imunoglobulina quimérica ou seu fragmento de ligação a antígeno são bem conhecidos no estado da técnica.
Marcadores detectáveis adequados incluem, por exemplo, radioisótopo (por exemplo, como Índio-111, Tecnécio-99m ou lodo-131), marcadores emisso- resde pósitrons (por exemplo, Flúor-19), íons paramagnéticos (por exemplo, Gadolínio (III), Manganês (1l)), marcador de epítopo (tag), marcador de afini- dade (por exemplo, biotina, avidina), marcador de spin, enzima, grupo fluo- rescente ou grupo quimioluminescente.
Quando marcadores não são em- pregados, a formação de complexo (por exemplo, entre imunoglobulina qui- méricae CD52 humana) pode ser determinada por ressonância plasmônica de superfície ou outros métodos adequados.
Todos os métodos e técnicas adequadas descritas acima para anticorpos humanizados desta invenção z podem ser também usados no mesmo.
Ácidos nucleicos e vetores recombinantes “15 A presente invenção refere-se também a ácidos nucleicos isola- dos e/ou recombinantes (incluindo, por exemplo, essencialmente puros), compreendendo sequências que codificam uma imunoglobulina humanizada, cadeia leve humanizada, cadeia pesada humanizada, imunoglobulina mono- clonal de camundongo, cadeia leve de imunoglobulina de camundongo, ca- deia pesada de imunoglobulina de camundongo, imunoglobulina quimérica, cadeia leve quimérica ou cadeia pesada quimérica da presente invenção.
Ácidos nucleicos citados neste relatório descritivo como "isola- - dos" ou "purificados" são ácidos nucleicos que foram separados dos ácidos nucleicos DNA genômico ou RNA celular de sua fonte de origem (por exem- “25 plo,como existentes em células ou em mistura de ácidos nucleicos tal como uma biblioteca), e incluem ácidos nucleicos obtidos por métodos aqui descri- tos ou outros métodos adequados, incluindo ácidos nucleicos essencialmen- te puros, ácidos nucleicos produzidos por síntese química, por combinações de métodos biológicos e químicos, e ácidos nucleicos recombinantes que são isolados (consultar, por exemplo, Daugherty, B.L. et al, Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. e J.S.
Crowe, Gene, 101: 297- 302 (1991).
- 105/222 C Ácidos nucleicos citados neste relatório descritivo como "recom- binantes" são ácidos nucleicos que foram produzidos pela metodologia de DNA recombinante, incluindo aqueles ácidos nucleicos que são gerados por procedimentos fundamentados em método de recombinação artificial, tal como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou clonagem em vetor u- sando enzimas de restrição.
Ácidos nucleicos "recombinantes" são também aqueles que resultam de eventos de recombinação ocorridos através dos mecanismos naturais de células, mas que são selecionados, depois da in- trodução às células de ácidos nucleicos desenhados, para possibilitar e tor- nar provável um evento desejado de recombinação.
A presente invenção refere-se também mais especificamente a ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes, compreendendo uma se- : quência de nucleotídeos que codifica uma imunoglobulina humanizada, imu- noglobulina de camundongo ou imunoglobulina quimérica com especificida- *15 dedeligaçãoporCD52 humana (por exemplo, uma imunoglobulina humani- zada da presente invenção na qual a parte não humana (por exemplo, as CDRs) é derivada de um anticorpo monoclonal murino anti-CD52, uma imu- noglobulina de camundongo da presente invenção; ou uma imunoglobulina quimérica da presente invenção na qual a parte não humana (por exemplo, a VhneWV) é derivada de um anticorpo monoclonal murino anti-CD52) ou parte (por exemplo, parte de ligação a antígeno) deste (por exemplo, sua cadeia pesada ou leve). - Ácidos nucleicos da presente invenção podem ser usados para produzir imunoglobulinas humanizadas com especificidade de ligação por “25 CD52 humana, imunoglobulinas de camundongo com especificidade de liga- ção por CD52 humana e imunoglobulinas quiméricas com especificidade de ligação por CD52 humana.
Por exemplo, um ácido nucleico (por exemplo, DNA (tal como cDNA) ou RNA) ou um ou mais ácidos nucleicos codificado- res de uma imunoglobulina humanizada, imunoglobulina de camundongo ou —imunoglobulina quimérica da presente invenção podem ser incorporados em um construto adequado (por exemplo, vetor recombinante) para manipula- ção adicional de sequências ou para produção das imunoglobulinas codifi-
- 106/222 ' cadas em células hospedeiras adequadas.
Construtos ou vetores (por exemplo, vetores de expressão) ade- quados para a expressão de uma imunoglobulina humanizada com especifi- cidade de ligação por CD52 humana, imunoglobulina de camundongo com especificidade de ligação por CD52 humana ou imunoglobulina quimérica com especificidade de ligação por CD52 humana são também providos. E- xiste disponível uma variedade de vetores, incluindo vetores que são manti- dos em uma cópia única ou múltiplas cópias em uma célula hospedeira ou que se integram no(s) cromossomo(s) da célula hospedeira. Os construtos | 10 ou vetores podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada, e j células que expressam uma imunoglobulina humanizada, imunoglobulina de camundongo ou imunoglobulina quimérica da presente invenção podem ser à produzidas e mantidas em cultura. Um único vetor ou múltiplos vetores po- dem ser usados para a expressão de uma imunoglobulina humanizada, imu- *15 —noglobulina de camundongo ou imunoglobulina quimérica com especificida- de de ligação por CD52 humana.
Vetores de expressão adequados, por exemplo, vetores de ex- pressão em célula de mamífero, podem conter também alguns componen- tes, incluindo, entre outros, um ou mais dos seguintes: origem de replicação, gene marcador selecionável, um ou mais elementos de controle de expres- são, tal como elemento de controle transcricional (por exemplo, promotor, intensificador, terminador) e/ou um ou mais sinais de tradução, sequência de « sinalização ou sequência líder para direcionamento à membrana ou secre- ção. Em um construto ou vetor, uma sequência de peptídeo de sinalização “25 pode ser fornecida pelo construto ou vetor ou por outra fonte. Por exemplo, os sinais transcricionais e/ou traducionais de uma imunoglobulina podem ser usados para direcionar a expressão.
Um promotor pode ser provido para expressão em uma célula hospedeira adequada. Promotores podem ser constitutivos ou induzíveis.
Por exemplo, um promoter pode ser ligado operacionalmente a um ácido nucleico codificador de uma imunoglobulina humanizada ou cadeia de imu- noglobulina, de tal modo que direcione a expressão do polipeptídeo codifica-
- 107/222 f do. Existe disponível uma variedade de promotores adequados para hospe- deiros procarióticos (por exemplo, promotores lac, tac, T3, T7 para E. col) e eucarióticos (por exemplo, álcool desidrogenase de levedura (ADH1), SV40, CMV). Aqueles versados no estado da técnica serão capazes de selecionar o promotor apropriado para expressão de um anticorpo anti-CD52 ou parte deste da invenção.
Adicionalmente, os vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendem tipicamente um marcador selecionável para seleção de célu- las hospedeiras carregando o vetor e, no caso de vetor replicável, uma ori- gem de replicação. Genes codificando produtos que conferem resistência antibiótica ou a fármacos são marcadores selecionáveis comuns e podem ser usados em células procarióticas (por exemplo, gene de B-lactamase (re- sistência à ampicilina), gene Tet (resistência à tetraciclina) e eucarióticas (por exemplo, genes de resistência à neomicina (G418 ou geneticina), gpt "15 (ácido micofenólico), ampícilina ou à higromicina)). Genes marcadores de dihidrofolato redutase permitem seleção com metotrexato em uma variedade de hospedeiros. Genes que codificam o produto gênico de marcadores auxo- tróficos do hospedeiro (por exemplo, LEU2, URA3, HIS3) são frequentemen- te usados como marcadores selecionáveis em levedura. O uso de vetores virais (por exemplo, baculovírus) ou de fago e de vetores capazes de se in- tegrar no genoma da célula hospedeira, tal como vetores retrovirais são também contemplados.
A invenção refere-se, portanto, a moléculas isoladas de ácido nucleico que codificam uma imunoglobulina humanizada, cadeia leve huma- —nizada, cadeia pesada humanizada, imunoglobulina de camundongo, cadeia leve de imunoglobulina de camundongo, cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, imunoglobulina quimérica, cadeia leve quimérica ou cadeia pesada quimérica desta invenção. A invenção refere-se também a moléculas isoladas de ácido nucleico que codificam uma parte de ligação a antígeno das imunoglobulinas e de suas cadeias. Sequências polipeptídicas codifica- das pelos ácidos nucleicos desta invenção estão descritas abaixo e nos E- xemplos a seguir.
P 108/222 : Em algumas concretizações, um ácido nucleico e um vetor desta invenção codificam uma cadeia pesada (ou sua parte de ligação a antígeno) ou uma cadeia leve (ou sua parte de ligação a antígeno) desta invenção. Uma célula hospedeira, contendo o ácido nucleico codificador da cadeia pe- sadaeo ácido nucleico codificador da cadeia leve, pode ser usada para produzir um anticorpo, compreendendo a cadeia pesada e a leve (ou parte de ligação a antígeno do anticorpo). O ácido nucleico codificador da cadeia pesada e o ácido nucleico codificador da cadeia leve podem ser colocados em vetores de expressão separados. Podem ser colocados também em um único vetor de expressão sob o mesmo controle ou diferente de expressão. Consultar, por exemplo, Cabilly Patente U.S. 6 331 415; Fang Patente U.S. 7 í 662 623.
. Método para produzir imunoglobulinas com especificidade por CDS2 humana Outro aspecto da invenção refere-se a um método para produzir *15 um anticorpo anticCD52 humana desta invenção. O anticorpo desta invenção pode ser produzido, por exemplo, pela expressão de um ou mais ácidos nu- cleicos recombinantes, codificadores do anticorpo, em uma célula hospedei- ra adequada. A célula hospedeira pode ser produzida usando qualquer mé- todo adequado. Por exemplo, os construtos de expressão (por exemplo, o únicoou mais vetores, por exemplo, vetor de expressão em célula de mamí- fero) descritos neste relatório podem ser introduzidos em uma célula hospe- deira adequada, e a célula resultante pode ser mantida (por exemplo, em cultura, em um animal, em uma planta) em condições adequadas para ex- pressão do(s) construto(s) ou (vetor(es). Células hospedeiras adequadas — podem ser procarióticas, incluindo células bacterianas tais como de E. coli (por exemplo, cepa DH5a'Y (Invitrogen, Carlsbad, CA)), B. subtilis e/ou de outras bactérias adequadas, eucarióticas, tais como células de fungo ou de levedura (por exemplo, Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces ce- revisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), ou outras célu- las eucarióticas inferiores, e células de eucariotos superiores tais como a- quelas de insetos (por exemplo, células S2 Drosophila Schnieder, células Sf9 de insetos (WO 94/26087 (O'Connor), células TN5B1-4 (HIGH 5) de in-
. 109/222 : setos (Invitrogen), mamíferos (por exemplo, células COS, tais como COS-1 (Nº de acesso na ATCC: CRL-1650) e COS-7 (Nº de acesso na ATCC: CRL- 1651), CHO (por exemplo, Nº de acesso na ATCC: CRL-9096), CHO DG44 (Urlaub, G. and Chasin, LA., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220 —(1980)), 203 (Nº de acesso na ATCC: CRL-1573), HeLa (Nº de acesso na ATCC: CCL-2), CV1 (Nº de acesso na ATCC: CCL-70), WOP (Dailey, L., et al., J. Virol., 54:739-749 (1985)), 3T3, 293T (Pear, W. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)), células NSO, células SP2/0, células HuT 78 e as semelhantes)), ou de plantas (por exemplo, tabaco, lemna (len- tilhade água) e algas). (Consultar, por exemplo, Ausubel, F.M. et a/., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)). Em algumas concretizações, a célula hos- . pedeira não é parte de um organismo multicelular (por exemplo, planta ou animal), por exemplo, é uma célula hospedeira isolada ou é parte de uma “15 cultura celular.
A presente invenção refere-se também a células compreenden- do um ácido nucleico, por exemplo, vetor, da invenção (por exemplo, vetor de expressão). Por exemplo, um ácido nucleico (ou seja, um ou mais ácidos nucleicos) codificadores das cadeias pesadas e leves de uma imunoglobuli- na humanizada, as cadeias pesadas e leves de imunoglobulina de camun- dongo ou as cadeias pesadas e leves de uma imunoglobulina quimérica, a referida imunoglobulina tendo especificidade de ligação por CD52 humana, ou um construto (ou seja, um ou mais construtos, por exemplo, um ou mais vetores) compreendendo tais ácidos nucleicos, podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada por um método apropriado à célula hospe- deira selecionada (por exemplo, transformação, transfecção, eletroporação, infecção), com o(s) ácido nucleico(s) sendo ou tornando-se operacionalmen- te ligado(s) a um ou mais elementos de controle de expressão (por exemplo, em vetor, em construto criado por processos na célula, integrado no genoma da célula hospedeira). As células hospedeiras podem ser mantidas em con- dições adequadas para expressão (por exemplo, na presença de indutor, meio adequado suplementado com sais, fatores de crescimento, antibiótico,
- 110/222 f suplementos nutricionais apropriados, etc.), pelo qual o(s) polipeptídeo(s) codificado(s) é (são) produzido(s). Se desejado, a proteína codificada (por exemplo, imunoglobulina humanizada, imunoglobulina de camundongo, imu- noglobulina quimérica) pode ser isolada, por exemplo, das células hospedei- ras, meio de cultura ou leite.
Este processo abrange a expressão em célula hospedeira (por exemplo, célula de glândula mamária) de um animal ou planta transgênica (por exemplo, tabaco) (consultar, por exemplo, WO 92/03918). Proteínas de fusão podem ser produzidas, em que uma parte da imunoglobulina (por exemplo, imunoglobulina humanizada; cadeia de imu- noglobulina) é ligada a um grupo não imunoglobulina (ou seja, um grupo que não ocorre em imunoglobulinas como encontradas na natureza) em localiza- . ção N-terminal, localização C-terminal ou interna à proteína de fusão.
Por exemplo, algumas concretizações podem ser produzidas pela inserção de "15 um ácido nucleico codificador de sequência(s) de imunoglobulina em vetor de expressão adequado, tal como vetor pET (por exemplo, pET-15b, Nova- gen), vetor de fago (por exemplo, pPCANTAB 5 E, Pharmacia) ou outro vetor (por exemplo, pRIT2T Protein A fusion vector, Pharmacia). O construto resul- tante pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para ex- pressão.
Quando da expressão, algumas proteínas de fusão podem ser iso- ladas ou purificadas de lisado celular por meio de uma matriz de afinidade adequada (consultar, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., Eds., Vol. 2, Supl. 26, pág. 16.4.1-16.7.8 (1991)). A invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende —ácido(s) nucleico(s) recombinante(s) codificador (es) de uma imunoglobulina aqui provida (por exemplo, imunoglobulina humanizada, cadeia leve humani- zada ou cadeia pesada humanizada, imunoglobulina de camundongo, ca- deia leve de camundongo ou cadeia pesada de camundongo, imunoglobuli- na quimérica, cadeia pesada quimérica ou cadeia leve quimérica da inven- ção). A invenção refere-se também a uma célula hospedeira que compreen- de ácido(s) nucleico(s) recombinante(s) codificador (es) de parte de ligação a antígeno da imunoglobulina ou de suas cadeias.
Em algumas concretiza-
' 111/222 fi ções, a célula hospedeira compreende um vetor recombinante (por exemplo, vetor de expressão, vetor de expressão em célula de mamífero) da invenção como citados neste relatório descritivo. A invenção refere-se também a um método para preparar uma imunoglobulina ou cadeia polipeptídica de imunoglobulina desta invenção. Em uma concretização, o método compreende manter uma célula hospedei- ra da invenção como aqui descrita (por exemplo, célula hospedeira que con- tenha um ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam a imunoglobulina ou cadeia polipeptídica (por exemplo, cadeia leve e cadeia pesada, apenas cadeia leve ou apenas cadeia pesada da invenção)) em condições apropria- das para expressão da imunoglobulina ou cadeia polipeptídica. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser cultivada em substrato ou suspensão. Em " algumas concretizações, o método compreende ainda a etapa de purificar ou isolar a imunoglobulina ou cadeia polipeptídica.
A invenção refere-se ainda a um método para preparar imuno- globulinas através de exibição em fago. Por exemplo, uma biblioteca de exi- bição em fago de anticorpos virgens para antígeno de CD52 pode ser inves- tigada. Alternativamente, pode ser usado um método para preparar imuno- globulinas através de seleção guiada (Publicação de Pedido de Patente U.S.
2006-0251658 A1.). Uma biblioteca personalizada construída em torno de, por exemplo, região CDR3 de cadeia pesada fixa (e/ou cadeia leve) de um anticorpo anti-CD52 conhecido pode ser criada. As regiões CDR1 e CDR2 das cadeias pesadas e leves podem ser derivadas de um repertório virgem (Osburn et al., Methods, 36:61-68 (2005)). Em uma concretização, ScFvs —anti-CD52 podem ser gerados a partir de bibliotecas de ScFv de anticorpos virgens, as quais são usadas para obter anticorpos quiméricos humanos de camundongo com as propriedades desejadas de ligação. Estas bibliotecas podem ser rastreadas para anticorpos com as propriedades desejadas de ligação. Bibliotecas de ScFv de fagos podem ser utilizadas. Por exemplo, —ScFvs que reconheçam CD52 humana podem ser isolados a partir de sele- ção guiada em bibliotecas de scFv, após uma série de ciclos de seleção de CD52 humana recombinante, essencialmente como descrito em Vaughan et
" 112/222 7 al. (1996). Resumidamente, após incubação com a biblioteca, o antígeno imobilizado, pré-acoplado com esferas paramagnéticas e fago ligado, pode ser recuperado por separação magnética, enquanto fago não ligado é remo- vido por lavagem. O fago ligado pode ser resgatado em seguida como des- critopor Vaughan et a/. (1996), e o processo de seleção é repetido.
Em uma concretização específica, é construída uma biblioteca, formada pelo domínio variável completo da cadeia pesada de um anticorpo anti-CD52 fundido em formato de cadeia única a um repertório de regiões variáveis humanas virgens de cadeia leve. Depois da seleção, o conjunto de regiões variáveis humanas de cadeia leve que complementa a região variá- vel de cadeia pesada de camundongo é identificado. Uma biblioteca é então construída, formada pelo repertório de regiões variáveis humanas de cadeia . leve, selecionadas acima, fundidas em formato de cadeia única a uma região variável quimérica de cadeia pesada constituída de regiões CDR1 and CDR2 “15 humanas virgens e uma região CDR3 fixa proveniente do domínio variável de cadeia pesada de anticorpo anti-CD52 de camundongo. Depois da sele- ção de ligantes à CD52, os melhores clones para ligação são selecionados. Cinco das 6 regiões CDR podem ser de origem humana, enquanto a CDR-3, da região variável da cadeia pesada, pode ser idêntica à CDR3 original do domínio variável de cadeia pesada de camundongo.
As seleções podem ser realizadas usando CD52 acoplado à a- mina de DYNABEADS M-270 (Dynal) de acordo com as recomendações do fabricante. Alternativamente, seleções usando CD52 biotinilada podem ser preparadas usando o reagente hexanoato de succinimidil-6-(biotinamido) específico da amina primária específica, seguindo as instruções do fabrican- te (EZ link NHS LC Biotin, Pierce).
Os resultados de seleções podem ser testados em preparados periplásmicos em rastreamentos de alto rendimento, com base em ensaios de competição dos scFvs presentes no preparado periplásmico para compe- tiçãopelaligaçãoàCD52.
Amostras capazes de competir nos rastreamentos de alto rendi- mento podem ser submetidas ao sequenciamento de DNA como descrito em
' 113/222 E Vaughan et al. (1996) e Osburn et al. (1996). Os clones seriam então ex- pressos e purificados em forma de scFvs ou IgGs e avaliados quanto à sua capacidade para ligar-se à CD52, neutralizar CD52 ou uma combinação des- te, por exemplo, usando ensaios tais como ensaio de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e ensaio de citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Preparados de scFV purificado podem ser então preparados como descrito no Exemplo 3 de WO 01/66754. As concentrações proteicas de preparados de scFV purificado foram determina- das usando o método de BCA (Pierce). Abordagens semelhantes podem ser usadas para rastrear um parceiro ideal (a cadeia oposta) de uma cadeia pe- sada ou leve (ou Vx ou Vi) fixa de imunoglobulina.
Em uma concretização específica, a invenção está direcionada a : um método para produzir um hibridoma que secreta um anticorpo monoclo- nal com especificidade de ligação por CD52 humana, compreendendo admi- “15 nistrar linfócitos de camundongo transgênico para CD52 a um camundongo não transgênico tendo a mesma linhagem (por exemplo, CD1) como o ca- mundongo transgênico para CD52 humana, produzindo com isso um ca- mundongo não transgênico imunizado.
Esplenócitos do camundongo não transgênico imunizado são colocados em contato com células imortalizadas, produzindo, pelo mesmo, células fundidas, e as células fundidas são manti- das em condições nas quais hibridomas que secretam um anticorpo mono- clonal tendo especificidade de ligação por CD52 humana são produzidos, resultando, dessa forma, em hibridoma secretor de anticorpo monoclonal com especificidade de ligação por CD52 humana. —Imunoglobulinas contendo grupo de toxina ou toxina A invenção refere-se também a imunoglobulinas que compreen- dem um grupo de toxina ou toxina.
Grupos adequados de toxina compreen- dem uma toxina (por exemplo, toxina ativa de superfície, citotoxina). O grupo de toxina ou toxina pode ser ligado ou conjugado à imunoglobulina usando — qualquer método adequado.
Por exemplo, o grupo de toxina ou toxina pode ser ligado covalentemente à imunoglobulina diretamente ou através de um ligante adequado.
Ligantes adequados podem incluir ligantes não cliváveis
. 114/222 a ou cliváveis, por exemplo, ligantes cliváveis por pH ou ligantes que compre- endem um sítio de clivagem para uma enzima celular (por exemplo, esteara- ses celulares, proteases celulares, tais como catepsina B). É possível usar estes ligantes que podem ser clivados para preparar uma imunoglobulina capazde liberar um grupo de toxina ou toxina depois que a imunoglobulina é internalizada
Uma variedade de métodos para ligar ou conjugar um grupo de toxina ou toxina a uma imunoglobulina pode ser usada.
O método específico selecionado dependerá do grupo de toxina ou toxina e da imunoglobulina a serem ligados ou conjugados.
Se desejado, ligantes que contêm grupos fun- cionais terminais podem ser usados para ligar a imunoglobulina e o grupo de toxina ou toxina.
Em geral, a conjugação é obtida reagindo o grupo de toxina BR ou toxina que contém um grupo funcional reativo (ou é modificado para con- ter um grupo funcional reativo) com um ligante ou diretamente com uma i- “15 —munoglobulina.
Ligações covalentes são formadas, reagindo um grupo de toxina ou toxina que contém (ou é modificado para conter) um grupo químico ou funcional capaz de, em condições apropriadas, reagir com um segundo grupo químico, formando com isso uma ligação covalente.
Se desejado, um grupo químico reativo adequado pode ser adicionado a uma imunoglobulina ou ligante usando qualquer método adequado (Consultar, por exemplo, Hermanson, G.
T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).). Muitas combinações de grupos químicos reativos adequados são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, um grupo amina pode reagir com um grupo eletrofílico, como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, iodo), N-hidroxisuccinimidil éster (NHS) e os semelhantes.
Tióis podem reagir com maleimida, dissulfeto de iodoacetila, acrilolia e piridila, tiol de áci- do 5-tiol-2-nitrobenzoico (TNB-tiol) e os semelhantes.
Um grupo funcional aldeido pode ser acoplado a moléculas contendo amina ou hidrazida, e um grupo azida pode reagir com grupo de fósforo trivalente para formar ligações do tipo fosforamidato ou fosforimida.
Métodos adequados para introduzir grupos ativadores em moléculas são conhecidos no estado da técnica (con- sultar, por exemplo, Hermanson, G.
T., Bioconjugate Techniques, Academic
: 115/222 : Press: San Diego, CA (1996)).
Grupos de toxina ou toxinas adequadas incluem, por exemplo, maitansinoide (por exemplo, maitansinol, por exemplo, DM1, DM4), taxano, caliqueamicina, duocarmicina ou seus derivados. O maitansinoide pode ser, por exemplo, maitansinol ou análogo de maitansinol. Exemplos de análogos de maitansinol incluem aqueles com anel aromático modificado (por exem- plo, C-19-des-cloro, C-20-des-metoxi, C-20-aciloxi) e aqueles tendo modifi- cações em outras posições (por exemplo, C-9-CH, C-14-alcoximetila, C-14- hidroximetila ou aceloximetila, C-15-hidroxi/aciloxi, C-15-metoxi, C-18-N- desmetila, 4,5-desoxi). Maitansinol e análogos de maitansinol estão descri- tos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nºº 5 208 020 e 6 333 410, cujos conte- údos são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Maitan- - sinol pode ser acoplado a anticorpos e fragmentos de anticorpos usando, por exemplo, N-succinimidil 3-(2-piridilditio)proprionato (também conhecido como “15 — N-succinimidil 4-(2-piridiltio)pentanoato (ou SPP)), 4-succinimidil-oxicarbonil- a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato (SDPB), 2 iminotiolan ou anidrido S-acetilsuccínico. O taxano pode ser, por exemplo, taxol, taxotero ou novo taxano (consultar, por exemplo, WO 01/38318). À caliqueamicina pode ser, por exemplo, bromo-complexo de caliqueamiíicina (por exemplo, bromo alfa, beta ou gama-complexo), iodo-complexo de cali- queamicina (por exemplo, bromo alfa, beta ou gama-complexo) ou seus aná- logos e miméticos. Bromo-complexos de caliqueamicina incluem 11-BR, 12- BR, 13-BR, 14-BR, J1-BR, J2-BR e K1I-BR. lodo-complexos de caliqueamicina incluem 11-1, 121, 13-1, J1-1, J2, L1-1 e KI-BR. Caliqueamicina e seus mutan- tes, análogos e miméticos estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nº 4 970 198, 5 264 586, 5 550 246, 5712 374 e 5714 586, cujos conteú- dos são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Análogos de duocarmicina (por exemplo, KW-2189, DC88, DC89 CBI-TMI e seus deri- vados) estão descritos, por exemplo, na Patente U.S. Nº 5 070 092, Patente US Nº5187 186, Patente US. Nº 5 641 780, Patente U.S. Nº 5 641 780, Patente U.S. Nº 4 923 990 e Patente U.S. Nº. 5 101 038, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência neste pedido de patente.
' Exemplos de outras toxinas incluem, entre outras, antimetabóli- tos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5- fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, meclorotamina, tioepa clorambucil, CC-1065 (consultar as Patentes US Nº 5 475 092, 5 585 499,5846 545), melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofos- famida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cisdi- clorodiamina de platina (1!) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mi- tramicina, mitomicina, puromicina, antramicina (AMC)), duocarmicina e seus análogos ou derivados e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina, vin- blastina, taxol, auristatinas (por exemplo, auristatina E) e maitansinoides e - seus análogos ou homólogos).
A toxina pode ser também uma toxina ativa de superfície, tal "15 como uma toxina que seja geradora de radicais livres (por exemplo, grupos de toxina contendo selênio) ou grupo contendo radionuclídeo. Grupos ade- quados contendo radionuclídeos incluem, por exemplo, grupos que contêm iodo radioativo (1311 or 125), ítrio (90Y), lutécio (177Lu), actínio (225Ac), praseodímio, astatina (211At), rênio (186Re), bismuto (212Bi ou 213Bi), in- dio (111In), tecnécio (99mTc), fósforo (32P), ródio (188Rh), enxofre (358), carbono (14C), trítio (3H), cromo (51Cr), cloro (36CI), cobalto (57Co ou 58Co), ferro (59Fe), selênio (75Se) ou gálio (67Ga). A toxina pode ser uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo de fon- tes bacterianas, por exemplo, toxina diftérica, exotoxina de pseudomonas (PE)e proteínas de plantas, por exemplo, a cadeia A de ricina (RTA), as pro- teinas inativadoras de ribossomo (RIPs) gelonina, proteína antiviral de po- keweed, saporina e dodecandrona são contempladas para uso como toxi- nas.
Compostos antisense de ácidos nucleicos, criados para ligar, desabilitar, promover degradação ou impedir a produção do MRNA respon- sável por gerar uma determinada proteína alvo podem ser usados também como toxina. Compostos antisense incluem RNA ou DNA antisense, de fita simples ou dupla, oligonucleotídeos ou seus análogos que possam hibridi- zar-se especificamente com espécies individuais de mMRNA e impedir a transcrição e/ou o processamento de RNA da espécie de mRNA e/ou a tra- dução do polipeptídeo codificado e com isso reduzir a quantidade do respec- tivo polipeptídeo codificado.
Ching, et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U.S.A. 86: 10006-10010 (1989); Broder, et al., Ann.
Int.
Med. 113: 604-618 (1990); Lo- reau, et al., FEBS Letters 274: 53-56 (1990). Agentes terapêuticos antisense úteis incluem, por exemplo: Veglin TM (VasGene) e OGX-011 (Oncogenix). Toxinas podem ser também agentes fotoativos.
Agentes fotoati- vos adequados incluem materiais à base de porfirina, tais como porfímero sódico, as porfirinas verdes, clorina E6, o próprio derivado da hematoporfiri- na, ftalocianinas, etiopurpurinas, texafrina e os semelhantes. . A toxina pode ser anticorpo ou fragmento de anticorpo que se |i- ga a um alvo intracelular.
Tais anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser direcionados a compartimentos ou alvos subcelulares definidos.
Por e- xemplo, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ligar-se a um alvo intracelular selecionado a partir de erbB2, EGFR, BCR-ABL, p21Ras, Cas- pase3, Caspase7, Bcl-2, p53, Ciclina E, ATF-V/CREB, HPV16 E7, HP1, co- lagenases Tipo IV, catepsina L, bem como a outros descritos em Konter- mann,RE, Methods, 34:163-170 (2004), aqui incorporado, em sua totalida- de, por referência neste pedido de patente.
Métodos e composições terapêuticas Os anticorpos desta invenção são úteis em imunossupressão e imunoablação.
Os anticorpos têm como células que expressam CD52 (por exemplo, células T e B) e reduzem (ou "depletam" neste relatório descritivo) a sua população em um indivíduo em necessidade deste.
A depleção de lin- fócitos pode ser útil para tratar uma variedade de doenças e condições tais como inflamação, doenças autoimunes e câncer (por exemplo, neoplasia maligna de linfócitos (de célula B ou célula T)). Consultar, por exemplo, Reiff, A, Hematology, 10(2):79-93 (2005). Exemplos de doenças e condições que podem ser tratadas com os anticorpos ou parte de ligação a antígenos desta invenção incluem, entre outras, esclerose múltipla, lúpus, artrite reumatoide,
: 118/222 doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD), doença intestinal inflamatória, vasculite, doença de Behcet, granulomatose de Wegener, síndrome de Sjo- gren, uveite, psoríase, esclerodermia, polimiosite, diabetes tipo | (etiologia autoimune), citopenias autoimunes (por exemplo, neutropenia autoimune, PRCA refratária dependente de transfusão) leucemia e linfoma tais como linfoma não Hodgkin com doença em massa e leucemia linfocítica crônica de células B.
Por conseguinte, aspectos desta invenção são métodos para depleção de linfócitos e para tratar inflamação, doença autoimune ou câncer, ” 10 administrando uma quantidade efetiva de um anticorpo da invenção a um indivíduo em necessidade deste (por exemplo, paciente humano portador de doença autoimune, câncer hematológico ou paciente a receber um trans- : plante). O anticorpo pode ser administrado também profilaticamente para prevenir o aparecimento de inflamação ou recidiva de doença autoimune ou “15 câncer.
Por exemplo, o anticorpo desta invenção pode ser administrado co- mo parte de um regime de condicionamento para preparar um paciente para transplante (por exemplo, transplante de células-tronco, infusão de células T alogênicas ou transplante de órgão sólido). Alguns anticorpos anti-CD52 desta invenção são direcionados de preferência contra populações de células CD52+. Uma possível explica- (O ção é que epítopos aos quais estes anticorpos se ligam incluem um ou mais grupos carboidratos na proteina CD52, e estes grupos carboidratos podem ser mais prevalentes em CD52 expressa em um tipo de células em compa- ração a outro.
Por exemplo, foi constatado que o anticorpo 7F11, 5F7, 3G7 e 11C11 depletam células T em maior medida do que células B.
Dessa forma, as versões humanizadas e quiméricas destes anticorpos podem ser usadas para tratar neoplasia maligna de células T com efeitos colaterais imunossu- pressores mais brandos.
Por serem direcionados contra células que expressam CD52, os anticorpos desta invenção podem ser usados também para depletar tipos de células CD52+, além de células T e células B.
Por exemplo, estudos de- monstraram que leucócitos vasculares (VLC) e monócitos-células mieloides
. 119/222
- Tie2+ expressando altos níveis de CD52, promovem angiogênese tumoral e contribuem para resistência do tumor à terapia anti-VEGF.
Pulaski et al., J.
Translational Med. 7:49 (2009). Anticorpos anti-CD52 desta invenção po- dem, portanto, ser usados para inibir angiogênese tumoral ao se direciona- rem contra VLC e monócitos Tie2+. Para tanto, os anticorpos anti-CD52 po- dem ser administrados por via sistêmica ou localmente em um sítio de neo- vascularização, tal como sítio tumoral.
A terapia com anticorpo anti-CD52 pode ser usada associada ao tratamento padrão de câncer, tal como quimio- terapia, cirurgia ou radiação, ou a outra terapia direcionada tal como terapia com anticorpo anti-VEGF.
A terapia com anticorpo anti-CD52 pode ser usa- da para tratar, por exemplo, câncer de mama, câncer de pulmão, glioma, câncer colo-retal e quaisquer outras indicações de anticorpos anti-VEGF.
À : terapia com anticorpo anti-CD52 pode ser usada também em outras condi- ções de neovascularização, incluindo condições neovasculares não oncoló-
-15 gicas.
Anticorpos desta invenção podem ser administrados a um indiví- duo (por exemplo, humano) isoladamente ou associado com outro agente (por exemplo, imunossupressor) em terapia combinada.
O anticorpo pode ser administrado antes, junto ou subsequentemente à administração do a- gente adicional.
Em algumas concretizações, o agente adicional é, por e- xemplo, um composto anti-inflamatório, tal como sulfassalazina, outro com- posto anti-inflamatório não esteroidal ou composto anti-inflamatório esteroi- dal.
Em algumas concretizações, o agente adicional é outro anticorpo de depleção linfocitária, tal como outro anticorpo anti-CD52, anticorpo anti- CD20, anticorpo anti-BAFF, anticorpo anti-BAFF-R e os semelhantes.
Em algumas concretizações, o agente adicional é, por exemplo, uma citocina (por exemplo, IL-7), anticorpo anti-receptor de citocina ou receptor solúvel, que afete, manipule e/ou aumente o processo de reconstituição ocorrido a- pós a depleção linfocitária mediada por um anticorpo anti-CD52 (consultar, por exemplo, Sportes et al., "Cytokine Therapies"”. Ann.
N.Y.
Acad.
Sci. 1182:28-38 (2009)). Em outra concretização, um mimético peptídico sintético pode ser administrado associado com uma imunoglobulina da presente in-
p 120/222 Fi venção.
Estudos demonstraram que a depleção linfocitária por alentuzu- mabe é mediada por neutrófilos e células NK (Hu et al, Immunology 128:260-270 (2009). Por conseguinte, em uma concretização de terapia combinada, um agente que estimula neutrófilos e células NK pode ser admi- nistrado a um paciente, antes, durante ou depois de terapia com anticorpo anti-CD52, para aumentar a terapia com o anticorpo. Estimular neutrófilos e/ou células NK inclui, entre outros, (1) aumentar suas taxas de divisão, (2) aumentar a sua expressão na superfície celular dos receptores Fc corres- pondentes ao isotipo do anticorpo anti-CD52 (por exemplo, FeyRllla e FeyRI- Ilb, FeyRII, FeyRI e FcaRI), (3) mobilizar e aumentar o número de células circulantes, (4) recrutar as células para sítios direcionados (por exemplo, - sítios de tumores, inflamação ou dano tecidual), (5) e aumentar a sua ativi- dade citotóxica. Exemplos de agentes que estimulam neutrófilos e/ou células 715 NK incluem, por exemplo, fator estimulador de colônia de granulócitos- monócitos (GM-CSF) (por exemplo, LEUKINEO ou sargramostima e mol- gramostima); fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF) (por e- xemplo, NEUPOGENPG ou filgrastima, filgrastima peguilada e lenograstima); interferon gama (por exemplo, ACTIMMUNEO); antagonistas do receptor 4 de quimiocina CXC (CXCR4) (por exemplo, MOZOBILT“ ou plerixafor); e agonistas do receptor 2 de quimiocina CXC (CXCR2). A contagem de neu- trófilos do paciente pode ser monitorada periodicamente para assegurar a eficácia ideal do tratamento. A contagem de neutrófilos do paciente pode ser medida também antes de ser iniciado o tratamento com o anticorpo anti- CD52.A quantidade do estimulador pode ser ajustada com base na conta- gem de neutrófilos do paciente. Uma dose mais alta do estimulador pode ser usada se o paciente apresentar contagem de neutrófilo inferior à normal.
Durante períodos de neutropenia, a qual pode ser causada por tratamento com o anticorpo anti-CD52, uma dose mais alta do estimulador de neutrófilos pode ser também administrada para maximizar o efeito do anticorpo anti- CDS52.
Dado que a eficácia da terapia com o anticorpo anti-CD52 é me-
J 121/222
| lIhorada pela estimulação de neutrófilos e/ou células NK, esta concretização de terapia combinada possibilita o uso de menos anticorpo em um paciente, ao mesmo tempo em que mantida eficácia terapêutica semelhante.
O uso de menos anticorpo anti-CD52, mantendo-se a eficácia do tratamento, pode ajudar a reduzir os efeitos colaterais do anticorpo anti-CD52, o que inclui resposta imune no paciente contra o anticorpo administrado, bem como o desenvolvimento de autoimunidade secundária (autoimunidade que surge durante ou depois de tratamento com anticorpo anti-CD52). Esta concretiza- ção de terapia combinada é útil também em cenário de oncologia, por exem-
plo, quando o paciente apresenta neutropenia.
Em outra concretização de terapia combinada, é possível usar um estimulador de células T reguladoras para aumentar a terapia com o an- . ticorpo anti-CD52. Os dados obtidos mostram que anticorpos anti-CD52 de- pletam células T reguladoras CD4* CD25*FoxP3* em medida muito menor, 115 em comparação a outras células T CD4+. Células T reguladoras (também conhecidas como células "Treg" ou células T supressoras) são células que são capazes de inibir a proliferação e/ou a função de outras células linfoides por meio de mecanismos dependentes de contato ou independentes de con- tato (por exemplo, produção de citocinas). Vários tipos de células T regula- doras foram descritos, incluindo células T yô, células T natural killer (NKT), células T CD8*, células T CD4* e células T CD4' CD8' duplo negativas.
Con- sultar, por exemplo, Bach et al., !mmunol. 3:189-98 (2003). Células T regula- doras CD4*CD25*FoxP3* têm sido citadas como células T reguladoras "na- turais"; estas células expressam CD4, CD25 e o fator de transcrição da For- Kkhead FoxP3 (Forkhead box p3). Portanto, nesta concretização de terapia combinada, é possível administrar um agente que estimula células T regula- doras CD4*CD25'*FoxP3* antes, durante ou após a terapia com o anticorpo anti-CD52, para afetar a composição do sistema imune após a depleção lin- focitária.
O agente pode, por exemplo, ativar estas células T, estabilizar e/ou expandira população das células, mobilizar e aumentar a circulação das células e/ou recrutar as células para sítios direcionados.
Exemplos de tais agentes são rapamicina, TGF- B ativo ou latente (por exemplo, TGF-B1,
: 122/222 TGF-B2, TGF-B3, TGF-B4 e TGF-B5), I1L-10, IL-4, IFN-a, vitamina D3, dexa- metasona e micofenolato de mofetila (consultar, por exemplo, Barrat et al., J. Exp. Med. 195:603-616 (2002); Gregori et al., J Immunol. 167: 1945-1953 (2001); Battaglia et al., Blood 105: 4743-4748 (2005); Battaglia et al., J. Im- munol.177:8338-8347 (2006)).
Nesta invenção, quantidade eficaz de anticorpo anti-CD52 para tratar uma doença é uma quantidade que ajuda o indivíduo tratado a atingir um ou mais desfechos clínicos desejados. Por exemplo, para lúpus (cujas manifestações incluem lúpus eritematoso sistêmico, nefrite lúpica, lúpus eri- tematoso cutâneo, lúpus no SNC, manifestações cardiovasculares, manifes- tações pulmonares, manifestações hepáticas, manifestações hematológicas, manifestações gastrointestinais, manifestações musculoesqueléticas, lúpus . eritematoso neonatal, lúpus eritematoso sistêmico da infância, lúpus eritema- toso induzido por fármaco, síndrome anti-fosfolipídica e síndromes de defici- ênciade complemento resultando em manifestações lúpicas; consultar, por exemplo, Robert G. Lahita, Editor, Systemic Lupus Erythematosus, 4th Ed., Elsevier Academic Press, 2004), os desfechos clínicos podem ser medidos monitorando-se um sistema orgânico afetado (por exemplo, hematúria e/ou proteinúria em nefrite lúpica) e/ou usando um índice de atividade da doença que oferece um escore composto de gravidade da doença em vários siste- mas orgânicos (por exemplo, BILAG, SLAM, SLEDAI, ECLAM). Consultar, por exemplo, Mand! et al., "Monitoring patients with systemic lupus erythe- matosus" em Systemic Lupus Erythematosus, 4º edição, pág. 619-631, R.G. Lahita, Editor, Elsevier Academic Press, (2004).
Em outro exemplo de doença autoimune, esclerose múltipla (in- cluindo esclerose múltipla recidivante-remitente, progressiva secundária, progressiva primária e progressiva recidivante ((Lublin et al., Neurology 46 (4), 90711 (1996)), é diagnosticada, por exemplo, pelo histórico de sinto- mas e exame neurológico com o auxílio de testes tais como imagem por res- —sonância magnética (MRI), punções espinhais, testes de potencial evocado e análise laboratorial de amostras de sangue. Na MS, o tratamento tem co- mo meta reduzir a frequência e a gravidade de recidivas, prevenir incapaci-
' 123/222 : dade decorrente da progressão da doença e promover reparo tecidual (Compston e Coles, 2008). Por conseguinte, uma quantidade de anticorpo anti-CD52 que ajude a ser alcançado um desfecho clínico compatível com esta meta é uma quantidade eficaz de anticorpo para o tratamento.
A fim de minimizar o aparecimento de imunogenicidade, o uso de um anticorpo humanizado é preferido para tratar um paciente humano nos métodos e composições terapêuticas desta invenção. Em casos em que a administração repetida não é necessária, pode ser apropriado também administrar um anticorpo quimérico humano de camundongo desta invenção aum paciente humano. Os anticorpos da invenção podem ser usados para tratar um in- divíduo que tenha sido previamente tratado com Campath-1HG8 e que tenha V desenvolvido anticorpos neutralizantes contra Campath-1H8 (por exemplo, indivíduo refratário a Campath-1H8). Por exemplo, poderia ser tratado um indivíduo com doença autoimune (por exemplo, esclerose múltipla, lúpus, vasculite) e/ou câncer (por exemplo, leucemia (por exemplo, leucemia linfo- cítica crônica), linfoma (por exemplo, linfoma não Hodgkin)) que tenha sido tratado previamente com Campath-1HO (por exemplo, com um ou mais ci- clos de tratamento com Campath-1HO) e que tenha desenvolvido anticorpos neutralizantes contra Campath-1H8 que reduzem a eficácia de tratamento posterior com Campath-1H8. Foi demonstrado que os anticorpos humaniza- dos desta invenção (por exemplo, 2C3, 12G6 e 9D9 humanizados) são ca- pazes de ligar-se à CD52 humana apesar de a presença de anticorpos neu- tralizantes contra alentuzumabe. Em outra concretização, poderia ser tratado um indivíduo que tenha se tornado refratário ao tratamento com um determi- nado anticorpo humanizado aqui descrito com um dos outros anticorpos hu- manizados descritos neste pedido de patente. O anticorpo desta invenção pode ser administrado em dose uni- tária única ou doses múltiplas a qualquer momento considerado apropriado por um profissional de saúde. A dose pode ser determinada por métodos conhecidos no estado da técnica e pode depender, por exemplo, da idade, sensibilidade, tolerância e bem-estar geral individual. Uma variedade de vias
" 124/222
: de administração pode ser usada, incluindo, mas não necessariamente, en- tre outras, parenteral (por exemplo, injeção intravenosa, intra-arterial, intra- muscular, intratecal, intraperitoneal, subcutânea), oral (por exemplo, na die- ta), local, tópica, inalação (por exemplo, inalação intrabrônquica, intranasal ou oral, gotas intranasais) ou retal, dependendo da doença ou condição a ser tratada.
A administração parenteral pode ser um modo preferido de ad-
ministração.
Em uma concretização, os anticorpos da invenção são adminis- trados a um paciente usando o mesmo regime de dose que Campath-1HO (por exemplo, o regime de administração de Campath-1HO para leucemia linfocítica crônica). Em outra concretização, um anticorpo da invenção é ad- ministrado a um paciente com doença autoimune (por exemplo, esclerose : múltipta (MS)) em um regime compreendendo administração de um primeiro ciclo do anticorpo, seguido por pelo menos outro ciclo do anticorpo, em que cadaciclode tratamento compreende 1 - 5 doses que são aplicadas em dias consecutivos e em que cada ciclo de tratamento é separado do ciclo seguin- te por pelo menos 1 - 24 meses (por exemplo, 12 meses). Por exemplo, em uma concretização, um paciente com esclerose múltipla é tratado com um primeiro ciclo do anticorpo, compreendendo 5 doses diárias do anticorpo, e é seguido por pelo menos outro ciclo de tratamento com o anticorpo, em que o tratamento ocorre depois de 12 meses do primeiro ciclo, compreendendo 3 doses do anticorpo aplicadas em dias consecutivos.
Em outra concretização, um paciente com MS é novamente tratado somente se for observada evi- dência de atividade renovada de MS (consultar, por exemplo, WO —2008/031626; cujos ensinamentos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente). Em algumas concretizações, pode ser necessário administrar ciclos mais frequentes de tratamento (por exem- plo, a cada quatro meses, a cada seis meses) se pacientes com formas mais avançadas de MS ou formas mais progressivas de outras doenças autoimu- nes (tais como vasculite; consultar, por exemplo, Walsh et al., Ann Rheum Dis 67:1322-1327 (2008)) apresentarem recidiva precocemente após o seu último ciclo de tratamento.
Evidência de atividade renovada de MS pode ser
' determinada com base no juízo profissional do médico responsável, usando quaisquer meios que possa ter à sua disposição. Existe atualmente uma va- riedade de técnicas disponíveis para diagnosticar atividade renovada de MS, incluindo, entre outras, recursos clínicos (recidiva ou progressão de deficiên- cianeurológica) ou por imagem por ressonância magnética (MRI) do cérebro ou da medula espinhal. Como bem entendido por especialistas médicos, a atividade da doença detectada por MRI pode ser indicada pela ocorrência de novas lesões cerebrais ou espinhais em imagens ponderadas em T1 (inten- sificadas ou não) ou em T2 ou pelo aumento do volume destas lesões. Mé- todos diagnósticos para MS estão em constante evolução, portanto, prevê- se que possam existir métodos adicionais no futuro que detectarão atividade renovada de MS (por exemplo, razão de transferência de magnetização ou . espectroscopia por MR). O método diagnóstico específico usado para detec- tar atividade renovada de MS não representa uma limitação à invenção rei- vindicada. Em certas concretizações, exames repetidos de MRI são realiza- dos em intervalos fixos depois de um ciclo de tratamento, visando determinar se repetir o tratamento é necessário para qualquer determinado paciente, e o momento ideal para este paciente repetir o tratamento. Em geral, é dese- jável que o tratamento seja repetido antes que a doença apresente nova- mente manifestações clínicas.
A formulação variará de acordo com a via de administração se- lecionada (por exemplo, solução, emulsão). Uma composição apropriada, compreendendo o anticorpo a ser administrado, pode ser preparada em um veículo ou um carreador fisiologicamente aceitável. A composição pode compreender doses múltiplas ou ser uma composição de dose unitária úni- ca. Para soluções ou emulsões, carreadores adequados incluem, por exem- plo, soluções aquosas ou alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, in- cluindo solução salina e meios tamponados. Veículos parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer com lactato ou óleos fixos. Veículos intravenosos podem incluir vários aditivos, conservantes ou repositores hídricos, de nutri- entes ou de eletrólitos (Consultar, em geral, Remington's Pharmaceutical
' 126/222 ] Sciences, 17th Edition, Mack Publishing Co., PA, 1985). Para inalação, o composto pode ser solubilizado e carregado em dispensador adequado para administração (por exemplo, atomizador, nebulizador ou dispensador de ae- rossol pressurizado).
Métodos diagnósticos e composições As imunoglobulinas da presente invenção são úteis também em uma variedade de processos com aplicações em pesquisa e diagnóstico. Por exemplo, podem ser usadas para detectar, isolar e/ou purificar CD52 huma- na ou suas variantes (por exemplo, por purificação por afinidade ou outros métodos adequados como citometria de fluxo, por exemplo, para células tais como linfócitos, em suspensão) e para estudar a estrutura (por exemplo, conformação) e a função de CD52 humana. Para aplicações in vitro, em que a imunogenicidade do anticorpo não representa preocupação, os anticorpos de camundongo e os quiméricos desta invenção serão úteis, além de anti- 115 corpos humanizados. As imunoglobulinas da presente invenção podem ser usadas em aplicações diagnósticas (por exemplo, in vitro, ex vivo). Por exemplo, as i- munoglobulinas humanizadas da presente invenção podem ser usadas para detectar e/ou medir o nível de CD52 humana em uma amostra (por exemplo, em células que expressam CD52 humana em tecidos ou líquidos corporais, tais como exsudato inflamatório, sangue, soro, líquido intestinal, tecidos por- tando CD52 humana). Uma amostra (por exemplo, tecido e/ou líquido corpo- ral) pode ser obtida de um indivíduo e uma imunoglobulina aqui descrita po- de ser usada em método imunológico adequado para detectar e/ou medir a expressão de CD52 humana, incluindo métodos como citometria de fluxo (por exemplo, para células em suspensão como linfócitos), ensaios imuno- enzimáticos (ELISA), incluindo ensaios de quimioluminescência, radioimu- noensaio e imunohistologia.
Em uma concretização, é provido um método para detectar CD52 humana em uma amostra, compreendendo por uma amostra em con- tacto com uma imunoglobulina da presente invenção em condições adequa- das para ligação específica da imunoglobulina à CD52 humana e para detec-
: 127/222 Í tar complexos anticorpo-CD52 formados. Em uma aplicação do método, as imunoglobulinas aqui descritas podem ser usadas para analisar tecidos nor- mais contra inflamados (por exemplo, de ser humano) quanto à reatividade e/ou a expressão de CD52 humana (por exemplo, por imunohistologia) para detectar associações entre, por exemplo, doença intestinal inflamatória (IBD), doenças autoimunes (como esclerose múltipla e lúpus), câncer (como linfoma não Hodgkin e leucemia linfocítica crônica) ou outras condições e expressão aumentada de CD52 humana (por exemplo, em tecidos afetados). Por conseguinte, as imunoglobulinas da presente invenção permitem méto- | 10 dos imunológicos de avaliação da presença de CD52 humana em tecidos + normais e inflamados, por meio dos quais é possível avaliar a presença de doença, o progresso de doença e/ou a eficácia de terapia com anti-CD52 J humana no tratamento da doença, por exemplo, doença inflamatória. Adicionalmente, as imunoglobulinas podem ser usadas para e- xaminar tecidos depois de tratamento para depleção com anticorpo terapêu- tico anti-CD52 para medir o grau de eficácia da depleção, bem como se a expressão de CD52 foi regulada ou não negativamente (Rawstrom et al., Br.
J. Heam., 107:148-153 (1999)).
A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados possuem o mesmo significado como habitualmente en- tendido por aquele versado no estado da técnica ao qual esta invenção per- tence. Métodos exemplares e materiais são descritos abaixo, embora méto- dos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos neste pedido de patente possam ser também usados na prática ou testes da presente in- venção. Todas as publicações e outras referências citadas neste relatório descritivo são aqui incorporadas, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, inclu- indo definições, prevalecerá. Embora alguns documentos estejam citados neste pedido de patente, esta citação não constitui admissão de que qual- quer um destes documentos faça parte do conhecimento geral comum no estado da técnica. Por todo este pedido de patente e as reivindicações, a palavra "compreender" ou variações como "compreende" ou "compreenden-
: 128/222 í do" será entendida de modo a implicar a inclusão de um integrante ou grupo de integrantes declarado, mas não a exclusão de qualquer outro integrante ou grupo de integrantes.
Os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos somente, e não se destinam a ser uma limitação.
Exemplificação Exemplo 1: Geração de anticorpos anti-CD52 humana de camundongo Os anticorpos anti-CD52 humana de camundongo nos exemplos de trabalho seguintes foram gerados imunizando camundongos da linhagem CD1 com esplenócitos de camundongos transgênicos para CD52 humana de origem CD1 (Figura 1A), em que a exibição de CD52 humana sobre a superfície de células B e T de camundongos dos camundongos transgênicos foi verificada por citometria de fluxo.
Os camundongos transgênicos e os camundongos imunizados têm a mesma origem (CD1), dessa forma, os es- ' plenócitos dos camundongos transgênicos apresentaram CD52 humana na superfície celular como antígeno único, não próprio em formato nativo, e os camundongos não transgênicos imunizados criaram uma resposta de anti- corpo primariamente contra a CD52 humana.
Para coleta de esplenócitos dos camundongos transgênicos pa- ra CD52 humana, os camundongos foram sacrificados, os baços foram reco- lhidose suspensões de células únicas foram preparadas por passagens a- través de seringa.
Camundongos CD1 foram então imunizados com as célu- las de baço positivas para CD52 humana, 5 x 10º em 100 uL por camundon- go, com ou sem Adjuvante Completo de Freund por injeção intraperitoneal (i.p.). Foram aplicadas aos camundongos duas doses de reforço a cada du- as semanas, depois da primeira imunização com células de baço positivas para CD52 humana de camundongos transgênicos, 5 x 10º em 100 uL por camundongo com Adjuvante Incompleto de Freund, ip.
Secreções oculares foram coletadas, 100-200 ul por camun- dongo, em tubos separadores de soro com tampa amarela, de todos os ca- —mundongos antes da imunização, para determinar o nível basal de reativida- de, e uma semana depois de cada rodada de imunização para determinar resposta imune específica anti-CD52 humana.
Camundongos que produzi-
' 129/222 ' ram níveis altos de reatividade anti-CD52 humana, medidos por FACS, em células CHO K1 construídas para expressarem proteína CD52 humana, mas não em células CHO K1 parentais, foram sacrificados, o sangue foi recolhido e os baços coletados em condições estéreis para gerar hibridomas. Os hibri- domas foram gerados usando uma linhagem celular de mieloma não secre- tora de camundongo, SP2/0 Ag114, ou células de mieloma NS1, como parcei- ras de fusão, 3-4 dias após a imunização. As células fundidas foram coloca- das em meio completo de crescimento, contendo hipoxantina, aminopterina e timidina para gerar hibridomas. Depois de rastrear muitos sobrenadantes de hibridoma, foram selecionados vários clones que produziam anticorpos específicos anti-CD52 humana, os quais foram ainda subclonados para deri- var uma população clonal. Clones de hibridomas que produziam anticorpos anti-CD52 humana aumentados em escala para desenvolvimento adicional. Exemplo 2: Análise por PCR de cadeias pesadas e leves de anticorpos anti- CD52 humana de camundongo Alguns anticorpos monocionais anti-CD52 humana de camun- dongo (Figura 1B) foram identificados, testando sobrenadantes de hibrido- mas quanto à presença de reatividade anti-CD52 humana. Clones foram se- lecionados individualmente, e as sequências variáveis de cadeias pesadas e levesde camundongos foram identificadas com clonagem e sequenciamento por PCR. As sequências das cadeias leves são mostradas na Figura 2, em comparação a YTH 34.5 HL (ou seja, Ig kappa de Campath (rato) e anticorpo reagente CF1D12 (CF1D12 Kappa) (Invitrogen Life Science Technologies)). Da mesma forma, as sequências das cadeias pesadas são mostradas na Figura3, em comparação a YTH 34.5 HL e anticorpo reagente CF1D12.
No total, foram identificadas 10 sequências variáveis únicas de cadeia leve e 11 sequências variáveis de cadeia pesada. Se forem incluídos Campath6 e CF1D12, 7 regiões únicas de CDR-1 (Tabela 1), 8 regiões úni- cas de CDR-2 (Tabela 2) e 7 regiões únicas de CDR-3 (Tabela 3) foram i- dentificadas dentro das cadeias leves de anticorpos anti-CD52 humana.
J 130/222 Tabela 1: Sequências de CDR-1 de cadeia leve BB KSSOSLLESDGRTYLN(SEQIDNO:28) — | o KSSOSLLDSDGRTIYLN(SEQIDNO:30) -— =| [E o |KSSOSLLYSNGKTYLN(SEQIDNO3) — | Tabela 2: Sequências de CDR-2 de cadeia leve
B ; Do TVSNLGS(SEQIDNO 38) = | ' Tabela 3: Sequências de CDR-3 de cadeia leve Bus N WOGTHFPWT(SEQIDNO:43) == | Br a VOGTRFHT(SEQIDNO:45) —— = ==ú"Jj| Se forem incluídos Campath& e CF1ID12, no total, 8 regiões CDR-1 únicas (Tabela 4), 10 regiões CDR-2 únicas (Tabela 5) e 8 regiões CDR-3 únicas (Tabela 6) foram identificadas dentro das cadeias pesadas de anticorpos anti-CD52 humana. Tabela 4: Sequências de CDR-1 de cadeia pesada Bs TGFTFSDAWMD(SEQIDNO:50) | Bs TGLTFSDAWMD(SEQIDNO: 52) | E TN GFPFESNYWMN(SEQIDNO:53) |
. 131/222 Tabela 5: Sequências de CDR-2 de cadeia pesada
B [D | EIRNKAKNHVKYYAESVKG(SEQIDNO:60) | ns FIRNKANGYTTEYNASVKG (SEQIDNO:65) — | Tabela 6: Sequências de CDR-3 de cadeia pesada IB "| TTLDS(SEQIDNO68 = ns TGIDY(SEQIDNOTO) “|
E A associação de regiões CDR específicas de cadeia leve e pe- sada em 13 diferentes anticorpos anti-CD52 humana é retrada na Tabela 7. Tabela7: Classificação de anticorpos anti-CD52 humana com base na com- posição de CDR Nome do clone [Momedosoa UU ERR Foot con | cora | cor | erro nv vg BB | 68 | B | Be | [6863.25.35 o e e ng ema aee vç cc | bp | B | Ea apa uv BC | E | B | EMA e e e Lema see un vç E | Er a Bv | pb Ge [1266.1572 ns E Ee | ec | seat E e rea uv RF LaB1O AA nn GG Rn | Gg | Os clones 8G3.25.3.5, 4G7.F3, 9D9.A2, 11C11.C5, 3G7.E9, 5F7.1.1.4, 12G6.15.1.2, 23E6.2.2.1, 203.3.8.1, 7F11.1.9.7 e 4B10.1.2.4 são denominados a seguir 8G3, 4G7, 9D9, 11011, 3G7, 5F7, 12G6, 23E6, 2C3,
' 132/222 í 7F11 e 4B10, respectivamente.
Tabela 7.1: SEQ ID NOs das CDRs dos anticorpos anti-CD52 humana Nome do clone jeriDIZ sos e BB 43 86 e 2 36 | 43 | [467 | So | 6 | 6 | 2 [| 3 pag Papas e BB 2 a gg em vv e 29 | 36 | ag Ber sa e eg ag ag 23EB8 | 54 | 6a [| 7 [| 3 | 36 | 45 | Bs A ao da 48 | Exemplo 3: Clonagem de genes de região variável de IgG de camundongo, . provenientes de células de hibridoma de camundongo, para gerar anticorpo IlgG1 quimérico de camundongo/humano - Células de hibridomas em proliferação ativa e secretando anti- corpos foram usadas para isolar RNA, com reagente Trizol (Gibco/BRL) e seguindo o protocolo sugerido do fabricante. RNA foi quantificado mediando OD com Nanodrop, e a integridade do RNA foi determinada por sua corrida emgelou usando um bioanalisador. RNA total foi transcrito de modo reverse para cDNA, e as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves foram ampli- ficadas por reação em cadeia da polimerase (PCR). O cDNA foi gerado u- sando iniciador (primer) BD Sprint PowerScript Reverse Transcriptase (Clon- tech) e Oligo(dT), a 0,5 ua/ul (Invitrogen Cat. nº Y01212), e iniciadores re- verse (situados na região constante das cadeias pesadas e leves), listados numericamente abaixo, a 10 uM, seguindo o protocolo do fabricante. Especi- ficamente, os iniciadores de número 3 (SEQ ID NO: 77), 11 (SEQ ID NO: 85), 19 (SEQ ID NO: 93), 20 (SEQ ID NO: 94) e 21 (SEQ ID NO: 95) foram empregados. A amplificação por PCR das regiões variáveis de cadeia pesa- dae de leve foirealizada usando CDNA gerado como descrito acima. 1 ul de cDNA foi misturado com o iniciador forward e iniciadores reverse, a 10 UM, cada para cadeias pesadas e leves, e misturas com super mistura para PCR (Invitrogen) na presença de 2 ul. de MgCl; a 25 mM. O programa de
. 133/222 PCR foi conduzido nas seguintes etapas: 1) 95 ºC por 2 minutos; 2) 95 ºC por 30 segundos; 3) 56 ºC por 30 segundos; 4) 68 ºC por 45 segundos; 5) Etapas 2 a 4 repetidas 25 vezes; 6) 68 ºC por 10 minutos e manter a 16 ºC.
O produto da PCR foi analisado em gel 2% quanto à presença de sequência de região variável produzida com tamanho de aproximadamente 300 - 400 bp, e as bandas apropriadas foram clonadas em Kit de clonagem pCR2.1- TOPO TA (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante, e a sequência clonada e confirmada, usando iniciadores M13. Iniciadores usados para transcrição reversa e para amplificação por PCR de sequências de cadeia leveede cadeia pesada são providos.
Iniciadores de cadeia leve 1) Lead-ML kappa = 5' ATGGGCWTCAARATGRARWCWCAT 3' (Iníicia- dor forward em sequência líder) (SEQ ID NO: 75) 2) FRI-ML kappa = 5 GAYATTGTGMTRACMCARKMTCAA 3' (Iniciador forward no framework 1) (SEQ ID NO: 76) 3) ML kappa const = 5' ACTGGATGGTGGGAAGATGGA 3(Iniciador re- verse em região constante) (SEQ ID NO: 77) 4) VKMK=5 GAYATTGTIGMTSACMCARWCTMCA 3' (Iniciador forward no framework 1) (SEQ ID NO: 78) 5) MKC-Const=5 GGATACAGTTGGTGCAGCATC 3' (Iniciador reverse in em região constante) (SEQ ID NO: 79) Iniciadores de cadeia pesada 6) MH-SP-ALTI = 5º ATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTT 3' (Iniciador forward em sequência líder) (SEQ ID NO: 80) 7) MH-SP-ALT2 = 5 ATGRAATGSASCTGGGTYWIYCTCT 3' (Iniciador forward em sequência líder) (SEQ ID NO: 81) 8) MH-FRI1=5 SAGGTSMARCTGCAGSAGTCT 3' (Iniciador fonvard no framework 1) (SEQ ID NO: 82) 9) MH-FR1I-1=58 SAGGTGMAGCTCSWRSARYCSGGG 3' (Iniciador for- ward no framework 1) (SEQ ID NO: 83) 10) MH-J2 = 5' TGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC 3' (Iniciador reverse em região J) (SEQ ID NO: 84)
. 134/222 Á 11) MH-gamma-const = 6' AYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC 3' (Iniciador reverse em região constante) (SEQ ID NO: 85) 12) VH MH1 = 5º SARGINMAGCTGSAGSAGTC 3' (Iniciador fonvard no framework 1) (SEQ ID NO: 86) 13) VHMH2=58 SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG 3' (Iniciador forward no framework 1) (SEQ ID NO: 87) 14) VH MH3=5' CAGGTTACTCTGAAAGWGTSTG 3' (Iniciador forward no framework 1) (SEQ ID NO: 88) 15) VH MH4 = 5' GAGGTCCARCTGCAACARTC 3'(Iniciador fonward no framework 1) (SEQ ID NO: 89) 16) VH MH5 = 8º CAGGTCCAACTVCAGCARCC 3'(Iniciador fonvard no framework 1) (SEQ ID NO: 90) 17) VH MH6 = 5º GAGGTGAASSTGGTGGAATC 3'(Iniciador fonvard no f framework 1) (SEQ ID NO: 91) 18) VH MH7 = 5 GATGTGAACTTGGAAGTGTC 3'(Iniciador fonvard no framework 1) (SEQ ID NO: 92) 19) IgG1=58 ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC 3' (Iniciador rever- se em região constante de CH1 de IgG1 de camundongo) (SEQ ID NO: 93) 20) IgG2A=58 CTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA 3' (Iniciador reverse em região constante de CH1 de IgG2A de camundongo) (SEQ ID NO: 94) 21) IgG2B=5 AGGGGCCAGTGGATAGAGTGATGG 3' (Iniciador reverse em região constante de CH1 de IgG2B de camundongo) (SEQ ID NO: 95) Iniciadores degenerados levaram a algum grau de degeneração na extremidade 5' da região framework 1 da cadeia pesada e da cadeia leve.
A sequência de consenso de DNA de vários clones independentes de região variável de cadeia pesada e de clones de região variável de cadeia leve foi usada para derivar a sequência de aminoácidos.
Anticorpos anti-CD52 quiméricos funcionais foram produzidos unindo as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve ao DNA codi- ficador da região constante de cadeia pesada de IgG1 humana (sequência
' 135/222
Í idêntica à encontrada em Campath-1Hº) e de kappa de cadeia leve humana (sequência idêntica à encontrada em Campath-1Hº), respectivamente.
Para gerar o vetor pCEP4 (Invitrogen) de cadeia leve, codificador de cadeia leve do anticorpo contra CD52, a sequência variável da cadeia leve foi amplifica- daporPCR «e construída por clonagem independente de ligase no vetor de cadeia leve pCEP4 LIC para obter a sequência de sinalização kappa huma- na na extremidade 5' e a região constante de cadeia leve na extremidade 3'. Do mesmo modo, para gerar o vetor pCEP4 de cadeia pesada, a sequência da região variável da cadeia pesada foi construída por clonagem indepen- dente de ligase no vetor de cadeia pesada pCEP4 LIC para obter a sequên- cia de sinalização de cadeia kappa humana na extremidade 5' e a região constante da cadeia pesada, abrangendo as regiões CH1, hinge, CH2 e CH3 na extremidade 3". As sequências de aminoácido das regiões constan- tes da cadeia pesada e da leve são idênticas às das regiões constantes pre-
sentes no anticorpo Campath1H.
Resumidamente, o vetor pCEP4 LIC foi digerido com BfuA1(New England Biolabs-NEB) em tampão apropriado, seguindo as recomendações do fabricante, e depois de concluída a digestão, o vetor foi purificado com o kit de purificação PureLink PCR (Invitrogen). O plasmídeo linearizado foi tra- tadoem seguida com T4 DNA polimerase (New England Biolabs) para gerar extremidades de fita simples e foi usado para clonar o fragmento da região variável.
O vetor específico para cadeia pesada pCEP4 LIC foi usado para clonar a região variável de cadeia pesada, e o vetor específico para cadeia leve pCEP4 LIC foi usado para clonar a região variável de cadeia leve.
Foi gerado inserto de região variável por PCR, usando o plasmídeo pCR2.1- TOPO contendo a região variável de cadeia pesada ou o plasmídeo pCR2.1- TOPO contendo a região variável de cadeia leve, como modelos, e iniciado- res que contém a sequência específica da região variável e saliências (ove- rhangs) do vetor.
VENT DNA polimerase (New England Biolabs) foi usada para amplificação por PCR do inserto.
O inserto amplificado por PCR foi pu- rificado em gel e tratado com T4 DNA polimerase para gerar extremidades de fita única.
Vetores preparados para fragmentos dos respectivos insertos
' 136/222
É de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve foram combinados e incubados à temperatura ambiente por 10 minutos e usados para transfor-
mar células TOPO10 (Invitrogen), e colônias resistentes à ampicilina foram selecionadas e a sequência verificada.
Os clones pCEP4 de cadeia pesada epCEP4 de cadeia leve que continham as sequências corretas de cadeia pesada e de cadeia inseridas in frame (uma seguida à outra) foram amplifi- cados e usados para produção de proteína.
O construto de cadeia pesada foi cotransfectado com o construto correspondente de cadeia leve, em pro- porção de 1:1, em células HEK293 (Invitrogen) usando o lipídio catiônico
Lipofectamine""M 2000 (Invitrogen). O meio condicionado foi colhido três dias depois da transfecção, e o anticorpo quimérico foi purificado usando croma- tografia com proteína A.
Para este método de cromatografia, o meio foi adi- cionado à proteína A e lavado com 50 volumes da coluna de PBS.
O anti-
corpo quimérico foi eluído com 5 volumes da coluna de ácido cítrico 12,5 m, pH3,0.O pH do anticorpo eluído foi neutralizado por adição de HEPES 0,5 M.
O tampão foi trocado para PBS usando coluna de filtração em gel PD-10. Exemplo 4: Análise das especificidades por epítopo de anticorpos quiméri-
cos monoclionais anti-CD52 humana
As especificidades por epítopo dos clones foram determinadas avaliando a capacidade dos anticorpos quiméricos se ligarem a um painel de linhagens celulares, construídas para expressar mutantes de CD52 humana (Figura 4), gerados por mutagênese de varredura de alanina.
A substituição no anticorpo dos 10 primeiros aminoácidos da região extracelular de 12 ami- noácidos de CD52 foi conduzida em cDNA de CD52 humana no vetor de expressão pcDNA3.1 (Invitrogen), usando o Kkit de mutagênese sítio- direcionada STRATAGENE QUIKCHANGE Il XL.
O vetor pcDNA3.1, codifi-
cador de sequência do tipo selvagem ou mutante de CD52, teve a sequência verificada e transfectada em células CHO, usando Lipofectamine"”, e por seleção em meio contendo G418, para gerar linhagens de células CHO que expressavam CD52 do tipo selvagem ou mutante em alanina.
A ligação es- pecífica a epítopo de anticorpos quiméricos anti-CD52 humana foi determi-
nada pela ligação dos anticorpos contra as células do tipo selvagem e mu-
' 137/222 Í tantes que expressavam CD52, medida por FACS.
A análise por FACS foi realizada, detectando a ligação de anticorpos quiméricos anti-CD52 usando anticorpo secundário PE-conjugado de cabra anti-humano (Jackson Immu- noResearch Labs). As Figuras 5A-5C mostram a Intensidade Média de Fluo- rescência (MFI) de anticorpos monoclonais anti-CD52 contra linhagem de células do tipo selvagem e mutantes expressando CD52. Apesar de CD52 ser uma proteína GPI ancorada muito curta de 12 aminoácidos, os resulta- dos de FACS definem claramente que existem três conjuntos de anticorpos: (1) Grupo de ligação a N-terminal (como 4B10); (2) Grupo de ligação no meio (como 4G7,9D9 e 11C1) e (3) Grupo de ligação em C-terminal (como 23E6, 12G6 e 2C3). As especificidades por epítopo dos anticorpos monocio- nais anti-CD52 humana (identificados pelos nomes abreviados no final do Exemplo 2) estão resumidas na Tabela 8. Tabela 8: Características de 11 anticorpos monocionais de camundongo an- t-CD52 humana [elone o isotivo — | Especificidade por epítopo 9-10-11-12 3-4-5-6-7 3-4-5-6-7 11C11.C5 3G7.E9 12G6.15.1.2 23E6.2.2.1 2C3.3.8.1 7-8-9-10 7F11.1.9.7 1-2-3-4-5 1-2-3-4-5 CD52 é um antígeno extremamente pequeno, mas possui um grupo glicano N-ligado hidrofílico relativamente grande, bem como uma ân- cora GPI hidrofóbica.
Para explorar a possibilidade de que açúcares poderi- am constituir todo ou parte de um epítopo reconhecido pelos anticorpos anti- CD52,amostras de CD52, purificadas por afinidade, provenientes de células CHO-CD52 foram tratadas com a endoglicosidase, PNGase-F, para retirar completamente açúcares N-ligados do antígeno.
Amostras tratadas e de controle, com tratamento simulado, foram então resolvidas por SDS-PAGE,
J 138/222 ' analisadas por manchas em membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Invitrogen), sondadas com 3 ug/mL finais de cada um dos anticorpos qui- méricos monocionais anti-CD52 indicados, e foram subsequentemente, de- senvolvidas de acordo com procedimentos padrão para Westem Blotting, usando detecção intensificada por quimioluminescência. Blots (manchas) com Campath-1H& (C1H) e com apenas o anticorpo secundário (2º Alone) foram corridos como controles positivo e negativo, respectivamente, e son- dados com cada um dos anticorpos monocionais (Figura 5D). Os resultados revelaram diferentes preferências de ligação entre os anticorpos por CD52 — glicosilada contra desglicosilada. Esta caracterização permite a classificação por categoria dos onze anticorpos em quatro tipos de grupos de ligação:
1. — Anticorpos exibindo ligação sem preferência aparente para CD52 glico- silada contra desglicosilada (4G7, 9D9)
2. Anticorpos exibindo ligação específica por CD52 glicosilada (7F11, 4B10)
3. — Anticorpos exibindo ligação específica para CD52 desglicosilada (8G3)
4. Anticorpos exibindo ligação preferencial por CD52 desglicosilada sobre glicosilada CD52 (12G6, 5F7, 23E6, 2C3, 11011, 3G7) Exemplo 5: Atividade CDC de anticorpos quiméricos anti-CD52 Um ensaio de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) foi realizado como descrito abaixo. Resumidamente, células CHO K1, cons- truídas para expressar proteina CD52 (CHO-CDS52), foram usadas como cé- lulas-alvo e marcadas com Na2?"CrO, (New England Nuclear, Boston, MA) a 37 ºC por 1 a 2 horas. As células foram lavadas, ressuspensas com meio X- Vivo e misturadas com anticorpos anti-CD52 humana para concentração final de 2,2 ug/ml. Complemento humano (Sigma) foi adicionado às cavida- des experimentais para concentração final de 10%. Depois de 1 a 5 horas de incubação, 25 ul. de sobrenadante livre de células foram coletados de cada cavidade e contados em Contador de Cintilação MICROBETA TRILUX (Wal- lac, Gaithersburg, MD). A quantidade de *Cr liberada espontaneamente foi obtida incubando as células-alvo apenas em meio. A liberação espontânea de células-alvo era tipicamente inferior a 20%. A quantidade total de Cr
] incorporada foi determinada adicionando Triton X-100 1% em água destila- da, e o percentual de lise foi calculado como segue: [(contagem por minuto de amostra (c.p.m.) - c.p.m. espontânea) / ( c.p.m. total - c.p.m. espontânea)] X 100.
Doze diferentes anticorpos quiméricos anti-CD52 (região variável de camundongo e região constante de I9G1 humana) foram testados no en- saio de CDC com complemento humano em células CHO-CD52. O anticorpo humanizado Campath-1HO foi usado como controle positivo. Um controle negativo foi Campath-1HO nulo (mutante de não ligação mínima celular de Campath-1H& — duas mutações pontuais em região CDR2 de cadeia pesa- . da- alça H2 (K52bD e K53D; Gillland LK et al., Joumal of Immunology, 162:3663-3671 (1999)). Os resultados indicam que os anticorpos quiméricos : são capazes de mediar morte por CDC em células expressando CD52. Al- guns dos anticorpos quiméricos mediaram morte robusta equivalente ou me- -15 lhordo que CampathO (Figura 6). Exemplo 6: Atividade de ADCC de anticorpos quiméricos anti-CD52 Um ensaio de citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC) foi realizado como descrito abaixo. Resumidamente, células CHO K1, cons- truídas para expressar proteína CD52 (CHO-CD52), foram usadas como cé- lulas-alvo e marcadas com Naz”'CrO, (New England Nuclear, Boston, MA) a 37 ºC por 1 a 2 horas. As células foram lavadas, ressuspensas com meio X- Vivo e misturadas com anticorpos anti-CD52 humana para concentração final de 1,1 ug/ml.. PBMC humanas foram usadas como células efetoras e . adicionadas em proporção de 1:100 célula-alvo para efetora. Depois de in- —cubação de 6 horas durante a noite, 25 pl. de sobrenadante livre de células foram coletados de cada cavidade e contados em Contador de Cintilação MICROBETA TRILUX (Wallac, Gaithersburg, MD). A quantidade de S!Cr libe- rada espontaneamente foi obtida incubando as células-alvo apenas em mei- o. A liberação espontânea de células-alvo era tipicamente inferior a 20%. À — quantidade total de ºCr incorporada foi determinada adicionando Triton X- 100 1% em água destilada, e o percentual de lise foi calculado como segue: [(contagem em amostra por minuto (c.p.m.) - c.p.m. espontânea) / ( c.p.m.
. 140/222 á total - c.p.m. espontânea)] X 100.
Doze diferentes anticorpos quiméricos anti-CD52 (região variável de camundongo e região constante de I9gG1 humana) foram testados no en- saio de ADCC usando PBMC humanas como células efetoras. O anticorpo humanizado Campath-1HO& foi usado como controle positivo. Um controle negativo foi Campath-1H8 nulo (mutante de não ligação mínima celular de Campath-1H& — duas mutações pontuais em região CDR2 de cadeia pesa- da- alça H2 (K52bD e K53D; Gilliland, 1999, supra)). Os resultados indicam que os anticorpos quiméricos são capazes de mediar morte por ADCC em células expressando CD52. Alguns dos anticorpos quiméricos mediaram morte robusta equivalente ou melhor do que Campath€O (Figura 7). Exemplo 7: Avaliação da ligação de anticorpos quiméricos anti-CD52 contra população de linfócitos definidos Os anticorpos seguintes conjugados a fluoro cromo foram usa- dos para análise por citometria de fluxo: anti-CD3-FITC, anti-CD27-PE, anti- CDB62L-PE Cy5, anti-CD56- PE Cy7, ant-CD16-APC Cy7 (BD Biociência, San Diego, CA), anti-CD45RA-ECD (Beckman Coulter), anti-CD19-Pacific Blue, anti-CD4-APC Cy5.5 e anti-CD8 pacific orange (Invitrogen, CA). Todos os anticorpos quiméricos de camundongo anti-CD52 humana, bem como o humanizado Campath-1H& foram conjugados a Alexa flúor 647 (BD Phar- mingen). Células mononucleares humanas sadias de sangue periférico fo- ram obtidas de Buffy Coats (tubos revestidos) crioconservados ou de células mononucleares separadas de sangue de doadores normais, obtidas de for- necedores comerciais (Bioreclamation, NY, EUA). Para enriquecimento de células mononucleares, sangue periférico humano foi diluído 1:1 com solu- ção salina com tampão fosfato (PBS) estéril, sendo cuidadosamente espa- lhado em camada sobre Ficoll-hypaque (GE Healthcare Bio-Sciences, Upp- sala, Suécia) e centrifugado por 30 minutos à temperatura ambiente. A ca- mada de interfase de células monocelulares foi coletada e lavada em PBS contendo soro bovino fetal 5% (tampão de FACS). Hemácias contaminantes (RBCs) foram lisadas com solução de lise de RBC (Sigma, St. Louis, MO, EUA). As células foram ressuspensas em tampão FACS frio, e os resíduos
: 141/222 Ai foram removidos usando filtro de 40 micra. Dez citometrias coloridas de fluxo foram realizadas para avaliar a capacidade de ligação de 9 anticorpos qui- méricos anti-CD52 humana (4B10, 7F11, 9D9, 5F7, 2C3, 4G7, 23E6, 8G3, 3G7), em comparação ao Campath-1H8.
Resumidamente, replicas de 1 x 10º PBMC em tampão FACS fo- ram incubadas com um coquetel de diluições pré-tituladas de anticorpos contra CD3, CD27, CD45RA, CD62L, CD56, CD19, CD8, CD4, CD16 junta- mente com um dos 9 anticorpos quiméricos anti-CD52 humana (4B10, 7F11, 9D9, 5F7, 2C3, 4G7, 23E6, 8G3, 3G7) por 30 minutos a 4 ºC. As células fo- ram lavadas e fixadas em PBS contendo paraformaldeído 1%. 100.000 e- ventos das células coradas foram adquiridos em BD LSR-II (BD Biosciences, San Jose, CA), e os dados foram analisados usando o sofiware FlowJo ver- são 7.2 (Tree Star, Inc, Oregan, EUA). Múltiplos subconjuntos com caracte- rísticas fenotípicas distintas foram definidos entre linfócitos B e T, e CD52 demonstrou ser expressa em todos os linfócitos humanos. Dez análises de citometria colorida de fluxo foram realizadas para identificar os subconjuntos de linfócitos, e para avaliar similaridades e as diferenças nas características de ligação de anticorpos anti-CD52 a CD52 de superfície celular em subcon- juntos definidos. Usando uma combinação de marcadores, 11 populações celulares fenotipicamente distintas correspondentes às linhagens de células B, T e NK foram primeiramente definidas a partir do gate (área delimitada) de linfócitos. A intensidade de coloração que corresponde à capacidade de anticorpos anti-CD52 detectarem expressão de CD52 foi então avaliada. Os histogramas (Figuras 8A-8C) mostram uma comparação do nível de detec- çãodeCD52 com cada anticorpo em populações de linfócitos individuais. Os dados mostram que os anticorpos exibem diferenças significativas em liga- ção a CD52. O nível de detecção com 4B10, 9D9, 7F11 e Campath-1H8 são comparáveis, embora 4B10 mostre constantemente o nível mais alto de de- tecção do que outros anticorpos, incluindo Campath-1HG, em quase todos os subconjuntos de células examinados. Por outro lado, o nível de detecção de CD52 com os anticorpos 3G7, 4G7, 8G3 e 23E6 é significativamente mais baixo. Os resultados indicam uma hierarquia dentro dos anticorpos com
- 142/222 respeito à sua capacidade para reconhecer CD52 em diferentes populações de células, sendo mais alta com 4B10 e a mais baixa com 3G7. Curiosamen- te, estas diferenças são menos óbvias em subconjuntos de células efetoras CD4 e mais ainda em células NK, nas quais CD52 parece ser expressa em níveisrelativamente mais baixos. As variações nas características de ligação indicam que as propriedades dos anticorpos quiméricos não só diferem sig- nificativamente de Campath-1HO, mas refletem também diferenças em pro- priedades entre os anticorpos.
Exemplo 8: Análise de anticorpos quiméricos anti-CD52 em camundongos transgênicos para CD52 humana (7F11, 8G3, 23E6, 12G6, 4B10 e 5F7) Camundongos transgênicos para CD52 humana foram adminis- trados com Campathº ou anticorpos quiméricos anti-CD52 (7F11, 8G3, 23E6, 12G6, 4B10 e 5F7) para avaliar o nível de depleção de linfócitos. Os camundongos foram injetados por via intraperitoneal com Campath€ ou os anticorpos quiméricos anti-CD52, em volume de 100 ul. e em dose de 1 mg/kg. Três dias mais tarde, os camundongos foram sacrificados, e sangue e baço foram coletados para determinar o nível de depleção de células B e T. Citometria de fluxo foi utilizada para avaliar os números absolutos de célu- las T helper, células T citotóxicas e células B totais, presentes no sangue periférico circulante ou no baço de camundongos transgênicos huCD52. Es- tas populações de linfócitos foram definidas por sua expressão em superfície dos seguintes antígenos proteicos: expressão de CD4 identifica a população de células T helper; expressão de CD8 identifica a população de células T citotóxicas e expressão de CD19 identifica todas as populações de células B maduras. Um nível significativo de depleção de células T e de B foi observa- do para os anticorpos 12G6 e 4B10, o qual foi comparável à depleção ob- servada com Campathº. O tratamento com Campathº, o anticorpo quimérico 12G6 ou com o anticorpo quimérico 4B10 reduziu significativamente células TeB no sangue e no baço de camundongos tratados neste nível de dose. Os anticorpos quiméricos 7F11 e 5F7 resultaram em níveis significativos de depleção de células T no sangue e no baço, mas foram menos eficazes em depletar células B nos dois compartimentos. O tratamento com o anticorpo
. 143/222 a 23E6 resultou em nível moderado de depleção nesta dose, enquanto pouca a nenhuma depleção foi observada com o anticorpo 8G3 de afinidade mais baixa.
As Figuras 9A-9C mostram o nível de células T CDA4, células T CD8ecélulasBCDI19 no sangue após 72 horas da administração dos anti- corpos quiméricos.
As Figuras 10A-10C mostram o nível de células T CDA, células T CD8 e células B CD19 no baço após 72 horas da administração.
Exemplo 9: Análise de anticorpos quiméricos anti-CD52 em camundongos transgênicos para CD52 humana (2C3, 3G7, 4B10, 9D9 e 11C11)
Camundongos transgênicos para CD52 humana foram adminis- trados com Campathº ou anticorpos quiméricos anti-CD52 (2C3, 3G7, 4B10, 9D9 e 11C11) para avaliar o nível de depleção de linfócitos.
Os camundon- gos foram injetados por via intravenosa com Campathº Ou os anticorpos quiméricos anti-CD52 em volume de 100 ul e em dose de 1 mg/kg.
Três diasmais tarde, os camundongos foram sacrificados, e sangue e baço foram coletados para determinar o nível de depleção de células B e T.
Citometria de fluxo foi utilizada para avaliar os números absolutos de células T helper, céulas T citotóxicas e células B totais, presentes no sangue periférico circu- lante ou no baço de camundongos transgênicos huCD52. Estas populações delinfócitosforam definidas pela sua expressão em superfície dos seguintes antígenos proteicos: expressão de CD4 identifica a população de células T helper; expressão de CD8 identifica a população de células T citotóxicas e expressão de CD19 identifica todas as populações de células B maduras.
Um nível significativo de depleção de células T e de B foi observado para vários anticorpos no sangue e no baço.
A atividade de depleção para 2C3 e 9D9 foi comparável à observada com Campathº com níveis significativos de depleção de células T CD4 e CD8 e células B CD19. O tratamento com 4B10 quimérico resultou também em diminuição significativa nos números de linfócitos no sangue de camundongos transgênicos.
Embora o tratamento como anticorpo quimérico 3G7 ou com 11C11 depletassem significativa- mente células T no sangue, o nível de células B presentes não foi significati- vamente afetado nesta dose.
; 144/222 2 As Figuras 11A-11C mostram o nível de células T CDA, células T CD8 e células B CD19 no sangue após 72 horas da administração dos anti- corpos quiméricos.
Exemplo 10: Análise da eficácia de anticorpos anti-CD52 (7F11, 4810 e 12G6)
Quarenta camundongos SCID (n = 8 por grupo) foram injetados com 1 x 10º células tumorais B104 em volume de 100 uL no flanco direito.
No Dia 11 após a injeção de células tumorais, o tratamento iniciou com Campathº ou os anticorpos quiméricos 7F11, 4B10 ou 12G6. Os anticorpos foram administrados uma vez por semana em dose de 10 mg/kg por injeção intraperitoneal durante todo o restante do experimento.
Todos os camun- dongos no grupo não tratado desenvolveram tumores com crescimento pro- gressivo, requerendo o sacrifício com mediana de sobrevida de 29 dias.
O É tratamento com Campathº resultou em aumento estatisticamente significati- voem sobrevida, quando comparado ao grupo não tratado (mediana de so- brevida (MS) de 50 dias e p <0,0001). O tratamento com os anticorpos qui- méricos anti-CD52 resultou também em aumento estatisticamente significati- vo em sobrevida, quando comparado a camundongos não tratados (p <0,0001 para 7F11 e 4B10 e p = 0,0020 para 12G6). Com base em taxas de sobrevida, a atividade do anticorpo 7F11 e do 4B10 parece ser maior do que a de CampathO (63% de sobrevida para 7F11 e 75% de sobrevida para 4B10, em comparação a 50% de sobrevida para Campath8). A Figura 12 mostra o percentual de sobrevida dos camundongos após o tratamento.
Exemplo 11: Análise da eficácia de anticorpos anti-CD52 (2C3, 8G3 e 23E6) Quarenta camundongos SCID (n = 8 por grupo) foram injetados com 1 x 10º células tumorais B104 em volume de 100 ul no flanco direito.
No Dia 11 após a injeção de células tumorais, o tratamento iniciou com Campathº ou os anticorpos quiméricos 2C3, 8G3 ou 23E6. Os anticorpos foram administrados uma vez por semana em dose de 10 mg/kg por injeção intraperitoneal durante todo o restante do experimento.
Todos os camun- dongos no grupo não tratado desenvolveram tumores com crescimento pro- gressivo, requerendo o sacrifício com mediana de sobrevida de 26 dias.
O
. 145/222 É tratamento com Campathº, e o anticorpo 23E6 e o 2C3 resultou em aumen- tos estatisticamente significativos em sobrevida (p = 0,0025, p = 0,0007 e p = 0,0002 respectivamente). A Figura 13 mostra o percentual de sobrevida dos camundongos após o tratamento.
Exemplo 12: Análise da eficácia de anticorpos quiméricos anti-CD52 em mo- delo de enxerto tumoral (9D9 e 4B10) Quarenta camundongos SCID (n = 8 por grupo) foram injetados com 1 x 10º células tumorais B104 em volume de 100 uL no flanco direito.
No Dia 11 após a injeção de células tumorais, o tratamento iniciou com Campathº ou anticorpo quimérico 9D9 ou 4B10. Os anticorpos foram admi- nistrados uma vez por semana em dose de 10 mg/kg por injeção intraperito- neal durante todo o restante do experimento.
Todos os camundongos no grupo não tratado desenvolveram tumores com crescimento progressivo, Í requerendo o sacrifício com mediana de sobrevida de 27 dias.
O tratamento com CampathO resultou em aumento significativamente estatístico em so- brevida, quando comparado ao grupo não tratado (mediana de sobrevida não atingida e p <0,0001). O tratamento com os anticorpos quiméricos anti- CD52 resultou também em aumento estatisticamente significativo em sobre- vida, quando comparado a camundongos não tratados (p <0,0001 para 9D9 e4B10).A análise estatística das curvas de sobrevida revela que o anticorpo quimérico 9D9 exibiu atividade comparável a Campathº (p = 0,0675) neste experimento.
A Figura 14 mostra o percentual de sobrevida dos camundon- gos após o tratamento.
Exemplo 13: Análise da eficácia de anticorpos quiméricos anti-CD52 em mo- delodeenxertotumoral (2C3 e 11C11) Quarenta camundongos SCID (n = 8 por grupo) foram injetados com 1 x 10º células tumorais B104 em volume de 100 uL no flanco direito.
No Dia 11 após a injeção de células tumorais, o tratamento iniciou com Campathº ou anticorpo quimérico 203 ou 11C11. Os anticorpos foram admi- nistrados uma vez por semana em dose de 10 mg/kg por injeção intraperito- neal durante todo o restante do experimento.
Todos os camundongos no grupo não tratado desenvolveram tumores com crescimento progressivo,
: 146/222 Ã requerendo o sacrifício com mediana de sobrevida de 32 dias. O tratamento com Campathº resultou em aumento significativamente estatístico em so- brevida, quando comparado ao grupo não tratado (mediana de sobrevida não atingida e p <0,0001). O tratamento com os anticorpos quiméricos anti- CDS52 resultou também em aumento estatisticamente significativo em sobre- vida, quando comparado a camundongos não tratados (p <0,0001 para 2C3 e p = 0,0004 para 11C11). A análise estatística das curvas de sobrevida re- vela que o anticorpo quimérico 2C3 e o 11011 exibiram atividade compará- vela Campathº (p = 0,3173 para 2C3 e p = 0,9703 para 11C11). A Figura 15 mostrao percentual de sobrevida dos camundongos após tratamento com Campathº, o anticorpo quimérico 2C3 ou com o anticorpo quimérico 11C11.
Exemplo 14: Geração e análise do anticorpo humanizado 4B10 anti-CD52 O anticorpo humanizado anti-CD52 humana, 4B10, foi gerado É enxertando as regiões CDR do anticorpo de camundongo 4B10 no frame- —workde região variável de um anticorpo humano. As sequências de cadeia pesada e leve de 4B10 de camundongo foram avaliadas por alinhamento de sequências à base de rede a fim de identificar uma sequência de framework de cadeia pesada e leve de linhagem germinativa humana que servisse co- mo aceitadora adequada para o enxerto de CDR (Figura 16). Os resíduos definindoas regiões CDR por Kabat e IMGTO foram sobrepostos em regiões framework humanas com alta identidade de sequência para gerar sequên- cias de cadeia pesada e de leve humanizadas. A inspeção visual e a análise de sequências das sequências sobrepostas de cadeia leve e pesada de 4B10 foram realizadas para identificar a sequência aceitadora mais adequa- da De todas as sequências de linhagem germinativa com alta similaridade, a sequência da linhagem germinativa de VH3-72, para cadeia pesada, e a de VK2-A18b para cadeia leve (sequências de linhagem germinativa huma- na podem ser encontradas no site Internet, descritas na publicação por To- mlinson, IM, et al, EMBO J., 14(18):4628-4638 (1995); Cook, GP., et al, Nature Genetics, 7162-168 (1994)) foram selecionadas a partir de seu alto grau de homologia, similaridade de sequência com as regiões framework de camundongo e para alteração mínima da estrutura em alça de CDRs como a
| 147/222 sequência aceitadora de CDR. As sequências de CDR1, 2, e 3 de cadeia pesada e cadeia leve para 4B10 foram enxertadas em regiões framework humanas de VH3-72 e VK2-A18b, respectivamente, para gerar sequências da cadeia pesada humanizada e da cadeia leve humanizada para 4B10 (ilus- tradona Figura 17; Figura 110).
Exemplo 15: Avaliação das atividades de ligação de anticorpos monocionais quiméricos e humanizados 4B10 Anticorpos quiméricos e humanizados 4B10 foram produzidos e purificados como descrito no Exemplo 3 e analisados quanto à sua capaci- dade para ligar-se à linhagem de células B B104, que expressam endoge- namente CD52, por FACS. Resumidamente, 2 x 10º células B104 foram in- cubadas com anticorpo (0,02 ug/mL a 16,7 ug/mlL) em PBS contendo soro fetal bovino 5% e soro de cabra 5%. O anticorpo ligado foi detectado com anticorpo secundário de cabra anti-humano marcado com FITC, o qual de- tectou anticorpos quiméricos ou humanizados anti-CD52. Células marcadas foram analisadas usando sistema FACSCAalibur (Becton Dickinson). A Figura 18 mostra o aumento em vezes da média geométrica de intensidade de fluo- rescência de cada amostra normalizada (dividida) em relação ao da amostra do 2º apenas. As 11 diferentes concentrações (12º ponto no eixo X é o se- — cundário apenas) do anticorpo humanizado e do quimérico, usadas no en- saio, são mostradas no eixo X, e o aumento de vezes, em Média Geométri- ca, da fluorescência média está no eixo Y. Os resultados indicam que o anti- corpo humanizado 4B10 ligou-se tão bem ou ligeiramente melhor do que o anticorpo quimérico 4B10 a células expressando CD52.
Exemplo 16: Avaliação das atividades de ADCC de anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados 4B10 Anticorpos humanizados e quiméricos 4B10 foram avaliados quanto à sua capacidade para mediar morte por ADCC de células expres- sando CD52. Um ensaio de ADCC foi realizado como descrito no Exemplo 6. Resumidamente, células CHO K1, construídas para expressar proteína CD52 (CHO-CD52), foram usadas como células-alvo e marcadas com Na2'CrO, (New England Nuclear, Boston, MA) a 37 C por 1 a 2 horas. As
: 148/222 | células foram lavadas, ressuspensas em meio RPMI 1640, com FCS 10%, e misturadas com anticorpos quiméricos ou anticorpos humanizados 4B10 em várias concentrações variando de 10 ug/mL a 0,01 pg/ml.
PBMC humanas foram usadas como células efetoras e adicionadas a uma proporção de 1:50 de células-alvo para efetoras.
Depois de 6 horas de incubação durante a noite, 25 ul de sobrenadante livre de células foram coletados de cada cavi- dade e contados em Contador de Cintilação MICROBETA TRILUX (Wallac, Gaithersburg, MD). A quantidade de *Cr liberada espontaneamente foi obti- da por células-alvas incubadas apenas em meio.
A liberação espontânea de células-alvo era tipicamente inferior a 20%. A quantidade total de Cr incor- porada foi determinada adicionando Triton X-100 1% em água destilada, e o percentual de lise foi calculado como segue: [(c.p.m. da amostra - c.p.m. es- pontâneo) / (c.p.m. total - c.p.m. espontâneo)] X 100. i A Figura 19 ilustra as concentrações de controle, de anticorpos —quiméricos e de humanizados 4B10, usadas no ensaio (eixo X) e o eixo Y mostra o % de morte específica.
Os resultados indicam que o anticorpo hu- manizado 4B10 mediou morte por ADCC equivalente ou ligeiramente melhor do que o anticorpo quimérico 4B10. O controle por isotipo de controle de IgG1 mostrou somente níveis baixos de morte nas concentrações testadas.
Exemplo 17: Avaliação das atividades de CDC de anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados 4B10 Anticorpos humanizados e quiméricos 4B10 foram avaliados quanto à sua capacidade para mediar efeito citotóxico sobre células B104 que expressam endogenamente CD52 na presença de complemento huma- no O kit CelliTiter Glo (Promega) foi usado para determinar as células vivas restantes no ensaio.
Resumidamente, células B104 (células-alvo) foram es- palhadas a 2,5 x 10º células/cavidade em uma placa de 96 cavidades e fo- ram misturadas com anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados 4B10 em várias concentrações variando de 1 ug/mlL a 25 pog/mL, e complemento humano para concentração final de 10%. O complemento sozinho sem o anticorpo e o anticorpo sozinho sem o complemento foram usados como controles para determinar o fundo.
Depois de três horas de incubação a
: 149/222 a 37ºC, as placas foram centrifugadas por 3 minutos a 1500 rpm, e as células vivas presentes no grânulo foram determinadas usando o ensaio CellTiter Glo. As placas foram lidas em equipamento Envision. A Figura 20 mostra as células vivas presentes no ensaio, medidas com o ensaio CellTiter Glo. Mais uma vez com as concentrações crescentes do anticorpo humanizado e qui- mérico 4B10, há diminuição no número de células vivas. Estes resultados sugerem que o anticorpo humanizado teve desempenho tão bom ou ligeira- mente melhor do que o anticorpo quimérico 4B10 em morte mediada por CDC de células B104.
Exemplo 18: Análise de perfil farmacocinético de anticorpos quiméricos e humanizados anti-CD52 em camundongos transgênicos para CD52 (12G6. 7F11,4B10 quimérico e humanizado) Camundongos transgênicos para CD52 humana foram adminis- trados com um de Campath6, 12G6, 7F11 e anticorpos quiméricos e huma- nizados 4B10 anti-CD52 para examinar o nível de depleção de linfócitos. Os camundongos foram injetados por via intravenosa com um destes anticorpos em volume de 100 uL e dose de 1 mg/kg. Para análise de respostas de anti- anticorpo, 100 ul de sangue foram coletados em tubos separadores de soro, via punção do plexo retro-orbital em 2 horas, 1, 2, 4, 7 e 10 dias após a inje- ção do anticorpo. Análise por ELISA foi usada para determinar o nível de IgG1 humana circulante em cada amostra de soro. Com base em níveis cir- culantes de anticorpo, parece haver pouca a nenhuma diferença entre Cam- pathO, 7F11, e as formas quiméricas e humanizadas de 4B10. O anticorpo 12G6 exibiu valores mais baixos de cmax após a injeção, sugerindo que este anticorpo pode ser degradado mais rapidamente. A Figura 21 mostra o perfil farmacocinético de Campath& e dos anticorpos 12G6 (quimérico), 7F11 (quimérico), 4B10 (quimérico) e 4310 (humanizado).
Exemplo 19: Análise da atividade de depleção de anticorpos quiméricos e humanizados anti-CD52 em camundongos transgênicos para CD52 (4B10 — quiméricoe humanizado) Camundongos transgênicos para CD52 humana foram adminis- trados com Campath€O ou o anticorpo quimérico ou humanizado 4B10 anti-
a corpo anti-CD52 humana para examinar o nível de depleção de linfócitos. Os camundongos foram injetados por via intravenosa com Campath€& ou o anti- corpo quimérico ou o humanizado 4B10 anti-CD52 humana em volume de 100 uL e dose de 0,1 mg/kg. Três dias mais tarde, os camundongos foram sacrificados, e sangue e baços foram coletados para determinar o nível de depleção de células B e T. Citometria de fluxo foi utilizada para avaliar os números absolutos de células T helper, células T citotóxicas e células B to- tais presentes no sangue periférico circulante dos camundongos transgêni- cos huCD52. Estas populações de linfócitos foram definidas por sua expres- sãoem superfície dos seguintes antígenos proteicos: expressão de CDA4 i- dentifica a população de células T helper, expressão de CD8 identifica a po- pulação de células T citotóxicas e expressão de CD19 identifica todas as populações de células B maduras. A comparação da atividade de depleção no baço revelou que não havia diferença no nível de células T depletadas após administração de CampathO& ou das formas quiméricas ou humaniza- das de 4B10. Devido à dose baixa usada, somente um nível modesto de de- pleção de células B foi observado no baço. Com base em cada animal, apa- rentemente o anticorpo humanizado 4B10 é tão bom ou ligeiramente melhor do que Campath6 em mediar depleção de linfócitos. As Figuras 22A-22C mostram o nível de células T CDA, células T CD8 e células B CD19 no san- gue após 72 horas da administração dos anticorpos quiméricos e humaniza- dos.
Exemplo 20: Eficiência relativa de ligação de anticorpos anti-CD52 humana Os valores de ECs,9 de anticorpos anti-CD52 selecionados foram estimados usando células CHO construídas para expressar CD52. Células CHO-CD52 foram tratadas com tripsina 0,25%, coletadas e enxaguadas com PBS/FBS 5%. As células então depositadas em placas de 96 cavidades de fundo Redondo em 1E5 células por cavidade. A coloração com anticorpo primário foi efetuada com diluição seriada de 12 pontos (1:2) de cada anti- corpo quimérico anti-CD52, partindo de 50 pug/mL. Fragmento FAB2 de ca- bra conjugado com FITC de anti-Fc gama humano a 10 pg/ml (Jackson 109-096-098) foi usado como secundário. As células foram lavadas 3 vezes pá em PBS/FBS 5% gelado antes e depois de cada incubação. As células fo- ram fixadas com PBS contendo paraformaldeído 2% livre de metanol e ava- liadas por citometria de fluxo. Os dados de citometria de fluxo foram analisa- dos usando o software Graph pad Prizm para determinar o valor de ECso com intervalo de confiança de 95%.
Os dados de ligação (Figura 23) indicam que os novos anticor- pos contra CD52 não só apresentam diferentes especificidades por epítopo, como mencionado anteriormente, mas também diferentes características de ligação, como mostrado na tabela fornecida abaixo. Campath-1H8 e os anti- corpos quimérico 7F11, 4B10, 2C3 e 12G6 revelaram valores relativamente semelhantes de EC50 entre 0,5 a 2,5 uguml. O anticorpo quimérico 9D9 mostrou características de ligação ligeiramente diferentes com valor de ECs, em torno de 5 a 7 ug/mL. O anticorpo humanizado 4B10 mostrou caracterís- i ticas de ligação semelhantes às do anticorpo quimérico 4B10, indicando que o anticorpo humanizado reteve as características de ligação como aquelas do anticorpo quimérico 4B10. Tabela 9: EC50 (pvg/mL) Clone ID Média Desvio padrão c1H* 1,36 0,46 2C3-Chi 1,32 0,33 4B10-Chi 2,18 0,33 4B10-H1/K1 2,23 0,50 7F11-Chi 2,22 0,29 9D9-Chi 6,05 1,18 12G6-Chi 0,95 0,21 * C1H refere-se a Campath-1HO6.
Exemplo 21: Humanização de clone 7F11 de anti-CD52 A humanização de clone 7F11 de anticorpo anti-CD52 humana foi realizada enxertando as regiões CDR do anticorpo 7F11 de camundongo em framework (arcabouço) de região variável de anticorpo humano, como descrito no Exemplo 14 para humanização do anticorpo 4B10. Sequências de CDR-1, CDR-2 e CDR-3 da cadeia pesada e cadeia leve de 7F11 foram
; 152/222 enxertadas nas regiões framework de VH3-72 e VK2 A18b humanos, res- pectivamente. As sequências JH6 (WGQGTTVTVSS: SEQ ID NO: 133) e JK2 (FGQGTKLEIK: SEQ ID NO: 134) humanas foram selecionadas como os peptídeos em C-terminal para cadeias pesadas e leves humanizadas, respectivamente, para gerar sequências de região variável de cadeia pesada humanizada (7F11-SFD1 e 7F11-SFD2) e cadeia leve humanizada (7F11- VK2) para 7F11 (Figura 24). As duas sequências de região variável da ca- deia pesada humanizada (7F11-SFD1 e 7F11-SFD2) diferem por um resíduo de aminoácido na região CDR-3. A versão 7F11-SFD1 contém treonina na posição 93 (indicada pelo sistema de numeração de Kabat), enquanto a ver- são 7F11-SFD2 contém alanina nesta posição. A posição 93 está sublinhada para 7F11-SFD1 e 7F11-SFD2 na Figura 24.
A sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de 7F11-SFD1 (SEQ ID NO: 274) e a sequência completa de aminoácidos da cadeialevede?7F11-K2(SEQ ID NO: 275) são mostradas na Figura 107.
Exemplo 22: Avaliação das atividades de ligação de anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados 7F11 Anticorpos quiméricos e humanizados 7F11 (7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2) foram produzidos e purificados usando os métodos descritos no Exemplo 3,e analisados quanto à sua capacidade para ligar-se a CD52 expressa na superfície de células CHO-CDS52 (células CHO construídas para expressar CD52) por citometria de fluxo. Resumidamente, 2 x 10º células CHO-CDB52 foram incubadas com um anticorpo a 10 ug/mL in PBS contendo soro fetal bovino 5% e soro de cabra 5%. Anticorpo ligado foi detectado com um anticorpo secundário anti-humano de cabra marcado com FITC, o qual detectou anticorpos quiméricos ou humanizados anti-CD52. Células marca- das foram analisadas usando sistema FACSCalibur (Becton Dickinson), e os dados foram analisados usando o software FlowJo versão 7.2 (Tree Star, Inc, Oregon, EUA). O histograma na Figura 25 compara os níveis de CD52 detectados com anticorpos quiméricos e humanizados 7F11. Os resultados indicam que os anticorpos humanizados 7F11 ligam-se tão bem ou ligeira- mente melhor do que o anticorpo quimérico 7F11 a células expressando rá CD52.
Exemplo 23: Humanização de clone 2C3 de anticorpo anti-CD52 A humanização do clone 2C3 de anticorpo anti-CD52 humana foi realizada enxertando as regiões CDR do anticorpo 2C3 de camundongo em framework de região variável de anticorpo humano, como descrito no Exem- plo 14 para humanização do clone 4B10 de anticorpo. As sequências de CDR-1, CDR-2 e CDR-3 da cadeia pesada e cadeia leve de 2C3 foram en- xertadas em regiões framework humanas de VH3-72 e VK2 A18b, respecti- vamente. As sequências de JH6 (WGQGTTVTVSS: SEQ ID NO: 133) e JK5 (FGOGTRLEIK: SEQ ID NO: 135) humanas foram selecionadas como os peptídeos em C-terminal para as cadeias pesadas e leves humanizadas, respectivamente, para gerar sequências de região variável de cadeia pesada humanizada (2C3-SFD1) e cadeia leve humanizada (2C3-VK1) para 2C3 (Figuras 26A e B). Diferentemente dos clones humanizados 4B10 e 7F11, a afinidade de ligação do anticorpo humanizado 2C3 com CDR enxertada foi reduzida em grande medida. A afinidade de ligação foi restaurada ao serem introduzidas mutações reversas à estrutura com CDR enxertada, com o ob- jetivo de limitar o número de mutações reversas ao mínimo e manter o anti- corpo remoldado tão "humano" quanto possível, reduzindo dessa forma a possibilidade de imunogenicidade. Mutações reversas únicas ou múltiplas foram incorporadas nas sequências de regiões variáveis da cadeia pesada e da leve humanizadas. As posições das mutações reversas (como indicadas pelo sistema de numeração de Kabat) estão retratadas na Tabela 10 e Tabe- la 11 abaixo. Anticorpos gerados com estas mutações reversas foram avali- —ados quanto à afinidade de ligação restaurada. Três variantes de cadeia leve (2C3-VK1(L46R), também denominada 2C3-VK11; 2C3-VK1(Y36L-L46R), também denominada 2C3-VK12; e 2C3-VK1(M41-A19V-Y36L-Q45K-L46R), também denominada 2C3-VK13) e 5 variantes de cadeia pesada (2C3- SFD1(L78V), também denominada 2C3-VH12; 2C3-SFD1(G49A), também denominada 2C3-VH15; 2C3-SFD1(G49A-L78V), também denominada 2C3- VH16; 2C3-SFD1(L18M-G49A-L78V), também denominada 2C3-VH17; e 2C3-SFD1(L18M-G42E-G49A-L78V), também denominada 2C3-VH19) fo-
| ram gerados usando técnicas padrão de biologia molecular. As sequências de aminoácidos para a sequência de região variável com CDRs enxertadas das cadeias pesadas 2C3-SFD1 e 2C3-VH12, 2C3-VH15, 2C3-VH16, 2C3- VH17 e 2C3-VH19 com mutações reversas são mostradas na Figura 26A, comos aminoácidos revertidos por mutação, sublinhados, e as CDRs mos- tradas em negrito. Da mesma forma, para as sequências de cadeia leve, a sequência de região variável com CDRs enxertadas de 203-VK1 e de 2C3- VK11, 2C3-VK12 e 2C3-VK13 com mutações reversas são mostradas na Figura 26B, com os aminoácidos revertidos por mutação, sublinhados, e as CDRs mostradas em negrito.
A sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de 2C3-SFD1 (SEQ ID NO: 272) e a sequência completa de aminoácidos da cadeia leve de 2C3-K12 (SEQ ID NO: 273) são mostradas na Figura 106. Tabela 10: Mutantes reversos de cadeia pesada do clone 203 , 2C3-VH12 LaV(78 2C3-VH15 G a A (49 2C3-VH16 G a A (49), La V (78) — 2C3-VH17 LaM(18), Ga A(49) La V (78) 2C3-VH19 LaM(18), GaE(42) Ga A(49) La V(78 Tabela 11: Mutantes reversos de cadeia leve (kappa) do clone 2C3 Clone ID Mutação (posição com numeração de Kabat YaL(36)andL aR (46 2C3-VK13 Mal(4) AaV(19) YaL (36), QL a KR (45,46 Exemplo 24: Avaliação das atividades de ligação de anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados 2C3 Anticorpos quiméricos e humanizados 2C3 foram produzidos e purificados usando os métodos descritos no Exemplo 3. Alguns dos anticor- pos humanizados produzidos por pareamento de variantes de cadeia pesada com variantes de cadeia leve e um anticorpo quimérico correspondente fo- ram analisados por citometria de fluxo quanto à sua capacidade para ligar-se a CD52 expressa na superfície de células CHO-CD52, usando os métodos descritos no Exemplo 22. Os dados de ligação sugerem que clones gerados
: 155/222 a por pareamento de variantes de cadeia pesada com variantes de cadeia leve 2C3-VK1 ou 2C3-VK11 apresentaram menor capacidade de ligação, en- quanto clones gerados por pareamento de variantes de cadeia pesada com 2C3-VK12 ou 2C3-VK13 exibiram ligação equivalente ou melhor do que a de um anticorpo quimérico 2C3. Um histograma representativo de clones sele- cionados (Figura 27A) compara o nível de CD52 detectado por anticorpos quiméricos e humanizados 2C3. A ligação de 2C3-SFD1/K1 é significativa- mente menor, quando comparada àquela do anticorpo quimérico correspon- dente. A incorporação de um único resíduo de camundongo na posição 46 (leucina para arginina) na cadeia leve (resultando em 2C3-VK11) não restau- rou a ligação, quando pareada com a cadeia pesada 2C3-SFD1 para produ- zir o anticorpo 2C3-SFD1/K11. Adicionalmente, a ligação não foi restaurada pela incorporação de três mutações reversas na cadeia pesada (resultando Ê em 2C3-VH17) para produzir o anticorpo 2C3-H17/K11. No entanto, a liga- ção foi completamente restaurada quando a cadeia pesada 2C3-SFD1 foi pareada com 2C3-VK12, com duas mutações reversas, para produzir o anti- corpo 2C3-SFD1/K12, sugerindo que mutações reversas específicas preci- sam ser incorporadas para restaurar a atividade de ligação. A Figura 27B mostra um histograma de clones humanizados selecionados que demons- tram ligação equivalente àquela de um anticorpo quimérico 2C3. Esses re- sultados indicam que a mutação reversa de dois resíduos de aminoácidos na cadeia leve 2C3-VK12 foi suficiente para restaurar completamente a avidez do anticorpo. As alterações nos resíduos 36 (Y para L) e 46 (L para R) pos- sibilitaram restaurar a ligação, quando pareados com quase qualquer varian- te de cadeia pesada. Como, o clone 2C3 humanizado mostrando ligação restaurada com número mínimo de resíduos no framework, derivado do anti- corpo original do camundongo, é 2C3-SFD1/K12.
Exemplo 25: Humanização de clone 12G6 de anticorpo anti-CD52 A humanização do clone 12G6 de anticorpo anti-CD52 humana foirealizada enxertando as regiões CDR do anticorpo 12G6 de camundongo em um framework de região variável de anticorpo humano como descrito no Exemplo 14 para humanização do clone de anticorpo 4B10. Sequências o CDR-1, CDR-2 e CDR-3 da cadeia pesada e cadeia leve de 12G6 foram en- xertadas em regiões framework humanas de VH3-72 e VK2 A18b, respecti- vamente.
As sequências JH6 (WGQGTTVTVSS: SEQ ID NO: 133) e JK2 (FGQGTKLEIK: SEQ ID NO: 134) humanas foram selecionadas como os peptídeos em C-terminal para as cadeias pesadas e leves humanizadas, respectivamente, para gerar sequências de região variável de cadeia pesada humanizada (12G6-SFD1) e cadeia leve (12G6-VK1) para 12G6 (FIGURAS 28A and 28B). Quando a região variável de cadeia pesada 12G6-SFD1 e a região variável de cadeia leve and 12G6-VK1 foram combinadas no anticor- po12G6-SFD1I/K1 humanizado, a afinidade de ligação por CD52 foi reduzida em grande medida.
A afinidade de ligação foi restaurada introduzindo muta- ções reversas à estrutura enxertada com as CDRs.
Mutações reversas úni- cas e múltiplas foram incorporadas nas sequências de região variável da ' cadeia pesada humanizada e da cadeia leve humanizada.
As posições des- tas mutações reversas (como indicadas pelo sistema de numeração de Ka- bat) estão retratadas na Tabela 12 e Tabela 13 abaixo.
Anticorpos gerados com estas mutações reversas foram avaliados quanto à afinidade de ligação restaurada.
Quatro variantes de cadeia leve (12G6-VK1(Y36V), também de- nominada 12G6-VK10; 12G6-VK1(Y36V-Q45K-L46R), também denominada 12G6-VK11; 12G6-VK1(Y36V-L46R), também denominada 12G6-VK12; e 12G6-VK1(L46R), também denominada 12G6-VK13) e três variantes de ca- deia pesada (12G6-SFD1(L78V), também denominada 12G6-VH10; 12G6- SFD1(G49A), também denominada 12G6-VH11; e 12G6-SFD1(G49A-L78V), também denominada 12G6-VH12) foram geradas usando técnicas padrão de biologia molecular.
As sequências de aminoácidos para a região variável enxertada com as CDRs da sequência de cadeia pesada de12G6-SFD1 e 12G6-VH10, 12G6-VH11 e 12G6-VH12 com mutações reversas são mostra- das na Figura 28A com os aminoácidos revertidos por mutação sublinhados, e as regiões de CDRs em negrito.
Da mesma forma, para as sequências de cadeialeve,a sequência de região variável com CDRs enxertadas de 12G6- VK1 e de 12G6-VK10, 12G6-VK11, 12G6-VK12 e 12G6-VK13 com muta- ções reversas são mostradas na Figura 28B com os aminoácidos revertidos
" por mutação sublinhados, e as regiões de CDRs em negrito.
A sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de 12G6-SFD1 (SEQ ID NO: 279) e a sequência completa de aminoácidos da cadeia leve de 12G6-K12 (SEQ ID NO: 280) são mostradas na Figura 109.
— Tabela12: Mutantes reversos de cadeia pesada do 12G6 Clone ID posição com numeração de Kabat; 12G6-VH10 LaV(78) 12G6-VH11 G a A (49 12G6-VH12 G a A (49) andL a V (78 Tabela 13: Mutantes reversos de cadeia leve (kappa) do clone 12G6 12G6-VK10 YaVv(36 12G6-VK11 = Y a V (36), QL a KR (45,46 12G6-VK12 YaVv(36),LaR(46 12G6-VK13 La R (46) Exemplo 26: Avaliação das atividades de ligação de anticorpos monoclionais - quiméricos e humanizados 12G6 Anticorpos quiméricos e humanizados 12G6 foram produzidos e purificados usando os métodos descritos no Exemplo 3. Alguns dos anticor- pos humanizados produzidos por pareamento de variantes de cadeia pesada com variantes de cadeia leve e um anticorpo quimérico correspondente fo- ram analisados por citometria de fluxo quanto à sua capacidade para ligar-se a CD52 expressa na superfície de células CHO-CD52, usando os métodos descritos no Exemplo22. Os dados de ligação sugerem que clones gerados por pareamento de variantes de cadeia pesada com variantes de cadeia leve 12G6-VK1, 12G6-VK10 ou 12G6-VK13 apresentaram menor capacidade de ligação, enquanto clones gerados por pareamento de variantes de cadeia pesada com 12G6-VK11 ou 12G6-VK12 mostraram ligação equivalente ou melhor do que aquela do anticorpo quimérico 12G6 correspondente. Um his- tograma representativo de clones selecionados (Figura 29) compara o nível de CD52 detectado por anticorpos quiméricos e humanizados 12G6. Esses resultados indicam que a mutação reversa de dois resíduos de aminoácido na região variável de cadeia leve de 12G6 (clone 12G6-VK12) foi suficiente para restaurar completamente a especificidade do anticorpo. As alterações a em resíduos numerados por Kabat 36 (Y para V) e 46 (L para R) possibilita ram restaurar a ligação quando pareados com quase qualquer variante de cadeia pesada. Como tal, o clone 12G6 humanizado mostrando ligação res- taurada com número mínimo de resíduos no framework, derivado do anticor- pooriginaldo camundongo, é 12G6-SFD1/K12.
Exemplo 27: Humanização de clone 9D9 de anticorpo anti-CD52 .
A humanização de clone 9D9 de anticorpo anti-CD52 humana clone 9D9 foi realizada enxertando as regiões CDR do anticorpo 9D9 de ca- mundongo em um framework de região variável de anticorpo humano como descritono Exemplo 14 para humanização do clone de anticorpo 4B10. Se- quências CDR-1, CDR-2 e CDR-3 da cadeia pesada e cadeia leve de 9D9 foram enxertadas em regiões framework humanas de VH3-23 e VK2 A18b, respectivamente. As sequências de JH6 (WGQGTTVTIVSS: SEQ ID NO: ' 133) e JK2 (FGQGTKLEIK: SEQ ID NO: 134) humanas foram selecionadas comoos peptídeos em C-terminal para as cadeias pesadas e leves humani- zadas, respectivamente, para gerar sequências de região variável de cadeia pesada humanizada (9D9-VH10) e cadeia leve humanizada (9D9-VK2) (Fi- guras 30A e 30B). Quando a cadeia pesada 9D9-VH10 e a cadeia leve 9D9- VK2 foram combinadas no anticorpo 9D9-H10/K2 humanizado, a afinidade de ligação por CD52 foi reduzida em grande medida. A afinidade de ligação foi restaurada introduzindo mutações reversas à estrutura enxertada com as CDRs. Mutações reversas únicas e múltiplas foram incorporadas nas se- quências de região variável da cadeia pesada humanizada e da cadeia leve humanizada. As posições destas mutações reversas (como indicadas pelo sistema de numeração de Kabat) estão retratadas na Tabela 14 e Tabela 15 abaixo. Anticorpos gerados com estas mutações reversas foram avaliados quanto à afinidade de ligação restaurada. Quatro variantes de cadeia leve (9D9-VK2(Y36L-Q45K-L46R), também denominada 9D9-VK12; 9D9- VK2(Y36L-L46R), também denominada 9D9-VK13; 9D9-VK2(L46R), tam- bém denominada 9D9-VK14; e 9D9-VK2(Q45K-L46R), também denominada 9D9-VK15) e cinco variantes de cadeia pesada (9D9-VH10(W47L-V48T- S49A-N76S-L78V), também denominada 9D9-VH11; 9D9-VH10(W47L-
r.
VA48T-S49A), também denominada 9D9-VH15; 9D9-VH10(W47L), também denominada 9D9-VH16; 9D9-VH10(W47L-V48T), também denominada 9D9- VH17; e 9D9-VH10(W47L-S49A), também denominada 9D9-VH18) foram geradas usando técnicas padrão de biologia molecular.
As sequências de aminoácidos para região variável com CDRs enxertadas da sequência de cadeia pesada 9D9-VH10 e de 9D9-VH11, 9D9-VH15, 9D9-VH16, 9D9- VH17 e 9D9-VH18 com mutações reversas são mostradas na Figura 30A, com os aminoácidos revertidos por mutação sublinhados e as CDRs em ne- grito.
Da mesma forma, para as sequências de cadeia leve, a sequência de região variável enxertadas com CDRs de 9D9-VK2 e de 9D9-VK12, 9D9- VK13, 9D9-VK14 e 9D9-VK15 com mutações reversas são mostradas na Figura 30B com os aminoácidos revertidos por mutação sublinhados e as CDRs em negrito. ' As sequências completas de aminoácidos das cadeias pesadas de9D9-H16(SEQID NO: 276) e 9D9-H18 (SEQ ID NO: 277), e a sequência completa de aminoácidos da cadeia leve de 9D9-K13 (SEQ ID NO: 278) são mostradas na Figura 108. Tabela 14: Mutantes reversos de cadeia pesada de 9D9 Clone ID Mutação (posição com numeração de Kabat) 9D9-VH11 WVS a LTA (47-49), Na S (76), La V (78 WVS a LTA (47-49 WV a LT (47,48 Tabela 15: Mutantes reverses de cadeia leve (kappa) de 9D9 Clone ID Mutação (posição com numeração de Kabat) Y al (36) e QL a KR (45,46 9D9-VK13 YaL(36)eLaR(46 QL a KR (45,46 Exemplo 28: Avaliação das atividades de ligação de anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados 9D9 Anticorpos quiméricos e humanizados 9D9 foram produzidos e purificados usando os métodos descritos no Exemplo 3. Alguns dos anticor- pos humanizados produzidos por pareamento de variantes de cadeia pesada o com variantes de cadeia leve e um anticorpo quimérico correspondente fo- ram analisados por citometria de fluxo quanto à sua capacidade para ligar-se a CD52 expressa na superfície de células CHO-CD52, usando os métodos descritos no Exemplo22. Os dados de ligação sugerem que clones gerados porpareamento de variantes de cadeia pesada com variantes de cadeia leve 9D9-VK2, 9D9-VK14 ou 9D9-VK15 apresentaram menor capacidade de liga- ção, enquanto clones gerados por pareamento de variantes de cadeia leve 9D9-VK12 ou 9D9-VK13 com variantes de cadeia pesada com mutações reversas 9D9-VH11, 9D9-VH15, 9D9-VH16 e 9D9-VH18 exibiram ligação equivalente ou melhor do que aquela do anticorpo quimérico 9D9 correspon- dente.
Quando variantes de cadeia leve 9D9-VK12 e 9D9-VK13 foram pare- ados com a cadeia pesada original com CDRs enxertadas 9D9-VH10 ou a sequência 9D9-VH17 com mutação reversa, a ligação foi significativamente reduzida, sugerindo que para clones 9D9 humanizados, tanto sequências de pesada como de cadeia leve deveriam ser construídas com mutações rever- sas para restaurar a capacidade de ligação.
Um histograma representativo de clones selecionados (Figura 31) compara o nível de CD52 detectado por anticorpos quiméricos e humanizados 9D9. Esses resultados indicam que a mutação reversa de dois resíduos de aminoácido (por exemplo, Y para L na posição36,eL paraR na posição 46), na região variável de cadeia leve de 9D9 (clone 9D9-VK13) era necessária para restaurar a especificidade do anticoro quando pareado com cadeias pesadas alteradas por mutação em uma posição (por exemplo, W para L, na posição 47) ou em duas posições (por exemplo, W para L na posição 47 e S para A na posição 49). Como tais, os clones9D9 humanizados mostrando ligação restaurada com número mi- nimo de resíduos no framework, derivado do anticorpo original do camun-
dongo, são 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13. Exemplo 29: Determinação de eficiência relativa de ligação de anticorpos humanizados anti-CD52 humana
Os valores de ECs9 de anticorpos quiméricos e humanizados an- ti-CD52 foram estimados usando células T CD4+ isoladas de PBMCs de do- adores sadios, obtidas de fontes comerciais (Bioreclamation, NY, USA). Cé-
a lulas T CD4+ foram isoladas por seleção negativa, usando kit EasySep
(Stem Cell Technologies). Células T CD4+ isoladas de tecido esplênico de camundongos CE1 transgênicos huCD52 foram usadas também (Stem Cell
Technologies) de acordo com os métodos descritos acima no Exemplo 20 para células CHO-CD52. Resumidamente, células T CD4+ humanas foram isoladas de 50 mL do sangue periférico de doadores sadios (Bioreclamati-
on), e células T CD4+ de camundongos transgênicos huCD52 foram isola-
das de tecido do baço.
As células foram lavadas com PBS/FBS 5% e deposi-
tadas em placas de 96 cavidades de fundo redondo em 1 x 10º células por cavidade.
A coloração com anticorpo primário foi efetuada com diluição seri-
ada de 8 pontos (1:3) de cada anticorpo quimérico e humanizado anti-CD52,
partindo de 100 ug/mL.
Um anticorpo secundário de fragmento F(ab'), de cabra conjugado com FITC de anti-Fc gamma humano a 10 pug/mL (Jackson
' 109-096-098) foi usado.
As células foram lavadas 3 vezes em PBS/FBS 5%
gelado, antes e depois de cada incubação.
As células foram fixadas com
PBS, contendo paraformaldeído 2% livre de metanol, e avaliadas por citome-
tria de fluxo.
Os dados de citometria de fluxo foram analisados com o softwa-
re GraphPad Prism para determinar valor de ECso com intervalo de confiança de 95%. Com base na ligação de anticorpos anti-CD52 a células T CD4+ isoladas de PBMCs humanas e a células T CD4+ isoladas de tecido esplêni-
co de camundongos transgênicos para CD52 humana, curvas de ligação
(Figuras 32A, 32B, 32C) foram geradas, e valores de EC5,5 estimados e mos-
trados na Figura 33. Todos os anticorpos exibiram características semelhan-
tes de ligação a células T CD4+ humanas e a células T CD4+ isoladas de camundongos transgênicos para CD52 humana.
Os dados de ligação indi-
cam que os anticorpos humanizados possuem afinidades de ligação equiva- lentes ou melhores, quando comparadas a seus anticorpos quiméricos origi- —
nais, sugerindo que a afinidade de ligação é retida ou melhorada quando da humanização.
Os anticorpos humanizados 2C3 e 12G6 apresentam valores de ECrsy pelomenos duas vezes mais baixos do que o anticorpo Campath-
1H, conforme determinado por este ensaio de ligação celular.
Exemplo 30: Avaliação da ligação de anticorpos humanizados anti-CD52 a
E uma população definida de linfócitos
Campath-1HO& (C1H) e os anticorpos humanizados 2C3 (2C3- SFD1/K12), 9D9 (9D9-H16/ K13 e 9D9-H18/K13) e 12G6 (12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12) foram avaliados quanto a sua ligação a vários subconjun- tosdePBMC, em PMBCs de doadores normais, usando os métodos descri- tos acima no Exemplo 7 para anticorpos quiméricos anti-CD52. Alguns dos anticorpos conjugados a fluorocromo foram usados para análise por citome- tria de fluxo.
Anti-CD27-PE, anti-CD19 e anti-CD11c-PE Cy5, anti-CD56 e anti-CD123-PE Cy7, anti-CD16-APC Cy7 e CD4-APC foram obtidos da BD Biosciences (San Diego, CA), enquanto anti-CDS4RA-ECD e anti-HLA-DR- ECD foram obtidos da Beckman Coulter.
Anti-CD3-Pacific Blue, anti-CD8 e anti-CD14-Pacific Orange e anti-CD4-APC cy5.5 foram obtidos da Invitrogen (CA). Todos os anticorpos humanizados anti-CD52 humana (9D9-H18/K13, ' 9D9-H16/K13, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12 e 2C3-SFD1/K12), bem como o Campath-1H8 foram conjugados a FITC.
Células mononucleares humanas sadias de sangue periférico foram obtidas a partir de Buffy Coats crioconservados ou de células mononucleares separadas do sangue de do- adores normais, obtidos de fornecedores comerciais (Bioreclamation, NY, EUA), conforme descrito acima no Exemplo 7. Para enriquecimento de célu- las mononucleares, sangue periférico humano foi diluído 1:1 com solução salina com tampão fosfato (PBS) estéril e foi cuidadosamente espalhado sobre Ficoll-Hypaque (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Suécia) e cen- trifugado por 30 minutos à temperatura ambiente.
A camada de interfase de células mononucleares foi coletada e lavada em PBS contendo soro fetal bovino 5% (tampão FACS). Hemácias contaminantes (RBCs) foram lisadas com solução de lise de RBC (Sigma, St.
Louis, MO, EUA). As células foram ressuspensas em tampão FACS frio, e os resíduos foram retiradas usando filtro de 40 um.
Citometria de fluxo multicolorida foi realizada para avaliar a capacidade de ligação de anticorpos humanizados anti-CD52 humana 2C3 (2C3-SFD1/K12), 9D9 (9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13) e 12G6 (12G6-
SFD1/K11 e 12G6-SFD1/K12), em comparação a Campath-1HO8. Resumidamente, réplicas de 1 x 10º PBMCs em tampão FACS
7 foram incubadas com coquetéis pré-titulados de anticorpos para examinar linfócitos e células derivadas de mieloide.
O coquetel para linfócitos compre- endeu anticorpos contra CD3, CD27, CD45RA, CD56, CD19, CD8, CD4 e CD16. O coquetel de anticorpos para definir populações de mieloides incluiu anticorpos contra HLA-DR, CD11c, CD123, CD4 e CD14. Em cada um dos coquetéis, um dos anticorpos anti-CD52 estava incluído em concentração de ug/mL.
As células foram coradas por 30 minutos a 4 ºC e lavadas e fixa- das em PBS contendo paraformaldeído 10%. 100.000 eventos das células coradas foram adquiridos em citômetro de fluxo BD LSR Il (BD Biosciences, 10 SanJose, CA), e os dados foram analisados usando o software FlowJo ver- são 7.2 (Tree Star, Inc, Oregon, EUA). Múltiplos subconjuntos com caracte- rísticas fenotípicas distintas foram definidos entre linfócitos B e T, e CD52 demonstrou ser expressa em todos os linfócitos humanos.
A análise por ci- í tometria de fluxo multicolorida foi realizada para identificar os subconjuntos de linfócitos e para avaliar similaridades e diferenças nas características de ligação dos anticorpos humanizados anti-CD52 a CD52 de superfície celular em subconjuntos definidos.
Usando uma combinação de marcadores, popu- lações celulares fenotipicamente distintas, correspondendo a linhagens de células B, T, NK e apresentadoras de antígeno foram primeiramente defini- das.A intensidade de coloração, que corresponde à capacidade de anticor- pos humanizados anti-CD52 detectarem expressão de CD52 em cada uma das populações celulares definidas, foi avaliada e comparada à de Campath- 1HO.
Os histogramas (Figura 34) comparam o nível de CD52 detectado por cada anticorpo em populações individuais.
Os resultados indicam que todos osanticorpos humanizados anti-CD52 ligam-se à CD52 na superfície celular em medida semelhante.
Adicionalmente, não foram observadas diferenças entre Campath-1H8 e anticorpos humanizados anti-CD52 com respeito ao nível de detecção de CD52 na superfície celular.
A análise foi realizada em seis diferentes doadores.
Dados representativos gerados usando células derivadas de um doador são mostrados na Figura 34. Um padrão semelhan-
te de ligação foi observado com células de outros doadores.
Exemplo 31: Avaliação das atividades de ADCC de anticorpos monoclonais
- quiméricos e humanizados 7F11
Anticorpos humanizados e quiméricos 7F11 foram avaliados quanto a sua capacidade para mediar morte por ADCC de células expres- sando CD52. Um ensaio de ADCC foi realizado usando os métodos descri- tos acimano Exemplo 6. Resumidamente, células CHO K1 construídas para expressar proteína CD52 (CHO-CD52) foram usadas como células-alvo.
As células-alvo foram marcadas com Na2*'CrO, (New England Nuclear, Boston, MA) a 37 ºC por 2 a 3 horas.
As células foram lavadas, ressuspensas em meio RPMI 1640 com FCS 10% e misturadas com um anticorpo IgG de con- trole, um anticorpo quimérico 7F11 ou um anticorpo humanizado 7F11 (7F11-SFD1/K2 ou 7F11-SFD2/K2) em várias concentrações variando de 5 upg/mL a 0,01 pg/ml.
Células NK humanas isoladas de PBMCs, usando kit para isolamento de células NK (Stem Cell Technologies), foram usadas co- Í mo células efetoras e adicionadas em proporção 1:5 de célula-alvo para efe- tora.
Depois de 2 a 6 horas de incubação, 25 ul de sobrenadante livre de células foram coletados de cada cavidade e contados em Contador de Cinti- lação MicroBeta Trilux (Wallac, Gaithersburg, MD). A quantidade de “Cr li- berada espontaneamente foi obtida incubando as células-alvo apenas em meio.
A liberação espontânea de células-alvo era tipicamente inferior a 20%. A quantidade total de S'Cr incorporada foi determinada adicionando Triton X- 100 1% em água destilada, e o percentual de lise foi calculado como segue: [(c.p.m. da amostra - c.p.m. espontânea)/( c.p.m. total - c.p.m. espontânea)] X 100. A Figura 35 ilustra as concentrações de IgG de controle, de anticorpo quimérico 7F11 e de anticorpos humanizados 7F11, usados no ensaio (eixo X)contra% de lise específica (eixo Y). Os resultados indicam que anticorpos humanizados 7F11 (7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2) mediam morte por ADCC de modo equivalente ou ligeiramente melhor, quando comparados a um anticorpo quimérico 7F11. O isotipo I9G1 de controle revelou somente baixos níveis de morte nas concentrações testadas.
Exemplo 32: Avaliação das atividades de CDC de anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados 7F11
Anticorpos humanizados e quiméricos 7F11 foram avaliados a quanto a sua capacidade para mediar citotoxicidade dependente de com- plemento (CDC) de células expressando CD52. Um ensaio de CDC foi reali- zado usando os métodos descritos acima no Exemplo 5 para anticorpos quiméricos anti-CD52. Resumidamente, células CHO K1, construídas para expressar proteina CD52 (CHO-CD52), foram usadas como células-alvo e marcadas com Naz”'CrO, (New England Nuclear, Boston, MA) a 37 ºC por 2 a 3 horas.
As células foram lavadas, ressuspensas em meio RPMI 1640, misturadas com um anticorpo IgG de controle, um anticorpo quimérico 7F11 ou um anticorpo humanizado 7F11 (7F11-SFD1/K2 ou 7F11-SFD2/K2) em várias concentrações variando de 20 ug/mL a 500 ng/ml.
Complemento hu- mano (Sigma) foi adicionado às cavidades experimentais para concentração final de 10%. Depois de 1 a 5 horas de incubação, 25 ul. de sobrenadante livre de células foram coletados de cada cavidade e contados em Contador : de Cintilação MicroBeta Trilux (Wallac, Gaithersburg, MD). A quantidade de Cr liberada espontaneamente foi obtida incubando as células-alvo apenas em meio.
A liberação espontânea de células-alvo era tipicamente inferior a 20%. A quantidade total de *Cr incorporada foi determinada adicionando Triton X-100 1% em água destilada, e o percentual de lise foi calculado co- mo segue: [(contagens de amostra por minuto (c.p.m.) - c.p.m. espontânea)/( cpm. total- c.p.m. espontânea)] X 100. A Figura 36 ilustra as concentra- ções de IgG de controle, de anticorpo quimérico 7F11 e de anticorpos hu- manizados 7F11 (7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2), usados no ensaio (eixo X) contra % de lise específica (eixo Y). Os resultados indicam que o anticor- po quimérico 7F11 e o anticorpo humanizado 7F11-SFD1/K2 mediaram mor- te equivalente, enquanto o anticorpo humanizado 7F11-SFD2/K2 mediou morte por CDC de modo significativamente melhor do que o anticorpo qui- mérico 7F11. O anticorpo do isotipo IgG1 de controle revelou somente níveis baixos de morte nas concentrações testadas.
Exemplo 33: Avaliação das atividades de ADCC de anticorpos monoclonais
— quiméricose humanizados 2C3
Anticorpos humanizados e quiméricos 2C3 foram avaliados quanto à sua capacidade para mediar morte por ADCC de células expres-
fa sando CD52. Um ensaio de ADCC foi realizado usando os métodos descri- tos acima no Exemplo 6, com ligeiras modificações.
Resumidamente, células T isoladas de PBMCs de doadores sadios, usando kit para isolamento de células T CD4+ (Stem Cell Technologies), foram usadas como células-alvo.
As células-alvo foram marcadas durante a noite com Na2z'CrO, (New En- gland Nuclear, Boston, MA) a 37 ºC.
As células foram lavadas, ressuspensas em meio RPMI 1640 com FCS 10%, misturadas com um anticorpo IgG de controle, um anticorpo quimérico 2C3 ou um anticorpo humanizado 2C3 (2C3-SFD1/K12) em várias concentrações variando de 10 pg/ml a 100 pg/ml.
Células NK humanas isoladas de PBMCs (usando Kit para isolamen- to de células NK da Stem Cell Technologies) foram usadas como células efetoras e foram adicionadas em proporção 1:5 de célula-alvo para efetora.
Depois de 2 a 6 horas de incubação, 25 ul. de sobrenadante livre de células foram coletados de cada cavidade e contados em Contador de Cintilação MicroBeta Trilux (Wallac, Gaithersburg, MD). A quantidade de Cr liberada espontaneamente foi obtida incubando as células-alvo apenas em meio.
À liberação espontânea de células-alvo era tipicamente inferior a 20%. A quan- tidade total de ººCr incorporada foi determinada adicionando Triton X-100 1% em água destilada, e o percentual de lise foi calculado como segue: [(c.p.m. da amostra - c.p.m. espontânea) / (c.p.m. total - c.p.m. espontânea)] X 100. A Figura 37 ilustra as concentrações de IgG de controle, de anticorpo quimérico 2C3 e de anticorpo humanizado 2C3 (2C3-SFD1/K12), usados no ensaio (eixo X) contra % de lise específica (eixo Y). Os resultados indicam que o anticorpo humanizado 2C3-SFD1/K12 mediou morte por ADCC equi- valente à do anticorpo quimérico 2C3. O isotipo I9G1 de controle mostrou somente níveis baixos de morte nas concentrações testadas.
Exemplo 34: Avaliação das atividades de CDC de anticorpos monoclionais quiméricos e humanizados 2C3
Anticorpos humanizados e quiméricos 2C3 foram avaliados quantoa sua capacidade para mediar citotoxicidade dependente de com- plemento (CDC) de células expressando CD52. Um ensaio de CDC foi reali- zado usando os métodos descritos acima no Exemplo 5, com ligeiras modifi-
f cações. Resumidamente, células T isoladas de PBMCs de doadores sadios foram usadas como células-alvo e marcadas durante a noite com Naz'CrO, (New England Nuclear, Boston, MA) a 37 Cc. Depois de serem marcadas durante a noite, as células foram lavadas, ressuspensas em meio RPMI 1640comFCS 10%, misturadas com um anticorpo IgG de controle, um anti- corpo quimérico 2C3 ou um anticorpo humanizado 2C3 (2C3-SFD1/K12) em várias concentrações variando de 10 pug/ml a 10 ng/ml. Complemento hu- mano (Sigma) foi adicionado às cavidades experimentais para concentração final de 10%. Depois de 1 a 5 horas de incubação, 25 ul. de sobrenadante livrede células foram coletados de cada cavidade e contados em Contador de Cintilação MicroBeta Trilux (Wallac, Gaithersburg, MD). A quantidade de S'Cr liberada espontaneamente foi obtida incubando as células-alvo apenas em meio. A liberação espontânea de células-alvo era tipicamente inferior a ' 20%. A quantidade total de ººCr incorporada foi determinada adicionando Triton X-100 1% em água destilada, e o percentual de lise foi calculado co- mo segue: [(contagens por minuto de amostra (c.p.m.) - c.p.m. espontânea) / (c.p.m. total - c.p.m. espontânea)] X 100. A Figura 38 ilustra as concentra- ções de IgG de controle, de anticorpo quimérico 2C3 e de anticorpo humani- zado 2C3 (2C3-SFD1/K12), usados no ensaio (eixo X) contra % de lise es- pecífica (eixo Y). Os resultados indicam que o anticorpo quimérico 203 e o anticorpo humanizado 2C3 (2C3-SFD1/K12) mediaram lise equivalente. O anticorpo de isotipo I9G1 de controle mostrou somente níveis baixos de mor- te nas concentrações testadas.
Exemplo 35: Avaliação de atividades de ADCC de anticorpos monoclonais —quiméricose humanizados 12G6 Anticorpos humanizados e quiméricos 12G6 foram avaliados quanto sua capacidade para mediar morte por ADCC de células expressan- do CD52. Um ensaio de ADCC foi realizado por ensaios de liberação de cromo, usando células T isoladas de PBMCs de doadores sadios como célu- las-alvo, conforme descrito acima no Exemplo 31. A Figura 39 ilustra as con- centrações de IgG de controle, de anticorpo quimérico 12G6 e de anticorpos humanizados 12G6 (12G6-SFD1/K11 ou 12G6-SFD1/K12), usados no en-
f saio (eixo X) contra % de lise específica (eixo Y). Os resultados indicam que os anticorpos humanizados 12G6 12G6-SFD1/K11 e 12G6-SFD1/K12 medi- aram morte equivalente por ADCC, quando comparados ao 12G6 anticorpo quimérico. O isotipo I9gG1 de controle mostrou somente níveis baixos de — mortenas concentrações testadas.
Exemplo 36: Avaliação das atividades de CDC de anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados 12G6 Anticorpos humanizados e quiméricos 12G6 foram avaliados quanto a sua capacidade para mediar citotoxicidade dependente de com- plemento (CDC) de células expressando CD52. Um ensaio de CDC foi reali- zado por ensaios de liberação de cromo, usando células T isoladas de PBMCs de doadores sadios como células-alvo, conforme descrito acima no Exemplo 32. A Figura 40 ilustra as concentrações de IgG de controle, de ' anticorpo quimérico 12G6 e de anticorpos humanizados 12G6 (12G6- SFDI/KI1 e 12G6-SFD1/K12), usados no ensaio (eixo X) contra % de lise específica (eixo Y). Os resultados indicam que o anticorpo quimérico 12G6 mediou lise equivalente, quando comparado a anticorpos humanizados 12G6 (12G6-SFD1/K11 e 12G6-SFD1/K12). O anticorpo de isotipo I9G1 de controle mostrou somente níveis baixos de morte nas concentrações testa- das. Exemplo 37: Avaliação de atividades de ADCC de anticorpos quiméricos e humanizados 9D9 Anticorpos humanizados e quiméricos 9D9 foram avaliados quanto a sua capacidade para mediar morte por ADCC de células expres- — sando CD52. Um ensaio de ADCC foi realizado por ensaios de liberação de cromo, usando células T isoladas de PBMCs de doadores sadios como célu- las-alvo, conforme descrito acima no Exemplo 31. A Figura 41 ilustra as con- centrações de IgG de controle, de anticorpo quimérico 9D89 e de anticorpos humanizados 9D9 (9D9-H10/K13, 9D9-H11/K13, 9D9-H16/K13 e 9D9- —H18/K13), usados no ensaio (eixo X) contra % de lise específica (eixo Y). Os resultados indicam que os anticorpos quiméricos e humanizados 9D9 (com exceção de 9D9-H10/K13) mediaram morte equivalente por ADCC. O isotipo
A IgG1 de controle mostrou somente níveis baixos de morte nas concentra- ções testadas.
Exemplo 38: Avaliação das atividades de CDC de anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados 9D9 Anticorpos humanizados e quiméricos 9D9 foram avaliados quanto a sua capacidade para mediar citotoxicidade dependente de com- plemento (CDC) de células expressando CD52. Um ensaio de CDC foi reali- zado por ensaios de liberação de cromo, usando células T isoladas de PBMCs de doadores sadios como células-alvo, conforme descrito acima no Exemplo 32. A Figura 42 ilustra as concentrações de IgG de controle, de anticorpo quimérico 9D9 e de anticorpos humanizados 9D9 (9D9-H10/K13, 9D9-H11/K13, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13), usados no ensaio (eixo X) contra % de lise específica (eixo Y). Os resultados indicam que anticorpo ' quimérico 9D9 mediou lise equivalente, quando comparado a anticorpos .-15 humanizados 9D9 (com exceção de 9D9-H10/K13). O anticorpo de isotipo IgG1 de controle mostrou somente níveis baixos de morte nas concentra- ções testadas.
Exemplo 39: Avaliação de atividades de ADCC de Campath-1H8 e de anti- corpos humanizados anti-CD52 em células T primárias Campath-1HQ e anticorpos humanizados anti-CD52 foram avali- ados quanto a sua capacidade para mediar morte por ADCC de células ex- pressando CD52. Um ensaio de ADCC foi realizado por ensaios de liberação de cromo, usando células T isoladas de PBMCs de doadores sadios como células-alvo, conforme descrito acima no Exemplo 31. A Figura 43 ilustra as concentrações de IgG de controle, de Campath-1H8 e de anticorpos huma- nizados 2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13, 9D9-H18/K13, 12G6-SFD1/K11 e 12G6-SFD1/K12, usados no ensaio (eixo X) contra % de lise específica (eixo Y). Os resultados indicam que os anticorpos humanizados 2C3, 9D9 e 12G6 acima mediaram morte por ADCC de modo equivalente ao de Campath-1HO em concentrações acima de 10 ng/mL.
O isotipo I9gG1 de controle mostrou somente níveis baixos de morte nas concentrações testadas.
Exemplo 40: Avaliação das atividades de CDC de Campath-1HG8 e de anti-
e Ê corpos humanizados anti-CD52 em células T primárias Campath-1H8 e anticorpos humanizados anti-CD52 foram avali- ados quanto a sua capacidade para mediar citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de células expressando CD52. Um ensaio de CDC foi realizado por ensaios de liberação de cromo, usando células T isoladas de PBMCs de doadores sadios como células-alvo, conforme descrito acima no Exemplo 32. A Figura 44 ilustra as concentrações de IgG de controle, de Campath-1HO8 e de anticorpos humanizados 2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13, 9D9-H18/K13, 12G6-SFD1/K11 e 12G6-SFD1/K12, usados no ensaio (eixo X) contra % de lise específica (eixo Y). Os resultados indicam que os anti- corpos humanizados 2C3 e 12G6 mediaram morte por CDC de modo equi- valente a Campath-1HG, enquanto anticorpos humanizados 9D9 demonstra- | ram atividade de CDC significativamente reduzida, semelhante ao seu anti- ú corpo quimérico correspondente. O isotipo IgG1 de controle mostrou somen- te níveis baixos de morte nas concentrações testadas.
Exemplo 41: Avaliação de capacidade neutralizante de amostras de soro contendo anticorpos neutralizantes anti-Campath-1H8 para bloquear a ativi- dade de anticorpos humanizados 2C3, 12G6 e 9D9 anti-CD52 A fim de avaliar a capacidade de anticorpos humanizados liga- rem-sea células expressando CD52 na presença de anticorpos neutralizan- tes contra Campath-1HO, anticorpos anti-CD52 (Campath-1HO, 2C3- SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12 ) foram reagidos com soro hu- mano contendo reatividade de anticorpo anti-Campath-1HO e avaliados quando a ligação a células Raji expressando CD52. Amostras de soro obti- das de pacientes com esclerose múltipla recividante-remitente que foram incluídos no estudo CAMMS223 (The CAMMS223 Trial Investigators, "Alem- tuzumab vs. interferon Beta-1a in early multiple sclerosis;" N Engl J Med 359:1786-1801 (2008)) foram usadas no ensaio. A administração repetida do anticorpo Campath-1HO resultou na geração de respostas de anticorpo anti- Campath-1HO8 na maioria dos pacientes. O título de anticorpo anti-Campath- 1H é muito baixo no Mês 12 na maioria dos pacientes e aumenta significati- vamente quando da administração de um segundo ciclo de Campath-1H8,
Ê resultando em título alto de resposta anti-Campath-1H8& no soro no Mês 13. Ensaios de neutralização de anticorpo anti-CD52 foram conduzidos, usando amostras de soro do Mês 12 e do Mês 13, obtidas de cinco diferentes paci- entes com MS (MS-1 a MS-5) que haviam sido tratados com Campath-1HO sobo protocolo de CAMMS223. Os anticorpos anti-CD52, Campath-1H€, 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K12 e 9D9-H16/K13 (usados no Exemplo 30 e demonstrados ligarem-se a células expressando CD52), conjugados com FITC foram usados para corar células Raji que expressam CD52 humana na ausência ou presença de uma gama de diluições de soro obtido de pacien- tes que haviam sido tratados com Campath-1H.
Resumidamente, amostras de soro de pacientes com MS (Mês 12 e Mês 13) foram diluídas em série de 6 vezes e incubadas com 10 ug/mL de anticorpos anti-CD52 conjugados com FITC (Campath-1HG, 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K12 e 9D9-H16/K13) ' por 1 hora a 37 *C.
As células Raji foram lavadas com tampão de coloração, contendo HBSS, FBS 5% e azida 0,1% e, em seguida, depositadas em pla- cas de 96 cavidades de fundo redondo em 1 x 10º células por cavidade.
As células foram bloqueadas com 10 ug/mL de fragmento Fc de IgG humana por 30 minutos em gelo e tampão de coloração.
As células foram lavadas, em seguida, com tampão de coloração e ressuspensas em 100 uL da mistu- rade anticorpo-soro, como descrito acima.
Depois de 30 minutos no gelo, as = células foram lavadas e fixadas com BD Cytofix, e as células revestidas com anticorpo marcado com FITC foram analisadas usando sistema FACSCAalibur (Becton Dickinson), após o que, os dados foram analisados usando o soft- ware FlowJo versão 7.2 (Tree Star, Inc, Oregon, EUA). A ligação de anticor- pos ant-CD52 conjugados com FITC, na presença de anticorpos neutrali- zantes anti-Campath-1HO no soro, foi avaliada por citometria de fluxo e o % de ligação em relação ao controle, como medida de inibição, foi calculado como (MF! com soro/MFI de controle (sem soro)) X 100. Dados representati- vos de um dos doadores (MS-1) são mostrados na Figura 45. O eixo X indi- caofatorde diluição do soro e o eixo Y, o % de ligação de controle, como medida de atividade neutralizante de anticorpo.
Os dados demonstram cla- ramente que amostras de soro de 12 meses não exibem efeito inibidor sobre
Campath-1HO ou outros anticorpos anti-CD52, sugerindo que existe baixo bloqueio ou nenhum de anticorpos anti-Campath-1HO no soro. Amostras de soro do Mês 13 mediaram inibição completa da ligação de Campath-1HQ, mesmo em diluição de 1:1000 do soro, mas não mediaram inibição dos anti- corpos humanizados 2C3, 12G6 e 9D9 anti-CD52, mesmo na concentração mais alta (diluição de 1:24) testada. Dois dos cinco pacientes desenvolveram títulos de anticorpos neutralizantes anti-Campath-1HO de >1:1000, enquanto que os três outros apresentaram títulos de anticorpos neutralizantes em tor- no de 1:100 contra Campath-1HQ8. Ainda que dois dos soros do Mês 13 dos pacientes apresentassem títulos relativamente altos de anticorpos neutrali- zantes de >1:1000 contra Campath-1HG, estes soros não inibiram a ligação dos anticorpos humanizados 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K12 e 9D9-H16 1K13, sugerindo que a reatividade de anticorpo anti-Campath-1HO em paci- í entes tratados com Campath-1HG8 não bloqueou a ligação destes anticorpos — humanizados a CD52 presentes em células.
Exemplo 42: Análise de depleção e repovoamento de anticorpos anti-CD52 em camundongos transgênicos huCD52 (4B10-H1/K1) As atividades de depleção de Campath-1H8& e do anticorpo hu- manizado anti-CD52 (4B10-H1/K1) em diferentes níveis de dose foram exa- minadas no camundongo transgênico huCD52. Os camundongos foram inje- tados por via intravenosa com 0,1; 0,5; 1,0 ou 5,0 mg/kg de cada anticorpo. Duas horas após a administração, soro foi coletado para examinar o nível de citocinas circulantes. Três dias após a administração, os camundongos fo- ram sacrificados, e sangue e baços foram coletados de cada camundongo (N=5) para determinar o nível de depleção celular, usando análise por ci- tometria de fluxo. Amostras foram avaliadas para determinar os números relativos de subpopulações de células T helper (CD4+), células T citotóxicas (CD8+), células B (B220+) e células mieloides totais, presentes no sangue periférico circulante ou no baço de camundongos transgênicos huCD52. Adi- cionalmente, foi realizada análise do subconjunto de células T e B para de- terminar o efeito global de depleção. Um subconjunto de camundongos (N=5) foi mantido vivo para monitorar a cinética de repovoamento. A deple-
ção foi maior no compartimento de células T, com células T CD4+ sendo as mais depletadas, seguidas por células T CD8+, células B, células NK e ou- tras células mieloides. Dentro do compartimento de células T CD4+, células T CD4+ virgens foram as mais depletadas, seguidas por células CD4+ de memória central (CM), CD4+ efetoras de memória (EM) e células T CD4+ reguladoras (Treg). Um padrão semelhante foi observado para células T CD8+ (Virgem>CM>EM). Por outro lado, células B maduras foram depleta- das em maior medida do que células B imaturas. A comparação de camun- dongos tratados com Campath-1H& a camundongos tratados com 4B10- H1/K1i demonstrou padrões semelhantes de células, tanto no sangue como no baço, em cada uma das doses examinadas.
A análise de citocinas séricas demonstrou aumentos dose- dependentes para TNFa, IL-6 e MCP-1. O nível circulante destas citocinas permaneceu elevado, também em comparação a camundongos não tratados nas doses de 0,5 e 0,1 mg/kg. Aumentos discretos foram também observa- dos para IL-10 no grupo tratado com Campath-1HG8, nas três doses mais altas, mas somente para a dose mais alta no grupo tratado com 4B10-H1/K1 humanizado. Não foram notados aumentos significativos no nível circulante de IL-12 ou de IFNg (não mostrado).
Em 50 a 60 dias após a administração, com a exceção do grupo de 1,0 mg/kg, os níveis de linfócitos em todos os grupos administrados com Campath-1HO recuaram para os níveis de camundongos não tratados. No grupo de 1,0 mg/kg, os linfócitos retornaram para níveis normais em 80 dias após a administração. Cinética semelhante de repovoamento foi também observada para os camundongos tratados com o anticorpo humanizado 4B10-H1/K1. Os linfócitos recuaram para níveis de controle em 50 dias após a administração em todos os grupos tratados com 4B10-H1/K1, com a exce- ção do nível de 0,5 mg/kg. Os níveis de linfócitos circulantes no grupo de 0,5 mg/kg permaneceu diminuído durante todo o ciclo do período de monitora- ção. Linfócitos totais foram monitorados quanto ao repovoamento no san- que.
As Figuras 46A-46E mostram o nível de células T CD4+, células
T CD8+ e células B B220+ no sangue após 72 horas da administração de Campath-1H8 ("Campath") e de anticorpos humanizados 4B10-H1/K1 ("4B10"). As Figuras 47A-47E mostram o nível de células T CD4+, células T CDB8+ e células B B220+ no baço após 72 horas da administração de Cam- path-IH& ("Campath") e de anticorpos humanizados 4B10-H1/K1 ("4B10"). As Figuras 48A-48E mostram os níveis de citocinas circulantes após 2 horas da administração de Campath-1HO& ("Campath") e anticorpos humanizados 4B10-H1/K1 ("4B10"). As Figuras 49A-49B mostram o repovoamento de lin- fócitos circulantes sobre um período de tempo após administração com Campath-1H8& ("Campath") e anticorpos humanizados 4B10-H1/K1 ("4B10"). Exemplo 43: Análise de depleção e repovoamento de anticorpos anti-CD52 em camundongos transgênicos huCD52 (7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2) A atividade de depleção de anticorpos humanizados (7F11- Ú SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2) em diferentes níveis de dose foi examinada em camundongos transgênicos huCD52. Os camundongos foram injetados por via intravenosa com 0,1; 0,5; 1,0 e 5,0 mg/kg de cada anticorpo.
Duas horas após a administração, soro foi coletado para examinar o nível de citocinas circulantes.
Três dias após a administração, os camundongos foram sacrifi- cados, e sangue e baços foram coletados de cada camundongo (N = 5) para determinar o nível de depleção celular, usando análise por citometria de flu- ' xo.
Amostras foram avaliadas para determinar os números relativos de sub- populações de células T helper (CD4+), células T citotóxicas (CD8+), células B (B220+) e células mieloides totais, presentes no sangue periférico circu- lante ou no baço de camundongos transgênicos huCD52 Adicionalmente, foi realizada uma análise do subconjunto de células T e B para determinar o efeito global de depleção.
Um subconjunto de camundongos (N = 5) foi man- tido vivo para monitorar a cinética de repovoamento.
A administração de ca- da anticorpo humanizado 7F11 (7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2) em todas as doses resultou em depleção de um número significativo de células T e de célulasB no sangue.
Esses dados demonstraram também que vários sub- conjuntos de células T e B são depletados em graus variados, dependendo da dose usada de anticorpo.
Células T virgens (tanto CD4 como CD8) de-
monstraram a maior depleção, com outras populações celulares (incluindo células de memória e T reg) sendo depletadas em grau inferior. No compar- timento de células B, células B maduras foram depletadas mais rapidamente do que células B imaturas. No baço, depleção dose-dependente foi observa- da,comdepleção significativa de linfócitos observada nos níveis de dose de 5 e 1 mg/kg. Semelhantemente à situação no sangue, células T virgens fo- ram mais rapidamente depletadas do que células de memória. Células B foram depletadas em menor medida do que células T, com cada um dos clo- nes 7F11 humanizados (7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2). Depleção não foi - 10 observada para células NK ou neutrófilos no sangue ou no baço em quais- quer das doses injetadas. A análise de citocinas séricas demonstrou aumen- tos dose-dependentes para TNFa e IL-6. Os níveis destas citocinas perma- neceram elevados, quando também comparados a camundongos não trata- dos nas doses de 0,5 e 0,1 mg/kg. Aumentos dose-dependentes no nível de —MCP-1 circulante foram também notados.
Em 30 dias após a administração, os níveis de linfócitos nos grupos administrados com 0,1 e 0,1 mg/kg recuaram para os níveis de ca- mundongos não tratados. Nos grupos de 1,0 e 5,0 mg/kg, os linfócitos retor- naram para níveis normais em 50 e 80 dias, respectivamente, para o clone 7F11-SFD1/K2,e em 80 dias após a administração para os grupos de 1,0 e o de 5,0 mg/kg do clone 7F11-SFD2/K2. Linfócitos totais foram monitorados quanto ao repovoamento no sangue.
As Figuras 50A-50E mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+ no sangue após 72 horas da administração dos anticorpos humanizados 7F11-SFD1/K2 ("7F11 SFD1") e 7F11-SFD2/K2 ("7F11 SFD2"). As Figuras 51A-51E mostram o nível de células T CD4+, cé- lulas T CD8+ e células B B220+ no baço após 72 horas da administração dos anticorpos humanizados 7F11-SFD1/K2 ("'7F11 SFD1") e 7F11-SFD2/K2 ("7TF11 SFD2"). As Figuras 52A-52F mostram os níveis de citocinas circulan- tes após 2 horas da administração dos anticorpos humanizados 7F11- SFD1/K2 ("'7F11 SFD1") e 7F11-SFD2/K2 ("7F11 SFD2"). As Figuras 53A- 53B mostram o repovoamento de linfócitos circulantes sobre um período de
O ÔÔÔÔ RRRRRÚ NCCC, 176/222 tempo após administração com os anticorpos humanizados 7F11-SFD1/K2 ("7TF11 SFD1") e 7F11-SFD2/K2 ("7F11 SFD2”). Exemplo 44: Análise de anticorpos humanizados 7F11 anti-CD52 em ca- mundongos transgênicos para CD52 (7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2)
A atividade de depleção dos anticorpos quiméricos 7F11 e anti- corpos humanizados 7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2, em comparação a Campath-1HO, foi examinada no camundongo transgênico huCD52. Os ca- mundongos foram injetados por via intravenosa com 1,0 mg/kg de cada anti- corpo.
Três dias após a administração, os camundongos foram sacrificados,
Ne 10 esangue e baços foram coletados de cada camundongo (N = 5) para deter- minar o nível de depleção celular, usando análise por citometria de fluxo.
Amostras foram avaliadas para determinar os números relativos de subpopu- lações de células T helper (CD4+), células T citotóxicas (CD8+), células B
. (B220+) e células mieloides totais, presentes no sangue periférico circulante ou no baço de camundongos transgênicos huCD52. A administração de Campath-1HO resultou em depleção de um número significativo de células T e de células B no sangue e no baço.
Embora um nível comparável de deple- ção de células T fosse observado no sangue para o anticorpo quimérico e os humanizados 7F11 (7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2), as células B foram —depletadas em menor medida.
Essa observação foi também evidente no ba- $ O ço, onde depleção significativa de células T foi notada, mas somente nível modesto de depleção de células B foi alcançado com os anticorpos 7F11 (TF11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2). As Figuras 54A-54B mostram o nível de células T CD4+, células TCDB8+e células B B220+ no sangue após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Campath"), anticorpos quiméricos 7F11 e de anticorpos humanizados 7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2. Exemplo 45: Análise de Perfis PK de anticorpos anti-CD52 em camundongos transgênicos para CD52 (7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2) Visando assegurar que o processo de humanização não alteras- se a taxa de depuração do anticorpo, o perfil farmacocinético do anticorpo quimérico 7F11 anti-CD52 e dos anticorpos humanizados 7F11-SFD1/K2 e
7F11-SFD2/K2 anti-CD52 foi determinado em camundongos transgênicos huCD52. Os camundongos foram injetados por via intravenosa com anticor- pos a 5 mg/kg, e sangue foi coletado em vários momentos, iniciando duas horas após a administração. O nível circulante de cada anticorpo foi avalia- do, usando ELISA para anti-lgG humana. Para cada um dos clones humani- zados, houve uma ligeira diferença na Cmax, notada em 2 horas após a ad- ministração. As taxas de depuração para o anticorpo quimérico 7F11 e anti- corpos humanizados 7F11-SFD1/K2 e 7F11-SFD2/K2 foram semelhantes, bem como em relação ao Campath-1H8 no decorrer do experimento, indi- cando que o processo de humanização não alterou significativamente o perfil farmacocinético dos anticorpos.
A Figura 55 mostra o nível de Campath-1HO ("Campath"), de an- ticorpo quimérico 7F11 e de anticorpos humanizados 7F11-SFD1/K2 e 7F11- SFD2/K2 no sangue sobre um período de tempo após a administração.
Exemplo 46: Análise de depleção e repovoamento de anticorpos anti-CD52 em camundongos transgênicos hucD52 (2C3-SFD1/K12) A atividade de depleção do clone 2C3-SFD1/K12 em diferentes níveis de dose foi examinada no camundongo transgênico huCD52. Os ca- mundongos foram injetados por via intravenosa com 0,1; 0,5; 1,0 ou 5,0 mg/kg de anticorpo. Duas horas após a administração, soro foi coletado para e examinar potencialmente o nível de citocinas circulantes. Três dias após a administração, os camundongos foram sacrificados, e sangue e baços foram coletados de cada camundongo (N = 5) para determinar o nível de depleção celular, usando análise por citometria de fluxo. Amostras foram avaliadas para determinar os números relativos subpopulações de células T helper (CD4+), células T citotóxicas (CD8+), células B (B220+) e células mieloides totais, presentes no sangue periférico circulante ou no baço de camundon- gos transgênicos huCD52. Adicionalmente, foi realizada uma análise do subconjunto de células T e B para determinar o efeito global de depleção.
Um subconjunto de camundongos (N = 5) foi mantido vivo para monitorar a cinética de repovoamento. A administração de 2C3-SFD1/K12 nas doses de 5, 1 e 0,5 mg/kg resultou em depleção de um número significativo de células
T e de células B no sangue. Um nível variável de depleção de linfócitos foi observado no sangue na dose de 0,1 mg/kg, com células T CD4+ e células B sendo depletadas em maior medida do que células T CD8+. Esses dados demonstraram também que vários subconjuntos de células T e B são deple- tados em graus variados, dependendo da dose usada de anticorpo. Células T virgens (tanto CD4 como CD8) demonstraram a maior depleção, quando comparadas a outras populações celulares (incluindo células de memória e T reg), as quais foram depletadas em grau inferior. No compartimento de células B, células B maduras foram depletadas mais rapidamente do que e 10 células B imaturas. No baço, depleção dose-dependente foi observada com depleção significativa de linfócitos observada nos níveis de dose de 5 e 1 mg/kg. Semelhantemente ao Campath-1HO, células T virgens foram mais rapidamente depletadas do que células de memória. Depleção foi observada : para células NK e neutrófilos no sangue, mas pouca ou nenhuma depleção +15 foi observada no baço em quaisquer das doses injetadas. A análise de cito- cinas séricas demonstrou aumentos dose-dependentes para TNFa e para IL- 6, com a dose de 5 mg/kg induzindo o nível mais alto de cada citocina. NÍ- veis comparável aos de camundongos não tratados foram observados nos níveis de dose de 0,5 e 0,1 mg/kg, para TNFa, e no nível de dose de 0,1 mg/kg para lL-6. Aumentos dose-dependentes no nível de MCP-1 circulante foram também notados.
Em 30 dias após a administração, os níveis de linfócitos para os grupos de 0,1 e 0,5 mg/kg recuaram para os níveis de camundongos não tratados. Nos grupos de 1,0 e 5,0 mg/kg, os linfócitos retornaram a níveis normais em 80 dias após a administração. Linfócitos totais foram monitora- dos quanto ao repovoamento no sangue.
As Figuras 56A-56E mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+ e células B B220 no sangue após 72 horas da administração de an- ticorpos 2C3-SFD1/K12. As Figuras 57A-57E mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+ no baço após 72 horas da admi- nistração de anticorpos 2C3-SFD1/K12. As Figuras 58A-58F mostram os níveis de citocinas circulantes após 2 horas da administração de anticorpos
2C3-SFD1/K12. A Figura 59 mostra o repovoamento de linfócitos circulantes sobre um período de tempo após administração com anticorpos 2C3- SFD1/K12. Exemplo 47: Análise de depleção e repovoamento de anticorpos anti-CD52 emcamundongos transgênicos hucD52 (12G6-SFD1/K11) A atividade de depleção do clone 12G6-SFD1/K11 em diferentes níveis de dose foi examinada no camundongo transgênico huCD52. Os ca- mundongos foram injetados por via intravenosa com 0,1; 0,5; 1,0 ou 5,0 mg/kg de anticorpo. Duas horas após a administração, soro foi coletado para : 10 potencialmente examinar o nível de citocinas circulantes. Três dias após a administração, os camundongos foram sacrificados, e sangue e baços foram coletados de cada camundongo (N = 5) para determinar o nível de depleção celular, usando análise por citometria de fluxo. Amostras foram avaliadas 1 para determinar os números relativos de subpopulações de célula T helper (CD4+), células T citotóxicas (CD8+), células B (B220+) e células mieloides totais, presentes no sangue periférico circulante ou no baço de camundon- gos transgênicos huCD52. Adicionalmente, foi realizada uma análise do subconjunto de células T e B para determinar o efeito global de depleção.
Um subconjunto de camundongos (N = 5) foi mantido vivo para monitorar a cinética de repovoamento. A administração de 12G6-SFD1/K11 nas doses o | de 5, 1 e 0,5 mg/kg resultou em depleção de um número significativo de cé- lulas T e de células B no sangue. Um nível variável de depleção de linfócitos foi observado no sangue na dose de 0,1 mg/kg, com células T CD4+ e célu- las B sendo depletadas em maior medida do que células T CD8+. Esses da- dos demonstraram também que vários subconjuntos de células T e B são depletados em graus variados, dependendo da dose usada de anticorpo. Células T virgens (tanto CD4 como CD8) demonstraram a maior depleção, quando comparadas a outras populações celulares (incluindo células de memória e T reg), as quais foram depletadas em grau inferior. No comparti- mento de células B, células B maduras foram depletadas mais rapidamente do que células B imaturas. No baço, depleção dose-dependente foi observa- da com depleção significativa de linfócitos observada nos níveis de dose de e 1 mg/kg.
Semelhantemente ao Campath-1HG8, células T virgens foram mais rapidamente depletadas do que células de memória.
Depleção foi ob- servada para células NK e neutrófilos no sangue, mas pouco a nenhuma depleção foi observada no baço em quaisquer das doses injetadas.
A análi- 5 sede citocinas séricas demonstrou aumentos dose-dependentes para TNFa e IL-6, com a dose de 5 mg/kg induzindo o nível mais alto de cada citocina.
Níveis comparáveis aos de camundongos não tratados foram observados nos níveis de dose de 0,5 e 0,1 mg/kg, para TNFa, e no nível de dose de 0,1 mg/kg para IL-6. Aumentos dose-dependentes no nível de MCP-1 circulante foramtambém notados.
Em 30 dias após a administração, os níveis de linfócitos recua- ram para os níveis de camundongos não tratados.
Nos grupos de 1,0 e 5,0 mg/kg, os linfócitos retornaram para níveis normais em 80 dias após a admi- Pr nistração.
Linfócitos totais foram monitorados quanto ao repovoamento no 4P sangue.
As Figuras 60A-60E mostram o nível de células T CD4+, células T CDB8+ e células B B220+ no sangue após 72 horas da administração de anticorpos 12G6-SFD1/K11. As Figuras 61A-61E mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+ no baço após 72 horas da admi- nistração de anticorpos 12G6-SFD1/K11. As Figuras 62A-62F mostram os níveis de citocinas circulantes após 2 horas da administração de anticorpos 12G6-SFD1/K11 ("12G6 hu"). A Figura 63 mostra o repovoamento de linfóci- tos circulantes sobre um período de tempo após administração com anticor- pos 12G6-SFD1/K11. Exemplo 48: Análise de perfil PK de anticorpos anti-CD52 em camundongos transgênicos para CD52 (2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11 e 9D9-H10/K12) Os perfis farmacocinéticos de anticorpos anti-CD52 foram de- " terminados em camundongos transgênicos huCD52. Este experimento com- « parou a forma quimérica e a humanizada dos anticorpos para assegurar que o processode humanização não alterava a taxa de depuração dos anticor- pos.
As comparações incluíram os anticorpos quiméricos 2C3, 12G6 e 9D9 e os anticorpos humanizados 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1I/K11 e 9D9-
H10/K12. Os camundongos foram injetados por via iv com anticorpos em dose de 5 mg/kg, e sangue foi coletado em vários momentos, iniciando duas horas após a administração.
Os níveis circulantes de cada anticorpo foram avaliados, usando ELISA para anti-lgG humana.
Para cada par do anticorpo quimérico/humanizado, houve uma ligeira diferença na Cmax notada em 2 horas após a administração.
Para os anticorpos 2C3 e 12G6, a Cmax da versão humanizada (ou seja, 20C3-SFD1/K12 e 12G6-SFD1/K11) foi ligeira- mente mais alta, enquanto a versão quimérica foi ligeiramente mais alta para o par de 9D9. As taxas de depuração para os pares de anticorpos foram se- melhantes sobre o período do experimento, indicando que o processo de humanização não alterou significativamente o perfil farmacocinético dos an- ticorpos.
As Figuras 64A-64C mostram o nível de anticorpos quiméricos ] 2C3, 2C3-SFD1/K12, quimérico 12G6, 12G6-SFD1/K11, quimérico 9D9 e 45 9D9-H10/K12 no sangue sobre um período de tempo após a administração.
Exemplo 49: Análise de depleção e repovoamento de anticorpos anti-CD52 em camundongos transgênicos huCD52 (9D9-H10/K12) A atividade de depleção do clone 9D9-H10/K12 em diferentes níveis de dose foi examinada no camundongo transgênico huCD52. Os ca- —“mundongos foram injetados por via intravenosa com 0,1; 0,5; 1,0 ou 5,0 mg/kg de anticorpo.
Duas horas após a administração, soro foi coletado para potencialmente examinar o nível de citocinas circulantes.
Três dias após a administração, os camundongos foram sacrificados, e sangue e baços foram coletados de cada camundongo (N = 5) para determinar o nível de depleção celular, usando análise por citometria de fluxo.
Amostras foram avaliadas para determinar os números relativos de subpopulações de célula T helper (CD4+), células T citotóxicas (CD8+), células B (B220+) e células mieloides í totais, presentes no sangue periférico circulante ou no baço de camundon- & gos transgênicos huCD52. Adicionalmente, foi realizada uma análise do — subconjunto de células T e B para determinar o efeito global de depleção.
Um subconjunto de camundongos (N = 5) foi mantido vivo para monitorar a cinética de repovoamento.
A administração de 9D9-H10/K12 nas doses de 5,
1 e 0,5 mg/kg resultou em depleção de um número significativo de células T e células B no sangue.
Somente um nível modesto de depleção de linfócitos foi observado no sangue na dose de 0,1 mg/kg.
Esses dados demonstraram também que vários subconjuntos de células T e B são depletados em graus variados, dependendo da dose usada de anticorpo.
Células T virgens (tanto CD4 como CD8) demonstraram a maior depleção, quando comparadas a outras populações celulares (incluindo células de memória e T reg), as quais foram depletadas em grau inferior.
No compartimento de células B, células B maduras foram depletadas mais rapidamente do que células B imaturas.
No baço, depleção significativa destas células foi observada somente nos níveis de dose de 5 e 1 mg/kg.
Semelhantemente ao Campath-1HG, células T vir- gens foram mais rapidamente depletadas do que células de memória.
De- pleção foi observada para células NK e neutrófilos no sangue, mas pouca ou á nenhuma depleção foi observada no baço em quaisquer das doses injeta- das A análise de citocinas séricas não demonstrou aumentos significativos para TNFa ou IL-6 em quaisquer dos níveis de dose testados.
Aumentos dose-dependentes no nível de MCP-1 circulante, foram, contudo, notados.
A parte de repovoamento deste experimento foi encerrada pre- cocemente, quando linfócitos foram repovoados em 50 - 80% (dependendo dadose). O repovoamento de linfócitos foi monitorado com base em conta- gens de linfócitos totais e não de células Te B.
As Figuras 65A-65E mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+ no sangue após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H10/K12 ("9D9"). As Figuras 66A-66E mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+ no baço após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H10/K12 ("9D9"). As Figuras -67F mos- tram os níveis de citocinas circulantes após 2 horas da administração de an- , ticorpos 9D9-H10/K12 ("9D9"). A Figura 68 mostra o repovoamento de linfó- P citos circulantes sobre um período de tempo após administração com anti- corpos 9D9-H10/K12 ("9D9"). Exemplo 50: Análise de depleção e repovoamento de anticorpos anti-CD52 em camundongos transgênicos hucD52 (2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11 and 9D9-H10/K12)
A atividade de depleção de Campath-1H8 e dos clones humani- zados 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11 e 9D9-H10/K12 em diferentes níveis de dose foi examinada no camundongo transgênico huCD52. Os camundon-
gos foram injetados por via intravenosa com 0,1 ou 1,0 mg/kg de anticorpo.
Duas horas após a administração, soro foi coletado para potencialmente e- xaminar o nível de citocinas circulantes.
Três dias após a administração, os camundongos foram sacrificados, e sangue e baços foram coletados de ca- da camundongo para determinar o nível de depleção celular, usando análise por citometria de fluxo.
Amostras foram avaliadas para determinar os núme- ros relativos de subpopulações de células T helper (CD4+), células T citotó-
xicas (CD8+), células B (B220+) e células mieloides totais, presentes no sangue periférico circulante ou no baço de camundongos transgênicos
' huCD52. Adicionalmente, foi realizada uma análise do subconjunto de célu- lasTeB para determinar o efeito global de depleção.
Todos os anticorpos humanizados (2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11 e 9D9-H10/K12) mediaram depleção de linfócitos no baço e sangue, quando comparados com animais tratados com PBS.
A depleção foi mais robusta no sangue do que no baço para todos os anticorpos, e ocorreu de modo dose-dependente em ambos os tecidos.
A depleção foi mais drástica para células T CD4 e CD8+, com me- nos depleção no compartimento de células B.
Vários subconjuntos de célu-
las T e B foram depletadas em graus variados.
Células T virgens (tanto CD4 como CD8) demonstraram a maior depleção, quando comparadas a outras populações celulares (incluindo células de memória e T reg), as quais foram
—depletadas em grau inferior.
No compartimento de células B, células B ma- duras foram depletadas mais rapidamente do que células B imaturas.
A aná-
lise de citocinas séricas revelou aumentos significativos no nível de IL-6,
; MCP-1 e TNFa, após 2 horas da administração.
Aumentos foram notados . para todos os anticorpos, incluindo Campath-1HO, e dose-dependentes (ou seja, níveis mais altos de citocinas foram observados para o nível de dose de 1,0 mg/kg do que para a dose de 0,1 mg/kg). Em comparação ao Campa- th-1HO, 20C3-SFD1/K12 e 12G6-SFD1/K11 induziram níveis semelhantes de
I1L-6, enquanto 9D9-H10/K12 induziu IL-6 em grau significativamente menor. Para MCP-1, o anticorpo 12G6-SFD1/K11 induziu níveis mais baixo, e tanto 12G6-SFD1/K11 como 9D9-H10/K12 diminuíram os níveis de TNFa, quando comparados a Campath-1H€.
As Figuras 69A-69D mostram o nível de populações de linfócitos em massa (Células T CD4+, células T CD8+ e células B) e de subtipos de células T CD4+, células T CD8+ e células B220+ B/NK no sangue após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Campath") e de anticorpos 2C3- SFD1/K12 ("203"), 12G6-SFD1/K11 ("12G6") e 9D9-H10/K12 ("9D9"). As Figuras 70A-70D mostram o nível de populações de linfócito em massa (Cé- lulas T CD4+, células T CD8+ e células B) e de subtipos de células T CD4+, células T CD8+ e células B220+ B/NK no baço após 72 horas da administra- ção de Campath-1H8O ("Campath") e de anticorpos 2C3-SFD1/K12 ("2C3"), ' 12G6-SFD1/K11 (12G6") e 9D9-H10/K12 ("9D9"). As Figuras 71A-71F mos- tram os níveis de citocinas circulantes após 2 horas da administração de Campath-1H8 e de anticorpos 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11 e 9D9- H10/K12. Exemplo 51: Comparação direta de clones humanizados 9D9 anti-huCD52 em camundongos transgênicos huCD52 (9D9 H10/K12 e 9D9 H11/K12) A atividade de depleção de dois clones humanizados 9D9 anti- CD52 (9D9-H10/K12 e 9D9-H11/K12) foi examinada em camundongos transgênicos huCD52. Os camundongos foram injetados por via intravenosa com 0,1 ou 1,0 mg/kg de anticorpo. Três dias após a administração, os ca- mundongos foram sacrificados, e sangue e baços foram coletados de cada camundongo para determinar o nível de depleção celular, usando análise por citometria de fluxo. Amostras foram avaliadas para determinar os núme- ros relativos de subpopulações de células T helper (CD4+), células T citotó- . xicas (CD8+), células B (B2200+) e células NK totais, presentes no sangue periférico circulante ou no baço de camundongos transgênicos huCD52. O tratamento com qualquer um dos anticorpos resultou em depleção seme- lhante de linfócitos no sangue e baço, com a depleção de linfócitos no san- gue sendo mais robusta. Adicionalmente, células T CD4 e células T CD8+ foram mais fortemente depletadas do que células B e células NK nos dois tecidos. Embora a depleção com o clone 9D9-H10/K12 pareça mais robusta do que a depleção com o clone 9D9-H11/K12, a diferença não é estatistica- mente significativa.
A Figura 72 mostra o nível de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e células NK no sangue após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H10/K12 e 9D9-H11/K12. A Figura 73 mostra o nível de célu- las T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e células NK no baço após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H10/K12 e 9D9-H11/K12.
Exemplo 52: Comparação direta de clones humanizados 12G6 anti-huCD52 em camundongos transgênicos hucD52 (12G6-SFD1/K11 e 12G6-SFD1- K12) A atividade de depleção de dois clones 12G6 humanizados anti- Á CD52 (12G6-SFD1/K11 e 12G6-SFD1/K12) foi examinada no camundongo transgênico huCD52. Os camundongos foram injetados por via intravenosa com 0,1 ou 1,0 mg/kg de anticorpo. Duas horas após a administração, soro foi coletado para potencialmente examinar o nível de citocinas circulantes. Três dias após a administração, os camundongos foram sacrificados, e san- gue e baços foram coletados de cada camundongo para determinar o nível de depleção celular, usando análise por citometria de fluxo. Amostras foram avaliadas para determinar os números relativos de subpopulações de células T helper (CD4+), células T citotóxicas (CD8+), células B (B220+) e células mieloides totais, presentes no sangue periférico circulante ou no baço de camundongos transgênicos huCD52. Adicionalmente, foi realizada uma aná- lisedo subconjunto de células T e B para determinar o efeito global de de- pleção. A administração do anticorpo 12G6-SFD1/K11 ou do anticorpo 12G6-SFD1/K12 resultou em nível significativo de depleção de linfócitos no : sangue. Aparentemente, houve pouca a nenhuma diferença na atividade de S depleção de linfócitos dos dois clones. O padrão de depleção de linfócitos foi tal que células T CD4 virgens e células T CD8+ foram depletadas em grau mais alto do que células T de memória ou células Treg. As populações de células mieloides foram depletadas em menor grau, independentemente do clone (12G6-SFD1/K11 ou 12G6-SFD1/K12) ou da dose. A análise de citoci- nas séricas não foi realizada para este experimento. As Figuras 74A-74D mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ /NK e células mieloides no sangue após 72 horas da administração de anticorpos 12G6-SFD1/K11 ("12G6 K11") e 12G6- SFD1/K12 ("12G6 K12"). As Figuras 75A-75D mostram o nível de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+/NK e células mieloides no baço a- pós 72 horas da administração de anticorpos 12G6-SFD1/K11 ("12G6 K11") e 12G6-SFD1/K12 ("12G6 K12").
Exemplo 53: Comparação direta de clones humanizados 9D9 de anti- hucD52 em camundongos transgênicos hucD52 (9D9 H11/K12, 9D9 H16/K13 e 9D9 H18/K13) A atividade de depleção de três anticorpos humanizados 9D9 " (9D9-H11/K12, 9D9-H16/K13, and 9D9-H18/K13) foi comparada no camun- dongo transgênico huCD52. Camundongos transgênicos para CD52 humana foram tratados com PBS, como controle por veículo, e com 1 mg/kg ou 0,1mg/kg de cada anticorpo. Em duas horas após a administração, soro foi coletado para determinar o nível de citocinas circulantes. Três dias mais tar- de, os camundongos foram sacrificados, e sangue periférico e o baço foram coletados e processados para análise por citometria de fluxo. Amostras fo- ram avaliadas para determinar os números relativos subpopulações de célu- la T helper (CD4+), células T citotóxicas (CD8+), células B (B220+) e células mieloides totais, presentes no sangue periférico circulante ou no baço de camundongo transgênicos huCD52. Adicionalmente, foi realizada uma análi- sedo subconjunto de células T e B para determinar o efeito global de deple- ção. Todos os anticorpos 9D9 (9D9-H11/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13) mediaram depleção celular de populações de linfócitos e de células mieloi- í des no sangue e baço em medida semelhante. A depleção observada de . linfócitos e de células mieloides foi mais robusta no sangue do que no baço.
A comparação da atividade de depleção dos clones 9D9 (9D9-H11/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13) demonstrou que 9D9-H16/K13 resultou na depleção mais robusta, seguido por 9D9-H18/K13 e 9D9-H11/K12. Isso foi mais evidente para linfócitos no baço, na dose de 1 mg/kg na qual o trata- mento com 9D9-H16/K13 resultou em grau mais alto de depleção do que com qualquer um dos outros clones (9D9-H18/K13 e 9D9-H11/K12). Além disso, o padrão de depleção foi tal que células T CD4 virgem e CD8+ foram — depletadas em grau mais alto do que células T de memória ou células Treg, e populações de células B foram depletadas em grau mais alto com 9D9- H16/K13. Populações de células mieloides foram menos afetadas pelo tra- tamento anti-CD52, independentemente do clone de anticorpo (9D9- H11/K12, 9D9-H16/K13 ou 9D9-H18/K13) da dose. Das citocinas analisadas, aumentos foram notados em IL-6, TNFa e MCP-1. Após a injeção, níveis circulantes semelhantes de I1L-6 e MCP-1 foram observados para todos os clones 9D9 (9D9-H11/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13), no nível de dose de 0,1 e no de 1,0 mg/kg. Ligeiras diferenças foram observadas com níveis : circulantes de TNFa, em que a injeção do clone 9D9-H16/K13 resultou em aumento modesto na dose de 1,0 mg/kg. A Figura 76 mostra o nível de populações de linfócitos em mas- sa (Células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+) no sangue após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H11/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9- H18/K13. As Figuras 77A-77D mostram o nível de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B, B220+/NK e células mieloides no sangue após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H11/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13. A Figura 78 mostra o nível de populações de linfócitos em massa (Células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+) no baço após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H11/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13. As Figuras 79A-79D mostram o nível de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B, B220+/NK e células mieloides no baço após 72 horas da administração de anticorpos 9D9-H11/K12, 9D9-H16/K13 ' e 9D9-H18/K13. As Figuras 80A-80F mostram os níveis de citocinas circu- x lantes após 2 horas da administração de anticorpos 9D9-H11/K12, 9D9- H1I6/K13e9D9I-H18/K13.
Exemplo 54: Análise de perfil PK de anticorpos anti-CD52 das famílias 2C3 12G6 e 9D9 em camundongos transgênicos para CD52
Os perfis farmacocinéticos de 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13 humanizados foram deter- minados em camundongos transgênicos huCD52. Os camundongos foram injetados por iv com anticorpos em dose de 1mg/Kkg, e sangue foi coletado em vários momentos, iniciado duas horas após a administração. Os níveis circulantes de cada anticorpo foram avaliados usando ELISA para anti-lg humana. A meia-vida calculada foi: 203-SFD1/K12 79,0 + 23,9 horas, 12G6- SFD1/K11 49,0 + 14,4 horas, 12G6-SFD1/K12 75,1 + 28,5, 9D9-H16/K13 59,8 + 26,6 horas and 9D9-H18/K13 42,2 + 15,7 horas.
No geral, houve uma variabilidade interanimal significativa para exposição nestes estudos. A meia-vida terminal de eliminação de 2C3- SFD1/K12 e 12G6-SFD1/K12 foi semelhante, enquanto a meia-vida de 12G6-SFD1/K11 foi mais curta, mas não significativamente diferente. A de- ' puração (clearance) foi mais rápido 2C3-SFD1/K12, seguido por 12G6- SFD1I/K11 e 12G6-SFD1/K12. Os dois tratamentos com 12G6 refletiram um ao outro na maioria dos momentos medidos, enquanto 2C3-SFD1/K12 mos- trou menos exposição e depuração mais rápida. 9D9-H16/K13 e 9D9- H18/K13 foram bem semelhantes para todos os parâmetros PK medidos.
As Figuras 81A-81B mostram o nível de anticorpos 2C3- SFD1I/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/ K13 no sangue sobre um período de tempo após a administração.
Tabela 16 PK Ki2 KM K12 K13 K13 ugi/m! Exemplo 55: Avaliação de tempestade (storm) de citocinas em resposta a ” tratamento com anticorpos anti-CD52 A liberação de citocinas séricas após tratamento com anticorpos anti-CD52 foi avaliada em camundongos transgênicos huCD52. Os animais foram tratados com 1 mg/kg de Campath-1H6, 12G6-SFD1/K11, 12G6-
SFD1/K12, 9D9-H16/K13 ou 9D9-H18/K13. Um grupo de animais foi tratado com 5 mg/kg de 2C3-SFD1/K12 em vista de resultados prévios indicando que a injeção com 2C3-SFD1/K12 pode resultar em níveis mais baixos de depleção, quando comparado a os outros anticorpos, normalizando com isso os gruposcom base na dose necessária para alcançar níveis semelhantes de depleção. Todos os grupos foram sangrados depois de 1 2, 4, 24 e 48 horas do tratamento, e análise por CBA para citocinas inflamatórias foi con- duzida. Todos os grupos foram também sacrificados 3 dias após o tratamen- to, e os baços foram avaliados quanto à depleção de linfócitos por citometria defluxo. O tratamento com cada um dos anticorpos resultou em depleção de vários alvos, semelhante àquela observada para Campath-1H8. Isso foi também verdadeiro para 2C3-SFD1/K12, em que uma dose 5 mg/kg foi utili- zada para provocar depleção semelhante. Alguma variabilidade em depleção À foi observada com 12G6-SFD1/K12 e 9D9-H16/K13, mais possivelmente causada pelo sangramento repetido dos animais para obter soro para análi- se de citocinas. A expressão de citocinas, no entanto, foi menor para anti- corpos dos membros das famílias 12G6 (12G6-SFD1I/K1I1 e 12G6- SFD1/K12) e 9D9 (9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13). Esse achado foi mais a- centuado para liberação de IL-6, MCP-1 e TNFa nos momentos iniciais de 1 e2horas.
As Figuras 82A-82F mostram o nível de citocinas no sangue so- bre um período de 48 horas, após a administração de Campath-1H8& ("Cam- path") ou anticorpos 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 ou 9D9-H18/K13. As Figuras 83A-83E mostram o nível de linfócitos em massa, células T CD4+, células T CD8+, células B B220+/NK e células mieloides no baço após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Campath") ou anti- corpos 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 ou 9D9-H18/K13.
' Exemplo 56: Avaliação da cinética de repovoamento no sangue de camun- - dongo transgênico para CD52 após tratamento com anticorpos anti-CD52 A cinética de repovoamento de vários tipos de células foi avalia- da após administração de dos anticorpos humanizados 2C3-SFD1/K12, 9D9- H16/K13 e 12G6-SFD1/K12 anti-CD52. Os camundongos foram injetados por via iv com cada anticorpo, em dose de 2 mg/kg, para assegurar nível robusto de depleção.
Em vários momentos após a injeção, o sangue foi cole- tado para análise por citometria de fluxo, visando determinar o nível de linfó- citos circulantes no sangue, incluindo células CD4+ e células T CD8+, célu- lasT reguladoras, células B, células NK, neutrófilos e macrófagos.
Não fo- ram observadas diferenças na atividade inicial de depleção para cada anti- corpo, o que foi confirmado no Dia 3 após a injeção.
Os camundongos foram sangrados semanalmente durante o primeiro mês e a cada duas semanas, posteriormente, para monitorar a cinética de repovoamento.
A cinética do repovoamento de linfócitos foi semelhante para qualquer dos anticorpos anti- CD52 (2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12), quando compara- dos a Campath-1HG.
No Dia 57, as células B retornaram ao basal no san- gue, enquanto as células T se aproximaram de níveis basais no Dia 84. No ' Dia 116, as células T CD8+ não retornaram a níveis de controle, mas cinéti- casemelhante de repovoamento para todos os outros tipos de células moni- torados foi observada com cada um dos anticorpos anti-CD52 (2C3- SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12) e Campath-1H8. As Figuras 84A-B4G mostram o repovoamento de células T CD4+ e CD8+ circulantes, células T reguladoras, células B, células NK, neu- trófilos e macrófagos sobre um período de tempo após a administração de Campath-1H6 ("Campath") e dos anticorpos 2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12. Exemplo 57: Avaliação de expressão de CD52 em camundongos transgêni- cos para CD52 usando os anticorpos anti-CD52 A expressão de huCD52 foi avaliada usando os anticorpos hu- manizados para determinar se padrões semelhantes de coloração poderiam ser observados sobre populações celulares maduras e em desenvolvimento em camundongos transgênicos huCD52. Os anticorpos 2C3-SFD1/K12, . 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13 foram con- —jugados com FITC para uso em coloração para citometria de fluxo.
Tecidos de camundongos transgênicos huCD52 foram coletados e processados para coloração.
Os anticorpos 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12,
9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13 coraram linfócitos expressando huCD52 do baço de camundongos transgênicos, de modo semelhante ao Campath-1H€O.
Os padrões de coloração foram representativos das populações de linfócitos e subconjuntos encontrados em outros órgãos linfoides, como o timo e a me- dulaóssea.
A Figura 85 mostra a capacidade de Campath-1H8 e dos anti- corpos 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13 marcados com FITC se ligarem especificamente a huCD52 em populações celulares de linfócitos no baço.
Exemplo 58: Comparação direta de tratamento de dose única com anti- huCD52 em camundongos transgênicos huCD52 A atividade de depleção de vários anticorpos humanizados anti- CD52 (2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e ' 9D9-H18/K13) foi comparada no camundongo transgênico.
Os camundon- gos foram injetados por via iv com anticorpos na dose de 1 mg/kg.
Em 2 ho- ras após a administração, soro foi coletado para análise de citocinas.
Três dias mais tarde, os camundongos foram sacrificados, e sangue e o baço fo- ram coletados para comparar o nível de depleção de linfócitos.
Níveis signifi- cativos de depleção de células B e T foram observados para todos os anti- corpos anti-CD52 (2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9- H16/K13 e 9D9-H18/K13) e foram comparáveis àqueles observados após administração de Campath-1H6O.
A análise de subconjuntos não revelou também diferenças significativas no nível de depleção para cada anticorpo (2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9- H1I8/K13), no sangue ou no baço.
Após injeção de Campath-1HO, houve aumento acentuado nos níveis circulantes de IL-6 e TNFa.
Embora a injeção de cada um dos anticorpos anti-CD52 (2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13) resultassem em diminuição . significativa no nível de TNFa, quando comparados a Campath-1HG8, os ní- veisdell-6foram semelhantes.
As Figuras 86A-86E mostram o nível de populações de linfócito em massa (Células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+) e de subti-
pos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+/NK e células mie- loides no sangue após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Cam- path") e anticorpos 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9- H16/K13 e 9D9-H18/K13. As Figuras 87A-87E mostram o nível de popula- ções de linfócito em massa (Células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+) e de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+/NK e células mieloides no baço após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Campath") e anticorpos 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13. As Figuras 88A-88C mos- tram os níveis de citocinas circulantes após 2 horas da administração de Campath-1HO ("Campath") e anticorpos 2C3-SFD1/K12, 12G6-SFD1/K11, 12G6-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 9D9-H18/K13. Exemplo 59: Depleção profunda de linfócitos em camundongos transgênicos para huCD52 após tratamento com dose única com anticorpos anti-huCD52 Ás A análise extensa de depleção foi realizada no camundongo transgênico huCD52, usando anticorpos anti-CD52 2C3-SFD1/K12, 9D9- H16/K13 e 12G6-SFD1/K12. Camundongos (N = 4) foram injetados por iv com uma dose única de cada anticorpo a 1 mg/kg.
Três dias mais tarde, os camundongos foram sacrificados, e sangue, baço, linfonodos e timo foram coletados para comparar o nível de depleção de linfócitos, usando análise multicolorida por citometria de fluxo.
Níveis significativos de depleção de cé- lulas B e T foram observados para todos os anticorpos anti-CD52, 2C3- SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12, e foram comparáveis àqueles observados após administração de Campath1HO em cada tecido examina- do.
A análisede subconjuntos não revelou também diferenças significativas no sangue ou no baço.
Níveis significativos de depleção de linfócitos foram também observados nos linfonodos de camundongos.
Pareceu, no entanto, R haver alguma variabilidade na atividade do anticorpo, especialmente quando . investigado o subconjunto de células T de memória frontal e efetoras.
Devido a questões técnicas referentes ao LSR-ll e o corante CD8, o timo não pôde ser avaliado.
As Figuras 89A-89D mostram o nível de subtipos de células T
CD4+, células T CD8+, células B B220+, e células NK/ mieloides no sangue após 72 horas da administração de Campath-1HO ("Campath") e de anticor- pos 2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12. As Figuras 90A-90D mostram o nível de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B — B220+, e células NK/ mieloides no baço após 72 horas da administração de Campath-1H& ("Campath") e de anticorpos 2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 and 12G6-SFD1/K12. As Figuras 91A-91D mostram o nível de subtipos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+, e células NK/ mieloides no linfonodo após 72 horas da administração de Campath-1H8 ("Campath") ede anticorpos 2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12. Exemplo 60: Criação e avaliação do camundongo transgênico huCD52 Knock-in/Knock-out (KVKO) em antecedentes de C57BL/6 Um novo modelo de camundongo com knock-in (expressão di- minuída)/knock-out (expressão desabilitada) de CD52 foi criado sobre os antecedentes de C57BI/6. Para criar este camundongo, a sequência do gene de CD52 do camundongo foi substituída pela sequência do gene da CD52 humana.
A estratégia direcionada permitiu a substituição da sequência do camundongo pela sequência humana, enquanto era mantida a estrutura e- xon-intron.
Um marcador de seleção foi usado para identificar progênie con- tendo a nova sequência de gene.
O alelo final foi criado pela retirada do marcador de seleção, deixando somente a sequência do gene da CD52 hu- mana.
A caracterização básica do modelo de camundongo huCD52 KI/KO envolveu determinar o nível de expressão de CD52 humana em linfó- citos.
Sangue de camundongos transgênicos huCD52-KI/KO (N = 4) e de camundongos C57BL/6 (N = 2) foram corados para expressão de hCD52, e o número de moléculas de CD52/célula foi enumerado usando o ensaio de ' anticorpo anti-humano Simply Cellular do laboratório Bang.
A coloração de DB células do sangue periférico de camundongos transgênicos huCD52-KI/KO demonstrou que a expressão de huCD52 é muito alta na maioria dos linfóci- tos destes animais.
Os níveis de expressão foram semelhantes àqueles ob- servados em populações de células CD4, CD8 e B humanas.
Os níveis de expressão em células NK e macrófagos foram mais baixos do que os obser- vados para células T e células B. Nível aumentado de expressão de hucCD52 foi detectado em neutrófilos nestes camundongos, ao contrário do nível di- minuído de expressão em neutrófilos humanos ou de células semelhantes dalinhagem original do camundongo transgênico sobre os antecedentes de CD-1. Níveis semelhantes de expressão de CD52 foram observados em cé- lulas T e células B do camundongo transgênico huCD52 CD1 original e o camundongo huCD52 KI/KlI.
A Figura 92A mostra o nível de expressão de huCD52 em subti- pos de células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e células NK/células mieloides em camundongos transgênicos huCD52-KI/KO e não transgênicos de controle. A Figura 92B mostra o nível de expressão de huCD52 em células T CD4+, células T CD8+ e células B em camundongos ' transgênicos huCD52-KI/KO e hucD52 CD1. Exemplo 61: Comparação direta de características de depleção entre lotes em pequena e grande escala de 12G6 e 2C3 Camundongos transgênicos huCD52 KI/KO foram administrados com 12G6-SFD1/K12 ou 2C3-SFD1/K12 para determinar a atividade de de- pleção. Adicionalmente, a atividade foi examinada usando anticorpos gera- dosde duas diferentes fontes (lotes em pequena escala e em grande escala) na Genzyme. Os camundongos foram injetados por iv com cada anticorpo em dose de 1 mg/kg. Três dias após a injeção, os camundongos foram sacri- ficados, e o sangue foi coletado para análise por citometria de fluxo para de- terminar os níveis circulantes de células T CD4+ e células T CD8+, células BB, células NK, neutrófilos e macrófagos. Não foram observadas diferenças significativas em deleção de células T CD4, células T CD8+, células B e cé- lulas NK entre os anticorpos derivados de lote em pequena escala e em : grande escala.
. Os vários lotes de anticorpos 12G6-SFD1/K12 e 2C3-SFD1/K12 foram avaliados também por citometria de fluxo para comparar a intensidade de coloração em esplenócitos de camundongos transgênicos huCD52- KI/KO. Os dois anticorpos, 12G6-SFD1/K12 e 2C3-SFD1/K12, parecem re-
conhecer CD52 humana na mesma medida que Campath-1H8 em esplenó- citos isolados. Adicionalmente, não houve diferença no nível de reconheci- mento entre as duas fontes (lotes em pequena escala e em grande escala) de anticorpo.
As Figuras 93A-93B mostram a ligação a huCD52 de anticorpos 12G6-SFD1/K12 e 2C3-SFD1/K12 (de várias fontes de produção), quando comparados a Campath-1HQ8 de controle. A Figura 94 mostra o nível de po- pulações de linfócitos em massa (Células T CD4+, células T CD8+ e células B B220+) no sangue após 72 horas da administração de anticorpos 12G6- SFD1I/K12 e2C3-SFD1/K12 de várias fontes de produção. Exemplo 62: Análise de perfil PK de anticorpos anti-CD52 em camundongos transgênicos hucD52-KI/KO Os perfis farmacocinéticos de anticorpos humanizados 2C3- SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12 foram determinados em ca- —mundongos transgênicos hucD52 KI/KO. Os camundongos foram injetados por via iv com anticorpos em dose de 1mg/Kkg, o sangue tendo sido coletado em vários momentos, iniciando duas horas a administração. Os níveis circu- lantes de cada anticorpo foram avaliados usando ELISA anti-lg humana. A taxa global de depuração foi semelhante para cada um dos anticorpos. hu- —manizados anti-CD52 2C3-SFD1/K12, 9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12, com 2C3-SFD1/K12 exibindo cinética potencialmente mais rápida, enquanto 12G6-SFD1/K12 permaneceu presente no soro pelo período de tempo mais longo. As Figuras 95A-95B mostram os níveis de anticorpos 2C3- SFD1I/K12,9D9-H16/K13 e 12G6-SFD1/K12 no sangue sobre um período de tempo após a administração. Exemplo 63: Avaliação de pré-tratamento com 12G6 e 2C3 em EAE em ca- i mundongos transgênicos hucD52-KV/KO - A eficácia do tratamento com anticorpo anti-CD52 em reduzir a incidência global e a gravidade de Encefalite Autoimune Experimental (EAE) foi avaliada em camundongos huCD52 KI/KO. Camundongos huCD52-KI/KO foram tratados com um ciclo de 2C3-SFD1/K12 ou de 12G6-SFD1/K12 do
Dia -5 ao Dia -1. EAE (um modelo de esclerose múltipla) foi induzida por i- munização com peptídeo MOG35-55 emulsionado em CFA, e tratamento com toxina Pertussis nos Dia 0 e 2. Camundongos tratados com veículo co- meçaram a exibir sinais de paralisa em 10 dias após a injeção, os quais evo- luíram para doença progressiva grave.
Por outro lado, o pré-tratamento com o anticorpo 2C3-SFD1/K12 ou 12G6-SFD1/K12 retardou o aparecimento da doença e diminuiu a gravidade global da doença.
A Figura 96 demonstra o escore clínico de EAE de 2C3- SFD1/K12 e 12G6-SFD1/K12 sobre um período de tempo de progressão da doença.
Exemplo 64: Modificação de Fc de anticorpos para alterar o perfil farmacoci- nético de anticorpos anti-CD52 Alterações na região Fc de anticorpos 1) afetam a atividade bio- lógica do anticorpo ao alterarem interações com receptores Fc e/ou 2) alte- ramo perfil farmacocinético do anticorpo ao alterarem interações com o re- ceptor neonatal FcRn.
A molécula de FcRn é expressa em endotélio vascu- lar e acredita-se que seja o principal sítio de reciclagem de IgG.
O FcRn liga- se à parte Fc do anticorpo, o qual se torna internalizado dentro de uma célu- la.
Anticorpos com interações de alta afinidade com o FcRn serão reciclados novamente para a superfície da célula e liberados mais uma vez na circula- ção.
Anticorpos com interações com afinidade mais baixa dissociam-se den- tro da célula e, no final, degradam-se.
Mutagênese sítio-direcionada para aumentar a interação com FcRn gera um anticorpo que pode ser mantido em circulação por período de tempo mais longos, quando comparado a um anti- corpo não modificado.
Por outro lado, mutações dentro da região Fc de um anticorpo que diminuem a ligação a FcRn encurtam a meia-vida circulante do anticorpo.
Mutações que foram descritas para diminuir a ligação a FcRn, ' resultando em meia-vida circulante mais curta, incluem mutação única ' His435Ala e a mutação dupla His310Ala/His435GlIn (consultar, por exemplo, Kimetal, "Mapping the site on human IgG for binding of the MHC class I- related receptor, FcRn," Eur.
J.
Immunol., 29:2819-2825 (1999) e Kenanova et al., "Tailoring the Pharmacokinetics and Positron Emission Tomography
Imaging Properties of Anti-Carcinoembryonic Antigen Single-Chain Fv-Fc Antibody Fragments," Cancer.
Res. 65(2):622-631 (2005)). O anticorpo 2C3-SFD1/K12 foi modificado por mutação para ge- rar anticorpos His435Ala 2C3-SFD1/K12 ("2C3-SFD1/K12-Modificado 1") e His310Ala/His435GIn 2C3-SFD1/K12 ("2C3-SFD1/K12-Modificado 2") com perfis PK alterados.
A análise Biacore foi conduzida para confirmar a diminu- ição da ligação a moléculas de camundongo e humana de FcRn.
Ambos os anticorpos Campath-1H8 e 2C3-SFD1/K12 ligaram-se a cada molécula, de camundongo e humana, de FcRn com cinética semelhante.
Por outro lado, anticorpos His435Ala 2C3-SFD1/K12 ligaram-se em níveis baixos à molécu- la de camundongo FcRn, mas não a FcRn humana.
Os anticorpos His310Ala/His435GIn 2C3-SFD1/K12 não se ligaram à molécula de camun- dongo ou humana de FcRn, indicando que a incorporação da mutação única ou dupla na região Fc de 2C3-SFD1/K12 Fc afeta significativamente a liga- çãoaFcRnde camundongo e humana.
As Figuras 97A-97B demonstram a capacidade de Campath1 HO ("Campath"), 2C3-SFD1/K12 ("2C3"), His435Ala 2C3-SFD1/K12 ("H435A 2C3") e His310Ala/His435GIh 2C3-SFD1/K12 ("H310A/H435Q 2C3") liga- rem-se a moléculas de camundongo e humanas de FcRn.
Exemplo 65: Avaliação da meia-vida de anticorpos Fc modificados anti-CD52 após administração i.v. em camundongos C57BI/6 Modificações em Fc foram incorporadas na cadeia principal de 2C3-SFD1/K12 para gerar os anticorpos 2C3-SFD1/K12-Modificado 1 e 2C3- SFD1/K12-Modificado 2 que exibiam ligação diminuída ao receptor de FcRn, responsável por manter anticorpos em circulação.
O perfil farmacocinético foi determinado para o anticorpo 2C3-SFD1/K12 e os anticorpos 2C3- SFD1/K12-Modificado 1 e 203-SFD1/K12-Modificado 2 com ligação diminuí- ' da a FcRn.
Camundongos C57BL/6 foram usados para avaliar o perfil PK na E ausência de antígeno-alvo (2C3-SFD1/K12 liga-se à CD52 humana, mas não reage cruzado com CD52 de camundongo). Os camundongos foram injetados por via iv com anticorpos em dose de 1 mg/kg.
Em vários momen- tos, sangue foi coletado para analisar o nível de I9G1 humana circulante no soro do camundongo por ELISA.
Ambos anticorpos, 2C3-SFD1/K12- Modificado 1 e 2C3-SFD1/K12-Modificado 2, foram depurados do sangue mais rápido do que o anticorpo 2C3-SFD1/K12. 2C3-SFD1/K12 exibiu meia- vida de 403 horas, enquanto 2C3-SFD1/K12-Modificado 1 exibiu meia-vida de51 horase 2C3-SFD1/Ki12-Modificado 2, de 8 horas.
Os perfis PK de 2C3-SFD1/K12 e 2C3-SFD1/K12-Modificado-1 foram compatíveis com mo- delo de 1 compartimento com somente um fase única de eliminação.
Por outro lado, perfis para 2C3-SFD1/K12-Modificado-2 foram compatíveis com modelo de 2 compartimentos, com 2 fases distintas de eliminação (especifi- cada como alfa e beta na tabela). A primeira fase durou 48 horas após a do- se (alfa) e a segunda fase (beta, também denominada fase de eliminação terminal) iniciou 48 horas após a dose.
A Figura 98 mostra a depuração in vivo de 2C3-SFD1/K12 ("2C3 não modificado"), 2C3-SFD1/K12-Modificado 1 ("2C3-Fc mutante 1") e 2C3- SFD1I/Ki12-Modificado 2 ("2C3-Fc mutante 2") em camundongos não trans- gênicos.
Tabela 17-Sumário de dados farmacocinéticos entre grupos S o |2C3-SFD1/K12 2C3-SFD1/K12- — | 2C3-SFD1/K12- ES ienes 2 Modificado 1 Modificado 2 S t1/2 (h) 403 + 140 51,0 + 12,3 8,05 + 0,74 (Alfa 282 + 385 (Beta CI (mVh/kg 1,35 + 0,36 5,90 + 4,67 Vz (ml/Kkg 94,8 + 14,3 1932 + 1341 AUC (ug*h/ml) 3748 + 937 781 + 171 230 + 105 9,65 + 1,72 11,9 + 0,83 9,64 + 3,70 Tabela 18 -Dados individuais de animais Ne ea) ugumb | (hugimb | (mi/kg) | (mi/hi'kg 11,56 2967,86 10,54 4635,96 10,06 3783,76 123,77 . 10,57 3130,92 2025,29 235,71 10,56 í 10,57 | [AVG |402,65 EL Iso JjJ1092 172 Jear38 jf4073 joos |
Grupo nº Animal | HL Lambda z | Cmax | AUCINF- obs | Vz obs. : E 1h = “(ugiml) | (h*ugiml) “= | (mVkg) | (mi/h/kg 2C3-M1 35,20 513,50 98,89 2C3-NM1 11,68 | 842,55 2C3-M1 50,55 11,39 | 902,62 2C3-M1 717,95 2C3-M1 56,38 911,32 89,26 2C3-M1 63,40 12,41 | 995,22 91,91 2C3-M1 33,86 12,02 | 513,17 95,19 2C3-M1 63,14 10,56 108,08 2C3-M1 66,75 11,02 122,12 | [AVG |50,96 11,93 | 780,86 ll |SD 1230 170,51 14,33 E a Alpha... | Beta ds Cmax is AUCINF.. |. Vz obs cite obs. ne | | HAL Lambda | HL Lambda | (ug/mly jobs | (mvkg) | (mihikg) = oh SROREA chumbo ENT RIOS Faltando IL |AvGe| sos | 78198 | 96 | 22983 | 193180 | 590 | Lt 1 so| o | 38,83 | 370 | 10469 | 134143] 467 |) nº —Os grupos testados foram 2C3-SFD1/K12 ("2C3"), 2C3-SFD1/K12- Modificado 1 ("2C3-M1") e 203-SFD1/K12-Modificado 2 ("2C3-M2") *Animal4.1sem beta t1/2, fora do limite Vz ** . Animais 4.5 e 4.6, dados insuficientes para análise de PK. ***Animal 4.7 injeção incompleta.
Exemplo 66: Avaliação da meia-vida de anticorpos Fc modificados anti-CD52 após administração i.v. em camundongos transgênicos huCD52 heterozigo- tos O perfil farmacocinético foi determinado para o anticorpo 2C3- " SFD1/K12 e os anticorpos 2C3-SFD1/K12-Modificado 1 e 203-SFD1/K12- Modificado 2 com ligações reduzidas a FCcRn in vitro.
Camundongos trans- s gênicos huCD52 foram usados para avaliar o perfil PK na presença do antí- —geno-alvo do anticorpo 2C3-SFD1/K12. Os camundongos foram injetados por via iv com anticorpos na dose de 1 mg/kg.
Em vários momentos, sangue foi coletado para determinar o nível de IgG1 humana circulante no soro do camundongo por ELISA.
Os dois anticorpos, 2C3-SFD1/K12-Modificado 1 e 2C3-SFD1/K12-Modificado 2, foram depurados do sangue mais rápido do que o anticorpo 2C3-SFD1/K12. 2C3-SFD1/K12 exibiu meia-vida de 64 ho- ras, enquanto 2C3-SFD1/K12-Modificado 1 exibiu meia-vida de 32 horas e 2C3-SFD1I/K12-Modificado 2, de 6,5 horas.
A Figura 99 mostra a depuração in vivo de 2C3-SFD1/K12 ("2C3"), 203-SFD1/K12 modificado 1 ("2C3-Fc mutante 1") e 203-SFD1/K12 modificado 2 ("2C3-Fc mutante 2") em camundongos transgênicos huCD52. ' Tabela 19 - Sumário de dados farmacocinéticos entre grupos 2C3:SFDUI2 “| modificado 1.º Modificado? * t1/2 (h 64,2 + 12,1 32,3 +3,25 6,58 + 2,03 CI (ml/h/kg 2,15+ 0,31 2,51 + 0,28 5,41 + 0,83 Vz (mi/kg 198 + 42,8 117 +211 49,7 + 111 AUC (ug*h/ml) | 475 +73,4 403 + 44,5 188 + 27,2 Cmax (ugiml 8,88 + 1,69 12,4 + 1,67 12,9 + 1,91 Tabela20- Individual Animal Data São A da SIS & ug/mb —(htugimb) 2 )-(mlkg mi/h/kg 12c3 — 23 jeza 69 ja19 j26691 (226 | 1203 —j 25 5802 --""s09g j52659 j15895 [1900 | [123 “| 29 Jem 1830 42,6 21029 |237 Lo | Média fe egg lara59 19787 [215 | Lo so JB 6 7340 4380 [031 | co A so jugimb/ | (htugumy 22] (mivko) =] mina). 27,57 411,82 - 13,52 [Media aa os a955 1737 251 | Ú [o 1 1s 132 — j16 [4448 j2106 jo28 |
SESC AE JOR a To ato tre A (NIM rugrmb 1 (mikg)o | (minvko): | 2c3mM2 411 fFatando 900 Faltando [Faltando | Faltando | Faltando [2c3mM2 Jas Jratando — | Faltando | Faltando — | Faltando | Faltando | [2c3m2 Ja49 Falando ——— | Faltando |Faltaado — | Faltando | Faltando | [o Mega 658 510 1878 j4967 549 | Lo ag oras jan | o8 | Parâmetros PK não disponíveis para 4.11, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8 e 4.9 devido a dados insuficientes. nº - Os grupos testados foram 2C3-SFD1/K12 ("2C3"), 2C3-SFD1/K12- Modificado 1("2C3-M1") e 2C3-SFD1/K12-Modificado 2 ("2C3-M2") Exemplo 67: Avaliação de depleção in vivo após administração iv de anticor- pos Fc modificados anti-CD52 em camundongos transgênicos huCD52 hete- ' rozigotos A atividade de depleção foi determinada para os anticorpos 2C3- SFD1I/Ki2, 2C3-SFD1/K12-Modificado 1 e 203-SFD1/K12-Modificado 2 em camundongos transgênicos huCD52. Os camundongos foram tratados com 1 mg/kg de anticorpos 2C3-SFD1/K12, 2C3-SFD1/K12-Modificado 1 ou 2C3- SFD1/K12-Modificado 2 e avaliados quanto à presença de células T CDA, células T CD8+, células B e células NK 72 horas mais tarde.
A administração de anticorpos 2C3-SFD1/K12-Modificado 1 ou 2C3-SFD1/K12-Modificado 2 resultou em níveis diminuídos de depleção no sangue e no baço, comparado à administração de anticorpos 2C3-SFD1/K12. Além disso, 2C3-SFD1/K12- Modificado 1 induziu depleção maior do que 2C3-SFD1/K12-Modificado 2, no sangue e no baço. 7 20 As Figuras 100A-100B mostram o nível de populações de linfóci- tos em massa (Células T CD4+, células T CD8+, células B B220+ e células : NK) no sangue e no baço após 72 horas da administração de anticorpos 2C3-SFD1/K12 ("203"), 203-SFD1/K12 modificado 1 ("2C3 Fc mutante-1") e 2C3-SFD1/K12 modificado 2 ("2C3 Fc mutante-2").
Exemplo 68: Especificidades detalhadas por epítopo de anticorpos humani- zados anti-CD52 Especificidades detalhadas por epítopo dos anticorpos humani- zados 12G6-SFD1/K12, 2C3-SFD1/K12 e 9D9-H16/K13 foram determinadas com equipamento Biacore T100. Como controle, a especificidade por epíto- po do clone 097 (anticorpo purificado anti-CD52 humana, Biolegend) foi ava- liada usando as mesmas metodologias. A especificidade por epítopo do clo- ne 097 foi previamente caracterizada, usando um método ELISA para peptí- deo (Hale G, "Synthetic peptide mimotype of the CAMPATH-1 (CD52) anti- gen a small glycosylphosphatidylinositol-anchored glycoprotein," Immunote- chnology, 1:175-187 (1995)). Neste ensaio Biacore T100, os anticorpos eram diretamente imobilizados em chips sensores de carboximetil dextrano da Biacore CM5 Series S (GE nº BR-1006-68), usando acoplamento de amina. A superfície de carboximetil dextrano foi ativada usando uma mistura de N- hidroxissuccinamida (NHS) 0,1 M e cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetila- minopropil)carbodiimida (EDC) 0,4 M, permitindo à superfície ligar-se a gru- . pos reativos amina nos anticorpos. Pelo fato de anticorpos IgM tenderem a apresentar nível mais alto de ligação não específica, quando comparados a IgGs, a ligação de isotipo IgMK (migMxKk) de camundongo como controle (Clone nº MM-30 da Biolegend) foi também investigada. Depois da imobili- zação do anticorpo, a reação na superfície do chip sensor reativo foi inter- rompida usando cloridrato de etanolamina 1 M/NaOH pH 8,5. Uma célula de fluxo em cada chip era a superfície de referência como branco, e células de fluxos subsequentes foram imobilizadas com 10.000 RU de anticorpo.
Uma série de peptídeos mutantes por varredura de alanina, compreendendo a sequência da CD52 humana (MUT 1 — MUT 12 (SEQ ID NOS: 169-180, respectivamente), Tabela 21) (consultar, por exemplo, Hale ' G, "Synthetic peptide mimotype of the CAMPATH-1 (CD52) antigen, a small : glycosylphosphatidylinositol-anchored — glycoprotein'" — Immunotechnology, 1:175-187 (1995)) foram sintetizados. A ligação do anticorpo a estes peptí- deos mutantes de CD52 e a peptídeos do tipo selvagem de CD52 humana foi testada a concentrações de 500 nM, 100 nM, 50 nM, e O nM. Os peptí-
deos foram diluídos no tampão de corrida do ensaio, HBS-EP+ (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, P20 surfactante 0,05%, EDTA 3 mM, pH 7,4). Amostras de 100 nM em duplicata foram incluídas. O anticorpo de cadeia leve (kappa) específica de rato anti-gM de camundongo (Southern Biotech, Clone nº 1B4B1)foitambém incluído como IgM de controle. As temperaturas d câma- ra de amostras do equipamento T100 e do ensaio foram definidas para 4 ºC e 25ºC, respectivamente. As amostras de peptídeos da CD52 humana foram injetadas por cinco minutes em vazão de 50 ul/minute para medir associa- ção, e lavadas em HBS-EP+ por cinco minutos em vazão de 50 ul/minuto para medir dissociação. Qualquer peptídeo restante ligado à superfície do anticorpo foi removido usando uma segunda injeção por sessenta segundos de glicina-HCI 10 mM pH 2,0 em vazão de 50 ul/minuto. A análise foi reali- zada usando o software Biacore T100 Kinetics Evaluation v2.0 (GE Health- care). Os dados foram ajustados para modelo de 1:1 com célula de fluxo de referência e subtração de concentração de O nM (subtração de dupla refe- Ú rência). Sensorgramas representativos de reconhecimento negativo de epí- ' topo em peptídeo de anticorpo 12G6-SFD1/K12 ((-), MUT 8) e positivo ((+), MUT 9) são mostrados na Figura 101A e Figura 101B, respectivamente. Os dados compilados de ligação a peptídeo estão resumidos na Tabela 21.
A especificidade previamente caracterizada de ligação do clone 097 (Hale G, "Synthetic peptide mimotype of the CAMPATH-1 (CD52) anti- gen, a small glycosylphosphatidylinositol-anchored glycoprotein," Immunote- chnology, 1:175-187 (1995)) foi determinada revestindo placas de ELISA com peptídeos contendo os seis resíduos da parte C-terminal de CD52 hu- manae, em seguida, medindo a ligação do anticorpo ao peptídeo fixado. Cada resíduo foi substituído por todos os 20 aminoácidos. Como os peptí- deos estão presos a uma superfície sólida neste ELISA, o ensaio pode ser ' mais influenciado por efeitos de avidez do que o ensaio Biacore T100 descri- E to neste pedido de patente, que usa um anticorpo fixo à superfície sobre a qualos peptídeos fluem. No estudo por ELISA, substituições de alanina nas posições 11 e 12 (resíduos de prolina e serina, respectivamente, no tipo sel- vagem) da forma madura de CD52 humana demonstraram reduzir ligação forte do clone 097 ao peptídeo. No presente estudo Biacore T100, substitui ções de alanina nas posições 11 e 12 (bem como nas posições 7, 8, 9€ 10) demonstraram anular a ligação do clone 097. Os efeitos de avidez sugeridos como hipótese do ensaio ELISA representam possivelmente o motivo porque oepítopo mapeado do 097 é menor quando determinado pelo método ELISA do que quando determinado pelo ensaio descrito Biacore T100. A ligação dos anticorpos humanizados 2C3-SFD1/K12 e 12G6- SFD1/K12 à sequência de peptídeos da CD52 é sensível a substituições de alanina nas posições 7, 8 e 11, e a ligação de 9D9-H16/K13 humanizado é sensível a substituições de alanina nas posições 4 e 11. Estas especificida- des definidas para epítopos sobrepõem-se aos resultados observados no Exemplo 4 (resumidos na Tabela 8). Leves variações entre os resultados não são previstas, dado que o método Biacore T100, usado para medir liga- ção no presente caso, não foi significativamente diferente do método usado no Exemplo 4. Ao contrário do presente caso, no Exemplo 4, células CHO ' construídas eram usadas para expressar mutantes alanina-substituídos de - CD52 humana do tipo selvagem. CD52 humana expressa em tais células de mamíferos podem ser glicosiladas, afetando a ligação. Este não é o caso para a CD52 humana usada no ensaio Biacore T100. Tabela21: Ligação a peptídeos mutantes de hcD52 por varredura de alani- na Peptídeo | Sequência de peptídeo | Ligação Ligação | Ligação Ligação | Ligação de2C3 — | degD9 |de1l2G6 | deos7 | demiom SFD1/K12 | H16/K13 | SEDIMKI2 de controle LMUTA1 — | AQNDTSATSSPSADE a MUT2 — | GANDTSATSSPSADE ag GQOADTSQATSSPSADE [Naa GCONATEATE SP ADE pI GONDASQTSSPSADE aa |MUT6 —) GonDTAQGTSSPSADE [ar IMUT7 — | GoNDTSATSSPSADE Mute atos aa s sea AMUTO | coNDTSATASPSADE ' GONDTSQATSAPSADE a EMUT11 | cenDTSATSSASADE LMUTT2 | GoNDTSETSSPAADE : eontrafes É Biotina
PSAD de rato
(+) Ligação detectada: Resposta máxima (RmaJ > 2RUs por inje- ção de peptídeo a 500 nM (-) Nenhuma ligação detectada.
Resposta máxima (RmaJ < 2RUs para injeção de peptídeo a 500nM Exemplo 69: Avaliação de respostas de células T CD4+ T induzidas por Campath-1HO ou 12G6-SFD1/K12 A resposta proliferativa de células T CD4+ foi avaliada após es- timulação repetida in vitro com células dendríticas autólogas (DC), pré- carregadas com um conjunto de peptídeos sobrepostos de 15 mer, compre- endendo sequências das regiões variáveis de Campath-1H8 ou do anticorpo humanizado 12G6-SFD1/K12. Esses experimentos utilizaram células T e DCs de doador humano normal.
Os resultados foram medidos, quantificando a incorporação de timidina tritiada de células T CD4+ em proliferação em resposta a células apresentadoras de antígenos (APC) pulsados com peptí- deos autólogos. ' Preparo de células: PBMCs foram isoladas de um produto por - aférese de doador humano normal, adquirido da BioMed Supplies (Carlsbad, CA). O rastreamento do haplotipo de HLA do sangue do doador foi realizado pela Key Biologics, LLC (Memphis, TN) (Tabela 22). PBMCs foram isoladas usando o gradiente de densidade Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) e uma série de lavagem com solução salina com tampão fosfato (PBS, Invitrogen, Carlsbad, CA). Células T CD4+ foram isoladas de PBMC usando o kit para isolamento de CD4+ positivas em esferas Dynal (Invitrogen), seguindo o pro- tocolo recomendado pelo fabricante.
Células T CD4+ isoladas foram conge- ladasnomeio Recovery Cell Culture Freezing Media (Invitrogen) e armaze- nadas em nitrogênio líquido.
Células dendríticas (DC) foram induzidas a par- tir de PBMCs, semeando células aderentes com GM-CSF (Leukine, Bayer, ' Leverkusin, Alemanha) e IL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) por seis dias.
Meio J suplementado com seis GM-CSF e IL-4 foi reposto no Dia 4. As DCs foram subsequentemente isoladas dos frascos e congeladas no meio de congela- mento Freezing Media, em seguida transferidas para tanques de nitrogênio para armazenamento.
Tabela 22: Haplotipo de HLA de doadores de sangue Doador — Haplotipo de HLA DR Conjunto de peptídeos
Ú Peptídeo: Peptídeos abrangendo as regiões variáveis da cadeia pesadaedalevede Campath-1HG8 e de 12G6-SFD1/K12 foram sintetizados, usando um sintetizador automático de peptídeo Rainin Symphony e usando química Fmoc padrão em resina CLEAR (Peptides International, Louisville, KY). Aminoácidos (EMD Biosciences, San Diego, CA ou Anaspec, San Jose, Ca) foram protegidos ortogonalmente com grupos tert-Butoxicarbonila (BOC), tert-Butila (tBu), 2,2,4,6,7-Pentametildihidro-benzofuran-5-sulfonila (Pbf) ou Tritila (Trt). Acoplamentos foram realizados usando um aminoáci- do/HCTU/HOBt/DIEA/resina com razão molar de 6:6:3:12:1. Uma solução de Piperidina 20% e 1,8-diazabiciclo[5.4.0]Jundec-7-eno (DBU) 2,5% em DMF foi usada para remover Fmoc do terminal amino durante cada ciclo.
A resina foi desprotegida/clivada usando um coquetel de resina 15 mL/0,1 mM em razão É v/v de água 2,5%/TIS 2,5%/Anisol 5%/TFA 90% por 3 horas.
O sobrenadan- . te foi precipitado em éter dietílico (-80 ºC) e transformado em grânulo a 3000 rpm por 10 minutos.
O éter foi decantado e o grânulo foi lavado novamente.
O peptídeo bruto foi então liofilizado.
HPLC analítica (XBridge C18 4,5 x 100 mm, Waters Corp., Milford, MA) e espectrometria de massa MALDI-TOF
(Synapt, Waters Corp., Milford, MA) foram usadas para verificar as sequên- cias e avaliar a pureza.
Todos os reagentes eram de grau HPLC (EMD Bios- ciences, San Diego, Ca ou Sigma Aldrich, St.
Louis, MO). Peptídeos liofiliza- dos foram ressuspensos em DMSO 100% DMSO (Sigma). Quarenta e três peptídeos de Campath-1H8 foram combinados em 11 grupos lineares, cada um contendo 3 ou 4 peptídeos por grupo (Tabela 23: de cima para baixo, peptídeos de cadeia leve são indicados pelas SEQ ID NOs: 187-206 e peptí- deos de cadeia pesada são indicados pelas SEQ ID NOs: 207-229). Os 42 peptídeos de 12G6-SFD1/K12 foram combinados em 8 grupos lineares, ca- daum contendo cinco ou seis peptídeos por grupo (Tabela24: de cima para baixo, peptídeos de cadeia leve são indicados pelas SEQ ID NOs: 230-250 e peptídeos de cadeia pesada são indicados pelas SEQ ID NOs: 251-271). Tabela 23: 43 peptídeos de 15 mer de cadeia pesada e cadeia leve de Cam- path-1HO, sobrepostos por 10 aminoácidos cada de Peptídeos de Campath- 1HO
Cadeia pesada Cadeia leve CIH Peptides Peptide IDH Peptide IDH DIQMTOSPSSLSASV 978 QVQLQESGPGLVRPS 2998 QSPSSLSASVGDRVT 979 ESGPGLVRPSQTLSL 999 LSASVGDRVTITCKA 980 LVRPSQTLSLTCTVS 1000 GDRVTITCKASQNID 981 QTLSLTCTVSGFTFT 1001 ITCKASQNIDKYLNW 982 TCTVSGFTFTDFYMN 1002 SQNIDKYLNWYQQKP 983 GEFTFTDFYMNWVRQP 1003 KYLNWYQQKPGKAPK 984 DFYMNWVRQOPPGRGL 1004 YQOKPGKAPKLLIYN 285 WVRQPPGRGLEWIGF 1005 GKAPKLLIYNTNNLQ 986 PGRGLEWIGFIRDKA 1006 LLIYNTNNLOTGVPS 987 EWIGFIRDKAKGYTT 1007 TNNLQTGVPSRFSGS 988 IRDKAKGYTTEYNPS 1008 TGVPSRESGSGSGTD 989 KGYTTEYNPSVKGRV 1009 RFSGSGSGTDFTFTI 990 EYNPSVKGRVTMLVD 1010 GSGTDFTFTISSLOQP 991 VKGRVTMLVDTSKNQ 1011 FTFTISSLQPEDIAT 992 TMLVDTSKNQFSLRL 1012 ' SSLQPEDIATYYCLQ 993 TSKNQFSLRLSSVTA 1013 EDIATYYCLQHISRP 994 FSLRLSSVTAADTAV 1014 : YYCLOHISRPRTFGO 995 SSVTAADTAVYYCAR 1015
HISRPRTFGQGTKVE 996 ADTAVYYCAREGHTA 1016 RTFGQOGTKVEIKRTV 2997 YYCAREGHTAAPFDY 1017
EGHTAAPFDYWGQGS 1018
APEFDYWGQOGSLVTVS 1019
WGQGSLVTVSSASTK 1020
Tabela 24: 42 peptídeos de 15 mer de cadeia pesada e cadeia leve de 12G6-SFD1/K12, sobrepostos por 10 aminoácidos cada de Peptídeos de 12G6-SFD1/K12 Cadeia pesada Cadeialeve GLD52 Peptides Peptide IDH Peptide IDH DIVMTQTPLSLSVTP 1027 EVOLVESGGGLVQOPG 1048 QTPLSLVTPGÇPAS 1028 ESGGGLVQPGGSLRL 1049 LSVTPGQPASISCKS 1029 LVQPGGSLRLSCAAS 1050 GOPASISCKSSOSLL 1030 GSLRLSCAASGFPFS 1079 ISCKSSQOSLLYSNGK 1031 SCAASGEFPFSNYWMN 1080 SOSLLYSNGKTYLNW — 1032 GFPFSNYWMNWVRÇA 1081 YSNGKTYLNWVLQOKP 1072 NYWMNWVRQOAPGKGL 1082 TYLNWVLOKPGOSPQO 1073 WVROAPGKGLEWVGQO 1055 VLOKPGOSPORLIYL 1074 PGKGLEWVGQOIRLKS 1056 GOSPORLIYLVSKLD 1036 ENWVGQOIRLKSNNYAT 1060 RLIYLVSKLDSGVPD 1037 IRLKSNNYATHYAES 1061 VSKLDSGVPDRFSGS 1038 NNYATHYAESVKGRF 1062 SGVPDRFSGSGSGTD 1039 HYAESVKGRFTISRD 1063 1 RFSGSGSGTDFTLKI 1040 VKGRFTISRDDSKNS 1064 GSGTDFTLKISRVEA 1041 TISRDDSKNSLYLQM 1065 : FTLKISRVEAEDVGV 1042 DSKNSLYLQOMNSLKT 1066 SRVEAEDVGVYYCVQ 1043 LYLQOMNSLKTEDTAV 1067 EDVGVYYCVOGSHFH 1075 NSLKTEDTAVYYCTP 1068 YYCVOGSHFHTEFGQOG 1076 EDTAVYYCTPIDYWG 1083 GSHFHTFGQOGTKLEI 1077 YYCTPIDYWGOGTTV 1084 TFGOGTKLEIKRTVA 1078 IDYWGOGTTVTVSSA 1085 Estimulação in vitro Pulsos de antígeno DC e maturação: Antes do tratamento com peptídeos, DCs foram descongeladas, lavadas e semeadas em RPM! (Invi- 19 trogen, Carisbad, CA) suplementado com Soro Humano 5% (HS, Sigma, St.
Louis, MO), Penicilina-Estreptomicina 1% (Invitrogen, Carisbad, CA), 100 ng/ml. de GM-CSF e 20 ng/ml de IL.
DCs foram semeadas em 2 x 10º células/ml. em 4 mL de meio em placas de cultura de tecido de 6 cavidades, e deixadas para que aderissem por 1 hora 37 Cc.
Depois da aderência das .- 15 células,10 pug/mL (40 ug total) de cada peptídeo foram adicionados às cavi- dades contendo DCs, correlacionando-se 120 ug ou 160 ug de peptídeos totais a cada cavidade (grupos de 3 peptídeos ou de 4 peptídeos de Campa- th-1HO), ou 200 ug ou 240 ug de peptídeos totais adicionados a cada cavi-
dade (grupos de 5 peptídeos ou 6 peptídeos de 12G6-SFD1/K12). 40 ug do epítopo de ligação pan-DR (PADRE) foram adicionados a uma cavidade de DCs e serviram como controle positivo, uma vez que pode ligar-se a maioria das moléculas de HLA-DR (Alexander J, et al., "Development of high po- tency universal DR-restricted helper epitopes by modification of high affinity DR-blocking peptides," Immunity, 1:751-761 (1994)). Igualmente, 40 ug de cada um dos três peptídeos de toxoide tetânico de ligação a HLA-DR (DTIMMEPPYCKGLDIYYKA (SEQ ID NO: 183), SAMLTNLIIFGPGPVLNK- NEV (SEQ ID NO: 184) e NNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 185)) foram adicionados a uma cavidade de DCs. Da mesma forma, um adenoví- rus inativado por calor foi empregado como fonte positiva de antígeno e adi- cionado a uma cavidade de DCs a 1 ug/mL. Finalmente, um grupo de DCs permaneceu não pulsado com antígeno e serviu como grupo educado "nulo". As DCs pulsadas com os vários antígenos foram incubadas por pelo menos três horas a 37ºC. As DCs foram então tratadas com "coquetel de citocinas de maturação", contendo 50 ng/ml. de TNF-a, 10 ng/mL de IL-6, 25 ng/ml . de IL-1beta (Peprotech, Rocky Hill, NJ) e 500 ng/ml de PGE-2 (Sigma Aldri- ch, St. Louis, MO). As DCs pulsadas com antígeno foram deixadas para que maturassem durante a noite a 37ºC.
Estabelecimento de cocultura: Após a carga de peptídeos e a maturação, as DCs foram lavadas duas vezes com PBS e reabastecidas com 4 mL de RPMI, suplementado com HS 10%. Células T CD4+ autólogas foram descongeladas e ressuspensas a 2 x 10º células/ml. em RPMI suple- mentado com HS 10%, Penicilina e Estreptomicina. As DCs foram cultivadas em seguida com células T CD4+ virgens em proporção de 10:1 célula T:DDC (8 x 10º células T:8 x 10º DCs) em 8 mL de meio. A cocultura foi então incu- bada a 37 C por 7 dias. Aproximadamente 72 horas após o início da cocultu- ] ra, as células foram suplementadas com 25 IU de IL-2 recombinante (Pepro- : tech, Rocky Hill, NJ), e ainda suplementadas com 25 IU de IL-2 recombinan- teemmeiofresco a cada 3-4 dias posteriormente.
Re-estimulação de cocultura: No Dia 7 (Stim nº 2) e Dia 14 (Stim nº 3), as coculturas foram re-estimuadas seguindo o procedimento acima.
Ensaio de proliferação: DCs foram semeadas, pulsadas com an- tígeno e maturadas como informado acima, a 5 x 10º célutas/mlL em 1 mL de meio em placas de ligação baixa de 24 cavidades para facilitar a transferên- cia subsequente de células para placas de ensaio com fundo em U.
Um pep- tídeode ligação irrelevante HLA DR, CS 378-398 (sequência do peptídeo: DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS (SEQ ID NO: 186)), foi usado como controle negativo (Alexander J, ef al., "Development of high potency universal DR- restricted helper epitopes by modification of high affínity DR-blocking pepti- des," Immunity, 1:751-761 (1994)). Depois de maturação de DCs por 24 ho- ras, as células foram destacadas das placas usando lavagens com PBS ge- lado.
As DCs foram semeadas em placas de 96 cavidades com fundo em U, junto com células T estimuladas com antígeno em proporção de 1:1 célula T:DC (2,5 x 10º DC/cavidade). Cada grupo de células T foi analisado em triplicata com DC pulsada com o(s) peptídeo(s) educador(es) (resposta es- pecífica) e DC pulsada com peptídeo irrelevante (resposta não específica), ' bem como controles com apenas células T e com apenas DCO ensaio pros- . seguiu por 72 horas antes que fosse adicionado timidina tritiada 1 uCi por cavidade (Perkin Elmer, Waltham, MA). As células foram colhidas em coletor de placa de 96 cavidades (Perkin Elmer), e a quantidade de timidina tritiada incorporada foi quantificada por CPM, medida em contador Wallac Microbeta Trilux (Perkin Elmer). O índice de estimulação foi calculado dividindo a CPM específica pela CPM não específica.
Uso de V beta em receptor de células T (TCR): Células T CD4+ que ainda restassem após estabelecimento do ensaio de proliferação foram coletadas para determinação final de expressão de cadeia V beta em recep- tor de células T.
As células foram descongeladas e coradas com anticorpos reconhecendo 24 membros conjugados da família V beta por 30 minutos, ' seguido as orientações do fabricante no Kit IOTest Beta Mark (Beckman LF Coulter, França). Após lavagem com PBS e ressuspensão com formaldeído 1%, as células foram analisadas em FACScalibur (Becton Dickinson, Fran- Kklin Lakes, NJ). O percentual de células expressando cada uma das cadeias V beta detectadas foi calculado, como resumido na Figura 102 e Figura 103.
Campath-1H8 Avaliação de imunogenicidade A avaliação de imunogenicidade de peptídeos de Campath-1HO foi realizada como descrito acima, usando PBMCs de dez doadores normais, da BioMedSupply (BMS). O sumário das respostas, indicadas pelo índice de estimulação, está retratado na Tabela 25A.
Cada doador é listado em uma coluna, e cada linha lista o grupo de peptídeos usados para estimular células T CD4+. O Índice de Estimulação (SI) é determinado dividindo a resposta imune específica ao grupo peptídico educador por uma resposta irrelevante.
Valores de SI < 2,0 não estão listados.
Os dados sobre proliferação de cada um dos dez doadores estão resumidos na Tabela 25A e são relatados na Figura 104A-J.
Seis doadores exibiram índice de estimulação acima de 2,0 e foram denominados, como resultado, "respondedores de Campath-1H8&". Células T CD4+ educadas de um dos respondedores, BMS352, exibiram resposta imunes específicas quando analisadas com dois grupos peptídicos diferentes.
Um sétimo doador, BMSA486, foi classificado também como "res- ' pondedor". Neste doador, um índice de estimulação 1,7 vezes o fundo foi ' registrado com o grupo de peptídeos 986-989 da cadeia leve.
Quando a re- gulação positiva de V beta foi analisada nas culturas de células T educadas neste doador, foi demonstrado que as células T educadas para 986-989 exi- biam alta regulação positiva de um único V beta, VB3 (Figura 102). A regula- ção positiva de um único V beta e a resposta proliferativa específica indica- ram que BMS486 era respondedor de Campath-1HO.
Os três doadores não respondedores, BMS200, BMS154 e BMS167, não mostraram dados prolife- rativos ou regulação positiva de V beta, indicando que uma resposta imune específica para peptídeo não ocorreu.
Os dados de Campath-1H8& foram quantificados em taxa de 70% (7/10) de respondedores.
O número total de grupos peptídicos provocando resposta imune foi oito.
Três destes oito gru- : pos peptídicos imunogênicos provocaram fortes respostas nos respectivos
. doadores com índices de estimulação de 3,0 ou acima (Tabela 26).
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Exemplo 70: Avaliação de respostas de células T CD4+ induzidas por 12G6-
SFD1/K12 Avaliação de imunogenicidade e análise V beta da região variá- vel de 12G6-SFD1/K12 foram realizadas como descrito no Exemplo 69 para Campath-1HO, empregando células de dez doadores normais.
Os dados sobre proliferação para cada um dos dez doadores, resumidos na Tabela 25B, são relatados na Figura 105A-J.
Dois destes dez doadores foram usa- dos também na avaliação de Campath-1H8 descrita acima (BMS486 e BMS484), enquanto os demais oito doadores foram testados somente com os peptídeosde 12G6-SFD1/K12. Um doador, BMS484, respondeu a grupos peptídicos e foi classificado "respondedor de 12G6-SFD1/K12" (Tabela 25B). Dois doadores, BMS927 e BMS928, respondeu cada um a um grupo de pep- tídeos e foram, portanto, classificados como respondedores.
O doador BMS928 mostrou índice fraco de estimulação de 2,0 ao grupo contendo os peptídeos de cadeia pesada 1066, 1067, 1068, 1083, 1084 e 1085. Essa ] resposta foi confirmada pela análise de células T proliferativas para uso de V . beta.
As células T com resposta do BMS928 exibiram regulação positiva de um único V beta, VB20 (Figura 103). O doador BMS927 mostrou índice de estimulação de 2,5 em células T educadas com um grupo de peptídeos de cadeialeve.A análise de V beta das células T com resposta do BMS927 não indicaram regulação positiva de um único V beta sobre o fundo.
No entanto, este doador continua na categoria de "respondedor", uma vez que o kit de V beta representa somente 70% de todos os possíveis usos de V beta.
A taxa de imunogenicidade de 12G6-SFD1/K12 nestes 10 doadores foi de 30% (3/10), menos do que a metade da taxa de respondedores de Campath-1H& (70%). No total, cinco grupos de peptídeos provocaram resposta, enquanto nenhum destes cinco grupos induziu índice de estimulação acima de 3,0
] (Tabela 26).
Tabela 26: Sumário de respostas imunes a Campath-1H8 e 12G6-SFD1/K12 E T Campath-1H& | 12G6-SFD1/K12 Percentual de respondedores 70% (7/10 30% (3/10) Número de grupos de peptídeos provocando E E resposta Grupos de peptídeos com resposta com ín- 3/8 (38%) 0/3 (0%) dice de estimulação >= 3,0 Sumário Peptídeos correlacionando-se com as regiões variáveis da ca- deia pesada e da leve do anticorpo monocional humanizado anti-CD52 12G6-SFD1/K12 induziram menos respostas imunes de dez doadores (30%) do que peptídeos das regiões variáveis da cadeia pesada e da leve de Cam- path-1HO (70%). As respostas imunes à base de células T CD4+ que foram geradas com 12G6-SFD1/K12 foram também de magnitude menor do que as respostas induzidas por Campath-1HO.
A tabela a seguir lista os números de identificação de sequência ' usados neste relatório descritivo.
Tabela 26: Lista de SEQ ID NOs - [SEQGIBNO] —-— - TNPo —— — [pESCRÇÃO 2 po Campath-1GO — CFID12 8G3 (camundongo: 8 6 | Região variável Ca AS OL) 8 | Ee | NT 23E6 (camundongo 2C3 (camundongo: 12 7F11 (camundongo) 13 4B10 (camundongo) CF1ID12 . ; Região variável . de Cadela pesada (VH)
CDR-1 de cadeia leve 7F11 (camundongo go, CDR-2 de cadeia leve camundongo: | DAS de cadeia leis
:
dongo'
: CDR-1 de cadeia pesada | 68 4G7 (camundongo ; DDR2de cadaia passa 66 6 | 6 | 8G3, 4G7, 11011, 3G7 (camundongo:
;
DDS de canta pesada y Iniciadores de cadeia leve quência líder)
[4 constante: VK-MK (Iniciador forward na região frame- work 1 RENA MKC-Const (Iniciador reverse em região constante: cia líder cia líder work 1) mework 1) Po ão constante. work 1 VH MH2 (Iniciador forward na região frame- Iniciadores de work 1 cadeia pesada hisduic (Iniciador forward na região frame- work 1
NC - work 1 VH MHG6 (Iniciador forward na região frame- work 1 ' VH MH7 (Iniciador fonvard na região frame- work 1 CH1 de IGG1 de camundongo 1g9G1 te CH1 de IGG2A de camundongo: te CH1 de IgG2B de camundongo | e6 |vH(parcia) | 4810 (camundongo):alinhamento ===> | humana (VH | 98 JVH(parcia) —————— | 4610 (humanizado) alinhamento ===> | | so ao | aeemeineaennte | Ca EE mamas 4B10 (humanizado): alinhamento : 102 - Peptídeos mutantes de varredura por alanina de CD52
A MUT6
LC CDR1 LC CDR-2 LC CDR-3 SQSXH/R/KF/LIVIPX " HC CDR-1 HC CDR2 HC CDR-3 . : E Léa
EEE ç$ ” 12
G VKIO 6 vL VK11 ! VvKi2 VKI3 is
E o N—— VH18 165 ve Peptídeos por varredura de alanina de CD52 179
WA ... Toxoide tetânico HLA- : : a EAN a o a Peptídeo "irrelevante" Joe [ERTADAR jesseses | | : so | Ass Sinpat1hS Bs os dAA tudo de imunogenicidade [990 EEE [996 ' [E CEA O eme ERRA NO Sotrependate su pat |— 213 deos de 15 mer para estu- Fa] toda meneaenindade 006 OO . 1007.
1260-SFD 16tz | — 241 | Le sotrepondose a per: Fis enseada [aaa | ndo de imunogenicidade : 12G6-SFD1/K12 HC sobrepondo-se a pep- tídeos de 15 mer para es- tudo de imunogenicidade c
LELLO + ooo EIS 7F11-SFD1 7F 7F11-K2 11 He 90916 9D9-H18 9D9-K13 12G6-SFD1 12 4B10-H1 48 4B10-K1 10 HC (ácido nucleico 2C3-SFD1 2
284 LC (ácido nucleico) — | 203-K12 S 285 HC (ácido nucleico 7F11-SFD1 7F LC (ácido nucleico) 7FIT-K2 n áci 9D9-H16 HC (ácido nucleico) 9D9-H18 LC (ácido nucleico; 9D9I-Ki13 HC (ácido nucleico) 12G6-SFD1 12 LC (ácido nucleico) 12G6-K12 ç HC (ácido nucleico) 4B10-H1 4B LC (ácido nucleico) 4B10-K1 10 MccDRs — | 7FNSEDaIRVFADO : Os ensinamentos de todas as patentes, pedidos de patentes pu- blicados e referências citadas neste relatório descritivo são aqui incorpora- dos em sua totalidade por referência neste pedido de patente.
Embora esta invenção tenha sido especificamente apresentada edescrita com referência a concretizações de exemplos desta, será enten- dido por aqueles versados no estado da técnica que várias alterações em forma e detalhes poderão ser efetuadas na mesma, sem se afastar do âmbi- to da invenção abrangida pelas reivindicações anexadas.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo monoclonal anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve e a cadeia pesada compreendem as três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) encontradas em: a) SEQ ID NOs: 3 e 16, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 4 e 17, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 5 e 18, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 6 e 19, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 7 e 20, respectivamente; 1) SEQ ID NOs: 8 e 21, respectivamente; 9) SEQ ID NOs: 9 e 22, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 10 e 23, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 11 e 24, respectivamente; j) SEQ ID NOs: 12 e 25, respectivamente; k) SEQ ID NOs: 12 e 137, respectivamente; ou 1) SEQ ID NOs: 13 e 26, respectivamente.
2. Anticorpo monoclonal anti-CD52 humana, ou parte de ligação a antígeno deste, caracterizado pelo fato de que se liga ao mesmo epítopo em CD52 humana que o anticorpo monoclonal ou parte de ligação a antíge- no como definido na reivindicação 1.
3. Anticorpo monocional anti-CD52 humana, ou parte de ligação a antígeno deste, caracterizado pelo fato de que compete ou compete de modo cruzado com o anticorpo monoclional ou parte de ligação a antígeno como definido na reivindicação 1.
4. Anticorpo monoclonal ou parte de ligação a antígeno de acor- do com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende (H)- CDR1, H-CDR2, H-CDR3 de cadeia pesada e (L)-CDR1, L-CDR2, e L-CDR3 de cadeia leve, cujas sequências de aminoácidos são: a) SEQ ID NOs: 51, 59, 69, 29, 36 e 43, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 50, 60, 69, 29, 37 e 43, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 50, 61, 68, 29, 38 e 43, respectivamente;
d) SEQ ID NOs: 50, 61, 69, 29, 36 e 43, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 50, 62, 69, 29, 39 e 43, respectivamente; 1N) SEQ ID NOs: 52, 61, 70, 30, 40 e 43, respectivamente; 9) SEQ ID NOs: 53, 63, 71, 31, 36 e 44, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 54, 64, 71, 31, 36 e 45, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 55, 63, 72, 31, 36 e 46, respectivamente; j) SEQ ID NOs: 56, 65, 73, 32, 41 e 47, respectivamente; 1) SEQ ID NOs: 56, 65, 294, 32, 41 e 47, respectivamente; ou |) SEQ ID NOs: 56, 66, 74, 33, 41 e 48, respectivamente.
5. Anticorpo monoclonal ou parte de ligação a antígeno de acor- do com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve e a cadeia pesada do referido anticorpo compreendem as sequências de amino- ácidos de: a) SEQ ID NOs: 3 e 16, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 4 e 17, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 5 e 18, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 6 e 19, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 7 e 20, respectivamente; f) SEQ ID NOs: 8 e 21, respectivamente; 9) SEQ ID NOs: 9 e 22, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 10 e 23, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 11 e 24, respectivamente; ) SEQ ID NOs: 12 e 25, respectivamente; ou k) SEQ ID NOs: 13 e 26, respectivamente.
6. Anticorpo monoclonal ou parte de ligação a antígeno de acor- do com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida cadeia pesada e a cadeia leve compreendem as sequências de aminoácidos de: a) SEQ ID NOs: 103 e 102, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 136 e 138, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 137 e 138, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 139 e 147, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 149 e 155, respectivamente;
1) SEQ ID NOs: 149 e 156, respectivamente; g) SEQ ID NOs: 158 e 165, respeciivamente; h) SEQ ID NOs: 158 e 166, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 159 e 165, respectivamente; )) SEQ ID NOs: 159 e 166, respectivamente; k) SEQ ID NOs: 161 e 166, respectivamente; ou 1) SEQ ID NOs: 163 e 166, respectivamente.
7. Anticorpo monoclonal anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada e a cadeia leve do referido anticorpo compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 272 e 273, respectivamente, sem as sequências de sinaliza- ção.
8. Anticorpo monoclonal anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, caracierizado pelo fato de que a cadeia pesada e a cadeia leve do referido anticorpo compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 274 e 275, respectivamente, sem as sequências de sinaliza- ção.
9. Anticorpo monocional anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada e a cadeia leve do referido anticorpo compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 276 e 278, respectivamente, sem as sequências de sinaliza- ção.
10. Anticorpo monocional anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada e a cadeia leve do referido anticorpo compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 277 e 278, respectivamente, sem as sequências de sinaliza- ção.
11. Anticorpo monoclional anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada e a cadeia leve do referido anticorpo compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 279 e 280, respectivamente, sem as sequências de sinaliza- ção.
12. Anticorpo monoclonal anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, caracierizado pelo fato de que a cadeia pesada e a cadeia leve do referido anticorpo compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 281 e 282, respectivamente, sem as sequências de sinaliza- ção
13. Anticorpo monocional anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve do referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 102, 138, 145-148, 153-157 e 164-
168.
14. Anticorpo monocional anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve do referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 273, 275, 278, 280 e 282, sem as se- — quências de sinalização.
15. Cadeia leve ou parte desta de anticorpo, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 102, 138, 145-148, 153-157, 164-168, 273, 275, 278, 280 e 282, sem as sequências de sinalização, se presentes.
16. Anticorpo monocional anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada do referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 103, 136, 137, 139-144, 149-152 e 158-163.
17. Anticorpo monoclional anti-CD52 humana ou parte de ligação a antígeno deste, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada do referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 272, 274, 276, 277, 279 e 281, sem as sequências de sinalização.
18. Cadeia pesada ou parte desta de anticorpo, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 103, 136, 137, 139-144, 149-
152, 158-163, 272, 274, 276, 277, 279 e 281, sem as sequências de sinali- zação se presentes.
19. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifi- ca a cadeia pesada ou uma parte de ligação a antígeno desta, ou da cadeia leve ou de parte de ligação a antígeno desta de um anticorpo ou parte de ligação a antígeno deste como definido em qualquer uma das reivindicações 1a14,16e 17.
20. Uso de um ácido nucleico isolado compreendendo uma se- quência de nucleotídeos de cadeia pesada e um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeos de cadeia leve, caracteri- zado pelo fato de ser para a produção de um medicamento para tratar um paciente em necessidade deste, em que a referida sequência de nucleotí- deos de cadeia pesada e a sequência de nucleotídeos de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo constituído por: à) SEQ ID NO: 283 e SEQ ID NO: 284, respectivamente, ambas sem sequências codificadoras de peptídeos de sinalização; b) SEQ ID NO: 285 e SEQ ID NO: 286, respectivamente, ambas sem sequência codificadoras de peptídeos de sinalização; c) SEQ ID NO: 287 e SEQ ID NO: 289, respectivamente, ambas sem sequências codificadoras de peptídeos de sinalização; d) SEQ ID NO: 288 e SEQ ID NO: 289, respectivamente, ambas sem sequências codificadoras de peptídeos de sinalização; e) SEQ ID NO: 290 e SEQ ID NO: 291, ambas, respectivamente, sem sequências codificadoras de peptídeos de sinalização; e SEQ ID NO: 292 e SEQ ID NO: 293, ambas, respectivamente, sem sequências codificadoras de peptídeos de sinalização.
21. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compre- ende uma primeira sequência de ácido nucleico codificadora da cadeia pe- sada ou de parte de ligação a antígeno desta de um anticorpo monoclonal — como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 16 e 17, a referi- da primeira sequência de ácido nucleico, ligada operacionalmente a um ele- mento de controle de expressão, e uma segunda sequência de nucleico co-
dificando a cadeia leve ou uma parte de ligação a antígeno desta do referido anticorpo monoclional, a referida segunda sequência de ácido nucleico, liga- da operacionalmente a um elemento de controle de expressão.
22. Anticorpo monocilonal ou parte de ligação a antígeno de a- cordo com a reivindicação 1 a 14, 16 e 17, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de uma doença autoimune.
23. Anticorpo monocional ou parte de ligação a antígeno de a- cordo com a reivindicação 1 a 14, 16 e 17, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de câncer.
24. Anticorpo monoclonal ou parte de ligação a antígeno de a- cordo com a reivindicação 1 a 14, 16 e 17, caracterizado pelo fato de ser para inibir a angiogênse.
25. Uso do anticorpo monocional ou parte de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 16 e 17, caracteri- zado pelo fato de ser para a produção de um medicamento para tratar uma doença autoimune em um paciente em necessidade deste.
26. Uso do anticorpo monocional ou parte de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 16 e 17, caracteri- zado pelo fato de ser para a produção de um medicamento para tratar cân- cerem um paciente em necessidade deste.
27. Uso do anticorpo monoclional ou parte de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 16 e 17, caracteri- zado pelo fato de ser para a produção de um medicamento para tratar um paciente em necessidade de transplante.
28. Uso do anticorpo monoclonal ou parte de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 16 e 17, caracteri- zado pelo fato de ser para a produção de um medicamento para tratar neo- vascularização em um paciente em necessidade deste.
29. Uso do anticorpo ou parte de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 16 e 17, caracterizado pelo fato de ser como medica- mento.
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