BRPI0908878B1 - Polinucleotídeo e polipeptídeos isolados, vetor, célula hospedeira recombinante, métodos para fabricação de um polinucleotídeo e polipeptídeo,usos de um polipeptídeo isolado, composição de enzima para panificação,composição para panificação, métodos para preparar um produto de laticínio ou uma massa ou um produto assado ou um bolo, massa e produto assado - Google Patents

Abstract

LIPASES COM ESPECIFICIDADE ALTA EM RELAÇÃO AOS ÁCIDOS GRAXOS DE CADEIA CURTA E USO DAS MESMAS. A presente invenção se refere às novas sequências de polinucleotídeo compreendendo genes que codificam novas enzimas lipolíticas, bem como equivalentes funcionais do gene ou as sequências de aminoácido como homologia alta em relação às mesmas. A invenção também se refere aos métodos de emprego destas enzimas lipolíticas nos processos industriais, por exemplo, na indústria de laticínios ou panificação.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere às sequências de polinucleotídeo identificadas recentemente compreendendo genes que codificam uma nova enzima lipolítica. A invenção caracteriza a sequência de codificação de comprimento pleno do novo gene, bem como a sequência de aminoácido da proteína funcional de comprimento pleno e equivalentes funcionais do gene ou da sequência de aminoácido. A invenção também se refere aos métodos de emprego destas proteínas nos processos industriais, por exemplo, na indústria de alimentos, tal como a indústria de laticínios. Também estão incluídas na invenção as células transformadas com um polinucleotídeo de acordo com a invenção, apropriadas para produção destas proteínas e células.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

As lipases são enzimas que catalisam a hidrólise das ligações de éster nos substratos de lipídeo, conduzindo à liberação de ácidos graxos. As lipases são usadas nas aplicações de laticínios para geração de sabor, de forma mais importante nos queijos. Tradicionalmente, as preparações de lipase para ruminantes são usadas derivadas de cabra, cabrito, bezerro ou carneiro. Estas são derivadas de tecidos pré-gástricos destes ruminantes e estas preparações de lipase são também referidas como esterases pré-gástricas. Preparações comerciais estão no mercado, tais como, Piccantse® C, L, KG e K (DSM Food Specialties, Países-Baixos). Estas lipases são úteis na preparação de uma variedade de queijos italianos, espanhóis, gregos e franceses. O desenvolvimento de um perfil de sabor específico nestes tipos de queijo durante a maturação é grande, devido à ação das lipases na gordura do leite. As lipases catalisam a hidrólise da gordura do leite com geração de ácidos graxos livres. Ditos ácidos graxos podem apresentar cadeias curtas (ácidos graxos C4-C6, tais como, contendo 4 ou 6 átomos de carbono, isto é, ácido butírico, capróico) e de cadeia média a longa (ácidos graxos C12- C18). Subsequentemente, os ácidos graxos livres podem participar das reações químicas, por exemplo, a formação de compostos de sabor, tais como, acetoacetato, ácidos beta- ceto, metil cetonas, ésteres e lactonas. A conversão dos ácidos graxos nos componentes de sabor pode ser catalisada pelas enzimas originando da população microbiana no queijo.

Ê conhecido que o tipo de ácidos graxos livres liberados pelas lipases no queijo pode ser influenciado pelo tipo de lipases usadas. Por exemplo, as lipases que liberam primariamente ácidos graxos de cadeia curta (por exemplo, ácidos graxos contendo C4 e C6) conduzem ao desenvolvimento de um sabor picante, forte, temperado, penetrante, enquanto a liberação dos ácidos graxos de cadeia média a longa pode conduzir a um sabor de sabão. As lipases encontram uso crescente em outras aplicações de laticínios diferentes dos queijos, tais como, Queijo Modificado com Enzima (EMC; Wilkinson e outros em Encyclopedia of Dairy Sciences, (2003; Fox e outros Eds, Academic Press) pp. 434-438) ou a hidrólise da gordura de manteiga e creme e suas aplicações (Kilara em Encyclopedia of Dairy Sciences, (2003; Fox e outros Eds, Academic Press) pp. 914-918).

Lipases de ruminantes são preferidas em relação às lipases microbianas em razão de sua especificidade para liberar ácidos graxos de cadeia curta (ácidos graxos contendo C4, C6) da gordura do leite. Estes compostos são tanto compostos saborizantes propriamente quanto são convertidos em ésteres voláteis com um impacto de sabor específico (Liu e outros, Int. Dairy J. 2004, 14, 923-945). Uma questão interessante é a composição de lipases de ruminantes, que é o tópico de vários documentos (por exemplo, Addis e outros Int. dairy J. (2005) 15, 1271-1278; Richardson e outros, J. Dairy Sei. (1967) 50, 1061-1065; Addid e outros Int. Dairy J. (2005) 15, 563-569; Hamosh Nutrition (1990) 6, 421-428; Calvo e outros (2004) J. Dairy Sei. 87, 1 132-1142). Os dados apresentados conduzem a conclusão de que a maioria das enzimas dos ruminantes se constitui provavelmente em misturas de 2 ou mais lipases e que variações na composição ocorrem levando a alterações do desempenho na formação do sabor do queijo. Esta variação leva a indústria a buscar fontes de enzima alternativas com consistência melhorada. A ocorrência de doenças nos animais tais como esfoladura e da vaca louca é outro fator que leva a indústria a buscar alternativas. Suporte adicional vem do desejo de se ter acesso fácil aos produtos de qualidade Kosher e Halal. Existe, portanto, um forte desejo da indústria de buscar alternativas para as lipases derivadas de animais.

O Pedido de Patente US2004/0001819 descreve a clonagem e expressão de esterase pré-gástrica de cabrito na levedura Pichia pastoris. Embora potencialmente interessante, a enzima é fracamente produzida e além disto, o perfil de liberação do ácido graxo livre comutou para ácidos graxos de cadeia mais longa, em comparação à esterase de cabrito original. Estes dois aspectos tornaram esta enzima não atraente em razão da fraca economia e pouco desempenho na aplicação. Uma alternativa preferida seriam as lipases microbianas ou lipases (microbianas) produzidas recombinantemente por microorganismos.

Várias lipases microbianas estão no mercado (por exemplo, vide, Bjurlin e outros, JAOCS (2001) 78, 153-160). A característica mais importante das lipases microbianas para aplicação em queijos é seu perfil de liberação de ácido graxo da gordura do leite, que mimetizaria tão próximo quanto possível as lipases derivadas de animais. Lipases microbianas são, entretanto, melhoradoras fracas a este respeito, uma vez que elas possuem uma preferência pela liberação de ácidos graxos de cadeia longa (C12-C18) em relação aos ácidos graxos de cadeia curta (C4, C6). Isto frequentemente conduz à formação de um gosto de sabão e não a um sabor picante desejado. Portanto, a despeito do fato de que existe um número considerável de preparações de lipase microbiana comerciais no mercado, ainda existe uma necessidade industrial de uma lipase não derivada de animal que possa substituir as lipases derivadas de animais, tais como, lipases pré-gástricas de ruminantes.

DESCRIÇÃO DA FIGURA

Figura 1: Perfil de FFA gerado por enzimas lipolíticas L01, L03, L04 e por uma lipase microbiana comercial de Rhizomucor miehei (Piccantase® R8000) na pasta do queijo Cheddar em comparação ao perfil de FFA do queijo parmesão.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

Ê um objetivo da presente invenção prover novas enzimas lipolíticas que são apropriadas para serem usadas na indústria de laticínios, mais especificamente na fabricação de queijo e produtos semelhantes a queijo, na lipólise de gordura de manteiga ou creme ou na produção de queijo modificado com enzima. Adicionalmente, é um objetivo da invenção prover novos polinucleotídeos codificando as novas enzimas lipolíticas. Um objetivo adicional é prover enzimas lipolíticas produzidas recombinantemente bem como cepas recombinantes produzindo as mesmas. Também, polipeptídeos de fusão fazem parte da invenção, bem como métodos para fabricação e uso dos polinucleotídeos e polipeptídeos de acordo com a invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê uma enzima lipolítica que é apropriada para ser usada na indústria de laticínios. Surpreendentemente, a nova enzima lipolítica é extremamente apropriada ao uso na produção de sabor por modificação enzimática dos ingredientes de alimento contendo lipídeo, preferivelmente queijo. A nova enzima lipolítica pode ser vantajosamente usada também na maturação do queijo, na fabricação de produtos semelhantes ao queijo. No creme ou modificação da gordura de manteiga. Adicionalmente, a enzima pode ser apropriadamente usada também em outras aplicações alimentícias, tais como, na fabricação de produtos de panificação.

A invenção provê, adicionalmente, novos polinucleotídeos codificando novas enzimas lipolíticas.

O polinucleotídeo de acordo com a invenção compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada de: (a) a sequência de nucleotídeo conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou um equivalente funcional da mesma possuindo pelo menos 90% de homologia em relação à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1; (b) uma sequência de nucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo sendo o complemento da SEQ ID NO: 1 e onde a dita sequência é pelo menos 90% homóloga à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1; (c) uma sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 2 ou um equivalente funcional da mesma possuindo pelo menos 90% de homologia com relação ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ; (d) uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo isolado possuindo atividade lipolítica que é um equivalente funcional do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, que possui pelo menos 60% de homologia em relação ao polipeptídeo maduro e o polipeptídeo isolado possuindo um grau de especificidade na direção da Rspec óe triglicerídeos que é pelo menos de 0,7; (e) uma sequência que é degenerada como resultado da degeneração do código genético em uma sequência conforme definida em qualquer um de (a), (b), (c), (d); (f) uma sequência de nucleotídeo que é o complemento de uma sequência de nucleotídeo conforme definida em (a), (b), (c), (d), (e) .

Especificamente, a invenção provê polinucleotídeos possuindo sequência de nucleotídeo que hibridiza, preferivelmente sob condições de estringência alta com um polinucleotídeo sendo o complemento da SEQ ID NO: 1 e onde dita sequência é pelo menos 90% homóloga à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1. Consequentemente, a invenção provê polinucleotídeos que são pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, 93%, 94%, 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% homólogas em relação à sequência de acordo com a SEQ ID NO: 1.

Em uma concretização, tal polinucleotídeo isolado pode ser obtido sinteticamente, por exemplo, por síntese de fase sólida ou por outros métodos conhecidos de um versado na técnica.

Em outra concretização, a invenção provê um gene de enzima lipolítica de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou equivalentes funcionais que ainda estão codificando a enzima ativa.

Preferivelmente o polinucleotídeo de acordo com a invenção é uma sequência de DNA.

A invenção também se refere aos vetores compreendendo uma sequência de polinucleotídeo de acordo com a invenção e iniciadores, sondas e fragmentos que podem ser usados para ampliar ou detectar o DNA de acordo com a invenção.

Em uma concretização adicionalmente preferível, o vetor é provido onde a sequência de polinucleotídeo de acordo com a invenção é operaveImente ligada a pelo menos uma sequência reguladora permitindo a expressão da sequência de polinucleotídeo em uma célula hospedeira apropriada. Preferivelmente, tal célula hospedeira apropriada é um fungo filamentoso, mais preferivelmente espécie Aspergillus. Cepas apropriadas pertencem a Aspergillus Níger, oryzae ou nidulans. Preferivelmente a célula hospedeira é Aspergillus niger.

A invenção também se refere às células hospedeiras produzidas recombinantemente que contêm polinucleotídeos de acordo com a invenção.

A invenção também provê métodos para preparação de polinucleotídeos e vetores de acordo com a invenção.

Em outra concretização, a invenção provê células hospedeiras recombinantes onde a expressão de um polinucleotídeo de acordo com a invenção é significativamente aumentada ou onde o nível de produção da atividade lipolítica é significativamente melhorado.

Em outra concretização a invenção provê uma célula hospedeira produzida recombinantemente que contém DNA heterólogo ou homólogo de acordo com a invenção e onde a célula é capaz de produzir uma enzima lipolítica funcional de acordo com a invenção, isto é, é capaz de expressar ou preferivelmente superexpressar um polinucleotídeo codificando a enzima lipolítica de acordo com a invenção, por exemplo, uma cepa Aspergillus compreendendo um número de cópias aumentado de um gene de acordo com a invenção.

Ainda em outro aspecto da invenção é provido um polipeptídeo isolado possuindo atividade lipolítica. Os polipeptídeos de acordo com a invenção compreendem uma sequência de aminoácido selecionada de: (a) uma sequência de aminoácido de acordo com o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 ou um equivalente funcional do mesmo apresentando uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga em relação ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo que é um equivalente funcional do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, que é pelo menos 60% homólogo em relação ao dito polipeptídeo maduro e o qual polipeptídeo apresenta um grau de especificidade na direção da RSpec dos triglicerídeos que é pelo menos de 0,7; (c) uma sequência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Preferivelmente o polipeptídeo de acordo com a invenção apresenta um grau de especificidade na direção da Rspec dos triglicerídeos que é pelo menos de 0,7, preferivelmente, pelo menos 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 1,7, 2, 2,5, 3.

Em uma concretização a invenção também se refere a um polipeptídeo isolado apresentando atividade lipolítica que é um equivalente funcional do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% homólogo em relação ao dito polipeptídeo maduro e o qual polipeptídeo isolado apresenta um grau de especificidade na direção da Rspec dos triglicerídeos que é pelo menos de 0,7, preferivelmente, pelo menos 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 1,7, 2, 2,5, 3. A invenção também se refere a um polinucleotídeo que compreende um polinucleotídeo codificando dito polipeptídeo. A Rspec é definida adicionalmente no relatório descritivo.

Proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo de acordo com a invenção também estão dentro do escopo da invenção. A invenção também provê métodos para fabricação de polipeptídeos de acordo com a invenção.

A invenção também se refere ao uso da enzima lipolítica de acordo com a invenção em qualquer processo industrial conforme descrito no presente documento, mais especificamente na indústria alimentícia, por exemplo, na indústria de laticínios ou de panificação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Polinucleotídeos

A presente invenção provê em um primeiro aspecto um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada de: (a) uma sequência de nucleotídeo conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou um equivalente funcional da mesma apresentando pelo menos 90% de homologia em relação à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1; (b) uma sequência de nucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo sendo o complemento da SEQ ID NO: 1 e onde dita sequência é pelo menos 90% homóloga à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1; (c) uma sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 ou um equivalente funcional da mesma apresentando pelo menos 90% de homologia em relação ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2; (d) uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo isolado apresentando atividade lipolítica que é um equivalente funcional do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, que é pelo menos 60% homólogo em relação ao dito polipeptídeo maduro e o polipeptídeo isolado apresentando um grau de especificidade na direção da Rspec dos triglicerídeos que é pelo menos de 0,7; (e) uma sequência que é degenerada como um resultado da degeneração do código genético em relação a uma sequência conforme definida em qualquer um dentre (a), (b) , (C), (d); (f) uma sequência de nucleotídeo que é o complemento de uma sequência de nucleotídeo conforme definido em (a) , (b) , (c) , (d) , (e) .

Em uma concretização, a presente invenção provê polinucleotídeos codificando enzimas lipolíticas, apresentando uma sequência de aminoácido correspondendo ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 ou equivalentes funcionais apresentando pelo menos 90% de homologia em relação à sequência de aminoácido correspondendo ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2.

No contexto da presente invenção "polipeptídeo maduro" é definido no presente documento como um polipeptídeo apresentando atividade lipolítica que está em sua forma final seguindo-se tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como, processamento de término N, truncagem de término C, glicosilação, fosforilação, etc. O processo de maturação pode depender do vetor de expressão específico usado, do hospedeiro da expressão e do processo de produção. Preferivelmente, o polipeptídeo maduro constitui os aminoácidos 34 a 304 na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2. A "sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo maduro" é definida no presente documento como a sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo maduro. Preferivelmente a sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo maduro constitui os nucleotídeos 100 a 912 na SEQ ID NO: 1.

Em outra concretização a invenção se refere um polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo isolado apresentando atividade lipolítica que é um equivalente funcional do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% homólogo em relação ao dito polipeptídeo maduro e o polipeptídeo isolado apresentando um grau de especificidade na direção da Rspec dos triglicerídeos que é pelo menos de 0,7, preferivelmente, pelo menos 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 1,7, 2, 2,5, 3. A invenção também se refere a um polinucleotídeo que compreende um polinucleotídeo codificando dito polipeptídeo. A Rspec é definida adicionalmente no relatório descritivo.

A invenção provê sequências de polinucleotídeos compreendendo o gene codificando a enzima lipolítica bem como sua sequência de codificação. Consequentemente, a invenção se refere a um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1 ou às variantes, tais como, equivalentes funcionais do mesmo apresentando pelo menos 90% de homologia em relação à SEQ ID NO: 1.

Especificamente, a invenção se refere a um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeo que hibridiza, preferivelmente sob condições estringentes, mais preferivelmente sob condições altamente estringentes, ao complemento de um polinucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1 e onde preferivelmente a dita sequência é pelo menos 90% homóloga à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1.

Mais especificamente, a invenção se refere a um polinucleotídeo isolado compreendendo ou consistindo essencialmente em uma sequência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1. Tal polinucleotídeo isolado pode ser obtido por síntese com métodos conhecidos dos versados na técnica.

Conforme empregado no presente documento, os termos "gene" e "gene recombinante" se referem às moléculas de ácido nucléico que podem ser isoladas do DNA cromossômico, que incluem um quadro de leitura aberta codificando uma proteína, por exemplo, uma enzima lipolítica. Um gene pode incluir sequências de codificação, sequências de não codificação, introns e sequências reguladoras. Além disto, um gene se refere a uma molécula isolada de ácido nucléico ou polinucleotídeo conforme definido no presente documento.

Uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, tal como uma molécula de ácido nucléico apresentando a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ou um equivalente funcional da mesma pode ser isolada utilizando técnicas de biologia molecular padrão e as informações de sequência providas no presente documento. Por exemplo, utilizando toda ou parte da sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 1 como uma sonda de hibridização, moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção podem ser isoladas utilizando técnicas de hibridização e clonagem padrão (por exemplo, conforme descrito em Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Além disto, uma molécula de ácido nucléico englobando toda ou uma parte da SEQ ID NO: 1 pode ser isolada por reação da cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos escolhidos com base nas informações de sequência contidas na SEQ ID NO: 1.

Um ácido nucléico da invenção pode ser ampliado utilizando DNAc, RNAm ou alternativamente, DNA genômico, como um molde e iniciadores de oligonucleotídeo apropriados de acordo com técnicas de ampliação de PCR padrão. 0 ácido nucléico assim ampliado pode ser clonado dentro de um vetor apropriado e caracterizado por análise de sequência de DNA.

Adicionalmente, oligonucleotídeos correspondendo a ou hibridizáveis no complemento das sequências de nucleotídeos de acordo com a invenção podem ser preparados por técnicas sintéticas padrão, por exemplo, utilizando um sintetizador de DNA automatizado.

Em uma concretização preferida, uma molécula de ácido nucléico isolada da invenção compreende a sequência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1. A sequência da SEQ ID NO: 1 codifica o polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 2 e a enzima lipolítica de acordo com o polipeptídeo maduro na SEQ ID NO: 2. A enzima lipolítica de acordo com o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 é indicada como L01. A sequência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1 é indicada como DNA L01.

Em outra concretização preferida, uma molécula de ácido nucléico isolada da invenção compreende uma molécula de ácido nucléico que é um complemento da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1 ou um equivalente funcional destas sequências de nucleotídeos.

Uma molécula de ácido nucléico que é complementar a outra sequência de nucleotídeo é uma que é suficientemente complementar a outra sequência de nucleotídeo, tal que, ela pode hibridizar em outra sequência de nucleotídeo, pelo que, formando um duplexo estável.

Um aspecto da invenção se refere às moléculas de ácido nucléico isoladas que codificam um polipeptídeo da invenção ou uma variante, tal como um equivalente funcional do mesmo, por exemplo um fragmento ou domínio biologicamente ativo, bem como moléculas de ácido nucléico suficientes para uso como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucléico codificando um polipeptídeo da invenção e fragmentos de tais moléculas de ácido nucléico apropriados para uso como iniciadores de PCR para a ampliação ou mutação das moléculas de ácido nucléico.

Um "polinucleotídeo isolado" ou "ácido nucléico isolado" é um DNA ou RNA que não é imediatamente contínuo com ambas as sequências de codificação com as quais ele é imediatamente contínuo (uma na extremidade 5' e uma na extremidade 3') no genoma ocorrendo naturalmente do organismo do qual ele se deriva. Assim, em uma concretização, o ácido nucléico isolado inclui algumas ou todas as sequências de não codificação 5' (por exemplo, promotoras) que são imediatamente contínuas à sequência de codificação. O termo portanto inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado ao vetor em um plasmídeo ou vírus de replicação autônoma ou dentro do DNA genômico de um procarioto ou eucarioto ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um fragmento de DNAc ou DNA genômico produzido por PCR ou tratamento de endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Também inclui um DNA recombinante que é parte de um gene híbrido codificando um polipeptídeo adicional que é substancialmente isento de material celular, material virótico ou meio de cultura (quando produzido por técnicas de DNA recombinantes) ou precursores químicos ou outras substâncias químicas (quando quimicamente sintetizadas). Além disto, um "fragmento de ácido nucléico isolado" é um fragmento de ácido nucléico que não ocorre naturalmente como um fragmento e não seria encontrado no estado natural.

Conforme empregado no presente documento, os termos "polinucleotídeo" ou "molécula de ácido nucléico" incluem moléculas de DNA (por exemplo, DNAc ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, RNAm) e análogos de DNA ou RNA gerado usando análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucléico pode ser de filamento simples ou duplo, porém preferivelmente é um DNA de filamento duplo. O ácido nucléico pode ser sintetizado usando análogos de oligonucleotídeo ou derivados (por exemplo, inosina ou nucleotídeos de fosforotioato). Tais oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, para preparar ácidos nucléicos que tenham capacidades de emparelhamento de base alteradas ou resistência aumentada às nucleases.

Outra concretização da invenção provê uma molécula de ácido nucléico isolado que é antissentido em relação à molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção, por exemplo, o filamento de codificação de uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção.

Também estão incluídos no escopo da invenção os filamentos complementares dos polinucleotídeos de acordo com a invenção.

Fragmentos de ácido nucléico, sondas e iniciadores

Uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção pode compreender apenas uma porção ou um fragmento da sequência de ácido nucléico de acordo com SEQ ID NO: 1, por exemplo um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciado ou um fragmento codificando uma porção da proteína de acordo com a invenção. A sequência de nucleotídeo de acordo com a invenção permite a geração de sondas e iniciadores designados para uso na identificação e/ou clonagem de equivalentes funcionais da proteína de acordo com a invenção apresentando pelo menos 90% de homologia em relação à proteína de acordo com SEQ ID NO: 2. A sonda/iniciador compreende tipicamente oligonucleotídeo substancialmente purificado que compreende tipicamente uma região da sequência de nucleotídeo que hibridiza preferivelmente sob condições altamente estringentes pelo menos cerca de 12 ou 15, preferivelmente cerca de 18 ou 20, preferivelmente cerca de 22 ou 25, mais preferivelmente cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ou 75 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma sequência de nucleotídeo de acordo com a invenção.

As sondas com base na sequências de nucleotídeo de acordo com a invenção, mais preferivelmente com base na SEQ ID NO:1 podem ser empregadas para detectar transcritos ou sequências genômicas codificando as mesmas ou proteínas homólogas, por exemplo, nos organismos. Nas concretizações preferidas, a sonda compreende adicionalmente um grupo marcador anexado a mesma, por exemplo, o grupo marcador pode ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator de enzima. Tais sondas podem também ser usadas como parte de um kit de teste de diagnóstico para identificar as células que expressam uma proteína de acordo com a invenção.

Identidade e homologia

Os termos "homologia" ou "porcentagem de identidade" são usados alternadamente no presente documento. Para a finalidade desta invenção, é definido no presente documento que, a fim de determinar a porcentagem de homologia de duas sequências de aminoácido ou de duas sequências de ácido nucléico, as sequências são alinhadas para fins de comparação de comparação ótima. A fim de otimizar o alinhamento entre as duas sequências, fendas podem ser introduzidas em qualquer uma das duas sequências que são comparadas. Tal alinhamento pode ser realizado por todo o comprimento pleno das sequências sendo comparadas. Alternativamente, o alinhamento pode ser realizado por um comprimento curto, por exemplo, cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucléicos/base ou aminoácidos. A identidade é a porcentagem de emparelhamentos idênticos entre duas sequências sobre a região alinhada reportada.

Uma comparação das sequências e determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. O versado na técnica estará ciente do fato de que vários programas de computador diferentes estão disponíveis para alinhar duas sequências e determinar a homologia entre duas sequências (Kruskal, J. B. (1983). An overview of squence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of Sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). A porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeo pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências. (Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Ambas sequências de aminoácido e sequências de nucleotídeo podem ser alinhadas pelo algoritmo. O algoritmo de Needleman- Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para a finalidade desta invenção, o programa NEEDLE do pacote EMBOSS foi empregado (versão 2.8.0 ou mais atual, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden J. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276 - 277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para as sequências de proteína é usado EBLOSUM62 para substituição da matriz. Para sequência de nucleotídeo é usado o EDNAFULL. Os parâmetros opcionais usados são uma penalidade de abertura de fenda de 10 e uma penalidade de extensão de fenda de 0,5. 0 versado na técnica apreciará que todos estes parâmetros diferentes renderão resultados ligeiramente diferentes, porém que a porcentagem de identidade total das duas sequências não é significativamente alterada quando se usa algoritmos diferentes.

Após alinhamento pelo programa NEEDLE conforme descrito acima, a porcentagem de identidade entre uma sequência de questão e uma sequência da invenção é calculada como se segue: Número de posições correspondentes no alinhamento mostrando um aminoácido idêntico ou nucleotídeo idêntico em ambas sequências, dividido pelo comprimento total do alinhamento após subtração do número total de fendas no alinhamento. A identidade conforme definida no presente documento pode ser obtida de NEEDLE por emprego da opção NOBRIEF e é marcada na saída do programa como "identidade mais longa".

As sequências de ácido nucléico e proteína da presente invenção podem adicionalmente ser usadas como uma "sequência de questão" para realizar uma pesquisa contra bases de dados públicas para, por exemplo, identificar outros elementos da família ou sequências correlatas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (version 2.0) de Altschul, e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Pesquisas com nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, classificação = 100, comprimento da palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeo homólogas às moléculas de ácido nucléico da invenção. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, classificação 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácido homólogas para moléculas de proteína da invenção. Para obter os alinhamentos fendidos para fins de comparação, BLAST Fendido pode ser utilizado conforme descrito em Altschul e outros, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402. Quando se utiliza programas BLAST e BLAST Fendido, os programas padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser empregados. Vide a homepage do National Center for Biotechnology Information em http://www.ncbi.nlm,nih.gov/.

Hibridização

Conforme usado no presente documento, o termo "hibridização" se destina a descrever condições para hibridização e lavagem sob as quais as sequências de nucleotídeo pelo menos cerca de 60%, 65%, 80%, 85%, 90%, preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 95% e mais preferivelmente pelo menos 98% homólogas uma à outra tipicamente permanecem hibridizadas em relação ao complemento uma da outra.

Um exemplo preferido, não limitante de tais condições de hibridização são a hibridização em cloreto de sódio 6X/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 1 X SSC, 0,1% SDS a 50%, preferivelmente a 55°C, preferivelmente a 60°C e mesmo mais preferivelmente a 65°C.

Condições altamente estringentes incluem, por exemplo, hibridizando a 68°C em solução de 5 x SSC/5 x Denhardt/1,0% SDS e lavagem em 0,2 x SSC/0,1% SDS a temperatura ambiente. Alternativamente, a lavagem pode ser realizada a 42°C.

O versado na técnica saberá quais condições aplicar para condições de hibridização de estringência e condições altamente estringentes. Diretrizes adicionais com relação a tais condições estão prontamente disponíveis na técnica, por exemplo, em Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; e Ausubel e outros (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).

Naturalmente, um polinucleotídeo que hibridiza apenas em relação a uma sequência poli A (tal como trato poli (A) de término 3' de RNAms) , ou com relação aos resíduos de um estiramento complementar de T (ou U) não seria incluído em um polinucleotídeo da invenção usado para hibridizar especificamente uma porção de um ácido nucléico da invenção, uma vez que tal polinucleotídeo hibridizaria em qualquer molécula de ácido nucléico contendo um estiramento poli(A) ou um complemento da mesma (por exemplo, praticamente qualquer clone de DNAc de filamento duplo).

Obtenção de DNA de comprimento pleno de outros organismos

Em uma abordagem típica, bibliotecas de DNAc construídas de outros organismos, por exemplo, fungos filamentados, especificamente da espécies Fusarium podem ser classificadas.

Por exemplo, cepas Fusarium podem ser classificadas quanto aos polinucleotídeos homólogos com relação à SEQ ID NO: 1, por análise Northern blot. Mediante a detecção dos transcritos homólogos aos polinucleotídeos de acordo com a invenção, as bibliotecas de DNAc podem ser construídas de RNA isolado da cepa apropriada, utilizando técnicas padrão bem conhecidas dos versados na técnica. Alternativamente, uma biblioteca de DNA genômica total pode ser classificada usando uma sonda hibridizável em relação a um polinucleotídeo de acordo com a invenção.

As sequências gênicas homólogas podem ser isoladas, por exemplo, por desempenho de PCR usando dois grupos iniciadores de oligonucleotídeo degenerados projetados com base nas sequências de nucleotídeo conforme ensinado no presente documento.

O molde para a reação pode ser DNAc obtido por transcrição reversa de RNAm preparado de cepas conhecidas ou suspeitas de expressar um polinucleotídeo de acordo com a invenção. O produto da PCR pode ser subclonado e sequenciado para garantir que as sequências ampliadas representem as sequências de uma nova sequência de ácido nucléico de acordo com a invenção ou um equivalente funcional do mesmo.

O fragmento de PCR pode então ser usado para isolar um clone de DNAc de comprimento pleno por uma variedade de métodos conhecidos. Por exemplo, o fragmento ampliado pode ser marcado e usado para classificar um bacteriófago ou biblioteca de DNAc de cosmídeo. Alternativamente, o fragmento marcado pode ser usado para classificar uma biblioteca genômica.

A tecnologia de PCR também pode ser usada para isolar sequências de DNAc de comprimento pleno de outros organismos. Por exemplo, RNA pode ser isolado, seguindo procedimentos padrão, de um celular apropriado ou fonte de tecido. Uma reação de transcrição reversa pode ser realizada no RNA usando um iniciador de oligonucleotídeo específico para a maioria da extremidade 5' do fragmento ampliado para o início da primeira síntese de filamento.

O híbrido RNA/DNA resultante pode então ser "talhado" (por exemplo, com guaninas) usando uma reação de transferase terminal padrão, o híbrido pode ser digerido com RNase, H e segunda síntese de filamento pode então ser iniciada (por exemplo, com um iniciador poli-C). Assim, as sequências de DNAc a montante do fragmento ampliado podem ser facilmente isoladas. Para uma revisão das estratégias de clonagem úteis, vide, por exemplo, Sambrook e outros, supra e Ausubel e outros, supra.

Vetores

Outro aspecto da invenção se refere aos vetores, incluindo vetores de clonagem e expressão compreendendo uma sequência de polinucleotídeo de acordo com a invenção codificando um polipeptídeo possuindo atividade lipolítica ou um equivalente funcional do mesmo de acordo com a invenção. A invenção também se refere aos métodos de desenvolvimento, transformação ou transfecção de tais vetores em uma célula hospedeira apropriada, por exemplo, sob condições nas quais a expressão de um polipeptídeo da invenção ocorre. Conforme usado no presente documento, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucléico capaz de transporte de outro ácido nucléico ao qual ele foi ligado.

Polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados a um vetor replicável, recombinante, por exemplo, um vetor de clonagem ou expressão. 0 vetor pode ser usado para replicar o ácido nucléico em uma célula hospedeira compatível. Assim, em uma concretização adicional, a invenção provê um método para fabricação de polinucleotídeos da invenção por introdução de um polinucleotídeo da invenção em um vetor replicável, introdução do vetor no interior de uma célula compatível e desenvolvimento da célula hospedeira sob condições que realizam a replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado da célula hospedeira. Células hospedeiras apropriadas são descritas a seguir.

O vetor no qual o cassete de expressão ou polinucleotídeo da invenção é inserido pode ser qualquer vetor que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e a escolha do vetor frequentemente dependerá da célula hospedeira na qual ele deve ser introduzido.

Um vetor de acordo com a invenção pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extra-cromossômica, a replicação da qual é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado ao genoma da célula hospedeira e replicado em conjunto com o(s) cromossoma(s) nos quais foi integrado.

Um tipo de vetor é um "plasmídeo" que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor virótico, onde os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados dentro do genoma virótico. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira dentro da qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos possuindo uma origem bacteriana de replicação e vetores epissômicos de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetor epissômicos de não mamíferos) são integrados ao genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira e desta forma são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disto, determinadores vetores são capazes de direcionar a expressão dos genes aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são referidos no presente documento como "vetores de expressão". Em geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Os termos "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercaladamente no presente documento como o plasmídeo é a forma de vetor mais geralmente usada. Contudo, a invenção não pretende incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como, cosmídeos, vetores viróticos (por exemplo, retrovirus de replicação defeituosa, adenovirus e vírus adeno associado) e vetores fago que servem a funções equivalentes.

Os vetores de acordo com a invenção podem ser usados in vitro, por exemplo, para produção de RNA ou usados para transfectar ou transformar uma célula hospedeira.

Um vetor da invenção pode compreender dois ou mais, por exemplo, três, quatro ou cinco polinucleotídeos da invenção, por exemplo, para superexpressão.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucléico da invenção em uma forma apropriada para expressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira, o que significa que o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que são operavelmente ligadas à sequência de ácido nucléico a ser expressa.

Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operativamente ligado" significa que a sequência de nucleotídeo de interesse é ligada à(s) sequência (s) reguladora(s) de um modo que permite a expressão da sequência de nucleotídeo (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido em uma célula hospedeira), isto é, o termo "operativamente ligado" se refere a uma justaposição onde os componentes descritos estão em relação, permitindo que os mesmos funcionem em seu modo pretendido. Uma sequência reguladora, tal como um promotor, melhorador ou outro sinal de regulação de expressão "operavelmente ligado" a uma sequência de codificação é posicionado, tal que, um modo no qual a expressão da sequência de codificação é obtida sob condição compatível com as sequências de controle ou outras sequências, sendo dispostas tal que elas funcionam de acordo com suas finalidades pretendidas, por exemplo, a transcrição inicia em um promotor e prossegue através da sequência de DNA codificando o polipeptídeo.

O termo "sequência reguladora" inclui promotores, melhoradores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinal de poliadenilação). Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

O termo sequências reguladoras inclui aquelas sequências que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeo em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que direcionam a expressão das sequências de nucleotídeo apenas em determinada célula hospedeira (por exemplo, sequências reguladoras específicas para tecido).

Um vetor ou construção ou expressão para uma dada célula hospedeira pode assim compreender os seguintes elementos operavelmente ligados um ao outro em uma ordem consecutiva a partir da extremidade 5' para a extremidade 3' em relação ao filamento de codificação da sequência codificando o polipeptídeo da primeira invenção: (1) uma sequência promotora capaz de direcionar transcrição da sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo em uma dada célula hospedeira; (2) opcionalmente, uma sequência de sinal capaz de direcionar a secreção do polipeptídeo de uma dada célula hospedeira para um meio de cultura; (3) uma sequência de DNA da invenção codificando uma forma madura e preferivelmente ativa de um polipeptídeo possuindo atividade lipolítica de acordo com a invenção; e preferivelmente também (4) uma região de terminação de transcrição (terminadora) capaz de terminar a transcrição a jusante da sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo.

A jusante da sequência de nucleotídeo de acordo com a invenção pode haver uma região não traduzida 3' contendo um ou mais sítios de terminação de transcrição (por exemplo, um terminador). A origem do terminador é menos importante. O terminador pode, por exemplo, ser inerente à sequência de DNA codificando o polipeptídeo. Contudo, preferivelmente, um terminador de levedura é usado nas células hospedeiras de levedura e um terminador de fungo filamentoso é empregado nas células hospedeiras de fungo filamentoso. Mais preferivelmente, o terminador é endógeno em relação à célula hospedeira (na qual a sequência de 5 nucleotídeo codificando o polipeptídeo deve ser expressa).

Na região transcrita, um sítio de ligação de ribossoma para tradução pode estar presente. A porção de codificação das transcrições maduras expressas pelas construções incluirá uma AUG de início de tradução no começo e um códon de 10 terminação apropriadamente posicionado na extremidade do polipeptídeo a ser traduzido.

A expressão melhorada do polinucleotídeo da invenção pode também ser obtida pela seleção das regiões reguladoras heterólogas, por exemplo, regiões de promotor, 15 líder de secreção e/ou de terminador que podem servir para aumentar a expressão e, caso desejado, níveis de secreção da proteína de interesse do hospedeiro da expressão e/ou para prover o controle induzível da expressão de um polipeptídeo da invenção. 20 Será apreciado pelos versados na técnica que o projeto do vetor de expressão pode depender de fatores, tais como, a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser 25 introduzidos nas células hospedeiras para desta forma produzirem proteínas ou peptídeos, codificados pelos ácidos nucléicos conforme descrito no presente documento (por exemplo, o polipeptídeo possuindo atividade lipolítica de acordo com a invenção, formas mutantes do polipeptídeo, 30 fragmentos, variantes ou equivalentes funcionais dos mesmos, proteínas de fusão, etc.).

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser projetados para expressão dos polipeptídeos de acordo com a invenção nas células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser produzidos nas células bacterianas, tais como, E.coli e Bacilli, células de insetos (usando vetores de expressão de baculovírus), células de fungos, células de levedura ou células de mamíferos. Células hospedeiras apropriadas são discutidas adicionalmente em Goeddel, Gene Expression Technology: Métodos in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo usando sequências reguladoras de promotor T7 e polimerase T7.

Para a maioria dos fungos filamentados e leveduras, o vetor ou construção da expressão é preferivelmente integrada ao genoma da célula hospedeira a fim de ser obter transformantes estáveis. Contudo, para determinadas leveduras vetores epissômicos apropriados também estão disponíveis, nos quais a construção da expressão pode ser incorporada para expressão estável e de alto nível, exemplos incluem vetores derivados de plasmídeos 2 μ e pKDl de Saccharomyces e Kluyveromyces, respectivamente ou vetores contendo uma sequência AMA (por exemplo, AMAI de Aspergillus). No caso das construções de expressão serem integradas ao genoma das células hospedeiras, as construções são tanto integradas em locais aleatórios no genoma ou em locais alvo predeterminados usando recombinação homóloga, quando então os locais alvo compreendem, preferivelmente, um gene altamente expresso.

Consequentemente, os vetores de expressão úteis na presente invenção incluem vetores cromossômicos, epissômicos e derivados de vírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófago, epissoma de levedura, elementos cromossômicos de levedura, vírus, tais como, baculovírus, papovavírus, vírus vacínia, adenovirus, poxvirus das galinhas, vírus da pseudo-raiva e retrovirus e vetores derivados de combinações dos mesmos, tais como aqueles derivados de elementos genéticos de plasmídeo e bacteriófago, tais como, cosmídeos e fagemidos.

A inserção de nucleotídeo seria operativamente ligada a um promotor apropriado. Além do promotor nativo para o gene codificando o polipeptídeo da invenção, outros promotores podem ser usados para direcionar a expressão do polipeptídeo da invenção. O promotor pode ser selecionado por sua eficiência na direção da expressão do polipeptídeo da invenção no hospedeiro de expressão desejado. Exemplos de promotores que podem ser úteis na invenção incluem o promotor de fago lambda PL, os promotores E.coli lac, trp e TAC, os promotores SV40 precoce e tardio e promotores de retrovirus LTRs, para denominar alguns. Outros promotores apropriados serão conhecidos dos versados na técnica. Em uma concretização específica, são preferidos os promotores que são capazes de direcionar um alto nível de expressão dos polipeptídeos de acordo com a invenção em um fungo ou levedura. Tais promotores são conhecidos na técnica.

Vários promotores podem ser usados os quais são capazes de direcionar a transcrição das células hospedeiras da invenção. Preferivelmente, a sequência de promotor é derivada de um gene altamente expresso. Exemplos de genes altamente expressos preferidos dos quais os promotores são preferivelmente derivados e/ou que são compreendidos nos locais alvo predeterminados preferidos para integração das construções da expressão incluem, porém não estão limitados aos genes codificando enzimas glicolíticas, tais como, triosefosfato isomerases (TPI), gliceraldeído-fosfato desidrogenases (GAPDH) , fosfoglicerato cinases (PGK), piruvato cinases (PYK ou PKI), álcool desidrogenases (ADH), bem como genes codificando amilases, glicoamilases, proteases, xilanases, celobioidrolases, β-galactosidases, álcool (metanol)oxidases, fatores de alongamento e proteínas ribossômicas. Exemplos específicos de genes altamente expressos incluem, por exemplo, o gene LAC4 de Kluyveromyces sp., os genes de metanol oxidase (AOX e MOX) da Hansenula e Pichia, respectivamente, os genes da glicoamilase (glaA) de A. niger e A. awamori, o gene A oryzae TaKA-amilase, o gene A. nidulans gpdA e os genes de T.reesei celobiohidrolase.

Exemplos de promotores constitutivos e/ou induzíveis fortes que são preferidos para uso nos hospedeiros da expressão de fungos são aqueles que são obtidos dos genes de fungo para promotores de xilanase (xlnA), ftase, ATP-sintetase, subunidade 9 (oliC), triose fosfato isomerase (tpí), álcool desidrogenase (AdhA), a- amilase (amy), amiloglicosidase (AG do gene glaA), acetamidase (amdS) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpd) . Exemplos de promotores de levedura fortes são aqueles obtidos dos genes para álcool desidrogenase, lactase, 3-fosfoglicerato cinase e triosefosfato isomerase.

Exemplos de promotores bacterianos fortes são os promotores de α-amilase e SPo2 bem como promotores dos genes de protease extracelular.

Promotores apropriados para células vegetais incluem promotores de nopalina sintase (nos), octopina sintase (ocs), manopina sintase (mas), subunidade pequena de ribulose (rubisco ssu), histona, actina de arroz, faseolina, vírus mosaico da couve-flor (CMV) 35S e 19S e circovírus.

Todos os promotores mencionados acima são prontamente disponíveis na técnica.

O vetor pode incluir adicionalmente sequências flanqueando o polinucleotídeo o que propicia o surgimento ao RNA que compreende sequências homólogas às sequências genômicas eucarióticas ou sequências genômicas viróticas. Isto permitirá a introdução dos polinucleotídeos da invenção no genoma de uma célula hospedeira.

O vetor pode conter um polinucleotídeo da invenção orientado em uma direção de antissentido para prover a produção de RNA de antissentido.

O DNA do vetor pode ser introduzido nas células procarióticas ou eucarióticas através das técnicas de transformação convencional ou de transfecção. Conforme empregado no presente documento, os termos "transformação" e "transfecção" se referem a uma variedade de técnicas reconhecidas na arte para introdução do ácido nucléico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo fosfato de cálcio ou coprecipitação de cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transdução, infecção, lipofecção, transfecção mediada por lipídeo catiônico ou eletroporação. Métodos apropriados para transformação ou transfecção das células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, e outros {Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis e outros, Basic Methods in Molecular Biology (1986) e outros manuais de laboratório.

Para transfecção estável das células de mamíferos, é conhecido que, dependendo do vetor de expressão e técnica de transfecção usados, apenas uma pequena fração das células pode integrar o DNA estranho dentro do seu genoma. A fim de identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência aos antibióticos) é geralmente introduzido às células hospedeiras juntamente com o gene de interesse. Marcadores preferidos selecionáveis incluem, porém não estão limitados aos que conferem resistência aos medicamentos o que complementam um defeito na célula hospedeira. Eles incluem, por exemplo, genes marcadores versáteis que podem ser usados para transformação da maioria dos fungos e leveduras filamentados, tais como, genes de acetamidase ou DNAcs (os genes amdS, niaD, facA ou DNAcs de A. nidulans, A. oryzae ou A. niger) ou genes provendo resistência aos antibióticos, como G418, higromicina, bleomicina, canamicina, metotrexato, fleomicina, resistência a orbenomila (benA). Alternativamente, os marcadores de seleção específicos podem ser usados, tais como, marcadores auxotróficos, que requerem cepas hospedeiras mutantes correspondentes: por exemplo, URA3 (de S. cerevisiae ou genes análogos de outras leveduras) , pyrG ou pyrk (de A. nidulans ou A. niger) , argB (de A. nidulans ou A. niger) ou trpC. Em uma concretização preferida, o marcador de seleção é deletado da célula hospedeira transformada após introdução da construção de expressão, de modo a obter células hospedeiras transformadas capazes de produção de polipeptídeo que são isentas dos genes marcadores de seleção.

Outros marcadores incluem ATP sintetase, subunidade 9 (oliC), crotidina-5-fosfatodescarboxilase (pvrA), o gene resistente a G418 bacteriana (este pode também ser usado na levedura, porém não no fungo), o gene resistente a ampicilina (E. coli), o gene resistente a neomicina (Bacillus) e o gene E.coli uidA, codificando para β- glicuronidase (GUS). Os vetores podem ser usados in vitro, por exemplo, para a produção de RNA ou usados para transfectar ou transformar uma célula hospedeira.

A expressão das proteínas nos procariotes é frequentemente realizada em E.coli com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis direcionando a expressão das outras proteínas de fusão ou não fusão. Os vetores de fusão adicionam vários aminoácidos a uma proteína codificada, por exemplo, ao término amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão servem tipicamente a três finalidades: 1) para aumentar a expressão da proteína recombinante; 2) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) para ajudar na purificação da proteína recombinante por atuar como um ligante na purificação por afinidade. Frequentemente, nos vetores de expressão de fusão, um sítio de clivagem proteolítico é introduzido na junção da fração de fusão e a proteína recombinante para permitir separação da proteína f recombinante da fração de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão.

Conforme indicado, os vetores de expressão preferivelmente conterão marcadores selecionáveis. Tais marcadores incluem resistência à diidrofolato redutase ou neomicina para cultura de célula eucariótica e resistência à tetraciclina ou ampicilina para cultivo em E.coli e 10 outras bactérias. Exemplos representativos de hospedeiro apropriado incluem células bacterianas, tais como, E.coli, Streptomyces Salmonella typhimurium e determinadas espécies de Bacillus; células de fungos, tais como da espécie Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. oryzae e A. 15 nidulans, leveduras, tais como, Kluyveromyces, por exemplo, K. lactis e/ou Puchia, por exemplo, P. pastoris; células de isentos, tais como, Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células de animais, tais como, CHO, COS e Bowes melanoma; e células vegetais. Meios de cultura apropriados e condições para as 20 células hospedeiras descritas acima são conhecidos na técnica.

Vetores preferidos para uso nas bactérias são revelados, por exemplo, no WO-A1-2004/074468, sendo citados no presente documento como referência. Outros vetores 25 apropriados ficarão prontamente claros aos versados na técnica.

Promotores bacterianos conhecidos apropriados para uso na presente invenção incluem os promotores revelados no WO-A1-2004/074468, que são citados no presente documento 30 como referência.

A transcrição do DNA codificando os polipeptídeos da presente invenção por eucariotes maiores pode ser aumentada por inserção de uma sequência melhoradora ao vetor. Os melhoradores são elementos de acionamento cis do DNA, geralmente cerca de 10 a 3 00 pares de base que atuam para aumentar a atividade transcricional de um promotor em um dado tipo de célula hospedeira. Exemplos de melhoradores incluem o melhorador SV40 que está localizado no último lado da origem de replicação nos pares de base 100 a 270, o melhorador de promotor precoce de citomegalocírus, o melhorador de polioma no lado afastado da origem de replicação e os melhoradores de adenovirus.

Para secreção da proteína traduzida no lúmen do retículo endoplásmico, dentro do espaço periplásmico ou dentro do ambiente extracelular, o sinal de secretação apropriado pode ser incorporado ao gene expresso. Os sinais podem ser endógenos em relação ao polipeptídeo ou eles podem ser sinais heterólogos.

O polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser produzido em uma forma modificada, tal como, uma proteína de fusão e pode incluir não apenas sinais de secreção, porém também regiões funcionais heterólogas adicionais. Assim, por exemplo, uma região de aminoácidos funcionais, especificamente aminoácidos especificamente carregados, pode ser adicionada ao término N do polipeptídeo para aperfeiçoar a estabilidade e persistência na célula hospedeira, durante purificação ou durante manuseio e armazenamento subsequentes. Também, as frações de peptídeo podem ser adicionadas ao polipeptídeo para facilitar a purificação.

Polipeptídeos de acordo com a invenção

A invenção provê um polipeptídeo isolado possuindo atividade lipolítica compreendendo: (a) o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 ou um equivalente funcional do mesmo apresentando uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga em relação ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo que é um equivalente funcional do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, que é pelo menos 60% homólogo em relação ao dito polipeptídeo maduro e o qual polipeptídeo apresenta um grau de especificidade na direção da Rspec dos triglicerídeos que é pelo menos de 0,7; (c) uma sequência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo de acordo com a invenção.

Portanto, a invenção provê um polipeptídeo isolado apresentando atividade lipolítica compreendendo o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2, preferivelmente compreendendo aminoácidos 34-304 da SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácido obtida por expressão do polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1 em um hospedeiro apropriado. Também, é compreendido pela presente invenção um peptídeo ou polipeptídeo sendo um equivalente funcional e sendo pelo menos 90% homólogo em relação ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2.

Em outra concretização a invenção também se refere a um polipeptídeo isolado apresentando atividade lipolítica que é um equivalente funcional do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% homólogo em relação ao dito polipeptídeo maduro e o polipeptídeo isolado apresentando um grau de especificidade na direção da Rspec dos triglicerídeos que é pelo menos de 0,7, preferivelmente, pelo menos 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 1,7, 2, 2,5, 3. A Rspec será definida posteriormente no relatório descritivo.

Os polipeptídeos acima são compreendidos coletivamente no termo "polipeptídeos de acordo com a invenção".

Os termos "peptídeo" e "oligopeptídeo" são considerados sinônimos (como é comumente reconhecido) e cada termo pode ser usado intercaladamente conforme requeira o contexto pra indicar uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos acoplados por ligações de peptidila. A palavra "polipeptídeo" (ou proteína) é usada no presente documento para cadeias contendo mais de sete resíduos de aminoácido. Todas as fórmulas de oligopeptídeo e polipeptídeo ou sequências no presente documento são escritas da esquerda para a direita e na direção do término amino para o término carbóxi. O código de uma letra dos aminoácidos usado no presente documento é o geralmente conhecido na técnica e pode ser encontrado em Sambrook, e outros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .

Polipeptídeo ou proteína "isolado(a)" se refere a um polipeptídeo ou proteína removido de seu ambiente nativo. Por exemplo, polipeptídeos e proteínas produzidos recombinantemente nas células hospedeiras são considerados isolados para os fins da invenção como sendo polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram substancialmente purificados por qualquer técnica apropriada, tal como, por exemplo, o método de purificação de etapa única revelado em Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

Como é conhecido dos versados na técnica, é possível que os términos N da SEQ ID NO: 2 ou do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 possam ser heterólogos, bem como os términos C da SEQ ID NO: 2 ou do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2, devido aos erros de processamento durante a maturação. Especificamente, tais erros de processamento podem ocorrer quando da superexpressão do polipeptídeo. Além disso, a atividade de exo-protease pode propiciar a heterogeneidade. A extensão na qual a heterogeneidade ocorre depende também do hospedeiro e protocolos de fermentação que são usados. Tais artefatos de processamento de término C podem conduzir aos polipeptídeos mais curtos ou polipeptídeos mais longos, conforme indicado com a SEQ ID NO: 2 ou com o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 2. Como o resultado de tais erros, o término N pode também ser heterogêneo.

Em uma concretização adicional, a presente invenção provê um polinucleotídeo isolado codificando pelo menos um domínio funcional de um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 2 ou do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 2 que contém resíduos adicionais e inicia na posição -1 ou -2 ou -3, etc. Alternativamente, podem não estar presentes determinados resíduos e como uma conseqüência iniciar na posição 2, ou 3 ou 4, etc. Também os resíduos adicionais podem estar presentes no término C, por exemplo, na posição 347, 348 etc. Alternativamente, o término C pode não apresentar determinados resíduos e como uma consequência terminar na posição 345 ou 344, etc.

A enzima lipolítica de acordo com a invenção pode ser recuperada e purificada de culturas de célula recombinante por métodos conhecidos na técnica (Protein Purification Protocols, Methods in Molecular Biology series by Paul Cutler, Humana Press, 2004).

Polipeptídeos da presente invenção incluem produtos naturalmente purificados, produtos de procedimentos químicos sintéticos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes de um hospedeiro procariótico ou eucariótico, incluindo, por exemplo, células de bactérias, leveduras, plantas superiores, insetos e mamíferos. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos da presente invenção podem ser glicosilados ou não glicosilados. Além disto, os polipeptídeos da invenção também podem incluir um resíduo de metionina modificada, em alguns casos como o resultado dos processos mediados por hospedeiro.

Fragmentos de Polipeptídeo

A invenção também se refere aos fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeos de acordo com a invenção.

Fragmentos biologicamente ativos de um polipeptídeo da invenção incluem polipeptídeos compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente idênticas ou derivadas de uma sequência de aminoácido da proteína de acordo com a invenção (por exemplo, o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2) , que incluem menos aminoácidos que a proteína de comprimento pleno, porém que exibem pelo menos uma atividade biológica da proteína de comprimento pleno correspondente, preferivelmente que exibem atividade lipolítica. Tipicamente, os fragmentos biologicamente ativos compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade da proteína de acordo com a invenção. Um fragmento biologicamante ativo da proteína da invenção pode ser um polipeptídeo que é, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, ou mais aminoácidos menor em comprimento que o polipeptídeo maduro na SEQ ID NO: 2, e que possui pelo menos 90% de homologia em relação ao polipeptídeo maduro na SEQ ID NO: 2. Além disto, outras porções biologicamente ativas, nas quais outras regiões da proteína são deletadas, podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas quanto a uma ou mais atividades biológicas da forma nativa de um polipeptídeo da invenção.

A invenção também caracteriza fragmentos de ácido nucléico que codificam os fragmentos acima biologicamente ativos da proteína de acordo com a invenção.

Proteínas de Fusão

Os polipeptídeos de acordo com a invenção ou equivalentes funcionais dos mesmos, por exemplo, porções biologicamente ativas dos mesmos, podem ser operavelmente ligados a um polipeptídeo que não está de acordo com a invenção (por exemplo, sequências heterólogas de aminoácidos) para formar proteínas de fusão. Um "polipeptídeo que não está de acordo com a invenção" se refere a um polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido correspondendo a uma proteína que não é substancialmente homóloga a uma proteína de acordo com a invenção. Tal "não-polipeptídeo que não está de acordo com a invenção" pode ser derivado do mesmo ou de um organismo diferente. Dentro de uma proteína de fusão o polipeptídeo de acordo com a invenção pode corresponder a todos ou a um fragmento biologicamante ativo da enzima lipolítica de acordo com a invenção. Em uma concretização preferida, uma proteína de fusão compreende pelo menos duas porções biologicamente ativas da proteína de acordo com a invenção. Dentro da proteína de fusão, o termo "operaveImente ligado" indica que o polipeptídeo de acordo com a invenção e o polipeptídeo que não está de acordo com a invenção são fundidos um ao outro na estrutura. O polipeptídeo que não está de acordo com a invenção pode ser fundido ao término N ou ao término C do polipeptídeo.

Por exemplo, em uma concretização, a proteína de fusão é uma proteína de fusão na qual as sequências de aminoácidos são fundidas ao término C das sequências GST. Tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação da proteína recombinante de acordo com a invenção. Em outra concretização, a proteína de fusão de acordo com a invenção é uma proteína contendo uma sequência de sinal heteróloga no término N. Em determinadas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras de mamíferos e levedura), a expressão e/ou secreção da proteína de acordo com a invenção pode ser aumentada através do uso de uma sequência de sinal heteróloga.

Em outro exemplo, a sequência secretora gp67 da proteína de invólucro do baculovírus pode ser usada como uma sequência de sinal heteróloga (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outros, eds., John Wiley & Sons, 1992). Outros exemplos de sequências de sinal heterólogas eucarióticas incluem as sequências secretoras de melitina e fosfatase alcalina da placenta humana (Stratagene; La Jolla, Califórnia). Ainda em outro exemplo, sequências de sinal heterólogas procarióticas incluem o sinal secretor de phoA (Sambrook e outros, supra) e a proteína A secretora de sinal (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey).

Uma sequência de sinal pode ser empregada para facilitar a secreção e isolamento de uma proteína ou polipeptídeo da invenção. As sequências de sinal são tipicamente caracterizadas por um núcleo de aminoãcidos hidrófobos, que são geralmente clivados da proteína madura durante a secreção em um ou mais eventos de clivagem. Tais peptídeos de sinal contêm sítios de processamento que permitem a clivagem da sequência de sinal das proteínas maduras conforme as mesmas passam através da via secretora. A sequência de sinal dirige a secreção da proteína, tal como de um hospedeiro eucariótico no qual o vetor de expressão é transformado e a sequência de sinal é subsequente ou concorrentemente clivada. A proteína pode ser então prontamente purificada do meio extracelular por métodos conhecidos. Alternativamente, a sequência de sinal pode ser ligada à proteína de interesse usando uma sequencia, o que facilita a purificação, tal como com um domínio GST. Assim, por exemplo, a sequência codificando o polipeptídeo pode ser fundida a uma sequência de marcador, tal como uma sequência codificando um peptídeo, que facilita a purificação do polipeptídeo fundido. Em determinadas concretizações preferidas deste aspecto da invenção, a sequência de marcador é um peptídeo de hexa- histidina, tal como o marcador provido em um vetor pQE (Qiagen, Inc.), entre outros, muitos dos quais são comercialmente disponíveis. Conforme descrito em Gentz e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina provê purificação conveniente da proteína de fusão. O marcador HÁ é outro peptídeo útil para purificação que corresponde a um epítopo derivado da proteína de hemaglutinina da influenza, que foi descrita, por exemplo, por Wilson e outros, Cell 37:767 (1984).

Preferivelmente, uma proteína de fusão de acordo com a invenção é produzida por técnicas de DNA recombinante padrão. Por exemplo, fragmentos de DNA codificando as sequências diferentes de polipeptídeo são ligados em conjunto na estrutura de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, por emprego de términos de extremidade cega ou de extremidade de avanço para ligação, digestão da enzima de restrição para prover términos apropriados, enchimento das extremidades de coesão conforme apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar união indesejada e ligação enzimática. Em outra concretização, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, a ampliação por PCR dos fragmentos de gene pode ser realizada usando iniciadores de fixação, que propiciam ressaltos complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem subsequentemente ser recombinados e reampliados para gerar uma sequência de gene quimérico (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel e outros John Wiley & Sons: 1992). Além disto, muitos vetores de expressão são comercialmente disponíveis os quais já codificam uma fração de fusão (por exemplo, um polipeptídeo de GST) . Um ácido nucléico codificando um polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser clonado em tal vetor de expressão, tal que, a fração de fusão é ligada na estrutura à proteína de acordo com a invenção.

Equivalentes Funcionais

Os termos "equivalentes funcionais" e "variantes funcionais" são empregados intercaladamente no presente documento.

Equivalentes funcionais do polinucleotídeo de acordo com a invenção são polinucleotídeos isolados apresentando pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, preferivelmente pelo menos 90% de homologia em relação à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 e que codifica um polipeptídeo que exibe pelo menos uma função específica da enzima lipolítica de acordo com a invenção, preferivelmente um polipeptídeo apresentando atividade lipolítica. Um equivalente funcional de um polipeptídeo de acordo com a invenção é um polipeptídeo apresentando pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, preferivelmente pelo menos 90% de homologia em relação ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 e que exibe, pelo menos uma função de uma enzima lipolítica de acordo com a invenção, preferivelmente que exibe atividade lipolítica. Equivalentes funcionais conforme mencionados no presente documento também englobam fragmentos biologicamente ativos apresentando atividade lipolítica, conforme descrito acima.

Equivalentes funcionais do polipeptídeo de acordo com a invenção podem conter substituições de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro da sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 ou substituições, inserções ou deleções de aminoácidos que não afetam a funcionalidade específica da enzima. Consequentemente, uma substituição de aminoácido de funcionalidade neutra é uma substituição no polipeptídeo maduro da sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 que substancialmente não altera sua funcionalidade específica. Por exemplo, os resíduos de aminoácido que são conservados entre as proteínas da presente invenção são previstos para serem especialmente não receptíveis à alteração. Adicionalmente, os aminoácidos conservados entre as proteínas de acordo com a presente invenção e outras enzimas lipolíticas não são prováveis de serem receptivas à alteração.

Equivalentes funcionais dos polinucleotídeos de acordo com a invenção podem conter, tipicamente, mutações silenciosas ou mutações que não alterem a função biológica do polipeptídeo codificado. Consequentemente, a invenção provê moléculas de ácido nucléico codificando polipeptídeos de acordo com a invenção que contêm alterações nos resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma atividade biológica específica. Tais proteínas diferem na sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 e ainda retém pelo menos uma atividade biológica do mesmo, preferivelmente elas retém a atividade lipolítica. Em uma concretização, um equivalente funcional do polinucleotídeo de acordo com a invenção compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo de acordo com a invenção, onde o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido substancialmente homóloga de pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga em relação ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2. Em uma concretização, o equivalente funcional do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 apresentando pelo menos 90% de homologia em relação à mesma é o polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido de acordo com o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 4 (indicado a seguir como L02) , em outra concretização é o polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido de acordo com o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 6 (indicado a seguir como L03), e em outra concretização é o polipeptídeo apresentando uma sequência de aminoácido de acordo com o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 8 (indicado a seguir como L04). Em uma concretização preferida o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8 respectivamente é a sequência de aminoácidos 34 a 304 na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 OU SEQ ID NO: 8, respectivamente.

Um equivalente funcional do polinucleotídeo de acordo com a invenção codificando um polipeptídeo de acordo com a invenção compreenderá uma sequência de polinucleotídeo que é pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais homóloga em relação a uma sequência de ácido nucléico de acordo com SEQ ID NO 1. Em uma concretização um equivalente funcional do polinucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1 apresentando pelo menos 90% de homologia em relação à mesma é o polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 3 (indicado como DNA L02) , em outra concretização é o polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 5 (indicado como DNA L03), ainda em outra concretização é o polinucleotídeo apresentando uma sequência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 7 (indicado como DNA L04) . A sequência de polinucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 3 codifica o polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 4, a sequência de polinucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 5 codifica o polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 6, a sequência de polinucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 7 codifica o polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 8. Em uma concretização preferida os polinucleotídeos 100-912 na SEQ ID NO: 3, 5, 7 respectivamente, codificam o polipeptídeo maduro na SEQ ID NO: 4, 6, 8.

Um polinucleotídeo isolado codificando uma proteína homóloga em relação ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 pode ser criado por introdução de uma ou mais substituições de nucleotídeo, adições ou deleções nas sequências de nucleotídeo de codificação de acordo com SEQ ID NO: 1, tal que, uma ou mais substituições de aminoácidos, deleções ou inserções são introduzidas na proteína codificada. Tais mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, tais como, mutagênese direcionada a sítio e mutagênese mediada por PCR.

Ácidos nucléicos codificando outros elementos da família possuindo atividade lipolítica, que assim possuem uma sequência de nucleotídeo que difere das SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 e que preenchem as condições mencionadas acima estão dentro do escopo da invenção. Além disto, ácidos nucléicos codificando proteínas possuindo atividade lipolítica que possuem uma sequência de aminoácido que difere do polipeptídeo maduro nas SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 e que preenchem as condições mencionadas acima estão dentro do escopo da invenção.

Os polinucleotídeos de acordo com a invenção podem ser otimizados em seu uso de códon, preferivelmente de acordo com os métodos descritos no W02006/077258 e/ou W02008/000632. W02008/000632 endereça otimização do par de códons. A otimização do par de códons é um método onde as sequências de nucleotídeos codificando um polipeptídeo são modificadas com relação ao seu uso do códon, especificamente os pares de códons que são usados, de modo a obter a expressão aperfeiçoada da sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo e/ou produção melhorada do polipeptídeo codificado. Os pares de códons são definidos como um conjunto de dois tripletos subsequentes (códons) em uma sequência de codificação.

Moléculas de ácido nucléico correspondendo às variantes (por exemplo, variantes naturais alélicas) e homólogos dos polinucleotídeos de acordo com a invenção podem ser isoladas com base em sua homologia com relação aos ácidos nucléicos revelados no presente documento usando os DNAcs revelados no presente documento ou um fragmento apropriado do mesmo, como uma sonda de hibridização de acordo com as técnicas de hibridização padrão, preferivelmente sob condições de hibridização altamente estringentes.

Em outro aspecto da invenção, proteínas aperfeiçoadas são providas. Proteínas aperfeiçoadas são proteínas onde pelo menos uma atividade biológica é aperfeiçoada quanto comparada à atividade biológica do peptídeo possuindo sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 2. Tais proteínas podem ser obtidas por mutações introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação SEQ ID NO:1, tal como por mutagênese de saturação e os mutantes resultantes podem ser expressos recombinantemente e classificados quanto à atividade biológica. Por exemplo, a técnica provê ensaios padrão para medição da atividade enzimática das enzimas lipolíticas e assim proteínas aperfeiçoadas podem ser facilmente selecionadas.

Em uma concretização preferida o polipeptídeo de acordo com a invenção apresenta uma sequência de aminoácido de acordo com aminoácidos 34 a 304 na SEQ ID NO: 2. Em outra concretização, o polipeptídeo é pelo menos 90% homólogo em relação ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 e retém pelo menos uma atividade biológica do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2, preferivelmente ele retém a atividade lipolítica e ainda difere na sequência de aminoácidos devido à variação natural ou mutagênese conforme descrito acima.

Em uma concretização adicionalmente preferida, a proteína de acordo com a invenção apresenta uma sequência de aminoácido codificada por um fragmento de ácido nucléico isolado que hibridiza com um polinucleotídeo sendo o complemento da SEQ ID NO: 1 e onde a dita sequência de nucleotídeo é pelo menos 90% homóloga à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1, preferivelmente sob condições de hibridização altamente estringentes.

Consequentemente, a proteína de acordo com a invenção é preferivelmente uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 90%, 91% 92% 93% 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga em relação ao polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2 e retém pelo menos uma atividade funcional do polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2.

Equivalentes funcionais de uma proteína de acordo com a invenção podem também ser identificados, por exemplo, por classificação das bibliotecas de mutantes combinatórias, por exemplo, mutantes de truncagem da proteína da invenção para atividade da enzima lipolítica. Em uma concretização, uma biblioteca diversificada de variantes é gerada por mutagênese combinatória no nível do ácido nucléico. Uma biblioteca diversificada de variantes pode ser produzida, por exemplo, por ligação enzimática de uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos nas sequências gênicas, tal que, um conjunto degenerado de sequências de proteína em potencial é expresso como polipeptídeos individuais ou alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusão maior (por exemplo, para exibição de fago). Existem vários métodos que podem ser usados para produzir bibliotecas de variantes em potencial dos polipeptídeos da invenção a partir de uma sequência de oligonucleotídeo degenerada. Métodos para sintetização de oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura e outros (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura e outros (1984) Science 198:1056; Ike e outros (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

Além disto, bibliotecas de fragmentos da sequência de codificação de um polipeptídeo da invenção podem ser usadas para gerar uma população diversificada de polipeptídeos para classificação de uma seleção subsequente de variantes. Por exemplo, uma biblioteca de fragmentos de sequência de codificação pode ser gerada por tratamento de um fragmento de PCR duplo filamentado da sequência de codificação de interesse com uma nuclease sob condições onde a abreviação ocorre apenas cerca de uma vez por molécula, desnaturação do DNA duplo filamentado, renaturação do DNA para formar DNA duplo filamentado que pode incluir pares de sentido/antissentido de produtos abreviados diferentes, remoção de porções simples filamentadas de duplexes reformados por tratamento com Sl nuclease e ligando a biblioteca de fragmento resultante em um vetor de expressão. Por este método, uma biblioteca de expressão pode ser derivada a qual codifica fragmentos internos e de término N de vários tamanhos da proteína de interesse.

Várias técnicas são conhecidas na arte para classificação de produtos de gene de bibliotecas combinatórias fabricados por mutações de ponto de truncagem e para classificação das bibliotecas de DNAc para produtos de gene possuindo uma propriedade selecionada. As técnicas mais amplamente usadas que são receptíveis à análise de alto rendimento, para avaliação de grandes bibliotecas de gene tipicamente incluem clonagem da biblioteca de gene nos vetores de expressão replicáveis, transformação das células apropriadas com a biblioteca resultante de vetores e expressão dos genes combinatórios sob condições nas quais a detecção de atividade desejada facilita o isolamento do vetor codificando o gene cujo produto foi detectado. Mutagênese de conjunto recursiva (REM), uma técnica que melhora a freqüência dos mutantes funcionais nas bibliotecas pode ser usada em combinação com os ensaios de classificação para identificar as variantes de uma proteína da invenção (Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:781 1-7815; Delgrave e outros (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

Os fragmentos de um polinucleotídeo de acordo com a invenção podem também compreender polinucleotídeos que não codificam polipeptídeos funcionais. Tais polinucleotídeos podem funcionar como sondas ou iniciadores para uma reação de PCR.

Ácidos nucléicos de acordo com a invenção independente se eles codificam polipeptídeos funcionais ou não funcionais podem ser usados como sondas de hibridização ou iniciadores de reação da cadeia de polimerase (PCR). Usos de moléculas de ácido nucléico da presente invenção que não codificam um polipeptídeo possuindo uma atividade lipolítica de acordo com a invenção incluem, entre outros, (1) isolamento do gene codificando a proteína ou variantes alélicas dos mesmos de uma biblioteca de DNAc; (2) hibridização in situ (por exemplo, FISH) para dispersões de metafase cromossômica para prover localização cromossômica precisa do gene conforme descrito em Verma e outros, Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) ; (3) análise Northern blot para detectar a expressão de RNAm em tecidos específicos e/ou células e 4) sondas e iniciadores que podem ser usados como uma ferramenta diagnóstica para analisar a presença de um ácido nucléico hibridizável para a sonda em uma dada amostra biológica (por exemplo, tecido).

Também é englobado por esta invenção um método para obtenção de um equivalente funcional de um gene de acordo com a invenção. Tal método vincula a obtenção de uma sonda marcada que inclui um ácido nucléico isolado que codifica toda ou parte da sequência de proteína de acordo com o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 2 ou uma variante de qualquer deles; classificação de uma biblioteca de fragmento de ácido nucléico com a sonda marcada sob condições que permitam a hibridização da sonda nos fragmentos de ácido nucléico na biblioteca, pelo que formando duplexos de ácido nucléico e preparação de uma sequência gênica de comprimento pleno dos fragmentos de ácido nucléico em qualquer duplexo marcado para obter um gene relacionado ao gene de acordo com a invenção.

Células Hospedeiras

Em outra concretização, a invenção caracteriza células, por exemplo, células hospedeiras transformadas ou células hospedeiras recombinantes compreendendo um polinucleotídeo de acordo com a invenção ou compreendendo um vetor de acordo com a invenção.

Uma "célula transformada" ou "célula recombinante" é uma célula na qual (ou em uma ancestral da mesma) foi introduzido, por meio de técnicas de DNA recombinante, um ácido nucléico de acordo com a invenção. Ambas as células procariótica e eucariótica estão incluídas, por exemplo, bactérias, fungos, leveduras e semelhantes. As células hospedeiras também incluem, porém não estão limitadas às linhagens de células de mamíferos, tais como, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 e linhagens de célula choroid plexus. Vários vetores apropriados para transfecção estável de células de mamíferos são disponíveis ao público, métodos para construção de tais linhagens de células são também publicamente conhecidos, por exemplo, em Ausubel e outros (supra). As células de fungos filamentosos são especialmente preferidas, especificamente espécies Aspergillus, tais como, Aspergillus niger ou oryzae ou awamori.

Uma célula hospedeira pode ser escolhida a qual modula a expressão das sequências inseridas ou modifica e processa o produto de gene em um modo específico, desejado. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, divagem) dos produtos de proteína podem facilitar o ótimo funcionamento da proteína.

Várias células hospedeiras possuem mecanismos característicos e específicos para processamento pós- translacional e modificação das proteínas e produtos de gene. Linhagens de células apropriadas ou sistemas hospedeiros familiares aos versados na técnica da biologia e/ou microbiologia molecular podem ser escolhidas para garantir a modificação e processamento corretos e desejados da proteína estranha produzida. Para esta finalidade, células hospedeiras eucarióticas que possuem o maquinário celular para processamento apropriado da transcrição primária, glicosilação e fosforilação do produto de gene podem ser usadas. Tais células hospedeiras são bem conhecidas na arte.

Caso desejado, uma célula conforme descrita acima pode ser usada na preparação de um polipeptídeo de acordo com a invenção. Tal método compreende tipicamente cultivo de uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, transformada ou transfectada com um vetor de expressão conforme descrito acima) sob condições para prover a expressão (pelo vetor) de uma sequência de codificação codificando o polipeptídeo e opcionalmente recuperação, mais preferivelmente recuperação e purificação do polipeptídeo produzido da célula ou meio de cultura. Os polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados a um vetor replicável recombinante, por exemplo, um vetor de expressão. O vetor pode ser usado para replicar o ácido nucléico em uma célula hospedeira compatível. Assim em uma concretização adicional, a invenção provê um método de fabricação de um polinucleotídeo da invenção por introdução de um polinucleotídeo da invenção em um vetor replicável, introdução do vetor em uma célula hospedeira compatível e desenvolvimento da célula hospedeira sob condições que realizam a replicação do vetor. 0 vetor pode ser recuperado da célula hospedeira.

Preferivelmente o polipeptídeo é produzido como uma proteína secretada no qual caso a sequência de nucleotídeo codificando uma forma madura do polipeptídeo na construção da expressão é operavelmente ligada a uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de sinal. Preferivelmente, a sequência de sinal é nativa (homóloga) em relação à sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo. Alternativamente, a sequência de sinal é estranha (heteróloga) em relação à sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo, caso em que a sequência de sinal é preferivelmente endógena em relação à célula hospedeira na qual a sequência de nucleotídeo de acordo com a invenção é expressa. Exemplos de sequências de sinal apropriadas para células hospedeiras de levedura são as sequências de sinal derivadas de genes de um fator de levedura. De modo semelhante, uma sequência de sinal apropriada para células hospedeiras de fungos filamentosos é, por exemplo, uma sequência de sinal derivada de um gene de amiloglicosidase (AG) de fungo filamentoso, por exemplo, o gene de A. niger glaA. Este pode ser usado em combinação com o promotor de amiloglicosidase (também denominado (glico)amilase) propriamente, bem como em combinação com outros promotores. Sequências de sinal híbrido podem também ser usados com o contexto da presente invenção.

Sequências líder de secreção heteróloga preferidas são aquelas originárias do gene de amiloglicosidase de fungos (AG) (glaA-ambas versões de 18 e 24 aminoácidos, por exemplo Aspergillus) , o gene de fator α (leveduras, por exemplo, Saccharomyces e Kluyveromices) ou o gene de OÍ- amilase {Bacillus).

Os vetores podem ser transformados ou transfectados em uma célula hospedeira apropriada conforme descrito acima para prover a expressão de um polipeptídeo da invenção. Este processo pode compreender cultivo de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão, conforme descrito acima, sob condições para prover a expressão pelo vetor de uma sequência de codificação codificando o polipeptídeo.

A invenção assim provê células hospedeiras transformadas ou transfectadas com ou compreendendo um polinucleotídeo ou vetor da invenção. Preferivelmente o polinucleotídeo é realizado em um vetor para a replicação e expressão do polinucleotídeo. As células serão escolhidas como sendo compatíveis com o dito vetor e podem, por exemplo, ser células procarióticas (por exemplo, bactéria), de fungo, levedura ou vegetal.

Um hospedeiro heterólogo pode também ser escolhido onde o polipeptídeo da invenção é produzido em uma forma que é substancialmente isenta de atividades enzimáticas que podem interferir com as aplicações, por exemplo, livre de enzimas de degradação de amido, degradação da celulose ou enzimas de degradação de hemicelulose. Isto pode ser obtido por escolha de um hospedeiro que normalmente não produz tais enzimas.

A invenção engloba processos para a produção do polipeptídeo da invenção por meio da expressão recombinante de uma sequência de DNA codificando o polipeptídeo. Para esta finalidade, a sequência de DNA da invenção pode ser usada para ampliação do gene e/ou troca dos sinais de expressão, tais como, promotores, sequências de sinal de secreção, a fim de permitir produção econômica do polipeptídeo em uma célula hospedeira homóloga ou heteróloga apropriada. Uma célula hospedeira homóloga é uma célula hospedeira que é da mesma espécie ou que é uma variante dentro da mesma espécie que as espécies das quais a sequência de DNA deriva.

Células hospedeiras apropriadas são preferivelmente microorganismos procarióticos, tais como, bactérias ou mais preferivelmente organismos eucarióticos, por exemplo, fungos, tais como, leveduras ou fungos filamentosos ou células de vegetais. Em geral, células de levedura são preferidas em relação às células de fungos porque elas são mais fáceis de serem manipuladas. Contudo, algumas proteínas são tanto fracamente secretadas das leveduras ou em alguns casos não são processadas apropriadamente (por exemplo, hiperglicosilação na levedura). Nestes exemplos, um organismo hospedeiro de fungo seria selecionado.

A célula hospedeira pode superexpressar o polipeptídeo e técnicas para engenharia de superexpressão são bem conhecidas. 0 hospedeiro pode assim apresentar duas ou mais cópias do polinucleotídeo de codificação (e o vetor pode assim apresentar duas ou mais cópias consequentemente).

Portanto, em uma concretização da invenção, a célula hospedeira recombinante de acordo com a invenção é capaz de expressar ou superexpressar um polinucleotídeo ou vetor de acordo com a invenção.

De acordo com a presente invenção, a produção do polipeptídeo da invenção pode ser efetuada pelo cultivo de uma célula hospedeira de acordo com a invenção, que foi transformada com um ou mais polinucleotídeos da presente invenção em um meio de fermentação de nutriente convencional.

As células hospedeiras recombinantes de acordo com a invenção podem ser cultivadas usando procedimentos conhecidos na técnica. Para cada combinação de um promotor e uma célula hospedeira, estão disponíveis condições de cultura as quais conduzem à expressão da sequência de DNA codificando o polipeptídeo. Após alcançar a densidade de célula desejada ou titulação do polipeptídeo, a cultura é parada e o polipeptídeo é recuperado usando procedimentos conhecidos.

O meio de fermentação pode compreender um meio de cultura conhecido contendo uma fonte de carbono (por exemplo, glicose, maltose, melado, etc.) uma fonte de nitrogênio (por exemplo, sulfato de amónio, nitrato de amónio, cloreto de amónio, etc.), uma fonte de nitrogênio orgânico (por exemplo, extrato de levedura, extrato de malte, peptona, etc.) e fontes de nutriente inorgânicas (por exemplo, fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro, etc.) .

A seleção do meio apropriado pode se basear na escolha do hospedeiro de expressão e/ou se basear nos requisitos regulatórios da construção de expressão. Tais meios são conhecidos dos versados na técnica. O meio pode conter caso desejado, componentes adicionais favorecendo os hospedeiros de expressão transformados em relação aos microorganismos potencialmente contaminantes.

A fermentação pode ser realizada por um período de meio dia a trinta dias. A mesma pode ser um processo de batelada, contínuo ou de batelada de alimentação, apropriadamente a uma temperatura na faixa de, por exemplo, cerca de 0 a 45°C e/ou em um pH, por exemplo, de cerca de 2 a cerca de 10. As condições de fermentação preferidas são uma temperatura na faixa de cerca de 20 a cerca de 37°C e/ou em um pH de cerca de 3 a cerca de 9. As condições apropriadas são geralmente selecionadas com base na escolha do hospedeiro de expressão e da proteína a serem produzidos.

Após fermentação, caso necessário, as células podem ser removidas do caldo de fermentação por meio de uma centrifugação ou filtração. Após a fermentação ter cessado ou após a remoção das células, o polipeptídeo da invenção pode então ser recuperado e, caso desejado, purificado e isolado por meios convencionais.

Uso da Enzima Lipolítica em Processos Industriais

A invenção também se refere ao uso da enzima lipolítica de acordo com a invenção em vários processos industriais. A despeito da experiência de longo prazo obtida com estes processos, a enzima lipolítica de acordo com a invenção caracteriza um número de vantagens significativas em relação às enzimas correntemente utilizadas. Dependendo da aplicação específica, estas vantagens podem incluir aspectos como custos de produção baixos, especificidade mais alta em relação ao substrato, menos antigênica, atividades colaterais menos indesejáveis, rendimentos mais altos quando produzidas em um microorganismo apropriado, faixas de pH e temperatura mais apropriadas, gostos melhores do produto final bem como classificação alimentícia e aspectos da dieta judaica.

Preferivelmente, o polipeptídeo isolado de acordo com a invenção apresentando atividade lipolítica pode ser usado na indústria alimentícia, mais preferivelmente na fabricação de alimentos.

Aplicações em Laticínios

Em uma concretização preferida o polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser usado na indústria de laticínios.

Em uma concretização, o polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser utilizado na fabricação de um produto de laticínio, preferivelmente um queijo, um produto semelhante a queijo, EMC ou de misturas de ácido graxo livre derivado de gordura do leite preferivelmente para desenvolver e/ou intensificar o sabor do produto de laticínio.

No contexto da presente invenção um "produto de laticínio" se refere a qualquer tipo de produto à base de leite, incluindo, porém não limitado ao queijo, manteiga, EMC, creme e outros análogos aos laticínios. São de interesse específico do contexto da presente invenção os produtos contendo gordura de leite e seus equivalentes, incluindo queijos normais, análogos aos queijos, queijos processados, manteigas, cremes dispersáveis, margarinas, EMC, etc.

Em uma concretização preferida, o produto de laticínio é um queijo. O queijo pode ser de qualquer variedade, por exemplo, queijos duros, tais como, Chester, Danbo, Manchego, Saint Paulin, Cheddar, Monterey, Colby, Edam, Gouda, Muenster, tipo Suíço, Gruyere, Emmenthaler, Parmesão, Pecorino, Provolone e Romano; queijo-coalho, tal como, Feta, queijos pasta filata, tais como, Mozzarella; queijos processados; queijo de molde branco, tais como, Brie e Camembert; ou queijos de molde azul, tais como, Gorgonzola e queijo Danish azul ou queijo fresco, tal como, por exemplo, Ricota, queijo Cremoso, Neufchatel ou queijo Cottage. Tipos preferidos de queijo neste contexto são Parmesão, Pecorin, Provolone, Romano e Feta.

O termo "análogos aos laticínios" se refere aos produtos semelhante aos laticínios que contêm gordura (tais como, por exemplo, gordura do leite, por exemplo, creme) como parte da composição e que contêm, adicionalmente, como parte da composição, um constituinte diferente do leite, tal como, por exemplo, óleo vegetal.

A presente invenção também se refere a um método para preparação de um produto de laticínio onde o polipeptídeo isolado de acordo com a invenção é adicionado a uma composição de laticínio usada na produção de um produto de laticínio. No contexto da presente invenção, uma composição de laticínio pode ser uma composição compreendendo leite e/ou um ou mais componentes do leite e/ou frações do leite que constituem a composição de partida na produção do produto de laticínio de acordo com a invenção ou pode ser um produto intermediário na produção do produto de laticínio (por exemplo, coalho ou soro). A composição de laticínio é um substrato apropriado para a enzima lipolítica e, portanto a composição de laticínio compreenderá pelo menos gordura do leite e/ou outra gordura, por exemplo, gordura derivada de vegetais. Enzimas lipolítícas de acordo com a invenção são capazes de catalisar a hidrólise das ligações de éster nos glicerídeos presentes na composição de laticínios e possuem, portanto atividade de lipase. Os glicerídeos são ésteres de glicerol e ácidos graxos. Triglicerídeos (também conhecidos como triacilglicerol ou triacilglicerídeos) estão mais presentes nos óleos vegetais e gordura animal. Lipases (EC 3.1.1.3) são definidas no presente documento como enzimas que hidrolisam um ou mais dos ácidos graxos dos lipídeos, mais especificamente eles hidrolisam a ligação de éster entre o ácido graxo e grupos hidroxila do glicerol.

Um componente de leite pode ser qualquer constituinte do leite, tal como, gordura do leite, proteína do leite, caseína, proteína do soro, lactose. Uma fração de leite pode ser qualquer fração de leite, tal como, por exemplo, leite desnatado, leite de manteiga, soro, creme, manteiga, leite tratado por ultrafiltração, leite em pó, leite em pó integral, leite em pó para manteiga ou leite em pó desnatado. No presente contexto, leite pode ser a secreção láctea de qualquer mamífero. Assim, o leite pode ser obtido por ordenha de gado, carneiros, cabras, búfalos ou camelos.

O produto de laticínio produzido com o processo destes aspectos da invenção pode ser produzido com qualquer processo apropriado conhecido na técnica e a enzima lipolítica será adicionada à composição de laticínio em qualquer etapa apropriada durante a produção do produto de laticínio sob condições apropriadas, por exemplo, de concentração de enzima, temperatura e tempo suficientes para a enzima exibir sua atividade lipolítica.

Em uma concretização, o método de acordo com a invenção é um método para produção de queijo. Neste caso, o método compreenderá uma etapa na qual o coalho é formado por coagulação enzimática de uma composição de laticínio com cultura láctea ou por coagulação ácida com ácido de classificação alimentícia ou ácido produzido por crescimento de bactérias de ácido láctico e é subsequentemente separado do soro. Dependendo do tipo de queijo a ser produzido, a produção do queijo pode compreender, adicionalmente, processamento do coalho e maturação do queijo resultante. 0 método para produzir queijo de acordo com este aspecto da invenção incluirá, preferivelmente, maturação do queijo resultante. A enzima lipolítica pode ser adicionada a uma composição de laticínio em vários estágios da preparação do queijo. Preferivelmente, a enzima é adicionada ao leite antes ou em conjunto com a adição de um coagulante (por exemplo, quimiosina). A adição neste ponto garante uma distribuição homogênea da enzima através de todo o queijo. Alternativamente, a enzima pode ser adicionada em um estágio tardio, por exemplo, ao coalho, porém isto traz o risco de distribuição heterogênea da enzima no queijo. Por esta razão, a adição da enzima ao leite é preferida.

Em outra concretização o método para produzir um produto de laticínio de acordo com a presente invenção é a fabricação de misturas de ácido graxo livre derivado de gordura do leite que são obtidas por lipólise da gordura do leite (por exemplo, gordura da manteiga ou creme) para render uma mistura de ácido graxo livre que pode ser, por exemplo, usada como saborizante, por exemplo, no sabor do queijo azul. Estas misturas de ácido graxo livre podem ser usadas como ingredientes saborizantes na produção de outros produtos, por exemplo, cremes de espalhar, sopas, sobremesas, aperitivos, chips, nachos, etc.). Outras aplicações de lipase incluem o uso em leite em pó modificado (Kilara em Encyclopedia of Dairy Sciences (2003; Fox e outros, Eds, Academic Press) páginas 914-918).

Ainda em outra concretização o método para produzir um produto de laticínio de acordo com a presente invenção é um método para produzir EMC. Neste caso, o método pode ser tipicamente realizado usando condições conhecidas dos versados na técnica (vide, por exemplo, capítulo 2.12, em Industrial Enzymology, segunda edição, Godfrey, West, Eds, MacMillan Press, Londres, 1996; Wilkinson e outros em Encyclopedia of Dairy Sciences (2003; Fox e outros, Eds, Academic Press) páginas 434-438) .

A quantidade de enzima a ser adicionada em qualquer um dos processos mencionados acima dependerá da atividade da enzima e do efeito de sabor desejado no produto final. A quantidade a ser usada em uma aplicação pode ser determinada pelos versados na técnica usando uma curva de resposta de dose. Nesta abordagem, quantidades crescentes de enzimas são adicionadas à composição de laticínio e subsequentemente a intensidade do perfil de sabor é analisada no produto final por um corpo de jurados treinados em paladar.

Em uma concretização preferida do uso de acordo com a invenção ou do método para produzir um produto de laticínio de acordo com a invenção, a enzima lipolítica de acordo com a invenção é usada para desenvolvimento e/ou intensificação do sabor. O desenvolvimento do sabor na produção de um produto de laticínio é devido, entre outras coisas, a ação das enzimas, sejam elas produzidas por microorganismos usados durante a produção do produto de laticínio ou especificamente adicionadas durante a fabricação, mais especificamente para a ação de enzimas lipolítícas e proteolíticas.

As enzimas lipolítícas são responsáveis pela lipólise da gordura do leite presente no produto de laticínio e a liberação consequente no produto de misturas de ácido graxo livre (doravante indicado como FFA) . A composição da misturas de ácido graxo livre é parcialmente responsável pelo sabor final do produto de laticínio. Começando de um substrato contendo gordura do leite, uma enzima lipolítica produzirá uma mistura específica de FFA de ácidos graxos livres contendo C4- a C18 onde a quantidade relativa de cada componente na mistura dependerá da especificidade da enzima na direção da hidrólise das ligações de éster de triglicerídeo específicas envolvendo os ácidos graxos contendo C4 a Cl 8 presentes no triglicerídeo. Por exemplo, uma enzima lipolítica que possui alta especificidade para ácidos graxos contendo C4 preferivelmente hidrolisará ligações de éster de triglicerídeo da fração de triglicerila com um ácido graxo contendo C4 ao invés de com ácidos graxos contendo C6 a C18 e o teor relativo de ácido graxo livre contendo C4 na mistura será superior quando comparado ao teor relativo dos ácidos graxos livres contendo C6 a C18. Adicionalmente, a quantidade relativa de cada componente na mistura também dependerá do substrato de partida e da composição de triglicerídeos presente. Uma vez que cada ácido graxo é responsável pelo fornecimento ao produto de características de sabor específicas, quando um substrato contendo gordura de leite específico for submetido à ação de uma enzima lipolítica sob condições de concentração de enzima, temperatura e tempo suficientes para reação da enzima, uma mistura de FFA específica é produzida, a qual propicia um perfil de sabor específico no substrato. A especificidade das várias enzimas lipolíticas na direção da liberação de ácidos graxos e, portanto, também o perfil de sabor gerado podem ser comparados um com o outro por determinação de um perfil de FFA para cada uma das enzimas usando o mesmo substrato. Um perfil de FFA fornece a quantidade relativa de ácidos graxos livres contendo C4 a C18 em relação à quantidade total de ácido graxo livre liberada pela ação da enzima lipolítica no substrato. O perfil de FFA será geralmente dependente do substrato de partida, na especificidade da enzima lipolítica com relação aos substituintes do ácido graxo na composição de lipídeos.

O grau de conversão de gordura (D) é calculado como se segue (expresso em %): D = [(quantidade total de FFA na composição que foi tratada com a enzima lipolítica) - (quantidade total de FFA na composição não tratada)]/(ácidos graxos totais presentes na composição) . A quantidade total de FFA e a quantidade total de ácidos graxos são expressas em mol/kg do substrato.

Um método apropriado para determinar o perfil de FFA partindo de um substrato é descrito nos Exemplos.

A enzima lipolítica de acordo com a invenção possui preferivelmente uma especificidade maior com relação à liberação dos ácidos graxos de cadeia curta, isto é, ácidos graxos livres contendo C4 a CIO, preferivelmente ácidos graxos livres contendo C4, quando comparada à liberação de ácidos graxos livres de cadeia mais curta, isto é, ácidos graxos livres contendo C12 a C18. Em uma concretização preferida, a enzima lipolítica de acordo com a invenção possui um grau de especificidade em relação aos ácidos graxos livres contendo C4 a CIO quando comparada aos ácidos graxos livres contendo C12 a C18 o que é expresso pela Razão de Especificidade (Rspec) que é pelo menos de 0,7, preferivelmente de 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,5, 1,7, 2, 2,5, 3. De modo geral a Rspec será tão alta quanto possível.

A Rspec pode ser calculada como se segue: Rspec = ∑ Teor relativo de C4-C10/∑ Teor relativo de C12-C18. Onde "∑ Teor relativo de C4-C10" é a soma do teor relativo de ácidos graxos livres contendo C4, C6, C8 e CIO presentes na composição que foi tratada com a enzima lipolítica e onde "∑ Teor relativo de C12-C18" é a soma do teor relativo de ácidos graxos livres contendo C12, C14, CIS e C18 presentes na composição que foi tratada com a enzima lipolítica. O "teor de Cx relativo", onde X pode ser qualquer um dentre 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 corresponde à porcentagem (%) da quantidade de ácido graxo livre contendo Cx na composição que foi tratada com a enzima lipolítica com relação à quantidade total de ácidos graxos livres presentes na composição que foi tratada com a enzima lipolítica. A quantidade de FFA (ou do ácido graxo livre) na fórmula mencionada acima é expressa em mol/kg. A RSpec é determinada em uma composição de laticínios fabricada usando queijo jovem (preferivelmente queijo Cheddar ou Gouda, preferivelmente um queijo jovem com um tempo de maturação de menos de duas semanas) e onde a enzima lipolítica é incubada sob condições (tais como, de dosagem, tempo de incubação e temperatura de incubação) que conduzem a um grau de conversão de gordura em uma amostra incubada compreendido entre 5%-25%, onde o grau de conversão da gordura é calculado conforme indicado acima.

A invenção também se refere a um produto de laticínio que é obtido pelo método de acordo com a invenção.

Em uma concretização preferida do uso de qualquer peptídeo isolado de acordo com a invenção ou do método para produzir um produto de laticínio de acordo com a invenção, o ∑ Teor relativo de C4-C10/∑ Teor relativo de C12-C18 é de pelo menos 0,7, preferivelmente de pelo menos 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,5, 1,7, 2, 2,5, 3. Por exemplo, no queijo parmesão tratado com esterase pré-gástrica de ruminante, esta razão é de aproximadamente 1,7 (calculada a partir dos dados de D.T. Lai, A. D. Mackenzie, CJ. O'Connor, K. W. Turner J. Dairy Sei. 80:2249-2257 (1997), página 2255). "Teor relativo de C4-C10" e "∑ Teor relativo de C12-C18" possuem o mesmo significado que o acima.

Na técnica, é sabido que, quando a enzima lipolítica atuando no substrato contendo gordura do leite primariamente libera ácidos graxos de cadeia curta (por exemplo, ácidos graxos contendo C4 e C6) isto conduz ao desenvolvimento de um sabor picante, forte, temperado, penetrante, enquanto, por exemplo, a liberação dos ácidos graxos de cadeia média pode conduzir a um sabor de sabão.

Portanto, em uma concretização preferida do uso da invenção ou do método para produzir um produto de laticínio de acordo com a invenção, as notas fortes, penetrantes, temperadas no perfil do sabor do produto de laticínio são aumentadas, preferivelmente as notas de sabão, no perfil do sabor do produto de laticínio são diminuídas.

Em um aspecto adicional a invenção se refere a um produto de laticínio obtido pelo método para preparar um produto de laticínio de acordo com a invenção. Exemplos de produtos de laticínio apropriados são aqueles mencionados nos aspectos anteriores da invenção.

Aplicações em Panificação

Outro exemplo de uma aplicação industrial da enzima lipolítica de acordo com a invenção em alimentos é o uso nas aplicações em panificação para aperfeiçoar a massa e/ou qualidade do produto assado.

Foi verificado surpreendentemente que as enzimas lipolíticas de acordo com a invenção podem atuar em vários tipos de lipídeo, variando de glicerídeos (por exemplo, triglicerídeos), fosfolipídeos ou glicolipídeos, tais como, galactolipídeos nas aplicações em panificação.

Mais especificamente, as enzimas lipolíticas de acordo com a invenção mostram pelo menos uma da propriedades que se seguem in situ quando usadas na massa: - uma atividade relativamente baixa com relação aos lipídeos apoiares. - uma atividade relativamente alta com relação aos lipídeos de diacila polares, pelo menos com relação aos galactolipídeos de diacila. - uma atividade relativamente baixa com relação aos compostos monoacila polares, tais como, lisogalactolipídeos e lisofosfolipídeos.

Foi verificado que estas propriedades inesperadas são extremamente vantajosas quando usadas como um substituinte dos emulsionantes químicos na massa. Glicerídeos e lipases foram definidos acima. Glicolipídeos (por exemplo, galactolipídeos) consistem em uma estrutura de glicerol com dois ácidos graxos esterifiçados em uma posição externa (sn-1) e média (sn-2), enquanto o terceiro grupo hidroxila é ligado aos resíduos de açúcar, tal como no caso dos galactolipídeos uma galactose, por exemplo, monogalacosildiglicerídeo ou digalactosildiglicerídeo. Galactolipase (EC 3.1.1.26) catalisa a hidrólise de um ou ambos os grupos de ácido graxo nas posições sn-1 e sn-2 respectivamente de um galactosildiglicerídeo.

Os fosfolipídeos consistem em uma estrutura de glicerol com dois ácidos graxos esterifiçados em uma posição externa (Sn-1) e a posição média (Sn-2), enquanto o terceiro grupo hidroxila do glicerol é esterificado com ácido fosfórico. 0 ácido fosfórico pode ser, por sua vez, esterificado por exemplo em um álcool amino como etanolamina (fosfatidiletanolamina), colina (fosfatidilcolina). As fosfolipases são definidas no presente documento como enzimas que participam da hidrólise de uma ou mais ligações nos fosfolipídeos.

Vários tipos de atividade de fosfolipase podem ser distinguidos os quais hidrolisam a(s) ligação(ões) éster que unem às frações acima graxa à estrutura do glicerol: - Fosfolipase Al (EC 3.1.1.32) e A2 (EC 3.1.1.4) catalisa a desacilação de um grupo acila graxa nas posições sn-1 e sn2 respectivamente, a partir de um diacilglicerolfosfolipídeo para produzir um lisofosfolipídeo. Esta é uma atividade desejável para substituição do emulsionante. - Lisofosfolipase (EC 3.1.1.5 - também denominada fosfolipase B pelo Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Enzyme Nomenclature, Academic Press, New York, 1992)) catalisa a hidrólise do grupo ácido graxo remanescente em um lisofosfolipídeo. Uma fosfolipase B foi reportada de Penicillium notatum (Saito e outros, 1991, Methods in Enzymology 197:446-456), que catalisa a desacilação de ambos ácidos graxos de urn diacilglicerofosfolipideo e possui atividade intrínseca de lisofosfolipase. A atividade da lisofosfolipase de substituir o emulsionante é menos desejável, uma vez que isto resultaria na extinção da combinação de uma cabeça polar e cauda apoiar, impedindo que o produto resultante influencie as propriedades de superfície. Surpreendentemente foi mostrado que a enzima lipolítica de acordo com a invenção mostra atividade de lisofosfolipase relativamente baixa na massa.

A farinha de trigo contém cerca de 2,2-2,9% de lipídeos. Os lipídeos da farinha podem ser divididos em lipídeos de amido (0,8-0,9%) e lipídeos de não amido (1,4- 2,0%). Considerando-se que os lipídeos de amido consistem principalmente de lisofosfolipídeos polares, os lipídeos de não amido consistem em cerca de 40% dos triglicerídeos neutros e 40% de fosfo e glicolipídeos polares. Para otimização da fração dos lipídeos de farinha, a lipase de acordo com a invenção é capaz de hidrolização dos lipídeos polares, sendo os fosfolipídeos e glicolipídeos, mais especificamente os galactolipídeos in situ na massa por adição de lipase de acordo com a invenção.

As enzimas para panificação podem ser usadas em vários produtos assados. O termo "produtos assados" é definido no presente documento como compreendendo produtos de pão, tais como, pão de forma, pães fofos tipo bolo, pão francês bem como, rocamboles, produtos de massa folheada, tais como, produtos de confeitaria, croissants ou produtos folhados recheados, bolos, tortas, bolinhos, sonhos com fermento e semelhantes.

A enzima lipolítica de acordo com a invenção pode ser usada, por exemplo, nos produtos assados. Os produtos assados, tais como, pães, são preparados de uma massa. Portanto, em uma concretização da invenção é provido o uso de um polipeptídeo isolado de acordo com a invenção na preparação de uma massa e é provida uma massa compreendendo o polipeptídeo de acordo com a invenção. A invenção também provê a preparação de uma massa compreendendo as etapas de adição do polipeptídeo a pelo menos um dos ingredientes da massa de acordo com a invenção. A massa é fabricada geralmente de ingredientes básicos, farinha (de trigo), água e opcionalmente sal. Dependendo dos produtos assados, outros ingredientes adicionados podem ser açúcares, aromatizantes, etc. Para produtos fermentados, levedura de padeiro é primariamente usada em seguida aos sistemas de fermentação química, tal como, uma combinação de um ácido (composto de geração) e bicarbonato. Levedura, enzimas e aditivos químicos são geralmente adicionados separadamente à massa.

As enzimas podem ser adicionadas em uma forma seca, por exemplo, granulada ou na forma líquida. Os aditivos químicos são geralmente adicionados na forma de pó. Também, as composições adjuvantes de processamento que são talhadas para aplicações específicas na panificação, podem ser compostas de uma mistura reservada de aditivos químicos e enzima.

A preparação de uma massa dos ingredientes e adjuvantes de processamento descritos acima é bem conhecida na técnica e compreende mistura dos ditos ingredientes e processamento dos adjuvantes e uma ou mais etapas de moldagem e fermentação.

A preparação dos produtos assados de tais massas é também bem conhecida na técnica e pode compreender moldagem e conformação e fermentação adicional da massa seguido por cozedura em temperaturas e tempos necessários. Em uma concretização a invenção provê um método para preparar um produto assado compreendendo a etapa de cozedura da massa de acordo com a invenção. A invenção também provê um produto assado obtido de acordo com este processo. Preferivelmente, o produto assado de acordo com a invenção é um pão.

A presente invenção também se refere aos métodos para preparação de uma massa ou um produto assado compreendendo a incorporação à massa de uma quantidade eficaz de uma enzima lipolítica da presente invenção que aperfeiçoa uma ou mais propriedades da massa ou o produto cozido obtido da massa em relação a uma massa ou um produto assado no qual o polipeptídeo não é incorporado.

A frase "incorporação à massa" é definida no presente documento como adição da enzima lipolítica de acordo com a invenção à massa, qualquer ingrediente do qual a massa será fabricada e/ou qualquer mistura de ingredientes de massa da qual a massa será fabricada. Em outras palavras, a enzima lipolítica de acordo com a invenção pode ser adicionada em qualquer etapa da preparação da massa e pode ser adicionada em uma, duas ou mais etapas. A enzima lipolítica de acordo com a invenção é adicionada aos ingredientes de uma massa que é amassada ou cozida para fabricar o produto assado usando métodos bem conhecidos na técnica. Vide, por Exemplo, Patente US número 4.567.046, EP-A-426.211, JP-A-60-78529, JP-A-62-111629 e JP-A-63-258528.

O termo "quantidade eficaz" é definido no presente documento como uma quantidade de enzima lipolítica de acordo com a invenção que é suficiente para prover um efeito mensurável em pelo menos uma propriedade de interesse da massa e/ou produto assado.

O termo "propriedade aperfeiçoada" é definido no presente documento como qualquer propriedade da massa e/ou um produto obtido da massa, especificamente um produto assado, que é aperfeiçoado pela ação da enzima lipolítica de acordo com a invenção em relação a uma massa ou produto no qual a enzima lipolítica de acordo com a invenção não é incorporada. A propriedade aperfeiçoa pode incluir, porém não está limitada à resistência aumentada da massa, elasticidade aumentada da massa, estabilidade aumentada da massa, pegajosidade reduzida da massa, capacidade de abertura aperfeiçoada da massa, capacidade de ser trabalhada em máquina aperfeiçoada da massa, volume aumentado do produto assado, sabor aperfeiçoado do produto assado, estrutura aperfeiçoada do farelo do produto assado, maciez aperfeiçoada do farelo do produto assado, formação de bolhas reduzida do produto assado e/ou antienvelhecimento aperfeiçoado do produto assado.

A propriedade aperfeiçoada pode ser determinada por comparação de uma massa e/ou produto assado com ou sem adição de um polipeptídeo da presente invenção de acordo com os métodos da presente invenção que são descritos abaixo nos Exemplos. Qualidades organolépticas podem ser avaliadas usando procedimentos bem estabelecidos na indústria de panificação e podem incluir, por exemplo, o uso de um corpo de jurados treinados em paladar.

O termo "resistência aumentada da massa" é definido no presente documento como a propriedade de uma massa que possui de modo geral propriedades mais elásticas e/ou requer mais trabalho para se moldada e conformada.

O termo "elasticidade aumentada da massa" é definido no presente documento como a propriedade de uma massa que possui uma tendência maior a voltar a sua forma original após ser submetida a uma determinada tensão física.

O termo "estabilidade aumentada da massa" é definido no presente documento como a propriedade de uma massa de ser menos suscetível ao abuso mecânico assim mantendo melhor sua forma e volume e sendo avaliada pela razão de altura:largura de uma seção transversal de um bolo em forma de pão após prova normal e/ou estendida.

O termo "pegajosidade reduzida da massa" é definido no presente documento como a propriedade de uma massa que possui menos tendência a aderir às superfícies, por exemplo, no maquinário de produção da massa e sendo tanto empiricamente avaliada pelo padeiro com experiência ou medida por uso de um analisador de textura (por exemplo, TAXT2) conforme conhecido na técnica.

O termo "capacidade de abertura aperfeiçoada da massa" é definido no presente documento como a propriedade da massa que pode ser submetida à tensa aumentada ou estiramento sem romper.

O termo "capacidade de ser trabalhada em máquina aperfeiçoada da massa" é definido no presente documento como a propriedade de uma massa de ser geralmente menos pegajosa e/ou mais firme e/ou mais elástica.

O termo "volume aumentado do produto assado" é medido como o volume de um dado pão determinado por um analisador de volume de pão automatizado (por exemplo, BVM- 3, TexVol Instruments AB, Vike, Suécia) usando detecção por ultrassom ou laser como é conhecido na técnica.

O termo "formação reduzida de bolhas do produto assado" é definido no presente documento como a redução visualmente determinada da formação de bolhas na casca do pão assado.

O termo "estrutura de farelo aperfeiçoada do produto assado" é definido no presente documento como a propriedade de um produto assado com células mais finas e/ou paredes de células mais finas no farelo e/ou distribuição das células mais uniforme/homogênea no farelo sendo de modo geral visualmente avaliado pelo padeiro ou por análise de imagem digital conforme conhecido na técnica (por exemplo, C-cell, Calibre Control International Ltd, Appleton, Warrington, Reino Unido).

O termo "maciez aperfeiçoada do produto assado" é o oposto de "firmeza" e é definido no presente documento como a propriedade de um produto assado de ser mais facilmente comprimido e é avaliada tanto empiricamente pelo padeiro versado no teste quanto medida pelo emprego de um analisador de textura (por exemplo, TAXT2) conforme conhecido na técnica.

O termo "sabor aperfeiçoado do produto assado" é avaliado por um corpo de jurados de teste treinado.

O termo "antienvelhecimento" aperfeiçoado do produto assado" é definido no presente documento como as propriedades de um produto assado que possuem uma taxa reduzida de deterioração dos parâmetros de qualidade, por exemplo, maciez e/ou elasticidade durante o armazenamento.

O termo "crocância aperfeiçoada" é definido no presente documento como a propriedade de um produto assado de fornecer uma sensação mais crocante que um produto de referência como conhecido na técnica, bem como de manter esta percepção mais crocante por mais tempo que um produto de referência. Esta propriedade pode ser quantificada por medição de uma curva de força versus distância a uma velocidade fixa em um experimento de compressão empregando, por exemplo, um analisador de textura TA-XT Plus (Stable Micro Systems Ltd, Surrey, Reino Unido) e obtendo parâmetros físicos desta curva de compressão, isto é (i) força da primeira máxima, (ii) distância da primeira máxima, (iii) a inclinação inicial, (iv) a força da máxima mais alta, (v) a área sob o gráfico e (vi) a quantidade de eventos de quebra (a força cai mais que um determinado valor pré-ajustado). Indicações de crocância aperfeiçoada são uma força mais alta da primeira máxima, uma distância menor da primeira máxima, uma inclinação inicial maior, uma força maior da máxima mais alta, área maior sob o gráfico e um número maior de eventos de quebra. Um produto crocante se classificaria estatisticamente melhor em pelo menos dois destes parâmetros em comparação a um produto de referência. Na técnica, "crocância" é também referida como frescura, friabilidade ou aspereza, significando um material com um comportamento de quebra friável, crocante ou áspero.

A presente invenção provê uma massa possuindo pelo menos uma das propriedades aperfeiçoadas selecionada do grupo consistindo em resistência aumentada, elasticidade aumentada, estabilidade aumentada, pegajosidade reduzida e/ou capacidade de abertura aperfeiçoada da massa.

A invenção também provê um produto assado de acordo com a invenção possuindo volume aumentado do bolo em forma de pão. A invenção provê um produto assado possuindo pelo menos uma propriedade aperfeiçoada selecionada do grupo consistindo em volume aumentado, sabor aperfeiçoado, estrutura aperfeiçoada do farelo, maciez aperfeiçoada do farelo, friabilidade aperfeiçoada, formação de bolhas reduzida e/ou antienvelhecimento aperfeiçoado.

O termo "massa" é definido no presente documento como uma mistura de farinha e outros ingredientes, firme o bastante para ser amassada ou enrolada. A massa pode ser fresca, congelada, preparada ou pré-assada. A preparação da massa congelada é descrita por Kulp and Lorenz em Frozen and Refrigerated Doughs and Batters.

O termo "produto assado" é definido no presente documento como qualquer produto preparado de uma massa, tanto com uma característica macia ou crocante. Exemplos de produtos assados, se do tipo branco, leve ou escuro, que podem ser vantajosamente produzidos pela presente invenção são pães (especificamente os brancos, de farinha integral ou pão de centeio), tipicamente na forma de bolos ou rolos, pão tipo baguete francesa, produtos de pastelaria, croissants, pasta, macarrões (cozidos ou fritos), pão árabe, tortilhas, tacos, bolos, panquecas, biscoitos finos, biscoitos, sonhos, roscas, cascas de torta, pão defumado e pão crocante e semelhantes.

Enzimas lipolíticas da presente invenção e/ou enzimas adicionais a serem empregadas nos métodos da presente invenção podem estar em qualquer forma apropriada para uso em questão, por exemplo, na forma de um pó seco, pó aglomerado ou granulado, especificamente um granulado não em pó, líquido, especificamente um líquido estabilizado, ou enzima protegida tal como descrito no WO 01/11974 e WO 02/26044. Os granulados e pós aglomerados podem ser preparados por métodos convencionais, por exemplo, por aspersão da enzima lipolítica de acordo com a invenção em um veículo em um granulador de leito fluido. O veículo pode consistir em núcleos particulados possuindo um tamanho de partícula apropriado. O veículo pode ser solúvel ou insolúvel, por exemplo, um sal (tal como NaCl ou sulfato de sódio), açúcar (tal como, sacarose ou lactose), álcool de açúcar (tal como, sorbitol), amido, farinha de arroz, farinha de trigo, cereais de milho, maltodextrinas, soja. A enzima lipolítica de acordo com a invenção e/ou enzimas adicionais podem estar contidas nas formulações de liberação lenta. Métodos para preparação de formulações de liberação lenta são bem conhecidos na técnica. A adição de estabilizadores nutricionalmente aceitáveis tais como, açúcar, álcool de açúcar ou outro poliol e/ou ácido láctico ou outro ácido orgânico de acordo com os métodos estabilizados pode, por exemplo, estabilizar as preparações de enzima líquida.

A enzima lipolítica de acordo com a invenção pode também ser incorporada às composições compreendendo levedura, tal como descrito na EP-A-0619947, EP-A-0659344 e WO 02/49441.

Para inclusão nas pré-misturas de farinha é vantajoso que o polipeptídeo de acordo com a invenção esteja na forma de um produto seco, por exemplo, um granulado não em pó, considerando-se que para inclusão em conjunto com um líquido ele esteja em uma forma líquida.

Uma ou mais enzimas adicionais podem também ser incorporadas à massa. Portanto, a invenção provê uma composição de enzima para panificação compreendendo a enzima lipolítica de acordo com a invenção e uma ou mais enzimas adicionais. A enzima adicional pode ser de qualquer origem, incluindo de mamíferos e plantas e preferivelmente de origem microbiana (bacteriana, levedura ou fungos) e pode ser obtida por técnicas convencionalmente usadas na arte.

Em uma concretização preferida, a enzima adicional pode ser uma amilase, tal como uma alfa-amilase (útil para provisão de fermentáveis de açúcares por levedura e retardo do envelhecimento) , beta-amilase, amilase maltogênica ou amilase não maltogênica, uma glicanotransferase de ciclodextrina, uma protease, uma peptidase, especificamente uma exopeptidase (útil no aperfeiçoamento do sabor), transglutaminase, lipase (útil para a modificação dos lipídeos presentes na massa ou constituintes da massa, de modo a amaciar a massa), galactolipase, fosfolipase, celulase, hemicelulase, especificamente uma pentosanase, tal como, xilanase (útil para a hidrólise parcial de pentosanas, mais especificamente arabinoxilana, que aumenta a capacidade de abertura da massa), protease (útil para enfraquecimento do glúten especificamente quando se utiliza farinha de trigo de grão duro), dissulfeto isomerase de proteína, por exemplo, uma dissulfeto isomerase de proteína conforme revelada no WO 95/00636, glicosiltransferase, peroxidase (útil para melhorar a consistência da massa), lacase ou oxidase, hexose oxidase, por exemplo, uma glicose oxidase, aldose oxidase, piranose oxidase, lipoxigenase ou ácido L-amino oxidase (útil para melhorar a consistência da massa).

Quando uma ou mais atividades de enzima adicionais devem ser adicionadas de acordo com os métodos da presente invenção, estas atividades podem ser adicionadas separadamente ou em conjunto com o polipeptídeo de acordo com a invenção, opcionalmente como constituinte(s) da composição de aperfeiçoamento do pão e/ou aperfeiçoamento da massa. As outras atividades da enzima podem ser qualquer uma das atividades das enzimas descritas acima e podem ser dosadas de acordo com práticas de panificação estabelecidas.

A presente invenção também se refere aos métodos para preparação de um produto assado compreendendo cozedura da massa obtida por um método da presente invenção para produzir um produto assado. A cozedura da massa para produzir um produto assado pode ser realizada usando métodos bem conhecidos na técnica. Em uma concretização da invenção, as enzimas lipolíticas da invenção são empregadas para preparar massas folheadas para produtos assados com crocância aperfeiçoada.

A presente invenção também se refere às massas e produtos assados, respectivamente, produzidos pelos métodos da presente invenção.

A presente invenção se refere, adicionalmente, a uma pré-mistura, por exemplo, na forma de uma composição de farinha, para massa e/ou produtos assados fabricados da massa, onde a pré-mistura compreende um polipeptídeo da presente invenção. 0 termo "pré-mistura" é definido no presente documento em seu significado convencional, isto é, uma mistura de agentes para panificação, geralmente incluindo farinha, que pode ser usada não apenas nas instalações/plantas de panificação, porém também em pequenas padarias de venda a varejo. A pré-mistura pode ser preparada por mistura do polipeptídeo ou uma composição para aperfeiçoamento do pão e/ou aperfeiçoamento da massa da invenção compreendendo o polipeptídeo com um veículo aperfeiçoado, tal como, farinha, amido, açúcar ou sal. A pré-mistura pode conter outros aditivos para aperfeiçoamento do pão e/ou aperfeiçoamento da massa, por exemplo, quaisquer dos aditivos incluindo enzimas menc ionados ac ima.

A presente invenção se refere, adicionalmente, aos aditivos para panificação na forma de um granulado ou pó granulado, que compreende um polipeptídeo da presente invenção. 0 aditivo para panificação possui preferivelmente uma distribuição de tamanho de partícula estreita com mais de 95% (em peso) das partículas na faixa de 25 a 500 μm.

Na fabricação da massa e do pão a presente invenção pode ser usada em combinação com os coadjuvantes de processamento definidos no presente documento anteriormente, tais como, os coadjuvantes de processamento químico como oxidantes (por exemplo, ácido ascórbico), agentes de redução (por exemplo, L-cisteína), e/ou emulsionantes (por exemplo, DATEM, SSL e/ou CSL) , e/ou quaisquer precursores de emulsionantes que possam ser um substrato para a enzima lipolítica da invenção e/ou coadjuvantes de processamento enzimático, tais como, oxidoredutases (por exemplo, glicose oxidase), enzimas de modificação de polissacarídeo (por exemplo, a-amilase, hemicelulase, enzimas de ramificação, etc.) e/ou enzimas de modificação de proteína (endoprotease, exoprotease, enzimas de ramificação, etc.).

Em uma concretização da invenção a enzima lipolítica de acordo com a invenção pode ser usada para substituir parcialmente o emulsionante da massa DATEM.

Em outra concretização a invenção provê uma composição para panificação compreendendo uma enzima lipolítica de acordo com a invenção e DATEM. DATEM é o acrônimo para ésteres do ácido diacetil tartárico de mono e diglicerídeos. Um dos componentes principais no DATEM pode ser l-estearoil-3-diacetiltartril-glicerol. Em uma concretização preferida, a composição para panificação compreende DATEM e uma enzima lipolítica de acordo com a invenção, selecionada dentre L01, L02, L03 e L04. Preferivelmente, a enzima lipolítica é L01 ou L02. Foi verificado surpreendentemente que uma composição para panificação compreendendo uma enzima lipolítica de acordo com a invenção e DATEM possui um efeito sinergético na massa fabricada usando a dita composição e/ou o produto assado obtido por cozedura da massa. O efeito sinergético pode ser medido por fabricação de massas ou produtos assados com adição de DATEM ou a enzima lipolítica de acordo com a invenção separadamente e como uma combinação. Podem ser comparados os efeitos produzidos em pelo menos uma propriedade da massa ou dos produtos assados por uso da composição para panificação por um lado e DATEM sozinho ou a enzima lipolítica sozinha usada cada um em uma dosagem dupla por outro lado. A sinergia é verificada quando o efeito da combinação é melhor que ambos o efeito produzido por DATEM sozinho em dosagem dupla e a enzima lipolítica sozinha em dosagem dupla. A sinergia pode ser mostrada, por exemplo, pela estabilidade aperfeiçoada da massa, crescimento no forno aperfeiçoado, estrutura de farelo aperfeiçoada, cor do farelo aperfeiçoada, volume aperfeiçoado do produto assado. Como um exemplo, existe um efeito sinergético quando, por exemplo, a estabilidade de uma massa fabricada por uso de uma composição compreende 0,15% peso/peso (com base na farinha) de DATEM e 0,12 ppm de enzima lipolítica (isto é, 0,12 mg de proteína Bradford da enzima lipolítica por kg de farinha) é melhor que a estabilidade de uma massa fabricada por uso de 0,3% peso/peso de DATEM sozinho e é melhor que a estabilidade de uma massa fabricada com o emprego de 0,24 ppm de enzima lipolítica sozinha.

O versado na técnica pode determinar facilmente a enzima lipolítica apropriada e quantidades de DATEM a serem usadas na composição para panificação de acordo com a invenção. As quantidades ótimas de DATEM ou da enzima lipolítica respectivamente podem ser primeiro determinadas, pelo que uma ou mais propriedades da massa ou do produto para panificação produzido com a dita massa são aperfeiçoadas se comparadas às propriedades de massas ou produtos assados obtidos tanto por adição de DATEM quanto de enzima lipolítica. Subsequentemente 30% a 50% peso/peso da quantidade ótima de cada produto podem ser usados na composição e o versado na técnica pode verificar por experimentação de rotina, em qual taxa de DATEM e a enzima lipolítica na composição é observado um efeito sinergético.

Em outra concretização preferida da invenção, a composição para panificação compreendendo DATEM e a enzima lipolítica de acordo com a invenção é empregada em um método para produzir uma massa ou um produto assado da invenção.

A composição para panificação de acordo com a invenção pode compreender em seguida a uma enzima lipolítica de acordo com a invenção e ao DATEM, um ou mais coadjuvantes de processo usados na panificação, tais como, aqueles mencionados acima e/ou uma ou mais enzimas adicionais conforme descrito acima. A composição para panificação compreendendo DATEM e a enzima lipolítica de acordo com a invenção pode estar em qualquer forma apropriada para ser usada na panificação, tal como em uma forma sólida ou líquida. Uma composição na forma sólida pode ser, por exemplo, um pó ou um granulado. A composição líquida pode ser, por exemplo, uma água ou uma composição à base de óleo e opcionalmente pode ser estabilizada. A composição para panificação compreendendo a enzima lipolítica de acordo com a invenção e DATEM pode também fazer parte de uma pré-mistura conforme definido acima. A composição para panificação compreendendo a enzima lipolítica de acordo com a invenção e DATEM pode ser adicionada como tal à farinha usada para preparar a massa. Opcionalmente, ela pode ser formada diretamente na massa por adição separada da enzima lipolítica de acordo com a invenção e DATEM em quantidades apropriadas aos ingredientes da massa.

Em outra concretização, a enzima lipolítica de acordo com a invenção pode ser usada na produção de bolo e na produção de uma massa mole da qual se fabrica um bolo.

A enzima lipolítica de acordo com a invenção pode ser usada em todos os tipos de bolo, incluindo bolos com manteiga, tais como, por exemplo, bolo inglês e bolo com manteiga e incluindo bolos espumados, tais como por exemplo, merengues, bolo de massa levedada, bolo de biscoito, rocambole, bolo genoise e bolo chiffon. O bolo levedado é um tipo de bolo macio que tem como base farinha de trigo, açúcar, fermento em pó e ovos (e opcionalmente fermento em pó). A única gordura presente é da gema do ovo, que algumas vezes é adicionada separada da clara. Ela é frequentemente usada como uma base para outros tipos de bolos e sobremesas. Um bolo inglês é fabricado tradicionalmente de 254 g de cada um dentre farinha, manteiga, ovos e açúcar, opcionalmente complementados com fermento em pó. No bolo chiffon a manteiga/margarina foi substituída por óleo. 0 teor de açúcar e gema de ovo foi diminuído em comparação ao bolo inglês ou bolo levedado e o teor da clara do ovo foi aumentado.

A enzima lipolítica de acordo com a invenção pode ser usada ambos em bolos normais e em bolos nos quais a quantidade de gemas e/ou gordura foi reduzida. A redução da quantidade de ovos e/ou gordura que é possível difere por tipo de bolo. O versado na técnica conhece a quantidade de ovos e/ou gordura que se encontra presente regularmente nas receitas de bolo e que depende do tipo de bolo. Em geral, uma redução da quantidade de ovos de pelo menos 5% peso/peso pode ser alcançada. Mais preferivelmente, uma redução da quantidade de ovos de pelo menos 10% peso/peso pode ser alcançada. Foi mostrado que mesmo uma redução da quantidade de ovos usados de pelo menos 20% peso/peso pode ser alcançada. A redução da quantidade de ovos pode ser de pelo menos 30% peso/peso, 40% peso/peso ou mesmo pelo menos 50% peso/peso.

Em geral, uma redução da quantidade de gordura de pelo menos 10% pode ser alcançada. Mais preferivelmente, uma redução da quantidade de gordura de pelo menos 20% pode ser alcançada, mesmo mais preferivelmente uma redução de pelo menos 3 0% pode ser alcançada. Foi mostrado que mesmo uma redução da quantidade de gordura de pelo menos 50% pode ser alcançada.

No Pedido de Patente Internacional número PCT/EP2008/051147 foi revelado que uma fosfolipase A pode ser usada na produção de bolos para aperfeiçoar pelo menos uma das propriedades selecionadas do grupo consistindo em: (i) viscosidade da massa mole, (ii) densidade específica, (iii) maciez inicial do farelo, (iv) homogeneidade dos poros do farelo, (v) diâmetro de poro do farelo, (vi) maciez do farelo quando do armazenamento, (vii) validade em prateleira e/ou (viii) volume do bolo. No mesmo pedido de patente foi também revelado que uma fosfolipase A pode ser usada na produção do bolo para permitir a redução da quantidade de ovos e/ou gordura na receita do bolo. Especificamente foi mostrado que isso era possível quando empregando fosfolipase A para reduzir a quantidade de ovos e/ou gordura usados na receita, enquanto mantendo pelo menos uma das propriedades selecionadas do grupo consistindo em: (i) viscosidade da massa mole, (ii) densidade específica, (iii) maciez inicial do farelo, (iv) homogeneidade dos poros do farelo, (v) diâmetro de poro do farelo, (vi) maciez do farelo quando do armazenamento, (vii) validade em prateleira e/ou (viii) volume do bolo. O termo "mantendo pelo menos" é usado no presente documento para indicar que uma propriedade é mantida ou aperfeiçoada.

Foi verificado agora que uma composição compreendendo pelo menos uma fosfolipase A e uma enzima lipolítica de acordo com a invenção pode ser usada na produção de bolo para aperfeiçoar pelo menos uma das propriedades selecionadas do grupo consistindo em: (i) viscosidade da massa mole, (ii) densidade específica, (iii) maciez inicial do farelo, (iv) homogeneidade dos poros do farelo, (v) diâmetro de poro do farelo, (vi) maciez do farelo quando do armazenamento, (vii) validade em prateleira e/ou (viii) volume do bolo. Também foi verificado que uma composição compreendendo pelo menos uma fosfolipase A e uma enzima lipolítica de acordo com a invenção pode ser usada na produção de bolo para permitir a redução da quantidade de ovos e/ou gordura usados na receita de bolo, preferivelmente enquanto mantendo pelo menos uma das propriedades selecionadas do grupo consistindo em (i) viscosidade da massa mole, (ii) densidade específica, (iii) maciez inicial do farelo, (iv) homogeneidade dos poros do farelo, (v) diâmetro de poro do farelo, (vi) maciez do farelo quando do armazenamento, (vii) validade em prateleira e/ou (viii) volume do bolo. Especificamente, quando uma composição compreendendo pelo menos uma fosfolipase A e uma enzima lipolítica de acordo com a invenção é usada no bolo, onde a quantidade de ovos e/ou gordura na receita de bolo foi reduzida ou em um bolo compreendendo uma quantidade normal de ovos e/ou gordura, uma ou mais das propriedades mencionadas acima pode ser adicionalmente aperfeiçoada se comparada ao uso da fosfolipase A sozinha.

Neste contexto, todos os tipos de fosfolipase A podem ser usados, por exemplo, fosfolipase Al ou fosfolipase A2. Qualquer tipo de fosfolipase Al pode ser usado. A fosfolipase Al é amplamente difundida na natureza, por exemplo, nos microorganismos E.coli, nos venenos de cobras e em mamíferos no cérebro, testículos e fígado. Um exemplo de uma fosfolipase Al apropriada disponível comercialmente é a Lecitase Ultra™ (Novozymes). Qualquer tipo de fosfolipase A2 pode ser usada. Um exemplo de uma fosfolipase A2 disponível comercialmente é a Cakezyme™ (DSM) ou Lecitase LIO (Novozymes) . Uma fosfolipase A2 preferida é a fosfolipase A2 pancreática de porco, por exemplo, expressa em Aspergillus niger (Cakezyme™, DSM).

A medição se uma propriedade é mantida, aperfeiçoada ou deteriorada em geral é obtida por preparação de uma massa mole e/ou um bolo em uma receita original, não contendo qualquer fosfolipase A e qualquer enzima lipolítica de acordo com a invenção e por preparado de outras massas moles e/ou bolos em uma receita contendo fosfolipase A, opcionalmente menos ovos e/ou gordura e opcionalmente a enzima lipolítica de acordo com a invenção e comparando uma determinada propriedade. No caso das propriedades das duas massas moles ou bolos a serem comparadas forem substancialmente as mesmas, a propriedade é mantida, no caso delas diferirem, tanto um aperfeiçoamento ou uma deterioração pode acontecer. Para todas as propriedades mencionadas a seguir, um método de medição foi fornecido, bem como uma indicação de quando uma propriedade pode ser considerada como aperfeiçoada.

A viscosidade da massa mole pode ser medida com um "Farinograph" (analisador de farinha) por métodos padrão de acordo com a International Association of Cereal Chemistry (ICC) e the American Association of Cereal Chemistry (AACC 54-2, ICC 115) . Se, por exemplo, a viscosidade da massa mole de uma massa mole fabricada com quantidade reduzida de ovos e/ou gordura e compreendendo fosfolipase A e uma enzima lipolítica de acordo com a invenção tiver sido aperfeiçoada ou deteriorada com relação à mesma massa mole, porém compreendendo tanto fosfolipase A sozinha quanto não compreendendo nenhuma fosfolipase A nem enzima lipolítica a mesma pode ser medida como se segue. No caso da viscosidade da massa mole de uma massa mole contendo uma quantidade reduzida de ovos e/ou gordura e preparada com fosfolipase A e a enzima lipolítica de acordo com a invenção ser a mesma que aquela, por exemplo, da mesma massa mole preparada sem fosfolipase A e sem a enzima lipolítica ou ser a mesma que aquela, por exemplo, da mesma massa mole preparada com fosfolipase A apenas a viscosidade da massa mole tendo sido mantida. No caso da viscosidade da massa mole ter aumentado, ela terá sido aperfeiçoada.

A densidade específica da massa mole pode ser medida por pesagem de um volume predeterminado de massa mole. A densidade específica será aperfeiçoada se esta tiver diminuído.

A maciez do farelo do bolo é avaliada tanto empiricamente pelo padeiro versado no teste quanto medida pelo uso de um analisador de textura (por exemplo, TAXT2) como é conhecido na arte. Na realidade, a firmeza do farelo é medida como é conhecido por um versado na técnica. A maciez do farelo medida dentro de 24 horas após cozimento é denominada maciez inicial do farelo. A maciez do farelo mais de 24 horas após o cozimento é denominada maciez do farelo quando do armazenamento, e é também uma medida para determinação da validade em prateleira. No caso da maciez inicial do farelo ter aumentado, ele terá aperfeiçoado. No caso da maciez do farelo quando do armazenamento tiver aumentado, ela terá aperfeiçoado.

A homogeneidade de poro do farelo do bolo pode ser avaliada empiricamente por um padeiro versado no teste ou por análise de imagem digital, conforme conhecido na técnica (por exemplo, C-cell, Calibre Control International Ltd, Appleton, Warrington, Reino Unido). No caso de desvio no tamanho do poro ser pequeno, o farelo é denominado mais homogêneo. No caso do desvio no tamanho de poro se tornar menor, a propriedade é aperfeiçoada.

O diâmetro de poro do farelo do bolo pode ser avaliado usando análise de imagem digital como conhecido na arte (por exemplo, C-cell, Calibre Control International Ltd, Appleton, Warrington, Reino Unido). No caso do diâmetro médio de poro do farelo diminuir, a propriedade será aperfeiçoada. Preferivelmente, este é o caso quando ao mesmo tempo, o mesmo volume do bolo for mantido.

A validade em prateleira do bolo pode ser medida por determinação da resiliência do bolo com o tempo. Isto faz parte do método para medir a maciez do farelo, como é conhecido de um versado na técnica, pelo que o relaxamento do bolo é também medido pelo uso de um analisador de textura (por exemplo, TAXT2) como é conhecido na técnica.

O volume de um dado bolo pode ser determinado por um analisador de volume de pão automatizado (por exemplo, BVM-3, TexVol Instruments AB, Viken, Suécia), usando detecção por ultrassom ou laser como conhecido na técnica. No caso do volume aumentar, a propriedade terá sido aperfeiçoada. Alternativamente, a altura do bolo após ser assado no recipiente do mesmo tamanho é uma indicação do volume do bolo. No caso da altura do bolo aumentar, o volume do bolo também será aumentado.

A estabilidade em emulsão da massa mole pode ser obtida por determinação da altura do bolo e análise visual da estrutura do bolo. No caso da altura do bolo ter diminuído, a estabilidade em emulsão da massa terá diminuído. No caso da estrutura do bolo ser mais densa, a estabilidade em emulsão da massa também terá diminuído.

Foi verificado, por exemplo, que quando da adição de uma composição compreendendo uma fosfolipase A e uma enzima lipolítica de acordo com a invenção em um bolo levedado normal ou em um bolo levedado contendo uma quantidade reduzida de ovos, pelo menos uma ou mais das propriedades que se seguem, por exemplo, uma estabilidade em emulsão aperfeiçoada da massa mole, uma emulsionamento mais eficaz da massa mole, uma elasticidade aperfeiçoada do bolo, uma maciez de farelo aperfeiçoada do bolo, um volume aperfeiçoado da massa mole podem ser observadas quando comparado ao mesmo bolo ou massa mole na qual apenas fosfolipase A ou nenhuma fosfolipase A e nenhuma enzima proteolítica de acordo com a invenção foi utilizada.

A presente invenção provê, portanto, o uso de uma composição compreendendo uma enzima lipolítica de acordo com a invenção e fosfolipase A na produção de bolo para melhorar pelo menos uma das propriedades selecionadas do grupo consistindo em: (i) viscosidade da massa mole; (ii) densidade específica, (iii) maciez inicial do farelo, (iv) homogeneidade de poro do farelo, (v) diâmetro de poro do farelo, (vi) maciez do farelo quando do armazenamento, (vii) validade em prateleira e/ou (viii) volume do bolo. A presente invenção também provê o uso de uma composição compreendendo uma enzima lipolítica de acordo com a invenção e fosfolipase A na produção de bolo para permitir a redução da quantidade de ovos e/ou gordura usados na receita do bolo, preferivelmente enquanto mantendo pelo menos uma da propriedades selecionadas do grupo consistindo em: (i) viscosidade da massa mole; (ii) densidade específica, (iii) maciez inicial do farelo, (iv) homogeneidade de poro do farelo, (v) diâmetro de poro do farelo, (vi) maciez do farelo quando do armazenamento, (vii) validade em prateleira e/ou (viii) volume do bolo.

Um versado na técnica pode determinar facilmente as quantidades adequadas de fosfolipase A e a enzima lipolítica, respectivamente, de acordo com a invenção, a serem usadas na composição dependendo da receita e tipo de bolo.

Opcionalmente, um ou mais outros ingredientes podem estar presentes na composição, seguido a fosfolipase A e à enzima lipolítica de acordo com a invenção, por exemplo, para permitir redução dos ovos e/ou gordura no bolo, tal como, por exemplo, fontes de proteína alternativas, hidrocolóides, amido modificado, extrato de levedura, cálcio. Ingredientes preferidos são extrato de levedura, amido modificado, cálcio.

Um extrato de levedura pode ser usado compreendendo pelo menos 30% peso/peso de 5'-ribonucleotídeos, preferivelmente pelo menos 34% peso/peso, 38% peso/peso, 40% peso/peso ou 42% peso/peso, mais preferivelmente pelo menos 44% peso/peso, 46% peso/peso, 48% peso/peso ou pelo menos 50% peso/peso de 5'-ribonucleotídeos com base na matéria seca isenta de cloreto de sódio. Foi verificado que o uso de tal extrato de levedura não apenas aperfeiçoa o sabor do bolo, porém também possui um efeito emulsionante surpreendente, uma vez que mediante seu uso, a viscosidade da massa mole é aperfeiçoada.

No contexto da presente invenção, a frase "5'- ribonucleotídeos" se refere à quantidade total de 5'- ribonucleotídeos de monofosfato formados durante degradação de RNA, isto é, 5'-monofosfato guanina (5'-GMP), 5'- monofosfato uracila (5'-UMP), 5'-monofosfato citosina (5'- CMP) , 5'-monofosfato adenina (5'-AMP), onde 5'-AMP pode ser parcial ou completamente convertido em 5'-monofosfato inosina (5'-IMP). Por exemplo, em um extrato de levedura que compreende 30% peso/peso de 5'-ribonucleotídeos com base na matéria seca isenta de cloreto de sódio, a quantidade total de 5'-GMP, 5'-UMP, 5'-CMP, 5'-AMP e 5'-IMP é de 3 0% peso/peso com base na matéria seca isenta de cloreto de sódio. Em uma concretização preferida, é empregado um extrato de levedura onde a quantidade total de 5'-GMP mais 5'-IMP é de pelo menos 15% peso/peso, preferivelmente pelo menos 17% peso/peso, 19% peso/peso, 20% peso/peso ou 21% peso/peso, mais preferivelmente pelo menos 22% peso/peso, 23% peso/peso, 24% peso/peso ou 25% peso/peso, com base na matéria seca isenta de cloreto de sódio. Devido à constituição do RNA, de onde surgem os 5'- ribonucleotídeos, 5'-GMP e 5'-IMP sempre estarão presentes em quantidades aproximadamente iguais nesta concretização. No contexto da presente invenção, os cálculos da porcentagem em peso dos 5'-ribonucleotídeos se baseiam no heptaidrato de sal dissódico dos mesmos, a menos que de outra forma especificado. Todas as porcentagens são calculadas com base na matéria seca isenta de cloreto de sódio. Na presente invenção, a frase, "matéria seca isenta de cloreto de sódio" se refere ao fato de que para o cálculo da porcentagem do peso, o peso de qualquer cloreto de sódio presente no extrato de levedura é excluído da composição. A medição de cloreto de sódio no extrato de levedura e o cálculo mencionado acima podem ser realizados pelos métodos conhecidos dos versados na técnica. Um exemplo dos extratos de levedura compreendendo 40% peso/peso de 5'-ribonucleotídeos dos quais 20% peso/peso de 5'-GMP mais 5'-IMP, porcentagens em peso sendo com base na matéria seca de extrato de levedura isenta de cloreto de sódio, é vendido sob a marca registrada Maxarite® Delite (DSM Food Specialties, Países-Baixos).

Amido modificado pode ser usado para reduzir, adicionalmente, a quantidade de gordura empregada na receita. Todos os tipos de amido modificado podem ser usados, por exemplo, amido de batata modificado ou amido de trigo modificado. Preferivelmente amido de batata modificado é empregado, tal como, por exemplo, revelado no US 6.864.063. Mais preferivelmente, amido de batata modificado é usado, o qual é obtido por tratamento do amido de batata com amilomaltase. Um exemplo de amido de batata modificado é vendido sob a marca registrada Etenia® (Avebe Food). Foi verificado surpreendentemente que nos bolos compreendendo uma quantidade reduzida de gordura, por exemplo, tão baixa quanto 30% peso/peso, e que são preparados usando uma combinação de fosfolipase A, uma enzima lipolítica de acordo com a invenção e amido de batata modificado, as propriedades de bolo desejadas como aquelas mencionadas acima, por exemplo, viscosidade da massa mole, são aperfeiçoadas se comparadas aos bolos produzidos usando 30% peso/peso menos gordura e sem adição de fosfolipase A, enzima lipolítica e amido de batata modificado.

Cálcio é preferivelmente adicionado para melhorar a atividade da fosfolipase A. Foi verificado como sendo especialmente vantajosa a adição de aproximadamente 40 a 200 mg de CaCl2.H2O por 5.000 CPU de Fosfolipase A (doravante indicada como PLA) à receita do bolo. Preferivelmente, entre 50 e 150 mg de CaCl2.H2O por 5.000 CPU PLA. são adicionados à receita de bolo e mais preferivelmente pelo menos 90 mg CaCl2.H2O por 5.000 CPU PIA. CPU (Unidade de Fosfolipase Cromogênica = 1 EYU (Unidade de Gema de Ovo) é definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de ácido por minuto da gema de ovo a 40 °C e pH 8,0. O substrato neste método: rac 1,2- dioctanoilditio fosfatidilcolina medida espectrofotometricamente em 405 nm. Surpreendentemente, foi verificado que a massa mole do bolo não fornece cálcio suficiente para a fosfolipase A trabalhar eficazmente. A invenção provê, adicionalmente, um método para preparar uma massa mole ou um método para preparar um bolo onde a composição compreendendo uma fosfolipase A e uma enzima lipolítica de acordo com a invenção é adicionada aos ingredientes do bolo.

Os ingredientes típicos do bolo são farinha de trigo, ovos e açúcar. Opcionalmente, fermento em pó, sal, água, emulsionantes (tais como, por exemplo, PGE's e monoglicerídeos), margarina, manteiga e/ou óleo são adicionados (por exemplo, para bolo inglês e bolinhos). Um método para preparar uma massa mole de acordo com a invenção compreende, preferivelmente, as etapas de: a. preparação da massa mole do bolo por adição de pelo menos: i. açúcar ii. farinha iii. fosfolipase A, a enzima lipolítica de acordo com a invenção e ovos.

Um método para preparar um bolo de acordo com a invenção compreende, adicionalmente, a etapa de: b. assar a massa mole para render um bolo.

De acordo com o método mencionado acima, ambos bolos compreendendo uma quantidade reduzida de ovos e/ou gordura e bolos onde nenhum ovo e/ou redução de gordura foi aplicada podem ser preparados.

O versado na técnica sabe como preparar uma manteiga ou um bolo começando dos ingredientes do bolo. Opcionalmente um ou mais outros ingredientes podem estar presentes na composição, por exemplo, para permitir redução de ovos e/ou gordura no bolo, tais como, fontes de proteína, hidrocolóides, extrato de levedura, amido modificado, cálcio. Ingredientes preferíveis são extrato de levedura, amido modificado, cálcio conforme definido acima.

A invenção provê, adicionalmente, um bolo ou uma massa mole obtida pelo método mencionado acima. A invenção também provê uma composição para panificação que pode ser usada, por exemplo, na produção de bolo ou massa mole, compreendendo uma fosfolipase A e uma enzima lipolítica de acordo com a invenção. Esta composição para panificação também pode ser usada em produtos de massa e produtos assados obtidos de tal massa. Por exemplo, ela pode ser usada nos produtos de massa contendo adicionalmente ovos e em produtos assados derivados da mesma, tais como, brioches e panetone, ambos normais e com uma quantidade reduzida de ovos.

A dita composição para panificação pode também fazer parte de uma pré-mistura de bolo compreendendo também farinha e opcionalmente outros ingredientes.

As aplicações industriais mencionadas acima da enzima lipolítica de acordo com a invenção compreendem apenas alguns exemplos e esta listagem não é restritiva.

A enzima lipolítica pode ser convenientemente produzida nos microorganismos. Nos processos acima é vantajoso empregar enzima lipolítica que é obtida por técnicas de DNA recombinante. Enzimas recombinantes podem ser produzidas a um custo baixo, com alto rendimento, isentas de agentes de contaminação como bactérias ou vírus, porém também isentas de toxinas bacterianas ou contaminação por outros aditivos de enzima.

Doravante, a invenção será ilustrada por meio dos exemplos não limitantes que se seguem.

EXEMPLOS Exemplo 1 Produção de lipases da invenção

As enzimas lipolítícas L01, L02, L03, L04 codificadas pelas sequências de nucleotídeo da SEQ ID NO:1 (DNA L01) , SEQ ID N0:3 (DNA L02), SEQ ID NO:5 (DNA L03), SEQ ID NO:7 (DNA L04) conforme providas no presente documento foram obtidas por construção de plasmídeos de expressão contendo as sequências de DNA, transformando uma cepa de Aspergillus niger com tal plasmídeo e o desenvolvimento das cepas A. niger do modo que se segue.

Esporos frescos (10G-107) de cepas de A. niger foram inoculados em 20 mL de meio CSL (frasco de 100 mL, chicana) e cresceram por 20-24 horas a 34°C e 170 rpm. Após inoculação de 5-10 mL de pré-cultura de CSL em 100 mL de meio CSM (frasco de 500 mL, chicana) as cepas foram fermentadas a 34°C e 170 rpm por 3-5 dias.

Sobrenadantes isentos de célula foram obtidos por centrifugação do caldo de fermentação em 5.000xg por 30 minutos a 4 °C. Os sobrenadantes isentos de célula são armazenados a -20°C até o uso. Opcionalmente, o sobrenadante pode ser filtrado adicionalmente em um filtro de microfibra GF/A Whatmann Glass (150 mm Ó) para remover as partículas maiores. Se necessário, o pH do sobrenadante é ajustado para pH 5 com 4 N KOH e filtrado em condições estéreis em um filtro de 0,2 μm (parte superior da garrafa) com sucção para remover o material de fungo.

O meio CSL consistiu em (em quantidade por litro) : 100 g de Sólidos de Milho em Infusão (Roquette), 1 g NaH2PO4*H2O, 0,5 g MgSO4*7H2O, 10 g de glicose *H2O e 0,25 g de Basildon (antiespumante). Os ingredientes foram dissolvidos em água desmineralizada e o pH foi ajustado para pH 5,8 com NaOH ou H2SO4; frascos de 100 mL com chicana e esferas de espuma foram cheios com 20 mL de caldo de fermentação e esterilizados por 20 minutos a 120°C após o que 200 μL de uma solução estéril contendo 5.000 IU/mL de penicilina e 5 mg/mL de estreptomicina foram adicionados a cada frasco após resfriamento para temperatura ambiente.

O meio de CSM consistia em (em uma quantidade por litro): 150 g de maltose *H2O, 60 g de Soytone (peptona), 1 g de NaH2PO4*H2O, 15 mg de MgSO4*7H2O, 0,08 g de Tween 80, 0,02 g de Basildon (antiespumante), 20 g de MES, 1 g de L- arginina. Os ingredientes foram dissolvidos em água desmineralizada e o pH foi ajustado para pH 6,2 com NaOH ou H2SO4; frascos de 500 mL com chicana e esferas de espuma foram cheios com 100 mL de caldo de fermentação e esterilizados por 20 minutos a 120°C após o que 1 mL de uma solução estéril contendo 5.000 IU/mL de penicilina e 5 mg/mL de estreptomicina foi adicionada a cada frasco após resfriamento para temperatura ambiente.

Exemplo 2 Purificação da enzima lipolítica da invenção

Após descongelamento dos sobrenadantes isentos de célula congelada obtidos no exemplo 1, os sobrenadantes foram centrifugados extensivamente a 4 °C para remover quaisquer sólidos. A fim de remover as contaminações de peso molecular baixo os sobrenadantes foram ultrafiltrados usando um sistema Millipore Labscale TFF equipado com um filtro com um corte de 10 kDa. As amostras foram lavadas 3- 5 vezes com volumes de 40 mL de tampão fosfato 100 mM frio, pH 6,0 incluindo 0,5 mM de CaCl2. O volume final da solução de enzima foi de 3 0 mL e é adicionalmente referido como "ultrafiltrado".

Para purificação adicional o ultrafiltrado pode ser aplicado a uma coluna de troca de ânion MonoQ. O gradiente de sal foi ajustado para 1M NaCl em uma coluna de 2 0 volumes. Os tampões eram uma mistura de 70 mM de Bis-TRIS e 50 mM de TRIS. 0 pH foi ajustado com 0,1 M HC1. Foi observado, surpreendentemente, que os melhores resultados foram obtidos quando a purificação foi realizada em pH = 9, onde a lipase elui em uma condutividade de 35mS/cm.

O teor de proteína total das amostras foi determinado usando o método Bradford (The protein Protocols Handbook, 2a edição, Editado por J.M.Walker, Humana Press Inc, Totowa 2002, pl5-21).

Determinação da concentração de enzima lipolítica por A280 e HPSEC

Alternativamente, a concentração de enzima lipolítica pode ser calculada da extinção em 280 nm (A280) atribuível à enzima lipolítica e o coeficiente de extinção molecular calculado de uma enzima lipolítica. A medição de A280 foi realizada em um espectrofotômetro Uvikon XL Secomam (Beun de Ronde, Abcoule, Países Baixos). 0 coeficiente de extinção molecular de uma enzima pode ser calculado do número resíduos de tirosina, triptofano e cisteína por molécula de enzima (S.C. Gill and P. H. von Hippel, Anal. Biochem. 182, 319-326 (1989)). 0 coeficiente de extinção molecular destes aminoácidos é de 1280, 5690 e 120 M^.cm'1 respectivamente. O número de resíduos de tirosina, triptofano e cisteína na enzima lipolítica da invenção pode ser deduzido das sequências de proteína selecionadas do grupo consistindo nas SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8. Os cálculos foram realizados para as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, compreendendo aminoácidos 34-304. O coeficiente de extinção molar para as enzimas lipolítícas codificadas pelas sequências de polinucleotídeo mencionadas acima é de 35560 M’1.cm"1 correspondendo a um OD em 28 nm de 1,25 cm-1 para 1 mg/mL. O peso molecular calculado dos polipeptídeos maduros é de 28,4, 28,3, 28,4, 28,5 kD para lipases L01, L04, L03 e L02 respectivamente considerando apenas os aminoácidos 34-304.

A extinção do ultrafiltrado em 280 nm (A280) que é atribuída à enzima lipolítica depende da pureza da amostra da enzima. Este teor de lipase específico pode ser determinado usando HP-SEC (High Performance Size Exclusion Chromatography) com uma coluna TSK SW-XL (300*7,8 mm; faixa MW 10-300 kDa). 0 tampão de eluição consistiu em tampão de fosfato de sódio 25 mM, pH 6,0 e foi usado em um fluxo de 1 mL/minuto. As amostras de 5-100 μL foram injetadas. A absorvência em 280 nm foi medida. 0 A280 atribuível à enzima lipolítica da invenção foi obtido da razão da superfície de máxima da respectiva máxima de enzima lipolítica no cromatograma e a superfície total da absorção máxima em 28 0 nm. A concentração da enzima lipolítica foi então calculada por multiplicação do A280 da amostra pela razão descrita acima e dividida pelo coeficiente de extinção calculado para a enzima lipolítica.

Exemplo 3 Ensaio

A atividade da lipase foi determinada espectrofotometricamente por emprego do substrato cromogênico, palmitato de p-nitrofenila (pNPP, Sigma N2752) . Neste ensaio, o pNPP é dissolvido em 2-propanol (400 mg pNPP por 10 mL de 2-propanol (Merck 1,09634)) e suspenso em 100 mM de tampão acetato pH 5,0 contendo Triton X-100 a 1,0% (Merck 1,12298) (5 mL de substrato em 45 mL de tampão). A concentração do substrato final foi de 1,1 mM. A lipase é incubada com esta solução de substrato a 37°C por 10 minutos. A reação é parada por adição do tampão de parada 2% TRIS (Merck 1,08387) + 1% Triton X-100 em uma razão de 1:1 com relação à mistura de reação e subsequentemente o p-nitrofenol formado (pNP) é medido a 405 nm. Este ensaio pode também ser aplicado em valores de pH diferentes, a fim de determinar a dependência do pH de uma lipase. Deve ser entendido que em valores de pH diferentes, tampões diferentes podem ser necessários ou que detergentes diferentes podem ser necessários para emulsionar o substrato. Uma unidade de lipase é definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de p- nitrofenol por minuto nas condições de reação declaradas. Deve ser entendido que não é prática incomum na análise de rotina usar soluções de enzima de calibre padrão com atividade conhecida determinada em um ensaio diferente para atividade correlata em um dado ensaio com unidades, conforme seria determinado no ensaio de calibração.

Alternativamente, a atividade da lipase pode ser determinada por emprego de 2,3-mercapto-l-propanol- tributirato (TBDMP) como um substrato. A lipase hidrolisa a(s) ligação(ões) de tioiéster de TBDMP pelo que liberando ácido butanóico e dibutirato de 2,3-mercapto-l-propanol, 2,3-mercapto-l-propanol-monobutirato ou 2,3-mercapto-1- propanol. Os grupos tiol liberados são titulados em uma reação de substrato subsequente com 4,4-ditiodipiridina (DTDP) formando 4 -tiopiridona. A última está em um equilíbrio tautomérico com 4-mercaptopiridina que absorve em 334 nm. A reação é realizada em 0,1 M de tampão acetato, pH 5,0 contendo 0,2% de Triton-X100, 0,65 mM de TBDMP e 0,2 mM de DTDP a 37°C. Uma unidade de lipase é definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de 4-tiopiridona por minuto nas condições de reação declaradas.

Além da medição espectrofotométrica, a atividade da lipase pode também ser determinada usando medição titrimétrica. Por exemplo, a atividade da esterase de uma enzima lipolítica pode ser medida na tributirina como um 5 substrato de acordo com o Food Chemical Codex, 4a edição, National Academy Press, 1996, p803.

Medições da Atividade

Tabela 1. Atividades da enzima lipolítica nos sobrenadantes isentos de célula como preparadas no Exemplo 10 1 (a atividade da lipase foi determinada em pH 5 usando palmitato de p-nitrofenila como um substrato. A atividade da lipase é fornecida como unidades/mg da proteína Bradford total).

Deve ser observado adicionalmente, que neste ensaio 15 apenas um substrato simples está presente e que o número de atividade não prediz a atividade real nas misturas de substrato como massa para pão.Caracterização da Proteína Tabela 2: Propriedades bioquímicas das lipases L01, L02, L03, L04

A estimativa de peso molecular SDS-PAGE foi realizada com NuPage 4-12% MES Simply Blue Safe Stain nas amostras ultrafiltradas. A fim de desglicosilar as proteínas, a amostra de proteína foi tratada com PNGase-F (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). Subsequentemente, ambas as amostras tratada e não tratada foram submetidas à eletroforese de gel SDS-PAGE. A caracterização e o manuseio de glicoproteínas é extensivamente descrito em The Protein Protocols Handbook, 2a edição, Editado por J.M.Walker, Humana Press Inc., Totowa 2002, Capítulo VI.

O ponto isoelétrico (PI) foi determinado por eletroforese de gel de foco isoelétrico para Marcador IEF 3-10 (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemanha), contendo proteínas marcadoras com uma faixa de pi de 3,5 a 10,7. Caso necessário, as amostras podem se dessalinizadas, por exemplo, usando colunas de fuso de dessalinização de proteína (número do produto 89849, Pierce, Rockford, USA) conforme descrito pelo fabricante. As amostras foram então diluídas 1:1 com Tampão de Amostra Novex® IEF pH 3-10 e submetidas a eletroforese de gel de foco isoelétrico usando o sistema de Eletroforese de Mini-Célula Xcell SureLock™ para géis IEF Novex® Invitrogen Carlsbad, USA) conforme descrito pelo fabricante. Após a operação do gel ter sido fixada com 12,5% TCA, foi lavada e colorida com SimplyBlue™ SafeStrain (Invitrogen, Carlsbad, USA).

Determinação do peso molecular de L01 por espectroscopia de massa (MS)

Lipase L01 foi desglicosilada antes da analise de MW. Antes da desglicosilação uma precipitação de TCA foi realizada. A precipitação de TCA foi realizada por diluição da amostra 1:1 em TCA a 20%. A amostra foi incubada por 4 horas a 4 °C. As proteínas foram micronizadas por centrifugação a 13.000 rpm por dez minutos a 4 °C. A microesfera foi lavada com acetona -20°C e centrifugada novamente a 13.000 rpm por dez minutos a 4°C. Esta etapa de lavagem foi repetida três vezes. A microesfera foi suspensa em 100 mM de NH4HCO3 e desglicosilação usando N-glicosidase F (PNGase-F, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) foi realizada a 37°C por toda noite. As cadeias de açúcar liberadas foram removidas por ultrafiltração usando um dispositivo centrífugo de corte de 10 kDa (Pali).

A lipase desglicosilada L01 foi analisada por MS. A amostra foi diretamente infusada em LTQ-Orbitrap MS (Thermo). Seis massas de proteína distintas poderiam ser calculadas entre 28 e 29 kDa. Estas massas de proteína, os resíduos de lipase L01 correspondentes e sua relativa abundância em comparação à sua forma mais abundante são mostrados na Tabela 1. Tabela 3. Massas intactas calculadas da lipase L01 desglicosilada. A abundância relativa é comparada à forma mais abundante de 28435.7 Da, ajustada para 100%.

As pequenas diferenças no MW indicam que usando SDS PAGE estas formas serão observadas como uma faixa simples em 28-29 kD. Ambos os términos N e C exibem heterogeneidade, o que pode ser causado por especificidade de processamento reduzida ou por degradação proteolítica adicional no processo de produção, após maturação inicial. Uma vez que as lipases desglicosiladas L02, L03, L04 mostram em SDS-PAGE uma mobilidade que é virtualmente idêntica à mobilidade de L01, conclui-se que L01, L03 e L04 sofrem processamento pós-translacional semelhante conforme observado para L01.

pH ótimo

A dependência de pH ótimo da enzima lipolítica pode ser determinada por realização de um ensaio que mede determinado tipo de atividade lipolítica em diferentes valores de pH. O pH no qual a atividade máxima é observada é o pH ótimo da enzima específica. Uma vez que o pH ótimo pode depender do tipo de substrato e das condições de ensaio aplicadas, ele deve ser restabelecido quando substratos diferentes são usados ou quando condições de ensaio são drasticamente alteradas. L01 possui um pH ótimo amplo de 6,5-9,5 usando p-nitrofenilpalmitato como um substrato a 37°C no tampão fosfato.

Exemplo 4 Aplicação em Laticínios - Perfil de Ácido Graxo Livre Gerado pelas Lipases de Acordo com a Invenção em um Sistema Semelhante a Queijo

O perfil de FFA gerado por polipeptídeos L01, L03 e L04 de acordo com a invenção e perfis FFA de uma lipase microbiana (Piccantase® R8.000, uma lipase microbiana de Rhizomucor miehei da DSM Food Specialties, Países-Baixos) (doravante abreviada como PicR8000) após incubação com pasta de queijo Cheddar foram comparados. O perfil de FFA do queijo parmesão como um padrão ouro é obtido de D. T. Lai, A.D. Mackenzie, C.J. O'Connor, K.W. Turner J. Dairy Sei. 80:2249-2257 (1997), página 2255 (doravante abreviado como ParmChees). O perfil de FFA da pasta do queijo Cheddar incubado com água ao invés de lipases foi empregado como um controle negativo ou controle neutro em todos os experimentos e isto não foi muito diferente do perfil de FFA do queijo Cheddar conforme conhecido na literatura M.V. Arbige, P. R. Freund, S. C. Silver, JT. Zelko, Food Technology 1986, páginas 91-98.

A pasta de queijo Cheddar foi preparada de queijo Cheddar jovem (isto é, com um tempo de maturação inferior a 2 semanas) por moagem e mistura com água para um teor de umidade final de 46,4% peso/peso (teor de gordura na matéria seca foi de 49,3% peso/peso). A pasta de queijo Cheddar foi pasteurizada por 5 minutos a +80°C, dividida em pequenas porções e armazenada a +4°C até o emprego como um substrato para as enzimas lipolíticas neste experimento.

Cada uma das lipases testadas (solução em água) foi adicionada a uma porção aquecida a +40°C de pasta de queijo Cheddar, completamente misturadas e incubadas por 1 e 4 dias a +40°C. As lipases de dosagem foram escolhidas a fim de se obter uma razão de conversão de gordura na pasta de queijo Cheddar entre 5-25%. A fim de parar a atividade lipolítica na pasta de queijo Cheddar, as amostras foram instantaneamente congeladas a -20 °C e armazenadas congeladas até a análise.

Todas as amostras foram analisadas com relação ao seu perfil de FFA. A determinação do FFA liberado nas pastas de queijo Cheddar foi realizada de acordo com o método padrão descrito na técnica (Jong C, de and Badings HT. J. High Resolution Chromatography, 13:84-98 (1990)). Em prazos curtos, apôs extração da gordura não reagida e FFA das amostras, cada FFA foi isolado do método de extração de fase sólida e o FFA isolado foi analisado por cromatografia gasosa em uma coluna de capilaridade. As máximas nos cromatogramas foram identificadas por comparação dos tempos de retenção com uma mistura padrão contendo o mesmo FFA. 0 teor de FFA nas várias amostras foi calculado das áreas máximas de FFA individual usando padrão interno que foi adicionado às amostras (com correção para resposta do detector e rendimento em extração). O teor de ácidos graxos livres foi medido em mg de cada ácido graxo livre por kg de pasta de queijo Cheddar e adicionalmente usando peso molecular de FFA foi recalculado em mmol por kg de pasta de queijo Cheddar. Como resultado, os perfis de ácidos graxos livres em mmol/kg foram usados para cálculo da porcentagem de conversão de gordura em cada amostra para verificar que esta estava compreendida entre 5-25%. 0 grau de conversão de gordura foi determinado por correção para base usando o perfil de FFA de uma medição nula sendo pasta de queijo Cheddar incubada com água.

Portanto, o grau de conversão de gordura em cada amostra foi determinado conforme indicado na descrição e presumindo-se que a pasta de queijo Cheddar contém uma quantidade total de ácidos graxos de 1,19 mol/kg:

Usando a fórmula [1] o D foi calculado para cada uma das amostras e os resultados são resumidos na Tabela 4.Tabela 4 - Grau de conversão de gordura

Conforme pode ser visto da Tabela 4 o D não se altera significativamente após tempo de incubação de 1 e 4 dias e as dosagens das enzimas estavam na faixa apropriada.

De modo a comparar a especificidade das lipases para liberar determinado FFA independente de suas dosagens é conveniente calcular o teor de Cx relativo de cada FFA (em mmol/kg de pasta de queijo Cheddar) para FFA total (em mmol/kg de pasta de queijo Cheddar) e assim os perfis de FFA são expressos em %. Este método de comparação é bem conhecido dos versados na técnica e amplamente usado na literatura. Uma vez que foi verificado que os perfis de FFA das amostras investigadas não alteraram significativamente entre o dia 1 e o dia 4, os únicos dados para o dia 4 são apresentados na Tabela 5 e mostrados na figura 1. O perfil FFA do queijo parmesão é fornecido em D.T. Lai, A. D. Mackenzie, C.J. O'Connor, K.W. Turner J. Dairy Sei. 80:2249- 2257 (1997), página 2255.Tabela 5: Teor de Cx relativo em cada amostra

Na Tabela 5 e na figura 1 fica claro que o perfil de FFA do queijo parmesão é muito diferente daquele gerado pela lipase microbiana picRSOOO que é comercializada para 5 produção de variedades fortes e picantes de queijos italianos, tais como, Provolone, Parmesão, Romano, (Technical Bulletin, DSM Países Baixos). De modo geral é sabido que as lipases microbianas não são FFA C4-C10 curtos específicos e vários exemplos incluindo preparações 10 comerciais estão disponíveis na técnica. Até agora, PicRSOOO é usada como uma das lipases microbianas que são capazes de tolerar FFA curto da gordura do leite.

Surpreendentemente, foi verificado que as lipases de acordo com a invenção L01, L03 e L04 mostraram em 15 comparação a PicRSOOO especificidade alta para a liberação de ácidos graxos livres contendo C4. O perfil de FFA gerado por estes polipeptídeos está mais próximo ao perfil de FFA do queijo parmesão se comparado com o da PicRSOOO. A especificidade das lipases pode ser comparada usando a taxa de especificidade Rspec que pode ser calculada como: Onde "∑C4-C10 e ∑C12-C18 são somas de FFA relativo e são definidos na descrição. A Rspec θ determinada para a composição de laticínios que foi fabricada usando queijo jovem (preferivelmente queijo Cheddar ou Gouda com um tempo de maturação de menos de duas semanas) incubado com uma enzima lipolítica sob condições de dosagem, tempo de incubação e temperatura de incubação que conduzem ao grau suficiente de conversão de gordura nas amostras incubadas compreendido entre 5%-25%, onde o grau de conversão da gordura é calculado conforme indicado acima. Os valores de Rspec para L01, L03, L04 e PicR8000 são fornecidos na Tabela 6.Tabela 6. Taxa de especificidade RSpec das lipases da invenção L01, L03 e L04 em comparação à lipase microbiana PicR8000 e queijo parmesão.

Conforme pode ser visto as lipases L01, L03 e L04 de acordo com a invenção mostram alta especificidade para a liberação de ácidos graxos livres contendo C4 a CIO em comparação à enzima microbiana Piccantase® R8000 que é menos específica.

Exemplo 5 Experimento de Panificação - Pão semelhante à baguete em grande escala

O desempenho de cozedura das enzimas lipolíticas L01-L04 foi também testado em pão semelhante à baguete) em grande escala. Farinha (Kolibri™) 2.000 g, 47 g de levedura comprimida, 40 g de sal, 50 ppm de ácido ascórbico, 2 ppm de Bakezyme® P500 (alfa-amilase de fungo), 15 ppm de Bakezyme® HSP6000 (hemicelulase de fungo) e 58 mL de água foram misturados em um misturador Diosna por 2 minutos em velocidade 1 e 71 Wh em velocidade 2, a uma temperatura de massa final de 27°C. A massa foi dividida em 6 peças de 350 g, enrolada e fermentada por 20 minutos a 32°C e 90% de umidade relativa. Após isto, os pedaços da massa foram moldados e conformados e fermentados por 100 minutos a 34°C em umidade relativa de 90%. Os pedaços de massa completamente fermentados sofreram incisões e foram assados em um forno a 24 0°C por 3 0 minutos com adição de vapor inicial.

Os sobrenadantes isentos de célula (com pelo menos 2 mg/mL de proteína Bradford total) contendo L01, L02, L03 ou L04 respectivamente, foram adicionados à farinha em dosagens variando de 0,1 ao máximo de 4 ppm da proteína Bradford (1 ppm de proteína Bradford é igual a 1 mg de proteína Bradford por quilo de farinha). Como um controle adicional, o sobrenadante isento de célula da cepa hospedeira A. niger isenta de L01-L04, contendo 0,3 mg/mL de proteína Bradford foi testado dosando um volume (mL) equivalente ao volume mais alto do sobrenadante isento de célula adicionado para obter as dosagens mais altas de L01- L04 testadas.

Os vários efeitos das enzimas lipolíticas em diferentes dosagens, tanto na massa e no produto assado final foram comparados a um controle neutro, um pão não contendo adições extras e um pão contendo 0,3% de DATEM (Panodan® 80CP). Após resfriamento para temperatura ambiente os volumes dos pães foram determinados por um analisador de volume de pão automatizado (BVM-3, TexVol Instruments). 0 volume do pão do pão de controle neutro é definido como 100%. Efeitos adicionais foram avaliados manual e visualmente por um padeiro experimente como se segue:

A estabilidade da massa foi avaliada por julgamento visual da taxa de altura/largura de uma seção transversal do pão em uma escala de 1 a 5. 1 = muito plano (taxa de altura/largura da seção transversal próxima de 0, 5 = muito alta (taxa de altura/largura da seção transversal do pão próxima de 0,8).

A capacidade de abertura da massa foi avaliada por julgamento manual em uma escala de 1-5. 1 = muito curta a 5 = muito extensível Crescimento no forno: 1 = incisão completamente fechada a 5 = incisão completamente aberta; ruptura Estrutura do farelo: 1 = estrutura do farelo aberta/regular com paredes de células mais espessas a 5 = estrutura do farelo muito fina/uniforme com paredes de célula mais finas. Cor do farelo: 1 = muito escura a 5 = branco brilhante.

Os resultados são fornecidos nas Tabelas 7-11 Tabela 7: Sobrenadante isento de célula da cepa hospedeira de A. niger (controle) em comparação ao controle e DATEM

Sobrenadante isento de célula da cepa hospedeira de A. niger (controle), dosado conforme descrito acima, não mostrou tanto como efeito positivo quanto efeito negativo no desempenho de cozedura em comparação ao controle neutro. Tabela 8. Desempenho de cozedura da enzima lipolítica L01 em dosagens diferentes (mg de proteína total por quilo de farinha (determinado de acordo com Bradford) Tabela 9. Desempenho de cozedura da enzima lipolítica L02 em dosagens diferentes (mg de proteína total por quilo de farinha (determinado de acordo com Bradford)Tabela 10. Desempenho de cozedura da enzima lipolítica L03 em dosagens diferentes (mg de proteína total por quilo de farinha (determinado de acordo com Bradford) Tabela 11. Desempenho de cozedura da enzima lipolítica L04 em dosagens diferentes (mg de proteína total por quilo de farinha (determinado de acordo com Bradford)

As lipases L01 a L04 aperfeiçoaram claramente a 5 estabilidade da massa, volume melhorado do pão, crescimento no forno aperfeiçoado e regularidade de farelo aperfeiçoada em comparação ao controle neutro. L01 a L04 foram eficazes na substituição de DATEM a 0,3%, a faixa de dosagem eficaz sendo de pelo menos: 0,25-2,0 ppm para L01, L02 e L04 e 10 0,25-1 ppm para L03. As lipases L01 a L04 não influenciaram a pegajosidade da massa em comparação ao controle neutro ou controle de DATEM. Em dosagens mais altas de L01 a L04 as massas se tornaram ligeiramente mais extensíveis sem efeito significativo no manuseio da massa.

Exemplo 6 Determinação das conversões de lipídeo na massa de mini-pão semelhante à baguete Experimento de panificação - mini-pão semelhante à baguete

Mini-pães semelhantes à baguetes foram assados de pedaços de massa de 150 g obtidos por mistura de 200 g de farinha (Kolibri™) , 4,6 g de levedura comprimida, 4 g de sal, 68 ppm de ácido ascórbico, 1 ppm de Bakezyme(® P500 (alfa-amilase de fungo), 5 ppm de Bakezyme® HSP6000 (hemicelulase de fungo) e no total 57% de água (farinha de trigo ajustada como 100%). Os sobrenadantes isentos de célula (com pelo menos 2 mg/mL de proteína total) contendo L01, L02, L03 ou L04 respectivamente foram adicionados a 0,5, 1,0 e 2,5 ppm de proteína Bradford. Como um controle adicional, o sobrenadante de cultura isento de célula da cepa hospedeira A. niger desprovido de L01 a L04 contendo 0,3 mg/mL de proteína Bradford foi testado em 3 ppm de proteína Bradford.

Após mistura por 6 minutos e 15 segundos em um misturador de pino, a massa foi dividida em duas peças de 150 g, enrolada e fermentada por 25 minutos a temperatura ambiente e umidade relativa de 90%. Os pedaços de massa foram então moldados e conformados e fermentados por 100 minutos a 32°C e 85% de umidade relativa. Os pedaços de massa completamente fermentados receberam incisões e foram assados em um forno a 240°C por 20 minutos com adição de vapor inicial. Os resultados de cozedura dos experimentos de panificação de mini-pães semelhantes à baguete são comparáveis aos obtidos em grande escala, conforme descrito no Exemplo 5.

Lipídeos Polares

Os lipídeos foram extraídos por agitação vigorosa da massa fermentada completamente moída e liofilizada (vide experimento de panificação, mini-pão semelhante à baguete acima) com butanol saturado em água. Após centrifugação o sobrenadante límpido é analisado em HPLC em LiChrospher 100 DIOL 5 μm (250 x 4,0 mm), componentes lipóidicos foram detectados por Difusão da Luz em Evaporação (Evaporative Light Scattering) (Alitech ELSD 2000ES), em fluxo de nitrogênio de 1,5 L/min, temperatura de 80°C, impactador ligado. A eluição foi realizada usando duas fases móveis em um programa de gradiente, em um fluxo de 1,0 mL/min: A: heptano/isopropanol/butanol/tetraidrofurano/iso-octano/água (64,5/17,5/7/5/5/1). B: isopropanol/butanol/tetraidrofurano/iso- octano/água (73/7/5/5/10).

Para ambas as soluções de eluição são adicionados 77 μL de solução amoníaca e 77 μL de ácido triflúor acético por litro.

Programa gradiente: linear de 100% A para 100% B em 25 minutos, então 100% B por 5 minutos, então gradiente linear de 100% B para 100% A por 0,5 min, e finalmente 100% A por 5 minutos com um volume de injeção de 20 μL em uma temperatura de coluna de 8 0 °C. Referências de galactolipídeos, fosfolipídeos, por exemplo, monogalactosildiglicerídeo, monoglactosilmonoglicerídeo, digalactosildiglicerídeo, digalactosilmonoglicerídeo, fosfatidilcolina e lisofosfatidilcolina foram usados para indicar a ordem de eluição dos vários compostos e calcular seus fatores de resposta e quantidades presentes na massa.

A composição de lipídeo da massa varia entre os tipos de colheitas da farinha. Embora um tipo de farinha tenha sido usado para todos os experimentos (Kolibry) os dados apresentados na Tabela 12 foram obtidos usando farinha de uma colheita diferente daquela data apresentada nas Tabelas 13-16.

As quantidades de lipídeos polares principais na massa completamente fermentada contendo a amostra de controle de base da cepa hospedeira A. niger (Tabela 12) ou contendo várias quantidades de L01 a L04 (Tabela 13-16), respectivamente, estão apresentadas em comparação às respectivas quantidades de lipídeo da massa de controle neutro. Os resultados ilustrados na Tabela 12 demonstram claramente que o sobrenadante de cultura isento de célula da cepa hospedeira de A. niger (controle) não possui qualquer influência significativa na composição de lipídeo da massa polar em comparação ao controle neutro na dosagem alta testada. A partir dos resultados mostrados nas Tabelas 13-16, pode ser concluído de forma não ambígua, que L01 a L04 convertem eficazmente os galactossildiglicerídeos em galactosilmonoglicerídeos já na dosagem mais baixa testada, com uma preferência para digalactosildiglicerídeo em comparação ao monogalactosildiglicerídeo e também em comparação à fosfatidilcolina.

Fica adicionalmente claro que o nível de galactosilmonoglicerídeo alto na massa em uma dosagem de 0,5-2,5 ppm (proteína Bradford) para L01 a L04 se correlaciona ao desempenho de cozedura descrito no Exemplo 5 .Tabela 12. Lipídeos polares em massa completamente fermentada (expressos como grama por quilo de massa liofilizada) com o sobrenadante isento de célula da cepa hospedeira A. niger (controle) ou sem qualquer adição (controle neutro). MGDG = monogalactosildiglicerídeo; MGMG monogalactosilmonoglicerídeo; DGDG digalactosildiglicerídeo; DGMG digalactosilmonoglicerídeo; PC = fosfatidilcolina; LPC = liso-fosfatidilcolina. Tabela 13 - Lipídeos polares em massa completamente fermentada (expressos como grama por quilo de massa liofilizada) contendo várias quantidades de L01 (expressas como mg de proteína Bradford por quilo de farinha) MGDG = monogalactosildiglicerídeo; MGMG monogalactosilmonoglicerídeo; DGDG digalactosildiglicerídeo; DGMG digalactosilmonoglicerídeo; PC = liso-fosfatidilcolina. Tabela 14 - Lipídeos polares em massa completamente fermentada (expressos como grama por quilo de massa liofilizada) contendo várias quantidades de L02 (expressas como mg de proteína Bradford por quilo de farinha) MGDG = monogalactosildiglicerídeo; MGMG monogalactosilmonoglicerídeo; DGDG digalactosildiglicerídeo; DGMG digalactosilmonoglicerídeo; PC = fosfatidilcolina; LPC = liso-fosfatidilcolina.Tabela 15 - Lipídeos polares em massa completamente fermentada (expressos como grama por quilo de massa liofilizada) contendo várias quantidades de L03 (expressas como mg de proteína Bradford por quilo de farinha) MGDG = monogalactosildiglicerídeo; MGMG 15 monogalactosilmonoglicerídeo; DGDG digalactosildiglicerídeo; DGMG = digalactosilmonoglicerídeo; PC = fosfatidilcolina; LPC = liso-fosfatidilcolina.Tabela 16 - Lipídeos polares em massa completamente fermentada (expressos como grama por quilo de massa liofilizada) contendo várias quantidades de L04 (expressas como mg de proteína Bradford por quilo de farinha) MGDG = monogalactosildiglicerídeo; MGMG monogalactosilmonoglicerideo; DGDG digalactosildiglicerídeo; DGMG digalactosilmonoglicerídeo; PC = fosfatidilcolina; LPC = liso-fosfatidilcolina.

Lipídeos Apoiares

Lipídeos apoiares são extraídos por agitação vigorosa de massa completamente fermentada, liofilizada, moída (vide Experimento de Panificação - mini-pão semelhante à baguete acima) com heptano contendo 1% de ácido acético. Após centrifugação, o sobrenadante límpido é analisado em HPLC em Spherisorb S3CN (Phenomenex OOD-0097- EO; 100 x 4,6 mm), componentes lipóidicos são detectados por Difusão da Luz em Evaporação (Alltech ELSD 2000ES), em fluxo de nitrogênio por 1,5 L/min, temperatura e 40°C, impactador desligado. A eluição é realizada usando duas fases móveis (A: heptano e B: éter t-butil-metílico contendo ácido acético a 1%) no programa gradiente linear que se segue, em um fluxo de 1,0 mL/min, volume de injeção de 20 μL e temperatura ambiente da coluna: Referências de tri, di e monoglicerídeos e ácido graxo são usadas para indicar a ordem de eluição dos vários compostos e calcular seus fatores de resposta e quantidades presentes na massa.

Exemplo 7 Experimento de Panificação - substituição parcial de DATEM no pão semelhante à baguete em grande escala

Para algumas aplicações de panificação, pode ser benéfico substituir parcialmente DATEM pela enzima lipolítica de acordo com a invenção ao invés de substituir completamente DATEM, conforme descrito no Exemplo 5. Neste exemplo, o efeito das composições compreendendo DATEM e L01 e das composições compreendendo DATEM e L02 nas propriedades da massa e do produto assado foi analisado.

A fim de avaliar a quantidade de enzima lipolítica necessária para substituir metade de DATEM em uma receita com DATEM a 0,3%, foi estudado o desempenho de cozedura no pão semelhante à baguete em escala plena das combinações de DATEM a 0,15% com várias quantidades de sobrenadantes isentos de célula com pelo menos 2 mg/mL de proteína Bradford total, contendo L01 ou L02 respectivamente.

Os vários efeitos da enzima lipolítica em diferentes dosagens combinadas com DATEM a 0,15% ambos na massa e no produto assado final, foram comparados a um controle nulo, isto é, um pão não contendo DATEM nem a enzima lipolítica e aos pães contendo uma concentração de DATEM total de 0,15% ou 0,3% respectivamente ou aos pães contendo 0,25 ppm de L01 ou L02.

A composição compreendendo DATEM (Lametop 501) e L01 foi testada usando a receita para pão semelhante à bengala e processo em grande escala: 2.000 g de farinha (isto é, 1.8 00 g de Kolibri™ e 200 g de íbis™), 47 g de levedura comprimida, 40 g de sal, 88 ppm de ácido ascórbico, 3 ppm de Bakezyme® P500 (alfa- amilase de fungo), 15 ppm de Bakezyme® HSP6000 (hemicelulase de fungo) e 57% de água foram misturados em um misturador Diosna por 2 minutos em velocidade 1 e 71 Wh em velocidade 2, a uma temperatura de massa final de 27°C. A massa foi dividida em 6 pedaços de 3 50 g, enrolada e fermentada por 20 minutos a 32°C e 90% de umidade relativa. Após isto, os pedaços de massa foram moldados e conformados e fermentaram por 90 minutos a 34°C em umidade relativa de 90%. Os pedaços de massa completamente fermentada receberam incisões e assaram em um forno a 240°C por 30 minutos com adição de vapor inicial. As bateladas de farinha empregadas neste experimento eram originárias de uma colheita diferente em comparação às bateladas de farinha empregadas nos Exemplos 5 e 6. A concentração de ácido ascórbico maior neste experimento foi usada seguindo-se a instrução do fornecedor pra esta batelada de farinha Kolibri. A composição compreendendo DATEM (Lametop) e L02 foi testada usando a receita do pão semelhante à baguete e processo em ampla escala: 2.000 g de farinha (isto é, 1.800 g de Kolibri™ e 200 g de Ibis™), 47 g de levedura comprimida, 40 g de sal, 68 ppm de ácido ascórbico, 2 ppm de Bakezyme® P500 (alfa- amilase de fungo), 15 ppm de Bakezyme® HSP6000 (hemicelulase de fungo) e 57% de água foram misturados em um misturador Diosna por 2 minutos em velocidade 1 e 71 Wh em velocidade 2, a uma temperatura de massa final de 27°C. A massa foi dividida em 6 pedaços de 350 g, enrolada e fermentada por 20 minutos a 32 °C e 90% de umidade relativa. Após isto, os pedaços de massa foram moldados e conformados e fermentaram por 100 minutos a 34°C em umidade relativa de 90%. Os pedaços de massa completamente fermentada receberam incisões e assaram em um forno a 24 0°C por 3 0 minutos com adição de vapor inicial. Novamente, as bateladas de farinha empregadas neste experimento eram originárias de uma colheita diferente em comparação às bateladas de farinha empregadas para a composição compreendendo L01 e às bateladas de farinha usadas nos Exemplos 5 e 6. Os resultados das composições compreendendo DATEM e L01 são fornecidos na Tabela 17, enquanto os resultados das composições compreendendo DATEM e L02 são fornecidos na Tabela 18. As características do pão e massa foram avaliadas conforme descrito no Exemplo 5.Tabela 17. Desempenho de cozedura das composições da enzima lipolítica L01 (fornecido como ppm, isto é, mg de proteína total por kg de farinha (determinado de acordo com Bradford) ) e DATEM (fornecido como %, isto é, g de DATEM por 100 g de farinha). Tabela 18. Desempenho de cozedura das composições da enzima lipolítica L02 (ppm, isto é, mg de proteína total por kg de farinha (determinado de acordo com Bradford)) e DATEM (fornecido como %, isto é, g de DATEM por 100 g de 5 farinha)

Estes resultados mostram claramente que a composição compreendendo 0,15% de DATEM e 0,08 ppm de L01 ou 0,07 ppm de L02, respectivamente, foi eficaz na substituição de DATEM a 0,3%, conduzindo a estabilidade de massa comparável, volume do pão, crescimento no forno, estrutura do farelo e cor do farelo. Uma dosagem mínima de 0,25 ppm de L01 ou L02, respectivamente, pode ser suficiente para substituir DATEM a 0,3% conforme também mostrado no Exemplo 5. Surpreendentemente, uma combinação de aproximadamente metade da dosagem de L01 (0,12 ppm) ou metade da dosagem de L02 (0,10 ppm), respectivamente, com metade da dosagem de DATEM (DATEM a 0,15%) mostrou um aperfeiçoamento na estabilidade da massa, estrutura do farelo e crescimento no forno em comparação ao DATEM 0,3% sozinho e comparado a 0,25 ppm de L01 sozinho ou 0,25 ppm L02 sozinho, respectivamente. Isto indica que as composições compreendendo DATEM e enzimas lipolíticas L01 ou L02 de acordo com a invenção mostram um efeito sinérgico.

Exemplo 8 Efeito de uma enzima lipolítica da invenção no bolo Victoria

Enzimas lipolíticas podem ser usadas nas receitas de bolo para aperfeiçoar, por exemplo, a estabilidade da emulsão da massa mole. Aqui, L01 foi testada quanto ao seu efeito no bolo Victoria. Os bolos Victoria foram preparados usando um misturador Hobart provido com um misturador batedor plano, como se segue: 1. Misture manteiga sem sal, 19% e açúcar 21% 2. Adicione os ingredientes secos: farinha para bolo tratada com aquecimento (Albatros, Meneba), 30%; pó para panificação (SAPP 15) , 0,4; bicarbonato de sódio, 0,3%; leite em pó, 0,4%; sal, 0,13% e L01, conforme indicado na Tabela 19 e misture 3. Adicione os ingredientes líquidos durante a mistura: ovo integral, 23% (peso/peso), água, 3,6% (peso/peso), 19% (peso/peso), glicerina, 2,1% (peso/peso). 4. Raspe a tigela e misture em velocidade mais alta por 2 minutos.

As porcentagens dos ingredientes são fornecidas em % (peso/peso) do peso final da massa mole. As dosagens de L01 são fornecidas em ppm, isto é, proteína Bradford (mg) em relação à massa do ovo líquido integral (kg) na receita de controle nulo.

As massas moles, peso da massa mole final 1.496 g, foram pesadas para peso da massa mole de 300 g por recipiente (diâmetro de 13 cm) e assadas em 165/170°C por 45 minutos.

Os vários efeitos de L01, ambos na massa mole e no bolo final, foram comparados a um controle nulo, isto é, uma massa mole/bolo não contendo a enzima lipolítica L01. A densidade específica da massa mole, isto é, peso da massa mole por volume da massa mole (g/L) foi medido por determinação do peso de um volume de massa mole definido (aqui 300 mL) . Os volumes dos bolos foram determinados por um analisador de volume de pão automatizado (BVM-3, TexVol Instruments), o bolo pesado e o volume de bolo específico (mL/mg) calculado. O volume específico do bolo do bolo de controle nulo foi definido como de 100%.

Os bolos foram armazenados um a um em sacos de polietileno a temperatura ambiente. Um, oito e dezoito dias após a cozedura, a firmeza e resiliência do farelo foram medidas usando um analisador de textura SMS TAX2 (Stable Microsystems) usando uma sonda cilíndrica de 4 cm. Em cada bolo, quatro fatias, tomadas do centro do bolo foram medidas. A sonda foi tracionada 10 mm pra dentro da fatia do bolo e a resistência gravada diretamente e após 3 0 5 segundos. Os valores relativos (diminuição da porcentagem) representam a resiliência, a capacidade do produto de cope com o estresse. O valor absoluto em t = 0 representa a firmeza.

A homogeneidade de poro do farelo foi avaliada 10 visualmente por um padeiro experimentado em uma escala relativa de 1 a 10: 1 = heterogêneo, estrutura de farelo irregular a 10 = estrutura e farelo uniforme homogênea. O diâmetro de poro do farelo foi avaliado visualmente por um padeiro experimentado em uma escala relativa de 1 a 10: 1 = 15 muito grande (estrutura de farelo aberta) a 10 = muito pequeno (estrutura de farelo muito fina).Tabela 19. Desempenho da enzima lipolítica L01 no bolo Victoria

Adição de L01 resultou em densidade de massa mole diminuída, volume aumentado do bolo, farelo mais homogêneo com poros pequenos e firmeza do farelo reduzida ambos inicialmente e durante a validade em prateleira em relação ao bolo de controle nulo. Nenhuma diferença significativa na resiliência do farelo foi observada para os bolos testados. Estes resultados mostram claramente que as enzimas lipolíticas da invenção aperfeiçoaram a estabilização em emulsão da massa mole de bolo, resultando em qualidade total do bolo aperfeiçoada. Estes resultados também mostram que as enzimas lipolíticas da invenção não são apenas funcionais na substituição dos emulsionantes, tais como, por exemplo, DATEM ou SSL/CSL nas receitas de pão, porém também nas receitas de bolo isentas de emulsionante, como adição à enzima lipolítica da invenção resultou em volume de bolo aumentado, um efeito que pode ser obtido por adição de emulsionantes, tais como, monoestearato de glicerol e em maciez de bolo aumentada, um efeito que é geralmente obtido por adição dos emulsionantes, tais como, monoglicerídeos.

Exemplo 9 Efeito de uma enzima lipolítica da invenção nas propriedades da massa mole e farelo em bolo levedado com ovo reduzido

A redução dos ovos nas receitas de bolo levedado resulta em um bolo esfarelável com uma estrutura de farelo fraca, aberta. As enzimas lipolíticas podem ser usadas para aperfeiçoar a qualidade total do bolo em tais receitas de bolo com ovo reduzido. Aqui, foi testado o efeito de L01 sozinha e em combinação com fosfolipase A no bolo levedado com ovo reduzido. Um bolo levedado com ovo reduzido foi testado.

Como a fosfolipase Cakezyme™ (DSM Food Specialties, Países-Baixos) foi usada uma fosfolipase A2 produzida em A. niger contendo 5.000 CPU/g. A atividade da fosfolipase foi determinada usando rac 1,2-dioctanoilditio fosfatidilcolina como substrato, a reação foi seguida espectrofotometricamente em 405 nm e a atividade expressa em unidades cromogênicas de fosfolipase: 1 CPU (Unidade Cromogênica de Fosfolipase) foi normalizada para 1 EYU (Unidade de Gema de Ovo), que é definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de ácido por minuto da gema de ovo a 40°C e pH 8,0.

Bolos fermentados foram preparados usando um misturador Hobart provido com um misturador de arame, como se segue: - ingredientes na % de peso da massa mole final (peso/peso): açúcar, 25%; farinha para bolo tratada com aquecimento (Albatros, Meneba), 21%; fermento em pó (SAPP 28), 0,6%; amido de trigo, 8,3%; emulsionante (BV40), 3,3%; bicarbonato de sódio, 0,4%; ovo integral (para massa mola de referência com todos ovos: 30%, para massa mole com quantidade reduzida de ovo: 24%); água (para massa mole de referência com todos ovos: 11,4%, para massa mole com ovo reduzido: 17,4%). 1. Misture todos os ingredientes, incluindo as respectivas quantidades de L01 e/ou fosfolipase A, conforme indicado na Tabela 20 por 1 minuto em velocidade 1. 2. Misture por 5 minutos em velocidade 3 3. Misture por 1 minuto em velocidade 1

As massas moles, peso final da massa mole de 848 g, foram pesadas para 400 g de peso de massa mole por recipiente (diâmetro de 28 cm) e assadas a 180/180°C por 25 minutos. As dosagens de L01 são fornecidas em ppm, isto é, proteína Bradford (mg) em relação à massa de ovo líquido integral (kg) na massa mole de referência com ovos, dosagens de fosfolipase A em % em peso de Cakezyme™ (produto) em relação à massa do ovo líquido integral na massa mole de referência com ovos.

Estrutura do farelo de bolo foi avaliada visualmente por um padeiro experimentado em uma escala relativa de 1 a 10: 1 = estrutura de farelo aberta/irregular com paredes de célula mais espessas a 10 = estrutura de farelo muito fina/uniforme com paredes de célula mais finas. Aqui, a maciez do farelo foi julgada visualmente com classificações relativas 1: muito forme a 10: muito macia. A coesão do farelo foi julgada manualmente com classificações relativas 1: muito esfarelado a 10: coesivo.Tabela 20: Desempenho da enzima lipolítica L101,fosfolipase A e uma combinação da mesma em bolo levedado com ovo reduzido em comparação ao bolo levedado com ovos * 20% menos ovos integrais que para a referência com ovos.

A redução de ovos em 20% e compensação do peso da massa mole correspondente com água resultou na viscosidade diminuída da massa mole, maciez diminuída do farelo, estrutura mais fraca do farelo e coesão diminuída do farelo em comparação à referência com ovos. Adicionando-se a fosfolipase A a massa mole com ovo reduzido, a viscosidade da massa mole foi restaurada ao nível da massa mole com ovos, a maciez e coesão do farelo foram consideravelmente aperfeiçoadas em comparação ao bolo com ovo reduzido e a estrutura do farelo foi mesmo ligeiramente aperfeiçoada em comparação ao bolo com ovos.

A adição de L01 à massa mole com ovo reduzido resultou em viscosidade da massa mole ligeiramente aperfeiçoada e estrutura de farelo mais fina em comparação à referência de ovo completo e na maciez do farelo aperfeiçoada e, especialmente coesão do farelo aperfeiçoada em comparação à referência com ovo reduzido.

Surpreendentemente, a adição de uma composição compreendendo L01 e fosfolipase A à massa mole de bolo com ovo reduzido aperfeiçoou adicionalmente a viscosidade da massa mole, estrutura do farelo e maciez do farelo em comparação às receitas com ovo reduzido e ovo completo nas quais tanto L01 ou fosfolipase A foi adicionada, e a coesão do farelo restaurada ao nível do bolo com ovos. A partir destes resultados, fica claro que a adição de uma enzima lipolítica da invenção sozinha ou em combinação com fosfolipase A aperfeiçoa as propriedades totais do bolo com ovo reduzido. Em uma receita de bolo com ovo reduzido, uma maciez e estrutura de farelo melhores que a do bolo com ovo inteiro podem ser obtidas quando uma enzima lipolítica da invenção é adicionada sozinha e especialmente em combinação com fosfolipase A.

Exemplo 10 Efeito de uma enzima lipolítica da invenção na crocância de uma massa folheada

A massa folheada foi preparada de 1.000 g de farinha Edelweiss, 43 0 g de água, 100 g de ovos, 50 g de levedura, 20 g de sal, 10 g de açúcar, 15 g de melhorador de pão e L01. L01 foi dosada em 0,23 ppm, isto é, mg de proteína, determinado de acordo com Bradford, por quilo de farinha. A referência não apresentou enzima. Após repouso apropriado a massa foi enrolada em uma camada. Uma camada de margarina para folhear (Trio Korst, Unipro, Bergen op Zoom, Países-Baixos) foi dobrada em uma folha de massa. Esta então foi enrolada em uma massa folheada em um procedimento padrão. Pedaços foram cortados da massa final e dobrados em massas de pastelaria na forma de borboleta e assados no forno a 235°C por 20 minutos. Os produtos foram testados após dois dias em um gabinete semifechado. 0 teste mecânico foi realizado usando um analisador de textura (TA- XT Plus, Stable Micro systems Ltd., Surrey, Reino Unido). Pelo menos 10 massas de pastelaria de referência e o produto com L01 foram caracterizados usando uma sonda de borda de 25 mm em uma velocidade de 1 mm/seg após 2 dias de armazenamento.

A curva de compressão de força versus distância foi analisada e os parâmetros foram obtidos de uma curva de compressão usando uma macro do Texture Analysis Software. Um tracejador de gráfico da StatGraphics (software de 5 análise estatística e modelagem) foi obtido para determinar as diferenças estatisticamente significativas entre as massas de pastelaria de referência e as massas de pastelaria contendo L01. Os resultados dos experimentos de compressão após 2 dias de armazenamento em condições 10 ambientes são apresentados na Tabela 21. Nos cinco parâmetros texturais foram encontradas diferenças significativas entre a referência e os produtos preparados com L01. Os produtos com L01 apresentaram moldagem mais fácil em relação aos da referência. Tabela 21 - Características de crocância nos produtos folheados assados após dois dias de armazenamento em condições ambientes

Isto mostra que os produtos folheados assados preparados com uma enzima lipolítica de acordo com a 20 invenção são mais crocantes após dois dias de armazenamento em condições ambientes que os produtos preparados sem enzima.

Claims (23)

1. Polinucleotídeo isolado que codifica uma enzima lipolítica caracterizado por compreender: (a) a sequência de nucleotídeo conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7; e (b) uma sequência de nucleotídeo que é o complemento de uma sequência de nucleotídeo conforme definida em (a).

2. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser produzido sinteticamente.

3. Vetor caracterizado por compreender uma sequência de polinucleotídeo conforme definida na reivindicação 1 ou 2.

4. Vetor, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser um vetor de expressão, em que a sequência de polinucleotídeo, conforme definida na reivindicação 1 ou 2, é operativamente ligada com pelo menos uma sequência reguladora permitindo a expressão da sequência de polinucleotídeo em uma célula hospedeira apropriada.

5. Vetor, de acordo com reivindicação 4, caracterizado por a célula hospedeira apropriada para a expressão do vetor ser um fungo filamentoso.

6. Célula hospedeira recombinante caracterizada por compreender um polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, ou compreender um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, em que a célula hospedeira é um Aspergillus.

7. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por ser capaz de expressar ou superexpresar o referido polinucleotídeo ou vetor.

8. Método para fabricar um polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, ou um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado por compreender as etapas de cultivo de uma célula hospedeira transformada com o referido polinucleotídeo ou o referido vetor e isolamento do referido polinucleotídeo ou do referido vetor da referida célula hospedeira.

9. Polipeptídeo isolado possuindo atividade lipolítica caracterizado por compreender: (a) uma sequência de aminoácido de acordo com o polipeptídeo maduro na sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2.

10. Polipeptídeo isolado possuindo atividade lipolítica caracterizado por o polipeptídeo consistir em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8.

11. Método para fabricar um polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 9 ou 10, caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira recombinante, conforme definida na reivindicação 6 ou 7, sob condições que permitam a expressão de um polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, ou um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, e, opcionalmente, recuperar o polipeptídeo codificado da célula ou meio de cultura.

12. Uso de um polipeptídeo isolado, conforme definido na reivindicação 9 ou 10, caracterizado por ser na fabricação de um produto de laticínio, preferivelmente na fabricação de queijo, produto semelhante a queijo, queijo modificado com enzima (EMC) ou na fabricação de misturas de ácido graxo livre obtidas pela lipólise de gordura de manteiga ou creme.

13. Método para preparar um produto de laticínio caracterizado por um polipeptídeo isolado, conforme definido na reivindicação 9 ou 10, ser adicionado à uma composição de laticínio usada na fabricação de um produto de laticínio sob condições suficientes para a enzima reagir.

14. Uso de um polipeptídeo isolado, conforme definido na reivindicação 9 ou 10, caracterizado por ser na fabricação de um produto assado.

15. Composição de enzima para panificação caracterizada por compreender um polipeptídeo isolado possuindo atividade lipolítica, conforme definido na reivindicação 9 ou 10, e uma ou mais enzimas adicionais, em que a enzima adicional é selecionada do grupo que consiste em uma amilase, uma alfa-amilase, uma beta-amilase, uma amilase maltogênica ou amilase não maltogênica, uma glicanotransferase de ciclodextrina, uma protease, uma peptidase, uma exopeptidase, uma transglutaminase, uma lipase, uma galactolipase, uma fosfolipase, uma celulase, uma hemicelulase, uma xilanase, uma arabinoxilana, uma protease, um dissulfeto isomerase de proteína, uma glicosiltransferase, uma peroxidase, uma lacase, uma oxidase, uma hexose oxidase, uma glicose oxidase, uma aldose oxidase, uma piranose oxidase, uma lipoxigenase ou uma ácido L-amino oxidase.

16. Composição para panificação, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender DATEM e um polipeptídeo isolado possuindo atividade lipolítica, conforme definido na reivindicação 9 ou 10.

17. Método para preparar uma massa caracterizado por compreender as etapas de adição do polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 9 ou 10, ou uma composição, conforme definida na reivindicação 15 ou 16, a pelo menos um dos ingredientes da massa.

18. Massa caracterizada por compreender o polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 9 ou 10, ou uma composição, conforme definida na reivindicação 15 ou 16.

19. Método para preparar um produto assado caracterizado por compreender a etapa de cozimento da massa, conforme definida na reivindicação 18.

20. Método para produzir um bolo ou uma massa a partir da qual um bolo pode ser derivado caracterizado por ser usada uma enzima lipolítica, conforme definida na reivindicação 9 ou 10.

21. Produto assado obtido pelo método, conforme definido na reivindicação 19, caracterizado por o bolo ser um bolo isento de emulsificante ou um bolo reduzido de ovos e/ou gordura, em que a quantidade de ovos no bolo com redução de ovos é de 20%, e em que o produto assado é preparado a partir de uma massa em que um polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 9, é adicionado.

22. Método para preparar uma massa caracterizado por compreender as etapas de: a) preparar uma massa de um bolo pela adição de pelo menos: i. açúcar ii. farinha iii. fosfolipase A, a enzima lipolítica, conforme definida na reivindicação 9, e ovos ou um método para preparar um bolo derivado a partir da referida massa, que ainda compreende as etapas de: b) assar a massa para produzir um bolo, em que o bolo compreende uma quantidade reduzida de ovos e/ou gordura ou em que o bolo é um bolo regular.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por um ou mais de outros ingredientes estarem presentes na composição, e serem selecionados de fontes de proteínas, hidrocolóides, extrato de levedura, amido modificado e cálcio.