TW201307563A - 純化乙醯肝素－ｎ－硫酸酯酶之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露製造及純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶之方法，其包含於可得到高度純乙醯肝素-N-硫酸酯酶之條件下製造或純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的層析步驟。

Description

純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶之方法 相關申請案
本申請案主張2011年5月19日提出之美國臨時專利申請序列號61/488,090之利益，其整體教示內容係藉引用方式併入本文。
本發明係關於製造及純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶之方法。所揭露之製造及方法大致上包含於可得到高度純乙醯肝素-N-硫酸酯酶之條件下令乙醯肝素-N-硫酸酯酶接受一或多個層析步驟。
黏多醣症(MPS)為一群組之因為溶小體酵素之不足或不存在所致之罕見遺傳性溶小體貯存病症。缺少這些酵素導致細胞及組織中，以及稱作溶小體之胞器中之複合糖分子的累積。在正常溶小體酵素存在下，這些糖轉變成其他物質且被身體所利用。這些複合糖稱為黏多醣或糖胺聚糖(GAG)，且係充作供身體結締組織用之積塊。
MPS III係因缺乏降解糖胺聚糖(GAG)所需之四種不同酵素所引起。每一種酵素之不足均明確地造成不同形式的聖菲利柏氏(Sanfilippo)症候群：第III A型(聖菲利柏氏A(Sanfilippo A))、第III B型(聖菲利柏氏B(Sanfilippo B))、第III C型(聖菲利柏氏C (Sanfilippo C))、及第III D型(聖菲利柏氏D(Sanfilippo D))。乙醯肝素-N-硫酸酯酶(HNS)為一種參與乙醯肝素硫酸酯之逐步降解的酵素。HNS將連接至乙醯肝素硫酸酯(一種型式之GAG)之葡萄糖胺殘基中之胺基上的硫酸酯部分水解。此酵素之不足係與第III A型黏多醣症(MPS，聖菲利柏氏A(Sanfilippo A)症候群)有關。受第III A型黏多醣症所苦之病患具有編碼HNS之基因的突變，導致此酵素之不足或不存在。
第III A型黏多醣症的症狀(聖菲利柏氏A(Sanfilippo A)通常出現在2至6歲間，然而有些情況下遲至13歲方診斷出。隨著嚴重程度之不同而存在病況之臨床症狀。中樞神經系統為第III A型黏多醣症病患受影響最嚴重之系統。HNS及其他次貯存化合物主要累積於中樞神經系統中。語言發展、動作技能、及智力發展的問題為該病況的特徵。整體而言，患有第III A型黏多醣症之個體具有顯著之發展遲緩，且長期生存力差。該病況係慢性耗弱且危急生命。
現今並無被認可之第III A型黏多醣症醫療法可行。已試圖用骨髓移植來減緩疾病之進展。因為乙醯肝素硫酸酯為HNS之天然基質，故動物研究已顯示HNS可有用於治療溶小體貯存病症，諸如第III A型黏多醣症(該症中之乙醯肝素硫酸酯增加)。
有鑒於關注於以HNS作為藥學劑，故仍持續需要以成本有效方式製備大量的高度純化材料。已報導由培養基 中純化HNS的各種報告(Hemsley et al.,Mol.Genet.Metab.90：313-328(2007))。雖然純化HNS的一些方法已予嘗試及說明，但無一者適於製造供人第III A型黏多醣症用之HNS。
本文提供之實施例大致上關於純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶(HNS)之方法，尤其由培養基中或由粗製重組HNS之半純化樣品中純化重組人HNS(rhHNS)之方法，以及關於包含藉使用該純化HNS步驟及方法所純化之HNS的組成物及配方。前述方法包含使用組合之層析法以純化HNS。
本文所述之實施例係以以下之認知為基準，亦即已公開之供離析HNS的步驟並不能可再生地產生足夠純度及醫療有用溶解度之HNS。以此認知為基準，本文提供於可降低污染物程度之條件下可再生地製造HNS之方法及分析法。藉這些方法製造及純化HNS則可提供含有減量污染物之HNS。一些實施例中，藉本文提供之方法及分析法所得之HNS含有減量之可能降低其溶解度之高pI的HNS。該純化法提供大量之比已知方法所提供者更高產率之HNS及更高純度之HNS。此純化法尤其可用於製備供人使用之醫藥級HNS(例如重組人HNS(rhHNS))。
於一面向中，本文提供純化重組人HNS之方法及分析法，其係藉將由細胞培養基中所萃取之材料純化，再將 該萃取材料暴露至一或多個柱式層析或分批層析介質上(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多個)。同樣地，於一面向中，本文提供藉將萃取自一或多個柱式層析或分批層析介質中之富集洗提液進一步純化以純化重組人HNS之方法及分析法，其係藉將此富集洗提液暴露至一或多個另加之柱式層析或分批層析步驟(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多個)。
一實施例中，將HNS使用四柱法純化，其包含下列之純化步驟：1)將萃取自細胞培養基中之溶液形式之初始HNS過濾；2)將已過濾之HNS裝載至陰離子交換基質(例如Q瓊脂糖快速流動柱(Q Sepharose Fast FlowTM))上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出；3)將得自陰離子交換柱中之洗提液裝載至疏水交互作用柱(HIC)(例如苯基瓊脂糖)上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出；4)將得自HIC柱之洗提液裝載至羥基磷灰石柱(HA)(例如陶瓷羥基磷灰石第1型)上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出；及5)將得自HA柱之洗提液裝載至陽離子交換柱(例如SP瓊脂糖)上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出。某些實施例中，將回收自陽離子交換柱中之洗提液進一步藉超濾法或濾洗法過濾及濃縮。某些實施例中，將回收自陽離子交換柱中之洗提液進一步純化(例如藉將此洗提液裝載至一或多個陰離子交換柱、HIC柱、HA柱及/或陽離子交換柱中)。
必需注意的是，某些實施例中，每一個柱式層析純化步驟之進行不必一定要依照先前進行之柱式層析純化步驟而定。因此，某些實施例中，每一個柱式層析純化步驟的順序並不苛求，且為求便利及清楚起見，接續之柱式層析純化步驟會提到前一步驟所得之特定洗提液。例如，某些實施例中，將乙醯肝素-N-硫酸酯酶(HNS)使用四柱法純化，然而在將萃取自細胞培養基中之溶液形式之初始HNS過濾後，所述之純化步驟係以不同的順序進行。例如，純化步驟可包含：1)將已過濾之HNS裝載至陰離子交換基質(例如Q瓊脂糖快速流動柱(Q Sepharose Fast FlowTM))上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出；2)將得自陰離子交換柱之洗提液裝載至羥基磷灰石(HA)柱(例如陶瓷羥基磷灰石第1型)上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出；3)將得自HA柱之洗提液裝載至陽離子交換柱(例如SP瓊脂糖)上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出；及4)將得自陽離子交換柱之洗提液裝載至疏水交互作用柱(HIC)(例如苯基瓊脂糖)上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出。
某些實施例中，將HNS使用至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或更多個柱式層析純化步驟進行純化。例如，某些實施例中，將HNS使用三柱法純化，其中在將萃取自細胞培養基中之溶液形式之初始HNS過濾後，將此已過濾之HNS接受下列之純化步驟：1)將HNS 裝載至陰離子交換基質(例如Q瓊脂糖快速流動柱(Q Sepharose Fast FlowTM))上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出；2)將得自陰離子交換柱之洗提液裝載至疏水交互作用柱(HIC)(例如苯基瓊脂糖)上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出；及3)將得自HIC柱之洗提液裝載至羥基磷灰石柱(HA)(例如陶瓷羥基磷灰石第1型)上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出。
同樣地，某些實施例中，將HNS使用至少兩個柱式層析純化步驟進行純化。例如，某些實施例中，在將萃取自細胞培養基中之溶液形式之初始HNS過濾後，將此已過濾之HNS使用二柱法純化，其包含下列之純化步驟：1)將HNS裝載至疏水交互作用柱(HIC)(例如苯基瓊脂糖)上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出；及2)將得自HIC柱之洗提液裝載至羥基磷灰石柱(HA)(例如陶瓷羥基磷灰石第2型)上，將柱清洗，再將富集之HNS由柱中洗提出。
雖然每一個所述之柱式層析純化步驟之進行可以不顧及前面的柱式層析純化步驟，但應了解，每一個柱式層析純化步驟所含的個別構成要素欲以所述之順序來進行。例如，將初始HNS萃取物(或另為得自前一個進行之柱式層析純化步驟中之洗提液)裝載至柱上之步驟必需在清洗彼柱之前進行，而柱之清洗必需在將富集之HNS由彼柱中洗提之前進行。
根據本文所提供之進一步面向，純化之重組HNS組成物被述及可用於治療受溶小體酵素不足諸如第III A型黏多醣症所苦之病患。HNS當經由天然發生之第III A型黏多醣症小鼠模型之腦脊髓液投服時，已顯示具有活性。Hemsley et al.,Mol.Genet.Metab.90：313-328(2007)。HNS於第III A型黏多醣症牧羊犬(Huntaway dog)模型中之腦池內(intra-cisternal)遞送亦顯示具有醫療活性。Hemsley et al.,Mol.Genet.Metab.98(4)：383-92(2009)。
根據本文所提供之又另於一面向，HNS組成物被述及實質不含高pI之HNS。另於一面向中，揭露內容提供之HNS組成物為實質純HNS。某些實施例中，純化HNS製劑大於90%無污染物。較佳地，該材料大於80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、甚至大於99%無污染物。
根據本發明之另於一面向中，本文所提供之藥學組成物包含醫療有效量之藉本文所述方法製得之純化重組HNS，連同適當賦形劑。重組HNS藥學組成物特別適於供局部、經口或非經腸部(例如靜脈內、皮下、肌內或鞘內)投服予病患。
本發明之以上所討論及許多其他特徵及伴隨的優點將藉由參照下列之本發明實施方式且當與附加之實例共同採用時更加明瞭。本文所述之各種實施例為好評的(complimentary)且可與熟諳此藝者鑑於本文所含之教示以所了解之方式組合或一起使用。
本文所述之某些實施例提供製備純化的HNS(用於治療第III A型黏多醣症的溶小體酵素)之方法。本文所述之某些實施例提供以本文所揭露之純化HNS組成物治療病患(例如患有第III A型黏多醣症的病患)之方法。純化HNS的方法於技藝中已知。例如參見Hemsley et al.,Mol.Genet.Metab.90：313-328(2007)；U.S.Patent Application Pub.No.2009/0186011，每一者均藉引用方式併入本文。然而，先前公開之製備HNS的方法不可用於大量製造，不能輕易按比例增加及/或不能可再生地製得適於供人使用之純HNS。
根據本文所揭露之方法製造及純化HNS則可提供含有減量污染物之HNS。藉本文所述方法製得之HNS特別適用於作為醫療劑(例如供治療第III A型黏多醣症)。
乙醯肝素-N-硫酸酯酶為一種溶小體酵素，在其領域中亦名為N-磺基(sulpho)葡萄糖胺磺基水解酶；SGSH；EC 3.10.1.1；N-磺基(sulfo)葡萄糖胺磺基水解酶；2-去氧-D-葡萄糖苷-2-胺基磺酸鹽磺基水解酶(胺基磺酸鹽磺基水解酶)；肝素磺醯胺酶；磺基葡萄糖胺磺醯胺酶；磺醯胺酶(sulphamidase)；HNS、rhHNS、磺醯胺酶(sulfamidase)、rhNS、及rhSGSH。本文所用之術語“HNS”涵蓋此酵素，包括其功能片段及/或衍生物，及其任何醫藥上可接受之形式。乙醯肝素-N-硫酸酯酶與線上人 孟德爾遺傳資料庫(Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM))識別號OMIM 605270關連，輸入http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/605270可於線上公開得到。此線上輸入之所有內容，及其所連結之所有頁面均藉引用方式併入本文。
本文所用之“HNS組成物”意指含有各種純度狀態之HNS的任何組成物。
本文所用之術語“實質純”意指蛋白質或多肽實質不含其他物質達到實際及適於供其所欲用途之程度。尤其，蛋白質具充分純度且充分地不含其宿主細胞及病毒之其他生物學構份以便用於例如藥學製劑中。本文所用之“實質純HNS”為HNS製劑，其已經離析或合成且其大於約90%無污染物。較佳地，該材料大於80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、甚至大於99%無污染物。純度可藉技藝中已知之方法評估。
本文所用之術語“治療”意指逆轉或阻斷病患疾病之進展。
因為HNS為天然存在之酵素，故其通常藉由自適於製造該蛋白質之宿主細胞中之細胞培養上層液培養基中離析出而製得。某些實施例中，將宿主細胞經由基因工程以製得HNS。例如，負責細胞機器製造HNS的基因可置於微生物體諸如細菌或黴菌中。其他實施例中，負責細胞機器製造HNS的基因可置於哺乳動物細胞中。可予使用之哺乳動物細胞之非限制性實例包括BALB/c小鼠骨髓瘤細 胞系(NSO/1，ECACC No：85110503)；人視網膜母細胞(PER.C6，CruCell,Leiden,The Netherlands)；藉SV40轉殖之猴腎CV1細胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚胎腎細胞系(次選殖以供於懸浮液培養物中生長之293或293細胞，Graham et al.,J.Gen Virol.,36：59,1977)；人纖維肉瘤細胞系(HT1080)；倉鼠嬰腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞+/- DHFR(CHO,Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77：4216,1980)；小鼠史托利細胞(sertoli cell)(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23：243-251,1980)；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人子宮頸癌細胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；Buffalo大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.,383：44-68,1982)；MRC 5細胞；FS4細胞；及人肝癌細胞系(Hep G2)。
本文提供之某些方面，乃將供宿主細胞用之培養條件最理想化以產生高程度之HNS及最小程度之污染物。本文提供之另於一面向中，純化HNS之方法欲用於生物學材料上，特別是含有HNS及其他污染性蛋白質之粗製混合物上，稱之為起始材料樣品或基體材料(bulk material)。根據本文所提供之於一面向中，係說明純化HNS之方法，尤其由重組方法培養基之粗製製劑或基體材料中純化重組人HNS(rhHNS)之方法。藉此法所得之rhHNS具有高純度及高生物比活性(例如至少10單位/毫克，至少15單位/毫克，至少20單位/毫克，至少25單位/毫克，至少30單位/毫克，至少35單位/毫克，至少40單位/毫克，至少45單位/毫克，至少47單位/毫克，至少50單位/毫克，至少60單位/毫克，至少70單位/毫克，至少75單位/毫克，至少85單位/毫克，至少90單位/毫克，至少100單位/毫克，或更多之範圍內)，且實際上不含有培養基中存在之宿主細胞蛋白質且不含有重組方法中所用宿主細胞中所含的核酸或其他污染物。
一實施例中，HNS樣品最初係藉收集細胞培養上層液培養基而構成。粗製溶液預期可予過濾或濃縮，再接受一或多個層析步驟以移除由細胞培養物中衍生之污染物而得基體材料。如本文所述之純化方法可包括一或多個接續之層析步驟(例如至少一個，至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、或更多個層析步驟)以求達到期望純度之HNS。
某些實施例中，乃先將半純化之材料藉暴露至巰基-乙基-吡啶中而予捕集。一實施例中，該巰基-乙基-吡啶為連結至纖維素基質上之4-巰基-乙基-吡啶。
另一實施例中，乃在進一步純化之前，將該HNS材 料接受病毒去活化。病毒去活化可例如藉將1%吐溫80(Tween 80)及0.3%TnBP加至處理中之HNS樣品或培養基中，再保持於環境溫度下3-16小時而完成。此步驟可於純化反應流程之任何時點進行。此外，使用0.2微米濾器進行之HNS組成物之過濾可併入任何裝載步驟中。
又另一實施例中，所得之HNS材料可在柱式層析純化之前隨意地減量。其他實施例中，可在柱式層析步驟之後回收富集HNS洗提液之後減量。
某些實施例中，乃包括藉一系列層析步驟以純化HNS之方法。某些實施例中，每一個所揭露之柱式層析純化步驟不必一定要進行。同樣地，就已揭露之多重柱式層析步驟而言，此等步驟不必接續地進行或以所引述之順序進行。例如，某些實施例中，HNS係使用至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或更多個柱式層析純化步驟進行純化。同樣地，某些實施例中，一或多個所引述之柱式層析步驟可進行多次。一些實施例中，一或多個層析步驟包括層析介質或樹脂之裝載、均衡、清洗、及洗提。儘管前述關於每一個層析純化步驟之連續進行，但應了解每一個柱式層析純化步驟所包含之個別組份欲以所引述之順序進行。例如，如同熟諳此藝者所理解，每一個層析純化步驟中所包含之裝載、均衡、清洗、及洗提步驟欲以所述之順序進行。
例示之純化技術包括分批層析及柱式層析。一些實施例中，乃將HNS組成物於純化期間與一系列層析介質接 觸。某些實施例中，該層析介質或樹脂包括一或更多陰離子交換樹脂。另一實施例中，該層析介質或樹脂包括一或更多疏水交互作用樹脂。又另一實施例中，該層析介質或樹脂包括一或更多羥基磷灰石樹脂。其他實施例中，該層析介質或樹脂包括一或更多陽離子交換樹脂。
某些實施例中，該層析介質或樹脂包括陰離子交換樹脂、疏水交互作用樹脂、羥基磷灰石樹脂、及陽離子交換樹脂。某些實施例中，乃將已萃取之材料使用Q瓊脂糖(Q Sepharose)填充柱、其後苯基瓊脂糖(Phenyl Sepharose)填充柱、其後陶瓷羥基磷灰石第I型填充柱；且其後最後以SP瓊脂糖(SP Sepharose)填充柱純化。供純化萃取材料之預期步驟不必全部要進行。例如，某些實施例中，將已萃取的材料使用Q瓊脂糖(Q Sepharose)填充柱、其後苯基瓊脂糖(Phenyl Sepharose)填充柱、其後陶瓷羥基磷灰石第I型填充柱純化。同樣地，供純化萃取材料之預期步驟不必均要以任何特定順序進行。例如，某些實施例中，將已萃取的材料使用Q瓊脂糖(Q Sepharose)填充柱、其後苯基瓊脂糖(Phenyl Sepharose)填充柱、其後另一個SP瓊脂糖(SP Sepharose)填充柱；其後最後以陶瓷羥基磷灰石第I型填充柱純化。前面每一個實施例中，每一個柱均隨意地以緩衝或其他水性溶液清洗，其後使用水性溶液將HNS洗提出。某些實施例中，HNS組成物係於每一個步驟之間由層析介質中洗提出。在前進至下一個純化步驟之前，每一個 洗提步驟預期可重覆一或多次。某些實施例中，已萃取之材料乃藉過濾法進一步純化。又其他實施例中，乃在層析之前、之後或之期間令已萃取之材料接受病毒去活化。
一實施例中，層析介質或樹脂包含陰離子交換樹脂。某些實施例中，HNS組成物與陰離子交換層析樹脂之接觸為例如第一、第二、第三或第四個層析步驟。各種層析樹脂及介質可予使用，包括例如得自GE Healthcare、Tosoh Biosciences、Applied Biosystems、Bio-Rad、及Pall之樹脂。適當陰離子交換層析介質之實例為二乙胺基乙基(DEAE)、四級胺基乙基(QAE)或四級銨(Q)樹脂。某些實施例中，陰離子交換層析樹脂為Q瓊脂糖(Q Sepharose)快速流動樹脂。
另一實施例中，純化HNS之方法包含疏水交互作用層析(HIC)步驟。一些實施例中，HNS組成物與疏水交互作用層析樹脂接觸以作為純化方法之中間步驟。其他實施例中，HNS組成物與疏水交互作用層析樹脂之接觸為例如第一、第二、第三或第四個層析步驟。適當疏水交互作用層析介質之實例包括苯基、辛基、丁基、已基、丙基、PPG、或醚。某些實施例中，HNS萃取物之純化係使用苯基瓊脂糖6快速流動(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow)柱進行。某些實施例中，HNS組成物或與疏水交互作用層析樹脂接觸後所得之洗提液乃進一步與羥基磷灰石層析樹脂接觸。
又另一實施例中，層析介質或樹脂包含羥基磷灰石 (HA)樹脂。其他實施例中，HNS組成物與羥基磷灰石樹脂之接觸為例如第一、第二、第三或第四個層析步驟。一些實施例中，含HNS之萃取物係使用陶瓷羥基磷灰石第I型予以純化。一些實施例中，含HNS之萃取物係使用陶瓷羥基磷灰石第II型予以純化。又另一實施例中，HNS組成物或與羥基磷灰石層析樹脂交互作用後所收集之洗提液乃進一步與陽離子交換層析樹脂接觸。
某些實施例中，HNS組成物係進一步使用陽離子交換層析步驟予以純化。某些實施例中，使用陽離子交換層析步驟進行之純化為HNS純化中之中間步驟。其他實施例中，HNS組成物與陽離子交換層析樹脂之接觸為第一、第二、第三、第四、或最後一個層析步驟。一些實施例中，層析介質或樹脂包含陽離子交換樹脂。適當陽離子交換層析介質之實例包括層析介質諸如羧甲基(CM)、磺基丙基(SP)或磺酸甲酯(S)。一些實施例中，陽離子交換層析樹脂為SP瓊脂糖(SP sepharose)快速流動樹脂。
一實施例中，乃將陽離子交換步驟後所得之HNS進一步過濾。某些實施例中，HNS係藉例如濾洗或超濾法進一步過濾。
一步驟中，純化作用乃在當將含有粗製HNS之材料裝載至基質上且預均衡之時發生。然後將基質清洗以移除雜質。預期可改變孔徑及長度之柱之特性以能利用各種梯度洗提。如同熟諳此藝者所理解，清洗及洗提溶劑係由所用基質及HNS於此環境中之極性來決定。
得自陰離子交換層析樹脂中之基體HNS組成物中的HNS之萃取及/或純化可於調整pH值後最理想化。例如，pH值7.0已顯示可使萃取及純化最理想化。因此，某些實施例中，在將HNS與陰離子交換層析樹脂接觸之前，先將未純化之基體HNS組成物之pH調整至且為約pH 7.0。某些實施例中，將待裝載至陰離子交換柱上之材料調整至約50 mM至約100 mM乙酸鈉。一些實施例中，待裝載至陰離子交換樹脂上之含有HNS組成物之溶液具有約50至約100 mM乙酸鈉濃度。已經得知具約3-4mS/cm導電率之HNS組成物可加速使用陰離子交換層析樹脂來移除高pI NHS物種。因此，某些實施例中，在將HNS組成物與陰離子交換層析樹脂接觸之前，先調整HNS組成物之導電率以得約3至約4 mS/cm之導電率。另一實施例中，在將HNS組成物與陰離子交換層析樹脂接觸之前，先將導電率調整至約3.5mS/cm。某些實施例中，在裝載至陰離子交換柱上之前，先將HNS組成物予以病毒去活化。又另一實施例中，在裝載至陰離子交換柱上之前，先將HNS組成物使用0.2微米濾器過濾。
一實施例中，在將富集之HNS組成物由陰離子交換柱中洗提出之前，先將陰離子交換柱以約5倍柱量之含有於且為約pH7.0之約20 mM MES-Tris及約20 mM氯化鈉濃度之緩衝液清洗。某些實施例中，在與每一個層析樹脂接觸之間，有額外之洗提步驟。一實施例中，使用構成於且為約pH7.0之約20 mM MES-Tris及約180 mM氯化鈉 濃度之緩衝液將HNS由陰離子交換層析樹脂中洗提出。某些實施例中，富集HNS於流通及清洗中之回收百分比係藉由吸光度單位、酵素活性或ELISA測量。一實施例中，此步驟後之宿主細胞蛋白質清除率約為兩倍。另一實施例中，該方法移除約10至約25%之高pI NHS。又另一實施例中，移除高pI NHS將使溶解度之改善。
某些實施例中，在將HNS組成物與疏水***互作用柱接觸之前，先將疏水***互作用樹脂以包含於且為約pH 7.0及約90至約120mS/cm導電率之約20 mM MES-Tris及約1.1至1.5M氯化鈉濃度之緩衝液均衡。此濃度、pH及導電率可促進HNS結合至疏水***互作用柱上，因而使HNS組成物之純化最理想化。
某些實施例中，含有富集HNS之得自陰離子交換層析步驟的洗提液為供疏水***互作用步驟用之起始材料。一實施例中，在將HNS組成物與疏水***互作用柱接觸之前，先調整HNS組成物之氯化鈉濃度以達約1.1M至約1.5M氯化鈉之氯化鈉濃度。另一實施例中，在將HNS組成物與疏水***互作用柱接觸之前，先調整氯化鈉濃度至約1.2M。在與疏水***互作用柱接觸之前，先調整HNS組成物之pH至約7.0。一些實施例中，在將HNS組成物與疏水***互作用柱接觸之前，先將HNS組成物調整以得於25℃下約85至120mS/cm之導電率。一些實施例中，在將HNS組成物與疏水***互作用柱接觸之前，先將HNS組成物調整以得於25℃下約90至110mS/cm之導 電率。
某些實施例中，將吸附至疏水***換作用樹脂上之HNS組成物以4倍柱量之包含於且為約pH7.0之約20 mM MES-Tris(用以洗掉雜質)及約1.1M至約1.5M氯化鈉濃度之緩衝液清洗。在另一實施例中，氯化鈉的濃度為約1.2M。
一實施例中，將疏水***換作用柱以約4倍柱量之含有於且為約pH7.0之約20 mM MES-Tris及約180至220 mM氯化鈉之緩衝液洗提以將富集HNS組成物由疏水***換作用柱中洗提出。某些實施例中，有額外之洗提步驟。一實施例中，係使用構成且為約pH7.0及於25℃下約19至約23mS/cm範圍內之導電率之約20 mM MES-Tris及約200 mM氯化鈉之緩衝液將HNS由疏水***換作用層析樹脂中洗提出以使純化之HNS的回收最理想化。另一實施例中，pH範圍約6.9至7.1。某些實施例中，富集HNS於流通及清洗中之回收百分比係藉由吸光度單位、酵素活性或ELISA測量。一實施例中，此步驟後之宿主細胞蛋白質清除率約為35至45倍。
某些實施例中，得自疏水***互作用柱之富集HNS的混合洗提液可用作為供羥基磷灰石柱純化用之起始材料。一些實施例中，將由疏水***互作用柱洗提後所得之含有HNS組成物的溶液調整至約2 mM至約4 mM之磷酸一鈉(NaPO4)濃度以使純化作用最理想化。某些實施例中，將磷酸一鈉濃度調整至約2mM及且為約pH 7.0+0.1。一實施例中，均衡緩衝液含有於且為約pH7.0之約20 mM MES-Tris及約200 mM氯化鈉。某些實施例中，將均衡緩衝液之pH調整至約7.0至約7.2。又另一實施例中，在裝載至陰離子交換柱上之前，先使用0.2微米濾器將NHS組成物過濾。另一實施例中，均衡緩衝液含有於且為約pH7.0之約2 mM磷酸一鈉、約20 mM MES-Tris及約200 mM氯化鈉。
一實施例中，在將富集HNS組成物由羥基磷灰石柱中洗提出之前，先將羥基磷灰石柱以4倍柱量之含有於pH約7.0至約7.2之約2 mM至約4 mM磷酸一鈉、約20 mM MES-Tris及約200 mM氯化鈉之緩衝液清洗。另一實施例中，清洗緩衝液含有於pH約7.0之約2 mM磷酸一鈉、約20 mM MES-Tris及約200 mM氯化鈉。
一些實施例中，與羥基磷灰石接觸之HNS係以含有於pH約7.4至約7.6約25 mM磷酸一鈉之溶液洗提。另一實施例中，將裝載至羥基磷灰石柱上之HNS以含有於pH約7.0至約7.6約20 mM磷酸一鈉至約30 mM磷酸一鈉之洗提液洗提。一實施例中，洗提緩衝液含有於pH約7.5+0.1約20 mM磷酸一鈉、約25 mM MES-Tris。某些實施例中，洗提步驟可重覆至少一次。某些實施例中，富集HNS於流通及清洗中之回收百分比係藉由吸光度單位、酵素活性或ELISA測量。
某些實施例中，得自羥基磷灰石柱之富集HNS的混合洗提液可用作為供陽離子交換柱純化用之起始材料。又 另一實施例中，在裝載至陽離子交換柱上之前，先將起始材料中之HNS組成物調整以得約3至約4 mS/cm之導電率以使HNS結合至陽離子樹脂上之作用最理想化。一些實施例中，將導電率調整至約3mS/cm且該溶液包含於且為約pH5.0之約20 mM乙酸鈉以使HNS結合至陽離子柱上之作用最理想化。又另一實施例中，裝載至陽離子交換樹脂上之HNS組成物的導電率為約4mS/cm且該溶液含有且為約pH5.0之約40 mM乙酸鈉以使HNS結合至陽離子柱上之作用最理想化。另一實施例中，裝載至陽離子交換樹脂上之HNS組成物的導電率為約3.5mS/cm+0.5且pH為約5.0。另一實施例中，在裝載至陽離子交換柱上之前，先使用0.2微米濾器將HNS組成物過濾。
一實施例中，均衡緩衝液含有約50 mM乙酸鈉、約20至約40 mM氯化鈉、且為約pH5.0。某些實施例中，將均衡緩衝液之pH調整至約4.9至約5.1。另一實施例中，均衡緩衝液含有約50 mM乙酸鈉、約20 mM氯化鈉、且為約pH5.0、及約5至約7 mS/cm範圍內之導電率。
一實施例中，在將富集HNS組成物由陽離子交換柱中洗提出之前，先將陽離子交換柱以4倍柱量之含有於pH約5.0至約7.2約50 mM乙酸鈉、約20 mM至40 mM氯化鈉之緩衝液清洗。另一實施例中，清洗緩衝液含有約50 mM乙酸鈉、約20 mM氯化鈉、且為約pH5.0、及約5至約7 mS/cm範圍內之導電率。
一些實施例中，HNS由陽離子交換樹脂中之洗提係以包含於pH約4.9至約5.1之約50 mM乙酸鈉及約90 mM至100 mM氯化鈉之洗提液進行。某些實施例中，HNS由陽離子交換樹脂中之洗提係以包含於pH約5.0+0.1之約50 mM乙酸鈉及約90 mM氯化鈉之洗提液進行。某些實施例中，洗提液具大約12至約14 mS/cm範圍內之導電率。某些實施例中，洗提步驟可重覆至少一次。某些實施例中，富集HNS於流通及清洗中之回收百分比係藉由吸光度單位、酵素活性或ELISA測量。
本文所述之另一實施例為純化之HNS，其已藉上述方法離析出大於約90%無污染物之純度。較佳地，該材料大於80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、甚至大於99%無污染物。純度可藉技藝中已知之任何適當方法評估。
本文所述之產物及方法可有用於治療及/或預防，病患的任何疾病/病況是以糖胺聚糖在疾病之發展及/或進展中佔有重要角色。某些實施例可尤其用於治療及/或預防其中HNS無功能或不存在之病患的任何疾病或病況。疾病之治療亦包括對疾病或疾病症狀之期望的改善。
本文所揭露之組成物可單獨使用或與其他供治療病患黏多醣症或其後遺症之醫療劑組合使用。這些其他醫療劑可在投服本組成物之前投服，或者彼等可在投服本組成物之同時或之後投服。病患可例如為任何人或非人之脊椎動物，例如狗、貓、馬、母牛、豬。
一實施例中，供純化HNS組成物用之配方緩衝液可為磷酸鹽緩衝液，諸如5 mM磷酸鈉、145 mM氯化鈉、pH 7.0。其他適當緩衝液為熟諳此藝者已知。
某些實施例中，最終HNS濃度為高於每升5克、高於每升10克、高於每升15克、高於每升20克。
本文所述之純化HNS組成物可局部(包括經眼部及至黏膜包括***部及直腸遞送)、肺部(例如藉由粉末或氣溶膠之吸入或吹入，包括藉由噴霧器；氣管內、鼻內)、經口或非經腸部投服。某些實施例中，以非經腸部投服較佳且包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、肌內、顱內、脊髓內或室(腦或心)內投服。
本文所述之實施例將藉由下列之實例進一步闡述，其不應解釋成對本發明之限制。除非有相反的明確表示，否則本文專利說明書及申請專利範圍中所用之冠詞應理解是包括複數的指示對象。除非有相反的明確表示，否則如果有一個、大於一個、或所有群組成員存在於、用於、或另關於既定產物或方法中，則所包括之介於一或多個群組成員間之“或”的申請專利範圍或說明乃視為明確。本發明包括其中群組中之確切一個群組成員存在於、用於、或另關於既定產物或方法中的實施例。本發明亦包括其中大於一個、或整個群組成員存在於、用於、或另關於既定產物或方法中的實施例。此外，應該理解的是，除非另有指定或者除非熟諳此藝者明顯已知將產生矛盾或不一致，否則本發明涵蓋所有變異、組合、及排列，其中係將來自一或多 個所列申請專利範圍中之一或多個限制、元素、條款、說明術語等置於附屬於相同基本申請專利範圍之另一個申請專利範圍中(或，當有關時，任何其他申請專利範圍)。當元素以列表呈現時(例如於馬庫西(Markush)群組或類似格式中)，應該理解的是元素之每一個亞群組亦被揭露，且任何元素可由群組中移除。應了解，通常，當本發明、或本發明方面，被指稱包含特定元素、特徵等時，則本發明之某些實施例或本發明之方面係由或基本上由此元素、特徵等所組成。為求簡化之目的，彼些實施例並未每一例均特別地明確闡述。亦應了解，不管是否有具體之排除被陳述於專利說明書中，本發明之任何實施例或方面可明確地不包括申請專利範圍。本申請案中所引述之所有參考資料的所有內容(包括文獻參考資料、公告專利及公開專利申請案及網站)均明確藉引用方式併入本文。
範例 實例I 人HNS之純化
本發明研究的目的係欲得到大量重組人HNS(具有增加之溶解度)。令經安定轉染之HT1080細胞於生物反應器培養條件下生長，再將活性HNS酵素由細胞培養基中純化。所用之液相層析儀器為得自GE Healthcare之AKTA Explorer層析系統((Piscataway,NJ)，型號：18-1403-00)及得自Thermo Scientific之Genesys 6 UV- Vis光譜儀((Waltham,MA)，Catalog #335908000，Serial 2M6F078007)。下列層析樹脂予以使用：得自GE Healthcare之Q瓊脂糖快速流動柱(Q Sepharose Fast Flow)((Piscataway,NJ)，catalog #17-0510-04)；得自GE Healthcare之苯基瓊脂糖6快速流動柱(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow)((Piscataway,NJ)，catalog #17-0973-04)；得自GE Healthcare之SP瓊脂糖快速流動柱(SP Sepharose Fast Flow)((Piscataway,NJ)，catalog #17-0729-04)；及得自Bio-Rad之陶瓷羥基磷灰石第I型(Ceramic Hydroxyapaptite，Type I，80微米粒徑)((Herculus,CA)，catalog #157-0085)。
此實例中所用之層析柱包括得自Kontes Glas之Kontes 30×1.0公分柱((Vineland,NJ)，Catalog #420830-3000)；得自GE Healthcare之XK 16/40柱((Piscataway,NJ)，catalog #18-8774-01)；得自GE Healthcare之XK5/30柱((Piscataway,NJ)，catalog #18-8751-01)；及得自Bio-Chem Valve之Omnifit 10×25毫米柱((Boonton,NJ)，Catalog #006CC-10-02-AF)。
使用對抗HT1080宿主細胞溶解物之由Cygnus Technologies所客製之山羊抗體的三明治基底ELISA分析法係用以測定宿主細胞蛋白質濃度。將已於樣品稀釋劑(20 mM磷酸鈉、0.1% ProClin 300，pH 6.0)中稀釋之五十微升樣品、分析對照組(75奈克/毫升)及標準劑同時與100微升HRP-共軛抗體(1：95稀釋於共軛體稀釋劑 中：含3毫克/毫升正常山羊IgG之Cygnus Technologies HRP共軛體稀釋劑)於預塗附之微-ELISA盤上、於環境溫度下、於滴定盤振盪器(Titer Plate Shaker)上培育2小時。
將孔之內容物於培育終了之時移除，再將盤以ELISA清洗緩衝液(25 mM Tris-HCl加上0.425%氯化鈉(w/v)，0.025% ProClin 300，pH 7.2)清洗4次。然後將一百微升TMB基質溶液(四甲基聯苯胺；BioFx TMBW1000-01)加至每一孔中，再將盤培育另30分鐘。藉加入100微升停止溶液(0.5N硫酸)令比色反應終止，再使用SPECTRAmax PLUS 384微量盤光譜儀於450 nm下測量吸光度，且設定於650 nm下進行背景扣除。使用SoftMax 4.8軟體及內插樣品之HCP濃度建構出標準曲線。使用此分析法，則可定量出HNS樣品中源自於HT1080細胞系之HCP量。
將對純化HNS自製IgG具專一性的TK1315兔多株抗體於37℃下以5.0微克/毫升之量塗附於MaxiSorp Nunc Immuno盤上一小時。將盤以含0.05%吐溫20(PBST)之磷酸鹽緩衝鹽水清洗三次，以2%牛血清白蛋白質(BSA)之PBST液將孔阻斷。將適度稀釋之樣品及參考標準劑於37℃下培育1小時。將盤以PBST清洗四次後，將第二種抗體，對純化HNS自製IgG具專一性的TK1315兔多株抗體-HRP共軛體(1：3000)施入。於37℃下培育30分鐘後，將盤以PBST清洗三次。將TMB基質(Bio-Rad， Hercules，CA)施入，再將盤於37℃下培育15分鐘，其後以2M硫酸停止反應。將盤於450nm下判讀，再使用二次曲線擬合法以產生標準曲線。此分析法係用以定量樣品中之HNS量。純化HNS蛋白質之濃度係藉使用Genesys 6 UV-Vis光譜儀測量A280吸光度得知。
使用4-甲基繖型基2-磺胺基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷作為基質進行之二步驟HNS活性分析法乃用以測定HNS活性。將已於基質/反應緩衝液中稀釋之十微升樣品加至分析盤(Costar 96孔盤，Corning #3912)中，其後將20微升基質溶液(20 mM 4-甲基繖型基2-磺胺基-2-去氧-α-D-吡喃葡萄糖苷之基質/反應緩衝液)加入。將盤於37℃下於Jitterbug(Boekel Scientific)中培育一小時，且在最初3分鐘伴隨著以設定為1之混合器混合。培育終了之時，將6微升Pi/Ci停止緩衝液加入，再將盤於Jitterbug中以設定於1之混合器混合3分鐘以令反應之第一步驟停止。然後將四十六微升之標準劑(0-50 uM 4-甲基繖型酮之基質/反應緩衝液；0-2300微微莫耳)加至盤之前兩排白空白列中，其後將十微升a-葡萄糖苷酶(每毫升250U，於0.2%去活化之BSA中)加至含有樣品及基質/反應緩衝液空白組(非標準組)之孔中。將盤於37℃下於Jitterbug中培育另一小時，且在最初3分鐘伴隨著以設定為1之混合器混合。培育終了之時，將200微升碳酸鹽停止緩衝液(0.5M碳酸鈉，pH 10.7，0.025%Triton-100)加至含有標準劑、樣品及空白組之孔中以令反應終 止。
將每一孔之內容物使用具有“震盪盤”功能之SpectraMax M2多種檢測型微量盤判讀儀混合三次並於460 nm下測量螢光。使用微軟Excel及內插樣品之HNS活性建構出標準曲線(0-2300微微莫耳)。一個活性單位定義為於37℃下於一小時內製造1微微莫耳4-甲基繖型酮。將HNS活性計算出，並以U/ml表示(或者如果蛋白質濃度已知，則為U/mg)。使用此分析法，可定量HNS樣品之活性值。
純化方法係由使用BioSepraTM MEP HyperCel吸收劑(Pall Life Sciences,P/N #12035-036)捕集以得未純化之基體材料所組成。
在進行Q柱步驟之前，先藉加入1%吐溫80(Tween 80)及0.3%TnBP至該未純化基體中，再保持混合物於環境下3至16小時以進行病毒去活化。病毒去活化後，以0.2微米濾器將混合物過濾。對於3.0、3.5及4.0 ms/cm導電率下之Q裝載進行研究。三種運行之操作條件乃概述於表1中。將供Q運行用之基體裝載材料調整至100 mM乙酸鈉。Q運行之流速為150公分/小時。
Q運行之結果乃概述於表2中。
Q法乃設計以移除10-25%高pI HNS而改善HNS藥物物質之溶解度。以Q評估運行之結果為基準(表2)，於3.0、3.5、及4.0 mS/cm下裝載Q柱將導致於Q FT/清洗中相似之HNS喪失及洗提液相似之HCP清除率。以活性及ELISA所測得之洗提液回收率有一些變異，其可能是因分析法之改變所致。既然於FT/清洗中有相似之HNS喪失，故預期所有之三種運行的回收率將會相似。以AU、活性、及ELISA測得之所有回收率均視為可接受的。以這些結果為基準，裝載材料之導電率設定為3.5±0.5 mS/cm。
實例2 苯基瓊脂糖(Phenyl Sepharose)柱
研究於1.1M、1.2M、1.3M、及1.5M氯化鈉下之苯基裝載。亦研究於180 mM、200 mM、及220 mM氯化鈉下之苯基洗提。苯基裝載之pH並未測試，因為HIC柱不預期會對裝載法中的pH變化敏感(pH 7.0±0.1)。供苯基運行之操作條件乃概述於表3及4中。供苯基運行之流速為150公分/小時。
供苯基運行之流速為150公分/小時。
供苯基運行之流速為150公分/小時。
苯基運行之結果乃概述於表5及6中。
LOQ相當於<150 U/毫升
於1.1M、1.2M、1.3M、及1.5M氯化鈉、pH 7.0下之裝載(於25℃下之導電率範圍為90至117 mS/cm)將導致FT/清洗中相似之HNS喪失，及苯基洗提液中相似之洗提量、回收率及HCP清除率(表5)。苯基柱於180 mM、200 mM、及220 mM氯化鈉、pH 7.0下之洗提(於25℃下之導電率範圍為20至23 mS/cm)將導致苯基洗提液相似之洗提量、回收率及HCP清除率(表6)。
以這些結果為基準，以調整苯基裝載至1.2 M氯化鈉、pH 7.0±1.0且導電率範圍於25℃下90至110 mS/cm較佳。推薦之苯基均衡及清洗緩衝液為20 mM MES-Tris，1.2M氯化鈉，pH 7.0±1.0且導電率範圍於25℃下100至120 mS/cm。推薦之苯基洗提緩衝液為20 mM MES-Tris，200 mM氯化鈉，pH 7.0±1.0且導電率範圍於25℃下19至23 mS/cm。
實例3 陶瓷羥基磷灰石(HA)柱
研究不同磷酸鈉濃度及不同pH值之HA裝載及洗提。供實驗運行之操作條件乃概述於表7及8中。HA運行之流速為150公分/小時。
供HA運行之流速為150公分/小時。
結果
HA運行之結果乃概述於表9及10中。定量極限濃度(LOC)相當於<150 U/毫升。
於4 mM磷酸一鈉下裝載HA柱將造成FT/清洗中吸光度單位之較高百分比喪失及洗提液中吸光度之較低百分比回收(表9)。於HA狀態下，HA洗提液之純度超過95%且吸光度單位測得之回收比以活性或ELISA結果為基底之回收更可信賴，此係由於這些分析法中有相對較大的改變所致。於2 mM磷酸一鈉、pH 7.2下裝載HA柱將導致洗提液中較低之HCP清除率。以這些結果為基準，HA法似乎對磷酸鹽濃度及pH敏感。將HA裝載調整至2 mM磷酸一鈉、pH 7.0±0.1可較佳。2 mM磷酸一鈉，20 mM MES-Tris，200 mM氯化鈉，pH 7.0±0.1之HA均衡及清洗 緩衝液亦較佳。
將HA柱以20 mM磷酸一鈉、pH 7.5緩衝液洗提將導致以吸光度單位測得之回收百分比較低(表10)。增加磷酸鹽濃度至30 mM可增加回收百分比，但低了洗提液中之HCP清除率。亦要注意的是，改變洗提緩衝液之pH亦將降低洗提液中之HCP清除率。所推薦之HA洗提緩衝液為20 mM磷酸一鈉、pH 7.5±0.1。
實例4 SP瓊脂糖(SP Sepharose)柱
研究於3.0及4.0 mS/cm下之SP裝載及於20 mM氯化鈉及40 mM氯化鈉下之SP EQ/清洗。亦研究於不同鹽濃度(80 mM氯化鈉、90 mM氯化鈉、100 mM氯化鈉)及不同pH值(pH 4.9、pH 5.0、及pH 5.1)下之SP洗提。實驗運行之操作條作乃概述於表11及12中。供SP運行之流速為150公分/小時。
供SP運行之流速為150公分/小時。
供SP運行之流速為150公分/小時。
SP運行之結果乃概述於表13及14中。
於稀釋或未稀釋條件下(導電率範圍為3.0至4.0 mS/cm)裝載SP柱可造成SP洗提液相似之回收率及HCP清除率(表13)。將SP柱於20 mM或40 mM氯化鈉、pH 5.0下(於25℃下導電率範圍為5.0至7.2 mS/cm)清洗可導致SP洗提液相似之回收率及HCP清除率(表13)。以這些結果為基準，將SP裝載條件調整至pH 5.0±0.1及導電率範圍3.5±0.5 mS/cm較佳。所推薦之SP均衡及清洗緩衝液為50 mM乙酸鈉、20 mM氯化鈉、pH 5.0±0.1且導電率範圍5至7 mS/cm。
於80 mM、90 mM、及100 mM氯化鈉，pH 5.0(於25℃下導電率範圍為11.5至13.7mS/cm)下洗提SP柱可導致相似之回收率及HCP清除率(表14)。然而，於80 mM氯化鈉下洗提液之柱量為47倍柱量，相比於90 mM 氯化鈉下為2.3倍柱量。再者，於90 mM氯化鈉，pH 4.9、pH 5.0、及pH 5.1下洗提SP柱將導致相似之回收率及HCP清除率。然而，pH 4.9洗提之洗提液量為4.4倍柱量，相比於pH 5.0時之洗提液為2.3倍柱量。這兩種情況下，洗提液量之增加均由於洗提廓線產生拖尾之故。欲避免收集過量之峰尾，故推薦收集由50 mAU至50 mAU之洗提液或至3倍柱量之最大量，取其先達到者。所推薦之SP洗提緩衝液為50 mM乙酸鈉、90 mM氯化鈉、pH 5.0+0.1且導電率範圍12至14 mS/cm，且洗提液之峰收集由50 mAU至50 mAU或至3倍柱量之最大量，取其先達到者。
這些分析法顯示上述供製備重組溶酶體硫酸酯酶之實驗規程可提供有效之製造大量高度純化酵素，人乙醯肝素-N-硫酸酯酶(HNS)之方法。
圖1說明本文所提供實施例之純化法流程圖。

Claims (27)

  1. 一種純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶之方法，其包含下列之步驟：a)於乙醯肝素-N-硫酸酯酶被吸附之條件下，令乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物與陰離子交換層析樹脂接觸；b)將吸附之乙醯肝素-N-硫酸酯酶由陰離子交換層析樹脂中洗提出；c)將得自步驟b)之乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物與疏水交互作用層析樹脂接觸；d)將吸附之乙醯肝素-N-硫酸酯酶由疏水交互作用層析樹脂中洗提出；e)將得自步驟d)之乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物與羥基磷灰石層析樹脂接觸；f)將吸附之乙醯肝素-N-硫酸酯酶由羥基磷灰石層析樹脂中洗提出；g)將得自步驟f)之乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物與陽離子交換層析樹脂接觸；及h)將吸附之乙醯肝素-N-硫酸酯酶由陽離子交換層析樹脂中洗提出。
  2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含下列之步驟：將乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物與連結至4-巰基-乙基-吡啶之纖維素基質接觸。
  3. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含下 列之步驟：將該乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物中之病毒去活化。
  4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟a)之陰離子交換層析樹脂為Q瓊脂糖(sepharose)快速流動樹脂。
  5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟c)之疏水交互作用層析樹脂為苯基瓊脂糖6快速流動樹脂。
  6. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟e)之羥基磷灰石層析樹脂為陶瓷羥基磷灰石第I型樹脂。
  7. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟g)之陽離子交換層析樹脂為SP瓊脂糖快速流動樹脂。
  8. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含過濾該乙醯肝素-N-硫酸酯酶之步驟。
  9. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中過濾步驟係藉濾洗或超濾法進行。
  10. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含在進行步驟a)之前將該乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物之pH調整至約7.0之步驟。
  11. 根據申請專利範圍第10項之方法，其中該溶液具有約50至約100 mM之乙酸鈉濃度。
  12. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含下列之步驟：在進行步驟a)之前，調整該乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物以得約3至約4 mS/cm之導電率。
  13. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟b)之洗提液包含於且為約pH 7.0之約20 mM MES-Tris及約180 mM氯化鈉。
  14. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含下列之步驟：在進行步驟c)之前，調整該乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物以達到約1.1M至約1.5M之氯化鈉濃度。
  15. 根據申請專利範圍第14項之方法，其中該氯化鈉濃度約1.2M。
  16. 根據申請專利範圍第14項之方法，其進一步包含下列之步驟：調整該組成物以得到於25℃約90至約110 mS/cm之導電率。
  17. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含下列之步驟：在進行步驟c)之前，將該樹脂以包含於且為約pH 7.0及約100至約120 mS/cm之導電率下之約20 mM MES-Tris及約1.2M氯化鈉濃度之緩衝液均衡(equilibrating)。
  18. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含下列之步驟：將步驟c)之該吸附之乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物以包含於且為約pH7.0之約20 mM MES-Tris及約180 mM至約220 mM氯化鈉濃度之洗提液均衡。
  19. 根據申請專利範圍第18項之方法，其中該氯化鈉 濃度約200 mM。
  20. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含下列之步驟：在進行步驟e)之前，調整含有步驟d)所得乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物之溶液至約2 mM至約4 mM之磷酸一鈉(NaPO4)濃度。
  21. 根據申請專利範圍第20項之方法，其中將磷酸一鈉之濃度調整至約2 mM。
  22. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含下列之步驟：將得自步驟e)樹脂中之乙醯肝素-N-硫酸酯酶以包含於且為約pH7.5之約25 mM磷酸一鈉(NaPO4)之洗提液洗提。
  23. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含下列之步驟：在進行步驟g)之前，調整步驟f)所得之乙醯肝素-N-硫酸酯酶組成物以得到約3至約4 mS/cm之導電率。
  24. 根據申請專利範圍第23項之方法，其中該導電率約3mS/cm且該溶液包含於且為約pH 5.0之約20 mM乙酸鈉。
  25. 根據申請專利範圍第24項之方法，其中該導電率約4mS/cm且該溶液含有於且為約pH 5.0之約40 mM乙酸鈉。
  26. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟h)係 以包含於且為約pH 5之約50 mM乙酸鈉及約90 mM氯化鈉之洗提液進行。
  27. 根據申請專利範圍第26項之方法，其中該洗提液具有約12至約14mS/cm之導電率。
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