BR112019012559A2 - variantes de enzima lipolítica - Google Patents

Abstract

a presente revelação descreve um polipeptídeo variante que tem atividade lipolítica, em que o variante tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em seq id no: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a seq id no: 2, e em que o dito variante tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptídeo maduro que tem atividade lipolítica como estabelecido em seq id no: 2. tal polipeptídeo variante pode ser usado na preparação de um produto assado.

Description

VARIANTES DE ENZIMA LIPOLÍTICA

Campo [0001] A presente revelação se refere a um polipeptídeo variante que tem atividade lipolitica, também chamado de um variante de enzima lipolitica. A revelação também se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica tal variante, um construto de ácido nucleico que compreende a sequência de ácidos nucleicos e à célula hospedeira recombinante que compreende um vetor de expressão recombinante que compreende o dito construto de ácido nucleico que codifica o variante. Além disso, a revelação se refere a um método para produzir um variante de polipeptídeo lipolítico. A revelação se refere adicionalmente a uma composição que compreende o polipeptídeo variante, uso de tal polipeptídeo variante na produção de um produto alimentício e ao uso do polipeptídeo variante para substituir pelo menos parte de um emulsificador químico na produção de uma massa e/ou um produto assado. A revelação se refere adicionalmente a uma massa, um processo para a produção de uma massa e um processo para a produção de um produto assado.

Antecedentes [0002] Na indústria de assados, por exemplo, na fabricação industrial de pães e massas, os auxiliares de processamento são usados para aprimorar as propriedades de uma massa e ou um produto assado. A fim de aprimorar as propriedades de manuseio da massa e/ou as propriedades finais dos produtos assados, há um esforço contínuo para desenvolver auxiliares de processamento com propriedades

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2/133 aprimoradas. Os auxiliares de processamento são definidos no presente documento como compostos que aprimoram as propriedades de manuseio da massa e/ou as propriedades finais dos produtos assados. As propriedades de massa que podem ser aprimoradas compreendem estabilidade, capacidade de retenção de gás, elasticidade, extensibilidade, moldabilidade etcetera. As propriedades dos produtos assados que podem ser aprimorados compreendem volume de pão, crocância de casca, salto de forno, textura do miolo, estrutura do miolo, maciez do miolo, sabor, envelhecimento relativo e vida de prateleira. Esses auxiliares de processamento podem ser divididos em dois grupos: aditivos químicos e enzimas (também chamadas de enzimas de panificação).

[0003] Os aditivos químicos com propriedades de aprimoramento incluem agentes de oxidação, como ácido ascórbico, bromato e azodicarbonato, agentes de redução, como L-cisteína e glutationa, emulsificantes que atuam como condicionadores de massa, como ésteres de ácido diacetil tartárico de mono/diglicerídeos (DATEM), estearoil lactilato de sódio (SSL) ou estearoil lactilato de cálcio (CSL), emulsificantes que atuam como amaciadores de miolo, como monostearato de glicerol (GMS) etceteras, materiais graxos, como triglicerídeos (gordura) ou lecitina e outros. Os emulsif icantes, como DATEM, SSL e/ou CSL podem ser usados para gerar tolerância de processo. Os emulsificantes também podem ser usados para aumentar o volume de um produto assado. A resistência dos clientes aos aditivos químicos está crescendo e há, portanto, necessidade constante de substituir aditivos químicos como

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3/133 emulsificantes químicos.

[0004] Há atualmente substitutos de emulsificantes químicos no mercado, como enzimas lipolíticas, que sob ação de um substrato podem gerar moléculas de emulsificação in situ. As enzimas lipolíticas são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações de éster em substratos de lipídeo, levando à liberação de ácidos graxos. Na indústria, fosfolipases são usadas para substituir completa ou parcialmente, por exemplo, DATEM. 0 documento WO1998026057 descreve uma fosfolipase que pode ser usada em um processo para fabricação de pão. 0 documento W02009/106575 descreve uma enzima lipolítica e seu uso em um processo para fabricação de pão. Apesar do fato de que há enzimas lipolíticas comerciais no mercado ainda há uma necessidade industrial de enzimas lipolíticas com desempenho aprimorado na indústria, especialmente, na indústria de assados.

Descrição das Figuras [0005] Figura 1. Estabelece o vetor de expressão pGBFIN50 de Aspergillus.

[0006] Figura 2. Estabelece o vetor de expressão pGBFINPL-00 de enzima lipolítica de Aspergillus

Descrição da listagem de sequências [0007] SEQ ID NO: 1 estabelece a sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica (estabelecida em nucleotídeos 100 a 914) que incluem uma sequência de sinal de terminal N de 33 aminoácidos (estabelecida em nucleotídeos 1 a 99) e pró-sequência de terminal C (estabelecida em nucleotídeos 915 a 1038) .

[0008] SEQ ID NO: 2 estabelece a sequência de

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4/133 aminoácidos do polipeptídeo de referência (também chamado de polipeptídeo parental) que tem atividade lipolítica (estabelecida em aminoácidos 34 a 304) que inclui uma sequência de sinal de terminal N de 33 aminoácidos (estabelecida em aminoácidos 1 a 33), e pró-sequência de terminal C (estabelecida em aminoácidos 305 a 346) [0009] SEQ ID NO: 3 estabelece uma sequência de iniciação translacional modificada do promotor de glucoamilase glaA.

[0010] SEQ ID NO: 4 estabelece a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo alfa-amilase de Alicyclobacillus pohliae.

[0011] SEQ ID NO: 5	estabelece a	sequência	de
aminoácidos de um polipeptídeo amilase stearothermophilus.	de Bacillus
[0012] SEQ ID NO: 6	estabelece a	sequência	de
aminoácidos de uma amilase	de Pseudomonas saccharophila
[0013] SEQ ID NO: 7 aminoácidos de uma amilase. Sumário	estabelece a	sequência	de
[0014] De acordo com	a revelação, é	fornecido	um
polipeptídeo variante que tem atividade lipolítica, em	que

o variante tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2,

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5/133 e em que o dito variante tem pelo menos 7 0 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

[0015] A revelação também fornece:

- uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptideo variante da revelação;

- Um construto de ácido nucleico que compreende a sequência de ácidos nucleicos operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle com capacidade de direcionar a expressão de uma enzima lipolitica em um hospedeiro de expressão adequado.

- Uma célula hospedeira recombinante que compreende um vetor de expressão recombinante que compreende o construto de ácido nucleico.

[0016] A revelação também se refere a um método para produzir um variante de polipeptideo lipolitico que compreende cultivar a célula hospedeira sob condições favoráveis à produção do variante de enzima lipolitica e recuperar o variante de enzima lipolitica.

[0017] Além disso, a revelação se refere a:

- Uma composição que compreende o polipeptideo variante da revelação;

- Uso do polipeptideo variante de acordo com a revelação, ou da composição de acordo com a revelação na produção de um produto alimentício, de preferência, na produção de uma massa e/ou um produto assado

- Uma massa que compreende o polipeptideo variante de acordo com a revelação, um polipeptideo variante obtenível pelo método de acordo com a revelação ou a composição de acordo com a revelação.

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- Um processo para a produção de uma massa que compreende a etapa de combinar uma quantidade eficaz do polipeptideo variante de acordo com a revelação, o polipeptideo variante obtenível pelo método de acordo com a revelação ou a composição de acordo com a revelação para pelo menos um ingrediente de massa.

- Um processo para a produção de um produto assado, cujo método compreende assar a massa de acordo com a revelação.

Descrição detalhada [0018] Ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações anexas, as palavras compreender, incluir e ter e variações como compreende, compreendendo, inclui e incluindo devem ser interpretadas inclusivamente. Ou seja, essas palavras são destinadas a expressar a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, onde for permitido pelo contexto.

[0019] Os artigos um e uma são usados no presente documento para se referirem a um ou a mais que um (isto é, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, um elemento pode significar um elemento ou mais de um elemento.

[0020] A presente revelação se refere aos polipeptídeos variantes que têm atividade lipolítica. Os polipeptídeos variantes de acordo com a revelação têm pelo menos uma propriedade alterada em comparação com um polipeptideo de referência que tem atividade lipolítica. Em um aspecto do polipeptideo variante, o polipeptideo de referência compreende a enzima lipolítica madura como estabelecido em

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SEQ ID NO: 2. Em um aspecto adicional do polipeptideo variante, o polipeptideo de referência é a enzima lipolitica madura como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

[0021] 0 variante tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2. Em um aspecto do polipeptideo variante, o polipeptideo maduro compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2. Em um aspecto adicional do polipeptideo variante, o polipeptideo maduro tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0022] 0 polipeptideo de referência também pode ser chamado no presente documento de um polipeptideo parental ou polipeptideo de comparação.

[0023] Um polipeptideo variante de acordo com a revelação pode ser um polipeptideo isolado, substancialmente puro, puro, recombinante ou sintético.

[0024] Em uma modalidade, o polipeptideo variante de acordo com a revelação é um polipeptideo de ocorrência não natural.

[0025] No presente documento, as posições que podem ser substituida para alcançar um variante da revelação são definidas com referência a SEQ ID NO: 2. 0 variante tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um residue de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, em que as posições são definidas com referência a SEQ ID

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NO: 2 .

[0026] De modo mais concreto, a revelação se refere a um polipeptídeo variante que tem atividade lipolitica, em que o variante tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2, e em que o dito variante tem pelo menos 7 0 % de identidade com o polipeptídeo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

[0027] Em uma modalidade o polipeptídeo maduro compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade o polipeptídeo de referência que tem atividade lipolitica compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade do polipeptídeo variante de acordo com a revelação, o polipeptídeo de referência compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2 e o polipeptídeo maduro compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0028] Em uma modalidade adicional, tal variante tem uma ou mais propriedades alteradas como comparado ao polipeptídeo de referência que tem atividade lipolitica como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2

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9/133 medida sob as mesmas condições, e o dito variante tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0029] Em uma modalidade, o polipeptideo variante de acordo com a revelação tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2, e em que o variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação com um polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica e em que o dito variante tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2. [0030] Em uma modalidade, o polipeptideo variante de acordo com a revelação tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2, e em que o variante tem uma razão alterada da atividade em lipídeos polares: atividade em lipídeos não polares em comparação com um polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica e em que o dito variante tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem

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10/133 atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

[0031] Em uma modalidade, o polipeptideo variante de acordo com a revelação tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um residue de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2, em que o variante tem uma razão aumentada da atividade em lipideos polares: atividade em lipideos não polares como comparado ao polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica medida sob as mesmas condições, e em que o dito variante tem pelo menos 7 0 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

[0032] Em uma modalidade o polipeptideo maduro compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade o polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade do polipeptideo variante de acordo com a revelação, o polipeptideo de referência compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2 e o polipeptideo maduro compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0033] Em uma modalidade adicional, tal variante tem uma ou mais propriedades alteradas como comparado ao

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11/133 polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2 medida sob as mesmas condições, e o dito variante tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0034] Em uma modalidade, o polipeptideo variante de acordo com a revelação tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2, o variante tem uma razão aumentada da atividade em lipídeos polares: atividade em lipídeos não polares como comparado ao polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2 medida sob as mesmas condições, e o dito variante tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0035] Em um aspecto, o variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação, é um variante de enzima lipolitica que tem pelo menos 70 % de identidade, em um aspecto pelo menos 75 % de identidade, em um aspecto pelo menos 80 % de identidade, em um aspecto pelo menos 85 % de identidade, em um aspecto pelo menos 90 % de identidade, em um aspecto pelo menos 95 % de identidade, em um aspecto pelo menos 96 % de identidade, em um aspecto pelo menos 97 % de

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12/133 identidade, em um aspecto pelo menos 98 % de identidade, em um aspecto pelo menos 99 % de identidade, com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. [0036] Em um aspecto, o variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação, é um variante de enzima lipolitica que tem pelo menos 70 % de identidade, em um aspecto pelo menos 75 % de identidade, em um aspecto pelo menos 80 % de identidade, em um aspecto pelo menos 85 % de identidade, em um aspecto pelo menos 90 % de identidade, em um aspecto pelo menos 95 % de identidade, em um aspecto pelo menos 96 % de identidade, em um aspecto pelo menos 97 % de identidade, em um aspecto pelo menos 98 % de identidade, em um aspecto pelo menos 99 % de identidade, com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0037] 0 variante de enzima lipolitica da revelação pode compreender uma ou mais substituições nas posições reveladas no presente documento. 0 variante de enzima lipolitica da revelação pode, por exemplo, compreender duas, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20 das posições reveladas.

[0038] 0 variante de enzima lipolitica da revelação pode compreender uma ou mais substituições adicionais não reveladas no presente documento desde que o variante tenha uma ou mais propriedades alteradas, como descrito no presente documento, em comparação com um polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica. As uma ou mais substituições adicionais podem ser selecionadas a partir de

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13/133 qualquer uma das posições 53, 112, 113, 117, 122, 124, 138, 141, 178, 179, 182, 200, 202, 203, 229, 238, 282, 284, 286, 295, em que as posições são definidas com referência a SEQ ID NO: 2. As substituições adicionais preferidas são listadas abaixo e na Tabela 1 (com as posições que são definidas em relação à sequência estabelecida em SEQ ID NO: 2). Um variante da revelação pode ser gerado usando qualquer combinação de substituições listadas na reivindicação 1 e abaixo ou na Tabela 1.

[0039] Uma substituição nesse contexto indica que uma posição no variante que corresponde a uma das posições estabelecidas acima em SEQ ID NO: 2 compreende um residue de aminoácido que não aparece naquela posição no polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica [0040] As alterações de aminoácido são descritas de acordo com a anotação de única letra.

[0041] A revelação fornece um polipeptideo variante de acordo com a revelação, em que o polipeptideo de referência compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2 e em que o polipeptideo maduro compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0042] Em uma modalidade o polipeptideo maduro tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade o polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

Polipeptideo maduro [0043] 0 variante de enzima lipolitica como a revelação

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14/133 é um polipeptídeo maduro.

[0044] Um polipeptídeo maduro é definido no presente documento como um polipeptídeo em sua forma final e é obtido após a tradução de um mRNA em polipeptídeo e modificações pós-translacionais do dito polipeptídeo. A modificação pós-translacional inclui processamento de terminal N, truncamento de terminal C, glicosilação, fosforilação e remoção de sequência líder, como peptídeos de sinal, propriedades e/ou pré-propriedades por divagem. 0 processo de maturação pode depender do vetor de expressão particular usado, do hospedeiro de expressão e do processo de produção. De preferência, o polipeptídeo maduro que tem atividade lipolítica na sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2 é o polipeptídeo como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0045] Uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro (com referência a sua sequência de aminoácidos).

[0046] Uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo maduro é definida no presente documento como a sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo maduro.

[0047] Como é conhecido à pessoa versada na técnica, é possível que a terminação N de um polipeptídeo maduro deve ser heterogênea devido aos erros de processamento durante a secreção e/ou maturação. Como é conhecido à pessoa versada na técnica, é possível que a terminação C de um polipeptídeo maduro deve ser heterogênea devido aos erros de processamento durante a secreção e/ou maturação. Em

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15/133 particular, tais erros de processamento devem ocorrer mediante a superexpressão do polipeptideo. Além disso, atividade de exo-protease deve dar origem a heterogeneidade. A extensão em que a heterogeneidade ocorre depende também do hospedeiro e dos protocolos de fermentação que são usados. Tais artefatos de processamento de terminal C devem levar a um polipeptideo maduro mais longo ou mais curto. Os erros de processamento durante a secreção e/ou a maturação também podem levar a uma terminação N heterogênea.

[0048] Em uma modalidade, o variante de enzima lipolitica contém um ou mais resíduos adicionais e começa na posição -1, ou -2, ou -3 etc. em que a dita posição é definida com referência à posição 34 de SEQ ID NO: 2. Em tal caso, a terminação N começa na posição 33, ou 32, ou 31 etc.

[0049] Alternativamente, pode faltar certos resíduos e, como uma consequência, pode começar na posição 2, ou 3, ou 4 etc. em que a dita posição é definida com referência à posição 34 de SEQ ID NO: 2. Em tal caso, a terminação N começa na posição 35, ou 36, ou 37 etc.

[0050] Além disso, os resíduos adicionais também podem estar presentes na terminação C, por exemplo, a terminação C termina na posição 305, 306 etc. Alternativamente, a

terminação C	pode	carecer	de	certos resíduos	e, como uma
consequência,	pode	; terminar	na	posição 303, ou	302 etc.
[0051] Em	um	aspecto,	a	enzima madura	compreende o
polipeptideo	como	estabelecido em aminoácidos	34 a 30 3 de
SEQ ID NO: 2.
[0052] Em	um	aspecto,	a	enzima madura	compreende o

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polipeptídeo	como	estabelecido	em aminoácidos 31 a 304	de
SEQ ID NO: 2.
[0053] Em	um	aspecto, a enzima madura compreende	o
polipeptídeo	como	estabelecido	em aminoácidos 31 a 303	de

SEQ ID NO: 2.

[0054] Em	um	aspecto,	a enzima	madura	compreende	o
polipeptídeo	como	estabelecido em aminoácidos	34 a 307	de
SEQ ID NO: 2.
[0055] Em	um	aspecto,	a enzima	madura	compreende	o
polipeptídeo	como	estabelecido em aminoácidos	34 a 302	de

SEQ ID NO: 2.

[0056] Em	um aspecto, a enzima madura compreende	o
polipeptídeo SEQ ID NO: 2	como estabelecido em aminoácidos 31 a 307	de
[0057] Em	uma modalidade, o polipeptídeo variante	de
acordo com .	a revelação, o variante tem uma sequência	de
aminoácidos	que, quando alinhada com a sequência	de
aminoácidos	como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende
uma ou mais partir de	das substituições de aminoácido selecionadas	a

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F141M

F141Y

V179L

V17 9M

V179S

L282E

L282F

L282K

L282M

L282N

L282R

L282S

L282T

I284A

I284D

I284E

I284M

I284N

I284P

I284Q

I284S

I284T

A2 8 6L

D295E

D295G

D295N

D295S

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18/133 as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2, e em que o dito variante tem pelo menos 7 0 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade adicional, tal variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação com um polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica. Em uma modalidade adicional, tal variante tem uma ou mais propriedades alteradas como comparado ao polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2 medida sob as mesmas condições, e o dito variante tem pelo menos 7 0 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como

estabelecido	em aminoácidos 34 a	304 de SEQ	ID	NO: 2 .
[0058] Em	uma modalidade o	polipeptideo	variante de
acordo com a	revelação tem uma	sequência	de	aminoácidos

que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende uma ou mais das substituições de aminoácido selecionadas a partir das substituições listadas acima, tem uma razão alterada da atividade em lipideos polares: atividade em lipideos não polares em comparação com um polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica e em que o dito variante tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

[0059] Em uma modalidade, o polipeptideo variante de acordo com a revelação tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende uma ou mais das substituições de aminoácido selecionadas a partir de

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I113H

I113L

I113N

I113R

I113T

L122A

L122M

H138E

H138S

F141M

F141Y

V179L

V17 9M

V179S

L282E

L282F

L282K

L282M

L282N

L282R

L282S

L282T

I284A

I284D

I284E

I284M

I284N

I284P

I284Q

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as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2, e em que o dito variante tem pelo menos 7 0 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolítica como estabelecido em SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade adicional, o variante tem uma ou mais propriedades alteradas (de preferência, tem uma razão aumentada da atividade em lipídeos polares: atividade em lipídeos não polares) em comparação com um polipeptideo de referência que tem atividade lipolítica. Em uma modalidade adicional, tal variante tem uma razão aumentada da atividade em lipídeos polares: atividade em lipídeos não polares como comparado ao polipeptideo de referência que tem atividade lipolítica como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2 medida sob as mesmas condições, e o dito variante tem pelo menos 7 0 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolítica como

estabelecido	em aminoácidos 34 a	304 de SEQ	ID	NO: 2 .
[0060] Em	uma modalidade o	polipeptideo	variante de
acordo com a	revelação tem uma	sequência	de	aminoácidos

que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende uma ou mais das substituições de aminoácido selecionadas a partir das

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21/133 substituições listadas acima, tem uma razão alterada da atividade em lipideos polares: atividade em lipideos não polares em comparação com um polipeptideo de referência que tem atividade lipolítica e em que o dito variante tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolítica como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

Polipeptideo variante que tem atividade lipolítica [0061] Uma enzima lipolítica demonstra atividade lipolítica, isto é, tem capacidade para catalisar a hidrólise de ligações de éster em lipideos, como triglicerídeos e/ou galactolipídeos e/ou fosfolipídeos. Em particular, variantes de enzima lipolítica de acordo com a revelação demonstram atividade lipolítica em lipideos presentes na farinha. A farinha inclui farinha de cereal, farinha de milho, farinha de arroz. No presente documento, a farinha inclui farinha integral de trigo.

[0062] A farinha de trigo contém aproximadamente 2-3 % de lipideos. Os lipideos de farinha podem ser divididos em lipideos de amido (0,8 - 1 %) e lipideos de não amido (1,4 - 2,0 %) . Enquanto os lipideos de amido consistem principalmente em lisofosfolipídeos polares, os lipideos de não amido consistem em cerca de 40 % de triglicerídeos neutros e 40 % fosfo- e glicolipídeos polares. Para otimização da fração de lipideos de farinha, o variante de polipeptideo lipolítico de acordo com a revelação tem, em um aspecto, capacidade de hidrólise dos lipideos polares, que são os fosfolipídeos e glicolipídeos (mais especificamente, os galactolipídeos) in situ na massa pela adição do variante de enzima lipolítica de acordo com a revelação.

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22/133 [0063] A atividade lipolitica dos variantes de enzima lipolitica de acordo com a revelação pode ser determinada por qualquer método adequado, por exemplo, por ensaios conhecidos na técnica ou descritos posteriormente no presente documento. Um polipeptideo variante que tem atividade lipolitica e variante de polipeptideo lipolitico, um variante de enzima lipolitica e um polipeptideo variante são usados intercambiavelmente no presente documento. Um polipeptideo que tem atividade lipolitica, um polipeptideo lipolitico e uma enzima lipolitica são usados intercambiavelmente no presente documento. Os variantes descritos no presente documento são coletivamente compreendidos nos termos um variante de polipeptideo lipolitico de acordo com a revelação ou um variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação ou um polipeptideo variante de acordo com a revelação.

[0064] Um triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3) demonstra atividade hidrolitica catalítica em uma ou mais ligações de éster em triglicerídeos (também conhecidos como triacilglicerol ou triacilglicerídeos). As expressões atividade em triacilgliceróis (TAG) e atividade de TAGlipase são usadas intercambiavelmente no presente documento. As expressões triglicerídeos e triacilglicerídeos e triacilgliceróis são usadas intercambiavelmente no presente documento [0065] Em geral, triglicerídeos e triglicerídeo são usados intercambiavelmente no presente documento: ambos se referem à classe de composto.

[0066] Uma galactolipase demonstra atividade de galactolipase (EC 3.1.1.26). A atividade de galactolipase é

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23/133 a atividade hidrolitica catalítica em uma ou mais ligações nos galactolipídeos. As expressões atividade de galactolipase e atividade em galactolipídeos são usadas intercambiavelmente no presente documento.

[0067] Galactolipídeos consistem em uma cadeia principal de glicerol com ácido graxo esterifiçado, enquanto o terceiro grupo hidroxila é ligado aos resíduos de açúcar, como no caso de galactolipídeos, uma galactose, por exemplo, monogalactosildiglicerídeo ou digalactosildiglicerídeo. Em geral, galactolipídeos e galactolipídeo são usados intercambiavelmente no presente documento: ambos se referem à classe de composto. No trigo, galactolipídeos estão principalmente presentes como diacilgalactolipídeos. Em um aspecto da revelação, os galactolipídeos são DGDG (digalactosildiglicerídeos) ou MGDG (monogalactosildiglicerídeos) .

[0068] Uma fosfolipase demonstra atividade de fosfolipase. A atividade de fosfolipase é uma atividade hidrolitica catalítica em uma ou mais ligações nos fosfolipídeos. As expressões atividade de fosfolipase e atividade em fosfolipídeos são usadas intercambiavelmente no presente documento. Fosfolipídeos consistem em uma cadeia principal de glicerol com ácido graxo esterifiçado, enquanto o terceiro grupo hidroxila do glicerol é esterificado com ácido fosfórico. 0 ácido fosfórico pode, por sua vez, ser esterificado para, por exemplo, um amino álcool similar à etanolamina (fosfatidiletanolamina), colina (fosfatidilcolina) . Podem ser distinguidos vários tipos de atividade de fosfolipase que hidrolisam a ligação (ou ligações) de éster que ligam as frações graxas de acila

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24/133 à cadeia principal de glicerol:

- A atividade de fosfolipase Al e A2 se refere à desacilação de um grupo acila graxo nas posições sn-1 externo e sn-2 intermediário respectivamente, a partir de um diacilglicerofosfolipideo para produzir um lisofosfolipideo. Isso é uma atividade desejável para substituição de emulsificante. Fosfolipase Al tem número EC 3.1.1.32 e fosfolipase A2 EC 3.1.1.4.

- A atividade de lisofosfolipase (também chamada de atividade de fosfolipase B) se refere à hidrólise do grupo acil graxo restante em um lisofosfolipideo. Para a substituição de emulsificante, a atividade de lisofosfolipase é usualmente menos desejável. A lisofosfolipase tem número EC 3.1.1.5.

[0069] Em geral, fosfolipideos e fosfolipideo são usados intercambiavelmente no presente documento: ambos se referem à classe de composto. Em um aspecto da revelação, os fosfolipideos são fosfatidilcolinas (PC).

[0070] As enzimas lipoliticas são usualmente classificadas de acordo com as ligações que as mesmas preferencialmente se dividem, mas podem mostrar alguma atividade além da maioria de seus substratos preferidos. Por exemplo, uma fosfolipase PLA1 pode mostrar maior atividade em relação à divagem de cadeias acila a partir da posição snl da cadeia principal de glicerol de um fosfolipideo, mas alguma atividade em hidrólise em TAG, galactolipideos e sn2 também pode ocorrer.

[0071] As expressões razão da atividade em galactolipideos: da atividade em triacilgliceróis e razão de atividade de galactolipase: atividade de TAG-lipase e

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25/133 razão entre galactolipase e atividade de TAG-lipase e razão da atividade de galactolipase: da atividade de TAGlipase são usadas intercambiavelmente no presente documento.

[0072] As expressões razão da atividade em fosfolipideos: da atividade em triacilgliceróis e razão de atividade de fosfolipase: atividade de TAG-lipase e razão entre a atividade de fosfolipase e a atividade de TAG-lipase e razão da atividade de fosfolipase: da atividade de TAG-lipase são usadas intercambiavelmente no presente documento.

[0073] Os lipideos polares incluem no presente documento fosfolipideos e galactolipideos.

[0074] Os lipideos não polares incluem no presente documento triglicerideos e/ou diglicerideos. 0 lipideo não polar pode ser trioleina.

[0075] No presente documento, os ésteres de ácidos graxos de cadeia longa são ésteres de C12-C18 ácidos graxos, por exemplo, ésteres de C16-C18 ácidos graxos, por exemplo, ésteres de C18 ácidos graxos, por exemplo, ésteres de C18:2 ácidos graxos.

[0076] No presente documento, os ésteres de ácidos graxos de cadeia curta são ésteres de C4-C8 ácidos graxos, por exemplo, ésteres de C4-C6 ácidos graxos, por exemplo, ésteres de C4 ácidos graxos.

[0077] Os ésteres do ácido graxo de cadeia curta podem ser pNP-butirato.

[0078] Os ésteres do ácido graxo de cadeia longa podem ser pNP-lineolato, pNP-oleato, pNP-estearato ou pNPpalmitato.

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26/133 [0079] Os ésteres do ácido graxo de cadeia não saturada podem ser pNP-lineolato ou pNP-oleato.

[0080] Os ésteres do ácido graxo de cadeia saturada podem ser pNP-estearato ou pNP-palmitato.

Propriedade Alterada/Aprimorada [0081] Um polipeptideo variante de acordo com a revelação terá tipicamente uma propriedade alterada como comparado a um polipeptideo de referência. Em particular, o polipeptideo variante terá uma propriedade aprimorada como comparado a um polipeptideo de referência que é relevante para o uso do polipeptideo variante na indústria alimentícia, de preferência, na preparação de uma massa e/ou um produto assado.

[0082] A propriedade alterada, tipicamente aprimorada, pode ser demonstrada pela fabricação de uma massa e/ou produto assado que compreende o variante de enzima lipolitica da revelação e um outro que compreende um polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica sob as mesmas condições e pela comparação dos resultados. A propriedade aprimorada pode ser demonstrada com os métodos e ensaios descritos no presente documento. As qualidades organolépticas podem ser avaliadas usando procedimentos bem estabelecidos na indústria de assados e, podem incluir, por exemplo, o uso de um painel de testadores de aromatizante treinados.

[0083] A propriedade alterada, tipicamente aprimorada, pode ser demonstrada em um ensaio ou uma análise (bio)química.

[0084] Um polipeptideo variante que exibe uma propriedade que é aprimorada em relação ao polipeptideo de

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27/133 referência que tem atividade lipolítica é um que demonstra uma redução mensurável ou aumento na propriedade relevante, tipicamente de modo que o variante seja mais adequado ao uso como estabelecido no presente documento, por exemplo, em um processo para a produção de um produto assado.

[0085] A propriedade pode, então, ser diminuída em pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 % pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 %. Alternativamente, a propriedade pode ser aumentada em pelo menos 10 %, pelo menos 25 %, pelo menos 50 %, pelo menos 100 %, pelo menos, 200 %, pelo menos 500 % ou pelo menos 1000 %. A diminuição ou aumento de percentual nesse contexto representa a diminuição ou o aumento de percentual em comparação ao polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica. É bem conhecido pela pessoa versada como tais alterações de percentual podem ser medidas - é uma comparação da propriedade do polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica e do variante de enzima lipolítica sob as mesmas condições.

[0086] O variante de enzima lipolítica de acordo com a revelação, a composição de acordo com a revelação e/ou a pré-mistura de acordo com a revelação tipicamente resultam em uma propriedade aprimorada na produção de um produto alimentício ou em uma propriedade aprimorada do próprio produto alimentício. Em particular, uma propriedade aprimorada de uma massa que compreende o polipeptídeo variante de acordo com a revelação e/ou uma propriedade aprimorada de um produto assado feito usando o polipeptídeo variante de acordo com a revelação.

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28/133 [0087] O termo propriedade aprimorada no presente documento inclui qualquer propriedade de uma massa e/ou um produto obtido a partir da massa, particularmente, um produto assado, que é aprimorado pela ação do variante de enzima lipolitica, a composição de acordo com a revelação ou a pré-mistura de acordo com a revelação relativa a uma massa ou produto assado em que um polipeptideo de referência é incorporado.

[0088] A propriedade aprimorada pode incluir um ou mais dentre, porém sem limitação, uma resistência aumentada da massa; uma elasticidade aumentada da massa; estabilidade aumentada da massa; uma extensibilidade aprimorada da massa; um volume aumentado do produto assado; aromatizante aprimorado do produto assado; estrutura aprimorada do miolo da crocância aprimorada do produto assado; salto de forno aprimorado; dureza reduzida de um produto assado, como dureza reduzida após armazenamento.

[0089] A propriedade aprimorada pode incluir uma propriedade reduzida de dureza após armazenamento de um produto assado.

[0090] A propriedade aprimorada pode ser determinada pela comparação de uma massa e/ou um produto assado preparado com e sem adição do polipeptideo (isolado) da presente revelação de acordo com os métodos de presente revelação que são descritos abaixo nos Exemplos. As qualidades organolépticas podem ser avaliadas usando procedimentos bem estabelecidos na indústria de assados e, podem incluir, por exemplo, o uso de um painel de testadores treinados, por exemplo, testadores de aromatizante, testadores de textura.

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29/133 [0091] O termo resistência aumentada da massa é definido no presente documento como a propriedade de uma massa que tem geralmente propriedades mais elásticas e/ou exige mais força de trabalho para modular e conformar.

[0092] 0 termo elasticidade aumentada da massa é definido no presente documento como a propriedade de uma massa que tem uma tendência maior de recuperar seu formato original após ser submetida a uma certa tensão fisica.

[0093] 0 termo estabilidade aumentada da massa é definido no presente documento como a propriedade de uma massa que é menos suscetivel a falhas de formação como uma consequência de abuso mecânico e, então, melhor na manutenção de seu formato e volume e é avaliada pela razão de altura: comprimento de uma seção transversal de um pão de forma após sova normal e/ou estendida.

[0094] 0 termo extensibilidade aprimorada da massa é definido no presente documento como a propriedade de uma massa que pode ser submetida a tensão aumentada ou alongamento sem ruptura.

[0095] Uma estabilidade de massa aprimorada pode ser uma resistência a choque aprimorada de uma massa. A resistência a choque aprimorada de uma massa pode ser demonstrada da seguinte forma.

[0096] As formas de pão preenchidas com massa bem sovada (volume vazio de > 70 %) sofrem choques ou impactos controlados, por exemplo, pela queda de uma forma da altura definida, por exemplo, 9 cm de altura, alo antes de entrar no forno para ser assada. Isso pode ser feito pelo puxamento simultâneo de 2 blocos que têm essa altura de queda a partir de baixo do fundo da forma. Dessa maneira, a

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30/133 forma cai da altura de queda e a massa passa por um choque. A resistência a choque de uma massa é aprimorada se, após a assadura da massa, o volume do pão de forma for maior como comparado a um pão de forma de referência (que também pode ser chamado de um pão de forma de controle) e/ou se a dureza do pão de forma após a assadura da massa for menor como comparado a um pão de forma de referência (que também pode ser chamado de um controle).

[0097] 0 termo volume aumentado do produto assado é, de preferência, medido como o volume de um pão de forma determinado por um analisador de volume de pão automático (por exemplo, BVM-3, TexVol Instruments AB, Viken, Sweden), usando detecção a laser ou ultrassônica como conhecido na técnica. No caso de o volume ser aumentado, a propriedade é aprimorada. Alternativamente, a altura do produto assado após a assadura no mesmo tamanho de forma é uma indicação do volume de produto assado. No caso de a altura do produto assado ter diminuído, o volume do produto assado aumentou.

[0098] 0 termo aromatizante aprimorado do produto assado é avaliado por um painel de teste treinado.

[0099] 0 termo estrutura aprimorada do miolo do produto

assado	no presente	documento inclui	a propriedade	de um
produto	assado com	paredes celulares	mais delicadas	e/ou
mais	finas no	miolo e/ou	distribuição	mais
uniforme/homogênea	de células de	gás no miolo	e é

usualmente avaliada visualmente pelo padeiro ou por análise de imagem digital como conhecido na técnica (por exemplo, C-cell, Calibre Control International Ltd, Appleton, Warrington, Reino Unido).

[0100] 0 termo crocância aprimorada é definido no

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31/133 presente documento como a propriedade que um produto assado tem de gerar uma sensação mais crocante que um produto de referência como conhecido na técnica, bem como de manter essa percepção mais crocante por um tempo maior que um produto de referência. Essa propriedade pode ser quantificada pela medição de uma força versus curva de distância em uma velocidade fixa em um experimento de compressão usando, por exemplo, um analisador de textura TA-XT Plus (Stable Micro Systems Ltd, Surrey, Reino Unido), e obtenção de parâmetros físicos a partir dessa curva de compressão, viz. (i) força do primeiro pico, (ii) distância do primeiro pico, (iii) a inclinação inicial, (iv) a força do pico mais alto, (v) a área sob o gráfico e (vi) a quantidade de ocorrências de fratura (quedas de força menores que um certo valor pré-definido). As indicações de crocância aprimorada são uma força maior do primeiro pico, uma distância menor do primeiro pico, uma inclinação inicial maior, uma força maior do pico mais alto, área maior sob o gráfico e um número maior de ocorrências de fratura. Um produto mais crocante deve se comportar estatística e significativamente melhor em pelo menos dois desses parâmetros como comparado a um produto de referência. Na técnica, crocância também é chamada de consistência crocante, consistência estaladiça ou consistência com crosta, que significa um material com um comportamento de quebra crocante, estaladiço ou com crosta. [0101] Salto de forno é, na fabricação de pão, definido como a ruptura de crescimento final de um pão de forma, como uma baguette, um batard ou uma bola (boule) , após o mesmo ser transferido para o forno e antes da crosta

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32/133 endurecer. Em alguns tipos de pão, o salto de forno é uma propriedade desejada e é induzido de uma maneira definida pelo corte da massa antes de ser assada. 0 corte é um termo que se refere ao processo de incisão através da pele de massa com uma faca afiada. As baguettes são tipicamente feitas com 3 ou 5 cortes diagonais. 0 salto de forno pode ser avaliado visualmente, por exemplo, por um padeiro experiente que julga ou classifica o salto de forno. Por exemplo, Salto de forno: 1 = incisão completamente fechada a 5 = incisão completamente aberta; rasgado. 0 salto de forno do produto assado pode ser determinado pela medição da abertura de crosta no comprimento mais amplo da abertura de crosta após a assadura da massa e pelo resfriamento do produto assado à temperatura ambiente. Um salto de forno aumentado é usualmente considerado um salto de forno aprimorado. Para alguns produtos assados, um salto de forno que tem uma borda mais rígida, irregular ou sensível é desejável e considerado um salto de forno aprimorado.

[0102] 0 termo dureza do produto assado é o oposto de maciez e é definido no presente documento como a propriedade de um produto assado que é menos facilmente comprimido. Dureza (que também pode ser chamado de firmeza) pode ser avaliada empiricamente por um padeiro versado ou medida pelo uso de um analisador de textura (por exemplo, TAXT Plus) como conhecido na técnica. A dureza medida em 24 horas após a assadura é chamada de dureza inicial. A dureza medida 24 horas ou mais após a assadura é chamada de dureza após armazenamento, por exemplo, após armazenamento por 1, 2, 3, 4 ou 6 semanas. Uma dureza reduzida pode ser demonstrada como uma dureza inicial

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33/133 reduzida e/ou como uma dureza reduzida após armazenamento. Uma dureza reduzida pode ser demonstrada por um aumento reduzido de dureza após armazenamento.

[0103] 0 variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação, a composição de acordo com a revelação e/ou a pré-mistura de acordo com a revelação podem resultar em um processo aprimorado para a produção uma massa (por exemplo, uma resistência aumentada da massa; uma estabilidade aumentada da massa e/ou uma extensibilidade aprimorada da massa) e/ou um processo aprimorado para a produção de um produto assado (por exemplo, uma resistência aumentada da massa; uma estabilidade aumentada da massa e/ou uma extensibilidade aprimorada da massa) e/ou um produto assado que tem pelo menos uma propriedade aprimorada.

[0104] Tip icamente, as propriedades alteradas são determinadas em condições ambiente. As condições ambiente como usado no presente documento incluem uma temperatura de 20 a 25 graus Celsius e um nível de umidificação de 40 % de umidade. As condições ambiente no presente documento incluem uma temperatura de 20 graus Celsius e um nível de umidificação de 40 % de umidade.

[0105] 0 variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação com um polipeptídeo de referência que tem atividade lipolitica e em que o dito variante tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptídeo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

[0106] Como indicado acima, a propriedade alterada, tipicamente aprimorada, pode ser demonstrada em um ensaio ou análise (bio)química. Acredita-se que um ensaio

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34/133 realizado com pH 7 ou 8 seja mais adequado para obter informações referentes à preparação de produtos assados de natureza mais alcalina, como bolo. Acredita-se que um ensaio realizado com pH 5,5 seja mais adequado para obter informações referentes à preparação de produtos assados de natureza mais ácida, como pão.

[0107] A propriedade alterada pode incluir uma razão aumentada da atividade em lipideos polares: atividade em lipideos não polares em comparação com o polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica medida sob as mesmas condições.

Razão da atividade em lipideos polares: da atividade lipideos não polares [0108] Em uma modalidade do polipeptídeo variante de acordo com a revelação, a propriedade alterada inclui uma razão aumentada da atividade em lipideos polares: atividade em lipideos não polares em comparação com o polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica medida sob as mesmas condições.

[0109] A revelação fornece variantes de enzima lipolítica que têm uma razão aumentada da atividade em lipideos polares: atividade em lipideos não polares em comparação com o polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica medida sob as mesmas condições.

[0110] Em uma modalidade o polipeptídeo variante de acordo com a revelação tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141,

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179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2, e em que o variante tem uma razão aumentada da atividade em lipideos polares: da atividade em lipideos não polares como comparado a um polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica medida sob as mesmas condições e em que o dito variante tem pelo menos 7 0 % de identidade com uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0111] Em uma modalidade do polipeptideo variante de acordo com a revelação, o polipeptideo de referência compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2 e o polipeptideo maduro compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0112] Em uma modalidade o polipeptideo variante de acordo com a revelação, o variante tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende uma ou mais das substituições de aminoácido selecionadas a partir de

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H138S

F141M

F141Y

V179L

V17 9M

V179S

L282E

L282F

L282K

L282M

L282N

L282R

L282S

L282T

I284A

I284D

I284E

I284M

I284N

I284P

I284Q

I284S

I284T

A2 8 6L

D295E

D295G

D295N

D295S

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37/133 em que a dita posição é definida com referência a SEQ ID NO: 2 e em que o variante tem uma razão aumentada da atividade em lipideos polares: da atividade em lipideos não polares como comparado a um polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica medida sob as mesmas condições e em que o dito variante tem pelo menos 7 0 % de identidade com uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0113] A determinação da atividade em lipideos polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 5,5 como Ensaio 2A, usando DGDG como substrato.

[0114] A determinação da atividade em lipideos polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 7 como análogo ao Ensaio 2A, usando DGDG como substrato e com uso de um tampão de pH 7.

[0115] A determinação da atividade em lipideos polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 8 como Ensaio 2B, usando DGDG como substrato.

[0116] A determinação da atividade em lipideos polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 5,5 como análogo ao Ensaio 2A, usando MGDG como substrato.

[0117] A determinação da atividade em lipideos polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 7 como análogo ao Ensaio 2A, usando MGDG como substrato e com uso de um tampão de pH 7.

[0118] A determinação da atividade em lipideos polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios

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38/133 adequados com pH 8 como análogo ao Ensaio 2B, usando MGDG como substrato.

[0119] A determinação da atividade em lipideos polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 5,5 como Ensaio IA, usando PC como substrato.

[0120] A determinação da atividade em lipideos polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 7 como análogo ao Ensaio IA, usando PC como substrato e com uso de um tampão de pH 7.

[0121] A determinação da atividade em lipideos polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 8 como Ensaio 1B, usando PC como substrato.

[0122] A determinação da atividade em lipideos não polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 5,5 como Ensaio 3A, usando

Trioleina como substrato.

[0123] A determinação da atividade em lipideos não polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 7 como análogo ao Ensaio 3A, usando Trioleina como substrato e com uso de um tampão de pH 7 .

[0124] A determinação da atividade em lipideos não polares pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 8 como análogo ao Ensaio 3B, usando Trioleina como substrato.

[0125] A razão da atividade em lipideos polares: da atividade lipideos não polares pode ser determinada através da medição das atividades particulares usando ensaios

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39/133 adequados como descrito no presente documento e pelo cálculo da razão análoga a Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n° nos Materiais e Métodos no presente documento.

[0126] Por exemplo, a razão da atividade em lipideos polares: da atividade lipideos não polares com pH 5,5 pode ser determinada pela aplicação de ensaios adequados com pH 5, 5 como descrito no presente documento (por exemplo, aplicando o Ensaio 2A, Ensaio 3A) e pelo cálculo da razão de acordo com Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAGlipase de variante n° nos Materiais e Métodos no presente documento.

[0127] Alternativamente, a razão da atividade em lipideos polares: da atividade lipideos não polares com pH 5, 5 pode ser determinada pela aplicação de ensaios adequados com pH 5,5 como descrito no presente documento (por exemplo, aplicando o Ensaio IA, Ensaio 3A) e pelo cálculo da razão análoga a Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n° nos Materiais e Métodos no presente documento.

[0128] Mais exemplos para determinar a razão da atividade em lipideos polares: da atividade em lipideos não polares são dados na Seção de Exemplo no presente documento. Consulte Determinação de propriedades alteradas e Tabelas 2 a 5 posteriormente.

Galactolipídeos, razão da atividade em galactolipídeos: da atividade em triglicerídeos.

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40/133 [0129] Em um aspecto da revelação, a razão aumentada da atividade em lipideos polares: da atividade em lipideos não polares como comparado ao polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica medida sob as mesmas condições é uma razão aumentada da atividade em galactolipídeos: da atividade em triglicerídeos como comparado ao polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) medida sob as mesmas condições.

[0130] A razão da atividade em galactolipídeos: da atividade em triglicerídeos é determinada em um certo pH, como pH 5,5 ou pH 7 ou pH 8.

[0131] Em um aspecto da revelação, a razão aumentada da atividade em galactolipídeos: da atividade em triglicerídeos é determinada com pH 5,5.

[0132] Em um aspecto da revelação, a razão aumentada da atividade em galactolipídeos: da atividade em triglicerídeos é determinada com pH 8.

[0133] A determinação da razão da atividade em galactolipídeos: da atividade em triglicerídeos pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados como descrito cima, por exemplo, para pH 5,5, por

- Medição da atividade em lipideos polares usando DGDG como substrato (Ensaio 2A);

- Medição da atividade em lipideos não polares usando Trioleína como substrato (Ensaio 3A);

- e cálculo da razão (consulte Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n° nos Materiais e Métodos no presente documento).

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41/133 [0134] A determinação da razão da atividade em galactolipídeos: da atividade em triglicerídeos pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 8 como Ensaios 2B e 3B como descrito no presente documento e pelo cálculo da razão (consulte Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n° nos Materiais e Métodos no presente documento).

[0135] Em um aspecto da revelação, a razão aumentada da atividade em galactolipídeos: da atividade em triglicerídeos é uma razão aumentada da atividade em DGDG: da atividade em Trioleína.

[0136] Em um aspecto da revelação, a razão da atividade em DGDG: da atividade em Trioleína é determinada com pH 5,5. (Por exemplo, Ensaios 2A e 3A e pelo cálculo da razão como descrito no presente documento) [0137] Em um aspecto da revelação, a razão da atividade em DGDG: da atividade em Trioleína é determinada com pH 8. (Por exemplo, Ensaios 2B e 3B e pelo cálculo da razão como descrito no presente documento)

Fosfolipídeos, razão da atividade em fosfolipídeos: da atividade em triglicerídeos [0138] Em um aspecto da revelação, a razão aumentada da atividade em lipídeos polares: da atividade em lipídeos não polares como comparado ao polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2) medida sob as mesmas condições é uma razão aumentada da atividade em fosfolipídeos: da atividade em triglicerídeos como comparado ao polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica (como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2)

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42/133 medida sob as mesmas condições.

[0139] A razão da atividade em fosfolipideos: da atividade em triglicerideos é determinada em um certo pH, como pH 5,5 ou pH 7 ou pH 8.

[0140] Em um aspecto da revelação, a razão aumentada da atividade em fosfolipideos: da atividade em triglicerideos é determinada com pH 5,5.

[0141] Em um aspecto da revelação, a razão aumentada da atividade em fosfolipideos: da atividade em triglicerideos é determinada com pH 8.

[0142] A determinação da razão da atividade em fosfolipideos: da atividade em triglicerideos pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados como

descrito cima, por exemplo,	para pH 5,5,	por
- Medição da atividade	em lipideos	polares usando PC
como substrato (Ensaio	IA) ;
- Medição da atividade	em lipideos	não polares usando

Trioleina como substrato (Ensaio 3A);

- e cálculo da razão análogo a Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n° nos Materiais e Métodos no presente documento.

[0143] A determinação da razão da atividade em fosfolipideos: da atividade em triglicerideos pode ser feita através da medição com uso de ensaios adequados com pH 8 como Ensaios IB e 3B como descrito no presente documento e pelo cálculo da razão análoga a Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n° nos Materiais e Métodos no presente documento.

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43/133 [0144] Em um aspecto da revelação, a razão aumentada da atividade em fosfolipideos: da atividade em triglicerideos é uma razão aumentada da atividade em PC: da atividade em Trioleina.

[0145] Em um aspecto da revelação, a razão da atividade em PC: da atividade em Trioleina é determinada com pH 5,5. (Por exemplo, Ensaios IA e 3A e pelo cálculo da razão como descrito no presente documento) [0146] Em um aspecto da revelação, a razão da atividade em PC: da atividade em Trioleina é determinada com pH 8. (Por exemplo, Ensaios IB e 3B e pelo cálculo da razão como descrito no presente documento) [0147] A revelação fornece uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo variante de acordo com a revelação, isto é, fornece uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o variante de enzima lipolitica da revelação.

[0148] A revelação fornece adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um variante lipolítico que compreende uma sequência que tem pelo menos 7 0 de % de identidade de sequência para o polipeptídeo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

[0149] Uma sequência de ácidos nucleicos da revelação pode compreender uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo variante da revelação que tem pelo

menos 60 %,	70	%, 75 %, 80	%, 85 %, 90	%, 95 %,	96 %, 97	o. 0 r
98 % ou 99	% de	identidade	de sequência	para o	polipeptídeo
maduro que SEQ ID NO:	tem 2 .	atividade	lipolitica como estabelecido	em
[0150] Em um	aspecto, a	sequência de	ácidos	nucleicos	da

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44/133 revelação compreende uma sequência de polinucleotideos que codifica um polipeptideo variante da revelação que tem pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência para o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0151] A revelação fornece um construto de ácido nucleico que compreende a sequência de ácidos nucleicos da revelação operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle com capacidade de direcionar a expressão de uma enzima lipolitica em um hospedeiro de expressão adequado.

[0152] A revelação fornece uma célula hospedeira recombinante que compreende um vetor de expressão recombinante que compreende o construto de ácido nucleico da revelação.

[0153] A revelação fornece um método para produzir um variante de polipeptideo lipolitico de acordo com a revelação que compreende cultivar a célula hospedeira da revelação sob condições favoráveis à produção do variante de enzima lipolitica e recuperar o variante de enzima lipolitica.

[0154] 0 método para produzir o variante de polipeptideo lipolitico de acordo com essa revelação inclui um método para produzir todos os variantes descritos no presente documento.

[0155] 0 termo fita complementar pode ser usado intercambiavelmente com o termo complemento. A fita complementar de um ácido nucleico pode ser o complemento de uma fita de codificação ou o complemento de uma fita de não codificação. Ao se referir aos ácidos nucleicos de fita

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45/133 dupla, o complemento de um ácido nucleico que codifica um polipeptideo se refere à fita complementar da fita que codifica a sequência de aminoácidos ou a qualquer molécula de ácido nucleico que contém a mesma. Tipicamente, a fita complementar inversa é destinada.

[0156] 0 termo sequência de controle pode ser usada intercambiavelmente com o termo sequência de ácidos nucleicos de regulação de expressão. 0 termo as usados no presente documento se refere às sequências de ácidos nucleicos necessárias para e/ou que afetam a expressão de uma sequência de codificação operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro particular ou in vitro. Quando as duas sequências de ácidos nucleicos são operacionalmente ligada, as mesma estarão usualmente na mesma orientação e também no mesmo quadro de leitura. Essas, em geral, serão essencialmente contiguas, embora isso possa não ser necessário. As sequências de ácidos nucleicos de regulação de expressão, como inter alia iniciação de transcrição apropriada, terminação, promotor, leitor, peptideo de sinal, propeptideo, prepropeptideo ou sequências melhoradoras; Sequência de Shine-Dalgarno, sequências repressoras ou ativadoras; sinais de processamento de RNA eficaz, como sinais de poliadenilação e processamento de RNA por emenda; sequências que estabilizam mRNA citoplásmico; sequências que melhoram a eficiência de tradução (por exemplo, sitios de ligação de ribossomo); sequências que melhoram a estabilidade de proteina; e, quando desejado, sequências que melhoram a secreção de proteina, podem ser qualquer sequência de ácidos nucleicos que mostra atividade no organismo hospedeiro de escolha e

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46/133 podem ser derivadas de genes que codificam proteínas, que são endógenos ou heterólogos a uma célula hospedeira. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha para a sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptideo. Quando desejado, a sequência de controle pode ser dotada de ligantes para o propósito de introduzir os sítios de restrição específica que facilitam a ligação das sequências de controle com a região de codificação da sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptideo. As sequências de controle podem ser otimizadas para seu propósito específico.

[0157] 0 termo derivado de também inclui os termos originado de, obtido a partir de, obtenível a partir de, isolado de e criado a partir de, e geralmente indica que um material especificado tem sua origem em outro material especificado ou tem características que podem ser descritas com referência ao outro material especificado. Conforme usado neste documento, uma substância (por exemplo, uma molécula de ácido nucleico ou polipeptideo) derivada de um microrganismo significa, de preferência, que a substância é nativa a esse microrganismo.

[0158] Como usado no presente documento, o termo endógeno se refere a um ácido nucleico ou sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente em uma célula hospedeira.

[0159] 0 termo expressão inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptideo que inclui, mas sem limitação a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-traducional e secreção.

[0160] Um vetor de expressão compreende um

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47/133 polinucleotideo que codifica para um polipeptídeo operacionalmente ligado às sequências de controle apropriadas (como um promotor e sinais de parada transcricional e traducional) para a expressão e/ou tradução in vitro, ou na célula hospedeira do polinucleotideo.

[0161] 0 vetor de expressão pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e que pode realizar a expressão do polinucleotideo. A escolha do vetor tipicamente dependerá da compatibilidade do vetor com a célula na qual o vetor será introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados. 0 vetor pode ser um vetor de replicação autônomo, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. Alternativamente, o vetor pode ser tal que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado ao genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossoma(s) no(s) qual(is) foi integrado. 0 vetor de clonagem integrativo pode se integrar de forma aleatória ou em um locus alvo predeterminado nos cromossomas da célula hospedeira. 0 sistema de vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson.

[0162] Uma célula hospedeira, como definido no presente documento, é um organismo adequado para

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48/133 manipulação genética e um que pode ser cultivado em densidades celulares úteis para produção industrial de um produto alvo, como um polipeptideo de acordo com a presente revelação. Uma célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de ocorrência natural ou uma célula hospedeira derivada de uma célula hospedeira parental após manipulação genética ou mutagênese clássica. Vantajosamente, uma célula hospedeira é uma célula hospedeira recombinante.

[0163] Uma célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira procariota, arqueobacteriana ou eucariota. Uma célula hospedeira procariota pode ser, sem limitação, uma célula hospedeira bacteriana. Uma célula hospedeira eucariótica pode ser, porém sem limitação, uma célula de levedura, uma célula fúngica, uma célula de amoeba, uma célula de alga, uma célula de planta, uma célula de animal, como uma célula de mamífero ou uma célula de inseto.

[0164] 0 termo heterólogo, como usado no presente documento, se refere a sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos que não ocorrem naturalmente em uma célula hospedeira. Em outras palavras, a sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos não é idêntica àquela naturalmente encontrada na célula hospedeira.

[0165] 0 termo hibridização significa o pareamento de fitas substancialmente complementares de compostos oligoméricos, como compostos de ácido nucleico.

[0166] A hibridização pode ser realizada sob condições de baixa, média ou alta estringência. As condições de hibridização de baixa estringência compreendem a hibridização em 6X de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, seguido por duas lavagens em 0,2X

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49/133 de SSC, SDS a 0,1 % pelo menos a 50 °C (a temperatura das lavagens pode ser aumentada para 55 °C para condições de baixa estringência). As condições de hibridização de média estringência compreendem a hibridização em 6X de SSC a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X de SSC, 0,1 % de SDS a 60 °C e condições de hibridização de alta estringência compreendem a hibridização em 6X de SSC a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X de SSC, 0,1 % de SDS a 65 °C.

[0167] Uma sequência de polinucleotideos ou ácidos nucleicos é definida no presente documento como um polimero de nucleotideo que compreende pelo menos 5 unidades de nucleotideo ou ácido nucleico. Um nucleotideo ou ácido nucleico se refere a RNA e DNA. Os termos ácido nucleico e sequência de polinucleotideos são usados intercambiavelmente no presente documento.

[0168] Um peptideo se refere a uma cadeia curta de residues de aminoácido ligados por ligações de peptideo (amida). O peptideo mais curto, um dipeptideo, consiste em 2 aminoácidos ligados por ligação simples de peptideo.

[0169] O termo polipeptideo se refere a uma molécula que compreende residues de aminoácidos ligados por ligações peptidicas e que contém mais de cinco residues de aminoácidos. O termo proteina, como usado no presente documento, é sinônimo do termo polipeptideo e também pode se referir a dois ou mais polipeptideos. Desse modo, os termos proteina e polipeptideo podem ser usados intercambiavelmente. Os polipeptideos podem ser opcionalmente modificados (por exemplo, glicosilados, fosforilados, acilados, farnesilados, prenilados,

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50/133 sulfonados e semelhantes) para adição de funcionalidade. Os polipeptideos que exibem atividade na presença de um substrato específico sob certas condições podem ser chamados de enzimas. Deve ser entendido que, como resultado da degeneração do código genético, pode ser produzida uma multiplicidade de sequências nucleotídicas que codificam um determinado polipeptideo.

[0170] Uma enzima é um polipeptideo que catalisa uma reação química.

[0171] Um fragmento de ácido nucleico isolado é um fragmento de ácido nucleico que não ocorre naturalmente como um fragmento e que não seria encontrado no estado natural.

[0172] 0 termo polipeptideo isolado como usados no presente documento significa um polipeptideo que é removido de pelo menos um componente, por exemplo, outro material de polipeptideo, com o qual o mesmo é naturalmente associado. 0 polipeptideo isolado pode ser isento de quaisquer outras impurezas. 0 polipeptideo isolado pode ser pelo menos 50 % puro, por exemplo, pelo menos 60 % puro, pelo menos 70 % puro, pelo menos 75 % puro, pelo menos 80 % puro, pelo menos 85 % puro, pelo menos 90 % puro, ou pelo menos 95 % puro, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % como determinado por SDS-PAGE ou qualquer outro método analítico adequado para esse propósito e conhecido pela pessoa versada na técnica. Um polipeptideo isolado pode ser produzido por uma célula hospedeira recombinante.

[0173] 0 variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação pode ser recuperado e purificado a partir de culturas de célula recombinante por métodos conhecidos na

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51/133 técnica (Protein Purification Protocols, Methods in Molecular Biology series por Paul Cutler, Humana Press, 2004) .

[0174] O variante de enzima lipolitica inclui produtos naturalmente purificados, produtos de procedimentos sintéticos químicos e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariota ou eucariota, incluindo, por exemplo, células de bactérias, leveduras, insetos, plantas e de mamíferos. Dependendo do hospedeiro empregado em um processo de produção recombinante, os polipeptídeos da presente revelação podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Além disso, os polipeptídeos da revelação também podem incluir uma modificação inicial no resíduo de metionina, em alguns casos, como resultado de processos mediados pelo hospedeiro.

[0175] Na revelação, um variante de polipeptideo lipolítico pode ser fornecido na forma de variante de prépolipeptideo ou variante de polipeptideo (maduro). Uma sequência de ácidos nucleicos correspondente também pode ser fornecida, isto é, um polinucleotídeo que codifica um variante de pré-polipeptídeo lipolítico ou um variante de polipeptideo lipolítico (maduro) pode ser fornecido.

[0176] 0 termo construto de ácido nucleico se refere no presente documento a uma molécula de ácido nucleico, de fita única ou fita dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou que tenha sido modificada de modo a conter segmentos de ácido nucleico que são combinados e justapostos de uma forma que, de outro modo, não existe na natureza. 0 termo construto de ácido nucleico é sinônimo do

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52/133 termo cassete de expressão, quando o construto de ácido nucleico contém todas as sequências de controle necessárias para a expressão de uma sequência de codificação, em que as ditas sequências de controle são operativamente ligadas à dita sequência de codificação.

[0177] 0 termo promotor é definido no presente documento como uma sequência de DNA que é ligada por RNA polimerase e direciona a polimerase para o sítio de partida transcricional a jusante correto de uma sequência de ácidos nucleicos para iniciar a transcrição. Um promotor também pode compreender sítios de ligação para reguladores.

[0178] 0 termo recombinante quando usado em referência a uma célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativa, ou que a célula é derivada de uma célula modificada desta forma. Assim, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que, de outra forma, são expressos de modo anormal, subexpressados ou não expressos. 0 termo recombinante é sinônimo de geneticamente modificado e transgênico.

[0179] Os termos identidade de sequência ou homologia de sequência são usados intercambiavelmente no presente documento. Para o propósito desta revelação, é definido no presente documento que, para determinar a percentagem de homologia de sequência ou identidade de sequência de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de

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53/133 comparação ideal. De modo a otimizar o alinhamento entre as duas sequências, podem ser introduzidas lacunas em qualquer uma das duas sequências que são comparadas. Esse alinhamento pode ser realizado ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas. Alternativamente, o alinhamento pode ser realizado ao longo de um comprimento menor, por exemplo, ao longo de cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucleicos/bases ou aminoácidos. A identidade de sequência é a porcentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências ao longo da região alinhada relatada.

[0180] Uma comparação de sequências e determinação da percentagem de identidade de sequência entre duas sequências pode ser feita com o uso de um algoritmo matemático. Um técnico no assunto deve estar ciente do fato de que existem vários programas de computador disponíveis para alinhar duas sequências e determinar a identidade entre duas sequências (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison; em D. Sankoff e J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, páginas 1-44 Addison Wesley). O percentual de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências nucleotídicas pode ser determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências.

(Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Ambas as sequências de aminoácidos e sequências de nucleotídeos podem ser alinhadas pelo algoritmo. O algoritmo de Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para os propósitos da presente

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54/133 revelação, foi usado o programa NEEDLE do pacote EMBOSS (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice,P. Longden,!. e Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp276—277, http://emboss.bioinformatics.nl/). É usado EBLOSUM62 para as sequências de proteínas para a matriz de substituição. Para a sequência de nucleotídeos, é usado EDNAFULL. Os parâmetros opcionais usados são uma penalidade de abertura de lacunas de 10 e penalidade de extensão de lacuna de 0,5. Um técnico no assunto compreenderá que todos estes parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a porcentagem total de identidade de duas sequências não é significativamente alterada quando são usados diferentes algoritmos.

[0181] Após o alinhamento pelo programa NEEDLE, como descrito acima, o percentual de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência da revelação é calculado como a seguir: Número de posições correspondentes no alinhamento apresentando um aminoácido idêntico ou nucleotídeo idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após subtração do número total de lacunas no alinhamento. A identidade definida como no presente documento pode ser obtida a partir de NEEDLE ao usar a opção NOBRIEF e é marcada na saída do programa como identidade mais longa. [0182] As sequências de proteínas e de ácidos nucleicos da presente revelação podem ser adicionalmente usadas como uma sequência de consulta, para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas, por exemplo, para identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Essas

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55/133 pesquisas podem ser realizadas com o uso dos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403—10. As pesquisas BLAST de nucleotideos podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para a obtenção de sequências nucleotidicas homólogas a moléculas de ácido nucleico da revelação. As pesquisas BLAST de proteínas são realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para a obtenção de sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteínas da revelação. Para obter alinhamentos com lacuna para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Quando são usados os programas BLAST e Gapped BLAST, podem ser usados os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST). Consulte a página principal (homepage) do Centro Nacional de Informação em Biotecnologia em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

[0183] Como indicado acima, o polipeptídeo variante de acordo com a revelação pode ser um polipeptídeo isolado, substancialmente puro, puro, recombinante ou sintético.

[0184] Em uma modalidade, o polipeptídeo variante de acordo com a revelação é um polipeptídeo de ocorrência não natural.

[0185] Uma enzima pura é sinônimo de polipeptídeo puro e significa um polipeptídeo que é removido de pelo menos um componente, por exemplo, outro material de polipeptídeo, com o qual o mesmo é naturalmente associado. O polipeptídeo pode ser isento de quaisquer outras

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56/133 impurezas. 0 polipeptideo pode ser pelo menos 50 % puro, por exemplo, pelo menos 60 % puro, pelo menos 70 % puro, pelo menos 75 % puro, pelo menos 80 % puro, pelo menos 85 % puro, pelo menos 90 % puro, ou pelo menos 95 % puro, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % como determinado por SDSPAGE ou qualquer outro método analítico adequado para esse propósito e conhecido pela pessoa versada na técnica. Um polipeptideo isolado pode ser produzido por uma célula hospedeira recombinante.

[0186] O termo substancialmente puro em relação aos polipeptídeos se refere a uma preparação de polipeptideo que contém na maioria 50 % em peso de outro material de polipeptideo. Os polipeptídeos revelados no presente documento estão, de preferência, em uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferencial que os polipeptídeos revelados no presente documento estejam na forma essencialmente pura, isto é, que a preparação de polipeptideo seja essencialmente isenta de outro material de polipeptideo. Opcionalmente, o polipeptideo também pode ser essencialmente isento de material de não polipeptideo, como ácidos nucleicos, lipideos, componentes do meio e similares. No presente documento, o termo polipeptideo substancialmente puro é sinônimo com os termos polipeptideo isolado e polipeptideo na forma isolada. O termo substancialmente puro em relação ao polinucleotídeo se refere a uma preparação de polinucleotídeo que contém na maioria 50 % em peso de outro material de polinucleotídeo. Os polinucleotídeos revelados no presente documento estão, de preferência, em uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferencial que o polinucleotídeo revelado

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57/133 no presente documento esteja na forma essencialmente pura, isto é, que a preparação de polinucleotideo seja essencialmente isento de outro material de polinucleotideo. Opcionalmente, o polinucleotideo também pode ser essencialmente isento de material de não polinucleotideo, como polipeptideos, lipideos, componentes do meio e similares. No presente documento, o termo polinucleotideo substancialmente puro é sinônimo com os termos isolado polinucleotideo e polinucleotideo na forma isolada.

[0187] Uma molécula sintética, como um ácido nucleico sintético ou um polipeptídeo sintético, é produzida por síntese enzimática ou química in vitro. A mesma inclui, porém sem limitação, ácidos nucleicos variantes feitos com uso de códon ideal para organismos hospedeiros de escolha.

[0188] Um ácido nucleico sintético pode ser otimizado para uso de códon, de preferência, de acordo com os métodos descritos nos documentos W02006/077258 e/ou W02008000632, que são incorporados ao presente documento a título de referência. 0 documento W02008/000632 aborda otimização de par de códon. A otimização de par de códon é um método em que as sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que foi modificado em relação a seu uso de códon, em particular, os pares de códon que são usados, são otimizados para obter expressão aprimorada da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo e/ou produção aprimorada do polipeptídeo codificado. Os pares de códon são definidos como um conjunto de dois tripletos subsequentes (códons) em uma sequência de codificação. Aquele versado na técnica saberá que o uso de códon precisa ser adaptado dependendo da espécie hospedeira, resultando

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58/133 possivelmente em variantes com desvio de homologia significativa de SEQ ID NO: 1, mas que ainda codifica o polipeptideo de acordo com a revelação.

[0189] Como usado no presente documento, os termos variante, derivado, mutante ou homólogo podem ser usados intercambiavelmente. Os mesmos podem se referir a polipeptídeos ou ácidos nucleicos. Os variantes incluem substituições, inserções, deleções, truncamentos, transversões e/ou inversões, em uma ou mais localizações relativas a uma sequência de referência. Os variantes podem ser feitos, por exemplo, por mutagênese de saturação de sitio, mutagênese de varredura, mutagênese de inserção, mutagênese aleatória, mutagênese de sitio dirigido e evolução dirigida, bem como várias outras abordagens de recombinação conhecidas a uma pessoa versada na técnica. Os genes variantes de ácidos nucleicos podem ser sintetizados artificialmente por técnicas conhecidas na técnica.

[0190] Um polipeptideo de acordo com a presente revelação pode ser codificado por qualquer sequência de polinucleotideos adequada. Tipicamente, uma sequência de polinucleotideos é otimizado por códon ou uma sequência otimizada por par de códon para expressão de um polipeptideo como revelado no presente documento em uma célula hospedeira particular. Os polinucleotideos de acordo com a revelação podem ser otimizados em seu uso de códon, de preferência, de acordo com os métodos descritos nos documentos W02006/077258 e/ou W02008/000632. 0 documento W02008/000632 aborda otimização de par de códon. A otimização de par de códon é um método em que as sequências de nucleotideos que codificam um polipeptideo são

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59/133 modificadas em relação a seu uso de códon, em particular, os pares de códon que são usados, para obter expressão aprimorada da sequência de nucleotideos que codifica o polipeptideo e/ou produção aprimorada do polipeptideo codificado. Os pares de códon são definidos como um conjunto de dois tripletos subsequentes (códons) em uma sequência de codificação.

[0191] Um polipeptideo da revelação pode ser codificado por uma sequência de polinucleotideos que compreende sequências de controle e/ou sequências de sinal apropriadas, por exemplo, para secreção.

[0192] Um polipeptideo da revelação pode ser codificado por um polinucleotideo que hibridiza sob condições de média estringência, de preferência, sob condições de altas estringência para a fita complementar da sequência de codificação de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 2 (ou a sequência do tipo selvagem correspondente ou uma códon de sequência otimizado ou par de códon otimizado para expressão em um organismo heterólogo, como um Bacillus, por

exemplo,	Bacillus	subtilis).
[0193]	Um polipeptideo da revelação	também pode	ser
codificado por um	ácido nucleico que tem	pelo menos 80	o. 0 f
85 %, 90	%, 91 %,	92 %, 93 %, 94 %, 95 %,	96 %, 97 %, 98	o. 0 r
9 9 % ou	100 %	de identidade para uma sequência	de

codificação de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 2 (ou a sequência do tipo selvagem correspondente ou uma códon de sequência otimizado ou par de códon otimizado para expressão em um organismo heterólogo, como um Bacillus, por exemplo, Bacillus subtilis).

[0194] Um polipeptideo da revelação também pode ser um

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60/133 variante de um polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições do polipeptídeo maduro SEQ ID NO: 1. Um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 pode ser uma sequência de aminoácidos que se difere em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 aminoácidos dos aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[0195] Em uma modalidade, a presente revelação apresenta um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo como revelado no presente documento.

[0196] Os fragmentos biologicamente ativos de um polipeptídeo da revelação incluem polipeptídeos que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas a ou derivadas da sequência de aminoácidos do variante de enzima lipolítica, que incluem menos aminoácidos que a proteína de comprimento completo, mas que exibe pelo menos uma atividade biológica da proteína de comprimento completo correspondente. Tipicamente, os fragmentos biologicamente ativos compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade do variante de enzima lipolítica. Um fragmento biologicamente ativo pode, por exemplo, compreender um domínio catalítico. Um fragmento biologicamente ativo de uma proteína da revelação pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Ademais, outras porções biologicamente ativas, em que outras regiões da proteína são deletadas, podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas para uma ou mais das atividades biológicas da forma nativa de um polipeptídeo da revelação. [0197] A revelação também apresenta fragmentos de ácido

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61/133 nucleico que codificam os fragmentos biologicamente ativos acima do variante de enzima lipolitica.

[0198] Um polipeptideo de acordo com a presente revelação pode ser uma proteina de fusão. As técnicas para produzir polipeptideos de fusão são conhecidas na técnica e incluem ligar as sequências de codificação que codificam os polipeptideos de modo que estejam em quadro. A expressão do polipeptideo fundido está sob controle do mesmo promotor (ou promotores) e terminador. Os polipeptideos hibridos podem compreender uma combinação de sequências polipeptideo completa ou parcial obtidas de pelo menos dois polipeptideos diferentes em que um ou mais podem ser heterólogos a uma célula hospedeira. Tais polipeptideos de fusão de pelo menos dois polipeptideos diferentes podem compreender um dominio de ligação de um polipeptideo, operacionalmente ligado a um dominio catalitico de um segundo polipeptideo. Os exemplos de polipeptideos de fusão e fusões de sequência de sinal são, por exemplo, como descrito em W02010/121933, W02013/007820 e W02013/007821.

[0199] Um polipeptideo da revelação pode ser um polipeptideo de ocorrência natural ou um polipeptideo recombinante ou geneticamente modificado.

[0200] Um polipeptideo da revelação pode ser purificado. A purificação de proteínas é conhecida por uma pessoa versada na técnica.

[0201] 0 termo atividade enzimática, algumas vezes também chamado de atividade catalítica ou eficiência catalítica, é geralmente conhecido pela pessoa versada na técnica e se refere à taxa de conversão de uma enzima e é usualmente expresso por meio da razão kkat/KM, em que kkat é

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62/133 a constante catalítica (também chamada de número de rotatividade) e o valor Km corresponde à concentração de substrato, em que a taxa de reação está na metade de seu valor máximo. Alternativamente, a atividade enzimática de uma enzima também pode ser especificada pela atividade específica (pmol de substrato convertido x mg ¹ x min¹; conforme acima) ou a atividade volumétrica (pmol de substrato convertido x ml ¹ x min¹; conforme acima) .

[0202] A referência também pode ser feita para a literatura geral como Structure and Mechanism in Protein Science: A guide to enzima catalysis and protein folding, Alan Fersht, W.H.Freeman, 1999; Fundamentals of Enzyme Kinetics, Athel Cornish-Bowden, Wiley-Blackwell 2012 e Voet et al., Biochemie [Biochemistry], 1992, VCH-Verlag, Capítulo 13, páginas 331-332 em relação à atividade enzimática.

[0203] Há várias maneiras de inserir uma sequência de ácidos nucleicos em um construto de ácido nucleico ou um vetor de expressão que são conhecidas por uma pessoa versada na técnica, consulte, por exemplo, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual, 3^a Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 2001. Pode ser desejável manipular uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptideo da presente revelação com sequências de controle, como sequências promotoras e terminadoras.

[0204] Um promotor pode ser qualquer sequência promotora apropriada para uma célula hospedeira eucariota ou procariota, que mostra atividade transcricional, que incluem promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode

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63/133 ser obtido a partir de polinucleotideos que codificam polipeptideos extracelulares ou intracelulares endógenos (nativos) ou heterólogos (estranhos) para a célula. 0 promotor pode ser um promotor constitutivo ou induzivel. Um promotor induzivel pode ser, por exemplo, um promotor induzivel por amido.

[0205] Os promotores adequados serão conhecidos para a pessoa versada. Em uma modalidade específica, são preferenciais promotores que têm capacidade para direcionar um alto nível de expressão dos polipeptídeos de acordo com a revelação em um fungo ou levedura. Tais promotores são conhecidos na técnica.

[0206] Pode ser usada uma variedade de promotores que tem capacidade para direcionar transcrição nas células hospedeiras da revelação. De preferência, a sequência promotora é derivada de um gene altamente expresso. Os promotores constitutivos forte são bem conhecidos e um apropriado pode ser selecionado de acordo com a sequência específica a ser controlada na célula hospedeira. Os exemplos de genes altamente expressados preferidos a partir dos quais os promotores são, de preferência, derivados e/ou que são compreendidos em localização-alvo predeterminada preferencial para integração de construtos de expressão. Os exemplos de promotores adequados são listados no documento WO 2009/106575, que incluem exemplos de promotores adequados em fungo filamentoso. Todos os promotores mencionados nos mesmos são prontamente disponíveis na técnica.

[0207] Qualquer terminador que é funcional em uma célula como revelado no presente documento pode ser usado, os

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64/133 quais são conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Os exemplos de sequências terminadoras adequadas em fungo filamentoso incluem sequências terminadoras de um gene fúngico filamentoso, por exemplo, aqueles listados no documento WO 2009/106575.

[0208] A revelação também se refere a um vetor que compreende um ácido nucleico da revelação, em que o dito vetor compreende pelo menos uma sequência de replicação autônoma e um ácido nucleico como descrito no presente documento.

[0209] 0 vetor pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou um vírus), que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante. A escolha do vetor tipicamente dependerá da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. De preferência, o vetor é um plasmídeo. 0 vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado. 0 vetor pode compreender adicionalmente um, de preferência, marcador não seletivo que permite a fácil determinação do vetor na célula hospedeira. Os marcadores adequados incluem GFP e DsRed. A chance de integração ou conversão de gene do vetor no genoma hospedeiro é, de preferência, minimizada. 0 vetor de acordo com a revelação pode ser um vetor extracromossomal. Tal vetor carece, de preferência, de regiões significativas de homologia com o genoma do hospedeiro para minimizar a chance de integração no genoma hospedeiro por recombinação homóloga. A pessoa versada na técnica sabe como construir um vetor com chance mínima de integração no genoma. Isso pode ser alcançado usando sequências de controle, como promotores e terminadores, que

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65/133 se originam de uma espécie diferente da espécie hospedeira. Outras maneiras de reduzir a homologia são pela modificação de uso de códon e introdução de mutações silenciosas. A pessoa versada na técnica sabe que o tipo de célula hospedeira, o comprimento das regiões de homologia para o genoma de célula hospedeira presente no vetor, e o percentual de homologia entre as ditas regiões de homologia no vetor e o cromossomo hospedeiro determinará se e em qual quantidade o vetor se integrará no genoma de célula hospedeira.

[0210] A sequência de replicação autônoma pode ser qualquer sequência adequada disponível pela pessoa versada na técnica que permite a replicação de plasmídeo que é independente de replicação cromossomal.

[0211] A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo que media a replicação autônoma que funciona em uma célula. 0 termo origem de replicação ou replicador de plasmídeo é definido no presente documento como uma sequência de nucleotídeos que permite que um plasmídeo ou vetor replique in vivo. Os exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação de plasmídeo pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 que permite a replicação em E. coli, RSF1010 que permite que a replicação em Pseudomonas seja descrita, por exemplo, por F. Heffron et al., em Proc. Nat' 1 Acad. Sei. EUA 72(9):3623-27 (Setembro de 1975), e pUBUO, pE194, pTA1060, e ρΑΜβΙ que permite a replicação em Bacillus.

[0212] De preferência, a sequência de replicação autônoma usada em fungos filamentosos é o replicon AMAI (Gems et al., 1991 Gene. 98(1):61-7). As repetições

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66/133 teloméricas também podem resultar em replicação autônoma (linearização in vivo e replicação autônoma de plasmideos que contêm DNA telomérico humano em Aspergillus nidulans, Aleksenko et al. Molecular and General Genetics MGG, 1998 Volume 260, Números 2-3, 159-164, DOI: 10.1007/s004380050881) . As sequências CEN/ARS e sequências de vetores de 3 μ da levedura também podem ser adequadas.

[0213] Um construto de expressão ou vetor para um determinado hospedeiro pode, então, compreender os seguintes elementos operacionalmente ligados entre si em uma ordem consecutiva da extremidade 5' e extremidade 3' em relação à fita de codificação da sequência que codifica o composto de interesse ou que codifica um composto envolvido na sintese do composto de interesse: (1) uma sequência promotora com capacidade para direcionar a transcrição de um ácido nucleico da revelação; (2) opcionalmente uma sequência para facilitar a tradução do RNA transcrito, por exemplo, um sitio de ligação de ribossomo (também indicado como sequência de Shine Delgarno) em procariotas, ou uma sequência de Kozak em eucariotas (3) opcionalmente, uma sequência de sinal com capacidade para direcionar a secreção do variante de enzima lipolitica codificado pelo ácido nucleico da revelação a partir da determinada célula hospedeira em um meio de cultura; (4) um ácido nucleico da revelação, como descrito no presente documento; e, de preferência, também (5) uma região de terminação de transcrição (terminador) com capacidade para terminar a transcrição a jusante do ácido nucleico da revelação. O vetor pode compreender essas e/ou outras sequências de controle como descrito no presente documento.

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67/133 [0214] A jusante de um ácido nucleico da revelação podem ser uma região não traduzida em 3' que contém um ou mais sítios de terminação de transcrição (por exemplo, um terminador, no presente documento também chamado de um códon de parada) . A origem do terminador não é crítica. 0 terminador pode, por exemplo, ser nativo para a sequência de DNA que codifica o polipeptideo. No entanto, de preferência, um terminador bacteriano é usado em células hospedeiras bacterianas e um terminador fúngico filamentoso é usado em células hospedeiras fúngicas filamentosas. Com mais preferência, o terminador é endógeno à célula hospedeira (em que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptideo deve ser expressa). Na região transcrita, um sítio de ligação de ribossomo para tradução pode estar presente. A porção de codificação das transcrições maduras expressadas pelos construtos incluirá um códon de partida, usualmente AUG (ou ATG), mas também há códons de partida alternativos, como, por exemplo, GUG (ou GTG) e UUG (ou TTG) , que são usados em procariotas. Além disso, um códon de terminação de tradução ou de parada é apropriadamente posicionado no final do polipeptideo a ser traduzido.

[0215] A expressão melhorada de um variante de enzima lipolitica da revelação também pode ser alcançada pela seleção de regiões reguladoras homólogas e heterólogas, por exemplo, regiões de promotor, de leitor de secreção e/ou de terminador, que podem servir para aumentar a expressão e, se desejado, níveis de secreção da proteína de interesse do hospedeiro de expressão e/ou para fornecer o controle induzível da expressão de um composto de interesse ou um composto envolvido na síntese de um composto de interesse.

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68/133 [0216] O vetor que compreende pelo menos uma sequência de replicação autônoma e um ácido nucleico da revelação, também chamado no presente documento de vetor (ou vetor de expressão) da revelação pode ser projetado para expressão do ácido nucleico em uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. Por exemplo, um variante de enzima lipolitica da revelação pode ser produzido em células bacterianas, como E. coli ou Bacilli, células de inseto (usando vetores de expressão baculovirus), células fúngicas, como células de levedura ou células de mamífero. As células hospedeiras adequadas são discutidas no presente documento e adicionalmente em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, EUA (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, usando sequências reguladoras de promotor T7 e polimerase T7.

[0217] A fim de identificar e selecionar as células que alojam um ácido nucleico e/ou vetor da revelação, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) é opcionalmente introduzido no vetor e/ou células hospedeiras juntamente com o ácido nucleico da revelação. Os marcadores selecionáveis preferidos incluem, porém sem limitação, aqueles que conferem resistência a fármacos ou que complementam um defeito na célula hospedeira. A pessoa versada na técnica sabe como escolher e aplicar tais marcadores. Os exemplos de marcadores adequados são listados no documento WO 2009/106575.

[0218] A expressão de proteínas em procariotas é

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69/133 frequentemente executada com vetores que contêm promotores induziveis ou constitutivos que direcionam a expressão de proteínas de fusão ou de não fusão. Os vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos a uma proteína codificada nos mesmos, por exemplo, para a terminação amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão servem para tipicamente três propósitos: 1) aumentar a expressão de proteína recombinante; 2) aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) auxiliar a purificação da proteína recombinante atuando como um ligante na purificação por afinidade. Frequentemente, em vetores de expressão de fusão, um sítio de divagem proteolítica é introduzido na junção da fração de fusão e da proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante da fração de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão.

[0219] A presente revelação também fornece uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico ou um vetor de expressão como revelado no presente documento. Uma célula hospedeira adequada pode ser uma célula de mamífero, inseto, planta, fungo ou algas ou uma célula bacteriana.

[0220] A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica. Em um aspecto, a célula hospedeira procariótica é uma célula bacteriana. Os exemplos de células bacterianas são listados no documento WO 2009/106575.

[0221] De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira de acordo com a revelação é uma célula hospedeira eucariótica. De preferência, a célula eucariótica é uma célula de mamífero, de inseto, de planta, de fungos ou de

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70/133 algas. Os exemplos de célula hospedeira eucariótica são listados no documento WO 2009/106575.

[0222] A célula eucariótica pode ser uma célula de fungos, por exemplo, uma célula de levedura, como uma célula do gênero Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia. Mais especificamente, uma célula de levedura pode ser de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica e Pichia pastoris Candida krusei.

[0223] As células fúngicas filamentosas preferidas pertencem a uma espécie de um Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora, Penicillium, Talaromyces, Rasamsonia, Thielavia, Fusarium ou Trichoderma genus e, com máxima preferência, uma espécie de Aspergillus niger, Acremonium alabamense, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Rasamsonia emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Fusarium oxysporum, Myceliophthora thermophila, Trichoderma reesei, Thielavia terrestris ou Penicillium chrysogenum. Uma célula hospedeira fúngica filamentosa mais preferencial pertence ao gênero Aspergillus, com mais preferência, a célula hospedeira pertence à espécie Aspergillus niger. Quando a célula hospedeira de acordo com a revelação é uma célula hospedeira Aspergillus niger, a célula hospedeira é, de preferência, CBS 513.88, CBS124.903 ou um derivado da mesma.

[0224] Várias cepas de fungos filamentosos são prontamente acessíveis ao público em um número de coleções

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71/133 de cultura, como a Coleção Americana de Cultura Tipo (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), Coleção de Cultura de Patente de Serviço de Pesquisa Agrícola, Centro de Pesquisa Regional do Norte (NRRL) e Coleção russa integral de Microorganismos da Academia russa de Ciências, (abreviação em russo - VKM, abreviação em inglês - RCM) , Moscow, Rússia. As cepas úteis no contexto da presente revelação podem ser Aspergillus niger CBS 513.88, CBS124.903, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, CBS205.89, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, P. chrysogenum CBS 455.95, P. chrysogenum Wisconsin541255(ATCC28089), Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Thielavia terrestris NRRL8126, Talaromyces emersonii CBS 124.902, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 ou ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 ou ATCC 56765 ou ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Myceliophthora thermophila Cl, Garg 27K, VKM-F 3500 D, Chrysosporium lucknowense Cl, Garg 2 7K, VKM-F 350 0 D, ATCC44006 e derivados das mesmas.

[0225] Uma célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira transgênica ou recombinante. A célula hospedeira pode ser geneticamente modificada com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão como revelado no presente documento com técnicas padrão conhecidas na técnica, como eletroporação, transformação de protoplasto ou conjugação, por exemplo, como revelado em Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^a Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 2001.

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72/133 [0226] As técnicas de genética padrão, como

superexpressão

de enzimas nas células hospedeiras,

modificação genética de células hospedeiras, ou técnicas de hibridização, são métodos conhecidos na técnica, conforme descrito em Sambrook e Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou F. Ausubel et al, eds., Current protocols in molecular biology, Green Publishing e Wiley Interscience, Nova York, EUA (1987) . Métodos para transformação, modificação genética, etc. de células hospedeiras fúngicas são conhecidos, por exemplo, a partir dos documentos EP-A-0 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 e WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 e US 6.265.186.

[0227] A revelação fornece um método para produzir um

variante de

polipeptideo lipolitico, cujo método

compreende:

a) selecionar

um polipeptideo que tem atividade

lipolitica;

b) substituir

pelo menos um resíduo de aminoácido que

corresponde a qualquer um dentre 113, 122, 138, 141,

179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2;

c) opcionalmente, substituir um ou mais aminoácidos adicionais, como definido no item b);

d) preparar o	variante resultante das etapas a)-c);
e) determinar	uma propriedade do variante; e
f) selecionar	um variante que tem uma propriedade

alterada em comparação com um polipeptideo de

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73/133 referência que tem atividade lipolítica medida sob as mesmas condições, produzindo, através disso, um variante de polipeptídeo lipolítico.

[0228] A revelação fornece um método para produzir um variante de polipeptídeo lipolítico, cujo método compreende:

a) selecionar um polipeptídeo que tem atividade lipolítica;

b) substituir pelo menos um resíduo de aminoácido que corresponde a qualquer um dentre 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2;

c) opcionalmente, substituir um ou mais aminoácidos adicionais, como definido no item b);

d) preparar o variante resultante das etapas a)-c);

e) determinar uma propriedade do variante; e

f) selecionar um variante que tem uma propriedade alterada em comparação com um polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica, através disso, produzir um variante de polipeptídeo lipolítico, em que a propriedade alterada inclui uma razão aumentada da atividade em lipideos polares: atividade em lipideos não polares em comparação com o polipeptídeo de referência que tem atividade lipolítica medida sob as mesmas condições.

[0229] A revelação fornece um método para produzir um variante de polipeptídeo lipolítico, em que na etapa b) a substituição, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende

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74/133 um ou mais dentre

I113H

I113L

I113N

I113R

I113T

L122A

L122M

H138E

H138S

F141M

F141Y

V179L

V17 9M

V179S

L282E

L282F

L282K

L282M

L282N

L282R

L282S

L282T

I284A

I284D

I284E

I284M

I284N

I284P

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as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2, e em que o variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação com um polipeptídeo de referência que tem atividade lipolitica.

[0230] A revelação fornece uma composição que compreende o polipeptídeo variante de acordo com a revelação ou obtenível pelo método de acordo com a revelação e um ou mais componentes selecionados a partir do grupo que consiste em leite em pó, glúten, gordura granulada, uma enzima adicional, um aminoácido, um sal, um oxidante, um agente de redução, um emulsificador, estearoil lactilato de sódio, estearoil lactilato de cálcio, poliglicerol ésteres de ácidos graxos e ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- e diglicerídeos, uma goma, um aromatizante, um ácido, um amido, um amido modificado, um umectante e um conservante.

[0231] Uma composição inclui uma pré-mistura. 0 termo pré-mistura é definido no presente documento para ser entendido em seu significado convencional, isto é, como uma mistura de agentes de panificação, que incluem geralmente

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76/133 farinha, que pode ser usada não apenas em instalações/usinas de panificação-pão industrial, mas também em padarias comerciais. A pré-mistura, de acordo com a revelação, pode ser preparada pela mistura do variante de polipeptideo lipolitico de acordo com a revelação polipeptideo com um carreador adequado, como farinha (por exemplo, farinha de trigo, farinha de milho e/ou farinha de arroz), amido, maltodextrina ou um sal. A pré-mistura pode conter aditivos como mencionado no presente documento. [0232] Os aditivos são, na maioria dos casos, adicionados em forma de pó. Os aditivos adequados incluem oxidantes (que incluem ácido ascórbico, bromato e azodicarbonamida (ADA), agentes de redução (que incluem L-cisteina), emulsificantes (que incluem, sem limitação, mono- e diglicerideos, monoglicerideos como monostearato de glicerol (GMS), estearoil lactilato de sódio (SSL), estearoil lactilato de cálcio (CSL), poliglicerol ésteres de ácidos graxos (PGE) e ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- e diglicerideos (DATEM), propileno glicol monostearato (PGMS), lecitina), gomas (que incluem goma guar e goma xantana), aromatizantes, ácidos (que incluem ácido citrico, ácido propiônico), amidos, amidos modificados, umectantes (que incluem glicerol) e conservantes. [0233] Em uma composição de acordo com a revelação, a enzima adicional é selecionada a partir de uma enzima lipolítica adicional; uma amilase, como uma alfa-amilase, por exemplo, uma alfa-amilase fúngica (que pode ser útil para fornecer açúcares fermentáveis por levedura), uma beta-amilase; uma glucanotransferase; uma peptidase, em

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77/133 particular, uma exopeptidase (que pode ser útil na melhoria do aromatizante); uma transglutaminase; uma celulase; uma hemicelulase, em particular, uma pentosanase, como xilanase (que pode ser útil para a hidrólise parcial de pentosanos, mais especificamente, arabinoxilano, que aumenta a extensibilidade da massa); protease (que pode ser útil para enfraquecimento de glúten em particular quando usando farinha de trigo forte); uma proteina dissulfeto isomerase, por exemplo, uma proteína dissulfeto isomerase como revelado no documento WO 95/00636; uma glicosiltransferase; uma peroxidase (que pode ser útil para aprimorar a consistência da massa); uma laccase; uma oxidase, como uma hexose oxidase, uma glicose oxidase, aldose oxidase, piranose oxidase; uma lipoxigenase; L-aminoácido oxidase (que pode ser útil no aprimoramento da consistência da massa) e uma asparaginase.

[0234] Em uma modalidade da composição de acordo com a revelação, a enzima adicional é uma enzima lipolítica adicional, isto é, uma enzima que hidrolisa triacilglicerol e/ou galactolipídeo e/ou fosfolipídeos.

[0235] A enzima lipolítica adicional pode ser uma enzima lipolítica como descrito no documento W02009/106575, como o produto comercial Panamore®, produto de DSM.

[0236] A enzima lipolítica adicional pode ser uma fosfolipase de mamífero, como PLA2 pancreática, por exemplo, PLA2 bovina ou porcina, como o produto comercial Lecitase 10L (PLA2 porcina, produto de Novozimas A/S).

[0237] A enzima lipolítica adicional pode ser de Fusarium, por exemplo, F. oxysporuma fosfolipase Al (documento WO 1998/026057), F. venenatuma fosfolipase Al (descrita no

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78/133 documento WO 2004/097012 como uma fosfolipase A2 chamada de FvPLA2), de Tuber, por exemplo, T. borchii fosfolipase A2 (chamada de TbPLA2, documento WO 2004/097012).

[0238] A enzima lipolítica adicional pode ser como descrito no documento WO 2000/032758 ou WO 2003/060112.

[0239] Panamore®, Lipopan® F, Lipopan® 50 e Lipopan® S são comercializados para atividade lipolítica normalizada, usando uma medição de DLU para Panamore® de DSM e uma medição de LU para a família Lipopan® de Novozimas. DLU é definido como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 micromol/min de p-nitrofenol de p-nitrofenil palmitato com pH 8,5 a 37 °C, enquanto LU é definido como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 micromol/min de ácido butírico de tributirina com pH 7 a 30 °C. A enzima lipolítica adicional pode ser usada em 2-850 DLU/kg de farinha ou em 50-23500 LU/kg de farinha. A enzima adicional pode ser usada em 14 DLU a 164 DLU/kg de farinha, em um aspecto 27-77 DLU/kg de farinha.

[0240] Em uma modalidade da composição de acordo com a revelação, a enzima lipolítica adicional é uma enzima lipolítica que tem pelo menos 60 % de identidade para a sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO 2, em um aspecto, a enzima lipolítica adicional é uma enzima lipolítica que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO 2.

[0241] Em uma modalidade da composição de enzima da revelação, a enzima adicional é uma enzima como reivindicado no documento EP0869167B1.

[0242] Em uma modalidade da composição de acordo com a

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79/133 revelação, a enzima adicional é uma alfa-amilase que tem pelo menos 70 % de identidade para a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 4, em um aspecto, a enzima adicional é uma alfa-amilase que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 4.

[0243] Em uma modalidade da composição de acordo com a revelação, a enzima compreende um variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação e uma alfa-amilase que tem pelo menos 7 0 % de identidade para a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO 4.

[0244] Em uma modalidade da composição de acordo com a revelação, a enzima adicional é uma amilase que tem pelo menos 7 0 % de identidade para a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO 5, em um aspecto, a enzima adicional é uma amilase que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 5.

[0245] Em uma modalidade da composição de acordo com a revelação, a enzima compreende um variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação e uma amilase que tem pelo menos 70 % de identidade para a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 5.

[0246] Em um aspecto da composição de enzima de acordo com a revelação, a enzima adicional é uma enzima como descrito no documento WO 9943794, em particular, como reivindicado no documento EP1058724B1.

[0247] Em uma modalidade da composição de acordo com a revelação, a enzima adicional é uma amilase que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 6,

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80/133 em um aspecto, a enzima adicional é uma amilase que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 6.

[0248] Em uma modalidade da composição de acordo com a revelação, a enzima compreende um variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação e uma amilase que tem pelo menos 70 % de identidade para a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 6.

[0249] Em uma modalidade da composição de acordo com a revelação, a enzima adicional é uma amilase que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 70 % idêntica à sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 7, em um aspecto, a enzima adicional é uma amilase que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 7.

[0250] Em uma modalidade da composição de acordo com a revelação, a enzima compreende um variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação e uma amilase que tem pelo menos 70 % de identidade para a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 7.

[0251] A revelação fornece uma composição que compreende o polipeptideo variante de acordo com a revelação ou obtenível pelo método de acordo com a revelação e uma hemicelulase, como uma xilanase.

[0252] A revelação fornece uma composição que compreende o polipeptideo variante de acordo com a revelação ou obtenível pelo método de acordo com a revelação e DATEM.

[0253] A revelação fornece um uso do polipeptideo variante de acordo com a revelação, ou da composição de acordo com a revelação, na produção de um produto alimentício, de

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81/133 preferência, na produção de uma massa e/ou um produto assado.

Uso da enzima lipolitica em processos industriais [0254] A revelação também se refere ao uso do variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação em inúmeros processos industriais. Apesar da experiência a longo prazo obtida com esses processos, o variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação apresenta inúmeras vantagens significativas nas enzimas atualmente usadas. Dependendo da aplicação específica, essas vantagens podem incluir aspectos como menores custos de produção, maior especificidade em relação ao substrato, menos antigênico, atividades colaterais menos indesejáveis, maiores rendimentos quando produzidos em um micro-organismo adequado, pH mais estável e faixas de temperatura, melhores gostos do produto final, bem como qualidade alimentar e aspectos de kosher.

[0255] De preferência, o variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação pode ser usado na indústria alimentícia, com mais preferência, na fabricação de alimentos.

Uso em aplicações industriais e aplicações de Padaria [0256] Um exemplo de uma aplicação industrial do variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação em alimentos é seu uso em aplicações de assados para aprimorar as propriedades de uma massa e ou um produto assado. Verificou-se que os variantes de enzima lipolitica de acordo com a revelação podem atuar em vários tipos de lipídios, que variam de glicerídeos (por exemplo, triglicerídeos), fosfolipídeos e/ou glicolipídeos, como

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82/133 galactolipídeos, que são relevantes em aplicações de padaria. Isso é vantajoso quando usado como um substituidor de emulsificantes quimicos em massa.

[0257] 0 uso do variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação em aplicações de padaria modifica os lipideos naturais da farinha. Isso pode resultar na estabilização aprimorada da massa. Isso pode garantir uma massa mais estável no caso de impermeabilização, um maior volume de pão e/ou estrutura aprimorada do miolo. Uma estrutura aprimorada do miolo inclui aquela da estrutura do miolo que pode se tornar mais uniforme e com células de miolo menores, a textura do miolo pode se tornar mais acetinado e/ou a cor do miolo pode parecer mais branca. 0 uso do variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação na indústria de assados reduz, de preferência, a necessidade da adição de emulsificantes como DATEM, CSL, PGME, PGE e/ou SSL que, de outro modo, são comumente adicionados à massa, por exemplo, para estabilizar a mesma. Massa [0258] 0 termo massa é definido no presente documento como uma mistura de farinha e outros ingredientes. Em um aspecto, a massa é rigida o suficiente para amassar ou enrolar. A massa pode ser fresca, congelada, preparada ou pré-assada. A preparação da massa congelada é descrita por Kulp e Lorenz em Frozen and Refrigerated Doughs and Batters .

[0259] A massa é feita usando ingredientes de massa, que incluem, sem limitação farinha (cereal), uma fonte de lecitina que inclui ovos, água, sal, açúcar, aromatizantes, uma fonte de gordura que inclui manteiga, margarina, óleo e

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83/133 gordura vegetal, o levedo do padeiro, sistemas de fermentação quimica, como uma combinação de um ácido (composto de geração) e bicarbonate, uma fonte de proteina que inclui leite, farinha de soja, oxidantes (que incluem ácido ascórbico, bromato e azodicarbonamida (ADA)), agentes de redução (que incluem L-cisteína), emulsificantes (que incluem mono/diglicerídeos, monoglicerídeos, como monostearato de glicerol (GMS), estearoil lactilato de sódio (SSL), estearoil lactilato de cálcio (CSL) , poliglicerol ésteres de ácidos graxos (PGE) e ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- e diglicerideos (DATEM), gomas (que incluem goma guar e goma xantana) , aromatizantes, ácidos (que incluem ácido citrico, ácido propanoico), amido, amido modificado, glúten, umectantes (que incluem glicerol) e conservantes.

[0260] Para produtos com fermento, em primeiro lugar, o levedo do padeiro é usado junto aos sistemas de levedação quimica, como uma combinação de um ácido (composto de geração) e bicarbonate.

[0261] Os cereais incluem milho graúdo, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveia, centeio, triticale, trigo sarraceno, quinoa, espelta, einkorn, farro, sêmola e trigo oriental.

[0262] A massa é usualmente feita de ingredientes básicos de massa que incluem farinha (cereal), como farinha de trigo ou farinha de arroz, água e opcionalmente sal. Para produtos com fermento, em primeiro lugar, o levedo do padeiro é usado junto aos sistemas de levedação química, como uma combinação de um ácido (composto de geração) e bicarbonate.

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84/133 [0263] O termo massa no presente documento inclui uma massa do tipo batter. Uma massa do tipo batter é uma mistura semilíquida, que é fina o suficiente para derramar ou cair de uma colher, de uma ou mais farinhas combinadas com líquidos, como água, leite ou ovos, usados para preparar vários alimentos, incluindo bolo.

[0264] A massa pode ser feita usando uma mistura que inclui uma mistura de bolo, uma mistura de biscoito, uma mistura de brownie, uma mistura de pão, uma mistura de panqueca e uma mistura de crepe.

[0265] 0 termo massa inclui massa retardada, aqui, a massa é armazenada a ou abaixo de 5 °C durante um período de armazenamento e recuperada para assaduras e vendas.

[0266] 0 termo massa retardada, como massa congelada. A massa congelada é tipicamente usada para fabricar produtos assados que incluem, sem limitação, biscoitos, pães, gressinos e croissants.

[0267] A massa congelada tem várias vantagens para a indústria de assados, como uma redução do trabalho noturno, melhor flexibilidade na produção e permite que as padarias ofereçam uma maior variedade de pães frescos.

[0268] Em um aspecto, a revelação se refere ao uso do variante de enzima lipolitica da revelação na preparação de uma massa congelada.

[0269] Um aspecto adicional inclui o uso do variante de enzima lipolitica da revelação para aprimorar a estrutura do miolo de um produto assado preparado a partir da massa congelada.

[0270] Um aspecto adicional inclui o uso do variante de enzima lipolitica da revelação para aumentar a estabilidade

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85/133 de massa da massa congelada.

[0271] Em um aspecto, a revelação se refere ao uso do variante de enzima lipolitica da revelação na preparação de um produto assado produzido usando farinha integral de trigo.

[0272] Um aspecto adicional inclui o uso do variante de enzima lipolitica da revelação para aprimorar a estrutura do miolo de um produto assado produzido usando farinha integral de trigo.

[0273] Um aspecto adicional inclui o uso do variante de enzima lipolitica da revelação para aumentar a estabilidade de massa de um produto assado produzido usando farinha integral de trigo.

[0274] Um aspecto adicional inclui o uso do variante de enzima lipolitica da revelação para aumentar a estabilidade de massa de um produto assado produzido usando farinha integral.

Produto assado [0275] 0 termo produto assado se refere a um produto alimenticio assado preparado a partir de uma massa.

[0276] Os exemplos de produtos assados, se de um tipo branco, marrom ou integral, que podem ser vantajosamente produzidos pela presente revelação incluem pão (em particular, pão branco, integral ou de centeio), tipicamente na forma de forma alongada ou rolos, pão do tipo baguette francesa, pastéis, croissants, brioche, panettone, pasta, macarrões (cozidos ou (salteados), pão pita e outros pães planos, tortillas, tacos, bolos, panquecas, cookies, em particular, biscoitos, rosquinhas, incluindo rosquinhas com fermento, roscas, crostas de

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86/133 torta, pão cozido a vapor, pão crocante, brownies, bolos de chapa, alimentos rápidos (por exemplo, pretzels, lascas de tortilla, lanches fabricados, salgadinhos de batata fabricados). 0 termo produto assado inclui, sem limitação, pão que contém de 2 a 30 % em peso de açúcar com base no peso de receita total, pão contendo fruta, cereais de café da manhã, barras de cereal, bolo sem ovo, rolos macios e pão sem glúten.

[0277] O termo produto assado inclui sem limitação, pão que contém de 2 a 30 % em peso de açúcar com base no peso de receita total, pão contendo fruta, cereais de café da manhã, barras cereais, bolo sem ovo, rolos macios, pão sem glúten, bolo, doughnuts, brioche, pães de hamburger, waffles de Bruxelas. Em um aspecto, os produtos assados é um produto assado que compreende sacarose, como pão que contém de 2 a 30 % em peso de açúcar com base no peso de receita total, bolo, doughnuts, brioche, pães de hamburger, waffles de Bruxelas. O pão sem glúten no presente documento e posteriormente é o pão que contém no máximo 20 ppm de glúten. Vários grãos e fontes de amido são considerados aceitáveis para uma dieta sem glúten. As fontes frequentemente usadas são batatas, arroz e tapioca (derivada da mandioca). Um produto assado no presente documento inclui, sem limitação, pão de forma, forma alongada de pão, torções, pães redondos, como pães de hamburger ou pães cozidos a vapor, chapati, rosca, fatia de pão de vapor seco, miolo de pão, pão ázimo, focaccia, torradas integrais, zwieback, croutons, pretzels moles, pão macio e duro, gressinos, pão com fermento quimico e com fermento fúngico, produtos quimicos laminados, como bolos

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87/133 dinamarqueses, croissants ou produtos de massa folhada, muffins, bagels, coberturas de confeitaria, bolachas, wafers, crostas de pizza, tortillas, produtos de pasta, crepes, waffles, produtos pré-cozidos. Um exemplo de um produto pré-cozido inclui, sem limitação, pão parcialmente assado que é concluído no momento da venda ou consumo com um curto processo de assadura em segundo. Um produto assado no presente documento inclui, sem limitação, bolo de libra, bolo de manteiga, pão de ló, muffin, bolo de biscoito, rocambole, genoise e bolo chiffon, bolos de espuma.

[0278] 0 pão pode ser pão de forma branco ou marrom; tal pão pode, por exemplo, ser fabricado usando um denominado método de Massa e Esponja estilo americano ou método Direto estilo americano. 0 pão pode ser um pão de massa azeda. [0279] 0 termo tortilla no presente documento inclui tortilla de milho e tortilla de trigo. Uma tortilla de milho é um tipo de pão plano e fino, usualmente sem fermento feito de milho graúdo finamente triturado (usualmente chamado de milho nos Estados Unidos). Uma tortilla de farinha é um tipo de pão fino e plano, usualmente sem fermento, feito de farinha de trigo finamente triturada. 0 termo tortilla inclui adicionalmente um pão similar da América do Sul chamado arepa, as arepas são tipicamente muito mais espessas que as tortillas. 0 termo tortilla inclui adicionalmente um tipo de pão ázimo, uma panqueca fina em formato de pizza da China e um Roti indiano, que é feito essencialmente de farinha de trigo. Uma tortilla usualmente tem um formato redondo ou oval e pode ter diâmetro variável de cerca de 6 a mais de 30 cm.

[0280] A revelação fornece um uso em que o uso compreende

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88/133 substituir pelo menos parte de um emulsificador químico na produção de uma massa e/ou um produto assado.

[0281] Tal uso pode substituir completamente um emulsificador químico na fabricação de uma massa e/ou um produto assado. 0 uso pode ser para substituir pelo menos parte de DATEM na fabricação de uma massa e/ou um produto assado. 0 variante de enzima lipolítica de acordo com a revelação pode ser usado para substituir completa ou parcialmente o emulsificador DATEM. DATEM é o acrônimo para ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- e diglicerídeos. Um dos componentes principais em DATEM pode ser l-estearoil-3-diacetiltartril-glicerol.

[0282] 0 uso pode ser para substituir pelo menos parte de SSL e/ou CSL na fabricação de uma massa e/ou produto assado.

[0283] A revelação fornece um uso em que o uso é para a fabricação de um produto assado sem emulsificador químico ou emulsificador químico baixo.

[0284] Um produto assado de emulsificador químico baixo é um produto assado, como pão que compreende abaixo de 0,3 % em peso com base no emulsificador químico de farinha (como DATEM, SSL e/ou CSL) .

[0285] 0 termo sem emulsificador indica uso zero de emulsificador químico.

[0286] A revelação fornece uma massa que compreende o polipeptideo variante de acordo com a revelação, um polipeptideo variante obtenível pelo método de acordo com a revelação ou a composição de acordo com a revelação.

[0287] A preparação de uma massa dos ingredientes de massa é bem conhecida na técnica e inclui misturar os ditos

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89/133 ingredientes de massa e opcionalmente uma ou mais etapas de levedura e modulação.

[0288] A preparação de uma massa de acordo com a revelação pode compreender a etapa de combinar o variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação ou a composição de acordo com a revelação ou a pré-mistura de acordo com a revelação e pelo menos um ingrediente de massa. Combinar inclui, sem limitação, adicionar o polipeptídeo ou a composição de acordo com a revelação a pelo menos um ingrediente de massa, adicionar o pelo menos um ingrediente de massa ao variante de enzima lipolitica ou a composição de acordo com a revelação, misturar o variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação e o pelo menos um ingrediente de massa.

[0289] As enzimas podem ser combinadas com o pelo menos um ingrediente de massa em uma forma seca, por exemplo, granulada, em uma forma líquida, na forma de tablete ou na forma de uma pasta. Os aditivos são, na maioria dos casos, adicionados em forma de pó. Uma forma granulada ou pó aglomerado que compreende o variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação tem, de preferência, uma distribuição de tamanho de partícula estreita com mais que 95 % (em peso) das partículas na faixa de 25 a 500 μπι.

[0290] 0 variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação pode ser adicionado a uma massa, qualquer ingrediente a partir do qual a massa deve ser feita e/ou qualquer mistura de ingredientes de massa a partir da qual a massa deve ser feita. Em outras palavras, o variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação pode ser adicionado em qualquer etapa da preparação de massa e pode

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90/133 ser adicionado em uma, duas ou mais etapas.

[0291] A incorporação de uma quantidade eficaz da enzima lipolitica de acordo com a revelação em uma massa de preferência reduz a necessidade da adição de emulsificantes como DATEM e/ou SSL que, de outro modo, são completamente adicionados à massa a fim de estabilizar a mesma.

[0292] 0 termo quantidade eficaz é definido no presente documento com uma quantidade do variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação que é suficiente para fornecer um efeito mensurável em pelo menos uma propriedade de interesse da massa e/ou produto assado.

[0293] Uma quantidade eficaz da composição de acordo com a revelação um definidos no presente documento como uma quantidade da composição de acordo com a revelação que é suficiente para fornecer um efeito mensurável em pelo menos uma propriedade de interesse da massa e/ou produto assado. Uma quantidade eficaz para pão do variante de enzima lipolitica inclui 10-50 DLU por kg de farinha. Uma quantidade eficaz para pão do variante de enzima lipolitica inclui 400-700 DLU por kg de manteiga (peso total dos ingredientes).

[0294] DLU é definido como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 micromol/min de p-nitrofenol de palmitato de p-nitrofenila com pH 8,5 a 37 °C. DLU pode ser medido analogamente como descrito no Ensaio 8A.

[0295] A revelação fornece um processo para a produção de uma massa que compreende a etapa de combinar uma quantidade eficaz do polipeptídeo variante de acordo com a revelação, uma quantidade eficaz do polipeptídeo variante obtenível pelo método de acordo com a revelação ou quantidade eficaz

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91/133 da composição de acordo com a revelação com pelo menos um ingrediente de massa.

[0296] Se uma ou mais enzimas adicionais forem usadas no processo para a produção uma massa, essas podem ser adicionadas separadamente ou em conjunto com o variante de enzima lipolítica de acordo com a revelação, opcionalmente como constituinte (ou constituintes) da composição de aprimoramento de massa e/ou aprimoramento de pão. As enzimas adicionais podem ser dosadas de acordo com as práticas de assadura estabilizadas.

[0297] A revelação fornece um processo para a produção de um produto assado, cujo método compreende assar a massa de acordo com a revelação ou a massa obtida pelo processo da revelação.

[0298] 0 variante de enzima lipolítica e/ou a composição de acordo com a revelação podem ser usados na preparação de uma ampla faixa de bolos, incluindo bolos encurtados, como, por exemplo, bolo de libra e bolo de manteiga, e incluindo bolos de espuma, como, por exemplo, merengues, pão de ló, bolo de biscoito, rocambole, genoise e bolo chiffon. 0 variante de enzima lipolítica e/ou a composição de acordo com a revelação podem ser usados na preparação de um muffin. Pão de ló é um tipo altamente aerado de bolo macio à base de farinha de trigo, açúcar e ovos (e opcionalmente fermento em pó e gordura ou óleo) . É frequentemente usado como uma base para outros tipos de bolos e sobremesas. Um bolo de libra é tradicionalmente preparado a partir de 453,59 g (uma libra) de farinha, manteiga, ovos e açúcar, opcionalmente complementado com fermento em pó. 0 açúcar e a gema do ovo são diminuídos em comparação a 453,59 g (uma

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92/133 libra) ou pão de ló e ο teor de ovo branco é aumentado.

[0299] Um método para preparar uma massa compreende, de preferência, as etapas de:

a. preparar a massa do bolo pela adição de pelo menos:

i. açúcar;

ii. farinha;

iii. o variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação;

iv. pelo menos um ovo; e

v. opcionalmente uma gordura.

[0300] A gordura inclui, manteiga, margarina, óleo e gordura vegetal. Os ingredientes opcionais incluem amido, componentes de leite e/ou emulsificador.

[0301] Um método para preparar um bolo de acordo com a revelação compreende adicionalmente a etapa de

b. assar a massa para obter um bolo.

[0302] A pessoa versada na técnica sabe como preparar uma massa ou um bolo a partir dos ingredientes de massa.

[0303] 0 variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação pode ser usado tanto em bolos regulares quanto em bolos em que a quantidade de ovos e/ou gordura foi reduzida. A redução da quantidade de ovos e/ou gordura que é possivel difere por tipo de bolo. A pessoa versada na técnica sabe a quantidade de ovos e/ou gordura que está presente regularmente em receitas de bolo e que é dependente do tipo de bolo. Por exemplo, uma redução da quantidade de ovos de pelo menos 5 % p/p com base no peso total da massa pode ser alcançada. Por exemplo, uma redução da quantidade de ovos de pelo menos 10 % p/p pode ser alcançada, em um aspecto adicional, uma redução de pelo

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93/133 menos 20 % p/p da quantidade de ovos pode ser alcançada. Por exemplo, uma redução da quantidade de gordura de pelo menos 10 % p/p com base no peso total da massa pode ser alcançada. Por exemplo, uma redução da quantidade de gordura de pelo menos 20 % pode ser alcançada. Em um aspecto adicional, uma redução de pelo menos 30 % de gordura pode ser alcançada.

[0304] O variante de enzima lipolitica de acordo com a revelação pode ser usado para reduzir a quantidade de ovo na preparação do bolo.

[0305] Em um aspecto do método para preparar uma massa, a massa compreende entre 3 e 25 % em peso do ovo inteiro com base no peso total da massa. Em um aspecto do método para preparar uma massa, a massa compreende entre 4 e 20 % em peso do ovo inteiro com base no peso total da massa. Em um aspecto do método para preparar uma massa, a massa compreende entre 5 e 15 % em peso do ovo inteiro com base no peso total da massa. Em um aspecto do método para preparar uma massa, a massa compreende entre 6 e 12 % em peso do ovo inteiro com base no peso total da massa.

Modalidades da revelação:

[0306]

1. Um polipeptideo variante que tem atividade lipolitica, em que o variante tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um residue de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ

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ID NO: 2, e em que o dito variante tem pelo menos 7 0 % de identidade com o polipeptideo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

2. Um polipeptideo variante de acordo com a modalidade 1, em que o polipeptideo de referência compreende a enzima lipolitica madura como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

3. Um polipeptideo variante de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que o polipeptideo de referência é a enzima lipolitica madura como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

4. Um polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o polipeptideo maduro compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

5. Um polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o polipeptideo maduro tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

6. Um polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação com um polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica.

7. Um polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que o variante demonstra uma razão aumentada da atividade em lipideos polares: atividade em lipideos não polares em comparação com o polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica medida sob as mesmas condições.

8. Um polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7 que, quando alinhado com a sequência

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95/133 de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 141, 179, 282, 284, 295.

9. Um polipeptídeo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8 que, quando alinhado com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 179, 282, 284, 295.

10. Um polipeptídeo variante de acordo com a modalidade 7 ou 8 que, quando alinhado com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 141, 179, 282, 284, 295, e em que o variante demonstra uma razão aumentada da atividade em lipídeos polares: da atividade em lipídeos não polares determinada com pH 5,5 como comparado ao polipeptídeo de referência que tem atividade lipolitica.

11. Um polipeptídeo variante de acordo com a modalidade 7 ou 8 que, quando alinhado com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295 e em que o variante demonstra uma razão aumentada da atividade em lipídeos polares: da atividade em lipídeos não polares determinada com pH 8 como comparado ao polipeptídeo de referência que tem atividade lipolitica.

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96/133

12. Um polipeptideo variante de acordo com a modalidade 7 ou 8 que, quando alinhado com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, e em que o variante demonstra uma razão aumentada da atividade em galactolipídeos: da atividade em triglicerídeos como comparado ao polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica.

13. Um polipeptideo variante de acordo com a modalidade 7 ou 8 que, quando alinhado com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, e em que o variante demonstra uma razão aumentada da atividade em fosfolipídeos: da atividade em triglicerídeos como comparado ao polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica.

14. Um polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13 que, quando alinhado com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende uma ou mais das substituições de aminoácido selecionadas a partir de

I113H

I113L

I113N I113R I113T

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L122A

L122M

H138E

H138S

F141M

F141Y

V17 9L

V17 9M

V179S

L282E

L282F

L282K

L282M

L282N

L282R

L282S

L282T

I284A

I284D

I284E

I284M

I284N

I284P

I284Q

I284S

I284T

A2 8 6L

D295E

D295G

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98/133

D295N

D295S

15. Um polipeptídeo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que o variante tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende uma ou mais das substituições de aminoácido

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16. Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo variante de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.

17. Um construto de ácido nucleico que compreende a sequência de ácidos nucleicos da modalidade 16 operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle com capacidade de direcionar a expressão de uma enzima lipolítica em um hospedeiro de expressão adequado.

18. Um vetor de expressão recombinante que compreende o construto de ácido nucleico da modalidade 17.

19. Uma célula hospedeira recombinante que compreende o vetor de expressão da modalidade 18.

20. Um método para produzir um variante de polipeptídeo lipolítico de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15 que compreende cultivar a célula hospedeira da modalidade 19 sob condições favoráveis à produção do variante de enzima lipolítica e recuperar o variante de enzima lipolítica.

21. Um método para produzir um variante de polipeptídeo lipolítico, cujo método compreende:

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a) selecionar um polipeptideo que tem atividade lipolitica;

b) substituir pelo menos um resíduo de aminoácido que corresponde a qualquer um dentre 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295 as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2;

c) opcionalmente, substituir um ou mais aminoácidos adicionais, como definido no item b);

d) preparar o variante resultante das etapas a)-c);

e) determinar a razão da atividade em lipídeos polares: da atividade em lipídeos não polares do variante e de um polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica sob as mesmas condições; e

f) selecionar um variante que tem uma razão aumentada da atividade em lipídeos polares: da atividade em lipídeos não polares em comparação ao polipeptideo de referência, produzindo, através disso, um variante de polipeptideo lipolítico.

22. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 66 a 72 em que na etapa b) a substituição, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende um ou mais dentre

I113H

I113L

I113N

I113R

I113T

L122A

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101/133

L122M

H138E

H138S

F141M

F141Y

V179L

V17 9M

V179S

L282E

L282F

L282K

L282M

L282N

L282R

L282S

L282T

I284A

I284D

I284E

I284M

I284N

I284P

I284Q

I284S

I284T

A2 8 6L

D295E

D295G

D295N

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D295S as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2, e em que o variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação com um polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica.

23. Uma composição que compreende o polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15 ou obtenível pelo método de acordo com 21 ou 22 e um ou mais componentes selecionados a partir do grupo que consiste em leite em pó, glúten, gordura granulada, uma enzima adicional, um aminoácido, um sal, um oxidante, um agente de redução, um emulsificador, estearoil lactilato de sódio, estearoil lactilato de cálcio, poliglicerol ésteres de ácidos graxos e ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- e diglicerídeos, uma goma, um aromatizante, um ácido, um amido, um amido modificado, um umectante e um conservante.

24. Uma composição de acordo com a modalidade 24 em que a enzima adicional é selecionada a partir de uma enzima lipolitica adicional; uma amilase, como um alfa-amilase, por exemplo, um alfa-amilase fúngica, uma beta-amilase; uma glucanotransferase; uma peptidase, em particular, uma exopeptidase; uma transglutaminase; uma celulase; uma hemicelulase, em particular, uma pentosanase como xilanase; protease; uma proteína dissulfeto isomerase; uma glicosiltransferase; uma peroxidase; uma laccase; uma oxidase, como uma hexose oxidase, uma glicose oxidase, aldose oxidase, piranose oxidase; uma lipoxigenase; L

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103/133 aminoácido oxidase e uma asparaginase.

25. Uma pré-mistura que compreende farinha e o polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15, o polipeptideo variante obtenível pelo método de acordo com a modalidade 21 ou 22 ou a composição de acordo com a modalidade 23 ou 24.

26. Um uso do polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15, ou da composição de acordo qualquer uma das modalidades 23 ou 24, ou da prémistura de acordo com a modalidade 25 na fabricação de um produto alimentício, de preferência, na fabricação de uma massa e/ou um produto assado.

27. O uso de acordo com a modalidade 26, em que o uso compreende substituir pelo menos parte de um emulsificador químico na fabricação de uma massa e/ou um produto assado.

28. O uso de acordo com a modalidade 26, em que o uso consiste em substituir completamente um emulsificador químico na fabricação de uma massa e/ou um produto assado.

29. O uso de acordo com a modalidade 27 ou 28, em que o uso compreende substituir pelo menos parte de DATEM na fabricação de uma massa e/ou um produto assado.

30. O uso de acordo com a modalidade 27 ou 28, em que o uso compreende substituir pelo menos parte de SSL e/ou CSL na fabricação de uma massa e/ou produto assado.

31. O uso do polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15, ou da composição de acordo com qualquer uma das modalidades 2 3 ou 24, ou da pré-mistura de acordo com a modalidade 25 na fabricação de um produto assado livre de emulsificador químico ou emulsificador químico baixo.

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104/133

32. O uso de acordo com a modalidade 31, em que ο produto assado foi produzido usando farinha integral de trigo e/ou grão integral.

33. O uso de acordo com qualquer uma das modalidades 26 a 32 em que o produto assado foi produzido a partir de uma massa congelada.

34. O uso de acordo com a modalidade 31 e/ou 32 em que o emulsificador químico consiste em mono- e diglicerídeos de ácidos graxos ou monoglicerídeos estearoil lactilato de sódio destilado (SSL), estearoil lactilato de cálcio (CSL), poliglicerol ésteres de ácidos graxos (PGE), monoésteres de propileno glicol de ácidos graxos (PGME) e ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- e diglicerídeos (DATEM) ou lecitina.

35. O uso de acordo com qualquer uma das modalidades 2 6 a 34, em que o uso consiste em aumentar o volume de um produto assado.

36. O uso de acordo com qualquer uma das modalidades 26 a 34, em que o uso consiste em reduzir a dureza de um produto assado.

37 .	0	uso de	acordo com qualquer uma das modalidades
26 a 34,	em	que o	uso consiste em criar uma estrutura mais
delicada 38 .	do 0	miolo uso de	de um produto assado. acordo com qualquer uma das modalidades
2 6 a 34, em que o de uma massa. 39. 0 uso de	uso consiste em aumentar a estabilidade acordo com qualquer uma das modalidades
26 a 38, 40 .	em 0	que o uso de	produto assado é pão, bolo e/ou pastel. acordo com qualquer uma das modalidades
26 a 34,	39	, em que o uso consiste em reduzir a quantidade

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105/133 de ovo na preparação do bolo.

41. Uma massa que compreende um polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15, o polipeptideo variante obtenivel pelo método de acordo com a modalidade 21 ou 22, a composição de acordo com a modalidade 23 ou 24, ou a pré-mistura de acordo com a modalidade 25.

42. Um processo para preparar uma massa que compreende a etapa de combinar uma quantidade eficaz do polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15, uma quantidade eficaz do polipeptideo variante obtenivel pelo método de acordo com a modalidade 21 ou 22, uma quantidade eficaz da composição de acordo com a modalidade 23 ou 24 ou uma quantidade eficaz da pré-mistura de acordo com a modalidade 25 com pelo menos um ingrediente de massa.

43. Um processo para a produção de um produto assado, que o método compreende assar a massa de acordo com a modalidade 41 ou a massa obtida pelo processo da modalidade 42 .

44. O processo de acordo com a modalidade 43, em que o produto assado é pão, bolo e/ou pastel.

45. Um produto assado obtenivel pelo processo de acordo com a modalidade 43 ou 44, ou pelo uso de acordo com qualquer uma das modalidades 26 a 40.

46. Um processo para a produção de um produto alimenticio, que o método compreende adicionar o polipeptideo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15, o polipeptideo variante obtenivel pelo método de acordo com a modalidade 21 ou 22, a composição de acordo com a modalidade 23 ou 24 ou a pré-mistura de acordo

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106/133

com a modalidade	25	a um	ingrediente	de	um	produto
alimentício.
47. Um processo	para	a produção	de	um	produto
alimentício, que	o	método	compreende	adicionar uma

quantidade eficaz do polipeptídeo variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15, uma quantidade eficaz do polipeptídeo variante obtenível pelo método de acordo com a modalidade 21 ou 22, uma quantidade eficaz da composição de acordo com a modalidade 2 3 ou 2 4 ou uma quantidade eficaz da pré-mistura de acordo com a modalidade 25 a um ingrediente de um produto alimentício.

[0307] Uma referência, no presente documento, a um documento de patente ou outra matéria que é dada como estado da técnica não deve ser considerada como uma admissão de que aquele documento ou matéria eram conhecidos ou que as informações contidas neles eram parte do conhecimento comum geral na data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.

[0308] A divulgação de cada referência apresentada no presente documento é incorporada aqui, por referência, em sua totalidade.

[0309] A presente revelação é adicionalmente ilustrada pelos seguintes Exemplos:

EXEMPLOS

Técnicas de biologia molecular e procedimentos gerais [0310] As técnicas de clonagem molecular padrão, como isolamento de DNA, eletroforese em gel, modificações de restrição enzimática de ácidos nucleicos, transformação de E.coli etc., foram realizadas como descrito por Sambrook et al., 1989 (2^a ed) e 2001 (3^a ed) , Molecular cloning: a

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107/133 laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York e Innes et al. (1990) Protocolos PCR, um guia para os métodos e aplicações, Academic Press, San Diego, EUA. Os exemplos do projeto geral de vetores de expressão para superexpressão de gene e vetores de interrupção para regulação descendente, transformação, uso de marcadores, Cepas e meios seletivos podem ser encontrados nos documentos WO199846772, WO199932617, W02001121779, WO2005095624, WO2006040312, EP 635574B, W02005100573, WO2011009700, W02012001169, WO2013135729, W02014013073 e W02014013074. Após transformação, as repetições diretas permitem a remoção do marcador de seleção por um (segundo) evento de recombinação homóloga. A remoção de um marcador, como amdS, pode ser feita pelo plaqueamento de meios de fluoro-acetamida, resultando na seleção de cepas livres de gene marcador (consulte também MARKER-GENE FREE abordado em EP 0 635 574). Alternativamente, um marcador pode ser removido, por exemplo, usando uma recombinase como detalhado no documento WO2013135729. Com uso dessas estratégias de transformação e remoção de marcador subsequente, um marcador pode ser usado indefinidamente em programas de modificação de cepa.

Cepas [0311] WT 1: Essa cepa Aspergillus niger é usada como uma cepa do tipo selvagem. Essa cepa é depositada em CBS Institute sob o número de depósito CBS 513.88.

[0312] GBA 30 6: A construção de GBA 30 6 usando WT1 como cepa de partida foi descrita em detalhes no documento WO2011 /009700 . Essa cepa GBA 306 tem o seguinte genótipo: AglaA, ApepA, HhdfA, um amplicon SamHI adaptado, AamyBII,

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AamyBI, e âamyA.

Ensaios bioquímicos

Materiais e Métodos [0313] 0 polipeptídeo de referência usado nos exemplos é um polipeptídeo de referência que tem atividade lipolitica e que tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

[0314] As propriedades dos variantes de enzima lipolitica foram testadas usando vários substratos. Esses incluem os seguintes:

- Fosfatidilcolinas, que podem ser abreviadas como PC;

- Digalactosildiglicerídeos, que podem ser abreviados como DGDG;

- Monogalactosildiglicerídeos, que podem ser abreviados como MGDG; e

- Triacilgliceróis que podem ser abreviados como TAG. Trioleína é aplicada em ensaios descritos no presente documento como um representativo de triglicerídeos.

- linoleato de para—nitrofenile (pNP-linoleato), que também pode ser chamado no presente documento de um éster de C18:2 ácido graxo;

- oleato de para—nitrofenila (pNP-oleato) , que também pode ser chamado no presente documento de um éster de C18:l ácido graxo;

- estearato de para-nitrofenil (pNP-estearato) , que também pode ser chamado no presente documento de um éster de C18:0 ácido graxo;

- palmitato de para—nitrofenil (pNP-palmitato) , que também pode ser chamado no presente documento de um éster de C16:0 ácido graxo;

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- butirato de para—nitrofenil (pNP-butirato), que também pode ser chamado no presente documento de um éster de C4 ácidos graxos;

Ensaio IA Atividade de fosfolipase com pH 5,5 [0315] A atividade enzimática do variante de enzima lipolitica e do polipeptideo parental (também chamado de polipeptideo de referência) pode ser expressa em Unidades de NEFA. Uma Unidade (U) é definida como a quantidade de enzima que libera um micromol de ácido graxo livre por minuto sob as condições de ensaio definidas.

[0316] 0 principio do ensaio é conforme segue: Uma mistura de enzima, tampão, substrato e cloreto de cálcio é incubada a 37 °C por 10 minutos. A reação é interrompida pela adição de uma solução ácida. A quantidade de ácidos graxos livres formados é subsequentemente determinada usando o principio do kit NEFA (Conjunto RI de NEFA-HR (2), 434-91795, Conjunto R2 de NEFA-HR (2), 436-91995, padrão de NEFA, 270-77000, todos de Wako Chemicals). O princípio do método de NEFA é da seguinte forma: O ácido graxo não esterificado (NEFA) na amostra de reação é convertido para acil-CoA, AMP e ácido pirofosfórico (PPi) pela ação de acil-CoA sintetase (ACS), na presença de coenzima A (CoA) e sal dissódico de 5-trifosfato de adenosina (ATP). Acil-CoA é oxidada para formar 2,3-trans-Enoil-CoA e peróxido de hidrogênio pela ação de acil-CoA oxidase (ACOD). Na presença de peroxidase (POD), o peróxido de hidrogênio formado produz um pigmento azul-púrpura após a condensação de oxidação quantitativa com 3-metil-N-etil-N-(βhidroxietil)-anilina (MEHA) e 4-aminoantipirina (4-AA). A concentração de ácidos graxos não esterifiçados (NEFA) é

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110/133 obtida pela medição de absorbância da cor azul-púrpura. O padrão de NEFA consiste em uma solução de ácido oleico, que é usado para produzir uma linha de calibração para calcular a quantidade de ácidos graxos livres. O método de NEFA é realizado no analisador Konelab Arena 30 (Thermo Scientific, Vantaa, Finlândia) e a intensidade da cor é medida em 540 nm. A absorbância de amostra de reação é corrigida pela subtração da absorbância de um espaço vazio de amostra de reação apropriado como descrito abaixo.

[0317] As amostras de enzima foram diluidas para uma faixa entre 0,05 - 1,5 U/ml em 0,2 M de tampão de acetato pH 5,5. Para cada amostra de reação e espaço vazio de amostra de reação, tubos de vidro que contêm 50 microlitros de uma solução de cloreto de cálcio de 0,1 M, 500 microlitros de solução de substrato (1 % (p/v) de L-alfafosfatidilcolina (P3556, Sigma Aldrich) em 2 % de Triton X100), e 250 microlitros de tampão de acetato de 0,2 M com pH 5,5 foram preparados. Esses foram pré-aquecidos por 10 minutos em um banho de água a 37 °C. A reação foi iniciada pela adição de 100 microlitros de amostra de enzima ao tubo de vidro. 10 minutos após a adição de amostra de enzima, 100 microlitros de 2,0 M de HC1 foram adicionados, o tubo foi imediatamente removido do banho de água e misturado bem por vórtice para terminar a reação. Para cada amostra de reação, um espaço vazio de amostra de reação correspondente foi preparado por incubação de tampão, substrato e cloreto de cálcio a 37 °C. Após 10 minutos, 100 microlitros de 2,0 M de HC1 foram adicionados, o tubo foi imediatamente removido do banho de água e misturado bem por vórtice. Desse modo, 100 microlitros de amostra de enzima foram

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111/133 adicionados ao tubo e misturados bem por vórtice.

[0318] Os ácidos graxos livres liberados foram determinados de acordo com as instruções de kit HR Series NEFA-HR (2), que foram adequadas para aplicação de analisador da seguinte forma. 150 microlitros de reagente NEFA-R1 foram pré-aquecidos por 300 segundos. Desse modo, 10 microlitros de amostra de reação foram adicionados e a incubação continuou por 180 segundos. Subsequentemente, 75 microlitros de reagente NEFA-R2 foram adicionados e a incubação continuou por 270 segundos. Nesse momento, a absorbância foi medida a 540 nm. A absorbância de cada amostra de reação foi corrigida pela subtração da absorbância do espaço vazio de amostra de reação correspondente. A quantidade de ácidos graxos não esterifiçados foi calculada usando uma linha de calibração de ácido oleico.

Ensaio 1B Atividade de fosfolipase com pH 8,0 [0319] A atividade enzimática do variante de enzima lipolitica e do polipeptídeo parental (também chamado de polipeptídeo de referência) pode ser expressa em Unidades de NEFA. Uma Unidade (U) é definida como a quantidade de enzima que libera um micromol de ácido graxo livre por minuto sob as condições de ensaio definidas.

[0320] O princípio do ensaio é conforme segue: Uma mistura de enzima, tampão, substrato e cloreto de cálcio é incubada a 37 °C por 10 minutos. A reação é interrompida pela adição de uma solução ácida. A quantidade de ácidos graxos livres formados é subsequentemente determinada usando o princípio do kit NEFA (Conjunto RI de NEFA-HR (2), 434-91795, Conjunto R2 de NEFA-HR (2), 436-91995, padrão de

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NEFA, 270-77000, todos de Wako Chemicals). O princípio do método de NEFA é da seguinte forma: O ácido graxo não esterificado (NEFA) na amostra de reação é convertido para acil-CoA, AMP e ácido pirofosfórico (PPi) pela ação de acil-CoA sintetase (ACS), na presença de coenzima A (CoA) e sal dissódico de 5-trifosfato de adenosina (ATP). Acil-CoA obtida é oxidada e produz 2,3-trans-Enoil-CoA e peróxido de hidrogênio pela ação de acil-CoA oxidase (ACOD). Na presença de peroxidase (POD), o peróxido de hidrogênio formado produz um pigmento azul-púrpura após a condensação de oxidação quantitativa com 3-metil-N-etil-N-(βhidroxietil)-anilina (MEHA) e 4-aminoantipirina (4-AA). A concentração de ácidos graxos não esterifiçados (NEFA) é obtida pela medição de absorbância da cor azul-púrpura. O padrão de NEFA consiste em uma solução de ácido oleico, que é usado para produzir uma linha de calibração para calcular a quantidade de ácidos graxos livres. O método de NEFA é realizado no analisador Konelab Arena 30 (Thermo Scientific, Vantaa, Finlândia) e a intensidade da cor é medida em 540 nm. A absorbância de amostra de reação é corrigida pela subtração da absorbância de um espaço vazio de amostra de reação apropriado como descrito abaixo.

[0321] As amostras de enzima foram diluídas para uma faixa entre 0,05 - 1,5 U/ml em 0,2 M de Tris-HCl com pH 8,0. Para cada amostra de reação e espaço vazio de amostra de reação, os tubos de vidro que contêm 50 microlitros de uma solução de cloreto de cálcio de 0,1 M, 500 microlitros de solução de substrato (1 % (p/v) de L-alfafosfatidilcolina (P3556, Sigma Aldrich) em 2 % de Triton X100) e 250 microlitros de 0,2 de M Tris-HCl com pH 8,0

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113/133 foram preparados. Esses foram pré-aquecidos por 10 minutos em um banho de água a 37 °C. A reação foi iniciada pela adição de 100 microlitros de amostra de enzima ao tubo de vidro. 10 minutos após a adição de amostra de enzima, 100 microlitros de 2,0 M de HC1 foram adicionados, o tubo foi imediatamente removido do banho de água e misturado bem por vórtice para terminar a reação. Para cada amostra de reação, um espaço vazio de amostra de reação correspondente foi preparado por incubação de tampão, substrato e cloreto de cálcio a 37 °C. Após 10 minutos, 100 microlitros de 2,0 M de HC1 foram adicionados, o tubo foi imediatamente removido do banho de água e misturado bem por vórtice. Desse modo, 100 microlitros de amostra de enzima foram adicionados ao tubo e misturados bem por vórtice.

[0322] Os ácidos graxos livres liberados foram determinados de acordo com as instruções de kit HR Series NEFA-HR (2), que foram adequadas para aplicação de analisador. 150 microlitros de reagente NEFA-R1 foram préaquecidos por 300 segundos. Desse modo, 10 microlitros de amostra de reação foram adicionados e a incubação continuou por 180 segundos. Subsequentemente, 75 microlitros de reagente NEFA-R2 foram adicionados e a incubação continuou por 270 segundos. Nesse momento, a absorbância foi medida a 540 nm. A absorbância de cada amostra de reação foi corrigida pela subtração da absorbância do espaço vazio de amostra de reação correspondente. A quantidade de ácidos graxos não esterifiçados foi determinada em relação a uma linha de calibração de ácido oleico.

Ensaio 2A Atividade de galactolipase com pH 5,5 [0323] Como sob o ensaio IA, exceto o substrato que

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114/133 consiste em 1 % (p/v) de Digalactosildiglicerideo (DGDG, baseado em planta, de Lipid Products), em 2 % de Triton X100 .

Ensaio 2B Atividade de galactolipase com pH 8,0 [0324] Como sob o ensaio 1B, exceto o substrato que consiste em 1 % (p/v) de Digalactosildiglicerideo (DGDG, baseado em planta, de Lipid Products), em 2 % de Triton X100 .

Ensaio 3A Atividade de TAG-lipase com pH 5,5 [0325] Como sob o ensaio IA, exceto o substrato que consiste em uma solução aquosa com 4,5 mM de Trioleína, 1,0 M de NaCl, 13 % (p/v) de Triton X-100 (62314, Sigma

Aldrich) .

Ensaio 3B Atividade de TAG-lipase com pH 8,0 [0326] Como sob o ensaio 1B, exceto o substrato que consiste em uma solução aquosa com 4,5 mM de Trioleína, 1,0 M de NaCl, 13 % (p/v) de Triton X-100 (62314, Sigma

Aldrich) .

Ensaio 4A Atividade lipolítica em pNP-linoleato com pH 5,5 [0327] A atividade enzimática do variante de enzima lipolítica e do polipeptídeo parental (também chamado de polipeptídeo de referência) pode ser expressa em Unidades de pNP (4-nitrofenol) . Uma Unidade (U) é definida como a quantidade de enzima que libera um micromol de 4-nitrofenol por minuto sob as condições do teste.

[0328] O princípio do ensaio é conforme segue: Para a amostra de reação, uma mistura de enzima e solução de substrato é incubada a 25 °C por 30 minutos. Durante o tempo de incubação, a absorbância a 348 nm (Abs 348nm) é medida. A inclinação inicial (Delta Abs 348nm) da medição de

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115/133 parte da absorbância linear da amostra de reação é corrigida com a inclinação inicial (Delta Abs 348nm) de um espaço vazio de amostra de reação apropriado como descrito abaixo. Uma linha de calibração é medida da seguinte forma uma mistura de tampão e solução de substrato é incubada a 25 °C por 30 minutos. Durante o tempo de incubação, a absorbância a 348 nm (Abs 348nm) é medida. Para a linha de calibração, o mesmo volume de tampão e substrato são usados como para a amostra de reação, mas, em vez da enzima 4nitrofenol ser usada. Para a linha de calibração, uma faixa de 0-10 mM de 4-nitrofenol é usada. A absorbância das amostras de calibração é plotada contra sua concentração e a inclinação inicial (Delta Abs 348nm) da parte linear é calculada.

[0329] A atividade da enzima é obtida pela divisão da inclinação inicial da amostra de reação pela inclinação inicial da linha de calibração. Isso gera a atividade da enzima em mM/min.

[0330] A solução de substrato foi preparada da seguinte forma: Uma solução de 8,0 mM do substrato cromogênico em 2propanol foi feita. Subsequentemente, 3,5 ml dessa solução foram adicionados a 4 6,5 ml de tampão de acetato de sódio em 100 milimol/1 com pH 5,5 que contém 1 % de Triton X-100, sob agitação vigorosa. O substrato foi pNP-linoleato (>95 % puro, de Syncom, Paises Baixos).

[0331] A enzima foi diluida em 100 milimol/1 de tampão de acetato de sódio com pH 5,5 que contém 1 % de Triton X100, de modo que o aumento de absorbância após 30 minutos seja menor que 1,0. A reação foi iniciada pela mistura de 10 microlitros de amostra de enzima diluida com 240

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116/133 microlitros de solução de substrato em uma placa de microtitulação. 200 microlitros dessa mistura foram adicionados a uma nova placa de microtitulação, colocados em um leitor de placa de microtitulação TECAN Infinite M1000, a temperatura é mantida a 25°C, e a alteração em absorbância da mistura foi medida por 30 minutos a 348 nm (ponto isosbéstico de 4-nitrofenol). O espaço vazio de amostra de reação foi preparado pela adição de 10 microlitros de tampão de acetato de sódio com pH 5,5 em vez de amostra de enzima à solução de substrato e seguindo, então, as etapas idênticas como descrito acima para a reação de enzima. Uma linha de calibração foi produzida a partir de 4-nitrofenol dissolvido em 100 milimol/1 de tampão de acetato de sódio com pH 5,5 que contém 1 % de Triton X-l00.

[0332] A absorbância das amostras de reação foi plotada contra o tempo. A inclinação foi determinada sobre a medição de parte da absorbância linear inicial. A inclinação inicial das amostras de reação foi corrigida pela subtração da inclinação do espaço vazio de amostra de reação. Subsequentemente, a atividade foi calculada em relação à inclinação da linha de calibração.

Ensaio 4B Atividade lipolítica em pNP-linoleato com pH 7,0 [0333] Como sob o ensaio 4A, exceto o tampão que consiste em 100 milimol/1 de MOPS com pH 7,0 que contém 1 % de Triton X-100.

Ensaio 5A Atividade lipolítica em pNP-oleato com pH 5,5 [0334] Como sob o ensaio 4A, exceto o substrato que consiste em pNP-oleato (>95 % puro, de Syncom, Países

Baixos).

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Ensaio 5B Atividade lipolitica em pNP-oleato com pH 7,0 [0335] Como sob o ensaio 4B, exceto o substrato que consiste em pNP-oleato (>95 % puro, de Syncom, Paises

Baixos).

Ensaio 6A Atividade lipolitica em pNP-estearato com pH 5,5 [0336] Como sob o ensaio 4A, exceto o substrato que consiste em pNP-estearato (N3627, Sigma Aldrich).

Ensaio 6B Atividade lipolitica em pNP-estearato com pH 7,0 [0337] Como sob o ensaio 4B, exceto o substrato que consiste em pNP-estearato (N3627, Sigma Aldrich).

Ensaio 7A Atividade lipolitica em pNP-butirato com pH 5,5 [0338] Como sob o ensaio 4A, exceto o substrato que consiste em pNP-butirato (N9876, Sigma Aldrich).

Ensaio 7B Atividade lipolitica em pNP-butirato com pH 7,0 [0339] Como sob o ensaio 4B, exceto o substrato que consiste em pNP-butirato (N9876, Sigma Aldrich).

Ensaio 8A Atividade lipolitica em pNP-palmitato com pH 8,5 [0340] Como sob o ensaio 4A, exceto o tampão que consiste em 100 milimol/1 de Tris com pH 8,5 que contém 1 % de Triton X-100, e o substrato que consiste em pNPpalmitato (N2752, Sigma Aldrich).

Ensaio 9 Perfil de pH de atividade lipolitica em pNPlinoleato [0341] Como sob o ensaio 4A, exceto o tampão que consiste em 100 milimol/1 de tampão de acetato de sódio com pH 4,0 que contém 1 % de Triton X-100, 100 milimol/1de tampão de acetato de sódio com pH 4,5 que contém 1 %de

Triton X-100, 100 milimol/1 de tampão de acetato de sódio com pH 5,0 que contém 1 % de Triton X-100, 100 milimol/1de tampão de acetato de sódio com pH 5,5 que contém 1 %de

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Triton X-100 milimol/1, 100 milimol/1 de tampão de MES com pH 6,0 que contém 1 % de Triton X-100, 100 milimol/1 de tampão de MOPS com pH 6,5 que contém 1 % de Triton X-100 milimol/1, 100 milimol/1 de tampão de MOPS com pH 7,0 que contém 1 % de Triton X-100 milimol/1, 100 milimol/1 de tampão de MOPS com pH 7,5 que contém 1 % de Triton X-100 milimol/1 ou 100 milimol/1 de tampão de TRIS com pH 8,0 que contém 1 % de Triton X-100 milimol/1.

Determinação de propriedades alteradas [0342] As propriedades alteradas de variantes de enzima lipolitica de acordo com a revelação em comparação com um polipeptideo de referência que tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2 foram obtidas da seguinte forma.

[0343] Em primeiro lugar, as propriedades dos variantes e do polipeptideo de referência foram medidas como descrito sob Ensaio IA a Ensaio 9 acima.

[0344] Em segundo lugar, a partir dessas medições. Os percentuais (%) listados nas Tabelas 2 a 5 abaixo foram obtidos. De modo a obter os percentuais listados nas tabelas abaixo, isso é explicado através de uma determinação e cálculo exemplificativos de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase (Tabela 2). Os % nas Tabelas 3 a 5 foram obtidos analogamente.

Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n° [0345] A atividade de variante n° em Digalactosildiglicerideo (DGDG) (medido como descrito sob

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Ensaio 2A acima) foi expressa como uma razão para a atividade medida para o mesmo variante em trioleina (medida como descrito sob Ensaio 3A acima).

[0346] 0 polipeptideo de referência (que tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2) foi submetido às mesmas condições experimentais.

[0347] Se a atividade de variante n° fosse 850 unidades/ml em DGDG (Ensaio 2A) , e 1000 unidades/ml em trioleina (Ensaio 3A), a razão entre a atividade de galactolipase e TAG-lipase para variante n° seria 0,85.

[0348] Se	a atividade	do polipeptideo	de referência
fosse 600	unidades/ml	em DGDG (Ensaio	2A) , e 1000
unidades/ml	em trioleina	(Ensaio 3A), então,	a razão entre

a atividade de galactolipase e TAG-lipase para o polipeptideo de referência seria 0,6.

[0349] Esse valor do polipeptideo de referência é, então, normalizado para 100 %.

[0350] Nesse cálculo exemplificativo, a razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n° comparada com o polipeptideo de referência seria, então, (0,85/0, 60) x 100 % = 142 %. 142 % (para variante n°) é um aumento comparado com 100 % (para o polipeptideo de referência), como resultado, diz-se que o variante n° tem uma razão aumentada entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase comparada com o polipeptideo de referência. Esse valor de 142 % é, então, uma % normalizada. Nas tabelas, são listadas as % normalizadas nos exemplos.

[0351] Em suma, a tabela 2 lista: a razão de

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120/133 [Atividade de variante n° em Ensaio 2A] : [Atividade de variante n° em ensaio 3A], expressada como um percentual da razão de [Atividade do polipeptideo de referência em Ensaio 2A] : [Atividade do polipeptideo de referência em Ensaio 3A]. [0352] 0 percentual, então, obtido é a razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase como listado na tabela 2.

Exemplo 1. Projeto e clonagem do variante de enzima lipolitica da revelação [0353] A sequência de proteínas (sequência de aminoácidos) do polipeptideo de referência (também chamado de polipeptideo parental) que tem atividade lipolitica é mostrada nos aminoácidos 34 a 304 SEQ ID NO: 2. Uma sequência de DNA adaptada em códon para expressão das proteínas de enzima lipolitica (variantes de enzima lipolitica e polipeptideo de referência) em Aspergillus niger foi projetada contendo sítios de enzima de restrição do tipo II Bsal adicional para permitir a subclonagem no vetor de expressão pGBFIN-50 de Aspergillus (consulte também Fig. 1) . A adaptação de códon foi realizada como descrito no documento W02008/000632. A sequência de DNA otimizada em códon para expressão do gene que codifica o polipeptideo de referência em A. niger é mostrada na SEQ ID NO: 1 .

[0354] A sequência de iniciação translacional do promotor de glucoamilase glaA foi modificada em 5'CACCGTCAAA ATG-3' (SEQ ID NO: 3) (já presente no vetor de expressão pGBFIN-50 de Aspergillus) e uma sequência de terminação translacional ideal 5'-TAAA-3' foi usada na

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121/133 geração dos construtos de expressão de enzima lipolitica (como também detalhado nos documentos W02006/077258 e W02011/009700). As sequências de DNA que codificam os variantes de enzima lipolitica e o polipeptideo de referência da invenção foram sintetizadas completamente (DNA2.0, Menlo Park, EUA) e clonadas em vetor de expressão pGBFIN-50 de Aspergillus niger através das etapas repetidas de digestão e ligação de Bsal (Método de clonagem de GoldenGate (New England Biolabs), de acordo com ο procedimento padrão. Os vetores resultantes que contêm o cassete de expressão de enzima lipolitica (incluindo o cassete de expressão para os variantes de enzima lipolitica e o polipeptideo de referência, consulte a Tabela 1 abaixo para detalhes) sob controle do promotor de glucoamilase e foram nomeados pGBFINPL-00 até pGBFINPL-51.

[0355] Subsequentemente, A. niger GBA 306 foi transformado com um fragmento de Pgla-3'gla amplificado por PCR gerado usando os vetores pGBFINPL-00 até pGBFINPL-51 como modelo. O fragmento de PCR compreende o cassete de expressão de enzima lipolitica sob controle do terminador e promotor de glucoamilase bem como o marcador de seleção de higromicina. Alternativamente, um fragmento purificado e digerido de Notl dos vetores pGBFINPL-00 até pGBFINPL-51 construídos, que contém o cassete de expressão de enzima lipolitica e o marcador de seleção de higromicina pode ser usado. Os experimentos de transformação foram realizados com cepa e métodos como descrito nos documentos WO199846772, WO199932617, WO2011009700, W02012001169, WO2013135729, W02014013073 e W02014013074 e referências nos mesmos. Após transformação, os protoplastos foram

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122/133 plaqueados em meio de regeneração seletivo que consiste em meio minimo de Aspergillus suplementado com 60 pg/ml de Higromicina B. Após a incubação por 5-10 dias a 30 °C, transformantes únicos foram novamente semeados para colônias únicas em PDA (Ágar Batata Dextrose) suplementado com 60 pg/ml de Higromicina B. Após 5-7 dias de crescimento e esporulação a 30°C, colônias únicas foram transferidas para placas de PDA. Após o crescimento por 5-7 dias a 30 °C, os esporos foram isolados e usados como material de inoculação para fermentações de frasco de agitação.

[0356] Os transformantes de enzimas lipoliticas nomeados PL-00, PL-01 até e incluindo PL-51, foram usados para fermentações (consulte Tabela 1 abaixo para detalhes) [0357] As alterações de aminoácido que foram introduzidas nos 51 variantes de enzima lipolitica são listadas na Tabela 1.

[0358] Tabela 1. Alterações de aminoácido introduzidas no polipeptideo parental, em que o polipeptideo parental tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2. Aminoácidos são descritos de acordo com uma anotação de letra única.

N°	Alteração de aminoácido*
00 (polipeptideo parental também chamado de polipeptideo de referência)	nenhum
01	Y53F
02	Y53S
03	S112T

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123/133

N°	Alteração de aminoácido*
04	I113H
05	I113L
06	I113N
07	I113R
08	I113T
09	N117D
10	N121D
11	L122A
12	L122M
13	F124L
14	H138E
15	H138S
16	F141M
17	F141Y
18	A178G
19	V17 9L
20	V17 9M
21	V179S
22	L182F
23	G2 0 0A
24	P202A
25	R2 0 3M
26	P229Q
27	P235L
28	F238L
29	L282E
30	L282F

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124/133

N°	Alteração de aminoácido*
31	L282K
32	L282M
33	L282N
34	L282R
35	L282S
36	L282T
37	I284A
38	I284D
39	I284E
40	I284F
41	I284M
42	I284N
43	I284P
44	I284Q
45	I284S
46	I284T
47	A2 8 6L
48	D295E
49	D295G
50	D295N
51	D295S

* posições que são definidas com referência a SEQ ID NO: 2

Exemplo 2. Expressão dos variantes de enzima lipolitica e o polipeptídeo de referência usando os transformantes PL-00 a PL-51 do Exemplo 1 [0359] Esporos frescos de PL-00 a PL-51 de Ά. niger

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125/133 foram preparados e usados para gerar material de amostra de enzima lipolitica pelo cultivo das cepas no frasco de agitação. As cepas de A.niger foram pré-cultivadas em meio de pré-cultura de 20 ml em um frasco de agitação de 100 ml com defletor que contém por litro: 100 g de Sólidos de Milhocina (Roquette) , 1 g de NaH2PO4.H2O, 0,5 g de MgSO4.7H2O, 10 g de Glicose.H2O, 0,25 g de Basildon com pH 5,8. Após o crescimento durante a noite a 34 °C e 170 rpm, 10 ml dessa cultura foram transferidos para meio de fermentação de 100 ml em frascos de agitação de 500 ml com defletor. O meio de fermentação contém por litro: (150 g de maltose, 60 g de bacto-soitona, 15 g de (NH4)2SC>4, 1 g de NaH2PC>4.H2O, 1 g de MgSC>4.7H2O, 1 g de L-arginina, 0,08 g de Tween-80, 0,02 g de Basildon, 20 g de MES, pH 6,2. As culturas foram cultivadas por 2-7 dias a 34 °C, 170 rpm. Os sobrenadantes de cultura foram recuperados por centrifugação por 10 min a 5000 xg.

Medição de atividade lipolitica [0360] A atividade enzimática dos variantes de enzima lipolitica e do polipeptideo parental (também chamado de polipeptideo de referência) pode ser expressa em Unidades de NEFA. Uma Unidade (U) é definida como a quantidade de enzima que libera um micromol de ácido graxo livre por minuto sob as condições de ensaio definidas.

[0361] A atividade lipolitica dos variantes de enzima lipolitica e do polipeptideo parental que tem atividade lipolitica foi demonstrada usando os Ensaios descritos no presente documento (consulte os exemplos abaixo). Todos os variantes de enzima lipolitica listados na Tabela 1 e o polipeptideo parental mostraram atividade lipolitica.

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Exemplo 3: Razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase com pH 5,5 de variantes de acordo com a revelação [0362] A razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variantes como comparado ao polipeptídeo de referência foi determinada usando as enzimas obtidas no Exemplo 2. Essa razão foi determinada como descrito no presente documento sob Materiais e Métodos acima (aplicando Ensaio 2A, Ensaio 3A, e Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n°) . Os resultados são listados na Tabela 2.

[0363] Tabela 2. A razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase com pH 5,5 de variantes de acordo com a revelação comparada ao polipeptídeo de referência. A razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase do polipeptídeo de referência (polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2), foi definida em 100 %. Na tabela, são listadas as % normalizadas. Uma razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de mais que 100 % mostra que o variante tem uma atividade de galactolipase aumentada comparada ao polipeptídeo de referência.

Alteração de Aminoácido*	Razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase com pH 5,5 (%)
I113N	208 %
I113T	148 %
I113H	375 %
I113R	188 %

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Alteração de Aminoácido*	Razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase com pH 5,5 (%)
F141Y	207 %
V17 9M	129 %
L282F	123 %
L282M	126 %
L282K	167 %
L282S	113 %
I284M	177 %
I284N	>500 %
I284D	214 %
I284Q	271 %
I284S	294 %
I284T	186 %
D295S	350 %
D295N	440 %
D295E	215 %
D295G	229 %

* posições que são definidas com referência a SEQ ID NO: 2

Exemplo 4: Razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase com pH 8,0 de variantes de acordo com a revelação [0364] A razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variantes como comparado ao polipeptideo de referência foi determinada usando as enzimas obtidas no Exemplo 2. Essa razão foi determinada como descrito no presente documento sob Materiais e Métodos acima (aplicando Ensaio 2B, Ensaio 3B e Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de

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128/133 galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n°) . Os resultados são listados na Tabela 3.

[0365] Tabela 3. A razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase com pH 8,0 de variantes de acordo com a revelação comparada ao polipeptideo de referência. A razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase do polipeptideo de referência (polipeptideo que tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2), foi definida em 100 %. Na tabela, são listadas as % normalizadas. Uma razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de mais que 100 % mostra que o variante tem uma atividade de galactolipase aumentada comparada ao polipeptideo de referência.

Alteração de Aminoácido*	Razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase com pH 8,0 (%)
I113L	122 %
I113T	151 %
I113H	273 %
I113R	247 %
H138S	128 %
F141Y	143 %
F141M	125 %
V179L	116 %
V179S	>500 %
V17 9M	137 %
L282R	484 %
L282E	234 %
L282S	>500 %

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Alteração de Aminoácido*	Razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase com pH 8,0 (%)
I284M	124 %
I284P	142 %
I284N	236 %
I284D	>500 %
I284E	132 %
I284Q	>500 %
I284A	140 %
I284S	174 %
I284T	138 %
A2 8 6L	>500 %
D295S	231 %
D295N	251 %
D295E	139 %
D295G	174 %

* posições que são definidas com referência a SEQ ID NO: 2

Exemplo 5: Razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase com pH 5,5 de variantes de acordo com a revelação [0366] A razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase de variantes como comparado ao polipeptídeo de referência foi determinada usando as enzimas obtidas no Exemplo 2. Essa razão foi determinada como descrito no presente documento sob Materiais e Métodos acima (aplicando Ensaio IA, Ensaio 3A, e Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n°) . Os resultados são listados na Tabela 4.

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130/133 [0367] Tabela 4. Razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase com pH 5,5 de variantes de acordo com a revelação comparada ao polipeptideo de referência. A razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAGlipase do polipeptideo de referência (polipeptideo que tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2), foi definida em 100 %. Na tabela, são listadas as % normalizadas. Uma razão entre a atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase de mais que 100 % mostra que o variante tem uma atividade de fosfolipase aumentada comparada ao polipeptideo de referência.

Alteração de Aminoácido*	Razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase com pH 5,5 (%)
I113N	216 %
I113T	344 %
I113H	481 %
I113R	296 %
F141Y	268 %
V179S	179 %
V17 9M	137 %
L282F	122 %
L282T	>500 %
L282R	149 %
L282E	117 %
L282N	116 %
L282S	150 %
I284M	149 %
I284N	>500 %

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Alteração de Aminoácido*	Razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase com pH 5,5 (%)
I284D	390 %
I284E	171 %
I284Q	>500 %
I284S	372 %
I284T	246 %
D295S	128 %
D295N	135 %
D295G	283 %

* posições que são definidas com referência a SEQ ID NO: 2

Exemplo 6: Razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase com pH 8,0 de variantes de acordo com a revelação [0368] A razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase de variantes como comparado ao polipeptideo de referência foi determinada usando as enzimas obtidas no Exemplo 2. Essa razão foi determinada como descrito no presente documento sob Materiais e Métodos acima (aplicando Ensaio 1B, Ensaio 3B e Determinação exemplificativa e cálculo de razão entre atividade de galactolipase e atividade de TAG-lipase de variante n°) . Os resultados são listados na Tabela 5.

[0369] Tabela 5. Razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase com pH 8,0 de variantes de acordo com a revelação comparada ao polipeptideo de referência. A razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAGlipase do polipeptideo de referência (polipeptideo que tem uma sequência de aminoácidos como estabelecido em

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132/133 aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2), foi definida em 100 %. Na tabela, são listadas as % normalizadas. Uma razão entre a atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase de mais que 100 % mostra que o variante tem uma atividade de fosfolipase aumentada comparada ao polipeptideo de referência.

Alteração de Aminoácido*	Razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase com pH 8,0 (%)
I113L	152 %
I113T	294 %
I113H	>500 %
I113R	>500 %
L122M	122 %
L122A	106 %
H138E	335 %
F141Y	171 %
F141M	156 %
V179L	113 %
V179S	>500 %
V17 9M	126 %
L282R	>500 %
L282E	>500 %
L282S	>500 %
I284P	132 %
I284N	242 %
I284D	>500 %
I284E	>500 %
I284Q	>500 %
I284A	128 %

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Alteração de Aminoácido*	Razão entre atividade de fosfolipase e atividade de TAG-lipase com pH 8,0 (%)
I284S	230 %
I284T	138 %
A2 8 6L	371 %
D295S	125 %
D295N	106 %
D295G	254 %

* posições que são definidas com referência a SEQ ID NO: 2

Claims (16)

1. Polipeptídeo variante caracterizado por ter atividade lipolitica, em que o variante tem uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2, e em que o dito variante tem pelo menos 7 0 % de identidade com o polipeptídeo maduro que tem atividade lipolitica como estabelecido em SEQ ID NO: 2.

2. Variante, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o variante tem uma ou mais propriedades alteradas em comparação com a polipeptídeo de referência que tem atividade lipolitica.

3. Polipeptídeo variante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de referência compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2 e em que o polipeptídeo maduro compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecido em aminoácidos 34 a 304 de SEQ ID NO: 2.

4. Polipeptídeo variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o variante tem uma sequência de aminoácidos que quando alinhada com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NO: 2, compreende uma ou mais das substituições

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2/6 de aminoácido selecionadas a partir de

I113H I113L I113N I113R I113T L122A L122M H138E H138S F141M F141Y V179L V17 9M V179S L282E L282F L282K L282M L282N L282R L282S L282T I284A I284D I284E I284M I284N I284P

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3/6

5. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que a propriedade alterada inclui uma razão aumentada da atividade em lipideos polares: atividade em lipideos não polares em comparação com o polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica medida sob as mesmas condições.

6. Sequência de ácidos nucleicos caracterizada por codificar o polipeptideo variante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.

7. Construto de ácido nucleico caracterizado por compreender a sequência de ácidos nucleicos, conforme definido na reivindicação 6, operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle com capacidade de direcionar a expressão da enzima lipolitica em um hospedeiro de expressão adequado.

8. Célula hospedeira recombinante caracterizada por compreender um vetor de expressão recombinante que compreende o construto de ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 7.

9. Método para produzir a variante de polipeptideo lipolitico, conforme definido em qualquer uma das

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4/6 reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender a célula hospedeira, conforme definido na reivindicação 8, sob condições favoráveis à produção do variante de enzima lipolitica e recuperar o variante de enzima lipolitica.

10. Método para produzir a variante de polipeptideo lipolitico, cujo método é caracterizado por compreender:

a) selecionar um polipeptideo que tem atividade lipolitica;

b) substituir pelo menos um resíduo de aminoácido em uma posição que corresponde a qualquer uma das posições 113, 122, 138, 141, 179, 282, 284, 286, 295, as ditas posições sendo definidas com referência a SEQ ID NO: 2;

c) opcionalmente, substituir um ou mais aminoácidos adicionais, como definido no item b);

d) preparar o variante resultante das etapas a)-c); e) determinar uma propriedade do variante; e f) selecionar um variante que tem uma propriedade alterada em comparação com um polipeptideo de

referência que tem atividade lipolitica, através disso, produzir um variante de polipeptideo lipolitico, em que a propriedade alterada inclui uma razão aumentada da atividade em lipideos polares: atividade em lipideos não polares em comparação com o polipeptideo de referência que tem atividade lipolitica medida sob as mesmas condições.

11. Composição caracterizada por compreender o polipeptideo variante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou obtenível pelo método, conforme definido na reivindicação 10, e um ou mais

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5/6 componentes selecionados a partir do grupo que consiste em leite em pó, glúten, gordura granulada, uma enzima adicional, um aminoácido, um sal, um oxidante, um agente de redução, um emulsificador, estearoil lactilato de sódio, estearoil lactilato de cálcio, poliglicerol ésteres de ácidos graxos e ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- e diglicerideos, uma goma, um aromatizante, um ácido, um amido, um amido modificado, um umectante e um conservante.

12. Uso caracterizado por ser do polipeptideo variante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou da composição, conforme definido na reivindicação 11, na produção de um produto alimentício, de preferência, na produção de uma massa e/ou um produto assado.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o uso compreende substituir pelo menos parte de um emulsificador químico na produção de uma massa e/ou um produto assado.

14. Massa caracterizada por compreender o polipeptideo variante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, um polipeptideo variante obtenível pelo método, conforme definido na reivindicação 10 ou uma composição, conforme definido na reivindicação 11.

15. Processo para a produção de uma massa caracterizado por compreender uma etapa de combinar uma quantidade eficaz do polipeptideo variante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, uma quantidade eficaz do polipeptideo variante obtenível pelo método, conforme definido na reivindicação 10 ou uma

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6/6 quantidade eficaz da composição, conforme definido na reivindicação 11, com pelo menos um ingrediente de massa.

16. Processo para a produção de um produto assado, cujo método é caracterizado por compreende assar a massa, conforme definido na reivindicação 14 ou a massa obtida pelo processo, conforme definido na reivindicação 15.