BRPI0906948B1 - Composições compreendendo uma enzima nacetilgalactosamina-6- sulfatase (galns) recombinante humana e uso das mesmas para tratar mucopolissacaridose tipo iva, síndrome de morquio a, ou deficiência múltipla de sulfatase - Google Patents

Composições compreendendo uma enzima nacetilgalactosamina-6- sulfatase (galns) recombinante humana e uso das mesmas para tratar mucopolissacaridose tipo iva, síndrome de morquio a, ou deficiência múltipla de sulfatase Download PDF

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Abstract

FABRICAÇÃO DE ENZIMAS SULFATASE LISOSSÒMICA HUMANAS ATIVAS ALTAMENTE FOSFORILADAS E USOS DA MESMA A presente invenção provê composições de enzimas sulfatase lisossômica humas ativas altamente fosforiladas, suas composições farmacêuticas, métodos de produção e purificação de tais enzimas sulfatase lisossômicas e composições e seu uso no diagnóstico, profilaxia ou tratamento de doenças e condições, incluindo particularmente doenças de depósito Iisossômico que são causadas por, ou associadas a, uma deficiência na enzima sulfatase Iisossômica.

Description

[001]O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisória U.S. No. 61/022,179, depositado em 18 de janeiro de 2008, do Pedido de Patente Provisória U.S. No. 61/099,373, depositado em 23 de setembro de 2008, e do Pedido de Patente Provisória U.S. No. 61/110,246, depositado em 31 de outubro de 2008, as especificações dos quais estão aqui incorporados por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002]A presente invenção refere-se ao campo técnico de biologia celular e molecular e de medicina, particularmente à fabricação de enzimas sulfatase lisos- sômicas humanas ativas altamente fosforiladas e seu uso no gerencialmente das doenças de depósito lisossômico associadas à deficiência da enzima sulfatase lisos- sômica. Em particular, a presente invenção refere-se à fabricação de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante ativa altamente fosforiladas (GALNS) e seu uso no gerenciamento de Mucopolissacaridose IVa (MPS IVa ou Síndrome de Morquio A) e outras doenças de depósito lisossômico associadas uma deficiência de GALNS.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003]As doenças de depósito lisossômico (LSDs), resultadam a partir da deficiência de enzimas lisossômicas específicas dentro da célula que são essenciais para a degradação dos resíduos celulares no lisossoma. A deficiência de tais enzimas lisossômicas leva ao acúmulo no interior dos lisossomas de “material de depósito” não-degradado, que provoca inchaço e mau-funcionamento dos lisossomas e, finalmente, danos celular e tecidual. Um grande número de enzimas lisossômicas tem sido identificado e correlacionado com suas doenças relalacionadas. Uma vez que uma enzima em falta tiver sido identificada, o tratamento pode ser reduzido ao problema exclusivo de forma eficaz entregando uma enzima substituinte para os tecidos afetados dos pacientes.
[004]Uma maneira de tratar doenças de depósito lisossômico é através de terapia de reposição intravenosa enzimática (ERT) (Kakkis, Expert Opin. Investig. Drugs 11 (5): 675 - 685, 2002). ERT leva vantagem da vasculatura para carregar enzima a partir de um local único de administração para a maioria dos tecidos. Uma vez que a enzima tem sido amplamente distribuída, deve ser tomada dentro das células. A base para retenção em células é encontrada em uma única característica de enzimas lisossômicas. As enzimas lisossômicas constituem uma classe separada de glicoproteínas definida pelo fosfato na posição 6 de resíduos de manose terminal. Manose-6-fosfato é ligado com alta afinidade e especificidade por um receptor encontrado sobre a superfície da maioria das células (Munier - Lehmann et al., Bio- chem. Soc. Trans. 24 (1): 133 - 136, 1996; Marnell et al., J. Cell. Biol. 99 (6): 1907 - 1916, 1984). O receptor de manose-6-fosfato (MPR), que possui dois manose-6- fosfato ligando os sítios por cadeia de polipeptídeos (Tong et al., J. Biol Chem. 264: 7962 - 7969, 1989), direciona a retenção da enzima do sangue para o tecido e, em seguida, media a via intracelular para o lisossoma.
[005]A produção em grande escala de enzimas lisossômicas envolve a expressão em linhagens celulares de mamíferos. O objetivo é a secreção predominante da enzima recombinante para o meio em volta do crescimento para colheita e processamento a jusante. Em um sistema ideal para a produção em grande escala de enzimas lisossômicas, a enzima seria fosforilada de forma eficaz e, em seguida, primariamente direcionada em direção à superfície da célula (isto é, para a secreção), ao invés de primariamente para o lisossoma. Como descrito acima, essa divisão de enzimas lisossômicas fosforiladas é exatamente o oposto do que ocorre em células normais. As linhagens celulares de fabricação utilizadas para a produção de enzimas lisossômicas focam na maximização do nível de manose-6-fosfato por mol de enzima, mas é caracterizado por baixa produtividade específica. Tentativas in vitro na produção de enzimas lisossômicas contendo altos níveis de porções de manose-6- fosfato resultaram em sucesso misto (Canfield et al., Patents U.S. No. 6,537,785). Aa enzimas in vitro apresentam elevados níveis de manose-6-fosfato, bem como elevados níveis de manose terminal não-modificados. A concorrência entre manose- 6-fosfato e os receptores de manose para enzima lisossômica resulta na necessidade de altas doses de enzimas para a eficácia, e poderia conduzir a uma maior imu- nogenicidade, em detrimento do indivíduo sendo tratado.
[006]As sulfatases constituem uma subclasse única de enzimas lisossômi- cas. As ulfatases racham os ésteres de sulfato provenientes de uma variedade de substratos, incluindo, por exemplo, esteróides, carboidratos, proteolgicans e glicoli- pídios. Todas as sulfatases eucarióticas conhecidas contêm um resíduo de cisteína em seu sítio catalítico. A atividade de sulfatase exige a modificação pós-translacional deste resíduo de cisteína para Cα-formilglicina (FGIy). A cisteína para ativação enzi- mática pós-translacional de FGIy ocorre dentro do retículo endoplasmático nas sulfatases desdobradas imediatamente após a translação, antes da segmentação das sulfatases para o lisossoma (Dierks et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 11963 - 11968, 1997). A enzima gerando formilglicina que catalisa essa reação é sulfatase modificando o fator 1 (SUMF1). Destacando a importância desta modificação pós- translacional única é o fato de que mutações em SUMF1, que resultam na formação de FGIy prejudicada nas enzimas sulfatase lisossômicas causam Deficiência de Múl-tiplas Sulfatases (MSD) no homem (Diez-Ruiz et al. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6: 355 - 379, 2005).
[007]Por conseguinte, a eficácia terapêutica de uma preparação de enzima sulfatase lisossômica depende do nível de manose-6-fosfato, e da presença de enzima ativa, naquela preparação.
[008]Assim, existe uma necessidade na técnica por um sistema eficaz e produtivo para a fabricação em grande escala de enzimas sulfatase lisossômicas ativa altamente fosforilada terapeuticamente eficaz, para o gerenciamento de distúrbios do depósito lisossômico causados por ou associados a uma deficiência de tais enzimas sulfatase lisossômicas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009]A presente invenção refere-se à descoberta de que quando um derivado da linhagem celular de CHO-K1 (designado G71), que está com defeito na acidifi- cação endossômica é projetado para expressar a sulfatase humana recombinante modificando o fator 1 (SUMF1), as células de G71 modificadas produzem altos rendimentos de enzimas sulfatase lisossômicas ativas recombinantes altamente fosfori- ladas, em parte, evitando perda de material para o compartimento lisossômico da linhagem celular de fabricação. Em uma modalidade, a invenção provê uma linhagem celular de grupo de complementação END3 que co-expressa SUMF1 recombi- nante humana e N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS), resultando em rendimentos elevados da enzima ativa altamente fosforilada. As li-nhagens celulares exemplares são G71, G71S, e os derivados das mesmas, que retêm a propriedade desejada de G71, ou seja, a capacidade para produzir altos rendimentos de enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes ativas altamente fos- foriladas. Esta aplicação de um grupo de complementação END3 modificou a linhagem celular de CHO-K1 co-expressando a SUMF1 recombinante humana e uma enzima sulfatase lisossômica recombinante seria especialmente útil para a fabricação de enzimas sulfatase lisossômica ativas altamente fosforiladas a serem utilizadas para tratamento de doenças de depósito lisossômico pela terapia de reposição de enzima (ERT).
[0010]Em um primeiro aspecto, a presente invenção apresenta um novo método de produção de enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes humanas ativas altamente fosforiladas ou fragmentos biologicamente ativos, mutantes, variantes ou derivados dos memos em uma célula CHO do grupo de complementação END3 ou derivado do mesmo, em quantidades que permitam seu uso terapêutico. Em uma modalidade ampla, o método compreende as etapas de: (a) cultivar uma célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivados das mesmas, (b) preparar um primeiro vetor de expressão de mamíferos capaz de expressar a enzima sulfatase lisossômica recombinante humana ativa altamente fosforilada ou fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivado da mesma na célula do grupo de complementação END3 derivado de CHO ou derivados dos mesmos, (c) preparar um segundo vetor de expressão de mamíferos capaz de expressar sulfatase recombinante humana modificando o fator 1 (SUMF1) ou fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivado da mesma nas células do grupo de com- plementação END3 derivada de CHO ou derivativa da mesma, (d) transfectar a célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivativa da mesma com o primeiro e segundo vetores de expressão, (e) selecionar e clonar um transfec- tante de uma célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivativa do mesmo que expressa a enzima sulfatase lisossômica recombinante humana ativa altamente fosforilada ou fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivativo da mesma, e (f) otimizar um método de processo de cultura celular para a produção da enzima sulfatase lisossômica recombinante humana altamente fos- forilada ou fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivativo do mesmo. A enzima sulfatase lisossômica recombinante humana é selecionada a partir do grupo consistindo em arilsulfatase A (ARSA), arilsulfatase B (ARSB), iduronato-2- sulfatase (IDS), sulfamidase / heparina-N-sulfatase (SGSH), N-acetilglicosamina- sulfatase (G6S) e N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS).
[0011]O método envolve as etapas de transfectar um cDNA que codifica toda ou parte da enzima sulfatase lisossômica e um cDNA que codifica todo ou parte de SUMF1 humana em uma células do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivativos da mesma. Em algumas modalidades, o primeiro e segundo vetores de expressão, que são capazes de expressar a codificação da enzima sulfatase lisossômicas recombinante humanas ativa altamente fosforilada e SUMF1 humana são, respectivamente, transfectadas simultaneamente para a célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivativas da mesma. Em algumas modalidades, o primeiro e segundo vetores de expressão são transfectados para a célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivativa da mesma seqüencialmente. Em algumas modalidades, uma codificação de cDNA para uma enzima sulfatase lisossômica humana de comprimento total é utilizada enquanto que em outras modalidades uma codificação de cDNA para um fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivativo do mesmo é utilizada. Em algumas modalidades, uma codificação de cDNA para uma SUMF1 humana é utilizada, enquanto que em outras modalidades uma codificação de cDNA para um fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivativo do mesmo é utilizada. Em algumas modalidades, múltiplos vetores de expressão são utilizados para transferir cDNAs da enzima sulfatase lisossômica humana e de SUMF1 humanas simultânea ou sequencialmente para a célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivativos da mesma. Em algumas modalidades, um único vetor de expressão é usado para transferir cDNAs da enzima sulfatase lisossômicas humana e de SUMF1 humana simultaneamente para a célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivativos da mesma Em uma modalidade preferida, a célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivativo da mesma é uma linhagem celular de G71, uma linhagem celular de G71S, ou um derivado de G71 ou de G71S.
[0012]Em uma modalidade preferida, o método compreende produzir uma enzima sulfatase lisossômica recombinante humana ativa altamente fosforilada, por exemplo, arilsulfatase A (ARSA), arilsulfatase B (ARSB), iduronato-2-sulfatase (IDS), sulfamidase / heparin-N -sulfatase (SGSH), N-acetilglicosamina-sulfatase (G6S) ou N-acetilgalactosamina- 6-sulfatase (GALNS), a partir de uma linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 ou derivados da mesma. Em uma modalidade particularmente preferida, o método compreende a produção de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana ativa altamente fosforilada (GALNS) a partir de uma linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 ou derivados da mesma. Uma linhagem celular do grupo de complementação END3 é qualquer linhagem celular de CHO modificada vez mantém as propriedades de uma linhagem celular do grupo de complementação END3, tal como a acidifica- ção endossômica com defeito. Em uma modalidade preferida, a célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivativo da mesma é uma linhagem celular de G71, uma linhagem celular de G71S, ou um derivado de G71 ou de G71S.
[0013]Em um segundo aspecto, a presente invenção provê uma linhagem celular de mamíferos deficiente de acidificação endossômica caracterizada por sua capacidade de produzir enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes humanas ativas altamente fosforiladas em quantidades que permitem o uso da enzima sulfatase lisossômica terapeuticamente. Em modalidades preferidas, a invenção provê linhagens celulares do grupo de complementação END3 derivadas de CHO-K1 designadas de G71, G71S, ou derivados das mesmas, que são capazes de produzir altos rendimentos de enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes humanas ativas altamente fosforiladas, permitindo a produção em grande escala de tais enzimas sulfatase lisossômicas terapêuticas. Em modalidades mais preferidas, a linhagem celular expressa e secreta uma enzima sulfatase lisossômica recombinante humana em quantidades de pelo menos cerca de 0,5, preferencialmente pelo menos cerca de 0,75, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,0, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,25 picogramas / células / dia.
[0014]Uma linhagem celular do grupo de complementação END3 é qualquer linhagem celular de CHO modificada que mantém as propriedades de uma linhagem celular do grupo de complementação END3, tal como a acidificação endossômica com defeito. Em uma modalidade, a linhagem celular de CHO do grupo de comple- mentação END3 é derivada a partir de G71 ou um derivativo da mesma e compreende (a) um vetor de expressão para sulfatase recombinante humana modificando o fator 1 (SUMF1) e (b) um vetor de expressão para uma enzima sulfatase lisossômica recombinante humana, em que a enzima sulfatase lisossômica recombinante humana é selecionada a partir do grupo consistindo em arilsulfatase A (ARSA), arilsulfa- tase B (ARSB), iduronato-2-sulfatase (IDS), sulfamidase / heparina-N-sulfatase (SGSH), N-acetilglicosamina-sulfatase (G6S) e N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS). Em uma modalidade preferida, a linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 compreende o vetor de expressão para N- acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS). Em uma modalidade mais preferida, a linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 expressa e secreta GALNS recombinante humana. Em outra modalidade preferida, a linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 é selecionada a partri do grupo que consiste em clone 4, clone 5, clone C6, clone C2, clone C5, clone C7, clone C10, clone C11 e clone C30. Em uma modalidade mais preferida, a linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 é clone C2. Em outra modalidade preferida, a linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 é adaptada para crescimento em suspensão.
[0015]Em um terceiro aspecto, a invenção provê enzimas sulfatase lisossô- micas recombinantes humanas produzidas em conformidade com os métodos da presente invenção e, portanto, presentes em quantidades que permitem utilizar as enzimas sulfatase lisossômica terapeuticamente. As enzimas sulfatase lisossômicas podem ser proteínas de comprimento total ou fragmentos, mutantes, variantes ou derivados das mesmas. Em algumas modalidades, a enzima sulfatase lisossômica ou fragmento, mutante, variante ou derivada da mesma de acordo com a invenção pode ser modificada conforme desejado para reforçar a sua estabilidade ou propriedades farmacocinéticas (por exemplo, PEGylation, mutagênese, fusão, conjugação). Em modalidades preferidas, a enzima é uma enzima sulfatase lisossômica humana, um fragmento da enzima sulfatase lisossômica humana, possuindo uma atividade biológica de uma enzima sulfatase nativa, ou um polipeptídeo que possui homologia de sequência substancial de aminoácidos com a enzima sulfatase lisossômica humana. Em algumas modalidades, a enzima sulfatase lisossômica é uma proteína de sequência, origem ou derivação de humanos ou de mamíferos. Em outras modalida-des, a enzima sulfatase lisossômica é tal que a sua deficiência provoca uma doença humana, tal como Leucodistrofia Metacrômica ou MLD (isto é, arilsulfatase A (ARSA)), síndrome de Maroteaux-Lamy ou MPS VI (isto é, arilsulfatase B (ARSB)), síndrome de Hunter ou MPS II (isto é, iduronato-2-sulfatase (IDS)), síndrome de Sanfilippo A ou MPS IIIa (isto é, sulfamidase / heparina-N-sulfatase (SGSH)), sín- drome de Sanfilippo D ou MPS IIId (isto é, N - acetilglicosamina -sulfatase (G6S)) e síndrome de Morquio A ou MPS IVa (isto é, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS)). Em uma modalidade particularmente preferida, a enzima sulfatase lisos- sômica é tal que a sua deficiência causa a síndrome de Morquio A ou MPS IVa (isto é, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS)). Em outra modalidade particularmente preferida, a enzima sulfatase lisossômica é tal que sua deficiência está associada a uma doença humana, tais como Deficiência de Múltiplas Sulfatases ou MSD (isto é, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS)).
[0016]A enzima sulfatase lisossômica também pode ser de origem ou derivada de sequência de humanos ou de mamíferos. Em ainda outras modalidades da invenção, em cada um dos seus aspectos, a enzima sulfatase lisossômica é idêntica em sequência de aminoácidos para a parte correspondente de uma sequência de aminoácido de enzima sulfatase lisossômica de mamífero ou de humano. Em outras modalidades, a porção polipeptídica é a enzima sulfatase lisossômica nativa proveniente de humano ou de mamífero. Em outras modalidades, o polipeptídeo da enzima sulfatase lisossômica é substancialmente homólogo (isto é, pelo menos, cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % idência na sequência de amino- ácidos) durante um comprimento de pelo menos, cerca de 25, 50, 100, 150 ou 200 aminoácidos, ou todo o comprimento do polipeptídeo, para a sequência de aminoá- cidos de enzima sulfatase lisossômica nativa de humanos ou de mamíferos. Em outras modalidades, o indivíduo a que a enzima sulfatase lisossômica está para ser administrada é humano.
[0017]Em modalidades preferidas, a enzima sulfatase lisossômica é uma enzima sulfatase lisossômica recombinante humana altamente fosforilada produzida por uma linhagem celular deficiente de acidificação endossômica, por exemplo, uma linhagem celular do grupo de complementação END3 derivada de CHO. Uma linhagem celular do grupo de complementação END3 é qualquer linhagem celular de CHO modificada que mantém as propriedades de uma linhagem celular do grupo de complementação END3, tal como a acidificação endossômica com defeito. Em uma modalidade preferida, a célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou derivativa da mesma é uma linhagem celular de G71, uma linhagem celular de G71S, ou um derivado de G71 ou de G71S.
[0018]Em mais modalidades preferidas, a enzima sulfatase lisossômica re- combinante humana possui um alto nível de oligossacarídeos fosforilados (isto é, superior a cerca de 0,25, preferencialmente superior a 0,5, e mais preferencialmente superior a cerca de 0,75 cadeias de oligomannose bis-fosforilada por cadeia de proteína). Em modalidades ainda mais preferidas, a enzima é uma N- acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana altamente fosforilada (GALNS).
[0019]Em modalidades mais preferidas, a enzima sulfatase lisossômica re- combinante humana, possui uma elevada porcentagem (isto é, pelo menos, cerca de 50 %, preferencialmente pelo menos cerca de 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90 %, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95 % ) de conversão do resíduo de cisteína do sítio ativo para Cα-formilglicina (FGIy). Em modalidades ainda mais preferidas, a enzima é uma N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana ativa (GALNS).
[0020]Em modalidades mais particularmente preferidas, a enzima sulfatase lisossômica recombinante humana possui um alto nível de oligossacarídeos fosfori- lados (isto é, maior que cerca de 0,25, preferencialmente maior que 0,5, e mais preferencialmente maior que cerca de 0,75 cadeias de oligomannose bis-fosforiladas por proteína) e uma alta porcentagem (isto é, pelo menos, cerca de 50 %, preferencialmente pelo menos cerca de 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90 %, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95 %) de conversão do resíduo de cisteína do sítio ativo para Cα-formilglicina (FGIy). Em modalidades mais particularmente referidas, a enzima é uma N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recom- binante humana ativa altamente fosforilada (GALNS).
[0021]Em um quarto aspecto, a invenção provê um método para purificar as enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes humanas produzidas pelos métodos da presente invenção. Em uma modalidade preferida, as enzimas sulfatase lisossô- micas são purificadas utilizando um processo de duas colunas (cromatografia de corante - ligando, por exemplo, Blue-Sepharose e cromatografia de permuta de ânion, por exemplo, SE Hi-Cap), compreendendo pelo menos cinco etapas de purificação: (1) filtrar a colheita, isto é, meio de cultura proveniente de uma linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 ou derivativa da mesma que ex-pressa sulfatase humana modificando o fator 1 (SUMF1) e a enzima sulfatase lisos- sômica recombinante humana; (2) ajustar o pH da colheita filtrada para pH 4,5 (para induzir a precipitação de proteínas contaminantes); (3) carregar a colheita filtrada de pH ajustado para uma coluna de corantes - ligando, por exemplo, coluna Blue- Sepharose, lavando a coluna e eluição da enzima sulfatase lisossômica proveniente da coluna, (4) carregar o eluato proveniente da coluna de corante - ligante em uma coluna de permuta aniônica, por exemplo, a coluna SE Hi-Cap, lavando a coluna e eluindo a enzima sulfatase lisossômica proveniente da coluna, e (5) e ultrafiltrar e diafiltrar o eluato a partir da permuta iônica. Opcionalmente, a colheita filtrada na etapa (1) é concentrada 10 a 20 vezes por ultrafiltração antes de ajustar o pH. Opcionalmente, a enzima sulfatase lisossômica ultrafiltratada e diafiltrada na etapa (5) é formulada em um tampão de formulação. Em uma modalidade particularmente preferida, a enzima lisossômica é um N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recom- binante humano.
[0022]Em outra modalidade preferida, as enzimas sulfatase lisossômicas são purificadas utilizando um processo de três colunas (cromatografia de captura, por exemplo, permuta aniônica SE Hi-Cap; cromatografia intermediária, por exemplo, corante - ligante Capto BlueZinc, Chelating Sepharose FF ou Capto Adhere; e cro- matografia em fase de polimento, por exemplo, Toyopearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi-Sub ou Phenyl Sepharose Low-Sub), compreendendo pelo menos cinco etapas de purificação: (1) ultrafiltrar a colheita, ou seja, meio de cultura de uma linhagem celular de CHO do grupo de complementação END3 ou derivado da mesma que expressa sulfatase humana modificando o fator 1 (SUMF1) e a enzima sulfatase lisossômica recombinante humana, por, por exemplo, Sartoon Cassettes (10 kDa , Hydrosart), (2) ajustar o pH da colheita filtrada para pH 4,5 (para induzir a precipitação de proteínas contaminantes), (3) carregar a colheita filtrada de pH ajustado para uma coluna de captura, por exemplo, permuta aniônica Fractogel EMD SE Hi- CAP (M), lavando a coluna e eluindo a enzima sulfatase lisossômica proveniente da coluna, (4) carregar o eluato proveniente da coluna de captura para uma coluna in termediária, por exemplo, corante - ligante Capto BlueZinc, Chelating Sepharose FF, ou Capto Adhere, lavando a coluna e eluindo a enzima sulfatase lisossômica proveniente da coluna, e (5) carregar o eluído em uma coluna de polimento, por exemplo, Toyopearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi-Sub ou Phenyl Sepharose Low-Sub, lavando a coluna e eluindo a enzima lisossômica proveniente da coluna . A enzima lisossômica eluída proveniente da etapa (5) é formulada em um tampão de formulação. Opcionalmente, a enzima sulfatase lisossômica eluída da etapa (5) é ultrafiltra- do e, em seguida, formulada em um tampão de formulação. Opcionalmente, a enzima sulfatase lisossômica proveniente da coluna na etapa (4) é exposta a pH 3,5 para baixa inativação viral de pH antes de carregar para a coluna de polimento na etapa (5). Em uma modalidade particularmente preferida, a enzima lisossômica é uma N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humano (GALNS).
[0023]Em um quinto aspecto, a invenção fornece uma N- acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana purificada, ativa altamente fosforilada (GALNS) ou mutante biologicamente ativo, variante ou derivado da mesma útil para tratar um indivíduo que sofre de uma doença de depósito lisossômico que é causada por (por exemplo, Mucopolissacaridose tipo IV (MPS IV) ou síndrome de Morquio A) ou associada a (por exemplo, Deficiência Múltipla de Sulfatase (MSD)) uma deficiência na enzima GALNS. Em uma modalidade preferida, a GALNS recombinante humana purificada, ativa altamente fosforilada: (a) possui uma pureza de pelo menos cerca de 90 % como determinado pela coloração Coomassie Blue quando submetidos a SDS-PAGE sob condições de não-redução, (b) tem pelo menos cerca de 90% de conversão do resíduo de cisteína na posição 53 para Cα- formilglicina (FGIy); e (c) é glicosilado ligado a N nos resíduos de asparagina nas posições 178 e 397, em que pelo menos, cerca de 50 % das cadeias de oligomannose conectadas ao resíduo de asparagina na posição 178 são bis-fosforiladas. A GALNS recombinante humana purificada, ativa altamente fosforilada consiste em uma faixa importante de cerca de 55 a 60 kDa (isto é, GALNS precursora humana sendo pelo menos, cerca de 75 %, preferencialmente pelo menos cerca de 85 %, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90 %, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95 % das proteínas visíveis) e em bandas menores ~39 kDa e ~19 kDa (isto é, GALNS de humanos maturos ou processados sendo inferior a cerca de 25 %, preferencialmente inferior a cerca de 15 %, mais preferencialmente menos que cerca de 10 %, e ainda mais preferencialmente menos que cerca de 5 % das proteínas visíveis) quando submetidos a SDS-PAGE sob condições de redução. Em uma modalidade particularmente preferida, a GALNS recombinante humana purificada, ativa altamente fosforilada consiste essencialmente em uma única faixa de cerca de 55 a 60 kDa (isto é, GALNS de humano precursor) quando submetidos a SDS-PAGE sob condições de redução. Em uma modalidade, a GALNS recombinan- te humana purificada, ativa altamente fosforilada é útil no tratamento de MPS IV ou Síndrome de Morquio. Em uma modalidade, a GALNS recombinante humana purificada, ativa altamente fosforilada é útil no tratamento de MSD.
[0024]Em um sexto aspecto, a invenção provê um método de tratamento de doenças causadas no todo ou em parte, pela deficiência, ou estão associadas a uma deficiência de uma enzima sulfatase lisossômica. O método compreende administrar uma enzima sulfatase lisossômica recombinante humana terapêutica produzida pelos métodos da presente invenção, em que a enzima sulfatase lisossômica se liga a um receptor MPR e é transportada através da membrana celular, entra na célula e é entregue aos lisossomos no interior da célula.
[0025]Em uma modalidade, o método compreende tratar um indivíduo que sofre de uma deficiência de uma enzima sulfatase lisossômica compreendendo administrar ao paciente em necessidade da mesma uma quantidade terapeuticamente eficaz da dita enzima sulfatase lisossômica, onde a dita enzima sulfatase lisossômi- ca é uma enzima sulfatase lisossômica recombinante humana ou fragmento biologi- camente ativo, mutante, variante ou derivado produzido por uma célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou um derivativo da mesma. Em algumas modalidades, o método compreende administrar uma enzima sulfatase lisossômica recombinante humana terapêutica, ou um fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou um derivado dos mesmosa, sozinhos ou em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. As modalidades preferidas incluem a otimização da dosagem para as necessidades dos indivíduos a serem tratados, preferencialmente, mamíferos e mais preferencialmente seres humanos, para de forma mais eficaz amenizar a deficiência da enzima sulfatase lisossômica.
[0026]Esta enzima sulfatase lisossômica terapêutica é particularmente úteis, por exemplo, no tratamento de pacientes que sofrem de doenças de depósito lisos- sômico causadas por uma deficiência de uma enzima sulfatase lisossômica, tais como pacientes que sofrem de Leucodistrofia Metacromática ou MLD, Mucopolissaca- ridose tipo VI (MPS VI) ou síndrome de Maroteaux-Lamy, Mucopolissacaridose tipo II (MPS II) ou síndrome de Hunter, Mucopolissacaridose tipo IIIa (MPS IIIa) ou síndro- me de Sanfilippo A, Mucopolissacaridose tipo IIId (MPS IIId) ou síndrome de Sanfilippo D e Mucopolissacaridose tipo IV (MPS IV) ou síndrome de Morquio A. Em uma modalidade particularmente preferida, a doença de depósito lisossômico é MPS IV ou Síndrome de Morquio A e a enzima sulfatase lisossômica humana recombinante é N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS). Em ainda outras modalidades, a invenção também provê composições farmacêuticas compreendendo a enzima sulfatase lisossômica deficiente causadora da doença de depósito lisossômico e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0027]Em outra modalidade, o método compreende tratar um indivíduo que sofre de uma doença de depósito lisossômico que está associada com uma deficiência em uma ou mais enzimas sulfatase lisossômicas, compreendendo administrar ao paciente em necessidade das mesmas uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma enzima sulfatase lisossômica, em que a dita enzima sulfatase lisossômica é uma N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recombinante humana ou fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivativo dos mesmos produzidos por uma célula do grupo de complementação END3 derivada de CHO ou um derivativo da mesma. Em algumas modalidades, o método compreende administrar a enzima GALNS recombinante humana terapêutica ou um fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivado dos mesmos sozinhos ou em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade particularmente preferida, a doença de depósito lisossômico é a Deficiência Múltipla de Sulfatase (MSD).
[0028]Em modalidades particularmente preferidas, a célula do grupo de complementação derivado END3 derivada de CHO ou um derivativo da mesma é uma linhagem celular de G71, uma linhagem celular de G71S ou um derivado de G71 ou de G71S.
[0029]Em ainda outra modalidade, a presente invenção provê um método de terapia de reposição enzimática administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de enzima sulfatase lisossômica a um indivíduo em necessidade da terapia de reposição enzimática, em que as células do paciente possuem lisosomas que contêm quantidades insuficientes da enzima sulfatase lisossômica para prevenir ou reduzir os danos às células, sendo que quantidades suficientes da enzima sulfatase lisossômica entram nos lisossomos para prevenir ou reduzir os danos às células. As células podem estar dentro ou fora do SNC ou não precisam ser compensados a partir do sangue pelas paredes capilares cujas células endoteliais estão estreitamente seladas à difusão de um agente ativo por junções apertadas.
[0030]Em uma modalidade particular, a invenção provê composições e composições farmacêuticas compreendendo uma enzima sulfatase lisossômica recombi- nante humana ativa, possuindo uma atividade biológica que é reduzida, deficiente ou ausente no lisossoma alvo e que é administrado ao indivíduo. As enzimas sulfatase lisossômicas humanas ativas incluem, mas não estão limitadas a, arilsulfatase A, arilsulfatse B, iduronato-2-sulfatase, sulfamidase / heparan-N-sulfatase, N- acetilglicosamina-6-sulfatase e N-acetilgalactosamina-6-sulfatase. Em uma modalidade preferida, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase é a enzima sulfatase lisossômica recombinante humana ativa.
[0031]Em uma modalidade preferida, a invenção provê um método de tratar um indivíduo que sofre de MPS IV ou Síndrome de Morquio A, ou MSD, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recombinante humana, em que a GALNS recombinante humana possui um alto nível de conversão do resíduo de cisteína do sítio ativo para Cα-formilglicina (FGIy) (isto é, pelo menos cerca de 50 %, preferencialmente pelo menos cerca de 70 %, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90 %, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95 % de conversão) e altos níveis de fosforilação (ou seja, superior a cerca de 0,25, preferencialmente superior a 0,5, e mais preferencialmente superior a cerca de 0,75 cadeias de oligomannose bis-fosforilada por cadeia de proteína).
[0032]Em uma modalidade mais preferida, a invenção provê um método de tratar um indivíduo que sofre de MPS IV ou Síndrome de Morquio A, ou MSD, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recombinante humana produzida pelas células do grupo de complementação END3, em que o GALNS recombinante humana tem um alto nível de conversão do resíduo de cisteína do sítio ativo para Cα- formilglicina (FGIy) (isto é, pelo menos cerca de 50 %, preferencialmente pelo menos cerca de 70 %, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90 %, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95 % de conversão), e altos níveis de fosforilação (ou seja, superior a cerca de 0,25, preferencialmente superior a 0,5, e mais preferenci- almente superior a cerca de 0,75 cadeias de oligomannose bis-fosforilada por proteína cadeia).
[0033]Em uma modalidade particularmente preferida, a invenção provê um método de tratar um indivíduo que sofre de MPS IV ou Síndrome de Morquio A, ou MSD, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma GALNS recombinante humana purificada, ativa altamente fosforiladas que: (a) possui uma pureza de pelo menos cerca de 90 % como determinado pela coloração Co- omassie Blue quando submetidos a SDS-PAGE sob condições de não-redução, (b) possui pelo menos cerca de 90 % de conversão do resíduo de cisteína na posição 53 para Cα-formilglicina (FGIy) e (c) é glicosilado ligados a N nos resíduos de aspa- ragina nas posições 178 e 397, em que pelo menos cerca de 50 % das cadeias de oligomannose conectadas aos resíduos de asparagina na posição 178 são bis- fosforilada. A GALNS recombinante humana purificada, ativa altamente fosforilada consiste em uma faixa importante de cerca de 55 a 60 kDa (isto é, GALNS precursora humana sendo pelo menos cerca de 75 %, preferencialmente pelo menos cerca de 85 %, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90 %, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95 % das proteínas visíveis) e em bandas menores de ~39 kDa e ~19 kDa (isto é, GALNS humana madura ou processada sendo inferior a cerca de 25 %, preferencialmente inferior a cerca de 15 %, mais preferencialmente inferior a cerca de 10 %, e ainda mais preferencialmente inferior a cerca de 5 % das proteínas visíveis) quando submetidas a SDS-PAGE sob condições de redução. Em uma modalidade mais particularmente preferida, a GALNS recombinante humana purificada, ativa altamente fosforilada é constituída essencialmente por uma única faixa de cerca de 55 a 60 kDa (isto é, GALNS humana precursora) quando submetidas a SDS-PAGE sob condições de redução.
[0034]Em algumas modalidades, o indivíduo que está sofrendo de MPS IV ou de Síndrome de Morquio A. Em algumas modalidades, o indivíduo está sofrendo de MSD.
[0035]O uso correspondente de enzimas sulfatase lisossômicas ativas altamente fosforiladas da invenção, que são preferencialmente produzidas pelos métodos da invenção, na preparação de um medicamento para o tratamento das doenças de depósito lisossômico descritas acima é também contemplado.
[0036]Em um sétimo aspecto, a presente invenção provê composições farmacêuticas compreendendo uma enzima sulfatase lisossômica recombinante humana ativa altamente fosforilada da aqui acima descrita que é útil para o tratamento de doenças causadas em todo ou em parte, ou estão associadas à deficiência de tal enzima sulfatase lisossômica, e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes far- maceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende uma N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recombinante humana ativa altamente fosforilada ou fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivado dos mesmos produzidos pelos métodos da invenção e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições farmacêuticas podem ser adequadas para administração por várias vias, tais como administração intratecal, parenteral, tópica, intranasal, inalatória ou oral. Em uma modalidade preferida, as composições farmacêuticas são adequadas para administração parenteral. Dentro do escopo deste aspecto estão as modalidades que caracterizam as sequências ácidos nucléicos codificando as enzimas sulfatase lisos- sômicas em grande escala ou fragmentos, os mutantes, variantes ou derivados dos mesmos, que podem ser administrados in vivo em células afetadas com uma deficiência da enzima lisossômica.
[0037]Em um outro aspecto, a invenção provê um método para a detecção de atividade de uma enzima sulfatase lisossômica compreendendo (a) cultivar as células condrócitas de um paciente que sofre de deficiência da enzima sulfatase li- sossômica, por exemplo, um paciente que sofre da síndrome de Morquio, sob condi- ções que promovam manutenção da diferenciação das condrócitas, (b) colocar em contato as condrócitas com uma enzima sulfatase lisossômica que degrada o sulfato de keratan (c) detectar os níveis de sulfato de keratan nas células, em que um nível de sulfato de keratan reduzido em células entraram em contato com a enzima sulfatase lisossômica em comparação com células que não entraram em contato com a enzima sulfatase lisossômica é indicativo da atividade da enzima sulfatase lisossô- mica. Em algumas modalidades, a enzima sulfatase lisossômica é N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS). Em algumas modalidades, o cultivo é realizado em meio composto por fator 1 de crescimento de insulina (IGF1), fator de crescimento transformador beta (TGF-β), transferrina, insulina e ácido ascórbico. Em algumas modalidades, o sulfato de keratan é detectado por microscopia confocal, ou através de ligação ao anticorpo do sulfato anti-keratan. O método pode ser realizado com qualquer enzima sulfatase lisossômica, incluindo a enzima que ocorre naturalmente ou recombinante humana ou fragmentos ou suas variantes, incluindo as variantes que compreendem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % idênticas à enzima humana precursora, sem a sequência de sinal, ou na forma madura da mesma.
[0038]Em ainda outro aspecto, a invenção provê um ensaio baseado em células para medir a atividade de uma enzima lisossômica recombinante humana para degradar os substratos naturais. O método compreende (a) cultivar uma célula humana isolada deficiente da enzima lisossômica sob condições em que os substratos naturais para a enzima lisossômica acumulam, (b) entrar em contato com a célula com a enzima lisossômica, (c) lisar a célula, (d) adicionar ao lisado da célula uma enzima que (i) é específica para os substratos naturais, e (ii) cliva os pequenos oli- gossacarídeos provenientes do substrato natural (e) rotulam os pequenos oligossa- carídeos com uma porção detectável; (f) opcionalmente, separar os pequenos oli- gossacarídeos rotulados; (g) detectar os pequenos oligossacarídeos rotulados e (h) determinar a atividade da enzima lisossômica para degradação dos substratos naturais, comparando (i) a quantidade de pequenos oligossacarídeos rotulados a partir de células em contato com a enzima lisossômica (ii) a quantidade de pequenos oli- gossacarídeos rotulados a partir de células não em contato com a enzima lisossômi- ca, em que a redução em (h) (i) quando comparada com (h) (ii) indica a atividade da enzima lisossômica para degradação de substratos naturais. Em uma modalidade, o pequeno oligossacarídeo é um mono-, di ou tri-sacarídeo. Em uma modalidade relacionada, o pequeno oligossacarídeo é um di-sacarídeo. Em algumas modalidades, a enzima lisossômica é selecionada a partir do grupo consistindo em arilsulfatase B (ARSB), iduronato-2-sulfatase (IDS), sulfamidase / heparina-N-sulfatase (SGSH), N- acetilglicosamina-sulfatase (G6S) e N -acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS). Em algumas modalidades, a enzima é α-L-iduronidase (IDU). Em algumas modalidades, a enzima é ácido α-glucosidase (GAA). Em algumas modalidades, a enzima é gluco- ronidase-β (GUSB). Em algumas modalidades, a enzima é β-galactosidase (GLB1).
[0039]As células humanas adequadas que podem ser utilizadas no ensaio baseado em células incluem qualquer célula humana que é deficiente da enzima lisossômica a ser testada, de modo que possa acumular os substratos naturais da enzima lisossômica. Por exemplo, as células que exibem naturalmemte uma deficiência total (100%) ou parcial da atividade, por exemplo, 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95% de redução ou mais em atividade, podem ser utilizadas. As células que expressam uma enzima mutante com atividade diminuída, ou as células derivadas de pacientes que sofrem de uma doença de depósito lisossômico, por exemplo, uma mucopolissacaridose, podem ser utilizadas. As células recombinantes alteradas para nocautear ou reduzir a atividade da enzima lisossômica, por exemplo, através da introdução de uma mutação ao gene codificador ou seu promotor ou outra região reguladora, podem ser utilizados. As células tratadas para reduzir a atividade da enzima lisossômica, por exemplo, tratadas com RNAi ou anti-sentido para reduzir a expressão da enzima, podem ser usadas.
[0040]As enzimas adequadas que clivam (digerem) os pequenos oligossaca- rídeos de carboidratos e que são "específicos para" (isto é, digerem predominantemente) os substratos naturais da enzima lisossômica podem ser selecionadas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, para detectar a atividade de GALNS ou GLBL (enzimas que degradam o sulfato de keratan) a enzima da etapa (d) pode ser Keratanase II ou qualquer enzima que actua principalmente sobre o sulfato de kera- tan. Como outro exemplo, para detectar IDU, ARSB, IDS ou GUSB (enzimas que degradam o sulfato de dermatan), a enzima da etapa (d) pode ser condroitinase ABC ou qualquer enzima que actua principalmente sobre o sulfato de dermatan. Como outro exemplo, para detectar IDU, IDS, SGHS, G6S ou GUSB (enzimas que degradam o sulfato de heparan), a enzima da etapa (d) pode ser heparanase I ou II hepa- ranase, ou ambas. Como outro exemplo, para detectar a GAA (uma enzima que degrada o glicogênio), a enzima da etapa (d) pode ser α-amilase ou qualquer enzima que atua principalmente em glicogênio.
[0041]Este método baseado em células é capaz de uma grande sensibilidade na detecção de atividade da enzima lisossômica. Em algumas modalidades, a atividade da enzima lisossômica é detectável quando a concentração de enzima li- sossômica está tão baixa quanto cerca de 10 nm, ou cerca de 5 nm, ou cerca de 1 nm, ou cerca de 0,75 nm, ou cerca de 0,5 nm, ou cerca de 0,25 nm, ou cerca de 0,1 nm, ou cerca de 0,05 nm, ou cerca de 0,01 nm, ou cerca de 0,005 nm, ou cerca de 1 pM, ou cerca de 0,5 pM.
[0042]Outras características e vantagens da invenção se tornarão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve-se entender, porém, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando as modalidades preferidas da invenção, são dadas apenas a título de ilustração, pois várias mudanças e modificações no espírito e escopo de aplicação da invenção se tornarão visíveis aos ver- sados a partir desta descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0043]A Figura 1 descreve a sequência de nucleotídeos de sulfatase humana modificando o fator 1 (SUMF1) (SEQ ID No: 1).
[0044]A Figura 2 descreve a sequência de aminoácidos de sulfatase humana modificando o fator 1 (SUMF1) (SEQ ID No: 2).
[0045]A Figura 3 descreve a sequência de nucleotídeos de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humano (GALNS) (SEQ ID No: 3).
[0046]A Figura 4 descreve a sequência de aminoácidos de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humana (SEQ ID No: 4). O peptídeo sinal de 26 aminoácidos no terminal N está ausente em GALNS processada.
[0047]A Figura 5 descreve a estrutura e as características de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humana processadas.
[0048]A Figura 6 mostra a expressão de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humana a partir de células de G71S co-transfectadas com sulfatase humana modificando o fator 1 (SUMF1) e vetores de expressão GALNS humana. (A) tela de clone G71S para GALNS ativos em 96 cavidades. (B) produtividade de GALNS do clone G71S em picogramas por célula por dia.
[0049]A Figura 7 ilustra um diagrama esquemático do controlador de biorrea- tor WAVE utilizado para a produção em grande escala das células G71S que expressam N-acetilgalaetosamina-6-sulfatase (GALNS) humana e suas variantes.
[0050]A Figura 8 mostra a estabilidade da atividade da enzima N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humana purificada sobre o armazenamento a 4 °C (diamantes) ou a -70° C (triângulos).
[0051]A Figura 9 mostra a purificação de humano N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana (GALNS) por (A) Cromatografia de Fluxo Rápido Blue Sepharose 6 seguido por (B) cromatografia Fractogel B SE Hi-PAC. A pureza é determinada por coloração Coomassie Blue de SDS-PAGE (à esquerda) e por Western blotting usando um anticorpo anti-GALNS (IVA) (à direita).
[0052]A Figura 10 mostra a purificação de N-acetil-galactosamina-6- sulfatase ser humano (GALNS) por ultrafiltração / diafiltração (UF / DF), Fractogel SE cromatografia Hi-Cap, cromatografia quelante Zn de Sepharose e cromatografia Toyopearl Butyl 650M. A pureza é determinada por coloração Coomassie Blue de SDS- PAGE (à esquerda superior) e por Western blotting usando um anticorpo anti- GALNS (à direita superior), um anti-anticorpo catepsina L (à esquerda inferior) e um anti-CHOP (proteínas de células de ovário de hamster chinês (em baixo à direita).
[0053]A Figura 11 mostra uma diminuição da dependente dose na quantidade de substrato de sulfato de dermatan que foi observada nas células GM0 1391 tratados com IDU.
[0054]A Figura 12 mostra uma diminuição dependente da dose na quantidade de substrato sulfato de dermatam foi que observada nas células GM00519 tratadas com ARSB.
[0055]A Figura 13 mostra a retenção de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humanos, ou não rotulada (círculo) ou conjugada com o A488 (quadrados) ou A555 (triângulos), por sinoviócitos cultivados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0056]A presente invenção refere-se à descoberta de um método que reconcilia a necessidade pela fabricação em grande escala de enzimas sulfatase lisossô- micas recombinantes com a exigência de um produto de enzima sulfatase lissômica ativa altamente fosforilada que seja eficiente na segmentação dos lisossomos e, portanto, é terapeuticamente eficaz.
[0057]A eficácia terapêutica de uma preparação de enzimas lisossômicas depende do nível de manose-6-fosfato, na preparação. O fosfato é adicionado à gli- coproteína alvo por uma modificação pós-translacional no retículo endoplasmático e Golgi anterior. As enzimas lisossômicas dobradas exibem um único determinante terciário que é reconhecido por uma enzima de modificação de oligossacarídeos. O determinante é composto de um conjunto de lisinas especificamente espaçadas e é encontrada na maioria das enzimas lisossômicas apesar da ausência de homologia na sequência primária. A enzima de modificação, fosfotransferase UDP-GIcNAc, liga-se ao determinante da proteína e acrescenta GIcNAc-1-fosfato à posição 6 dos resíduos do terminal de manose em oligossacarídeos próximos ao sítio de ligação; uma segunda enzima, fosfodiéster α-GlcNAcase, em seguida, cliva a ligação fosfato -GlcNAc para dar um oligossacarídeo terminal de manose-6-fosfato (Canfield et al, Patente U.S. No. 6,537,785). O objetivo da modificação de manose-6-fosfato é desviar enzimas lisossômicas da via secretora para a via lisossômica no interior da célula. A enzima de suporte de manose-6-fosfato está ligada pelo MPR no Golgi trans e encaminhado para o lisossoma, em vez da superfície celular.
[0058]Além da presença do marcador de manose-6-fosfato sobre os oligos- sacarídeos da enzima lisossômica, o encaminhamento lisossômico das enzimas depende da acidificação dos endossomos do tráfico emergindo a partir da extremidade da pilha de Golgi trans. O arrefecimento químico do ambiente acídico dentro destes endossomos com moléculas básicas difusíveis resultam em vômito do conteúdo vesicular, incluindo enzimas lisossômicas, para o meio extracelular (Braulke et al. Eur. J. Cell Biol. 43 (3): 316 - 321, 1987). A acidificação requer uma ATPase vacuolar específica incorporada dentro da membrana do endossoma) Nishi et al. Nat. Rev. Moi. Cell Biol. 3 (2): 94 - 103, 2002). O fracasso desta ATPase é esperado para aumentar a secreção de enzimas lisossômicas em detrimento do encaminhamento li- sossômico. As linhagens celulares de fabricação que carregam os defeitos na ATPase vacuolar seriam esperadas para prevenir o desvio não-produtivo da enzima recombinante fosforilada ao compartimento intracelular lisossômico.
[0059]Em 1984, células mutantes do ovário de hamster chinês (CHO mutan- tes) especificamente defeituosas na acidificação endossômica foram geradas e ca-racterizadas (Park et al. Somat. Cell Mol. Genet. 17 (2): 137 - 150, 1991). Células de CHO-K1 foram quimicamente mutagenizadas e selecionadas para a sobrevivência em temperaturas elevadas na presença de toxinas. Estas toxinas requerem acidifi- cação endossômica para a plena expressão da sua letalidade (Marnell et al, J. Cell. Biol. 99 (6): 1907 - 1916, 1984). No estudo anterior, um coquetel de duas toxinas com diferentes mecanismos de ação foram escolhidos para evitar a seleção de resistência específica à toxina. O princípio é que, enquanto a probabilidade de mutações casuais que resultem na resistência a uma toxina em particular é pequeno, a probabilidade de duas mutações simultâneas de serendipitous por duas toxinas completamente diferentes é inexistente. As seleções foram realizadas em temperatura elevada para permitir mutações sensíveis à temperatura. Esta tela genética resultou em dois mutantes, uma das quais foi designada G.7.1 (G71), que era resistente às toxinas em temperaturas elevadas. A lesão em G71 não foi devido à retenção ou mecanismo de ação das duas toxinas, mas resultam de uma incapacidade do clone para acidificar os endossomos em temperaturas elevadas. Essa incapacidade também ficou evidente em temperaturas permissivas (34°C), embora em menor grau. Células G71 também foram encontradas serem auxotróficos para o ferro em temperaturas elevadas, apesar da retenção normal de transferrina proveniente do meio (Timchak et al, J. Biol. Chem. 261 (30): 14154 - 14159, 1986). Uma vez que o ferro foi liberado da transferrina somente em pH baixo, a auxotrofia para absorção de ferro, apesar de transferrina normal indicou uma falha na acidificação endossômica. Outro estudo demonstrou que o defeito de acidificação foi manifestado primariamente em endos- somos e não em lisossomos (Stone et al, J. Biol. Chem. 262 (20) 9883 - 9886, 1987). Os dados sobre G71 foram consistentes com a conclusão de que uma mutação resultou na desestabilização da ATPase vacuolar responsável pela acidificação en- dossômica. Desestabilização foi mais evidente em temperaturas elevadas (39,5 °C), mas foi parcialmente expressa mesmo em baixas temperaturas (34 °C). Um estudo sobre o tráfico de duas enzimas endógenas lisossômicas, catepsina D e alfa- glicosidase, em células G71 (Park et al, Somat. Cell Mol. Genet. 17 (2): 137 - 150, 1991) mostrou que ambas as enzimas foram quantitativamente secretadas em tem-peraturas elevadas, e a glicosilação das enzimas não foi afetada. A secreção de al- fa-glicosidase de ácido fosforilado foi significativamente maior em temperaturas não- permissivoas.
[0060]A eficácia terapêutica de uma preparação de enzima sulfatase lisos- sômica não depende apenas do nível de manose-6-fosfato, mas também depende da presença da enzima ativa na preparação. Todass as sulfatases conhecidas contêm um resíduo de cisteína em seu sítio catalítico, este resíduo de cisteína é pós- traducionalmente modificado para Cα-formilglicina (FGIy) para ativar a enzima. Esta cisteína para ativação enzimática pós-translacional FGIy, que é catalisada pela sulfatase modificando o fator 1 (SUMF1), ocorre no retículo endoplasmático em sulfatases desdobradas imediatamente após a translação, antes da segmentação das sul-fatases para o lisossoma (Dierks et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 11963 - 11968, 1997). A importância desta única modificação pós-translacional é realçada pelo fato de que mutações em SUMF1, que resultam na formação FGIy prejudicada das enzimas sulfatase lisossômicas causa a Deficiência Múltipla de Sulfatase (MSD) no homem (Diez-Ruiz et al. Annu. Rev . Genomics Hum. Genet. 6: 355 - 379, 2005).
[0061]Assim, a capacidade das células G71, células CHO mutantes que estão com defeito na acidificação endossômica, para co-expressar a enzima sulfatase recombinante humana modificante (SUMF1) e uma enzima sulfatase lisossômica humana provê um mecanismo para a produção em grande escala de enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes humanas ativas altamente fosforiladas úteis para o gerenciamento das doenças de depósito lisossômico causadas por ou associadas a uma deficiência de tais enzimas sulfatase lisossômica.
I. DEFINIÇÕES
[0062]A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado como geralmente compreendido por um versado na técnica a que pertence esta invenção. As referências a seguir fornecem uma habilidade com uma definição geral de muitos dos termos utilizados na presente invenção: Singleton et al. DICIONÁRIO DE MICROBIOLOGIA E BIOLOGIA MOLECULAR (2d ed. 1994); O DICIONÁRIO DE CAMBRIDGE DA CIÊNCIA E TECNOLOGIA (Walker ed., 1988), O GLOSSÁRIO DA GENÉTICA, 5a ed., R. Rieger et al. (Eds.), Springer Verlag (1991); e Hale & Marham, O DICIONÁRIO DE BIOLOGIA DE HARPER COLLINS (1991).
[0063]Cada publicação, pedido de patente, patentes e outras referências citadas neste documento são incorporados por referência em sua totalidade, na medida em que não é incompatível com a presente descrição.
[0064]Note-se aqui que, como utilizados nesta especificação e nas reivindicações emanexo, as formas singulares "um", "uma" e "a" incluem a referência plural a menos que o contexto claramente dite de outra maneira.
[0065]Como utilizado aqui, os termos seguintes possuem os significados a eles atribuídos, a menos que de outra forma especificado.
[0066]"Variante alélica" se refere a qualquer uma das duas ou mais formas polimórficas de um gene que ocupa o mesmo locus genético. As variações alélicas surgem naturalmente através de mutação, e podem resultar em polimorfismo fenotí- pico dentro das populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (isto é, nenhuma mudança no polipeptídeo codificado), ou podem codificar os polipeptídeos possuindo sequências de aminoácidos alteradas. "Variantes alélicas" também se referem a cDNAs derivados de mRNA transcrito de variantes alélicas genéticas, bem como as proteínas codificadas por eles.
[0067]"Amplificação" se refere a qualquer meio pelo qual uma sequência de polinucleotídeo é copiada e, assim, expandida em um maior número de moléculas de polinucleotídeo, por exemplo, pela transcrição reversa, reação em cadeia de po- limerase e reação em cadeia de ligase.
[0068]A primeira sequência é uma “sequência de anti-sentido" em relação a uma segunda sequência se um polinucleotídeo cuja sequência for a primeira sequência especificamente hibridiza com um polinucleotídeo cuja sequência é a segunda sequência.
[0069]"cDNA" se refere a um DNA que é complementar ou idêntico a um mRNA, em qualquer forma de filamento simples ou filamento duplo.
[0070]Notação convencional é usada aqui para descrever sequências de po- linucleotídeo: a extremidade da mão esquerda de uma sequência de polinucleotídeo de único filamento é a extremidade -5'; a direção da mão esquerda de uma sequência de polinucleotídeo de filamento duplo é conhecida como a direção -5’. A direção de 5' para 3' de nucleotídeos adição de nucleotídeos para transcrições de RNA nascentes é referida como a direção da transcrição. O filamento de DNA possuindo a mesma sequência como um mRNA é referido como o “filamento de codificação”; sequências sobre o filamento de DNA possuindo a mesma sequência como um mRNA transcrito a partir desse DNA e que estão localizadas naextremidade -5' para -5'- da transcrição do RNA são referidas como "sequências a montante"; sequências sobre o DNA possuindo a mesma sequência como o RNA e que estão na extremidade -3' para -3' da transcrição do RNA de codificação são referidos como "sequências a jusante".
[0071]"Complementar" se refere à compatibilidade ou correspondência topo- lógica junto das superfícies de interação de dois polinucleotídeos. Assim, as duas moléculas podem ser descritas como complementares e, além disso, as características da superfície de contato são complementares entre si. Um primeiro polinucleotí- deo é complementar a um segundo polinucleotídeo se a sequência de nucleotídeos do primeiro polinucleotídeo for idêntica à sequência de nucleotídeos do parceiro de ligação de polinucleotídeo do segundo polinucleotídeo. Assim, o polinucleotídeo cuja sequência 5'-TATAC-3' é complementar a um polinucleotídeo cuja sequência é 5'- GTATA-3'. A sequência de nucleotídeos, é "substancialmente complementar" para uma sequência de nucleotídeos de referência se a sequência complementar à sequência de nucleotídeos indivíduo for substancialmente idêntica à sequência de nu- cleotídeos de referência.
[0072]"Substituição conservadora" se refere à substituição de um polipeptí- deo de um aminoácido com um ácido amino funcionalmente similar. Os seguintes seis grupos, cada um contém aminoácidos que são substituições conservadoras para o outro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V), e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).
[0073]O termo “fragmento” quando usado em referência a polipeptídeos se refere a polipeptídeos que são mais curtos que o polipeptídeo de comprimento total, em virtude do truncamento ou o terminal -N ou terminal -C da proteína ou ambos, e/ou por supressão de uma parte interna ou região da proteína. Fragmentos de um polipeptídeo podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica.
[0074]O termo "mutante" quando usado em referência a polipeptídeos se refere a polipeptídeos nos quais um ou mais aminoácidos da proteína tem sido substituídos por um aminoácido diferente. A substituição de aminoácidos pode ser uma substituição conservadora, como definido anteriormente, ou pode ser uma substituição não-conservadora. Os polipeptídeos mutantes podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica.
[0075]O termo "derivado", quando usado em referência a polipeptídeosse refere a polipeptídeos quimicamente modificados por técnicas como, por exemplo, e não limitado, como ubiquitinação, rotulagem (por exemplo, com radionuclídeos ou várias enzimas), polímeros de fixação covalente tal como PEGylation (isto é, derivação com polietileno glicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoá- cidos tais como a ornitina, que normalmente não ocorre em proteínas humanas. Os polipeptídeos derivados podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica.
[0076]O termo "derivado", quando usado em referência às linhagens celulares se refere a linhagens celulares que são descendentes da linhagem celular-mãe, por exemplo, este termo inclui as células que foram passadas ou subclonadas a partir de células-mãe e mantêm a propriedade desejada, os descendentes da linhagem celular-mãe que foram transformados e selecionados para a retenção da propriedade desejada, e os descendentes da linhagem celular-mãe que foram alterados para conter vetores de expressão diferentes ou ácidos nucléicos adicionados de forma exógena.
[0077]"Detectar" se refere à determinação da presença, ausência ou quantidade de um analito em uma amostra, e pode incluir a quantificação da quantidade da substância do analito em uma amostra, ou por célula em uma amostra.
[0078]"Poção detectável" ou um "rótulo" se refere a uma composição detec- tável por espectroscopia, fotoquímica, bioquímica, imunoquímica, ou por meios químicos. Por exemplo, os rótulos úteis incluem 32P, 35S, corantes fluorescentes, reagentes elétron-denso, enzimas (por exemplo, como é comumente usado em um ELISA), biotina - estreptavadina, dioxigenin, haptenos e proteínas para que soros ou anticorpos monoclonais estejam disponíveis, ou moléculas de ácido nucléico com uma sequência complementar a um alvo. A porção detectável muitas vezes gera um sinal mensurável, como um sinal radioativo, cromogênico ou fluorescente, que pode ser usado para quantificar a quantidade da porção detectável ligado em uma amostra. A porção detectável pode ser incorporada ou conectada a um primer ou uma sonda ou covalentemente ou através de ligação iônica, van der Waals ou de hidrogênio, por exemplo, a incorporação de nucleotídeos radioativos, ou nucleotídeos bio- tinilados que são reconhecidas por estreptavadina. A porção detectável pode ser direta ou indiretamente detectável. A detecção indireta pode envolver a ligação de uma segunda direta ou indiretamente porção detectável à porção detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser o ligando de um parceiro de ligação, tal como a biotina, que é um parceiro obrigatório para estreptavadina, ou uma sequência de nucleotídeos, que é o parceiro de ligação para uma sequência complementar, para a qual ele pode hibridizar especificamente. O parceiro de ligação pode por si só ser diretamente detectável, por exemplo, um anticorpo pode ser marcado por si só com uma molécula fluorescente. O parceiro de ligação também pode ser indiretamente detectado, por exemplo, um ácido nucléico possuindo uma sequência de nucleotí- deos complementares pode ser parte de uma molécula de DNA ramificado que por sua vez é detectável através de hibridação com outras moléculas de ácido nucléico marcado. (Veja, por exemplo, Fahrlander et al, Bio / Technology 6:1165, 1988). A quantificação do sinal é alcançada por, por exemplo, contagem de cintilação, densi- tometria, ou citometria de fluxo.
[0079]"Diagnóstico" significa a identificação da presença ou da natureza de uma condição patológica. Métodos diagnósticos diferem em sua especificidade e seletividade. Enquanto um determinado método de diagnóstico pode não fornecer um diagnóstico definitivo de uma condição, ele satisfaz se o método fornecer uma indicação positiva que auxilia no diagnóstico.
[0080]O termo "quantidade eficaz" significa uma dose suficiente para produzir um resultado desejado em uma condição de saúde, patologia e doença de um indivíduo ou para uma finalidade diagnóstica. O resultado desejado pode compreen- der uma melhora subjetiva ou objetiva no recipiente da dosagem. "Quantidade tera- peuticamente eficaz" se refere à quantidade de um agente eficaz para produzir o efeito pretendido benéfico para a saúde.
[0081]"Codificação" se refere à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, tal como um gene, um cDNA, ou um mRNA, para servir como modelos para a síntese de outros polímeros e macromolé- culas em processos biológicos possuindo uma sequência definida de nucleotídeos (isto é, rRNA, mRNA e tRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas que daí decorrem. Assim, um gene codifica uma proteína se a transcrição e tradução do mRNA produzido pelo gene produzir a proteína em uma célula ou outros sistemas biológicos. Ambos os filamentos de codificação, a sequência de nucleotídeos que é idêntica à sequência de mRNA e é normalmente fornecida em listagens de sequências, e o filamento não-codificante, usado como modelo para a transcrição de um gene ou o cDNA pode ser referido como codificação da proteína ou outros produtos do mesmo gene ou do cDNA. A menos que de outra forma especificado, uma "sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoáci- dos" inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. As sequências de nucleotídeos que codificam proteínas e RNA podem incluir íntrons.
[0082]"Dose equivalente" se refere a uma dose, que contém a mesma quantidade de agente ativo.
[0083]"Sequência de controle de expressão" se refere a uma sequência de nucleotídeo em um polinucleotídeo que regula a expressão (transcrição e/ou tradução) de uma sequência de nucleotídeos operatório ligadas aos mesmos. "Operativamente ligado" se refere a uma relação funcional entre duas partes em que a atividade de uma parte (por exemplo, a capacidade de regular a transcrição) resulta em uma ação sobre a outra parte (por exemplo, a transcrição da sequência). As se- quências de controle da expressão podem incluir, por exemplo, e sem limitação, as sequências de promotores (por exemplo, induzível ou constitutiva), intensificadores, terminadores da transcrição, um codon de partida (ou seja, ATG), os sinais de divisão para introns e códons de parada.
[0084]“Vetor de expressão” se refere a um vetor compreendendo um polinu- cleotídeo recombinante compreendendo as sequências de controle da expressão operativamente ligadas a uma sequência de nucleotídeos a ser expressa. Um vetor de expressão compreende elementos suficientes agindo cis para expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos aqueles conhecidos na técnica, tal como cosmids, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomos) e vírus que incorporam o polinucleotídeo recombinante.
[0085]"Altamente fosforiladas" “alto nível de fosforilação" e "alto nível de oli- gossacarídeos fosforilados" referem-se à preparação de enzimas sulfatase lisossô- mica em que pelo menos 50 % da enzima sulfatase lisossômica liga-se ao cátion independente do receptor de manose-6-fosfato através de oligossacarídeos fosfori- lados. A ligação é ainda caracterizada pela sensibilidade à competição com manose- 6-fosfato. Uma enzima sulfatase lisossômica altamente fosforilada também pode se referir a uma enzima sulfatase lisossômica com pelo menos 0,25, preferencialmente pelo menos 0,5, e mais preferencialmente pelo menos 0,75 cadeias de oligomannose bis-fosforilada por cadeia de proteína.
[0086]"Cadeias de oligomannose Bis-fosforiladas" como utilizado aqui se refere à manose contendo cadeias de oligossacarídeos que são ligados a -N a resíduos de asparagina em enzimas sulfatase lisossômicas e compreendem dois resíduos de manose-6-fosfato. Tipicamente, as cadeias de ligomannose bis-fosforiladas possuem sete resíduos de manose, ou seja, bis-fosfato manose 7 (BPM7), que estão ligadas a dois tipos de resíduos GIcNAc, que por sua vez, estão ligadas ao resíduo de asparagina na enzima sulfatase lisossômica.
[0087]"Ativo", "ativado" e "alto nível de ativação" referem-se à preparação de enzimas sulfatase lisossômica em que pelo menos 50 %, preferencialmente pelo menos 70 %, mais preferencialmente pelo menos 90 %, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95 % de resíduo de cisteína do sítio ativo da proteína foi pós- traducionalmente modificado para Cα-formilglicina (FGIy).
[0088]"Ativa altamente fosforilada" se refere à referência para a preparação de enzimas sulfatase lisossômica em que pelo menos 50 %, preferencialmente pelo menos 70 %, mais preferencialmente pelo menos 90 %, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95 % do resíduo de cisteína do sítio ativo da proteína foi pós- traducionalmente modificado para Cα-formilglicina (FGIy) e com pelo menos 0,25, preferencialmente pelo menos 0,5, e mais preferencialmente pelo menos 0,75 cadeias de oligomannose bis-fosforilada por cadeia de proteína.
[0089]O termo "biologicamente ativo" refere-se a polipeptídeo (isto é, a enzima) fragmentos, os mutantes, variantes ou derivados dos mesmos que mantenham pelo menos uma quantidade substancial (por exemplo, pelo menos cerca de 50 %, preferencialmente pelo menos cerca de 70 %, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90 %) de uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo de comprimento total. Quando usado em referência a uma enzima sulfatase lisossômica, um fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivado do mesmo mantém pelo menos uma quantidade substancial de atividade sulfatase (ou seja, a clivagem de ésteres de sulfato de seus substratos alvos). Quando usado em referência à sulfa-tase modificando o fator 1 (SUMF1), um fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivado do mesmo mantém, pelo menos, uma quantidade substancial de atividade de geração de formilglicina (isto é, a modificação do resíduo de cisteína do sítio ativo da enzima sulfatase lisossômica para Cα -formilglicina (FGIy)).
[0090]O termo “pureza” ou "puro", quando usado em referência a polipeptí- deos se refere à quantidade do polipeptídeo sendo analisado em comparação à qualquer substância contaminante que pode ser detectada através de um método particular. Para as enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes da invenção, "pureza" pode ser determinada submetendo à preparação da enzima sulfatase à separação eletroforética por SDS-PAGE sob condições de redução ou não-redução seguida por coloração com Coomassie Blue ou prata, ou por separação cromatográfica por HPLC (por exemplo, fase reversa C4 (RP)) ou por qualquer outra separação cromatográfica, por exemplo, exclucion de tamanho (SEC) e outros. Usando esses métodos, as enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes purificadas da invenção possuem uma pureza de pelo menos cerca de 80 %, preferencialmente pelo menos cerca de 90 % mais preferencialmente pelo menos cerca de 95 %, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 98 % ou 99 %.
[0091]O termo “precursor” ou "forma precursora" refere-se à forma recombi- nante da enzima sulfatase lisossômica que é secretada a partir de uma célula de mamíferos, ou seja, sem a sequência de sinal, mas faltando algumas modificações, como por exemplo, a clivagem interna das proteínas, que normalmente ocorrem no lisossoma. O termo "maduro", "forma madura" "processada” ou "forma processada" refere-se à forma recombinante da enzima sulfatase lisossômica que normalmente existe no lisossoma. Para as enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes da invenção, a abundância relativa de "precursora" ou "forma precursora" e "madura", "forma madura", "processada" ou "forma processada" pode ser determinada subme-tendo a preparação de enzima sulfatase à separação eletroforética por SDS-PAGE sob condições de redução seguidas por coloração com Coomassie Blue ou prata, ou por separação cromatográfica por HPLC (por exemplo, fase reversa C4 (RP)), ou por qualquer outra separação cromatográfica, por exemplo, exclucion de tamanho (SEC) e similares. Usando esses métodos, as enzimas sulfatase lisossômicas recombinan- tes purificadas da invenção consistem em pelo menos cerca de 75 %, preferencial- mente pelo menos cerca de 85 %, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90 %, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95 % de “precursora" ou "forma precursora". Alternativamente, usando esses métodos, as enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes purificadas da invenção consistem em menos de cerca de 25 %, preferencialmente menos que cerca de 15 %, mais preferencialmente menos que cerca de 10 %, e ainda mais preferencialmente menos que cerca de 5 % "madura", " forma madura", “processada" ou “forma processada". Em algumas modalidades, apenas a “precursora” ou "forma precursora" é detectada (ou seja, a preparação da enzima sulfatase é constituída essencialmente por uma única faixa de- tectável, quando submetida a SDS-PAGE em condições de redução ou de um único pico, quando analisados por HPLC.
[0092]Os termor "idênticos" ou “identidade” por cento no contexto de duas ou mais sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou possuem uma determinada porcentagem de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são as mesmas, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, como medida através de um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por inspeção visual.
[0093]"Ligante" se refere a uma molécula que une duas outras moléculas, seja covalentemente ou através de ligações iônica, van der Waals ou de hidrogênio, por exemplo, uma molécula de ácido nucléico que hibridiza a uma sequência complementar na extremidadel 5' e a outra sequência complementar na extremidade 3', juntando-se assim duas sequências não-complementares.
[0094]"Baixo nível de fosforilação" ou "baixa fosforilação" se refere a uma preparação de enzimas sulfatase lisossômicas em que a retenção em fibroblastos possuem um máximo de meia concentração superior a 10 nM ou a fração de enzimas sulfatase lisossômicas que ligam uma coluna receptora de manose-6-fosfato que é menor do que cerca de 25%.
[0095]"Ocorrência natural" como aplicado a um objeto se refere ao fato de que o objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de poli- nucleotídeo ou polipeptídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente alterada pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.
[0096]"Composição farmacêutica" se refere a uma composição adequada para uso farmacêutico em um animal indivíduo, incluindo os seres humanos e mamíferos. Uma composição farmacêutica compreende uma quantidade farmacologica- mente eficaz de uma enzima sulfatase lisossômica terapêutica e também compreende um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Uma composição farmacêutica compreende uma composição que compreende o(s) ingrediente(s) ativo(s), e o(s) ingrediente(s) inerte(s) que compõem o veículo, diluen- te ou excipiente, bem como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, a partir da combinação, complexação ou agregação de duas ou mais dos ingredientes, ou de dissociação de um ou mais dos ingredientes, ou de outros tipos de reações ou interações de um ou mais dos ingredientes. Assim, as composições farmacêuticas da presente invenção abrangem qualquer composição feita misturando uma enzima sulfatase lisossômica da presente invenção e um ou mais veículos, diluentes ou ex- cipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0097]"Veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis" referem-se a qualquer um dos veículos, diluentes, tampões, e excipientes farmacêuticos padrão, tais como, por exemplo, e não para limitação, uma solução salina tampona- da de fosfato, solução aquosa de 5 % de dextrose, e emulsões, tais como emulsão óleo / água ou água / óleo ou, e vários tipos de agentes umectantes e/ou adjuvantes. Os veículos, diluentes ou excipientes farmacêuticos adequados e as formulações são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Ed. 19. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Os veículos, diluentes ou excipientes farmacêuticos preferidos dependem do modo de administração do agente ativo. Os modos típicos de administração incluem, por exemplo, e não para limitação, administração enteral (por exemplo, oral) ou injeção parenteral (por exemplo, por via subcutânea, intramuscular, intravenosa ou intraperitoneal), ou tópica transdérmica ou transmucosal.
[0098]Um "sal farmaceuticamente aceitável" é um sal que pode ser formulado em uma enzima sulfatase lisossômica para uso farmacêutico, incluindo, por exemplo, sais metálicos (sódio, potássio, magnésio, cálcio, etc.) e sais de amônia ou aminas orgânicas.
[0099]"Polinucleotídeo" se refere a um polímero composto de unidades de nucleotídeos. Os polinucleotídeos incluem os ácidos nucléicos que ocorrem naturalmente, tais como o ácido desoxirribonucléico (“DNA”) eo ácido ribonucléico (“RNA”), bem como análogos de ácidos nucléicos. Os análogos de ácido nucléico incluem aqueles que incluem bases que não ocorrem naturalmente, nucleótidos que se engatam em elos com outros nucleotídeos diferentes daqueles de ligação de fosfodiéster que ocorrem naturalmente ou que incluem bases ligadas através de outros elos que não de ligações de fosfodiéster. Assim, os análogos de nucleotídeo incluem, por exemplo, e sem limitação, fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotriésteres, fosfora- midatos, boranofosfatos, metilfosfonatos, quiral-metil- fosfonatos, 2-O-metil ribonu- cleotídeos, ácido peptídeo nucléico (PNAs), e assim por diante. Tais polinucleotídeos podem ser sintetizados, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automatizado. O termo "ácido nucléico" tipicamente se refere a polinucleotídeos de grande porte. O termo “oligonucleotídeo” normalmente se refere a polinucleotídeos curtos, geralmente não superiores a cerca de 50 nucleotídeos. Deve ser entendido que quando uma sequência de nucleotídeos é representada por uma sequência de DNA (isto é, A, T, G, C), isso também inclui uma sequência de RNA (isto é, A, U, G, C) em que o "U" substitui "T."
[00100]"Polipeptídeo" se refere a um polímero composto de resíduos de aminoácidos, variantes estruturais relacionados que ocorrem naturalmente e análogos sintéticos dos mesmos que não ocorrem naturalmente ligados por ligações pep- tídicas, variantes estruturais relacionados que ocorrem naturalmente e análogos sintéticos dos mesmos que não ocorrem naturalmente. Os polipeptídeos sintéticos podem ser sintetizados, por exemplo, usando um sintetizador de polipeptídeo automatizado. O termo “proteína” normalmente se refere a polipeptídeos de grande porte. O termo “peptídeo” normalmente se refere a polipeptídeos de pequeno porte. Notação convencional é usada aqui para representar as sequências de polipeptídeos: a ex-tremidade de mão esquerda de uma sequência de polipeptídeo é o terminal - amino, a extremidade de mão direita de uma sequência de polipetídeo é o terminal - carbó- xi.
[00101]"Primer" se refere a um polinucleotídeo que é capaz de hibridizar es-pecificamente a um modelo de polinucleotídeo designado e fornecer um ponto de início para a síntese de um polinucleotídeo complementar. Tal síntese ocorre quando o primer polinucleotídeo é colocado sob condições em que a síntese é induzida, ou seja, na presença de nucleotídeos, um modelo de polinucleotídeo complementar, e um agente de polimerização, tal como DNA polimerase. Um primer é tipicamente de filamento único, mas pode ser de filamento duplo. Os primers são tipicamente ácidos desoxirribonucléicos, mas uma grande variedade de primers sintéticos e naturais é útil para muitas aplicações. Um primer é complementar ao modelo a que se destina hibridizar para servir como um sítio para o início da síntese, mas não precisa refleteir a sequência exata do modelo. Nesse caso, uma hibridização específica do primer para o modelo depende da severidade das condições de hibridização. Os primers podem ser marcados com, por exemplo, porções cromogênicas, radioativas ou fluorescentes e usadas como porções detectáveis.
[00102]"Sonda", quando usado em referência a um polinucleotídeo, se refere a um polinucleotídeo que é capaz de hibridizar especificamente a uma sequência designada de outro polinucleotídeo. A sonda hibridiza especificamente a um polinu- cleotídeo complementar alvo, mas não precisa refletir a sequência exata complementar do modelo. Nesse caso, uma hibridização específica da sonda para o alvo depende da severidade das condições de hibridização. As sondas podem ser marcadas com, por exemplo, porções cromogênicas, radioativas ou fluorescentes e usadas como metades detectáveis.
[00103]Um tratamento "profilático” é um tratamento administrado a um indivíduo que não apresenta sinais de uma doença ou apresenta apenas os primeiros sinais com a finalidade de diminuir o risco de desenvolver a patologia. Os compostos da invenção podem ser dados como um tratamento profilático para reduzir a probabilidade de desenvolver uma patologia ou para minimizar a severidade da patologia, se desenvolvida.
[00104]"Polinucleotídeo recombinante" se refere a um polinucleotídeo possuindo sequências que não são naturalmente unidos. Um polinucleotídeo recombi- nante ampliado ou montado pode ser incluído em um vetor apropriado, e o vetor pode ser usado para transformar uma célula hospedeira apropriada. Uma célula hospedeira, que compreende o polinucleotídeo recombinante é referida como uma "célula hospedeira recombinante". O gene é então expresso na célula hospedeira re- combinante para produzir, por exemplo, um "polipeptídeo recombinante". Um polinu- cleotídeo recombinante pode servir uma função não-codificante (por exemplo, o promotor, a origem de replicação, o sítio de ligação - ribossomo, etc.) também.
[00105]"Hibridizar especificamente a", "hibridização específica", ou "hibridi- zar seletivamente a" referem-se à ligação, duplexação, ou hibridização de uma molécula de ácido nucléico, preferencialmente, para uma sequência de nucleotídeos particular sob condições estritas, quando essa sequência está presente em uma mistura complexa (por exemplo, celular total) de DNA ou RNA.
[00106]O termo "condições severas" se refere às condições sob as quais uma sonda irá hibridizar preferencialmente a sua subsequência alvo, e, em menor medida, ou não em todas, outras sequências. "Hibridização severa" e "condições de lavagem severa de hibridização" no contexto de experimentos de hibridização de ácidos nucléicos, tais como hibridações de Sul e Norte são sequências dependentes, e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Técnicas de Labo-ratório em Bioquímica e Biologia Molecular, Hibridização com Sondas de Ácido Nu- cleico parte I, capítulo 2 "Resumo dos princípios da hibridação e da estratégia de ensaios em sondas de ácidos nucléicos", Elsevier, Nova York. Geralmente, a hibri- dação altamente severa e as condições de lavagem são selecionadas para serem cerca de 5 °C inferior ao ponto de fusão térmica (TM) para a sequência específica em uma força iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (em força iônica e pH definidos) em que 50 % da sequência alvo hibridiza a uma sonda perfeitamente combinada. Condições muito estritas são selecionadas para serem iguais à Tm para uma sonda particular.
[00107]Um exemplo de condições severas de hibridação para a hibridização de ácidos nucleicos complementares que possuem mais de 100 resíduos complementares sobre um filtro em um Southern ou Northern blot é formalina 50%, com 1 mg de heparina a 42 °C, com a hibridização sendo realizada durante a noite. Um exemplo das condições de lavagem altamente servera é de NaCl 0,15 M a 72 °C por aproximadamente 15 minutos. Um exemplo das condições de lavagem severa é uma lavagem de 0,2 X SSC a 65 °C por 15 minutos (ver, Sambrook et al. para uma descrição de tampão SSC). Muitas vezes, uma lavagem de alta severidade é precedida por uma lavagem de severidade baixa para remover o sinal da sonda de fundo. Um exemplo de lavagem de serveridade média para um dúplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45 °C por 15 minutos. Um exemplo de lavagem de severidade baixa para um dúplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4 a 6x SSC em 40 °C por 15 minutos. Em geral, uma relação sinal / ruído de 2x (ou superior) que a observada para uma sonda não-relacionada no ensaio de hibridização particular indica a detecção de uma hibridização específica.
[00108]Um "indivíduo" de diagnóstico ou tratamento é um animal humano ou não-humano, incluindo um mamífero ou um primata.
[00109]A expressão "substancialmente homóloga" ou "substancialmente idêntica", no contexto de dois ácidos nucléicos ou polipeptídeos, geralmente se refere a duas ou mais sequências ou subsequências que tenham pelo menos 40 %, 60 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96%, 97 %, 98 % ou 99 % de nucleotídeos ou a identidade dos resíduos de aminoácidos, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, como medida utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por inspeção visual. Preferencialmente, a identidade substancial existe sobre uma região de sequências que é pelo menos cerca de 50 resíduos de comprimento, mais preferencialmente sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, e mais preferencialmente as sequências são substancialmente idênticas sobre pelo menos cerca de 150 resíduos. Em uma modalidade mais preferida, as sequências são substancialmente idênticas por todo o comprimento de um ou ambos os biopolímeros de comparação.
[00110]Para comparação de sequência, normalmente uma sequência atua como uma sequência de referência, para que as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequência, o teste e as sequências de referência são colocados em um computador, coordenadas de subse- quência são designadas, se necessário, e os parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequência, então, calcula a porcentagem da identidade de sequência para a(s) sequência(s) teste(s) em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designado.
[00111]O alinhamento ideal de sequências para a comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 1970, pela busca pelo método da similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A. 85:2444, 1988, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual.
[00112]Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. O PILEUP cria um alinhamento múltiplo da sequência a apartir de um grupo de sequências relacionadas utilizando alinhamentos de pares progressivos para mostrar a relação e porcentagem de identidade de sequência. Ele também mostra uma árvore ou dendograma mostrando as relações de agregação utilizadas para criar o alinhamento. O PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351 - 360, 1987. O método utilizado é semelhante ao método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151 - 153, 1989. O programa pode alinhar até 300sequências, cada uma com um comprimento máximo de 5.000 nucleotídeos ou aminoácidos. O processo de alinhamento múltiplo começa com o alinhamento de pares das duas sequências mais similares, produzindo um conglomerado de duas sequências alinhadas. Este conglomerado é, então, alinhado para a próxima sequência mais relacionada ou conglomerado de sequências alinhadas. Dois conglomerados de sequências são alinhados por uma simples extensão do alinhamento de pares de duas sequências individuais. O alinhamento final é obtido por uma série de alinhamentos de pares progressivos. O programa é executado através da designação de sequências específicas e suas coordenadas de aminoácidos ou nucleotídeos para as regiões de comparação de sequência e através da designação dos parâmetros do programa. Por exemplo, uma sequência de referência pode ser comparada com outras sequências de teste para determinar a relação de porcentagem da identidade de sequência usando os seguintes parâmetros: peso padrão diferencial (3,00), peso de comprimento padrão diferencial (0,10), e os diferenciais finais ponderados. Outro algoritmo que é útil para gerar múltiplos alinhamentos de sequências é Clustal W (Thompson et al, Nucleic Acids Research 22: 4673 - 4680, 1994).
[00113]Outro exemplo de algoritmo que é adequado para determinar a porcentagem da identidade da sequência e similaridade da sequência é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403 - 410, 1990. Software para realização de análises BLAST está disponível ao público através do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia. Este algoritmo envolve primeiro identificar pares de sequência de alta pontuação (HSPs), identificando palavras curtas de comprimento W na sequência da consulta, que quer igualar ou satisfazer algumas pontuações limites de valores positivos T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento de uma sequência de dados. T é conhecido como o limite da pontuação da palavra vizinha (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403 - 410, 1990). Estes conflitos de palavras vizinhas iniciais atuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos já que os contém. Os conflituos de palavras são, então, estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, para tanto quanto a pontuação cumulativa de alinhamento pode ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas, utilizando sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (índice de recompensa por um par de resíduos sw correspondência; sempre > 0) e N (pontuação de pena de descasamento de resíduos; sempre < 0). Para as sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é utilizada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos conflitos das palavras em cada direção é interrompida quando: a pontuação cumulativa de alinhamento cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou menos, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo negativo de pontuação; ou o fim de uma sequência seja alcançado. Os parâmetros do algoritmo BLAST T W, e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W), de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = - 4, e uma comparação de ambos os filamentos. Para as sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 89:10915, 1989).
[00114]Além de calcular a porcentagem da identidade de sequência, o algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da semelhança entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873 - 5787, 1993). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de menor soma (P (N)), que fornece uma indicação da probabilidade de que uma conciliação entre duas sequências de aminoácidos ou de nucleótidos iriam ocorrer por acaso. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma sequência de referência, se a probabilidade de menor soma em uma comparação do teste de ácido nucléico para o ácido nucleico de referência é inferior a cerca de 0,1, mais preferencialmente inferior a cerca de 0,01 e mais preferencialmente inferior a cerca de 0,001.
[00115]Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucléicos ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucléico é reativo imunologicamente cruzado com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucléico, conforme descrito abaixo. Assim, um polipeptí- deo é tipicamente idêntico de forma substancial a um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os dois peptídeos diferem apenas por substituições conservativas. Outra indicação de que duas sequências de ácido nucléico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridizam umas com as outras em condições severas, como aqui descrito.
[00116]"substancialmente puro" ou "isolado", significa que uma espécie de objeto é a espécie predominante atual (ou seja, em uma base molar, mais abundante que quaisquer outras espécies macromoleculares individuais na composição), e uma fração substancialmente purificada é uma composição em que as espécies objeto compreendem pelo menos cerca de 50 % (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura significa que cerca de 80 % a 90% ou mais das espécies macromoleculares presentes na composição é a espécie purificada de interesse. A espécie de objeto é purificada à homogeneidade fundamental (espécie de contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos convencionais de detecção) se a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular. Espécies de solventes, moléculas pequenas (<500 Daltons), estabilizadores (por exemplo, BSA), e espécies de íons elementares não são consideradas espécies macromoleculares para os fins desta definição. Em algumas modalidades, as enzimas sulfatase lisos- sômicas da invenção são substancialmente puras ou isoladas. Em algumas modalidades, as enzimas sulfatase lisossômicas da invenção são substancialmente puras ou isoladas no que diz respeito às matérias-primas utilizadas macromolecular em sua síntese. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da invenção compreende uma enzima sulfatase lisossômica terapêutica substancialmente purificada ou isolada misturados com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes far- maceuticamente aceitáveis.
[00117]Um tratamento "terapêutico” é um tratamento administrado a um indivíduo que apresenta sinais ou sintomas da patologia com a finalidade de diminuir ou eliminar os sinais ou sintomas. Os sinais ou sintomas podem ser bioquímicos, celulares, histológicos, funcionais, subjetivos ou objetivo. As enzimas sulfatase lisossômi- cas da invenção podem ser dadas como um tratamento terapêutico ou de diagnósti- co.
[00118]"Índice Terapêutico" se refere ao intervalo de dose (quantidade e/ou tempo) sobre a quantidade mínima terapêutica e abaixo de uma quantidade excessivamente tóxica.
[00119]"Tratamento" se refere ao tratamento de profilaxia ou tratamento terapêutico de diagnóstico.
[00120]O termo "forma de dosagem unitária", como utilizado aqui, refere-se a adequados unidades fisicamente discretas adequadas como doses unitárias em seres humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de enzima sulfatase lisossômica da presente invenção calculada em uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado, em associação com um ou mais veículo, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As especificações para as novas formas de dosagem unitária da presente invenção dependem da enzima sulfatase lisossômica particular empregada e o efeito a ser alcançado, e a farmacodinâ- mica e associado com cada enzima sulfatase lisossômica no hospedeiro.
II. Produção de enzimas sulfatase lisossômicas
[00121]Em um aspecto, a presente invenção apresenta um novo método de produção de enzimas sulfatase lisossômicas ativas altamente fosforiladas em quantidades que permitem o uso terapêutico de tais enzimas. Em geral, o método apresenta a transformação de uma linhagem celular adequada, com a codificação do cDNA para sulfatase humana modificando o fator 1 (SUMF1) ou um fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou um derivado do mesmo e um cDNA codificando a enzima sulfatase lisossômica de comprimento longo ou fragmento biologicamente ativo, mutante, variante ou derivado do mesmo. Aqueles versados na técnica podem preparar outras construções de expressão que não aquelas expressamente descritas aqui para produção ideal de tais enzimas sulfatase lisossômicas em linhagens celulares transfectadas adequadas com o mesmo. Além disso, versados na técnica podem facilmente criar fragmentos de cDNA que codificam os fragmentos biologicamente ativos, variantes, mutantes ou derivados das SUMF1 que ocorrem naturalmente ou enzimas sulfatase lisossômicas que possuem a mesma atividade biológica ou similar às enzimas de comprimento longo que ocorrem naturalmente.
Células hospedeiras
[00122]As células hospedeiras utilizadas para produzir as enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes são linhagens celulares deficientes de acidificação en- dossômica caracterizadas pela sua capacidade de produzir tais enzimas sulfatase lisossômicas em quantidades que permitem o uso da enzima terapeuticamente. A invenção provê uma linhagem celular do grupo de complementação END3 derivada de CHO-K1, designada de G71. A invenção também provê uma linhagem celular G71, que foi adaptada para o crescimento em cultura de suspensão livre de soro, designada de G71S. A invenção também provê derivados das linhagens celulares G71 e G71S que tenham sido subclonadas adicionalmente ou que contenham plas- mídeos de expressão diferente.
[00123]As células que contêm e expressam DNA ou RNA codificando uma proteína recombinante são aqui referidas como células geneticamente modificadas. As células de mamíferos que contêm e expressam DNA ou RNA que codificam a proteína recombinante são referidas como células de mamíferos geneticamente modificadas. A introdução do DNA ou RNA nas células é através de um método de transfecção conhecido, tal como, por exemplo, e não para limitação, eletroporação, microinjeção, bombardeio de microprojétil, precipitação de fosfato de cálcio, precipitação de fosfato de cálcio modificado, tratamento de lipídios catiônicos, fotoporação, metodologias de fusão, transferência mediada pelo receptor, ou precipitação de poli- brene. Alternativamente, o DNA ou RNA pode ser introduzido por uma infecção com um vetor viral. Métodos de produção de células, incluindo células de mamíferos, que expressam DNA ou RNA que codificam uma proteína recombinante, são descritos nos Pedidos de Patentes co-pendentes U.S. No. de Série 08/334,797, intitulada "In vivo protein production and delivery system for gene therapy", por Richard F Selden, Douglas A. Treco e Michael W. Heartlein (depositado em 04 novembro de 1994); U.S. No. de Série 08/334,455, intitulada "In vivo production and delivery of erythropoietin or insulinotropin for gene therapy", por Richard F Selden, Douglas A. Treco e Michael W. Heartlein (depositado em 04 de novembro de 1994) e No. de Série 08/231,439, intitulado "Target introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy", por Douglas A. Treco, Michael W. Heartlein e F Richard Selden (depositado em 20 de abril de 1994). Os ensinamentos de cada uma destas aplicações são expressamente incorporados por referência, na sua totalidade.
[00124]Em modalidades preferidas, a célula hospedeira usada para produzir as enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes é uma linhagem celular deficiente de acidificação endossômica caracterizada pela sua capacidade de produzir tais enzimas sulfatase lisossômicas em quantidades que permitem o uso da enzima tera- peuticamente. Em modalidades preferidas, a invenção provê ainhagem celular do grupo de complementação END3 derivada de CHO-K1 designada de G71, e uma linhagem celular G71, que foi adaptada para o crescimento em cultura de suspensão livre de soro, designada G71S, que co-expressam a sulfatase humana modificando o fator 1 (SUMF1) e uma enzima sulfatase lisossômica recombinante, e são, portanto, capazes de produzir altos rendimentos de ativos enzimas sulfatase lisossômica altamente fosforilada, conforme especificado em "definições", permitindo a produção em grande escala de enzimas sulfatase lisossômicas terapêuticas. Na maioria das modalidades preferidas, a linhagem celular G71 ou G71S ou derivado da mesma expressa e segrega a enzimas sulfatase lisossômica recombinante em quantidades de pelo menos cerca de 0,5, preferencialmente pelo menos cerca de 0,75, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,0, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,25 picogramas células / dia.
Vetores e Construtos de ácido nucléico
[00125]Um construto de ácido nucléico usado para expressar a proteína re- combinante, ou sulfatase humana modificando o fator 1 (SUMF1) ou enzima sulfatase lisossômica ou ambos, pode ser aquele que é expresso de forma extra- cromossômica (episomal) na célula de mamíferos transfectada ou aquela que integra, ou de forma aleatória ou em um sítio pré-selecionado específico, através de re- combinação homóloga, no genoma da célula recipiente. Um construto que se expressa forma extra-cromossômica compreende, além de sequências de codificação de proteínas recombinantes, sequências suficientes para a expressão da proteína nas células e, opcionalmente, para a replicação do construto. Geralmente inclui um promotor, o DNA que codifica as proteínas recombinantes e um sítio de poliadenila- ção. O DNA que codifica a proteína recombinante é posicionado no construto de tal maneira que sua expressão está sob o controle do promotor. Opcionalmente, o construto pode conter componentes adicionais, tais como uma ou mais dos seguintes: um sítio de divisão, uma sequência intensificadora, um gene marcador selecio- nável sob o controle de um promotor apropriado, um gene marcador ampliável sob o controle de um promotor apropriado, e uma região de ligação da matriz (MAR) ou outro elemento conhecido pela técnica que aumenta a expressão da região onde está inserida.
[00126]Nestas modalidades em que o construto de DNA se integra ao ge- noma da célula, ele precisa incluir apenas as sequências de ácidos nucléicos que codificam as proteínas recombinantes. Opcionalmente, ele pode incluir uma sequência promotora e uma intensificadora, um sítio ou sítios de poliadenilação, um sítio ou sítios de divisão, sequências de ácido nucleico que codificam um marcador ou marcadores selecionável (is), sequências de ácido nucleico que codificam um marcador ampliável, uma região de fixação da matriz (MAR) ou outro elemento conhecido na técnica que aumenta a expressão da região onde está inserido, e/ou DNA homólogos ao DNA genômico na célula receptora, para atingir a integração do DNA para um sítio selecionado no genoma (para DNA específico ou sequências de DNA).
Métodos de Cultura Celular
[00127]As células de mamíferos contendo o DNA ou RNA que codifica a proteína recombinante são cultivadas em condições adequadas para o crescimento das células e a expressão do DNA ou RNA. Essas células que expressam a proteína recombinante podem ser identificadas, usando métodos conhecidos e métodos aqui descritos, e as proteínas recombinantes podem ser isoladas e purificadas, utilizando- se métodos conhecidos e também os métodos descritos aqui, com ou sem ampliação da produção de proteínas recombinantes. A identificação pode ser realizada, por exemplo, através da seleção de células de mamíferos geneticamente modificados, que exibem um fenótipo indicativo da presença de DNA ou RNA que codifica a proteína recombinante, tal como a triagem de PCR, triagem por análise Southern blot ou triagem para a expressão da proteína recombinante. A seleção de células que contêm incorporado o DNA que codifica a proteína recombinante pode ser realizada através da inclusão de um marcador selecionável no construto de DNA, com subsequente cultivo de células transfectadas ou infectadas contendo um gene marcador selecionável, em condições adequadas para a sobrevivência de apenas aquelas células que expressam o gene marcador de seleção. A amplificação adicional do cons- truto de DNA introduzido pode ser feita por meio de culturas de células de mamíferos geneticamente modificados em condições adequadas (por exemplo, o cultivo de células de mamíferos geneticamente modificados, contendo um gene marcador ampli- ficável na presença de uma concentração de um fármaco em que somente as células contendo várias cópias do gene marcador amplificável podem sobreviver).
[00128]As células de mamíferos geneticamente modificados que expressam a proteína recombinante podem ser identificadas, como aqui descrito, através da detecção do produto de expressão. Por exemplo, as células de mamíferos que expressam as enzimas sulfatase lisossômicas ativas altamente fosforiladas podem ser identificadas por um imunoensaio enzimático tipo sanduíche. Os anticorpos podem ser direcionados para a parte do agente ativo.
Variantes de Enzimas Sulfatase Lisossômicas
[00129]Em certas modalidades, os mutantes ou variantes das enzimas sulfatase lisossômicas ativas altamente fosforiladas podem ser preparados e serão úteis em uma variedade de aplicações nas quais as enzimas sulfatase lisossômicas ativas altamente fosforiladas podem ser utilizada. Os mutantes ou variantes da sequência de aminoácidos do polipeptídeo podem ser mutantes ou variantes de substituição, inserção ou exclusão. Os mutantes ou variantes de exclusão faltam um ou mais resíduos da proteína nativa que não são essenciais para a função ou atividade imuno- gênica. Um tipo comum do mutante ou variante de exlusão é uma falta de sequências de sinais de secreção ou sequências de sinal direcionando uma proteína para ligar a uma determinada parte de uma célula. Os mutantes ou variantes de inserção tipicamente envolvem a adição de material em um ponto não-terminal do polipeptí- deo. Isso pode incluir a inserção de um epítopo immuno-reactivo ou simplesmente um resíduo único. As adições do terminal, também chamadas de proteínas de fusão, são discutidas abaixo.
[00130]As variantes podem ser substancialmente homólogas ou substancialmente idênticas à enzima sulfatase lisossômica não-modificada nos termos acima definidos. As variantes preferidas são aquelas que são variantes de um polipeptídeo da enzima sulfatase lisossômica ativa altamente fosforilada, que mantém pelo menos alguma da atividade biológica, por exemplo, atividade sulfatase, da enzima sulfatase lisossômica. Outras variantes preferenciais incluem as variantes de um poli- peptídeo N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humano que mantém pelo menos algumas das atividades sulfatase do N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humano.
[00131]Os mutantantes ou variantes substitutional tipicamente trocam um aminoácido do polipeptídeo do tipo selvagem para outro em um ou mais sítios dentro da proteína, e podem ser projetados para modular uma ou mais propriedades do polipeptídeo, como, por exemplo, e não para limitação, a estabilidade contra clivagem proteolítica, sem a perda de outras funções ou propriedades. As substituições deste tipo, preferencialmente são conservativas, ou seja, um aminoácido é substituído por uma da forma e carga similar. As substituições conservativas são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, as mudanças de: alanina para serina, arginina para lisina; asparagina para glutamina ou histidina; aspartato para glutama- to; cisteína para serina, glutamina para asparagina; glutamato para aspartato; glicina para prolina; histidina para asparagina ou glutamina, isoleucina para leucina ou valina; leucina para valina ou isoleucina, lisina para arginina; metionina para leucina ou isoleucina; fenilalanina para tirosina, leucina para metionina, serina para treonina; treonina para serina, triptofano para tirosina; tirosina para triptofano ou fenilalanina; e valina para isoleucina ou leucina.
[00132]Um aspecto da presente invenção contempla a geração de mutantes ou variantes de sítios de glicosilação em que o sítio de glicosilação O- ou ligados a N da enzima sulfatase lisossômica foi transformada. Tais mutantes ou variantes irão render informações importantes relativas à atividade biológica, estrutura física e potencial de ligação do substrato da enzima sulfatase lisossômica ativa altamente fos- forilada. Em certos aspectos, é contemplada a possibilidade de outros mutantes ou variantes do polipeptídeo da enzima sulfatase lisossômica ativa altamente fosforilada poderem ser gerados de forma que retenham a atividade biológica, mas tiveram a atividade de ligação do substrato aumentada ou diminuída. Como tal, as mutações do sítio ativo ou região catalítica são particularmente contempladas, a fim de gerar os mutantes ou variantes da proteína com atividade de ligação do substrato alterada. Em tais modalidades, a sequência das enzimas sulfatase lisossômicas ativas alta- mente fosforiladas é comparada com a das outras enzimas relacionadas e os resíduos selecionados são especificamente mutados.
[00133]Numerando os aminoácidos da proteína madura proveniente do terminal de aminoácido putativo como o aminoácido número 1, as mutações exemplares que podem ser úteis incluem, por exemplo, a substituição de todas ou algumas das asparaginas potencialmente glicosiladas, incluindo as posições 178 e 397 da N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) (ver Figura 5).
[00134]A ligação de substrato pode ser modificada por mutações no / próximo ao sítio ativo da enzima sulfatase lisossômica. Levando em consideração que tais mutações são exemplares, aqueles versados na técnica irão reconhecer que outras mutações da sequência de enzima podem ser feitas para fornecer informações funcionais e estruturais adicionais sobre esta proteína e sua atividade.
[00135]A fim de construir mutantes ou variantes, tais como os descritos acima, um versado na técnica pode empregar tecnologias padrão bem-conhecidas. Especificamente contempladas são as exclusões do terminal N, exclusões do terminal C, exclusões internas, bem como a mutagênese aleatória e em ponto.
[00136]As exclusões do terminal N e do terminal C são formas de muta- géneses que levam vantagem, por exemplo, da presença de um único sítio de restrição adequado próximo da extremidade da região do terminal C ou N. O DNA é clivado no sítio e as extremidades cortadas são degradadas por nucleases tais como BAL31, exonuclease III, DNase I, e nuclease S1. Reunir as duas extremidades produz uma série de DNAs com exclusões de tamanho variável em torno do sítio de restrição. As proteínas expressas a partir de mutantes podem ser ensaiadas para função biológica adequada, por exemplo, atividade enzimática, utilizando técnicas padrão na técnica, e descrito na especificação. Técnicas similares podem ser em-pregadas para os mutantes de exclusão interna usando dois sítios de restrição devidamente colocados, permitindo assim uma exclusão precisamente definida para ser feita, e as extremidades a serem religadas como acima.
[00137]Também são contemplados os mutantes de digestão parcial. Em tais casos, um versado na técnica empregaria um "cortador frequente", que corta o DNA em diversos lugares, dependendo do comprimento do tempo de reação. Assim, variando as condições de reação, será possível gerar uma série de mutantes de tamanho variável, que pode então ser selecionado para a atividade.
[00138]A mutação de inserção aleatória também pode ser realizada através do corte das sequências de DNA com DNase I, por exemplo, e inserindo um trecho de nucleotídeos que codificam, 3, 6, 9, 12, etc, aminoácidos e religam a extremidade . Uma vez que essa mutação é feita os mutantes podem ser rastreados para várias atividades apresentadas pela proteína do tipo selvagem.
[00139]A mutagênese de ponto também pode ser empregada para identificar com particularidade que os resíduos de aminoácidos são importantes, em atividades particulares associadas à atividade biológica da enzima sulfatase lisossômica. Assim, um versado na técnica será capaz de gerar mudanças de base única no filamento de DNA para resultar em um códon alterado e uma mutação missense.
[00140]Os aminoácidos de uma proteína particular podem ser alterados para criar um equivalente, ou mesmo uma molécula de segunda geração melhorada. Tais alterações contemplam a substituição de um determinado aminoácido da proteína, sem perda significativa da capacidade de ligação interativa com estruturas como, por exemplo, as regiões de ligação de antígenos de anticorpos ou sítios de ligação nas moléculas de substrato ou receptores. Uma vez que é a capacidade interativa e a natureza de uma proteína que define qual a atividade funcional biológica da proteína, algumas substituições de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de proteínas, e em sua sequência de codificação de DNA marcada, e, no entanto, obter uma proteína com propriedades semelhantes. Assim, várias mudanças podem ser feitas nas sequências de DNA de genes sem perda significativa de sua utilidade ou ativi- dade biológica, como discutido abaixo.
[00141]Ao fazer essas alterações, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. Admite-se que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez, define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos, e assim por diante. Cada aminoácido tem sido atribuído um índice hidropático, com base em suas características de hidrofobicidade e carga (Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol., 157 (1): 105 - 132, 1982, aqui incorporado por referência). Geralmente, os aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoá- cidos que possuem um índice hidropático similar ou pontuação e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica semelhante, ou seja, ainda obter uma proteína biológica funcionalmente equivalente.
[00142]Além disso, a substituição de aminoácidos pode ser feita de forma eficaz com base na hidrofilicidade. A patente U.S. 4,554,101, aqui incorporada por referência, afirma que a maior a hidrofilicidade média local de uma proteína, como governada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com uma propriedade biológica da proteína. Como tal, um aminoácido pode ser substituído por outro possuindo um valor de hidrofilicidade similar e ainda obtém uma proteína biologicamente equivalente e imunologicamente equivalente.
[00143]Substituições exemplares de aminoácidos que podem ser usadas neste contexto da invenção incluem, mas não estão limitadas a troca de arginina e lisina, glutamato e aspartato, serina e treonina, glutamina e asparagina, e valina, leucina e isoleucina. Outras tais substituições que levam em conta a necessidade de retenção de alguma ou toda a atividade biológica, enquanto altera a estrutura secundária da proteína será bem conhecido aos versados na técnica.
[00144]Um outro tipo de variante que está contemplado para a preparação de polipeptídeos de acordo com a invenção é a utilização de peptídeos miméticos. Os miméticos são moléculas contendo peptídeos, que imitam elementos de estrutura secundária da proteína. Veja, por exemplo, Johnson et al, " Peptide Turn Mimetics" em biotecnologia e farmacêutica, Pezzuto et al, Eds., Chapman and Hall, Nova York (1993). A lógica subjacente ao uso de miméticos de peptídeo é que a espinha dorsal de peptídeos de proteínas existe principalmente para orientar as cadeias laterais de aminoácidos, de modo a facilitar as interações moleculares, tais como aqueles anticorpo e antígeno. Um mimético de peptídeo é esperado para permitir a interação molecular semelhante à molécula natural. Estes princípios podem ser utilizados, em conjunto com os princípios descritos acima, para projetar as moléculas de segunda geração que muitas das propriedades naturais das enzimas sulfatase lisossômicas, mas com as características alteradas e até melhoradas.
Glicosilação modificada de Enzimas Sulfatase Lisossômicas
[00145]As variantes de uma enzima sulfatase lisossômica ativa altamente fosforilada também podem ser produzidas com um padrão de glicosilação alterada em relação ao polipeptídeo de origem, por exemplo, excluir uma ou mais porções de carboidratos e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no polipeptídeo nativo.
[00146]A glicolisação costuma ser ligada a N ou ligada a O. Ligada a N refere-se à conexão da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de aspara- gina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a conexão enzimática da porção de carboidrato para a cadeia lateral de aspa- ragina. A presença de uma dessas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. Assim, os sítios de glicosilação ligados a N podem ser adicionados a um polipeptídeo, alterando a sequência de aminoácidos tal que contenha uma ou mais destas sequências de tripeptídeo. A glicosilação ligada a O se refere à conexão de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilo- se a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5- hidroxilisina ou 5- hidroxiprolina também podem ser utilizados. Os sítios de glicosila- ção ligados a O podem ser adicionados inserindo ou substituindo um ou mais resíduos de serina ou treonina na sequência do polipeptídeo original.
Comutação de domínio
[00147]Diversas porções de proteínas da enzima sulfatase lisossômica possuem uma grande quantidade de homologia de sequência. As mutações podem ser identificadas em polipeptídeos da enzima sulfatase lisossômica que podem alterar a sua função. Estes estudos são potencialmente importantes para pelo menos duas razões. Primeiro, eles fornecem uma expectativa razoável de que ainda outros homólogos, mutantes e variantes alélicos deste gene podem existir em espécies relacionadas, tais como ratos, coelhos, macacos, gibão, chimpanzé, macaco, babuíno, vaca, porco, cavalo, ovelha e o gato. Após o isolamento desses homólogos, as variantes e os mutantes, e em conjunto com outras análises, certos domínios ativos ou funcionais podem ser identificados. Em segundo lugar, este será um ponto de partida para a análise mutacional adicional da molécula como descrito acima. Uma maneira pela qual esta informação pode ser explorada é a "comutação de domínio"
[00148]A comutação de domínio envolve a geração de moléculas recombi- nantes utilizando polipeptídeos diferentes, mas relacionados. Por exemplo, comparando a sequência de uma enzima sulfatase lisossômico, por exemplo, N-acetil- galactosamina-6-sulfatase, com que de uma enzima sulfatase lisossômica similar a partir de outra fonte e com mutantes e variantes alélicos destes polipeptídeos, pode- se fazer previsões quanto às regiões funcionalmente importantes dessas moléculas. É possível, então, comutar os domínios relacionados destas moléculas em um esforço para determinar a criticidade destas regiões para função enzimática e efeitos em doenças de depósito lisossômico. Estas moléculas podem ter um valor adicional na medida em que estas “quimeras” podem ser distinguidas a partir de moléculas natu- rais, embora, eventualmente, proporcionando a mesma função, ou mesmo reforçada.
[00149]Com base nas enzimas sulfatase lisossômicas numerosas agora a serem identificadas, uma análise adicional de mutações e seus efeitos previstos na estrutura secundária irá acrescentar a este entendimento. É contemplado que os mutantes que comutam os domínios entre as enzimas sulfatase lisossômicas irão fornecer informação útil sobre a relação entre estrutura e função dessas moléculas e os polipeptídeos com os quais eles interagem.
Proteínas de Fusão
[00150]Além das mutações descritas acima, a presente invenção contempla ainda a geração de um tipo especializado de variante de inserção conhecida como uma proteína de fusão. Esta molécula geralmente possui toda ou uma parte substancial da molécula nativa, ligada ao terminal N ou C, a toda ou uma parte de um segundo polipeptídeo. Por exemplo, as fusões tipicamente empregam sequências líderes a partir de outras espécies para permitir a expressão recombinante de uma proteína em um hospedeiro heterólogo. Outra fusão útil inclui a adição de um domínio imunologicamente ativo, tal como um epítopo de anticorpos, para facilitar a purificação da proteína de fusão. A inclusão de um sítio de clivagem ou próximo da junção de fusão irá facilitar a remoção do polipeptídeo estranho após a purificação. Outras fusões úteis incluem a ligação dos domínios funcionais, tais como sítios ativos das enzimas, os domínios de glicosilação, sinais de segmentação celulares ou regiões transmembrana.
[00151]Existem vários sistemas de expressão da proteína de fusão comercialmente disponível que podem ser utilizados na presente invenção. Particularmente os sistemas úteis incluem, mas não estão limitados a, sistema glutationa S- transferase (GST) (Pharmacia, Piscataway, NJ), o sistema de proteína de ligação de maltose (NEB, Beverley, MA), o sistema FLAG (IBI, New Haven, CT), o sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Estes sistemas são capazes de produzir polipeptí- deos recombinantes suportando apenas um pequeno número de aminoácidos adicionais, que são susceptíveis de afetar a capacidade antigênica do polipeptídeo re- combinante. Por exemplo, tanto o sistema FLAG e o sistema 6xHis adicionam somente seqüências curtas, as quais são conhecidas por serem mal antigênicos e que não afetam adversamente o dobramento de polipeptídeos para sua conformação nativa. Outra fusão do terminal N que é contemplada para ser útil é a fusão de um dipeptídeo Met-Lys, na região do terminal N da proteína ou peptídeos. Essa fusão pode produzir um aumento benéfico na expressão de proteínas ou atividade.
[00152]Um construto de fusão particularmente útil pode ser um no qual um polipeptídeo da enzima sulfatase lisossômica ativa altamente fosforilada ou seu fragmento é fundido a um hapteno para aumentar a imunogenicidade de um construto de fusão da enzima sulfatase lisossômica. Isso pode ser útil na produção de anticorpos para enzima sulfatase lisossômica ativa altamente fosforilada para permitir a detecção da proteína. Em outras modalidades, um construto de fusão pode ser feito o que irá intensificar o direcionamento das composições relacionadas à enzima sulfatase lisossômica a um sítio específico ou celular.
[00153]Outros construtos de fusão incluindo um peptídeo heterólogo com propriedades desejadas, por exemplo, um motivo para orientar a enzima sulfatase lisossômica para um determinado órgão, tecido ou tipo de célula. Em uma modalidade preferida, um construto de fusão incluindo um peptídeo alvo de osso, por exemplo, resíduos de ácido aspártico 6 (6xAsp ou 6D) fundido a uma enzima sulfatase lisossômica pode ter como alvo a enzima para sítios particulares no osso.
[00154]Outros construtos de fusão incluindo um polipeptídeo heterólogo com propriedades desejadas, por exemplo, uma região Ig constante para prolongar a meia-vida do soro ou um anticorpo ou fragmento do mesmo também para direcionar é contemplada. Outros sistemas de fusão produzem híbridos de polipeptídeo onde é desejável para extirpar o parceiro de fusão do polipeptídeo desejado. Em uma modalidade, a parceira de fusão está associada ao polipeptídeo da enzima sulfatase lisos- sômica ativa recombinante altamente fosforilada por uma seqüência de peptídeos contendo uma seqüência de reconhecimento específico para uma protease. Exemplos de seqüências disponíveis são aqueles reconhecidos pela protease Tobacco Etch Virus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ou Fator Xa (New England Biolabs, Beverly, MA).
Derivativos
[00155]Como dito acima, um derivado refere-se a polipeptídeos modificados quimicamente por tais técnicas como, por exemplo, e não para limitação, de ubiquiti- nação, rotulagem (por exemplo, com radionuclídeos ou várias enzimas), fixação de polímeros covalentes como PEGylation (derivatização com polietileno glicol) e de inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos, tais como ornitina. Derivados da enzima sulfatase lisossômica também são úteis como agentes terapêuticos e podem ser produzidos pelos métodos da invenção.
[00156]Polietilenoglicol (PEG) pode ser associado à enzima sulfatase lisos- sômica produzida pelos métodos da invenção para prover uma meia-vida mais longa in vivo. O grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linear ou ramificada. O peso médio molecular do PEG irá variar preferencialmente do intervalo de cerca de 2 kiloDaltons (“KDa”) a cerca de 100 kDa, mais preferencialmente de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, mais preferencialmente de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa. Os grupos PEG serão geralmente conectados às enzimas sulfatase lisossômicas da invenção por acilação ou alquilação redutiva através de um grupo reativo na porção PEG (por exemplo, um aldeído, amino, tiol, ou grupo éster) para um grupo reativo da porção de proteína (por exemplo, um aldeído, amino ou um grupo éster). A adição de porções PEG de polipeptídeos de interesse pode ser realizada usando técnicas bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, publi- cação internacional No. WO 96/11953 e Patente U.S. No. 4,179,337.
[00157]A ligação do polipeptídeo da enzima sulfatase lisossômica com PEG ocorre geralmente na fase aquosa e pode ser facilmente controlado por fase reversa HPLC analítica. Os peptídeos PEGylated podem ser facilmente purificados por HPLC preparativo e caracterizados por HPLC analítico, análise de aminoácidos e espectrometria de massa de dessorção a laser.
Rótulos
[00158]Em algumas modalidades, a enzima sulfatase lisossômica terapêutica é rotulado para facilitar a sua detecção. Um “rótulo” ou uma “porção detectável" é uma composição detectável por espectroscopia, fotoquímica, bioquímica, imunoquí- mica, químicos, ou outros meios físicos. Por exemplo, os rótulos adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, os rótulos radioativos (por exemplo, 32P), fluoróforos (por exemplo, fluoresceína), reagentes elé- tron-denso, enzimas (por exemplo, como é comumente usado em um ELISA), biotina, digoxigenina, ou haptenos, bem como as proteínas que podem ser feitas detec- táveis, por exemplo, pela incorporação de um radiorótulo para o hapteno ou peptí- deo, ou utilizados para detecção de anticorpos especificamente reativos com o hap- teno ou peptídeo.
[00159]Exemplos de rótulos adequados para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, corantes fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína, Texas vermelho rodamina, e assim por diante), radiorótulos (por exemplo, 3H, 125I, 35S, 14C ou 32P), enzimas (por exemplo, cavalo peroxidase de rabanete, fosfatase alcalina e outros comumente usados em um ELISA) e rótulos colo- rimétricos como ouro coloidal, vidro colorido ou contas de plástico (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.)
[00160]O rótulo pode ser acoplado diretamente ou indiretamente para o componente desejado da enzima sulfatase lisossômica de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Preferencialmente, o rótulo em uma modalidade é ligado co- valentemente à enzima sulfatase lisossômica utilizando um reagente de isocianato para a conjugação de um agente ativo de acordo com a invenção. Em um aspecto da invenção, os reagentes bifuncionais de isocianato da invenção podem ser usados para conjugar um rótulo para uma enzima sulfatase lisossômica para formar um conjugado da enzima sulfatase lisossômica do rótulo sem um agente ativo conectado ao mesmo. O conjugado da enzima sulfatase lisossômica do rótulo pode ser utilizado como intermediário para a síntese de um conjugado rotulado de acordo com a invenção, ou pode ser usado para detectar o conjugado da enzima sulfatase lisossô- mica. Como indicado acima, uma grande variedade de rótulos pode ser usada, com a escolha do rótulo dependendo da sensibilidade necessária, a facilidade de conjugação com o componente desejado da enzima sulfatase lisossômica, necessidade de estabilidade, instrumentação disponível e provisão à disposição. Os rótulos não- radioativos são muitas vezes conectados por meios indiretos. Geralmente, uma molécula do ligando (por exemplo, biotina) é ligado covalentemente à enzima sulfatase lisossômica. O ligando então se liga a uma outra molécula (por exemplo, estreptavi- dina), que é inerentemente detectável ou covalentemente ligada a um sistema de sinal, tal como enzimas detectáveis, um composto fluorescente, ou um composto quimioluminescente.
[00161]As enzimas sulfatase lisossômicas da invenção também podem ser conjugadas diretamente aos compostos geradores de sinal, por exemplo, pela conjugação com uma enzima ou fluorofore. Enzimas adequadas para uso como rótulos incluem, mas não estão limitadas a, hidrolases, especialmente fosfatases, esterases e glicosidases ou oxidotases, particularmente peroxidases. Os compostos fluorescentes, ou seja, fluoroforos, adequados para uso como rótulos incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansyl, umbelliferone, etc. Outros exemplos de fluoroforos adequados incluem, mas não es- tão limitados a, eosina, amina TRITC, quinina, fluoresceína W, amarelo de acridina, rodamina lisamina, eritrosceína de cloreto de sulfonila B, rutênio (tris, bipiridinium), Texas Red, dinucleotídeo de adenina nicotinamida, dinucleotídeo de flavina adenina, etc. Os compostos quimioluminescentes adequados para uso como rótulos incluem, mas não estão limitados a, luciferina e 2,3 -dihidroftalazinedionas, por exemplo, luminol. Para uma revisão dos vários sistemas de rotulagens ou de produção de sinais ou que podem ser usados nos métodos da presente invenção, ver Patente U.S. No. 4,391,904.
[00162]Meios de detecção de rótulos são bem conhecidos àqueles versados na técnica. Assim, por exemplo, onde o rótulo for radioativo, os meios de detecção incluem um contador de cintilação ou película fotográfica, como na autoradiografia. Quando o rótulo for um rótulo fluorescente, pode ser detectada excitando o fluoro- cromo com o comprimento de onda apropriado da luz adequada e detectando a fluorescência resultante. A fluorescência pode ser detectada visualmente, através da utilização de detectores electrônicos, como o dispositivo de carga acoplada (CCDs) ou fotomultiplicadores e similares. Da mesma forma, os rótulos enzimáticos podem ser detectados através do fornecimento de substratos apropriados para a enzima e detectando o produto de reação resultante. Os rótulos colorimétricos ou quimiolumi- nescentes podem ser detectados simplesmente pela observação da cor associada ao rótulo. Outros sistemas de detecção e rotulagem apropriados para o uso nos métodos da presente invenção serão facilmente perceptíveis para os versados na técnica. Esses moduladores e ligandos rotulados podem ser utilizados no diagnóstico de uma doença ou condição de saúde.
[00163]Em uma modalidade preferida, o método compreende a etapa de produção de enzimas sulfatase lisossômicas ativas altamente fosforiladas a partir de linhagens celulares com defeitos no tráfico endossômico. Em uma modalidade particularmente preferida, o método compreende a etapa de produção de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recombinante humana ativa altamente fos- foriladas a partir da linhagem celular de CHO G71, ou um derivativo da mesma. A produção de enzimas lisossômicas sulfatase, tais como, por exemplo, e não para limitação, GALNS, compreende as etapas de: (a) desenvolver uma linhagem celular derivada de G71 ou de G71 que co-expresse uma enzima sulfatase lisossômica re- combinante humana, por exemplo, N-acetil-galactosamina-6-sulfatase (GALNS), e sulfatase recombinante humana modificando o fator 1 (SUMF1), (b) cultivar a enzima sulfatase lisossômica e linhagens celulares que co-expressam SUMF1, e (c) ampliar a enzima sulfatase lisossômica humana e as linhagens celulares que co- expressam SUMF1 para um biorreator para produção de enzimas sulfatase lisossô- micas. Em modalidades preferidas, a enzima sulfatase lisossômica humana, por exemplo, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS), e cDNAs de SUMF1 humanos são subclonados em vetores de expressão de mamífero, basicamente, como aqui descrito abaixo.
[00164]Para o desenvolvimento da linhagem celular, G71 ou G71S, um clone G71 adaptado para o crescimento em cultura de suspensão livre de soro, foi co- transfectado com um vetor de expressão de mamíferos de GALNS humana, um vetor de expressão de mamífero de SUMF1 humana e um gene marcador selecionável e transformante estáveis foram selecionados. Após uma primeira rodada de subclo- nagem de transfectantes estáveis, linhagens celulares foram selecionadas a partir do substrato fluorescente e especificamente designado. As linhagens celulares G71 ou G71S foram analisadas para a produtividade de células específicas (pg do produto / celular) de rotores com microcarregadores ou em cultura de suspensão, respectivamente. Os melhores produtores de GALNS humana foram identificados e dimensio-nados até o biorreator para a produção de material pré-clínico.
[00165]Em outra modalidade, a invenção provê um ensaio baseado em células para medir a atividade de uma enzima lisossômica recombinante humana para degradação de substratos naturais. O método compreende (a) cultivar uma célula isolada humana deficiente na enzima lisossômica sob condições nas quais os substratos naturais para a enzima lisossômica acumulam, (b) colocar em contato a célula com a enzima lisossômica, (c) lisar a célula, (d) adicionar à célula lisada uma enzima que (i) é específica para os substratos naturais, e (ii) cliva os oligossacarídeos de pequeno porte dos substratos naturais (e) rotular os oligossacarídeos de pequeno porte com uma porção detectável; (f) opcionalmente, separar os oligossacarídeos de pequeno porte rotulados; (g) detectar os oligossacarídeos de pequeno porte rotulados e (h) determinar a atividade da enzima lisossômica para degradar os substratos naturais, comparando (i) a quantidade de oligossacarídeos de pequeno porte rotulados a partir de células em contato com a enzima lisossômica com (ii) a quantidade de oligossacarídeos de pequeno porte rotulados a partir de células que não em contato com a enzima lisossômica, em que uma redução em (h) (i) quando comparado com (h) (ii) indica a atividade da enzima lisossômica para degradação de substratos naturais. Em uma modalidade, o oligossacarídeo de pequeno porte é mono-, di ou tri-sacarídeo. Em uma modalidade relacionada, o oligossacarídeo de pequeno porte é um dissacarídeo.
[00166]Em algumas modalidades, a enzima lisossômica é selecionada a partir do grupo consistindo em arilsulfatase B (ARSB), iduronato-2-sulfatase (IDS), sulfamidase / heparina-N-sulfatase (SGSH), N-acetilglicosamina-sulfatase (G6S) e N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS). Em algumas modalidades, a enzima lisos- sômica é α-L-iduronidase (IDU). Em algumas modalidades, a enzima lisossômica é ácido α-glicosidase (GAA). Em algumas modalidades, a enzima é β-glucoronidase (GUSB). Em algumas modalidades, a enzima é β-galactosidase (GLBL).
[00167]As células humanas adequadas que podem ser utilizadas no ensaio baseado em células incluem qualquer célula humana que é a deficiência na enzima lisossômica para ser testada, de modo que possa acumular os substratos naturais da enzima lisossômica. Por exemplo, as células que naturalmente exibem uma deficiência total (100%) ou parcial da atividade, por exemplo, 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % de redução ou mais em atividade, podem ser utilizadas. Células que expressam uma enzima mutante com atividade diminuída, ou células derivadas de pacientes que sofrem de uma doença de depósito lisossômico, por exemplo, uma mu- copolissacaridose, podem ser utilizadas. As células alteradas de forma recombinante para nocautear ou reduzir a atividade da enzima lisossômica, por exemplo, através da introdução de uma mutação ao gene que codifica ou seu promotor ou outra região reguladora, podem ser utilizadas. Células tratadas para reduzir a atividade da enzima lisossômica, por exemplo, tratadas com anti-senso ou RNAi para reduzir a expressão da enzima, podem ser usadas.
[00168]As enzimas adequadas que clivam (digerem) os oligossacarídeos de pequeno porte a partir de carboidratos e que são "específicas para" (isto é, predominantemente digerir) os substratos naturais da enzima lisossômica podem ser selecionadas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, para detecção de atividade de GALNS ou GLB1 (enzimas que degradam o sulfato de keratan) a enzima da etapa (d) pode ser Keratanase II ou qualquer enzima que actua primariamente sobre o sulfato de keratan. Como outro exemplo, para a detecção de IDU, ARSB, IDS ou GUSB (enzimas que degradam o sulfato de dermatan), a enzima da etapa (d) pode ser condroitinase ABC ou qualquer enzima que atua primariamente sobre o sulfato de dermatan. Como outro exemplo, para a detecção de IDU, IDS, SGHS, G6S ou GUSB (enzimas que degradam o sulfato de heparan), a enzima da etapa (d) pode ser heparanase I ou heparanase II, ou ambos. Como ainda outro exemplo, para detecção de GAA (uma enzima que degrada o glicogênio), a enzima da etapa (d) pode ser α-amilase ou qualquer enzima que atua primariamente no glicogênio.
[00169]Este método baseado em células é capaz de uma grande sensibilidade na detecção de atividade da enzima lisossômica. Em algumas modalidades, a atividade da enzima lisossômica é detectável quando a concentração de enzima está tão baixo como cerca de 10 nM, ou cerca de 5 nM, ou cerca de 1 nM, ou cerca de 0,75 nM, ou cerca de 0,5 nM, ou cerca de 0,25 nM, ou cerca de 0,1 nM, ou cerca de 0,05 nM, ou cerca de 0,01 nM, ou cerca de 0,005 nM, ou cerca de 1 pM, ou cerca de 0,5 pM.
III. PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS SULFATASE LISOSSÔMICAS
[00170]O material de biorreator contendo GALNS recombinante humano foi de 0,2 μm estéril filtrado e mantido a 4° C. O material de bioreactor foi carregado uma coluna de captura diretamente, ou concentrado 10 a 20 vezes por ultra-filtração antes de o carregar para uma coluna de captura. O material biorreator ou material biorreator concentrado foi ajustado o pH para pH 4,5 e, em seguida, carregado para uma coluna Blue-Sepharose, lavado seqüencialmente com acetato / fosfato20 mM, NaCl 50 mM, pH 4,5 e acetato / fosfato20 mM, NaCl 50 mM, pH 6,0 e eluída com 20 RNM acetato / fosfato, NaCl 100 mM, pH 7,0. O eluído da coluna Blue-Sepharose foi então carregado para Fractogel SE Hi-Cap, lavado seqüencialmente com acetato / fosfato 20 mM, NaCl 50 mM, pH 5,0 e acetato / fosfato20 mM, NaCl 50 mM, pH 5,5 e eluído com 20 mM acetato / fosfato, 50-350 mM gradiente de NaCl, pH 5.5. O eluído Fractogel SE Hi-Cap foi formulado em NaOAc 10 mM, NaH2PO4 1 mM, 0,005 % de Tween-80, pH 5,5.
[00171]Alternativamente, o material de biorreator contendo GALNS recombi- nante humana foi concentrada 20 vezes por ultra-filtração antes de o colocar em uma coluna de captura. O material de biorreator concentrado foi ajustado o pH para pH 4,5, filtrado e, em seguida, carregado para uma coluna Fractogel SE Hi-Cap, lavado sequencialmente com acetato / fosfato 10 mM, NaCl 50 mM, pH 4,5 e acetato / fosfato 10 mM, NaCl 50 mM, pH 5,0 e eluído com acetato / fosfato 10 mM, NaCl140 mM, pH 5.0. O eluído de Fractogel SE Hi-Cap foi então ajustado para NaCl 500 mM, pH 7,0 e carregado para Sepharose quelante de Zn (coluna Zn-IMAC), lavado com de acetato / fosfato 10 mM, NaCl 125 mM, imidazol 10 mM, pH 7,0 e eluído com acetato / fosfato 10 mM, NaCl 125 mM, imidazol 90 mM, pH 7,0. O eluído da coluna Sepharose quelante de Zn (Zn-IMAC) foi ajustado para pH 3,5 para a inativação viral de pH baixo, ajustado para acetato / fosfato 10 mM, NaCl 2M, pH 5,0, e depois carregados em uma coluna de butila Toyopearl 650M, lavado com acetato / fosfato 10 mM, NaCl 2M, pH 5,0 e eluído com de acetato / fosfato 10 mM, NaCl 0,7 M, pH 5,0. O eluído de Toyopearl Butyl 650M foi ultra-filtrado e filtrado ao dia em acetato 20 mM, fosfato 1 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5, e então formulado em acetato 20 mM, fosfato 1 mM, NaCl 150 mM, 0,01% Tween-20, pH 5,5.
[00172]A purificação de GALNS recombinante humana é descrita em detalhe abaixo, e a purificação de GALNS recombinante humana seguinte aos procedimentos modificados a partir do protocolo acima é descrita em detalhe abaixo.
[00173]A enzima GALNS recombinante humana foi expressa em células G71S como descrito no Exemplo III e purificada como descrito no Exemplo V. A GALNS recombinante humana purificada da invenção pode ser comparada a outras preparações documentadas de GALNS. Masue et al. Biochem J.. 110: 965 - 970, 1991 descreveram a purificação e caracterização de GALNS a partir da placenta humana. A enzima purificada foi encontrada para ter uma massa molecular de 120 kDa, consistindo em polipeptídeos de 40 kDa e 15 kDa, o último dos quais foi mostrado para ser uma glicoproteína. Assim, a enzima GALNS de Masue et al. parece corresponder à forma processada descrita na Figura 5. Bielicki et al. Biochem. J. 279: 515 - 520, 1991 descreveu a purificação e caracterização de GALNS do fígado humano. Quando analisadas por SDS-PAGE, a enzima apresentou massa molecular de 70 kDa sob condições não-redutoras e massa molecular 57 kDa, 39 kDa e 19 kDa sob condições de redução. Bielicki et ah, Biochem J. 311: 333 - 339, 1995 descreveram a purificação e caracterização de GALNS recombinante humana a partri de células de ovário de hamster chinês. A enzima purificada em SDS-PAGE foi encon- trada para ter uma massa molecular de 58 a 60 kDa em condições não-redutoras e massa molecular de 55 a 57 kDa, 39 kDa e 38 kDa sob condições de redução. Assim, as enzimas GALNS de Bielicki et al parecem corresponder a uma mistura da forma pré-processada (precursor) da enzima e processadas sob a forma mostrada na Figura 5. Em contrapartida, a enzima GALNS recombinante humana da invenção consiste em quase inteiramente da forma precursora da enzima (ver Figura 9), ou predominantemente (ou seja, pelo menos cerca de 85 %) da forma precursora da enzima (ver Figura 10).
IV. ENZIMAS SULFATASE LISOSSÔMICAS E DOENÇAS DE DEPÓSITO LISOSSÔMICO
[00174]A enzima sulfatase lisossômica é uma enzima de comprimento longo ou qualquer fragmento, mutante, variante ou um derivado dos mesmos, que mantém, pelo menos uma quantidade substancial (por exemplo, pelo menos cerca de 50 %, preferencialmente pelo menos cerca de 75 % e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90 %), de praticamente todas, ou toda a atividade terapêutica ou biológica (por exemplo, a atividade sulfatase) da enzima.
[00175]Em algumas modalidades, a enzima sulfatase lisossômica é aquela que, se não expressa, ou produzida ou se substancialmente reduzida na expressão ou produção, daria origem a uma doença, incluindo, mas não limitado a, as doenças de depósito lisossômico. Em algumas modalidades, a enzima sulfatase lisossômica é aquela que, se não expressa, ou produzida, ou se substancialmente reduzida na expressão ou produção, não pode dar origem a uma doença, mas cuja ausência ou expressão ou produção reduzida está associada com a doença, incluindo, mas não limitado a, doenças de depósito lisossômico. Preferencialmente, a enzima sulfatase lisossômica é derivada ou obtida a partir de um ser humano.
[00176]Preferencialmente, no tratamento de doenças de depósito lisossômi- co, a enzima sulfatase lisossômica é uma enzima que é encontrada em uma célula que se não expressa ou produzida ou estiver substancialmente reduzida em expressão ou produção, daria origem a uma doença de depósito lisossômico. Alternativamente, no tratamento de doenças de depósito lisossômico, a enzima sulfatase é uma enzima lisossômica cuja ausência ou redução substancial de expressão ou de produção está associada com a doença, apesar de sua ausência ou expressão ou produção substancialmente reduzida, não se pode dar origem à doença. Preferencialmente, a enzima sulfatase lisossômica é derivada ou obtida a partir de um ser humano.
[00177]Preferencialmente, a enzima é uma enzima sulfatase lisossômica, como a arilsulfatase A (ARSA) (Genbank No. de Adesão NP_300478 (isoforma a), Genbank No. de Adesão NP_001078897 (isoforma b) e outras variantes), arilsulfa- tase B / N- acetilglicosamina 4 -sulfatase (ARSB) (Genbank No. de Adesão P15848), iduronato-2-sulfatase (IDS) (Genbank No. de Adesão NP_000193 (isoforma a), Genbank No. de Adesão NP_006114 (isoforma b)), sulfamidase/heparin- N-sulfatase (SGSH) (Genbank No. de Adesão NP_000190), N-acetilglicosamina-sulfatase (G6S) (Genbank No. de Adesão NP_002067) e galactose 6 -sulfatase/N- acetilgalactosamine-6-sulfatase (GALNS) (Genbank No. de Adesão NP_000503). A tabela de doenças de depósito lisossômico e a deficiência das enzimas sulfatase lisossômicas na mesma, são úteis como agentes terapêuticos, do seguinte modo:
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Figure img0002
[00178]Em modalidades preferidas, a enzima sulfatase lisossômica é uma enzima sulfatase lisossômica recombinante humana produzida por uma linhagem celular deficiente de acidificação endossômica. Em mais modalidades preferidas, a enzima sulfatase lisossômica recombinante humana é ativa e tem um alto nível de oligossacarídeos fosforilados, conforme especificado em "Definições". Na maioria das modalidades preferidas, a enzima sulfatase lisossômica é uma N- acetilgalactosamina-6 sulfatase-(GALNS) recombinante humana ativa altamente fos- forilada.
[00179]Assim, as doenças de depósito lisossômico que podem ser tratadas ou prevenidas usando os métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Leucodistrofia Metacrômica ou MLD, síndrome de Maroteaux-Lamy ou MPS VI, síndrome de Hunter ou MPS II, Síndrome de Sanfilippo ou MPS IIIa, sín- drome de Sanfilippo D ou MPS IIId, e síndrome de Morquio A ou MPS IV. Em uma modalidade particularmente preferida, a enzima sulfatase lisossômica é tal que a sua deficiência causa a síndrome de Morquio A ou MPS IVa. Em outra modalidade particularmente preferida, a enzima sulfatase lisossômica é tal que sua deficiência está associada a uma doença de depósito lisossômico humano, tal como Deficiência múltipla de sulfatase ou MSD.
[00180]Assim, pela tabela acima, para cada doença a enzima sulfatase isos- sômica preferencialmente compreenderia uma enzima sulfatase lisossômica ativa específica deficiente na doença. Por exemplo, para os métodos que envolvem MPS II, a enzima preferida é iduronato-2-sulfatase. Para os métodos que envolvem MPS IIIA, a enzima preferida é sulfamidase / heparina-N-sulfatase. Para os métodos que envolvem MPS IIID, a enzima preferida é N-acetilglicosamina 6-sulfatase. Para os métodos envolvendo MPS IVA, a enzima preferida é galactose 6-sulfatase / N- aceti- lgalactosamina-6-sulfatase. Para os métodos que envolvem MPS VI, a enzima preferida é N-acetilgalactosamina 4-sulfatase. Para os métodos que envolvem Leukodis- tropia Metacromática (MLD), a enzima preferidad é arilsulfatase A. Para os métodos que envolvem Deficiência Múltipla de Sufatase (MSD), a enzima pode ser arilsulfa- tase A, arilsulfatase B / N-acetilglicosamina 4-sulfatase, iduronato-2-sulfatase, sulfa- midase/heparina-N-sulfatase, N-acetilglicosamina-sulfatase ou galactose 6- sulfatase/N-acetilgalactosamine-6-sulfatase, e a enzima preferida é galactose 6- sulfatase/N-acetilgalactosamine-6-sulfatase.
V. MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO IV (SÍNDROME DE MORQUIO, MPS IVA)
[00181]Mucopolissacaridose tipo IV (Síndrome de Morquio, MPS IVA) é uma doença rececessiva autossômica, hereditária pertencente ao grupo das doenças de depósito de mucopolissacarídeos. A síndrome de Morquio é causada por uma deficiência de uma enzima lisossômica necessária para a degradação de duas glicosami- noglicanas (GAGs), sulfato de keratan (KS) e condroitina-6-sulfato (C6S). Especificamente, a MPS IV é caracterizada pela ausência da enzima N-acetilgalactosamina- 6-sulfatase (GALNS), e a excreção de KS na urina. A falta de GALNS resulta na acumulação de quantidades anormalmente grandes de mucopolissacarídeos na cartilagem hialina, um componente principal do tecido esquelético. Todos os pacientes têm uma displasia esquelética sistêmica. Outros sintomas variam na gravidade de paciente para paciente e podem incluir perda auditiva, catarata, instabilidade espi-nhal, doença da válvula cardíaca e problemas respiratórios, entre outros.
[00182]A GALNS hidrolisa as ligações de sulfato éster de galactose-6-sulfato a partir de KS e N-acetilgalactosamina-6-sulfato a partir de C6S. GALNS humana é expressacomo uma proteína precursora de 55 a 60 kDa e com apenas dois sítios potenciais de glicosilação ligados a asparagina. Manose-6-fosfato (M6P) faz parte de oligossacarídeos presentes na molécula GALNS. M6P é reconhecido por um receptor na superfície da célula lisossômica e, portanto, é crucial para a retenção eficaz de GALNS.
[00183]Como todas as sulfatases, GALNS precisa ser processada por uma enzima de ativação da formilglicina (FGE) codificada pela sulfatase modificando o gene de fator 1 (SUMF1) para ganhar atividade. Devido a esta etapa de ativação, envolvendo a modificação pós-translacional de um resíduo de cisteína do sítio ativo para Cα-formilglicina (FGIy), a sobre-expressão de sulfatases recombinante pode conduzir a produção de enzimas sulfatase com baixa atividade específica (isto é, uma mistura de enzimas sulfatase ativadas e não ativadaos) e com título de baixa produção (ou seja, degradação e/ou não-secreção de sulfatases não ativadas).
[00184]Um objeto da presente invenção é fornecer uma enzima N- acetilgalactosamina-6-sulfatase humana ativa altamente fosforilada útil para o tratamento da Síndrome de Morquio e de outras doenças, por exemplo, Deficiência Múltipla de Sulfatase (MSD), que são causadas por ou associados com uma deficiência da enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase. Tal enzima N-acetilgalactosamina-6- sulfatase humana ativa altamente fosforilada tem a capacidade de localizar os tecidos em que KS e C6S acumulam, tem níveis adequados M6P para retenção eficaz, tem percentuais suficientemente elevados de FGIy para atividade enzimática, e tem relativamente altos níveis de produção.
[00185]Deve ser entendido que os métodos da invenção aqui descritos são aplicáveis à produção de outras enzimas sulfatase lisossômicas, por exemplo, arilsulfatase A (ARSA), arilsulfatase B / N-acetilglicosamina 4-sulfatase (ARSB), idu- ronato-2-sulfatase (IDS), sulfamidase / heparina-N-sulfatase (SGSH) e N- acetilglucosamina-sulfatase (G6S), útil para o tratamento de doenças de depósito lisossômico, que são causadas ou caracterizadas por sua deficiência da mesma.
VI. COMPOSIÇÕES E ADMINISTRAÇÃO FARMACÊUTICAS
[00186]As enzimas sulfatase lisossômicas da invenção podem ser administradas por uma variedade de vias. Para as preparações orais, as enzimas sulfatase lisossômicas podem ser usadas sozinhas ou em combinação com aditivos adequados para fazer comprimidos, pós, grânulos ou cápsulas, por exemplo, com aditivos convencionais, como a lactose, manitol, amido de milho ou amido de batata, com ligantes, tais como celulose cristalina, derivados de celulose, acácia, amido de milho ou gelatinas; com desintegradores, como amido de milho, amido de batata ou carbo- ximetilcelulose de sódio, com lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, se desejado, com diluentes, agentes de tamponamento, agentes de umedecimen- to, conservantes e aromatizantes.
[00187]As enzimas sulfatase lisossômicas da invenção podem ser formuladas em preparativos para a injeção por dissolução, suspensão ou emulsificando-os em um solvente aquoso ou não aquoso, tais como óleos vegetais ou outros similares, glicerídeos de ácidos alifáticos sintético, ésteres de ácidos alifáticos ou superiores ou propilenoglicol, e se desejar, com aditivos convencionais, tais como solubili- zantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsificantes, estabili- zantes e conservantes.
[00188]As enzimas sulfatase lisossômicas da invenção podem ser utilizadas na formulação de aerossol a ser administrada por via inalatória. As enzimas sulfatase lisossômicas da invenção podem ser formuladas em propulsores pressurizados aceitáveis como dichlorodifluorometano, propano, nitrogênio e assim por diante.
[00189]Além disso, as enzimas sulfatase lisossômicas da invenção podem ser feitas em supositórios, misturando com uma variedade de bases, tais como bases emulsificantes ou bases solúveis em água. As enzimas sulfatase lisossômicas da invenção podem ser administradas através de um supositório retal. O supositório pode incluir veículos, tais como a manteiga de cacau, carbograxas e polietileno gli- cóis, que derretem à temperatura do corpo, ainda são solidificados em temperatura ambiente.
[00190]As formas de dosagem única das enzimas sulfatase lisossômicas da invenção para a administração oral ou retal, tais como xaropes, elixires, e suspensões podem ser fornecidos onde cada unidade de dosagem, por exemplo, colher, colher de sopa, comprimidos ou supositórios, contém uma quantidade predeterminada de uma enzima sulfatase lisossômica contendo agente ativo. Do mesmo modo, as formas de dosagem unitária para injeção ou administração intravenosa podem incluir a enzima sulfatase lisossômica como uma solução em água destilada, soro fisiológico ou outro veículo farmaceuticamente aceitável.
[00191]Na prática, as enzimas sulfatase lisossômicas da invenção podem ser combinadas como o ingrediente ativo em mistura íntima com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis de acordo com as técnicas convencionais de manipulação farmacêutica. O veículo, diluente ou excipiente pode ter uma grande variedade de formas, dependendo da forma preferível de preparação desejada para a administração, por exemplo, oral ou parenteral (inclusive por via intravenosa). Na preparação das composições da enzima sulfatase lisossô- mica para forma de dosagem oral, qualquer dos meios farmacêuticos usuais podem ser empregados, como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromati- zantes, conservantes, agentes de coloração e similares, no caso de preparações líquidas orais, por exemplo, suspensões, elixires e soluções, ou veículos, tais como amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes de desintegração e, como no caso das preparações sólidas orais, por exemplo, pós, cápsulas moles e duras e comprimidos, com as preparações sólidas orais preferencialmente sobre as preparações líquidas.
[00192]No que diz respeito às vias de administração transdérmica, métodos para a administração transdérmica de fármacos são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Edição 17, (Gennaro et al. Eds. Mack Publishing Co., 1985). Manchas cutâneas ou de pele são um meio preferido para a administração transdérmica das enzimas sulfatase lisossômicas da invenção. As manchas preferencialmente fornecem um intensificador de absorção, tal como DMSO para aumentar a absorção das enzimas sulfatase lisossômicas. Outros métodos de liberação de fármacos transdérmicos são descritos na Pat. U.S. Nos. 5,962,012, 6,261,595 e 6,261,595, cada um dos quais será incorporada por referência, na sua totalidade.
[00193]Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como veículos, adjuvantes, transportadoras ou diluentes, estão disponíveis comercialmente. Além disso, substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, tais como ajuste de pH e agentes de tamponamento, agentes de ajuste de tonicidade, estabilizadores, agentes umectantes e similares, também estão disponíveis comercialmente.
[00194]Em cada um destes aspectos, as composições de enzimas sulfatase lisossômicas incluem, mas não estão limitadas a, composições adequadas para administração oral, retal, tópica, parenteral (incluindo por via subcutânea, intramuscular e intravenosa), pulmonar (inalação nasal ou bucal), ou nasal, embora a via mais adequada em cada caso irá depender em parte da natureza e da gravidade das condições a serem tratadas e sobre a natureza do ingrediente ativo. As vias exemplares de administração são as vias oral e venosa. As composições de enzimas sulfatase lisossômicas podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e preparadas por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica da farmácia.
[00195]Devido à sua facilidade de administração, os comprimidos e cápsulas representam a forma de unidade de dosagem oral mais vantajosa, caso em que os veículos farmacêuticos sólidos são obviamente empregados. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos por técnicas aquosa ou não aquosa padrão. A por- centagem de uma enzima sulfatase lisossômica ativa nessas composições podem, naturalmente, ser variada e pode ser convenientemente entre cerca de 2 por cento a cerca de 60 por cento do peso da unidade.
[00196]As composições das enzimas sulfatase lisossômicas da invenção podem ser administradas encapsuladas ou conectadas a envelopes ou vesículas virais, ou incorporadas em células. As vesículas são partículas micelulares que são geralmente esféricas e que são frequentemente lipídicas. Os lipossomas são vesículas formadas a partir de uma membrana de bicamada. As vesículas apropriadas incluem, mas não estão limitadas a, vesículas lipídicas unilamelares e vesículas multi- lamelares ou lipossomas. Essas vesículas e lipossomos podem ser feitas a partir de uma ampla gama de lipídeos ou compostos fosfolipídeos, tal como a fosfatidilcolina, ácido fosfatídico, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina sfingomielin, glicolipídios, gangliosídeos, etc. usando técnicas padrão, tais como as aquelas descritas em, por exemplo, patente U.S. No. 4,394,448. Essas vesículas ou lipossomas podem ser usados para administrar enzimas sulfatase lisossômicas de forma intracelular e entregar as enzimas sulfatase lisossômicas para os órgãos alvo. A liberação controlada de uma enzima sulfatase lisossômica de interesse também pode ser conseguida usando encapsulamento (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5,186,941).
[00197]Qualquer via de administração que dilui a composição da enzima sulfatase lisossômica na corrente sanguínea, ou, preferencialmente, pelo menos fora da barreira hemato-encefálica, pode ser utilizada. Preferencialmente, a composição da enzima sulfatase lisossômica é administrada perifericamente, mais preferencialmente por via intravenosa ou por cateter cardíaco. Injeções intrajugular e intracarotídica também são úteis. As composições de enzimas sulfatase lisossômicas podem ser administradas localmente ou regionalmente, como por via intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. Em um aspecto, as composições de enzimas lisossômicas sulfatase são administradas com um ou mais veículo, diluente ou excipiente farma- ceuticamente aceitáveis.
[00198]Aqueles versados na técnica irão facilmente compreender que as doses podem variar como uma função da enzima sulfatase lisossômica específica, a severidade dos sintomas e a susceptibilidade do indivíduo aos efeitos colaterais. As dosagens preferidas para uma determinada enzima sulfatase lisossômica são prontamente determináveis por aqueles versados na técnica por uma variedade de meios, incluindo, mas não limitado a, a resposta de dose e avaliações farmacocinéticas conduzidas em pacientes, em animais de teste e in vitro.
[00199]As dosagens a serem administradas podem também depender das necessidades individuais, no efeito desejado, na enzima sulfatase lisossômica particular utilizada, bem como na via escolhida para a administração. As dosagens de uma faixa de enzima sulfatase lisossômica de cerca de 0,2 pmol / kg a cerca de 20 nmol / kg, doses preferidas variam de 2 pmol / kg a 2 nmol / kg, e doses particularmente preferidas variam de 2 pmol / kg a 200 pmol / kg. Alternativamente, as doses da enzima sulfatase lisossômica podem estar na faixa de 0,01 a 1000 mg / kg, doses preferenciais podem estar na faixa de 0,1 a 100 mg / kg, e doses particularmente preferidas de 0,1 a 10 mg / kg. Essas doses serão influenciadas, por exemplo, e não para limitação, a enzima sulfatase lisossômica particular, a forma da composição farmacêutica, via de administração, bem como o sítio de ação da enzima sulfatase lisossômica particular.
[00200]As enzimas sulfatase lisossômicas da invenção são úteis para a intervenção terapêutica, profilaxia e diagnóstico em animais e, em especial nos seres humanos. As enzimas lisossômicas sulfatase podem apresentar acúmulo preferencial em tecidos específicos. As indicações médicas preferidas para uso de diagnóstico incluem, por exemplo, qualquer condição associada a um órgão alvo de interesse (por exemplo, pulmão, fígado, rim, baço).
[00201]Os métodos indivíduo encontrar uso no tratamento de uma variedade de condições diferentes da doença. Em certas modalidades, de interesse particular é o uso dos métodos indivíduo em condições de doença em que uma enzima sulfatase lisossômica ter desejado a atividade tenha sido previamente identificado, mas em que a enzima sulfatase lisossômica não está devidamente entregue no local de destino, zona ou compartimento para produzir um resultado plenamente satisfatório te-rapêutico. Com tais enzimas sulfatase lisossômicas, os métodos de produção de indivíduos ativos altamente fosforiladas enzimas sulfatase lisossômicas pode ser usado para melhorar a eficácia terapêutica e baixo índice terapêutico da enzima sulfatase lisossômico.
[00202]O tratamento é destinado a englobar todos os resultados benéficos a um indivíduo associado à administração de uma enzima sulfatase lisossômica incluindo uma probabilidade reduzida de adquirir uma doença, a prevenção de uma doença, retardar, parar ou reverter a progressão de uma doença ou uma melhora dos sintomas associados com a condição da doença que aflige o hospedeiro, onde a melhora ou benefício é usado em um sentido amplo para referir-se a pelo menos uma redução na magnitude de um parâmetro, por exemplo, um sintoma, associado com a patologia a ser tratada, tal como inflamação e dor que lhe estão associadas. Como tal, o tratamento inclui também situações em que o estado patológico, ou pelo menos sintomas associados com o mesmo, são completamente inibidos, por exemplo, impedidos de acontecer, ou parados, por exemplo, terminados, de forma que o hospedeiro não sofra com o estado patológico, ou pelo menos já não sofra com os sintomas que caracterizam a condição patológica.
[00203]Uma variedade de hospedeiros ou indivíduos pode ser tratada de acordo com os métodos descritos. Geralmente esses hospedeiros são "mamíferos" ou "mamíferos", onde esses termos são amplamente utilizados para descrever os organismos que estão dentro da classe Mamíferos, incluindo as ordens de carnívoros (por exemplo, cães e gatos), roedores (por exemplo, ratos, cobaias e ratos), e os primatas (por exemplo, humanos, chimpanzés e macacos). Em muitas modalidades, os hospedeiros serão os seres humanos.
[00204]Tendo agora geralmente descrita a invenção, a mesma pode ser mais facilmente entendida através da seguinte referência aos exemplos a seguir, que fornecem protocolos exemplares para a produção e purificação de enzimas sulfatase lisossômicas ativas altamente fosforiladas e sua utilização no tratamento de doenças de depósito lisossômico. Os exemplos são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção, de qualquer maneira. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão no que diz respeito ao número utilizado (por exemplo, as quantidades, as temperaturas, etc.), mas algum erro experimental e desvio devem, é claro, ser previsto.
EXEMPLOS EXEMPLO I VETORES DE EXPRESSÃO DE MAMÍFEROS PARA SULFATASE HUMANA MODIFICANDO O FATOR 1 (SUMF1) E N-ACETILGALACTOSAMINA 6- SULFATASE (GALNS) HUMANA
[00205]O objetivo foi construir vetores de expressão de mamífero apropriados para a produção de quantidades adequadas de células estavelmente transfecta- das de enzimas sulfatase lisossômicas ativas com os níveis de fosforilação melhorados.
[00206]A sulfatase humana de comprimento longo modificando o cDNA de fator 1 (SUMF1) (ver, Pedidos de Patente dos Estados Unidos Nos. U.S. 20005/0123949, data da publicação 09 de junho de 2005, e U.S. 2004/0229250, data da publicação 08 novembro de 2004, ambos os quais são aqui incorporados por referência, na sua totalidade), que codifica um polipeptídeo de 374 aminoácidos, foi clonado no vetor de expressão de mamífero cDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contém os promotores intensificadores CMV de humanos e um sítio de clonagem múltipla. A terminação de transcrição eficaz foi assegurada pela presença da sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento de bovinos. O marcador de seleção era um gene de resistência de zeocin sob o controle do promotor EM-7 e SV40 antes da sequência de poliadenilação. O plasmídeo resultante foi designado pcDNA4 SUMF1. As sequências de polinucleotídeo SUMF1 humano (SEQ ID NO: 1) e o polipeptídeo (SEQ ID NO: 2) são mostradas na Figura 1 e Figura 2, respectivamente.
[00207]O cDNA da N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana de comprimento longo (GALNS) (ver Tomatsu et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 181 (2) :677 - 683, 1991), que codifica um polipeptídeo de 522 aminoácidos incluindo um peptídeo sinal de 26 aminoácidos, foi clonado no vetor de expressão de mamíferos pCIN (BioMarin), que contém o promotor - intensificador CMV humano ligado ao íntron β-globina IVS2 de coelho e um sítio de clonagem múltipla. A terminação da transcrição eficaz foi assegurada pela presença da sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. O marcador de seleção foi um gene neomicina fos- fotransferase que carrega uma mutação de ponto para diminuir a eficácia das enzimas. O marcador foi novamente atenuado com o promotor HSV-tk fraco. O plasmí- deo resultante foi designado pCIN 4A. As sequências de polinucleotídeo GALNS humana (SEQ ID NO: 3) e de polipeptídeo (SEQ ID NO: 4) são mostradas na Figura 3 e Figura 4, respectivamente.
[00208]Para aumentar os níveis de expressão de SUMF1 e GALNS, elementos de andaime / região de fixação da matriz (MAR) (ver Mermod et al, Patente U.S. No. 7,129,062) foram clonados no plasmídeo de expressão de SUMF1 e GALNS.
[00209]BMAR SUMF1 foi feito digerindo P <1_68 x_x ncol preenchida MAR (Selexis) com BamHI e HincII, e depois inserir o fragmento MAR liberado para pcD- NA4 SUMF1 digerido com BgIII e Nrul.
[00210]PMAR SUMF1 foi feito digerindo P <1_68 ncol preenchido (MAR) SV40 EGFP (Selexis) com HindIII e XbaI para remover o gene EGFP, e depois inserir o gene SUMF1, que foi libertado da pcDNA4 SUMF1 por digestão com HindIII e XbaI.
[00211]BMAR 4A foi feito digerindo BMAR SUMF1 com Pmel e Spel para remover o gene SUMF1, e depois inserindo o gene GALNS, que foi lançado a partir de pCIN 4A por digestão com Pmel e Spel.
[00212]PMAR 4A foi feito digerindo P <1_68 ncol preenchido (MAR) SV40 EGFP (Selexis) com HindIII e XbaI para remover o gene EGFP, e depois inserir o gene GALNS, que foi libertado da pCIN 4A por digestão com HindIII e XbaI.
[00213]O cDNA de GALNS humano de comprimento total também foi clona- do no vetor de expressão de mamífero pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). pCDNA4 SUMF1 foi digerido com HindIII e XbaI para remover o SUMF1 cDNA e pCIN 4A foi digerido com HindIII e XbaI para isolar o cDNA GALNS. Os fragmentos de cDNA GALNS Hindlll / XbaI foi ligado ao fragmento Hindlll / XbaI do vetor p/cDNA4. O plasmídeo resultante foi designado pcDNA4-4A.
[00214]A integridade do gene GALNS no pCIN 4A, BMAR e vetores de expressão pCDNA4-4A foi confirmada por mapeamento de restrição usando enzimas obtidas a partir de New England Biolabs. O vetor de expressão PMAR 4A não foi mapeado.
[00215]A estrutura da forma totalmente transformada de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humana é mostrada na Figura 5. GALNS é expresso como um polipeptídeo de 522 aminoácidos com uma sequência de peptí- deo sinal de 26 aminoácidos. Um polipeptídeo GALNS de 496 aminoácidos é secre- tado como uma forma pré-processada (precursora) da enzima com um peso molecular de cerca de 55 a 60 kDa. Em GALNS ativo, o resíduo de cisteína na posição 53 do precursor ou do polipeptídeo de GALNS totalmente processado (correspondente à posição 79 do polipeptídeo GALNS de comprimento total) foi convertido para Cα- formilglicina (FGIy) por sulfatase modificando o fator 1 (SUMF1). No lisossoma, GALNS é clivada após a posição 325 do polipeptídeo GALNS totalmente processado, resultando em fragmentos peptídicos de GALNS de cerca de 40 kDa e 19 kDa. Esses peptídeos de GALNS são unidos por uma ponte de dissulfeto entre os resíduos de cisteína (C) nas posições 282 e 393 do polipeptídeo GALNS completamente processado. Existem dois sítios canônicos de glicosilação ligados a N, nas posições 178 e 397 do polipeptídeo GALNS completamente processado. Manose bis- fosfori- lada 7 (BPM7), composta por dois resíduos de manose-6-fosfato, foi encontrada em N178, mas não em N397.
EXEMPLO II LINHAGENS CELULARES G71S CO-EXPRESSANDO SULFATASE HUMANA MODIFICANDO O FATOR 1 (SUMF1) E N-ACETILGALACTOSAMINA-6- SULFATASE (GALNS) HUMANAS
[00216]O objetivo FOI desenvolver linhagens celulares capazes de produzir enzimas sulfatase lisossômicas ativas com níveis melhorados de fosforilação.
[00217]As células G71 (Rockford K. Draper) foram obtidas diretamente do CHO-K1 (ATCC CCL-61). A linhagem celular G71 é um mutante sensível à temperatura de CHO-K1 que diz respeito à acidificação dos endossomas, que foram observados para produzir diferenças na secreção de proteína total e fosforilação dos resíduos de manose para várias enzimas em temperaturas elevadas (Park et al, Somat. Cell Mol. Genet. 17 (2): 137 - 150, 1991; Marnell et al, J. Cell. Biol. 99 (6): 1907 - 1916, 1984).
[00218]As células G71 foram mantidas a 34°C em meio BioWhittaker Ultra- CHO suplementado com 2,5% de soro fetal, glutamina 2 mM, gentamicina e anfote- ricina.
[00219]Para facilitar o uso de linhagens celulares para a produção de proteína, as G71 células aderentes foram pré-adaptadas ao meio de crescimento isento de soro usando um protocolo para adaptação dependente de ancoragem, células de mamíferos dependentes de soro para cultura de suspensão livre de soro de alta densidade (Sinacore et al. Mol. Biotechnol. 15 (3) :249 - 257, 2000), resultando na cultura de linhagem celular adaptada de suspensão livre de soro, G71S. Alternativamente, as células aderentes G71, depois de serem estavelmente transfectadas como descritas abaixo, podem ser adaptadas ao meio de crescimento isento de soro, conforme descrito em Sinacore et al.
[00220]As combinações de pares dos vetores de expressão GALNS humana e SUMF1 humano (Exemplo 1), quer pcDNA4 SUMF1 mais pCIN4 4A, BMAR SUMF1 mais BMAR 4A, ou PMAR SUMF1 mais PMAR 4A, foram transfectadas, seguindo o protocolo II Martech como descrito pelas células Selexis G71S cultivadas em meio de cultura suplementado com Solution antibiótica antimicótica (100 UI de penicilina, 10 mg de estreptomicina, 25 mg de anfotericina B, Cellgro). Piscinas transfectantes foram cultivadas em meio UltraCHO (Cambrex) suplementado com 5% de soro bovino fetal Y-irradiado (FBS, JRH), 200 μm / mL G418 / mL (AG Scientific) e 200 μm / mL Zeocin (Invitrogen), e clonados por diluição limitante em placas de 96 cavidades no mesmo meio de crescimento. O crescimento do clone foi monitorado por imagem de tela de células (Innovatis). Todos os clones foram testados usan-do uma atividade de captura enzimática ELISA para GALNS ativa (ver Exemplo IV). A produtividade celular foi calculada dividindo-se a atividade de captura da enzima ELISA para atividade GALNS pelo crescimento celular (Vi-Ceil, Beckman Coulter) por dia, durante um período de quatro dias.
[00221]202 clones G71S foram gerados e selecionados para GALNS ativo: 86 clones co-transfectados com pcDNA4 SUMF1 mais pCIN 4A, 65 clones co- transfectados com BMAR SUMF1 mais BMAR 4A, e 51 clones co-transfectados com PMAR SUMF1 mais PMAR 4A. Os clones foram inicialmente selecionados com base nos elevados níveis de GALNS ativas a partir das placas de cultura de tecidos de 96 cavidades (Figura 6A). A atividade GALNS foi medida utilizando uma atividade de captura enzimática ELISA e representada em ng / mL (eixo-y). O eixo x mostra as três condições de co-transfecção utilizadas para SUMF1 e expressão GALNS: promotor hCMV sem MAR, promotor de hCMV com MAR, e promotor SV40 com MAR. Cada barra representa um único clone da respectiva população. A densidade celular não foi contabilizada nesta tela de clone de 96 cavidades e nem todos os clones co- transfectados G71S são apresentados nesta figura.
[00222]A maior GALNS ativa produzindo clones G71S foi escolhida para análise de produtividade (Figura 6B). A produtividade celular diária foi medida em pg / célula / dia obtida dividindo a atividade GALNS pela densidade celular para esse dia. Esta figura mostra o quarto dia (96 horas) após a semeadura em 5x105 células / frasco. Os clones foram testados para GALNS utilizando uma enzima de captura de atividade ELISA em pg / célula / dia (eixo Y). Os controles positivos consistiam em GALNS expressando BHK e clones CHO (BioMarin). Cada barra vertical representa um único clone. GALNS ativa foi produzida por clones pCIN 4A, mas apenas marginalmente acima do fundamento do ensaio.
[00223]A análise de clones pela tela de 96 cavidades e ensaios de produtividade de 4 dias demonstraram que a co-transfecção de vetores de expressão com elementos MAR aumentou a produtividade dos clones G71S em relação à co- transfecção de vetores de expressão, sem elementos MAR. O BMAR 4A + clones BMAR SUMF1 co-transfectados demonstraram rápida geração e piscina, rápido crescimento do clone, e capacidade para produzir mais de 2 vezes mais GALNS ativa do que a maior produtora de clones PMAR 4A, e até um aumento de 10 vezes mais do que clones CHO 4A e BHK 4A faltando elementos MAR.
[00224]A GALNS que expressa os clones G71S foi adaptada para o meio de crescimento livre de soro, usando o protocolo descrito em Sinacore et al, Mol. Bio- technol. 15 (3) :249 - 257, 2000. A adaptação toda foi feita na presença de dois agentes de seleção (zeocin a 200 μm / ml e neomicina a 200 μm / mL). A GALNS que expressa os clones G71 cultivados em frascos T foi dividida da seguinte forma: (1) em um misturador de 125 mL com o meio UltraCHO Cambrex FBS e 5 % (lote No. 8L2242), (2) em um misturador de 125 mL com meio JRH 302M (meio de produção) e 5 % FBS e (3) em frascos T como uma cópia (UltraCHO, 5 % FBS). Uma vez que as culturas em suspensão foram estabelecidas, as células aderentes foram descartadas, e o desmame da FBS foi iniciado. Quando a taxa de crescimento voltou a > 0,5 (1 / dia) por 3 passagens e a viabilidade foi superior a 95 %, a concentração de FBS foi reduzida em 50 %. As células foram deixadas em qualquer concentração de FBS dada por um período mínimo de 3 passagens. Uma vez adaptada para o crescimento em 2,5 % FBS, as células foram tomadas diretamente no meio livre de soro. As células foram depositadas em meio fresco com 10 % (v / v) de DMSO. Um degelo experimental foi testado para assegurar que as células sobreviveram ao processo de congelamento. Dois GALNS expressando clones G71S a partir do BMAR 4A + trans- fecção de BMAR SUMF1, os clones 4 e 5 levaram cerca de 15 passagens para a adaptação à cultura de suspensão livre de soro. A GALNS expressando o clone do pcDNA4 SUMF1 mais a transfecção de pCIN 4A, C6, também foi isolado e adaptados à cultura livre de soro.
[00225]As combinações de pares dos vetores de expressão de SUMF1 humana e GALNS humana (Exemplo I), pcDNA4 SUMF1 mais pCDNA4-4A, foram transfectados em células G71S, basicamente, como descrito acima, exceto 200 μm / mL de Zeocin (Invitrogen) que foi utilizado para a seleção. Seis GALNS expressando clones, C2, C5, C7, C10, C11 e C30, foram isolados e adaptados à cultura de suspensão livre de soro, basicamente, como descrito anteriormente.
EXEMPLO III CULTURA EM GRANDE ESCALA DE LINHAGENS CELULARES G71S EXPRESSANDO N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE (GALNS) HUMANA
[00226]O objetivo foi medir a produção de enzimas a partir de clones expressando G71S N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humana. As linhagens celulares de G71S de cultura de suspensão livre de soro adaptada co-expressando SUMF1 humana e GALNS humana foram cultivadas em grande escala e avaliadas para a produção de enzima GALNS ativa.
[00227]Como a adaptação à cultura de suspensão livre de soro foi relativamente rápida para a linhagem celular hospedeira de G71S, foi decidido que a produção poderia ser feita em um biorreator WAVE operado em modo de perfusão. O bior- reator WAVE permite uma maior flexibilidade em termos de volume de inóculo, pois o dimensionamento pode ser feito diretamente na bolsa, reduzindo o risco de contaminação e acelerando a produção de material. A Figura 7 mostra o esquema de ajuste do biorreator WAVE. O diagrama mostra, no modo de perfusão, que uma célula de carga monitora o volume médio na bolsa através da determinação do peso da bolsa e ajusta a alimentação e as taxas de colheita para manter o volume desejado. Na bolsa de 10 L, o pH também é controlado para o ponto de ajuste desejado por uma sonda que é inserida na bolsa.
[00228]O material proveniente de GALNS expressando os clones 4 e 5 de G71S foi produzido na escala de L 1. O pH de cultura não foi controlado nesta execução. A limitação operacional da bolsa WAVE é uma vazão de 3 volumes de vaso ao dia (VV / dia). A fim de evitar qualquer inativação de material, a taxa de perfusão de células específicas alvo (CSPR) foi de 0,3 nl / célula / dia, resultando em um tempo de permanência médio de oito horas para as enzimas GALNS. Portanto, a densidade celular na bolsa foi mantida em aproximadamente 10 a 12 x 106 células / mL. A taxa de crescimento para GALNS expressando os clones 4 e 5 de G71S foi de 0,16 e 0,20, respectivamente. O vazamento para manter a densidade de células alvo foi feito diretamente a partir do saco.
[00229]O pH do fluido da colheita foi ajustado para um pH entre 5,5 e 6,5 pa ra manter a atividade enzimática, uma vez que GALNS tinha sido mostrada previa-mente ser estável em pH 6. Isto foi realizado por uma adição programada de bolus de 5 % em volume de tampão de citrato de sódio pH 4,0 misto, em conformidade com a colheita saindo do reator. O fluido da colheita ajustado foi armazenado a 4 °C antes do processamento a jusante. Os dois GALNS expressando os clones 4 e 5 de G71S mediram títulos de cerca de 4,2 mg / L, com uma produtividade específica associada de aproximadamente 1,25 pg / célula / dia.
[00230]A GALNS expressando os clones C2, C5, C6, C7, C10, C11 e C30 de G71S, foi igualmente cultivada em grande escala e avaliada para a produção de enzima GALNS ativa.
EXEMPLO IV MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO E ATIVIDADE DE N- ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE (GALNS) HUMANA
[00231]Os ensaios imunosorbantes ligados a enzima (ELISA) foram desenvolvidos para medir a concentração e atividade da enzima GALNS a partir dos clones de G71S co-expressando SUMF1 humana e N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) humana.
Atividade de captura da enzima ELISA
[00232]A atividade de captura da enzima ELISA mede a atividade da enzima GALNS em fase sólida, após a captura por um anticorpo específico anti-GALNS ligado a uma placa de ELISA.
[00233]Tampões. Tampão A (Tampão de Carbonato): dissolver 3,09 gramas de Na2CO3 e 5,88 gramas de NaHCO3 em 900 mL de H2O desionizada (DI), em seguida, adicionar H2O DI para um volume final de 1000 mL. Verificar se o pH está entre 9,4 e 9,6, em seguida, esterilizar por filtração. Para revestir completamente uma microplaca de 96 cavidades com 100 μL por cavidade, diluir 19 μL de um anticorpo anti-GALNS em um tubo (12 mL). Tampão B (Tampão de bloqueio ELISA e Tampão de diluição em série): 1x PBS acídico, 0,05 % de Tween-20 e 2 % de BSA, pH ajustado para 6,5 com ácido acético. Tampão Bw (Tampão de lavagem): 100 mm de Na- OAc e 0,05 % de Tween-20, o pH foi ajustado para 6,5 com ácido acético. Buffer C (tampão de substrato): acetato de sódio 25 mM, NaCl 1 mM, 0,5 mg / mL de BSA desaltado e 0,01 % de azeto de sódio, com pH ajustado a 4,0 com ácido acético glacial. Tampão D (Tampão de β-Galactosidase): fosfato de sódio dibásico 300 mM, 0,1 mg / ml de BSA, 0,01 % de azeto de sódio e 0,01 % de Tween-20, o pH foi ajustado para 7,2 com ácido fosfórico. Tampão E (Tampão de parada): glicina 350 mM e tampão de carbonato 440 mM, pH ajustado para 10,7 com NaOH 6 M.
[00234]Reagentes. Anticorpos IgG anti-GALNS: anticorpos de coelho poli- clonal são proteína G purificada do soro. No D-PBS, proteína total = 3,17 mg / mL (BCA). Alíquotas (19 μL) são armazenados a -20°C por um tempo de uso cada. Substrato 4MU-Gal-6-S (Sólido, 440 MW): ações de 100 mM preparadas em água DI e armazenadas em 4°C. β-Galactosidase (Sigma G-4155): diluir para 12 mg / mL em tampão D antes de usar.
[00235]Protocolo: Ligar o anticorpo anti-GALNS à placa: uma placa Nunc Maxisorp ELISA (Nalge / Nunc International, Fisher No. 12-565-135) é revestida com anticorpo anti-GALNS em uma concentração final de proteína de 5 g / mL no Tampão A. Para preparar esta solução, descongelar uma alíquota de 19 uL, brevemente spin (10 s) em uma microcentrífuga para recolher o líquido. Transferir todos os 19 μL em 12 mL de tampão A. Misturar vigorosamente por inversão, em seguida, despejar em um reservatório, seguido pelo carregamento da placa (100 mL por cavidade) utilizando uma pipeta de multi-canal. Cobrir a placa e incubar a 40 °C durante a noite. Remover o anticorpo anti-GALNS desacoplado: lavar a placa por inundações com Tampão Bw três vezes. Bloco: bloquear a placa com o tampão B (320 μL por cavidade), em seguida, cobrir a placa e incubar a 37°C por 1 hora. Preparar uma série de diluições da GALNS purificada padrão e amostras de teste (desconhecidas) durante a etapa de bloco: o padrão é diluído em tampão B para a extremidade superior da faixa linear do ensaio (128 ng / mL na Linha A), em seguida, diluídas em série (2 vezes), nas linhas B-G em uma placa de 96 cavidades. Lane H é tampão vazio (ou seja, nenhuma enzima GALNS). Primeiro, preparar 500 μL de uma concentração de 128 ng / mL em tampão B. Em seguida, diluir em série 2 vezes no tampão B (250 μL para 250 μL) até chegar a 2 ng / mL. Remover o tampão de bloqueio: após a etapa de bloco, o tampão B é descartado. Ligar a enzima GALNS padrão e amostras de teste ao anticorpo anti-GALNS: carregar a placa com 100 μL / cavidade do padrão diluído em série e amostras de teste (executar em duplicado). Cobrir a placa e incu-bar a 37°C por 1 hora. Remover os inibidores de GALNS: lavar a placa por inundações com Tampão Bw, três vezes. Adicionar o substrato de GALNS (primeira reação): preparar solução de substrato final suficiente para carregar 100 μL por cavidade (preparado mais de uma hora antes de usar). Diluir a solução de armazenamento 4MU-Gal-6 (100 mM) a 1 mM em tampão C. Carregar 100 μL por cavidade. Cobrir a placa e incubar a 37 °C por 30 min. Adicionar β-Galactosidase (segunda reação): adicionar 50 μL de 12 mg / ml de β-galactosidase em tampão D a cada cavidade. Cobrir a placa e incubar a 37°C por 15 min. Parar a reação: adicionar 100 μL de Tampão E (tampão de parada) a cada cavidade para ionizar 4MU liberado. Transferência para placa de flúor: transferir (8 cavidades por vez) 200 μL de 250 μL de cada cavidade da placa de ELISA para uma placa de microtitulação de fundo chato preta não-tratada (Fluoroplate, Costar # 3915). Leitura de fluorescência: ler a placa em um leitor de placas Gemini (Molecular Devices Corporation), utilizando o programa SoftMax PRO (366 nm de excitação, 446 nm de emissão, 435 nm de corte).
GALNS ELISA
[00236]A GALNS ELISA mede a concentração da enzima GALNS em meio condicionado de cultura celular ou outras amostras de processo usando um imuno- ensaio enzimático tipo sanduíche.
[00237]Tampões. Tampão A (Tampão de Carbonato): dissolver 3,09 gramas de Na2CO3 e 5,88 gramas de NaHCO3 em 900 mL de H2O desionizada (DI), em seguida, adicionar H2O DI para um volume final de 1000 mL. Verificar se o pH está entre 9,4 e 9,6, em seguida, esterilizar por filtração. Para revestir completamente uma microplaca de 96 cavidades de com 100 μL por cavidade, diluir 19 μL do anticorpo anti-GALNS em um tubo (12 mL). Tampão B (tampão de bloqueio ELISA e Tampão de diluição em série): 1x PBS acídico, 0,05 % de Tween-20 e 2 % de BSA, pH ajustado para 6,5 com ácido acético. Tampaõ Bw (Tampão de lavagem): NaOAc 100 mM e 0,05 % de Tween-20, o pH ajustado para 6,5 com ácido acético. Tampão F (Tampão de parada): H2SO4 2N: total de 600 mL, adicionar 100 mL de H2SO4 12N e 500 mL de água MiIIiQ.
[00238]Reagentes. Anticorpos IgG Anti-GALNS: anticorpos de coelho poli- clonais são proteína G purificada do soro. No D-PBS, proteína total = 3,17 mg / mL (BCA). Alíquotas (19 microlitro) são armazenadas em -20°C para um tempo de uso cada. Anticorpo de detecção conjugado HRP (RIVAH): o anticorpo conjugado final é diluído 1: 100 em D-PBS / BSA 1 % e armazenado em alíquotas de 120 μL a -20°C para o uso uma vez. Kit fr Substrato TMB EIA (BioRad No. 172 - 1067).
[00239]Protocolo. Ligar o anticorpo anti-GALNS à placa: uma placa Nunc Maxisorp ELISA (Nalge / Nunc International, Fisher No. 12-565-135) é revestida com anticorpo anti-GALNS em uma concentração final de proteína de 5 μg / mL em tampão A. Para preparar esta solução, descongelar uma alíquota de 19 μL, brevemente spin (10 s) em uma microcentrífuga para recolher o líquido. Transferir todos os 19 μL em 12 mL de tampão A. Misturar vigorosamente por inversão, em seguida, despejar em um reservatório, seguido pelo carregamento da placa (100 μL por cavidade) utilizando uma pipeta de multi-canal. Cobrir a placa e incubar a 37 °C (incubadora de convecção) para 2 horas. Não usar um bloco quente. Remover o anticorpo anti- GALNS desacoplado: lavar a placa por inundações com o Tampão Bw, três vezes. Bloco: bloquear a placa com o tampão B (320 μL por cavidade), em seguida, cobrir a placa e incubar a 37°C por 1 hora. Preparar as diluições em séries de GALNS purificada padrão e amostras de teste (desconhecidas) durante a etapa de bloco: o padrão é diluído em tampão B para a extremidade superior da faixa linear do ensaio (40 ng / mL na Linha A), em seguida, diluídas em série (2 vezes) em linhas B - G em uma placa de 96 cavidades. Lane H é tampão vazio (ou seja, nenhuma enzima GALNS). Primeiro, preparar 500 μL de uma concentração a 40 ng / mL em tampão B. Em seguida, diluir em série de 2 vezes no tampão B (250 μL para 250 μL), até atingir 0,625 ng / mL. Remover o tampão de bloqueio: após a etapa de bloco, Buffer B é descartado.
[00240]Ligar a enzima GALNS padrão e as amostras de teste ao anticorpo anti-GALNS: carregar a placa com 100 μL / cavidade do diluído em série padrão e as amostras de teste (executar em duplicado). Cobrir a placa e incubar a 37° C por 1 hora. Lavagem: lavar a placa pelas inundações com tampão Bw, três vezes. Ligar o conjugado do anticorpo de detecção: descongelar uma alíquota (120 μL) RIVAH de anticorpos, brevemente spin (10 s) em uma microcentrífuga para recolher o líquido. Diluir todos os 120 μL em 11,9 ml de tampão B e inverter o tubo vigorosamente para misturar. Despejar em reservatório e adicionar 100 μL por cavidade com a pipeta de multicanal. Cobrir a placa e incubar a 37°C por 30 min. Lavagem: lavar a placa pelas inundações com tampão Bw, três vezes. Substrato TMB: preparar a solução do substrato final, misturando 1,2 mL da solução B com 10,8 mL da solução A. Despejar em reservatório e adicionar 100 μL por cavidade com a pipeta de multicanal. Cobrir a placa e incubar a 37°C por 15 min. Solução de parada: Pipetar 12 mL de solução de H2SO4 2N para o reservatório e adicionar 100 μL por cavidade com a pipeta de multicanal. Tocar suavemente para misturar. Leitura de A450: ler a placa no leitor de placas.
Ensaio de Atividade Específica de GALNS
[00241]O ensaio da atividade de GALNS específica mede a atividade enzi- mática da GALNS em solução utilizando um substrato GALNS específico.
[00242]Tampões. H2O MiIIiQ é usada para todos os tampões. Tampão de Diluição (DB): para 1 L de DB, dissolver 1,74 mL de ácido acético, 0,75 g de acetato de sódio, 233,6 mg de NaCl, 2 mL de 50 % de Tween-20 e 10 mL de azeto de sódio a 1 % em H2O MiIIiQ, e ajustar o pH para 4,0 + / - 0,5 com NaOH 0,1 M, se o pH for inferior a 3,95 e com ácido acético 0,1 M se o pH for superior a 4,05. As concentrações finais são as seguintes: ácido acético 19,5mM, acetato de sódio 5,5 mM, NaCl 1 mM, 0,1 % de Tween-20 e 0,01 % de azeto de sódio. Tampão de fosfato (PB): para 1L de PB, dissolver 13,9 g de NaH2PO4 -H2O e 55g de NaHPO4-7H2O, em H2O MiIIiQ, e ajustar o pH para 7,2. A concentração final é de 300 mM NAPI. Tampão de parada (SB): para 1 L de SB, dissolver 26,2 g de glicina e 46,6 g de carbonato de sódio em H2O MiIIiQ, e ajustar o pH para 10,6 com NaOH. Tampão de Ensaio (AB): diluir o depósito de 4MU-Gal-6S 1: 50 no DB (2 mM final). Tampão de β- Galactosidase (βGB): 25 μg / mL de β-Galactosidase em 300 mM NAPi, pH 7.2.
[00243]Reagentes. 4MU-Gal-6S: 100 mM em H2O (Toronto Research Chemicals Cat. No. M334480). β-Galactosidase: Sigma G-4155. 4 metilumbelliferone (padrão 4MU): Sigma M-1381 (10 mM estoque em DMSO).
[00244]Protocolo. Desempenhar diluições em série da enzima GALNS. Para GALNS purificada e formulada (~ 1,5 mg / ml), diluir as amostras 1: 10,000 em tubos de microcentrífuga de adesão de baixa proteína (U.S.A. Scientific Cat No. 1415 - 2600), contendo DB, antes de 1:1 diluições seriadas. Colocar 100 μL de DB em uma placa de 96 cavidades ligando a baixa proteína. Na primeira linha, pipetar 100 μL da amostra de GALNS. Agora serialmente diluída (1:1) até a placa (A - G em placas de 96 cavidades). Nenhuma amostra é adicionada à cavidade H (em branco). A faixa linear do presente ensaio é 1 a 75 ng / nulo. Usar o mesmo processo para a preparação da curva padrão 4MU. Diluir 10 mM do estoque de 4MU em DMSO 1: 100 em DB. Iniciar a curva padrão 4MU, adicionando 50 μL de 50 μL de 4MU na primeira cavidade, em seguida, diluir em série. Adicionar 50 mL do substrato diluído em AB (2 mM 4MU-Galactose-6S em DB) para uma placa fluorescente de 96 cavidades. Substrato pré-incubado por 10 min a 37 °C. Adicionar 50 μL dos 100 μL de diluições em série de GALNS padrão de 4MU e para os 50 μL de substrato em AB. Incubar a 37 °C durante 30 min (essa primeira reação remove o sulfato do substrato), arrefecer a primeira reação e iniciar a segunda reação adicionando 50 μL de β-Galactosidase (diluir estoque de β-galactosidase a 25 μg / mL em βGB . O fosfato inibe a GALNS e o aumento do pH também interrompe a reação de GALNS. O pH resultante agora está na faixa de pH ideal de β-galactosidase. Incubar esta segunda reação por 15 min a 37 °C. Ionizar 4MU liberado adicionando 100 μL de SB. Leitura de Ex355 Em460 no leitor da placa fluorescente de 96 cavidades. Cálculos da atividade da enzima (a 37° C em tampão de pH 4,0): 1 unidade = μmol 4MU liberado /min; atividade = μmol 4MU/min/mL; atividade específica = μmol 4MU/min / mg. Cálculo de concentração de proteínas: coeficiente de extinção de uso de GALNS (1 mg / mL = 1,708 unidades de absorvância a 280nm).
EXEMPLO V PURIFICAÇÃO DE N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE (GALNS) HUMANA
[00245]O objetivo foi obter uma grande quantidade de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recombinante humana. Células G71 esta- velmente transfectadas co-expressando SUMF1 humana e GALNS humana foram crescidas sob condições de cultura de biorreator e a enzima GALNS ativa foi purificada a partir do meio da célula.
[00246]Aparelho de Cromatografia Líquida. Sistema de explorador Amers- ham Pharmacia Biotech Akta 900, utilizando o software de controle Unicorn.
[00247]Métodos Analíticos da proteína. Os procedimentos padrão foram se- guidos por SDS-PAGE, coloração Coomassie Blue (B101-02-COOM), Western blot e ensaios de proteína de Bradford. A execução de purificação foi avaliada pelo rendimento da atividade, a pureza do produto GALNS foi avaliada visualmente por SDS- PAGE. A presença de impurezas processadaso foi detectada por Western blotting usando um anticorpo anti-GALNS. A concentração de proteínas foi medida utilizando um ensaio de proteína de Bradford. A concentração da proteína de GALNS purificada final foi medida por medida A280 usando um coeficiente de extinção de 1,708.
[00248]Resinas de Cromatografia. Blue Sepharose 6 FF (GE Healthcare, lote No. 306346) e Fractogel SE Cap-Hi (Merck KgaA, FC040894449).
[00249]Determinações da atividade enzimática de GALNS. A atividade específica de GALNS foi determinada utilizando um substrato fluorescente pequeno 4- metil-6-S-GAL (4-MU-6-S-GAL). O ensaio da atividade específica de GALNS envolve uma reação de duas etapas, onde além de β-galactosidase é necessário, após incubação de GALNS com o substrato durante um certo tempo para liberar o marcador fluorescente. As medições são feitas através de um leitor de placas de fluorescência.
[00250]Uma coluna de dessalinização 10DG (Bio-RAD) foi equilibrada com tampão de equilíbrio (EQB, NaOAc 50 mM, NaCl 10 mM, pH 5,8). H2O MiIIiQ foi usada para todos os tampões. Três (3) mL de GALNS purificada (0,5 a 2 mg / mL) foram carregados para a coluna de dessalinização, eluídos e coletados em alíquotas de 4 mL em tubos de ensaio separados usando EQB. A concentração de proteína foi calculada utilizando o coeficiente de extinção de GALNS (1 mg / mL = 1,708 unidades de absorvância a 280 nm).
[00251]Amostras de GALNS desaltadas foram diluídas em série (1:1) em tampão de diluição (DB, NaOAc 50 mM, NaCl 1 mM, pH 4,0 + 0,5 mg / mL de BSA). O estoque de BSA foi dessalinizado antes de usar carregando 50 mg / mL do estoque de BSA (não mais de 5% CV) para uma coluna G25 previamente equilibrada com H2O MilliQ. 100 μL da amostra de GALNS dessalinizada foram pipetados na primeira linha de uma placa de 96 cavidades de ligação de baixa proteína e as amostras de GALNS diluídas em série foram pipetadas para baixo da placa (linhas A - G em placas de 96 cavidades). 100 μL de DB foram pipetados no na última cavidade (H). A extremidade de topo da faixa linear deste ensaio é de 200 ng / mL, e a faixa linear é 3 a 200 ng / mL. O mesmo procedimento foi realizado para preparar a curva padrão com 4 metilumbelliferone (4MU) (Sigma M-1381, estoque de 10 mM em DMSO). 50 μL dos 100 μL de diluições em série do GALNS e 4MU foram transferidos para uma nova placa fluorescente de 96 cavidades (placa de fundo preto). 50 μL de 2 mM 4MU-Galactose-6S (em H2O MilliQ) foi adicionado às amostras a serem analisadas, e incubadas a 37° C por 30 minutos. Esta primeira reação foi arrefecida, e uma segunda reação foi iniciada adicionando 50 μL de β-Galactosidase (Sigma G- 4155, estoque diluído para 12 μg / mL em NAPI 300 mM, pH 7,2) e incubados a 37 °C por 15 minutos. 4MU liberado foi ionizado adicionando 100 μL de tampão de parada (Glicina / carbonato, pH 10,6). As placas foram lidas no leitor de placas fluorescente de 96 cavidades (excitação de 355 nm e emissão de 460 nm). 1 unidade é definida como 1 μmol de 4MU liberado / min, a atividade da enzima é dada em μmol 4MU/min/mL e a atividade específica é dada em μmol 4MU/min/mg, tudo a 37° C em pH 4,0.
[00252]Primeiro processo de purificação. Um primeiro processo de purificação incluiu uma etapa de ultrafiltração (UF) seguido por um processo de purificação de 2 colunas. 1. Filtração da colheita (HF): o material biorreator foi de 0,2 μm estéril filtrado. 2. Ultrafiltração (UF): o material biorreator foi concentrado 10 a 20X por ultra- filtração através de uma membrana Sartocon 30 kD. 3. Ajuste do pH 4,5: o material biorreator concentrado (UF (20X)) foi ajustado para pH 4,5 com tampão de ajuste de pH (NaOAc 1,75 M, pH 4,0) em temperatura ambiente e filtrado estéril antes de carregar em uma coluna de Blue Sepharose. 4. Fluxo Rápido de Blue Sepharose 6 (FF): o pH 4,5 ajustado (20X) foi carregado em uma coluna Blue Sepharose e a proteína GALNS foi eluída como demonstrado na Tabela 1 e Figura 9A.
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5. Fractogel SE Hi-Cap: o eluato da coluna de Blue Sepharose foi ajustado para pH 4,3 e carregado em uma coluna Fractogel SE Hi-Cap, e a proteína GALNS foi eluída como mostrado na Tabela 2 e Figura 9B.
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[00253]A proteína GALNS no eluato foi coletada por fracionamento, descartando o ombro de pré-eluição e cauda de pós- eluição. 6. UF / HF Final: o eluato da coluna de Fractogel SE Hi-CAP foi concentrado por ultrafiltração e filtrado estéril, conforme descrito acima.
[00254]Formulação. A proteína purificada GALNS foi formulada em NaOAc 10 mM, NaH2PO4 1 mM, 0,005 % de Tween-80, pH 5,5.
[00255]Estudos de Estabilidade. Estabilidade da GALNS purificada formulada final foi monitorada a 4 °C e -70 °C em função do tempo armazenando pequenas alíquotas de amostras de GALNS nas temperaturas respectivas. Em momentos determinados, as alíquotas de amostras congeladas foram rapidamente descongeladas em banho-maria a 37°C antes das medidas de atividade. A Figura 8 mostra que a GALNS purificada foi estável a 4 °C e -70° C, durante um período de até, no mínimo, 79 dias no tampão de formulação.
[00256]Resultado do primeiro processo de purificação. A Tabela 3 mostra o rendimento de purificação de três preparações de proteína GALNS produzida a partir do clone 4 de G71S em um biorreator de cultura de suspensão. A pureza foi estimada visualmente por SDS-PAGE em cerca de 95 % em todos os casos.
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[00257]A Figura 9 mostra um SDS-PAGE da proteína GALNS separado por (A) cromatografia de fluxo rápido Blue Sepharose 6 seguido de (B) cromatografia Fractogel SE Hi-PAC. Os géis foram corados com Coomassie Blue (à esquerda) ou anticorpo anti-GALNS (direita). Para o Western blot, o anticorpo de coelho anti- GALNS foi diluído a 1: 5000, e o anticorpo secundário foi um anticorpo de coelho de fosfatase anti-alcalina. A proteína GALNS tem um peso molecular aparente de ~55 a 60 kDa em SDS-PAGE, de acordo com o tamanho esperado da forma pré- processada secretada (precursora) da enzima faltando os peptídeos de sinal de resíduos de 26 aminoácidos, e também faltando a clivagem após a posição 325.
[00258]Caracterização do terminal N. O terminal N da proteína GALNS purificada foi determinada por LC / MS. A sequência do terminal N foi APQPPN, o que corresponde ao terminal N predito da forma secretada de GALNS faltando os peptí- deos de sinal de resíduos de 26 aminoácidos (comparar as sequências de polipeptí- deos de GALNS humana na Figura 4 e Figura 5).
[00259]Segundo processo de purificação. Um segundo processo de purificação incluiu uma etapa de ultrafiltração / diafiltration (UF / DF) seguido por um processo de purificação de 3 coluna. 1. Ultrafiltração (UF / DF): o material biorreator foi 20X concentrado por ultra- filtração / diafiltration através de uma membrana Sartocon 30 kD em pH 5,5. 2. Ajuste de pH 4,5: o material biorreator concentrado (UF / DF (20X)) foi ajustado para pH 4,5 com tampão de ajuste de pH (NaOAc 1,75 M, pH 4,0) em temperatura ambiente e filtrado estéril antes de carregar em uma coluna Fractogel EMD SE Hi-Cap . 3. Fractogel EMD SE Hi-Cap: o pH 4,5 ajustado de UF / DF (20X) foi carregado em uma coluna Fractogel EMD SE Hi-Cap, lavado seqüencialmente com acetato / fosfato 10 mM, NaCl 50 mM, pH 4,5 e acetato / fosfato 10 mM, NaCl 50 mM, pH 5,0, e a proteína GALNS foi eluída com de acetato / fosfato 10 mM, NaCl 140 mM, pH 5,0. 5. Quelante Zn de Sepharose FF: o eluato da coluna Fractogel EMD SE Hi- Cap foi ajustado para NaCl 500 mM, pH 7,0 e carregado em uma coluna de quelante Zn Sepharose FF (Zn-IMAC), lavada com acetato / fosfato 10 mM, NaCl 125 mM, imidazol 10 mM, pH 7,0, e a proteína GALNS foi eluída com acetato / fosfato 10 mM, NaCl 125 mM, imidazol 90 mM, pH 7,0. 6. Ajustar o pH 3,5: o eluato do quelante Zn Sepharose FF que contém a proteína GALNS foi ajustado para pH 3,5 para baixar a inativação do pH viral e, em seguida, ajustado para acetato / fosfato 10 mM, NaCl 2 M, pH 5,0. 7. Toyopearl Butil 650M: o eluato ajustado de baixo pH a partir do quelante Zn Sepharose FF foi carregado em uma coluna de Toyopearl butil 650M, lavado com acetato / fosfato 10 mM, NaCl 2 M, pH 5,0. E a proteína foi eluída com GALNS acetato / fosfato 10 mM, NaCl 0,7 M, pH 5,0. 8. UF / HF Final: o eluato do eluato de Toyopearl Butil 650M foi ultra-filtrado e filtrado no dia em acetato 20 mM, fosfato 1 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5.
[00260]Formulação. A proteína GALNS purificada foi formulada em NaOAc / HAc 10 mM, NaH2PO41 mM, NaCl 150 mM, 0,01 % de Tween-20, pH 5,5.
[00261]Resultados do segundo processo de purificação. A Tabela 4 mostra a recuperação da proteína GALNS produzida a partir do clone C2 de G71S em um biorreator de cultura de suspensão com o segundo processo de purificação. A pureza da enzima GALNS formulada (isto é, precursora e madura ou formas processadas juntas) foi cerca de 98 % determinado pelo C3 RP-HPLC. O percentual da forma precursora da enzima GALNS foi de cerca de 85%, conforme determinado por eletroforese em gel SDS-capilar.
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[00262]A Figura 10 mostra um SDS-PAGE da enzima GALNS separado por unltrafiltração / diafiltração (UF / DF), cromatografia de Fractogel SE Hi-PAC, croma- tografia de quelante Zn Sepharose FF e cromatografia Toyopearl Butil 650M. Os géis foram corados com Coomassie Blue (superior esquerdo), o anticorpo anti-GALNS (superior direito), anti-catepsina L (inferior esquerdo) e proteínas anti-CHO (CHOP, inferior direito). Para o Western blot, os anticorpos policlonais de coelho anti-GALNS foram diluídos a 1: 5000, e o anticorpo secundário foi um conjugado AP anti-coelho, o anticorpo policlonal de cabra L anti-catepsina L foi diluído para 1: 1000, e o anticorpo secundário foi um conjugado HRP anti-cabra, e o anticorpo policlonal de coelho anti-CHOP foi diluído a 1: 1000, e o anticorpo secundário foi um conjugado HRP anti-coelho. A enzima GALNS precursora tem um peso molecular aparente de ~55 a 60 kDa em SDS-PAGE, e as formas maduras ou processadas da enzima GALNS têm pesos moleculares aparentes de ~39 kDa e ~19 kDa em SDS-PAGE.
[00263]Sumário do primeiro processo de purificação. A enzima GALNS foi purificada usando um trem de purificação que tinha sido modificado a partir de um trem padrão (ver Tabela 5). O material de colheita do biorreator foi de 0,2 μm filtrado estéril e mantido a 4 °C antes do embarque para a coluna de captura de Blue Sepharose. O material de bioreactor filtrado foi carregado diretamente ou concentrado até 15X por ultrafiltração. A modificação do trem de purificação foi necessária porque as etapas de purificação a jusante, cromatografia SP Sepharose seguida por cromatografia Phenyl Sepharose, não renderam GALNS suficientemente pura. Usando cromatografia SE Hi-Cap como um substituto para as duas colunas de purificação a jusante resultou em um processo de purificação de 2 colunas, com a pureza do material final significativamente melhorado, e a recuperação GALNS global aumentou significativamente a partir de ~22% para ~80%. A pureza da enzima GALNS (constituída essencialmente da forma precursora, ver Figura 9), conforme determinado por cromatografia C4-RP, foi amplamente estimado em cerca de > 95 %, e enzima purificada GALNS manteve-se estável em tampão de formulação por mais de 79 dias tanto em 4 °C e em -70°C
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[00264]Sumário do segundo processo de purificação. A enzima GALNS também foi purificada utilizando um segundo trem de purificação (ver Tabela 6). A recuperação de GALNS global foi de cerca de 70 % e a pureza da enzima GALNS (incluindo ambas as formas precursores e maduras ou processadas, veja a Figura 10), conforme determinado por cromatografia C4-RP, foi grosseiramente estimado ser em cerca de 97 %.
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[00265]Estes testes indicam que os protocolos acima descritos para a preparação de enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes fornecem um método eficaz para a produção de grandes quantidades de enzimas altamente purificadas, em par- ticular a forma pré-processada secretada (precursora) de N-acetilgalactosamina-6- sulfatase (GALNS) humana.
EXEMPLO VI CARACTERIZAÇÃO DE N-ACETILGALACTOSAMINA-6- SULFATASE (GALNS) HUMANA PURIFICADA
[00266]As linhagens celulares G71 produzir proteínas (por exemplo, as enzimas lisossômicas) com maiores níveis de fosforilação de alta manose que é observado em uma linhagem celular média de mamíferos e um nível correspondentemente menor de oligossacarídeos de alta manose não fosforilada. Uma enzima sulfatase lisossômica (por exemplo, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS)), compreendendo um alto nível de oligossacarídeos de alta manose bisfos- forilada, tal como definido aqui, é comparada com as moléculas obtidas em Canfield et al, Patente U.S. 6,537,785, que não compreende oligossacarídeos complexos, e apresenta apenas oligossacarídeos de alta manose.
[00267]Para determinar os níveis de alta manose não fosforilada em uma enzima sulfatase lisossômica, um versado na técnica pode usar seqüenciamento exoglicosidase de oligossacarídeos liberados ("sequenciamento FACE"), para identificar o percentual de cadeias de oligossacarídeos de alta manose não-fosforiladas. Em um gel de perfil de liberação de lote FACE normal, a alta manose não-fosforilada co-migra com oligossacarídeos complexos particulares (por exemplo, oligomannose 6 e complexo biantenário totalmente sialilado). A alta manose não-fosforilada é, então, diferenciada dos outros oligossacáridos por sequenciamento enzimático.
[00268]Para determinar se a enzima sulfatase lisossômica purificada (por exemplo, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase recombinante humana (GALNS)), expressa em células G71S exibe aumento da fosforilação, o nível de manose-6-fosfato (M6P) sobre a enzima sulfatase lisossômica foi determinada, assim como a capacidade da enzima para se ligar ao receptor M6P (MPR).
[00269]A enzima GALNS recombinante humana, expressa em células G71S e purificada, foi analisada por eletroforese de carboidratos de fluorescência assistida (FACE) e por cromatografia em resina MPR-Sepharose. O sistema FACE utiliza eletroforese em gel de poliacrilamida para separar, quantificar e determinar a sequência de oligossacarídeos liberados a partir de glicoproteínas. A intensidade relativa da banda de oligomannose 7 bis-fosfato (O7P) no FACE (Haia et al, Eletroforese 19 (15): 2612 - 20, 1998) e o percentual de atividade retido na coluna MPR (Cacia et al. Biochemistry 37 (43): 15154 - 61, 1998) dão medidas confiáveis do nível de fosforila- ção por mol de proteína.
[00270]Atividade específica. A atividade específica de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recombinante humana foi determinada utilizando um substrato fluorescente pequeno de 4-metilumbelliferil-6-S-GAL (4MU-Gal- 6S) a 37 °C. Usando este teste, a atividade específica da GALNS purificado foi de 165 μmol / min / mg (0,165 U / mg).
[00271]Estabilidade do soro humano. A estabilidade do soro ex vivo da GALNS foi determinada. O soro humano (Sigma H-4522) foi esterilizado em filtro através de um filtro PES de 0,2 micrômetros e 4 mL do soro humano esterilizado em filtro foram pré-incubados em um balão de cultura de células T-25 para uma hora a 37° C em uma atmosfera de 10% de CO2 (pH neste ponto é de 7,4 ± 0,1). 0,4 mL de GALNS purificada dessalinisada (2 mg / mL de GALNS purificada foi dessalinizada em PBS usando colunas Bio-RAD 10DG) foi adicionado o soro humano pré- incubado, ou um controle de PBS contendo 0,5 mg / L de BSA. Amostras de 100 μL foram retiradas em momentos designados (por exemplo, 0, 1, 3, 5, 7,5 e 26 horas) e adicionado 900 mL de tampão de arrefecimento (QB, NaOAc 50 mM, pH 5,6 + NaCl 150 mM + 0,5 mg / mL de BSA + 0,001% de Tween-80). As amostras foram armazenadas a -40 °C até que estejam prontas para a medição da atividade enzimática de GALNS.
[00272]A atividade da enzima de GALNS foi medida utilizando a atividade de captura de enzima ELlSA. Ao extrapolar a curva de decaimento exponencial do % residual da atividade enzimática de GALNS, a meia-vida sérica do ex vivo da GALNS purificada foi estimada em ser de 217 horas.
[00273]Retenção em sinoviócitos (condrócitos). A capacidade de GALNS ser levada para o sinoviócito (condrócitos) foi determinada.
[00274]Os condrócitos (ATCC Número CRL-1832) são cultivados em meios de cultura (F12 Ham FBS + 10%) a 37°C em 5% de CO2 em pratos de 12 cavidades. A análise da retenção de três amostras requer 4 placas de 12 cavidades. As amostras purificadas GALNS e uma referência GALNS foram diluídas a 1 μm acPBS / BSA (PBS acídica + 200 μg / mL de BSA). A partir de estoques de 1 μm, curvas de diluição de retenção para amostras de GALNS e de referência foram preparadas: 50,5 μL(1 μm rhASB) em 5 mL de diluente do ensaio de retenção (UAD, DMEM + 2 mM + L-glutamina 0,5 mg / mL de BSA), resultando em amostras de GALNS de 10 nM e referência, que foram posteriormente diluídas em série de 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 e 0,16 nM por diluições seriadas de duas vezes em UAD. O crescimento médio dos pratos de 12 cavidades de condrócitos confluentes foi aspirado, 1 mL de uma UAD (em branco) ou diluições em série de amostras de GALNS ou referências foram adicionados às cavidades e incubadas por 4 horas a 37 °C em uma incubadora de 10% de CO2. O meio de retenção foi aspirado, inclinando cada prato para a integra- lidade, e cada cavidade foi lavada uma vez com 1 mL de PBS. O PBS foi aspirado e os condrócitos foram destacados adicionando 0,5 ml de tripsina / EDTA (0,25 % de Tripsina / 0,1 % de EDTA (Mediatech 25-053-CI, lote 25053025)) por cavidade. Após o descolamento da placa, os condrócitos foram previamente resfriados em alíquotas de gelo de tubos Eppendorf (total de 30 tubos). Os condrócitos tripsinizados foram resfriados e depois peletizados em baixa velocidade em uma microcentrífuga (4000 rpm por 3 minutos). A tripsina foi completamente aspirada, o pélete celular foi enxa- guado com 1 mL de PBS, repetindo as etapas de microcentrífuga e aspiração uma vez. 200 μL de tampão de lise celular (CLB, acetato de sódio 50 mM, pH 5,6 + 0,1 % de Triton X-100) foram adicionados a cada tubo. Os péletes celulares foram ressus- pensas por pulso vórtice três vezes. Após a ressuspensão, as misturas de lise celular foram armazenadas durante a noite a -80°C, ou analisadas diretamente.
[00275]Os lisados celulares foram descongelados em temperatura ambiente e transferidos para o gelo quando descongelados. Os lisados de células foram centrifugados para ressuspender qualquer material sólido visível, e depois rodar na mi- crocentrífuga de 14 Krpm durante 10 minutos a 4 °C para peletizar o material insolúvel. Os sobrenadantes foram transferidos para um novo conjunto de tubos e o pélete foi descartado. Então o ensaio de atividade GALNS foi realizadoa no sobrenadante. Uma curva de diluição de sete pontos (diluições em série de duas vezes partindo de 10 nM e terminando em 0,16 nM) é normalmente realizada que fecha que o esperado Kretenção de forma bastante equilibrada em ambos os lados. A molaridade das amostras de partida é calculada usando o peso molecular de apenas da proteínas.
[00276]A GALNS purificada apresentou um Kd para retenção em sinovióci- tos, com base na ligação do ligando de único sítio de 4,9 nM.
[00277]Ensaio de ligação da placa receptora de manose-6-fosfato (M6P). A capacidade de GALNS para se ligar ao receptor de manose-6-fosfato (M6P) foi determinada em uma placa ensaio de ligação. Placas de alta ligação FluoroNunc foram revestidas com 4 μg / mL do receptor M6P. As placas revestidas foram lavadas duas vezes com 250 μL / cavidade de tampão de lavagem (WB, TBS + 0,05% de Tween 20) e ligação inespecífica foi bloqueada com 200 μL / cavidade tampão de bloqueio e de diluição (BDB, tampão Pierce SuperBlock, lote No. CA46485) . As placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente (RT). Durante esta etapa de bloco, as amostras de GALNS purificadas (0,5 a 2 mg / mL armazenadas a 4° C por 2 semanas) foram diluídas a 10 nM em BDB, em seguida, diluídas seriadamente em tampão de diluição (DB, NaOAc 50 mM, NaCl 1 mM, pH 4,0 + 0,5 mg / mL de BSA) (250 μL + 250 μL) para 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 e 0,16 nM. As placas bloqueadas foram lavadas com WB como acima, e as amostras de GALNS diluídas foram dispensadas nos cavidades em duplicado, em 100 μL / cavidade e incubadas 1 hora em RT. Durante esta etapa de incubação, de substrato atividade de 2 mM foi preparado diluindo 0,1 mL do estoque de 6S-galactose-4MU 100 mM (armazenada em H2O,- 20°C) em 5 mL DB, e pré-aquecida em banho-maria a 37 °C. Após a incubação, as placas foram lavadas duas vezes com WB como acima, e 100 μL do substrato diluído foi adicionado e a atividade específica de GALNS foi determinada.
[00278]Usando o ensaio, a GALNS purificada apresentou um Kd para ligação ao receptor M6P, com base na ligação de único sítio de 2,4 nM.
[00279]Ligação da coluna do receptor de manose-6-fosfato (M6P). A capacidade de GALNS para se ligar ao receptor de manose-6-fosfato (M6P) foi determinada em uma coluna de ensaio de ligação. Uma coluna do receptor de M6P foi prepa-rada de acordo com as instruções do fabricante. O receptor de M6P era do laboratório Peter Lobel, a resina da coluna foi resina NHS ativada (Bio-RAD Affi-Gel 15), o tamanho da coluna foi de 0,7 mL. A coluna do receptor de M6P foi equilibrada com 10 volumes de coluna (CV) de tampão de equilíbrio (EQ, PBS ácida, pH 6,0 contendo β-glicerofosfato 5 mM, 0,05 % de Tween 20,5 mM de glicose-1-fosfato e 0,02 % de NaN3) em um taxa de fluxo de 0,25 mL/min. 6 μg de GALNS purificada (por 200 μL) foram carregados para a coluna do receptor de M6P a uma taxa de fluxo de 0,1 mL / min. GALNS não-ligado foi lavada fora da coluna com 10 CV de EQ, com um taxa de fluxo de 0,25 mL/min. A GALNS ligada foi eluída fora da coluna utilizando um tampão de eluição de 0 a 100 % (EL, PBS ácida, pH 6,0 contendo gradiente de β- glicerofosfato 5 mM, 0,05 % de Tween 20, de manose-6-fosfato 5 mM e 0,02 % de NaN3) (10 CV), seguido por 2 CV de 100% de EL. A coluna foi re-equilibrada com 3 CV de EQ.
[00280]Usando o ELISA para GALNS, o percentual de GALNS purificada que se liga ao receptor de M6P foi determinado ser de 56 %.
[00281]Análise de oligossacarídeos total por eletroforese capilar (CE). Para determinar o nível de manose-6-fosforilação sobre GALNS, o perfil de carboidrato ligado a N, dos oligossacarídeos totais sobre a GALNS foi determinado por eletroforese capilar (CE), conforme descrito em Ma et al. Anal. Chem. 71 (22) :5185 - 5192, 1999. O método utilizado PNGase F para clivar oligossacarídeos ligados a N de as- paragina. Os oligossacarídeos clivados foram isolados e posteriormente derivatiza- dos com corante fluorescente, e aplicado a uma coluna de spin G10 para remover excesso de corante. Os oligossacarídeos rotulados de forma fluorescente, purificados foram separados eletroforeticamente e picos subsequentemente quantificados utilizando o software MDQ-CE (32 Karat Ver. 7,0).
[00282]Usando este teste, as quantidades de manose 7 bis- fosforilada (BPM7), manose 6 mono-fosforilada (MPM6) e ácido siálico contendo oligossacarí- deos para GALNS purificada foram 0,58 mol / mol de enzima, 0,08 mol / mol de enzima e não detectável, respectivamente. O percentual de proteínas GALNS contendo BPM7 foi estimado em 29%.
[00283]Caracterização de Oligossacarídeos Bis 7. A localização dos oligos- sacarídeos de manose 7 bis-fosforilada (BPM7) em GALNS foi determinada. O resíduo de asparagina (Asn) na posição 178 foi glicosilada ligada a N para BPM7. O resíduo Asn na posição 397 não foi glicolisado ligado a N para BPM7, mas foi encontrado ser predominantemente açúcares do tipo oligomannose.
[00284]Afinidade de hidroxiapatite. Um modelo de ossos in vitro foi desenvolvido para determinar se o GALNS tinha a capacidade de direcionar para o osso. Uma suspensão de 4 mg / mL da grade de hidroxiapatita HTP-DNA (Bio-RAD) foi preparada e equilibrada em DBS + 50 μg / mL de BSA, pH 7,4. A GALNS purificada, após a adição de 50 μg / mL de BSA, foi dessalinizada em DBS, pH 7,4. A GALNS dessalinizada, na concentração final de aproximadamente 2 mg / mL, foi diluído em série em DBS + 50 μg / mL BSA, pH 7,4 em uma placa de 96 cavidades. 50 μL da GALNS diluída em série foram transferidos para placas de filtro de 96 cavidades (Millipore No. MSGVN2210, PVDF hidrofílica, baixa ligação protéica, tamanho de poros de 22 μm). 50 mL da suspensão de hidroxiapatita foram adicionados às cavidades da placa de filtro que contém a GALNS diluída em série e incubados por 1 hora a 37 °C com agitação moderada. A placa foi submetida à filtração a vácuo.
[00285]Os sobrenadantes do filtro a vácuo foram analisados por HPLC ou atividade enzimática de GALNS como descrito acima. A GALNS purificada apresentou um Kd de hidroxiapatita de 3 a 4,0 μm.
[00286]A linhagem celular G71S que expressa a sulfatase humana modificando o fator 1 (SUMF1) produz enzimas sulfatase lisossômicas com maiores quantidades de ativação (ou seja, a conversão do resíduo de cisteína do sítio ativo para Cα-formilglicina (FGIy)).
[00287]Para determinar se a enzima sulfatase lisossômica recombinante purificada (por exemplo, N-acetil-galactosamina-6-sulfatase humana (GALNS)) co- expressa com SUMF1 em células G71S que exibem aumento da ativação, a quantidade de conversão do resíduo de cisteína do sítio ativo de FGIy na enzima sulfatase lisossômica purificada foi determinada.
[00288]Ativação de GALNS. A ativação em porcentagem, ou seja, a conversão em porcentagem da cisteína do sítio ativo (Cis) resíduo de cisteína Cα- formilglicina (FGIy), da GALNS foi determinada por LC / MS (TFA). O TIC/1000 para Cys, FGIy e GIy foram 39, 1840 e 183, respectivamente, indicando que cerca de 90 % da GALNS purificada está em uma forma ativa (ou seja, FGIy).
[00289]Sumário. A Tabela 7 mostra um resumo da caracterização da GALNS recombinante expressa nas células do clone 4 de G71S. A Tabela 8 mostra um resumo da caracterização de GALNS recombinante expressa em células do clo- ne C2 de G71S.
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[00290]Estes resultados demonstram que a GALNS recombinante humana purificada tem um elevado nível de ativação, e altos níveis de fosforilação da mano- se 6-fosfato. Assim, células G71S co-expressando SUMF1 e uma enzima sulfatase lisossômica (isto é, GALNS) produzir de forma eficiente enzima sulfatase lisossômica ativa altamente fosforilada. O aumento do nível de resíduos de manose elevado em tais enzimas sulfatase lisossômicas leva a captação pela MPR nas células.
EXEMPLO VII Retenção e atividade de N- Acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) Re- combinante Humana em condrócitos de Morquio in vitro
[00291]A retenção de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recombi- nante humana pelos lisossomas de condrócitos Morquio e a capacidade de GALNS degradar o sulfato de keratan (KS) in vitro foi avaliada.
[00292]Os condrócitos de pacientes com mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IVa, Síndrome de Morquio) reduziram a atividade de GALNS e apresentam acúmulo lisossômico de KS. Um modelo in vitro de MPS IVa foi criado usando condrócitos isolados de biópsias de crista ilíaca de um paciente com MPS IVa. Os condrócitos primários, no entanto, diferenciam-se e perdem suas características de condrócitos em cultura. Assim, foram estabelecidas as condições de cultura para induzir a diferenciação de condrócitos in vitro.
[00293]Os condrócitos isolados de um paciente com MPS IVa, designados MQCH, foram cultivados em contas de alginato, na presença de IGF-1, TGF-β, transferrina, insulina e ácido ascórbico (meio de condrócitos de crescimento, Lonza No. CC-3225). O meio de cultura foi trocado duas vezes por semana durante os experimentos, de 6 a 15 semanas. Estas condições de cultivo induziram a expressão do fenótipo dos condrócitos e diferenciação. Estas células MQCH expressavam marcadores de condrócitos, incluindo o sexo que determina a região da caixa Y 9 (Sox 9), colágeno II, X colágeno, proteína da matriz oligomérica da cartilagem e agregam mRNA, como medido pela análise de RT-PCR quantitativa utilizando RNA isolado de culturas de células MQCH. Estas células MQCH cultivadas elaboraram também a matriz extracelular.
[00294]A microscopia confocal foi realizada para confirmar que as células MQCH acumularam KS. As células MQCH em uma cultura de 8 semanas foram trip- sinizadas, cytospun em lâminas de vidro, fixadas em acetona, e congelada até o uso. Após o descongelamento, as células foram reidratadas e coradas, como anticorpos primários e secundários, um anticorpo monoclonal anti-KS (Chemicon) e um anticorpo anti-coelho de cabra conjugado Alexa-488 (verde), respectivamente. As células MQ-CH exibiram coloração intracelular pontuada, de acordo com a acumulação de KS lisossômico.
[00295]Para determinar se a GALNS recombinante humana purificada poderia ser absorvida pelas células MQCH em lisossomas e degradar KS, uma cultura celular de MQCH de 6 semanas foi incubado com GALNS recombinante humana 10 nM duas vezes por semana durante 9 semanas. A retenção de GALNS e liberação de KS foram medidas por microscopia confocal. Os anticorpos primários utilizados foram: (a) um anticorpo policlonal de coelho anti-GALNS e um anticorpo monoclonal da Proteína-1 da Membrana Associada anti-lisossômica (LAMP-1), ou (b) um anticorpo monoclonal anti-KS e um anticorpo policlonal anti-LAMP-1. Os anticorpos secundários utilizados foram: anticorpos conjugados Alexa-488 (verde) para detectar anti-GALNS ou anticorpos anti-KS, ou Alexa-555 ou -594 (vermelho) para detectar anticorpos anti-LAMP-1. As preparações de células MQCH foram montadas em montagem contendo DAPI, os núcleos que mancham.
[00296]A co-localização significativa da enzima GALNS e KS e com o marcador lisossômico, LAMP-1, foi observada em células MQCH tratadas com GALNS. Após a exposição dos MQCH para GALNS recombinante humana, a quantidade de KS intracelular foi diminuída.
[00297]A retenção de GALNS também foi medida utilizando uma captura de enzima GALNS ELISA de captura e uma atividade específica de GALNS ELISA, ambos descritos no Exemplo IV acima. Os condrócitos humanos normais (NHKC), que expressam GALNS, foram utilizados como controle positivo. Como mostrado nas Tabelas 9 e 10, as células não-tratadas MQCH não tiveram enzima ou atividade de GALNS detectáveis, enquanto que as células MCQH tratadas por 9 semanas com GALNS 10 nM tinham enzima e atividade de GALNS significativa.
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[00298]Estes resultados demonstram que GALNS recombinante humana purificada é tomada pelos condrócitos Morquio em lisossomas e pode degradar KS li- sossômico in vitro. Estes condrócitos Morquio são úteis como um modelo in vitro eficaz para testar as enzimas sulfatase lisossômicas, tal como GALNS, que degrada KS.
EXEMPLO VIII ATIVIDADE DE ENZIMAS LISOSSÔMICAS RECOMBINANTES HUMANAS PARA DEGRADAR SUBSTRATOS NATURAIS EM UM ENSAIO À BASE DE CÉLULAS IN VITRO
[00299]Ensaios in vitro baseado na célula foram desenvolvidas para medir a atividade de enzimas lisossômicas recombinantes humanas, por exemplo, as enzimas sulfatase lisossômicas para degradas os substratos naturais.
[00300]A atividade enzimática de enzimas lisossômicas recombinantes humanas, por exemplo, as enzimas sulfatase lisossômicas, são normalmente medidas por um ensaio de uma in vitro livre da célula, utilizando um substrato artificial fluoro- gênico (ver Exemplo 4 para GALNS). No entanto, a atividade enzimática medida é dependente do tamanho do substrato artificial, ou seja, o número de unidades de monossacarídeos. Além disso, a atividade enzimática é medida em um ambiente que não é o reflexo da situação in vivo. Assim, o ensaio in vitro livre de células não leva em conta a capacidade da enzima lisossômica para clivar os substratos naturais, ou a sua capacidade de ser absorvido nas células-alvo e localizar para os lisos- somas.
[00301]Um ensaio baseado na célula in vitro foi desenvolvido para medir a atividade de duas enzimas lisossômicas recombinantes humanas, alfa-L-iduronidase (UDI) e arilsulfatase B (ARSB), para degradar os seus substratos naturais, ou seja, o sulfato de dermatan intracelular (DS)- que contém os substratos. DS contém variável ácido idurônico sulfatado β (1 a 3) -N-acetil-galactosamina β (1 a 4) unidades de dis- sacarídeo.
[00302]As células de fibroblastos humana GM005519 deficiente em ARSB ou as células de fibroblastos humana GM01391 deficiente em IDU foram cultivadas para confluência em placas de 12 cavidades, e as culturas foram mantidas após a confluência de 3 a 6 semanas para permitir a acumulação intracelular de DS.
[00303]As células pós-confluentes GM005519 ou GM01391 foram expostas a doses de saturação ARSB recombinante humano (10 nM) ou IDU recombinante humana (25 nM), respectivamente, por 4 a 5 dias. Células das enzimas sulfatase lisossômicas tratadas e não-tratadas e foram colhidas, centrifugadas e lisadas.
[00304]A atividade de enzimas lisossômicas no lisado celular foi medida pela determinação do teor de DS residual das células através de: (1) lise das células, (2), especificamente para digeriros substratos contendo DS, em dissacarídeos utilizando liase ABC de condroitina (EC 4.2.2.4 ) na célula lisada, (3) rotulagem de dissacarí- deos DS com um corante fluorescente (por exemplo, 2-amino-acridone, AMAC), (4) separação dos dissacarídeos DS (por exemplo, por eletroforese da zona capilar, CZE) e (5) detecção dos dissacarídeos rotulados DS (por exemplo, por fluorescência induzida por laser, LIF). Tais métodos são descritos, por exemplo, em Zinellu et ai, Eletroforese 2:2439 - 2447, 2007, e Lamari et al., J. Chromatogr. B 730: 129 - 133, 1999 (revisado em Volpi et al, Eletroforese 29: 3095 - 3106, 2008).
[00305]A Tabela 11 mostra a porcentagem de degradação de DS usando células GM00519 tratadas com ARSB, conforme determinado medindo a quantidade de dissacarídeos contendo N-acetilgalactosamina-4-sulfato (dissacarídeo 4S), que é o dissacarídeo DS predominante. Resultados semelhantes foram obtidos por meio de células GM01391 tratadas com IDU.
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aA degradação do percentual foi calculada medindo a área sob a curva do dissacarídeo 4S detectado na varredura CZE-LIF em lisados de ARSB-tratados, em comparação com células não tratadas
[00306]O ensaio acima indicou que as células-alvo assumiram ARSB re- combinante humana e IDU, que são localizadas em lisossomas, onde degradam seu substrato natural, intracelulare DS.
[00307]Um experimento da dose de encontro foi realizado para determinar a concentração em que IDU torna-se a limitação da taxa neste ensaio baseado em células. As células GM01391 foram cultivadas em placas de 12 cavidades. Em 4 semanas após a confluência, as células foram expostas a várias concentrações de IDU, de 0,8 nM a 25 nM, por 6 ou 26 horas. Os lisados celulares foram preparados e processados como descritos acima. IDU foi determinada a não se tornar a taxa limi- tante abaixo de 1 nM.
[00308]Em um segundo experimento da dose de encontro, as células GM01391 em 3 semanas pós-confluência foram expostas a várias concentrações de IDU, de 0,01 a 0,2 nM, durante 2 dias. Os lisados celulares foram preparados e processados como descritos acima. Nesse experimento, uma quantidade conhecida de um monossacarídeo padrão interno, GlcNAc-6S, foi cravado no lisados da célula para controlar por recuperação durante o processamento. Conforme mostrado na Figura 11, uma diminuição da dose dependente na quantidade de substrato DS foi observada nas células GM01319 tratadas com IDU.
[00309]Em um experimento da dose de encontro similar, as células GM00519 em 3 semanas após a confluência foram expostas a diferentes concentrações de ARSB, de 0,001 a 0,06 nM, por 5 dias. Os lisados celulares foram preparados e processados como descrito acima. Neste experimento, uma quantidade conhecida de um monossacarídeo padrão interno, GlcNAc-6S, foi cravado nos lisados da célula para controlar por recuperação durante o processamento. Conforme mostrado na Figura 12, uma diminuição da dose dependente na quantidade de substrato DS foi observada nas células GM00519 tratadas com ARSB.
[00310]Um ensaio in vitro baseado na célula foi desenvolvido para medir a atividade de uma enzima sulfatase lisossômica recombinante humana, GALNS, para degradar seu substrato natural, ou seja, o sulfato de keratan intracelular (KS), contendo substrato.
[00311]As células MQCH deficientes de GALNS foram cultivadas como descrito no Exemplo 7 acima e tratados com GALNS recombinante humana em 1 ou 10 nM. Após o tratamento, os lisados celulares de MQCH foram preparados e digeridos com Keratanase II (EC 3.2.1), que rompe os oligossacarídeos maiores KS em dissa- carídeos KS. Os dissacarídeos KS foram rotulados com AMAC, separados por CZE e detectados por LIF, como descrito acima para dissacarídeos DS. GIcNAe-6S, um monossacarídeo KS, foi cravado nos lisados da célula como padrão interno para controlar para recuperação durante o processamento. As quantidades de dois dissa- carídeos KS característicos, Gal6S-GlcNAc6S e Gal-GlcNAc6S foram medidos, e os dados obtidos foram corrigidos pela quantidade de GlcNAc6S recuperado. A Tabela 12 mostra a degradação por cento do KS, utilizando células MQCH tratadas com GALNS, conforme determinado pela medição da quantidade dos dois dissacarídeos KS característicos.
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a,b Percentagem de degradação foi calculado medindo a área sob a curva de Ga16S-GIcNAc6S e Gal-GlcNAc6S detectaram na varredura CZE-LIF em lisatos de GALNS-tratados em comparação às células MQCH não tratadas e ajuste para a área sob a curva do controle de pico GIcN Ac6S.
[00312]O ensaio acima indicado que as células alvo assumiram GALNS re- combinante humana, que é então, localizada para os lisossomas, onde GALNS degradou seu substrato natural, KS intracelular.
[00313]Globalmente, estes resultados demonstram que a atividade de enzimas lisossômicas recombinantes humanas, ARSB, IDU e GALNS, para degradar os seus substratos naturais podem ser medidos e quantificados em ensaios in vitro baseados nas células. Deve ser apreciado que esse ensaio in vitro com base na célula pode ser facilmente modificado para medir e quantificar a atividade de outras enzimas sulfatase lisossômicas, bem como uma ampla variedade de enzimas lisossômi- cas recombinantes.
EXEMPLO IX ENTREGA DE N-ACETILGALACTOSAMINA-6- SULFATASE (GALNS) RECOMBINANTE HUMANA PARA TECIDOS ESPECÍFICOS
[00314]A capacidade de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recom- binante humana, expressa em células G71 e purificada, para ser entregue aos tecidos específicos afetados por, ou associados a, deficiência de GALNS sobre sua administração em ratos foi avaliada.
[00315]A distribuição altamente específica de sulfato keratan dá o fenótipo muito característico de Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IV A) ou Síndrome de Morquio. O sulfato de keratan é encontrado principalmente na cartilagem (placas de crescimento ósseo das articulações, a válvula do coração, da laringe e do septo na sal) e da córnea, e é nestes tecidos que apresentam acúmulo de sulfato de keratan em pacientes com MPS IVA. Assim, para N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS), que é deficiente em MPS IV A ou Síndrome de Morquio, é importante para mostrar a entrega da enzima GALNS para a placa de crescimento dos ossos longos, a válvula de coração, córnea, laringe e nariz. Olhar para estes tecidos específicos, que são pobremente vascularizados alvos, entrega de uma GALNS fluorescente foi investigada em ratos.
[00316]Dois métodos de coloração imunohistoquímica foram testados em camundongos: (1) GALNS humana conjugada com Alexa 488 e (2) GALNS humana não-conjugada. A conjugação de GALNS humana para Alexa 488 foi realizada utilizando Kit de rotulagens de maleimide de Sondas Moleculares Alexa Fluor 488 C5 (A- 10254). A química de conjugação maleimide resultou em uma rotulagem 1: 1 para a relação de proteína.
[00317]Para confirmar que a etiqueta fluorescente não interferiu com a captação de GALNS, um experimento de imunocitoquímica foi realizado utilizando sino- viócitos de cultura (ATCC # CRL-1832). Um ensaio de retenção padrão foi utilizado para comparar a GALNS não-conjugada com GALNS conjugada (GALNS-A488 ou GALNS-A555). As células foram incubadas com a enzima GALNS por 4 horas com uma perseguição posterior com α-L-iduronidase (IDU) por 2 horas. Os resultados mostraram que a conjugação Alexa 488 não interfere com a retenção celular. A Figura 13 mostra o Kd estimado para GALNS, GALNS-A488, e GALNS-A555. O consumo foi medido por antígeno ELISA dos lisados das células em vez de atividade en- zimática, pois a rotulagem inativou a enzima. O Kd das enzimas GALNS não conjugadas e conjugadas estava determinado a ser aproximadamente igual.
[00318]Para determinar a estabilidade da etiqueta fluorescente, uma vez que a enzima GALNS foi incorporada à célula, imunocoloração em GALNS não- conjugada e conjugada foi realizada. Os anticorpos primários utilizados para a colo- ração era uma proteína anti-GALNS do anticorpo de coelho G-purificado na concentração de 1 μg / mL. Todas as imagens foram tiradas em um microscópio Leica IRE2 Widefield epi-fluorescente usando software MetaMorph. Deconvolução das pilhas de imagem foi necessária para medir a co-localização nessas imagens, devido à presença de luz fora do plano. A deconvolução foi feita usando software de visualização AutoQuant / AutoDeblur usando uma função de difusão do ponto teórico (algoritmo cego).
[00319]A imunocoloração mostrou boa sobreposição com o sinal que foi amplificado sobre o material GALNS-A488. O aumento observado na sensibilidade deveu-se ao anticorpo primário e secundário sendo ambos policlonais.
[00320]Para determinar se a enzima GALNS foi orientada para o lisossoma imunocoloração das sinoviócitos cultivados com Sondas Moleculares LysoTracker ou de outra enzima que se localiza no lisossomo foi realizada. LysoTracker pareceu mostrar alguma sobreposição com a enzima GALNS-488, no entanto, a coloração não foi uniforme. A perseguição de 2 horas de N-acetylgalactose amina -4-sulfatase (rhASB) recombinante humana, uma enzima lisossômica, que mostrou algumas co- localização com GALNS.
[00321]Os experimentos acima mostraram que a enzima GALNS-A488 é absorvida pelas células e localiza o lisossoma, e pode ser usado para determinar bio- distribuição in vivo.
[00322]Dois estudos in vivo foram conduzidos. Um primeiro estudo piloto foi uma dose única (10 mg / kg) de injeção bolus na veia da cauda de camundongos normais Balb / c, seguido por um segundo estudo com múltiplas (5) injeções todos os dias de 10 mg / kg na veia da cauda de camundongos Balb / c normal. A Tabela 13 e Tabela 14 descrevem os planos experimentais para o primeiro e segundo estudo, respectivamente. Tabela 13: Projeto Experimental do Primeiro Estudo Piloto
Figure img0019
[00323]No primeiro estudo piloto, o coração, do fígado e a junção fêmur /tíbia foram colhidos em pontos no tempo de 2 horas e 24 horas. No segundo estudo, o coração, o rim, o fígado e os ossos com quadrícepe e sóleo foram colhidos em pontos no tempo de 2 horas, 4 horas e 8 horas. Para ambos os estudos, o coração, rim e fígado foram fixados em paraformaldeído a 4% (PFA), durante 4 dias, embebido em parafina, seccionados a 7 μm de espessura. O osso, incluindo o músculo, no segundo estudo, foi fixado em imersão em PFA 4% para 8 dias, descalcificados, embebidos em parafina e seccionados para 7 μm de espessura.
[00324]As imagens da GALNS-A488 de camundongos injetados foram obtidas em um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss. Para a análise do primeiro estudo-piloto, uma pilha confocal por amostra foi adquirida para a válvula do coração e do fígado e utilizada para análise volumétrica. Duas pilhas / amostras con- focais foram adquiridas para a placa de crescimento e utilizadas para análise volumétrica. No segundo estudo, uma pilha confocal / amostra de válvula do coração, rins e fígado foi adquirida e utilizada para a análise volumétrica; duas pilhas / amostra confocais para placa de crescimento e zona de cartilagem de repouso (ZRC) foram adquiridos e utilizados para a análise volumétrica.
[00325]As conclusões dos estudos de imagem microscópica confocal foram: (1) foi possível detectar GALNS fluorescente in vivo, (2) o sinal foi específico (ausência de fundo) e a localização foi lisossômica, (3) a presença de GALNS foi demonstrada nas células sinusoidais do fígado; (5) no coração, a enzima GALNS esteve presente no septo e no átrio, mas o mais importante foi claramente visível ao nível da válvula do coração, onde foi distribuído mais profundamente após injeções múlti-plas; (6) na junção fêmur / tíbia, a enzima GALNS estava presente na parte mineralizada do osso (epífise), bem como a medula óssea. GALNS esteve presente na placa de crescimento. Mais particularmente, GALNS era abundante nos condrócitos da zona de repouso (ou zona de reserva de cartilagem), presente no início da zona pro- liferativa, e reapareceu em abundância na zona de ossificação, no final da placa de crescimento. Embora difícil de quantificar o efeito cumulativo de injeções múltiplas, o segundo estudo parece mostrar uma ampla distribuição. A Tabela 15 mostra um resumo dos estudos das imagens microscópicas confocais.
Figure img0020
Figure img0021
[00326]Para coloração secundária, a etapa inicial foi a otimização do anticorpo GALNS primário. Vários tecidos foram corados com diluições de 1: 100 a 1: 400 com o anticorpo de coelho anti-GALNS purificada de G-proteína. Resultados no primeiro estudo piloto indicaram que uma diluição de 1:100 foi ideal para uma alta relação sinal - ruído. Esse resultado foi confirmado no segundo estudo. As lâminas restantes foram processadas com uma diluição do anticorpo primário de 1: 100 e uma diluição do anticorpo secundário de 1: 1000.
[00327]O sinal para camundongos Balb / c dosados com GALNS tinha um sinal acima do controle (ou seja, ratos dosados PBS-Cys) quando corados com o anticorpo anti-GALNS G-purificada da proteína. Para confirmar que a enzima GALNS foi localizada no lisossoma, as secções foram coradas com o anticorpo anti- Lamp1. Lamp1 é um marcador para lisossomas. As imagens mostraram sobreposição entre os anticorpos anti-Lamp1 e anti-GALNS, indicando que a enzima GALNS foi localizada no lisossoma.
[00328]Em geral, os dois estudos in vivo indicam que a biodistribuição de GALNS está ligada à vascularização, ou seja, mais tecidos vascularizados contém mais sinal fluorescente. Mais importante, os estudos demonstram a presença de GALNS nos sítios de acúmulo de sulfato de keratan na Síndrome de Morquio, mesmo que estes sítios sejam mal vascularizadas.
EXEMPLO X EFEITOS DE N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE (GALNS) RECOMBINANTE HUMANA E OUTRAS ENZIMAS SULFATASE LISOSSÔMICAS EM CAMUNDONGOS DEFICIENTES EM ATIVIDADE DA ENZIMA SULFATASE LISOSSÔMICA
[00329]Os efeitos das enzimas sulfatase lisossômicas humanas ativas altamente fosforiladas da invenção, por exemplo, N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recombinante humana, em camundongos deficientes na atividade da enzima sulfatase lisossômica são avaliados.
[00330]A proteína GALNS recombinante humana é expressa em células G71S e purificadas. Outras enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes humanas podem ser expressas e purificadas basicamente de acordo com métodos descritos aqui ou através de procedimentos conhecidos na técnica.
[00331]Vários modelos de ratos da deficiência da enzima sulfatase lisossô- mica humana têm sido descritos, incluindo: Leucodistrofia Metacromática (MLD) (deficiência de arilsulfatase A), (Hess et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:1482114826, 1996), Mucopolissacaridose tipo VI (MPS VI) ou síndrome de Maroteaux- Lamy (deficiência de arilsulfatase B) (Evers et al. Proc. Natl. Acad. LSg U.S.A. 93:8214-8219, 1996), Mucopolissacaridose tipo II (MPS II) ou síndrome de Hunter (deficiência de iduronato-2-sulfatase) (Muenzer et al. Acta Paediatr. Suppl. 91 (439) :98-99, 2002; Cardone et al, Hum. Mol. Genet. 15:1225-1236, 2006) , Mucopolissa- caridose tipo IIIa (MPS IIIa) ou síndrome de Sanfilippo A (deficiência de sulfamida- se/heparan- N-sulfatase) (Bhaumik et al, Glycobiology 9 (12): 1389-1396, 1999), Mu- copolissacaridose tipo IVa (MPS IVa) ou síndrome de Morquio A (deficiência de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase) (Tomatsu et al, Hum. Mol. Genet. 12:3349 - 3358, 2003), e Deficiência Múltipla de Sulfatase (MSD) (sulfatase modificando uma deficiência de fator 1) (Settembre et al, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 104:4506-4511, 2007). Um modelo do rato de Mucopolissacaridose tipo IIId (MPS IIId) ou síndrome de Sanfilippo D (deficiência de N-acetilglicosamina 6-sulfatase) ainda tem de ser descrito.
[00332]Os modelos ratos com deficiência da enzima sulfatase lisossômica humana podem ser utilizados para avaliar a viabilidade da terapia de reposição en- zimática (ERT) como um meio para o tratamento de doenças de depósito lisossômi- co. Por exemplo, camundongos MPS IVa -knock-out (ratos de GALNS; Tomatsu et al. Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003) não tiveram atividade enzimática de GALNS detectável e mostram glicosaminoglicanos urinários aumentados (GAGs), ou seja, o sulfato de Keratan e condroitina-6-sulfato, e acúmulo de GAGs em múltiplos tecidos e órgãos, por exemplo, fígado, rim, baço, coração, cérebro, medula óssea e cartilagem. Os ratos GALNS, no entanto, não apresentam anormalidades esqueléticas associadas à doença humana. Outro modelo de rato MPS IVa foi desenvolvido que expressa uma GALNS humana inativa e mutantes, GALNS de ratos endógenos inativos (GALNStm(hC79S.mC76S)slu de ratos; Tomatsu et al, Hum. Mol. Genet. 14:3321 - 3335 , 2005). Em GALNStm(hC79S.mC76S)slu de ratos, que não têm atividade da enzima de GALNS detectada, a excreção de GAG urinária é aumentada, GAGs se acumulam em vários tecidos, incluindo vísceras, cérebro, córnea, ossos, ligamentos e da medula óssea, de depósito lisossômico é marcado em múltiplos tecidos e armazenamento do osso é evidente. As alterações patológicas em GALNStm(hC79S.mC76S)slu de ratos são diferentes daqueles observados em GALNS de ratos. No entanto, como os GALNS de ratos, GALNStm(hC79S.mC76S)slu de ratos não apresentam anormalidades esqueléticas associadas à doença humana. Assim, GALNS ou GAL- NStm(hC79S.mC76S)slu de ratos podem ser usadas para investigar o efeito da administração de GALNS recombinante humana no GAGs urinária aumentado e acúmulo de GAGs nos tecidos.
[00333]GALNS ou GALNStm(hC79S.mC76S)slu de quatro semanas de idade ou ratos do tipo selvagem são dados semanalmente injeções intravenosas (n = pelo menos 6 ou 8 por grupo) de várias doses de GALNS recombinante humana (por exem- plo, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 mg / kg) ou um controle de veículos através de 16 a 20 semanas de idade, e, em seguida, sacrificados para exame histológico. A urina é coletada a partir de excreção de GAG urinária de camundongos e é determinada conforme descrito (Tomatsu et al. Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003). O exame anatomopatológico de vários tecidos é realizado como descrito (Tomatsu et al, Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003).
[00334]Usando o GALNS ou GALNStm(hC79S.mC76S)slu de ratos, a GALNS re- combinante humana da invenção é esperada para demonstrar a capacidade de reduzir: (1) excreção de GAG urinária, (2) acúmulo de GAGs em múltiplos tecidos, por exemplo, órgãos viscerais, cérebro, córnea, ossos, ligamentos e medula óssea; (3) depósito lisossômico em múltiplos tecidos, e (4) armazenamento do osso.
[00335]O efeito da GALNS recombinante humano é investigado em um modelo do rato com Deficiência Múltipla de Sulfatase (MSD) (SUMF1 de ratos; Settem- bre et al, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 104:4506-4511, 2007). Porque os ratos SUMF1 mostram mortalidade freqüentes no início da vida, as injeções desses ratos com GALNS recombinante humana são iniciadas mais cedo do que o descrito acima para GALNS de ratos.
[00336]Os seguintes procedimentos conhecidos na técnica, os efeitos de outras enzimas sulfatase lisossômicas recombinantes humanas, ou seja, arilsulfatase A, arylsulfatse B, iduronato-2-sulfatase, sulfamidase / heparan-N-sulfatase e N- acetilglicosamina 6-sulfatase, são investigados em modelos do rato com MLD (ASA de ratos; Hess et al, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 93:14821-14826, 1996), MPS VI (As1-s de ratos; Evers et al, Proc. Natl . Acad. Sci U.S.A. 93:8214-8219, 1996), MPS II (ids de ratos; Cardone et al, Hum. Mol. Genet. 15:1225-1236, 2006), MPS IIIa (Bhaumik et al, Glycobiology 9 (12) :1389-1396, 1999) e MSD (SUMF1 de ratos; Set- tembre et al, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 104:4506-4511, 2007).
EXEMPLO XI TRATAMENTO DE PACIENTES HUMANOS COM MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO IVA (OU SÍNDROME DE MORQUIO) OU OUTRAS DEFICIÊNCIAS DA ENZIMA SULFATASE LISOSSÔMICA COM N- ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASE (GALNS) RECOMBINANTE HUMANA E OUTRAS ENZIMAS SULFATASE LISOSSÔMICA
[00337]Os pacientes humanos manifestando um fenótipo clínico da deficiência da enzima sulfatase lisossômica, como em pacientes diagnosticados com muco- polissacaridose tipo IV A (MPS IVa ou Síndrome de Morquio), são contemplados para a terapia de reposição enzimática com a enzima recombinante, ou seja, N- acetilgalactosamina- 6-sulfatase humana (GALNS). Todos os pacientes que sofrem de uma deficiência da enzimática sulfatase lisossômica manifestam alguma evidência clínica de excesso ou visceral prejudicial e acúmulo de tecido mole de material de armazenamento em seus lisossomas manifestados por vários graus de comprometimento funcional ou agravamento do estado de saúde associados a uma doença de depósito lisossômico particular. Todos os pacientes com MPS IVa manifestam alguma evidência clínica da deformidade óssea, baixa estatura e alterações da marcha, e/ou acúmulo de glicosaminoglicanos (GAG) no sangue ou na urina, com diferentes graus de comprometimento funcional.
[00338]Preferencialmente, os níveis das enzimas são monitorados em um paciente que sofre de uma deficiência da enzima sulfatase lisossômica para confirmar a ausência ou diminuição da atividade da enzima sulfatase lisossômica em seus tecidos. Pacientes com menos de 10%, preferencialmente menos que 5%, mais preferencialmente menos de 2% ou até mais, preferencialmente menos de 1% da atividade da enzima lisossômica em um indivíduo de outra maneira normal são candidatos adequados para o tratamento com a enzima sulfatase lisossômico adequado. Os dados podem ser coletados para determinar a atividade da enzima sulfatase lisos- sômica do paciente antes, durante e após a terapia.
[00339]A eficácia é determinada pela medição da percentagem de redução na excreção urinária do substrato, ou seja, glicosaminoglicanos (GAGs) da enzima sulfatase lisossômica ao longo do tempo. Os níveis de GAG urinário em pacientes que sofrem de uma deficiência da enzima sulfatase lisossômica são comparados com os níveis de excreção normal e/ou níveis em pacientes não tratados sofrem com a deficiência da mesma enzima sulfatase lisossômica e/ou níveis em um mesmo paciente antes da terapia com a enzima sulfatase lisossômica. A maior redução de 25%, preferencialmente maior do que a redução de 50% na excreção de GAGs degradado após a terapia com a enzima sulfatase lisossômica é um meio válido para medir uma resposta do indivíduo à terapia.
[00340]A eficácia também pode ser determinada de acordo com os sinais e sintomas reduzidos da patologia associada à doença de depósito lisossômico. A eficácia pode ser determinada por biópsia de tecido e exame de células e/ou lisosso- mos para determinar a extensão pela qual GAGs foram reduzidos nos lisossomas, células ou tecidos. A eficácia pode ser determinada pela avaliação funcional, que pode ser objetiva ou subjetiva (por exemplo, redução da dor ou dificuldade na função, aumento da força muscular e resistência, aumento do débito cardíaco, a resistência do exercício, alterações na massa corporal, estatura ou aparência, e assim por diante).
[00341]Uma composição farmacêutica compreendendo GALNS recombinan- te humana, expressa nas células G71S e purificada, e formulada de acordo com procedimentos conhecidos na técnica. É preferível administrar as composições farmacêuticas da invenção por via intravenosa.
[00342]O projeto básico de um estudo clínico inicial para investigar o efeito da administração de GALNS recombinante humana para pacientes com MPS IVa envolve um estudo de eficácia / segurança escalada de rótulo aberto em que várias doses de enzimas são administradas por via intravenosa nos pacientes em um inter- valo fixo, por exemplo, e não para limitação, semanalmente injeções de enzimas.
[00343]Para pacientes com MPS IVa, a eficácia é determinada pela medição, por exemplo, GAG urinário ou de sangue diminuído, que é susceptível de ser observado dentro de algumas semanas de ERT, resistência aumentada nos testes de função cardíaca, pulmonare e/ou motora, que é susceptível de ser observado dentro de alguns meses de ERT, e/ou alterações esqueléticas e/ou crescimento do corpo, que é susceptível de ser observado dentro de anos de ERT.
[00344]As medições do GAG urinário são úteis para o estabelecimento de um regime de dose adequada, bem como para determinar a eficácia, através da medição do percentual de redução na excreção urinária de GAG ao longo do tempo.
[00345]Uma variedade de testes de resistência pode ser empregada, incluindo, por exemplo, e não para limitação, testes de caminhada (distância percorrida em 6 ou 12 minutos), subir escadas (degraus por minuto), e função pulmonar / respiratória, incluindo a função cardíaca (ECG, ecocardiograma), função pulmonar (FVC, FEV1, pico de fluxo).
[00346]Para pacientes mais jovens em tratamento por longos períodos de tempo, o crescimento (altura) pode ser medido.
[00347]As doenças de depósito lisossômico associadas à deficiência na atividade da enzima sulfatase lisossômica que podem ser tratadas ou prevenidas usando os métodos da presente invenção são: Leucodistrofia Metacromática (LDM), Mucopolissacaridose tipo VI (MPS VI) ou síndrome de Maroteaux-Lamy, Mucopolis- sacaridose tipo II (MPS II) ou síndrome de Hunter, Mucopolissacaridose tipo IIIa (MPS IIIa) ou síndrome de Sanfilippo A, Mucopolissacaridose tipo IIId (MPS IIId) ou síndrome de Sanfilippo D, Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IVa) ou síndrome de Morquio A, ou Deficiência Múltipla de Sulfatase (MSD). Para cada doença de depósito lisossômico, a enzima sulfatase lisossômica recombinante compreenderia uma enzima sulfatase lisossômica específica.
[00348]Para os métodos que envolvem MLD, a enzima sulfatase lisossômica preferida é arilsulfatase A. Para os métodos que envolvem MPS VI, a enzima sulfatase lisossômica preferida é arilsulfatse B. Para os métodos que envolvem MPS II, a enzima sulfatase lisossômica preferida é iduronato-2-sulfatase. Para os métodos que envolvem MPS IIIA, a enzima sulfatase lisossômica preferida é sulfamidase / hepa- ran-N-sulfatase. Para os métodos que envolvem MPS IIID, a enzima sulfatase lisos- sômica preferida é N-acetilglicosamina-β-sulfatase. Para os métodos que envolvem MPS IVA, a enzima sulfatase lisossômica preferida é N-acetilgalactosamina-6- sulfatase. Para métodos envolvendo MSD, a enzima sulfatase lisossômica preferida é N-acetilgalactosamina-6-sulfatase.
[00349]Várias modificações e variações da invenção, tal como estabelecido nos exemplos ilustrativos acima são esperadas para os versados na técnica. Por conseguinte, apenas tais limitações como aparecem nas reivindicações em anexo devem ser colocadas sobre a invenção.

Claims (12)

1. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende enzimas N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recombinante humana isolada, as ditas enzimas consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentada nos aminoáci- dos 27 a 522 da SEQ ID NO:4, útil para tratar um indivíduo que sofre de uma doença de depósito lisossômico que é causada por ou associada a uma deficiência nas ditas GALNS, em que as ditas enzimas GALNS na dita composição: (a) consistem em uma faixa principal de 55 a 60 kDa que é pelo menos 75% das proteínas visíveis, ou pelo menos 85% das proteínas visíveis, como determinado pela coloração Coomassie Blue quando submetida a SDS-PAGE sob condições de redução; (b) têm pelo menos 50% de conversão do resíduo de cisteína na posição 53 para Cα-formilglicina (FGIy); e (c) são glicosiladas N-ligadas nos resíduos de asparagina nas posições 178 e 397, em que pelo menos 50% das cadeias de oligomannose ligadas ao resíduo de asparagina na posição 178 são bis-fosforiladas.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a doença de depósito lisossômico é Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IVa) ou síndrome de Morquio A, ou Deficiência Múltipla de Sulfatase.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a enzima GALNS consiste em uma faixa principal de 55 a 60 kDa que é pelo menos 85% das proteínas visíveis, como determinado pela coloração Coomassie Blue quando submetida a SDS-PAGE sob condições de redução.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a enzima GALNS consiste em uma faixa principal de 55 a 60 kDa que é pelo menos 90% das proteínas visíveis, como determinado pela coloração Coomassie Blue quando submetida a SDS-PAGE sob condições de redução.
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a enzima GALNS tem pelo menos 70% de conversão do resíduo de cisteína na posição 53 para Cα-formilglicina (FGIy).
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a enzima GALNS tem pelo menos 90% de conversão do resíduo de cisteína na posição 53 para Cα-formilglicina (FGIy).
7. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) recombinante humana purificada para uso no tratamento de um indivíduo que sofre de Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IVa) ou síndrome de Morquio A, ou Deficiência Múltipla de Sulfatase (MSD), a dita enzima consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentada nos aminoácidos 27 a 522 da SEQ ID NO:4, em que a dita enzima GALNS: (a) em que a enzima GALNS consiste em uma faixa principal de 55 a 60 kDa que é pelo menos 75% das proteínas visíveis, ou pelo menos 85% das proteínas visíveis, como determinado pela coloração Coomassie Blue quando submetida a SDS-PAGE sob condições de redução; (b) tem pelo menos 50% de conversão do resíduo de cisteína na posição 53 para Cα-formilglicina (FGIy); e (c) é glicosilada N-ligada nos resíduos de asparagina nas posições 178 e 397, em que pelo menos 50% das cadeias de oligomannose ligadas ao resíduo de asparagina na posição 178 são bis-fosforiladas.
8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um peptídeo de direcionamento ósseo.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo de direcionamento ósseo compreende seis resíduos de ácido aspártico.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda Tween-20.
11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que é uma composição farmacêutica estéril.
12. Uso de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar um indivíduo que sofre de Mucopolissacaridose tipo IVa (MPS IVa) ou síndrome de Morquio A, ou Deficiência Múltipla de Sulfatase (MSD).
BRPI0906948-8A 2008-01-18 2009-01-16 Composições compreendendo uma enzima nacetilgalactosamina-6- sulfatase (galns) recombinante humana e uso das mesmas para tratar mucopolissacaridose tipo iva, síndrome de morquio a, ou deficiência múltipla de sulfatase BRPI0906948B1 (pt)

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