BRPI0807710B1

BRPI0807710B1 - Anticorpos que se ligam a il-23p19 e il-23 humana, anticorpo, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, célula hospedeira microbiana, método de produção de um polipeptídeo e composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0807710B1
Application number: BRPI0807710-0A
Authority: BR
Inventors: Leonard G. Presta; Bryan M. Beyer; Richard N. Ingram; Peter Orth; Yan-Hui Liu
Original assignee: Merck Sharp & Dohme Corp
Priority date: 2007-02-23
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2021-12-14
Also published as: CN101687925A; NO2018040I1; HK1127864A1; LUC00092I2; EP2059534A1; CY2019004I1; TR201821029T4; US20100272731A1; JP2010518856A; US8293883B2; EP2426144B1; RS52345B; LTPA2018015I1; SI2059534T1; PT2059534E; JP2012228259A; JP2017060482A; RS58098B1; IL200560A; HUS1800045I1

Abstract

anticorpos manipulados anti-il-23p19. a presente invenção refere-se a anticorpos manipulados para il23p19 humana, assim como seus usos, por exemplo, no tratamento de distúrbios inflamatórios, autoimunes e proliferativos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se geralmente a anticorpos específicos para interleucina 23 p19 (IL-23p19) e seus usos. Mais especificamente, a invenção refere-se a anticorpos humanizados que reconhecem a IL-23p19 humana e modulam sua atividade, particularmente em distúrbios inflamatórios, autoimunes e proliferativos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O sistema imune funciona para proteger indivíduos de agentes infecciosos, por exemplo, bactérias, organismos multicelulares e vírus, assim como de cânceres. Esse sistema inclui vários tipos de células linfóides e mielóides tais como monócitos, macrófagos, células dendríticas (DCs), eosinófilos, células T, células B e neutrófilos. Essas células linfóides e mielóides geralmente produzem proteínas sinalizadoras conhecidas como citocinas. A resposta imune inclui a inflamação, isto é, o acúmulo de células imunes sistemicamente ou em uma localização particular do corpo. Em resposta a um agente infeccioso ou substância estranha, as células imunes secretam as citocinas que, por sua vez, modulam a proliferação, o desenvolvimento, a diferenciação e a migração de células imunes. A resposta imune pode produzir consequências patológicas, por exemplo, quando ela envolve inflamação excessiva, como nos distúrbios autoimunes (veja, por exemplo, Abbas et al. (eds.) (2000) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA; Oppenheim and Feldmann (eds.) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian and Mackay (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034; Davidson and Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350).

[003] A interleucina-12 (IL-12) é uma molécula heterodimérica composta pelas subunidades p35 e p40. Estudos indicaram que IL-12 desempenha um papel crítico na diferenciação de células T naives em linfócitos CD4+ tipo T auxiliar que secretam IFNy. Também foi mostrado que IL-12 é essencial para as respostas imune dependente de célula T e inflamatória in vivo. Veja, por exemplo, Cua et al. Nature 421:744-748. O receptor de IL-12 é composto pelas subunidades IL-12β1 e IL-12β2.

[004] A interleucina-23 (IL-23) é uma citocina heterodimérica compreendida por duas subunidades, p19 que é única para IL-23 e p40 que é partilhada com IL-12. A subunidade p19 é estruturalmente relacionada com IL-6, fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) e com a subunidade p35 de IL-12. IL-23 media a sinalização pela ligação a um receptor heterodimérico, compreendido por IL-23R e IL-12β1, que é compartilhada pelo receptor de IL-12. Vários estudos recentes demonstraram que as consequências de uma deficiência genética em p40 (camundongo "nocauteado" para p40; camundongo p40KO) eram mais severas do que aquelas encontradas em um camundongo p35KO. Alguns do mesmos resultados foram explicados eventualmente pela descoberta de IL-23 e pelo achado de que p40KO previne a expressão não apenas de IL-12, mas também de IL-23 (veja, por exemplo, Oppmann et al. (2000) Immunity 13:715-725; Wiekowski et al. (2001) J. Immunol. 166:7563-7570; Parham et al. (2002) J. Immunol. 168:5699-708; Frucht (2002) Sci STKE 2002, E1-E3; Elkins et al. (2002) Infection Immunity 70:1936-1948).

[005] Estudos recentes, através do uso de camundongos p40 KO, mostraram que o bloqueio de ambas, IL-23 e IL-12, é um tratamento efetivo para vários distúrbios inflamatórios e autoimunes. Entretanto, o bloqueio de IL-12 através de p40 parece ter várias consequências sistêmicas tais como suscetibilidade aumentada a infecções microbianas oportunistas. Bowman et al. (2006) Curr. Opin. Infect. Dis. 19:245.

[006] Anticorpos terapêuticos podem ser usados para bloquear a atividade de citocina. A limitação mais significativa ao uso de anticorpos como agente terapêutico in vivo é a imunogenicidade dos anticorpos. Como a maioria dos anticorpos é derivada de roedores, o uso repetido em humanos resulta na geração de uma resposta imune contra o anticorpo terapêutico. Tal resposta imune resulta na perda da eficácia terapêutica no mínimo e em uma resposta anafilática potencial fatal no máximo. Os esforços iniciais para reduzir a imunogenicidade dos anticorpos de roedores envolveram a produção de anticorpos quiméricos, nos quais as regiões variáveis de camundongo eram fundidas com regiões constantes humanas. Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-43. Entretanto, camundongos inoculados com híbridos de regiões variáveis humanas e regiões constantes de camundongo desenvolveram uma acentuada resposta anti-anticorpo dirigida contra a região variável humana, sugerindo que a retenção da região Fv completa do roedor em tais anticorpos quiméricos poderia ainda resultar em imunogenicidade indesejada nos pacientes.

[007] Acredita-se que, geralmente, as alças de regiões determinantes de complementaridade (CDR) de domínios variáveis compreendam o sítio de ligação de moléculas de anticorpo. Portanto, o enxerto de alças de CDR de roedor em regiões estruturais humanas (isto é, humanização) foi tentada para minimizar adicionalmente as sequências de roedores. Jones et al. (1986) Nature 321:522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534. Entretanto, alterações na alça de CDR ainda não resultam, uniformemente, em um anticorpo com as mesmas propriedades de ligação como o anticorpo de origem. Alterações em resíduos estruturais (FR), resíduos envolvidos no suporte da alça de CDR, em anticorpos humanizados também são necessários para preservar a afinidade de ligação com o antígeno. Kabat et al. (1991) J. Immunol. 147:1709. Embora o uso de enxerto de CDR e preservação de resíduo estrutural tenha sido descrito em vários construtos de anticorpo humanizado, é difícil predizer se uma sequência em particular resultará no anticorpo com a ligação e, as vezes, com as propriedades biológicas desejadas. Veja, por exemplo, Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029, Gorman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181, e Hodgson (1991) Biotechnology (NY) 9:421-5. Além disso, a maioria dos estudos anteriores usou sequencias humanas diferentes para sequencias variáveis leve de pesada de animal, tornando questionável a natureza preditiva de tais estudos. Sequências de anticorpos conhecidos ou, mais tipicamente, aquelas de anticorpos que têm estruturas conhecidas por raio X tem sido usadas, anticorpos NEW e KOL. Veja, por exemplo, Jones et al., supra; Verhoeyen et al., supra; e Gorman et al., supra. A informação exata da sequência foi descrita para alguns construtos humanizados. Anticorpos exemplares manipulados para IL-23p19 estão descritos nos Pedidos de Patente Provisória U.S. N° 60/891.409 e 60/891.413, comumente designados (ambos depositados em 23 de Fevereiro de 2007), nos Pedidos de Patente Provisória U.S. N° 2007/0009526 e 2007/0048315 e nos Pedidos de Patente Provisória U.S. N° WO 2007/076524, WO 2007/024846 e WO 2007/147019.

[008] Existe a necessidade por anticorpos anti-huIL-23p19 para uso, por exemplo, no tratamento de distúrbios inflamatórios, autoimunes e proliferativos. Preferivelmente, tais anticorpos são manipulados para introduzir as sequências da linhagem germinativa, para reduzir a imunogenicidade em indivíduos humanos, por exemplo, nas regiões estruturais. Preferivelmente, tais anticorpos terão alta afinidade por huIL-23p19 e se ligarão com alta especificidade a huIL-23p19.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção fornece compostos ligantes, tais como anticorpos ou seus fragmentos, incluindo anticorpos quiméricos ou recombinantes, que se ligam a IL-23p19 humana, compreendendo um domínio variável de cadeia leve ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que tem pelo menos uma, duas ou três CDRs selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID N° 32-46. Em uma modalidade, o composto de ligação da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende pelo menos uma CDRL1 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 32 a 36; pelo menos uma CDRL2 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 37 a 41 ; e pelo menos uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 42 a 46.

[010] Em uma modalidade, o composto de ligação compreende um domínio variável de cadeia pesada ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que tem pelo menos uma, duas ou três CDRs selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID N° 15-31. Em uma modalidade, o composto de ligação da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende pelo menos uma CDRH1 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 15 a 19; pelo menos uma CDRH2 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 20 a 26 ; e pelo menos uma CDRH3 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 27 a 31.

[011] Em outras modalidades, o composto de ligação da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, descritos nos dois parágrafos precedentes.

[012] Em algumas modalidades, o composto de ligação compreende uma região estrutural, em que a sequência de aminoácidos da região estrutural é toda ou substancialmente toda a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana.

[013] Em algumas modalidades, os domínios variáveis de cadeia leve e/ou cadeia pesada compreendem uma variante de uma ou mais das CDRs. Em várias modalidades, o domínio variante compreende até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de aminoácidos conservativamente modificados em relação à sequência das respectivas SEQ ID N°. Substituições conservativas de aminoácidos são fornecidas na Tabela 1.

[014] Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia leve compreende os resíduos 1 a 108 de SEQ ID N° 14 ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste dos resíduos 1 a 116 de SEQ ID N° 6 a 8, tal como SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7 ou SEQ ID N° 8. Em várias modalidades, o domínio variável variante compreende até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 ou mais resíduos de aminoácidos conservativamente modificados em relação à sequência das respectivas SEQ ID N°. Em uma modalidade adicional, o composto de ligação compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, descritos nesse parágrafo.

[015] Em uma modalidade, o composto de ligação compreende uma sequência de cadeia leve de SEQ ID N° 14 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 6 a 8.

[016] Em outras modalidades, o composto de ligação da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que consiste essencialmente dos resíduos 1 a 108 da SEQ ID N° 14 e/ou um domínio variável de cadeia pesada, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que consiste essencialmente em uma sequência selecionada do grupo que consiste em resíduos 1 a 116 das SEQ ID N° 6 a 8, tal como SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7 ou SEQ ID N° 8.

[017] Em outras modalidades, o composto de ligação da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve ou seu fragmento de ligação ao antígeno que tem pelo menos 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de homologia de sequência com os resíduos 1 a 108 da SEQ ID N° 14 e/ou um domínio variável de cadeia pesada, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que tem pelo menos 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de homologia de sequência com uma sequência selecionada do grupo que consiste em resíduos 1 a 116 das SEQ ID N° 6 a 8, tal como SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7 ou SEQ ID N° 8.

[018] Em uma modalidade, o composto de ligação da presente invenção se liga a IL-23p19 humana (SEQ ID N° 47) em um epítopo que compreende os resíduos 20 a 30 ou resíduos 82 a 110 ou ambos. Em outra modalidade, o composto de ligação a IL-23p19 humana se liga a um epítopo que compreende alguns ou todos os resíduos K20, T23, W26, S27, P30, E82, S95, L96, L97, P98, D99, P101, G103, Q104, H106, A107 e L110, e opcionalmente os resíduos L24, L85, T91, S100 e V102. Em várias modalidades, o epítopo para um anticorpo de interesse é determinado pela obtenção do raio X de uma estrutura cristalina de um complexo anticorpo:antígeno e determinando que resíduos sobre IL-23p19 estão dentro de uma distância especificada de resíduos sobre o anticorpo de interesse, em que a distância especificada é, por exemplo de 4A ou 5A. Em algumas modalidades, o epítopo é definido por uma fita de 11 ou mais resíduos de aminoácidos contíguos ao longo da sequência de IL-23p19 na qual pelo menos 30%, 40%, 45%, 50% ou 54% dos resíduos estão dentro da distância especificada do anticorpo.

[019] Em uma modalidade, a invenção refere-se a anticorpos que são capazes de bloquear a ligação de um composto de ligação da presente invenção a IL-23p19 humana em um ensaio de bloqueio cruzado. Em outra modalidade, a invenção refere-se a compostos ligantes que são capazes de bloquear a atividade mediada por IL-23, tais atividades incluindo, mas não limitadas a ligação ao seu receptor e promoção da proliferação ou sobrevivência de células TH17.

[020] Em algumas modalidades, o composto de ligação da presente invenção compreende ainda uma região constante de cadeia pesada, em que a região constante de cadeia pesada compreende uma região constante de cadeia pesada de y1, y2, y3 ou y4 humanas ou suas variantes. Em várias modalidades, a região constante de cadeia leve compreende uma região constante de cadeia lambda ou kappa humanas.

[021] Em várias modalidades, os compostos ligantes da presente invenção são anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos, humanizados ou totalmente humanos ou seus fragmentos. A presente invenção também considera que o fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em, por exemplo, Fab, Fba', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 e um diacorpo.

[022] A presente invenção abrange um método para suprimir uma resposta imune em um indivíduo humano, compreendendo administrar ao indivíduo necessitado um anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) específico para IL-23 em uma quantidade eficaz para bloquear a atividade de IL-23. Em algumas modalidades, o anticorpo específico para IL-23 é um anticorpo humanizado ou quimérico. Em modalidades adicionais, a resposta imune é uma resposta inflamatória incluindo artrite, psoríase e doença inflamatória do intestino. Em outra modalidade, a resposta imune é uma resposta autoimune, que inclui esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico e diabetes. Em outra modalidade, o indivíduo tem câncer e a resposta imune é uma resposta de Th17.

[023] A presente invenção também considera a administração de um agente imunossupressor ou anti-inflamatório adicional. Os compostos ligantes da presente invenção podem estar em uma composição farmacêutica que compreende o composto de ligação ou seu fragmento de ligação ao antígeno, em combinação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um agente imunossupressor ou anti- inflamatório.

[024] A presente invenção abrange um ácido nucleico isolado que codifica a sequência de polipeptídeos de uma modalidade de anticorpo do composto de ligação da presente invenção. O ácido nucleico pode estar em um vetor de expressão operativamente ligado a sequências de controle reconhecidas pela célula hospedeira transfectada com o vetor. Também é abrangida uma célula hospedeira que compreende o vetor e um método de produzir um polipeptídeo que compreende cultivar a célula hospedeira sob condições nas quais a sequência de ácido nucleico é expressa, produzindo da mesma maneira o polipeptídeo, e recuperando o polipeptídeo da célula hospedeira ou do meio.

[025] Em várias modalidades, a invenção refere-se ao uso de um composto de ligação da presente invenção na fabricação de medicamentos para tratamento de distúrbios que incluem, mas não estão limitados a doença inflamatória, doença autoimune, câncer, doença infecciosa (por exemplo, infecções bacterianas, micobacterianas, virais ou fúngicas, incluindo infecções crônicas), artrite, psoríase, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, uveíte, lúpus eritematoso sistêmico e diabetes.

[026] Em outras modalidades, a invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreendem um composto de ligação da presente invenção para o tratamento de distúrbios que incluem, mas não são limitados a doença inflamatória, doença autoimune, câncer, doença infecciosa (por exemplo, infecções bacterianas, micobacterianas, virais ou fúngicas, incluindo infecções crônicas), artrite, psoríase, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, uveíte, lúpus eritematoso sistêmico e diabetes.

[027] Em algumas modalidades, o composto de ligação ou composição farmacêutica da presente invenção induz um período prolongado de remissão dos sintomas da doença em um indivíduo, tal que o intervalo de dosagem pode ser prolongado para muito além da meia-vida do composto de ligação no indivíduo, por exemplo, no tratamento de uma doença recorrente-remissiva. Em várias modalidades, o intervalo entre uma administração e outra é de 6, 8, 12, 16, 20, 24, 30 semanas ou mais. Em outras modalidades, uma única administração é suficiente para prevenir permanentemente as recidivas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[028] Figura 1 mostra as comparações entre as sequências de domínio variável de cadeia pesada do clone de anticorpo IL-23p19 de camundongo anti- humano. As sequências são fornecidas para os clones m1A11, m11C1, m5F5, m21D1, m13B8, h13B8a, h13B8b e h13B8c. As CDRs estão indicadas. Em ambas as figuras, um prefixo "m" indica um anticorpo de murino e um "h" indica um anticorpo humanizado. Os sufixos "a", "b" e "c" referem-se a variantes da sequência do domínio variável de cadeia pesada de 13B8 humanizado, como discutido em maiores detalhes abaixo.

[029] Figura 2 mostra comparações das sequências de domínio variável de cadeia leve do clone de anticorpo IL-23p19 de camundongo anti-humano. As sequências são fornecidas para os clones m1A11, m11C1, m5F5, m21D1, m13B8, h13B8. As CDRs estão indicadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[030] Como usadas aqui, incluindo as reivindicações anexas, as formas no singular das palavras tais como "um", "uma" e "o/a" incluem suas referências correspondentes no plural a menos que o contexto claramente dite de outra maneira. A Tabela 7 abaixo fornece uma listagem de identificadores de sequências usadas nesse pedido. Todas as referências aqui citadas estão incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação, pedido de patente ou patente, estivesse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência. A citação das referências aqui não é pretendida como uma admissão de que qualquer um dos citados anteriormente seja pertinente a técnica anterior, nem constitui qualquer admissão com relação aos conteúdos ou datas da mesmas publicações ou documentos. I. Definições

[031] "Atividade proliferativa" abrange uma atividade que promove, que é necessária ou que está especificamente associada com, por exemplo, divisão celular normal, assim como com câncer, tumores, displasia, transformação celular, metástase e angiogênese.

[032] "Administração" e "tratamento", como se aplicam a um animal, humano, indivíduo experimental, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, referem-se ao contato de um agente farmacêutico exógeno, terapêutico, agente de diagnóstico ou composição com o animal, humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. "Administração" e "tratamento" podem referir-se, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, pesquisa e experimentação. O tratamento de uma célula abrange o contato de um reagente com a célula, assim como o contato de um reagente com um fluido, onde o fluido está em contato com a célula. "Administração" e "tratamento" também significam tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo de uma célula, por um reagente, diagnóstico, composição de ligação ou por outra célula. "Tratamento", como se aplica a um indivíduo humano, veterinário ou de pesquisa, refere-se a medidas terapêuticas, profiláticas ou preventivas para aplicações de pesquisa e diagnóstico. "Tratamento", como se aplica a um indivíduo humano, veterinário de pesquisa,uma célula, tecido ou órgão, abrange o contato de um agente com o indivíduo animal, célula, tecido, compartimento fisiológico ou fluido fisiológico. "Tratamento de uma célula" também abrange situações onde o agente contata o receptor de IL-23 (heterodímero IL- 23R/IL-12beta 1), por exemplo, na fase líquida ou fase coloidal, mas também situações onde o agonista ou antagonista não contata a célula ou o receptor.

[033] Como usado aqui, a expressão "anticorpo" refere-se a qualquer forma de anticorpo que exiba a atividade biológica desejada. Assim, ela é usada no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de extensão completa), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos totalmente humanos, etc. desde que eles exibam a atividade biológica desejada.

[034] Como usadas aqui, as expressões "fragmento de ligação a IL-23p19", "seu fragmento de ligação" ou "seu fragmento de ligação ao antígeno" abrangem um fragmento ou derivado de um anticorpo que ainda retenha sua atividade biológica de inibição da atividade de IL-23p19. Portanto, a expressão "fragmento de anticorpo" ou fragmento de ligação a IL-23p19 refere-se a uma porção de um anticorpo de extensão completa, geralmente suas regiões de ligação ao antígeno ou variável. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos Fv; diabodies; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples, por exemplo, scFv; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Tipicamente, um fragmento ou derivado de ligação retém pelo menos 10% de sua atividade inibitória de IL-23p19. Preferivelmente, um fragmento ou derivado de ligação retém pelo menos 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% (ou mais) de sua atividade inibitória de IL-23p19, embora qualquer fragmento de ligação com afinidade suficiente para exercer o efeito biológico desejado possa ser útil. Também é pretendido que um fragmento de ligação a IL-23p19 possa incluir variantes com substituições de aminoácidos conservativas que não alteram substancialmente sua atividade biológica.

[035] A expressão "anticorpo monoclonal", como usada aqui, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações que ocorram naturalmente que possam estar presentes em pequenas quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único epítopo antigênico. Em contraste, preparações convencionais de anticorpo (policlonal) incluem, tipicamente, uma grande quantidade de anticorpos direcionados contra (ou específicos para) diferentes epítopos. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, anticorpos monoclonais que podem ser usados de acordo com a presente invenção, podem ser feitos pelo método do hibridoma, descrito primeiro por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, Pat. U.S. N° 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpo usando as técnicas descritas em Clackson et al (1991) Nature 352:624-628 e Marks et al. (1991) J Mol. Biol. 222:581-597, por exemplo.

[036] Os anticorpos monoclonais incluem aqui, especificamente, anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada. Pat. U.S. N° 4.816.567; Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855.

[037] Um "domínio de anticorpo" é um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional que contém apenas a região variável de uma cadeia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Em algumas circunstâncias, duas ou mais regiões VH são covalentemente ligadas com um ligante peptídico para criar um anticorpo de domínio bivalente. As duas regiões VH de um anticorpo de domínio bivalente podem atingir os mesmos antígenos ou antígenos diferentes.

[038] Um "anticorpo bivalente" compreende dois sítios de ligação ao antígeno. Em algumas circunstâncias, os dois sítios de ligação têm as mesmas especificidade antigênicas. Entretanto, anticorpos bivalentes também podem ser biespecíficos (veja abaixo).

[039] Como usada aqui, a expressão anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" refere-se a fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeos. Geralmente, o polipeptídeo de Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite ao sFv formar a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão sobre sFv, veja Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315.

[040] Os anticorpos monoclonais também incluem anticorpos camelizados de domínio simples. Veja, por exemplo, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; Pat. U.S. N° 6.005.079). Em uma modalidade, a presente invenção fornece anticorpos de domínio simples que compreendem dois domínios VH com modificações tais que são formados anticorpos de domínio simples.

[041] Como usada aqui, a expressão "diabodies" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado com um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH -VL ou VL -VH). Com o uso de um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Diabodies estão descritos mais completamente em EP 404,097; WO 93/11161; and Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Para uma revisão sobre anticorpos manipulados veja Holliger e Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

[042] Como usada aqui, a expressão "anticorpo humanizado" refere-se a formas de anticorpos que contêm sequências de anticorpos não humanos (por exemplo, de murino) assim como de anticorpos humanos. Tais anticorpos contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina. O prefixo "hum" ou "hu" ou "h" é adicionado as designações do clone do anticorpo quando necessário para distinguir os anticorpos humanizados (por exemplo, hum13B8) dos anticorpos parentais de roedores (por exemplo, 13B8 de camundongo ou m13B8). As forma humanizadas de anticorpos de roedores geralmente compreenderão as mesmas sequências de CDR dos anticorpos parentais de roedores, embora certas substituições de aminoácidos possam ser incluídas para aumentar a afinidade, aumentar a estabilidade do anticorpo humanizado ou por outras razões.

[043] Os anticorpos da presente invenção também incluirão anticorpos com regiões Fc modificadas (ou bloqueadas) para fornecer funções efetoras alteradas. Veja, por exemplo, Pat. U.S. N°5.624.821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Tais modificações podem ser usadas para intensificar ou suprimir várias reações do sistema imune, com possíveis efeitos benéficos no diagnóstico e na terapia. Alterações da região Fc incluem alterações de aminoácidos (substituições, deleções e inserções), glicosilação ou deglicosilação e a adição de múltiplas Fc. Alterações na Fc também podem alterar a meia-vida de anticorpos em anticorpos terapêuticos e uma meia-vida prolongada poderá resultar em dosagem menos frequente, com conveniência aumentada e uso diminuído de material concomitantes. Veja, Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 a 734-35.

[044] A expressão "anticorpo totalmente humanizado" refere-se a um anticorpo que compreende apenas sequências de proteína imunoglobulina humana. Um anticorpo totalmente humanizado pode conter cadeias de carboidrato de murino, se produzidos em um camundongo, em uma célula de camundongo ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Similarmente, "anticorpo de camundongo" refere-se a um anticorpo que compreende apenas sequências de imunoglobulina de camundongo. Um anticorpo totalmente humanizado pode ser gerado em um ser humano, em um animal transgênico que tem as sequências da linhagem germinativa de imunoglobulina humana, por apresentação em fago ou outros métodos biológicos moleculares.

[045] Como usada aqui, a expressão "região hipervariável" refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende os resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 2434 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) e 89-97 (CDRL3) no domínio variável de cadeia leve e resíduos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) e 95-102 (CDRH3) no domínio variável de cadeia pesada (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (isto é, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) domínio variável de cadeia pesada (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901917). Como usada aqui, a expressão "estrutural" ou resíduos "FR" refere-se a aqueles resíduos de domínio variável diferentes de resíduos da região hipervariável definidos aqui como resíduos de CDR. A numeração dos resíduos acima refere-se ao sistema de numeração de Kabat e não necessariamente corresponde em detalhes a numeração de sequência na Listagem de Sequências em anexo.

[046] "Composto de ligação" refere-se a uma molécula, molécula pequena, macromolécula, polipeptídeo, anticorpo ou seu fragmento ou análogo, ou receptor solúvel capaz de se ligar a um alvo. "Composto de ligação" também pode referir-se a um complexo de moléculas, por exemplo, um complexo não covalente, a uma molécula ionizada e a uma molécula modificada covalentemente ou não covalentemente, por exemplo, modificada por fosforilação, acilação, reticulação, ciclização ou clivagem limitada, que é capaz de se ligar a um alvo. Quando usado com referência a anticorpos, a expressão "composto de ligação" refere-se a ambos os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno. "Ligante" refere-se a uma associação da composição de ligação com um alvo, onde a associação resulta na redução do movimento Browniano normal da composição de ligação, nos casos onde a composição de ligação pode ser dissolvida ou suspensa em solução. "Composição de ligação" refere-se a uma molécula, por exemplo, um composto de ligação, em combinação com um estabilizador, excipiente, sal, tampão, solvente ou aditivo, capaz de se ligar a um alvo.

[047] "Variantes conservativamente modificadas" ou "substituição conservativa" referem-se a substituições de aminoácidos que são conhecidas por aqueles versados na técnica e que podem ser feitas geralmente sem alterar a atividade biológica da molécula resultante, mesmo em regiões essenciais do polipeptídeo. Tais substituições exemplares são preferivelmente feitas de acordo com aquelas descrita na Tabela 1 a seguir: Tabela 1

[048] Além disso, aqueles versados na técnica reconhecerão que, em geral, substituições únicas de aminoácidos em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica. Veja, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition).

[049] A frase "consiste essencialmente em" ou variações tais como "consistem essencialmente em" ou "consistindo essencialmente em", como usada através do mesmo pedido e das reivindicações, indica a inclusão de quaisquer elementos ou grupos de elementos listados e a inclusão opcional de outros elementos, de natureza similar ou diferente dos elementos listados, que não alteram materialmente as propriedades básicas ou novas do regime de dosagem, método ou composição especificados. Como um exemplo não limitante, um composto de ligação que consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos citada também pode incluir um ou mais aminoácidos, incluindo substituições de um ou mais resíduos de aminoácidos, que não alteram materialmente as propriedades do composto de ligação.

[050] "Quantidade eficaz" abrange uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal da condição médica. Quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade eficaz para um paciente em particular ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores, tais como a condição a ser tratada, a saúde global do paciente, o método da via de dose de administração e a severidade dos efeitos colaterais. Veja, por exemplo, Pat. U.S. N° 5.888.530. Uma quantidade eficaz pode ser a dose máxima ou o protocolo de dosagem que evite efeitos colaterais ou efeitos tóxicos significativos. O efeito resultará em uma melhora de uma medida ou parâmetro diagnóstico em pelo menos 5%, geralmente em pelo menos 10%, mais geralmente em pelo menos 20%, o mais geralmente em pelo menos 30%, preferivelmente em pelo menos 40%, mais preferivelmente em pelo menos 50%, o mais preferivelmente em pelo menos 60%, idealmente em pelo menos 70%, mais idealmente em pelo menos 80% e o mais idealmente em pelo menos 90%, onde 100% é definido como o parâmetro de diagnóstico mostrado por um indivíduo normal. Veja, por exemplo, Maynard et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK.

[051] "Condição imune" ou "distúrbio imune" abrange, por exemplo, inflamação patológica, um distúrbio inflamatório e um distúrbio ou doença autoimune. "Condição imune" também refere-se a infecções, infecções persistentes, tumores e cânceres que resistem a erradicação pelo sistema imune. "Condição cancerosa" inclui, por exemplo, câncer, células cancerosa, tumores, angiogênese e condições pré-cancerosas tais como a displasia.

[052] "Distúrbio inflamatório" significa um distúrbio ou condição patológica onde a patologia resulta, no todo ou em parte, por exemplo, de uma alteração no número, alteração na taxa de migração ou alteração na ativação de células do sistema imune. As células do sistema imune incluem, por exemplo, células T, células B, monócitos ou macrófagos, células que apresentam antígeno (APCs), células dendríticas, microglia, células NK, células NKT, neutrófilos, eosinófilos, células mastocitárias ou qualquer outra célula especificamente associada com a imunologia, por exemplo, células endoteliais que produzem citocina ou células epiteliais,

[053] Uma "célula que produz IL-17" significa uma célula T que não é uma célula T tipo TH1 clássica ou uma célula T tipo TH2 clássica, referidas como células TH17. As células TH17 são discutidas em maiores detalhes em Cua and Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato and O'Shea (2006) Nature 441:166-168; Iwakura and Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:1218-1222. Uma "célula que produz IL-17" também significa uma célula T que expressa um gene ou polipeptídeo da Tabela 10B da Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2004/0219150 (por exemplo, proteína P responsiva a mitógeno, ligante 2 de quimiocina; interleucina-17 (IL-17); fator de transcrição relacionado a RAR; e/ou supressor de citocina sinalizadora 3), onde a expressão com tratamento por um agonista de IL-23 é maior do que o tratamento com um agonista de IL-12, onde "maior do que" é definido como se segue. A expressão com um agonista de IL-23 é geralmente pelo menos 5 vezes maior, tipicamente pelo menos 10 vezes maior, mais tipicamente pelo menos 15 vezes maior, o mais tipicamente pelo menos 20 vezes maior, preferivelmente pelo menos 25 vezes maior e o mais preferivelmente pelo menos 30 vezes maior do que o tratamento com IL-12. A expressão pode ser medida, por exemplo, com o tratamento de uma população substancialmente pura de células que produzem IL- 17. Uma resposta de Th17 é uma resposta imune na qual a atividade e/ou proliferação de células Th17 estão intensificadas, tipicamente acoplada com uma resposta reprimida de Th1.

[054] Além disso, uma "célula que produz IL-17" inclui uma célula progenitora ou precursora que é designada, em uma via de desenvolvimento celular ou de diferenciação celular, para se diferenciar em uma célula que produz IL-17, como definida acima. Uma célula progenitora ou precursora de uma célula que produz IL-17 pode ser encontrada em um linfonodo de drenagem (DLN). Além disso, "célula que produz IL-17" abrange uma célula que produz IL-17, como definida acima, que foi ativada, por exemplo, por um éster de forbol, ionóforo e/ou carcinogênico, posteriormente diferenciada, congelada, do mesmocada, inativada, parcialmente degradada, por exemplo, por apoptose, proteólise ou oxidação lipídica, ou modificada, por exemplo, por tecnologia recombinante.

[055] Como usada aqui, a expressão "molécula de ácido nucleico isolada" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está comumente associada na fonte natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolado é diferente na forma ou na disposição na qual ela é encontrada na natureza. Portanto, moléculas de ácido nucleico isolado são distintas das moléculas de ácido nucleico como elas existem em células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que comumente expressam o anticorpo, onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em uma localização cromossômica diferente daquela de células naturais.

[056] A expressão "sequências de controle" refere-se a sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência codificadora operativamente ligada em um organismo hospedeiro em particular. As sequências de controle que são adequadas para procariotos, por exemplo, incluem uma sequencia promotora e, opcionalmente, uma sequência operadora e um sítio de ligação a ribossoma. As células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação e intensificadores.

[057] Um ácido nucleico está "operativamente ligado" quando ele é colocado em um relacionamento funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma pré-sequência ou líder secretora está operativamente ligado ao DNA de um polipeptídeo se ele for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está operativamente ligado a uma sequência codificadora se ele afeta a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossoma está operativamente ligado a uma sequência codificadora se ele estiver posicionado de maneira a facilitar a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de DNA a serem ligadas são contíguas e, no caso de uma líder secretória, contíguas e em fase de leitura. Entretanto, intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida pela ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeo sintético são usados de acordo com a prática convencional.

[058] Como usadas aqui, as expressões "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" são usadas alternativamente e todas as tais designações incluem a progênie. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem o indivíduo celular primário e as culturas dele derivadas sem relação com o número de transferências. Também deve ser compreendido que toda a progênie não precisa ser idêntica em conteúdo de DNA devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progênie mutante que tem a mesma atividade funcional ou biológica como rastreada na célula originalmente transformada está incluída.Onde são pretendidas designações distintas, ficará claro no contexto.

[059] Como usada aqui, a "reação em cadeia da polimerase" ou "PCR" refere-se a um procedimento ou técnica na qual quantidades mínimas de um pedaço específico de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são amplificadas como descrito em, por exemplo, Pat. U.S. N° 4.683.195. Geralmente a informação da sequência a partir das extremidades da região de interesse ou além necessita estar disponível, tal que iniciadores de oligonucleotídeo possam ser designados; esses iniciadores serão idênticos ou similares na sequência a fitas opostas do modelo a ser amplificado. Os nucleotídeos 5' terminais dos dois iniciadores podem coincidir com as terminações do material amplificado. PCR pode ser usada para amplificar sequências específicas de RNA, sequências específicas de DNA do DNA genômico total e cDNA transcrito do RNA celular total, sequências de bacteriófagos ou plasmídeos, etc. Veja, de modo geral, Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). Como usada aqui, PCR é considerada ser um, mas não o único, exemplo de um método de reação em cadeia da polimerase para amplificação de uma amostra de teste de ácido nucleico, que compreende o uso de um ácido nucleico conhecido como um iniciador e uma polimerase de ácido nucleico para amplificar ou gerar um pedaço específico de ácido nucleico.

[060] Como usada aqui, a expressão "sequência da linhagem germinativa" refere-se a uma sequência de sequências não rearranjadas de DNA de imunoglobulina, incluindo sequências da linhagem germinativa de roedor (por exemplo, camundongo) e humano. Qualquer fonte adequada de DNA de imunoglobulina não rearranjado pode ser usada. Sequências da linhagem germinativa humana podem ser obtidas, por exemplo, dos bancos de dados de linhagens germinativas JOINSOLVER® no website do National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the United States National Institutes of Health. Sequencias da linhagem germinativa de camundongo podem ser obtidas, por exemplo, como descrito em Giudicelli et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:D256- D261.

[061] Para examinar a extensão da inibição da atividade de IL-23, por exemplo, amostras ou ensaios que compreendem, por exemplo, uma dada proteína, gene, célula ou organismo, são tratados com um agente ativador ou inibidor em potencial e são comparados com amostras de controle sem o agente. Amostras de controle, isto é, não tratadas com o agente, são designadas com um valor relativo de atividade de 100%. A inibição é obtida quando o valor de atividade em relação ao controle é de cerca de 90% ou menos, tipicamente 85% ou menos, mais tipicamente 89% ou menos, o mais tipicamente 75% ou menos, geralmente 70% ou menos, mais geralmente 65% ou menos, o mais geralmente 60% ou menos, tipicamente 55% ou menos, comumente 50% ou menos, mais comumente 45% ou menos, o mais comumente 40% ou menos, preferivelmente 35% ou menos, mais preferivelmente 30% ou menos, ainda mais preferivelmente 25% ou menos e o mais preferivelmente menos do que 25%. A ativação é obtida quando o valor da atividade em relação ao controle é de cerca de 110%, geralmente pelo menos 120%, mais geralmente pelo menos 140%, mais geralmente pelo menos 160%, frequentemente pelo menos 180%, mais frequentemente pelo menos 2 vezes, mais frequentemente pelo menos 2,5 vezes, comumente pelo menos 5 vezes, mais comumente pelo menos 10 vezes, preferivelmente pelo menos 20 vezes, mais preferivelmente pelo menos 40 vezes e o mais preferivelmente pelo menos 40 vezes maior.

[062] Metas na ativação ou inibição podem ser monitorizadas como se segue. Ativação, inibição e resposta ao tratamento, por exemplo, de uma célula, fluido fisiológico, tecido, órgão, animal ou indivíduo humano, podem ser monitorizados por uma meta. A meta pode compreender uma quantidade ou percentagem predeterminadas, por exemplo, de um indício de inflamação, de oncogenicidade, ou degranulação ou secreção celular, tal como a liberação de uma citocina, de oxigênio tóxico ou de uma protease. A meta pode compreender, por exemplo, uma quantidade predeterminada de fluxo ou transporte de íon; migração celular; adesão celular; proliferação celular; potencial para metástase; diferenciação celular; e alteração no fenótipo, por exemplo, alteração na expressão de gene que se relaciona com inflamação, apoptose, transformação, ciclo celular ou metástase (veja, por exemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood and Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins and Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:14671495; Grady and Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic and Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126).

[063] Uma meta de inibição é geralmente 75% do controle ou menos, preferivelmente 50% do controle ou menos, mais preferivelmente 25% do controle ou menos e o mais preferivelmente 10% do controle ou menos. Geralmente uma meta de ativação é de pelo menos 150% do controle, preferivelmente pelo menos duas vezes o controle, mais preferivelmente pelo menos quatro vezes o controle e o mais preferivelmente pelo menos 10 vezes o controle.

[064] "Molécula pequena" é definida como uma molécula com um peso molecular que é menor do que 10kDa, tipicamente menor do que 2 kDa e preferivelmente menor do que 1 kDa. Moléculas pequenas incluem, mas não são limitadas a moléculas inorgânicas, moléculas orgânicas, moléculas orgânicas que contêm um componente inorgânico, moléculas que compreendem um átomo radioativo, moléculas sintéticas, miméticos de peptídeo e miméticos de anticorpo. Como um terapêutico, uma molécula pequena pode ser mais permeável a células, menos suscetível a degradação e menos apta para desencadear uma resposta imune do que moléculas grandes.Moléculas pequenas, tais miméticos de peptídeo de anticorpos e citocinas, assim como moléculas pequenas de toxinas estão descritas. Veja, por exemplo, ., Casset et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos et al. (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini et al. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato and Sone (2003) Biochem. J. 371:603-608; Patente U.S. N° 6.326.482.

[065] Ligar "especificamente" ou "seletivamente", quando se referir a um ligante/receptor, anticorpo/antígeno ou a outro par de ligação, indica uma reação de ligação que é determinativa da presença da proteína em uma população heterogênea de proteínas e outros biológicos. Assim, sob condições designadas, um ligante específico se liga a um receptor em particular e não se liga, em quantidades significativas, a outra proteínas presentes na amostra. Como usado aqui, um anticorpo é dito se ligar especificamente a um polipeptídeo que compreende uma dada sequência (nesse caso IL-23p19) se ele se ligar a polipeptídeos que compreendem a sequência de IL-23p19 mas não se ligar a proteínas que carecem da sequência de IL-23p19. Por exemplo, um anticorpo que se ligue especificamente a um polipeptídeo que compreende IL-23p19 pode se ligar a uma forma marcada com FLAG® de IL-23p19 mas não se ligará com outras proteínas marcadas com FLAG®.

[066] O anticorpo ou composição de ligação derivados do sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo dos métodos considerados, ligam-se ao seu antígeno com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior, preferivelmente pelo menos dez vezes maior, mais preferivelmente pelo menos vinte vezes maior e o mais preferivelmente pelo menos 100 vezes maior do que a afinidade com antígenos não relacionados. Em uma modalidade preferida, o anticorpo terá uma afinidade que é maior do que cerca de 109 litros/mol, como determinada, por exemplo, pela análise Scatchard. Munsen et al (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239.

[067] Como usada aqui, a expressão "agente imunomodulador" refere-se a agentes naturais ou sintéticos que suprimem ou modulam a resposta imune. A resposta imune pode ser uma resposta humoral ou celular. Agentes imunomoduladores abrangem agentes imunossupressores ou anti-inflamatórios.

[068] "Agentes imunossupressores", fármacos imunossupressores" ou "imunossupressores" como usados aqui são terapêuticos que são usados na terapia imunossupressiva para inibir ou prevenir a atividade do sistema inume. Clinicamente, eles são usados para prevenir a rejeição de órgãos e tecidos transplantados (por exemplo, medula óssea, coração, rim, fígado) e/ou no tratamento de doenças autoimunes ou doenças que são muito provavelmente de origem autoimune (por exemplo, artrite reumatóide, miastenia gravis, lúpus eritematoso sistêmico, colite ulcerativa, esclerose múltipla). Fármacos imunossupressores podem ser classificados em quatro grupos: glicocorticóides citostáticos; anticorpos (incluindo Modificadores de Resposta Biológica ou DMARDs); fármacos que atuam sobre imunofilinas; outros fármacos incluindo os agentes quimioterapêuticos conhecidos usados no tratamento de distúrbios proliferativos. Para a esclerose múltipla, em particular, os anticorpos da presente invenção podem ser administrados em conjunto com uma nova classe de terapêuticos semelhantes a proteína que se liga a mielina, conhecidos como copaxonas.

[069] "Agentes anti-inflamatórios" ou "fármacos anti-inflamatórios" são usados para representar ambos os terapêuticos esteroidais e não esteroidais. Esteróides, também conhecidos como corticosteróides, são fármacos que lembram intimamente o cortisol, um hormônio naturalmente produzido pelas glândulas adrenais. Esteróides são usados como o tratamento principal para certas condições inflamatórias, tais como: vasculite sistêmica (inflamação dos vasos sanguíneos); e miosite (inflamação do músculo). Esteróides podem ser usados seletivamente para tratar condições inflamatórias tais como: artrite reumatóide (artrite inflamatória crônica que ocorre nas articulações em ambos os lados do corpo); lúpus eritematoso sistêmico (uma doença generalizada causada pela função anormal do sistema imune); síndrome de Sjogren (distúrbio crônico que causa olhos secos e boca seca).

[070] Fármacos anti-inflamatórios não esteroidais, geralmente abreviados como NSAIDs, são fármacos com efeitos analgésicos, antipiréticos e anti- inflamatórios - eles reduzem a dor, febre e a inflamação. A expressão "não esteroidal" é usada para distinguir esses fármacos dos esteróides, que (entre uma grande faixa de outros efeitos) têm uma ação depressiva similar a eicosanóide e ação anti-inflamatória. NSAIDs são geralmente indicados para o alívio sintomático das seguintes condições: artrite reumatóide; osteoartrite; artropatias inflamatórias (por exemplo, espondilite anquilosante, artrite psoriásica, síndrome de Reiter); gota aguda; dismenorréia; dor óssea metastática; cefaléia e enxaqueca; dor pós- operatória; dor de leve a moderada devida a inflamação e lesão tecidual; pirexia; e cólica renal. NSAIDs incluem salicilatos, ácidos arilalcanóicos, ácidos 2- arilpropionicos (profenos), ácidos arilantranílicos (ácidos fenâmicos), oxicams, coxibs e sulfonanilidas. II. Geral

[071] A presente invenção fornece anticorpos anti-IL-23 manipulados e seus usos para tratar distúrbios inflamatórios, autoimunes e proliferativos.

[072] Várias citocinas têm um papel na patologia ou na restauração de distúrbios neurológicos. IL-6, IL-17, interferon-gama (IFNgama, IFN-y) e fator que estimula colônia de granulócito (GM-CSF) têm sido associados com a esclerose múltipla. Matusevicius et al. (1999) Multiple Sclerosis 5:101-104; Lock et al. (2002) Nature Med. 8:500-508. IL-1alfa, IL-1beta e o fator beta 1 de transformação do crescimento (TGF-beta1) desempenham um papel em ALS, doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Hoozemans et al. (2001) Exp. Gerontol. 36:559-570; Griffin and Mrak (2002) J. Leukocyte Biol. 72:233-238; Ilzecka et al. (2002) Cytokine 20:239-243. TNF-alfa, IL-1beta, IL-6, IL-8, interferon-gama, e IL-17 parecem modular a resposta na isquemia cerebral Veja, por exemplo, Kostulas et al. (1999) Stroke 30:2174-2179; Li et al. (2001) J. Neuroimmunol. 116:5-14. O fator de crescimento celular endotelial vascular (VEGF) está associado com ALS. Cleveland and Rothstein (2001) Nature 2:806-819.

[073] Distúrbios inflamatórios do intestino, por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença celíaca e síndrome do intestino irritável são mediadas por células do sistema imune e por citocinas. Por exemplo, a doença de Crohn está associada com IL-12 e IFNy aumentadas, enquanto que a colite ulcerativa está associada com IL-5, IL-13 e fator beta de transformação do crescimento (TGFbeta) aumentados. A expressão de IL-17 também pode aumentar na doença de Crohn e na colite ulcerativa. Veja, por exemplo, Podolsky (2002) New Engl. J. Med. 347:417429; Bouma and Strober (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:521-533; Bhan et al. (1999) Immunol. Rev. 169:195-207; Hanauer (1996) New Engl. J. Med. 334:841-848; Green (2003) The Lancet 362:383-391; McManus (2003) New Engl. J. Med. 348:25732574; Horwitz and Fisher (2001) New Engl. J. Med. 344:1846-1850; Andoh et al. (2002) Int. J. Mol. Med. 10:631-634; Nielsen et al. (2003) Scand. J. Gastroenterol. 38:180-185; Fujino et al. (2003) Gut 52:65-70.

[074] O receptor de IL-23 é um complexo heterodimérico das subunidades IL-23R e IL-12β1. Veja Parham et al. (2000) J. Immunol. 168:5699. O receptor de IL- 12 é um complexo das subunidades IL-12Rβ1 e IL-12Rβ2. Veja Presky et al. (1996) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:14002. IL-23R tem sido implicada como um fator genético critico nos distúrbios inflamatórios do intestino doença de Crohn e colite ulcerativa. Duerr et al. (2006) Sciencexpress 26-October-2006:1. Um estudo com ampla associação ao genoma descobriu que o gene de IL-23R estava altamente associado com a doença de Crohn, com uma variante codificadora incomum (Arg381Gln) conferindo forte proteção contra a doença. Essa associação genética confirma os achados biológicos anteriores (Yen et al. (2006) J. Clin. Investigation 116:1218) que sugerem que IL-23 e seu receptor são alvos promissores para uma nova abordagem terapêutica para tratar IBD.

[075] As doenças inflamatórias da pele, articulações, SNC, assim como distúrbios proliferativos fazem surgir respostas imunes similares, e assim o bloqueio de IL-23 pode fornecer a inibição do mesmos distúrbios inflamatórios mediados por resposta imune, sem compreender a habilidade do hospedeiro de combater infecções sistêmicas. O antagonismo de IL-23 pode aliviar a inflamação associada com a doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, artrite reumatóide, artrite psoriásica, psoríase, espondilite anquilosante e dermatite atópica. O uso de inibidores de IL-23 poderá fornecer também a inibição de distúrbios proliferativos, por exemplo, câncer e distúrbios autoimunes, por exemplo, esclerose múltipla, diabetes tipo I e SLE. As descrições de IL-23 nesses vários distúrbios podem ser encontradas nos seguintes pedidos PCT publicados: WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631 e WO 01/18051. Os inibidores de IL-23 também encontram uso no tratamento de infecções, incluindo infecções crônicas, tais como infecções bacterianas, micobacterianas, virais e fúngicas.

[076] A subunidade p19 de IL-23 é um membro da família de citocinas hematopoiéticas de "cadeia longa" (Oppmann et al. (2000) supra) e compreende quatro a-hélices arranjadas, denominadas A, B, C e D, com uma topologia ascendente- ascendente-descendente-descendente. As 4 hélices estão conectadas por 3 alças de polipeptídeos. As alças A-B e C-D são modeladas para serem relativamente longas já que elas conectam hélices paralelas. A alça B-C curta conecta as hélices antiparalelas B e C. A subunidade p19 de IL-23 é um membro da família IL-6 de citocinas helicoidais. Essa família de citocinas se liga a seus receptores cognatos através de três epítopos conservados (sítio I, II e III; Bravo e Heath (2000) EMBO J. 19:2399-2411). A subunidade p19 interage com três subunidades de receptor de citocina para formar o complexo de sinalização competente. Quando expressa em uma célula, a subunidade p19 forma primeiro um complexo com a subunidade p40, que partilha com IL-12. Como observado acima, o complexo p19p40 é secretado da célula como uma proteína heterodimérica chamada de IL-23. Veja, por exemplo, Oppmann et al. (2000) supra. O complexo de receptor celular necessário para converter o sinal de IL-23 consiste em dois membros das grandes subunidades de receptor de sinalização da família de citocinas IL-6/IL-12, IL-23R específico para IL-23 (veja, por exemplo, Parham et al, supra) e IL-12Rb1, que é partilhado com IL-12.

[077] Conhecimentos da base estrutural de citocina de "cadeia longa"/receptor de reconhecimento mostraram que apesar de grandes áreas da superfície da proteína serem encobertas na formação de complexos citocina- receptor, a afinidade da interação é dominada por alguns, geralmente firmemente agrupados resíduos de aminoácidos que formam um "ponto quente" energético no centro da interface de ligação. A identidade dos resíduos que dominam a energia de ligação de uma grande interface proteína-proteína tem sido denominada como o "epítopo funcional". A afinidade da interação (e portanto da especificidade biológica) é consequentemente definida pela complementaridade estrutural dos epítopos funcionais do ligante e do receptor. Estudos detalhados de mutagênese mostraram que os resíduos mais significativos que constroem os epítopos funcionais de citocinas e receptores são contatos hidrofóbicos que envolvem tanto cadeias laterais não polares quanto o arcabouço de polipeptídeo. O "núcleo" não polar é circundado por um halo de resíduos polares de menor importância para a energia de ligação. Estudos cinéticos indicaram que o papel primário dos epítopos funcionais é estabilizar a interação proteína-proteína pela diminuição da taxa de dissociação do complexo. Tem sido sugerido que o contato inicial entre a citocina e o receptor é dominado pela difusão aleatória ou "ondulação" de superfícies de proteína produzindo vários contatos instáveis. O complexo é então estabilizado quando os epítopos funcionais do receptor e do ligante se unem. Veja, por exemplo, Bravo e Heath, supra. III. Geração de Anticorpos Específicos para IL-23 Qualquer método adequado para a geração de anticorpos monoclonais pode ser usado. Por exemplo, um receptor pode ser imunizado com uma forma ligada ou não ligada (por exemplo, que ocorre naturalmente) do heterodímero de IL-23 ou seu fragmento. Qualquer método adequado de imunização pode ser usado. Tais métodos podem incluir adjuvantes, outros imunoestimulantes, imunizações de ataque repetidas e o uso de uma ou mais vias de imunização.

[078] Qualquer fonte adequada de IL-23 pode ser usada como imunógeno para a geração do anticorpo não humano, específico para a subunidade p19, das composições e métodos aqui descritos. Tais formas incluem, mas não se limitam a proteína completa, incluindo heterodímeros ligados e que ocorrem naturalmente, peptídeo(s) e epítopos, gerados através de meios recombinantes, sintéticos, químicos ou de degradação enzimática conhecidos na técnica.

[079] Qualquer forma de antígeno pode ser usada para gerar o anticorpo que é suficiente para gerar um anticorpo biologicamente ativo. Assim, o antígeno desencadeante pode ser um epítopo único, epítopos múltiplos ou a proteína completa sozinha ou em combinação com um ou mais agentes intensificadores de imunogenicidade conhecidos na técnica. O antígeno desencadeante pode ser uma proteína de extensão completa isolada, uma proteína da superfície celular (por exemplo, imunizando com células transfectadas com pelo menos uma porção do antígeno) ou uma proteína solúvel (imunizando com apenas a porção do domínio extracelular da proteína). O antígeno pode ser produzido em uma célula geneticamente modificada. O DNA que codifica o antígeno pode ser genômico ou não genômico (por exemplo, cDNA) e codifica pelo menos uma porção do domínio extracelular. Como usada aqui, a expressão "porção" refere-se ao número mínimo de aminoácidos ou ácidos nucleicos, como apropriado, para constituir um epítopo imunogênico do antígeno de interesse. Quaisquer vetores genéticos adequados para a transformação das células de interesse podem ser empregados, incluindo, mas não limitado a vetores adenovirais, plasmídeos e vetores não virais, tais como lipídeos catiônicos.

[080] Qualquer método adequado pode ser usado para fazer surgir um anticorpo com as propriedades biológicas desejadas para inibir IL-23. É desejável preparar anticorpos monoclonais (mAbs) a partir de vários hospedeiros mamíferos, tais como camundongos, roedores, primatas, humanos , etc. A descrição de técnicas para preparar tais anticorpos monoclonais pode ser encontrada em, por exemplo, Stites et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, e referências citadas nesse; Harlow and Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY. Assim, anticorpos monoclonais podem ser obtidos por uma variedade de técnicas familiares aos pesquisadores versados na técnica. Tipicamente, células do baço de um animal imunizado com um antígeno desejado são imortalizadas, comumente pela fusão com uma célula de mieloma. Veja Kohler and Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519. Métodos de imortalização alternativos incluem a transformação com o Vírus de Epstein Barr, oncogenes ou retrovírus ou outros métodos conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Doyle et al. (eds. 1994 and periodic supplements) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, New York, NY. As colônias que surgem de células imortalizadas isoladas são rastreadas quanto a produção de anticorpos com a especificidade e afinidade desejadas pelo antígeno, e o rendimento dos anticorpos monoclonais produzidos por tais células pode ser intensificado por várias técnicas, incluindo injeção na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado. Alternativamente, pode-se isolar sequências de DNA que codificam um anticorpo monoclonal ou seu fragmento que se liga ao antígeno pelo rastreamento de uma biblioteca de DNA de células B humanas de acordo, por exemplo, com o protocolo geral desenvolvido por Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281.

[081] Outras técnicas adequadas envolvem a seleção de bibliotecas de anticorpos em fago ou vetores similares. Veja, por exemplo, Huse et al., supra e Ward et al. (1989) Nature 341:544-546. Os polipeptídeos e anticorpos da presente invenção podem ser usados com ou sem modificação, incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados. Frequentemente, os polipeptídeos e anticorpos serão marcados pelo acoplamento, tanto covalentemente quanto não covalentemente, de uma substância que fornece um sinal detectável. Uma grande variedade de marcadores e técnicas de conjugação são conhecidas e estão descritas exaustivamente AM ambas as literaturas, científica e de patente. Marcadores adequados incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofatores, inibidores, porções fluorescentes, porções quimioluminescentes, partículas magnéticas e semelhantes. Patentes que ensinam o uso de tais marcadores incluem Patentes U.S. Nos 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; e 4.366.241. Também podem ser produzidas imunoglobulinas recombinantes, veja Cabilly Patentes U.S. N° 4.816.567; e Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; ou feitos em camundongos transgênicos, veja Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156. Veja também as tecnologias Abgenix e Medarex.

[082] Anticorpos ou composições de ligação contra fragmentos predeterminados de IL-23 podem ser construídos pela imunização de animais com conjugados do polipeptídeo, fragmentos ou epítopos com proteínas transportadoras. Anticorpos monoclonais podem ser preparados a partir de células que secretam o anticorpo desejado. Esses anticorpos podem ser rastreados quanto a ligação com IL-23 normal ou defeituosa. Esses anticorpos monoclonais geralmente se ligarão com pelo menos uma Kd de cerca de 1 μM, mais comumente pelo menos cerca de 300 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM ou mais, geralmente determinado por ELISA. Anticorpos não humanos adequados também podem ser identificados usando ensaios biológicos descritos nos Exemplos 5 e 6 abaixo.

[083] Um hibridoma que expressa o anticorpo 13B8 foi depositado de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection (ATCC - Manassas, Virginia, USA) em 17 de Agosto de 2006, sob o Número de Acesso PTA- 7803. IV. Humanização de Anticorpos Específicos para IL-23

[084] Qualquer anticorpo não humano pode ser usado como uma fonte para a região hipervariável. Fontes de anticorpos não humanos incluem, mas não são limitadas a murino, Lagomorfos (incluindo coelhos), bovinos e primatas. Na maioria dos casos, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos das regiões hipervariáveis do receptor são substituídos por resíduos de regiões hipervariáveis de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano, que tenha a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em algumas circunstâncias, resíduos Fv da região estrutural (FR) de imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo da atividade biológica desejada. Para mais detalhes veja Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Reichmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

[085] Métodos para manipular anticorpos recombinantemente foram descritos, por exemplo, por Boss et al. (U.S. Pat. N° 4,816,397), Cabilly et al. (Pat. U.S. N° 4.816.567), Law et al. (Publicação de Pedido de Patente Européia N° EP438310A1) e Winter (Patente Européia N° EP239400B1).

[086] Variantes de sequencia de aminoácidos de anticorpo anti-IL-23 humanizado são preparadas pela introdução de alterações apropriadas de nucleotídeos no DNA do anticorpo anti-IL-23 humanizado ou por síntese de peptídeo. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções, e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos mostradas para o anticorpo anti-IL-23 humanizado. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para se chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar os processos pós-traducionais do anticorpo anti-IL-23 humanizado, tal como alterando o número ou a posição de sítios de glicosilação.

[087] Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do polipeptídeo do anticorpo anti-IL-23p19 humanizado que são localizações preferidas para a mutagênese, é chamado de "mutagênese por rastreamento de alanina" como descrito por Cunningham e Wells (1989) Science 244:1081-1085. Aqui, um resíduo ou um grupo de resíduos-alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como Arg, Asp, His, Lys e Glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno de IL-23. Os resíduos de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional para as substituições são então refinados pela introdução adicional de outras variantes no ou para os sítios de substituição. Assim, apesar do sítio para introdução de uma variação de sequência de aminoácido ser predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa ser determinada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, o rastreamento de Ala ou a mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região- alvo e as variantes de anticorpo anti-IL-23p19 humanizadas expressas são rastreadas quanto a atividade desejada.

[088] Inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carboxil terminal que variam em extensão de um resíduo a polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, assim como inserções intrassequências de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem o anticorpo anti-IL-23 humanizado com um resíduo de metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a um epítopo tag. Outras variantes insercionais da molécula do anticorpo anti-IL-23 humanizado incluem a fusão na terminação N ou C de um anticorpo anti-IL-23 humanizado de uma enzima ou um polipeptídeo que aumente a meia-vida sérica do anticorpo.

[089] Outro tipo de variante é a variante por substituição de aminoácido. Essas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido removido na molécula do anticorpo anti-IL-23p19 humanizado e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para a mutagênese por substituição incluem as alças hipervariáveis, mas alterações em FR também são consideradas.

[090] Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por alterar entende-se deletar uma ou mais porções de carboidratos encontradas no anticorpo e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação de anticorpos é tipicamente tanto ligada a N quanto ligada a O. Ligada a N refere-se ao acoplamento da porção de carboidrato a cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para o acoplamento enzimático da porção de carboidrato na cadeia lateral de asparagina. Assim , a presença de qualquer uma da mesmas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação ligada a O refere-se ao acoplamento de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora a 5- hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas.

[091] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente obtida pela alteração da sequência de aminoácidos, tal que ela contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeo acima descritas (para sítios de glicosilação ligados a N). A alteração também pode ser feita pela adição ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na sequência original do anticorpo (para sítios de glicosilação ligados a O).

[092] Outro tipo de variante de aminoácido é a substituição de resíduos para fornecer maior estabilidade química ao anticorpo humanizado final. Por exemplo, um resíduo de asparagina (N) pode ser alterado para reduzir o potencial para formação de isoaspartato em quaisquer sequências NG dentro da CDR de roedor. Um problema similar pode ocorres em uma sequência DG. Reissner e Aswad (2003) Cell Mol. Life Sci. 60:1281. A formação de isoaspartato pode debilitar ou anular completamente a ligação de um anticorpo ao seu antígeno-alvo. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 1 734. Em uma modalidade, a asparagina é substituída por glutamina (Q). Além disso, resíduos de metionina em CDRs de roedores podem ser alterados para reduzir a possibilidade de que o enxofre da metionina se oxidize, o que poderia reduzir a afinidade de ligação ao antígeno e também contribuir para a heterogenicidade molecular na preparação do anticorpo final. Id. Em uma modalidade, a metionina é trocada por alanina (A). Anticorpos com tais substituições são subsequentemente rastreados para assegurar que as substituições não diminuem a afinidade de ligação a IL-23p19 em níveis inaceitáveis.

[093] Moléculas de ácido nucleico que codificam variantes da sequência de aminoácidos de anticorpo humanizado específico para IL-23 são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não são limitados ao isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos que ocorrem naturalmente) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada ao sítio), mutagênese por PCR e mutagênese com cassete de uma variante anteriormente preparada ou uma versão não variante de anticorpo humanizado anti-IL-23p19.

[094] Comumente, variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo humanizado anti-IL-23 terão uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com as sequências de aminoácidos, tanto da cadeia leve quanto da cadeia pesada, do anticorpo humanizado original, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e o mais preferivelmente pelo menos 95%, 98% ou 99%. Identidade ou homologia com relação a essa sequência é definida aqui como o percentual de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos aos resíduos de anti-IL-23 humanizado, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para se obter o percentual máximo de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência. Nenhuma extensão, deleção ou inserção N-terminal, C-terminal ou interna deve ser interpretada como afetando a identidade ou homologia de sequência.

[095] O anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulina, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo IgG. Qualquer isotipo de IgG pode ser usado, incluindo IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Variantes dos isotipos de IgG também são consideradas. O anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais de uma classe ou isotipo. A otimização das sequências do domínio constante necessário para gerar a atividade biológica desejada é prontamente obtida pelo rastreamento de anticorpos nos ensaios biológicos descritos abaixo.

[096] Da mesma maneira, qualquer classe de cadeia leve pode ser usada nas composições e métodos do mesmo. Especificamente, kappa e lambda ou suas variantes são úteis nas presentes composições e métodos.

[097] Qualquer porção adequada das sequências de CDR de anticorpo não humano pode ser usada. As sequências de CDR podem ser mutagenizadas por substituição, inserção ou deleção de pelo menos um resíduo, tal que a sequência de CDR é distinta da sequência de anticorpo humano e não humano empregada. É considerado que tais mutações devem ser mínimas. Tipicamente, pelo menos 75% dos resíduos do anticorpo humanizado corresponderão àqueles resíduos de CDRs não humana, mais frequentemente 90% e mais preferivelmente mais do que 95%.

[098] Qualquer porção adequada das sequências de FR de anticorpo não humano pode ser usada. As sequências de FR podem ser mutagenizadas por substituição, inserção ou deleção de pelo menos um resíduo, tal que a sequência de FR é distinta da sequência do anticorpo humano e não humano empregada. É considerado que tais mutações devem ser mínimas. Tipicamente, pelo menos 75% dos resíduos do anticorpo humanizado corresponderão àqueles resíduos de FR não humano, mais frequentemente 90% e mais preferivelmente mais do que 95%, 98 ou 99%.

[099] Resíduos de CDR e FR são determinados de acordo com a definição de sequência padronizada de Kabat. Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. As SEQ ID N° 1 a 5 mostram as sequencias do domínio variável de cadeia pesada de vários anticorpos de camundongo anti-IL-23p19 humana e as SEQ ID N° 9 a 13 mostram as sequencias do domínio variável de cadeia leve. As FIGS. 1 e 2 fornecem a organização das sequências dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve de vários anticorpos da presente invenção. As CDRs são indicadas nas figuras e as sequências individuais de CDR são, cada uma, apresentadas com Identificadores de Sequência únicos como indicado na Tabela 7.

[0100] As formas humanizadas do anticorpo 13B8 são fornecidas. A sequência da cadeia leve de 13B8 humanizado (com a região constante kappa) é fornecida na SEQ ID N° 14 e o domínio variável de cadeia leve compreende os resíduos 1 a 108 daquela sequência. Três versões da sequência da cadeia pesada de 13B8 humanizado (com as regiões constantes y1) são fornecidas nas SEQ ID N° 6 a 8 e o domínio variável da cadeia pesada compreende os resíduos 1 a 116 daquelas sequências. As variantes da cadeia pesada de 13B8 estão ilustradas na Tabela 2, com as diferenças entre as sequências parentais grafadas em negrito. Met (M) foi modificado para Lys (K) para evitar o potencial de oxidação do resíduo e a inativação do anticorpo. A substituição de AQKLQ por NEMFE é uma substituição da sequência de CDR de murino pela sequência da linhagem germinativa da região estrutural humana selecionada para humanizar o anticorpo. Tabela 2 Variantes de CDRH2 do Anticorpo 13B8

[0101] As formas humanizadas dos outros anticorpos aqui descritos podem ser criadas simplesmente substituindo as CDRs do anticorpo parental de roedor dentro das sequências das cadeias leve e pesada de 13B8 humanizado fornecidas nas SEQ ID N° 14 e 6. Essa abordagem é mais provavelmente bem-sucedida para cadeias de anticorpo com CDRs que têm alta homologia com as CDRs do anticorpo 13B8, por exemplo, o clone 11C1 sobre a cadeia pesada e os clones 11C1 e 21D1 sobre a cadeia leve. Alternativamente, os anticorpos de murino podem ser independentemente humanizados usando as abordagens delineadas aqui, por exemplo, no Exemplo 2.

[0102] Em uma modalidade, as CDRs incluem variantes de qualquer sequência única de CDR aqui descrita (SEQ ID N° 15 a 46), na qual a variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10 ou mais substituições conservativas de aminoácidos em relação a sequência descrita, como determinado usando a Tabela 1.

[0103] Também são considerados os anticorpos quiméricos. Como observado acima, anticorpos quiméricos típicos compreendem uma porção da cadeia pesada e/ou leve idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é/são idêntica(s) ou homóloga(s) a sequências em anticorpos derivados de outras espécies ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como os fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada. Veja Pat. U.S. N° 4.816.567; e Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855.

[0104] Anticorpos biespecíficos também são úteis nos presentes métodos e composições. Como usada aqui, a expressão "anticorpo biespecífico" refere-se a um anticorpo, tipicamente um anticorpo monoclonal, que tem especificidades de ligação por pelo menos dois epítopos antigênicos diferentes, por exemplo, IL-23p19 e IL-17. Em uma modalidade, os epítopos são do mesmo antígeno. Em outra modalidade, os epítopos são de dois antígenos diferentes. Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser produzidos recombinantemente usando a coexpressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina. Veja, por exemplo, Milstein et al. (1983) Nature 305:537-39. Alternativamente, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Veja, por exemplo, Brennan et al. (1985) Science 229:81. Anticorpos biespecíficos incluem fragmentos de anticorpo biespecífico. Veja, por exemplo, Holliger et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48; Gruber et al (1994) J. Immunol. 152:5368.

[0105] Em outras modalidades, domínios constantes diferentes podem ser anexados às regiões VH e VL humanizadas fornecidas aqui. Por exemplo, se um uso particular pretendido de um anticorpo (ou fragmento) da presente invenção fosse requisitado para funções efetoras alteradas, um domínio constante de cadeia pesada diferente de IgG1 poderia ser usado. Embora anticorpos IgG1 forneçam meia-vida longa e funções efetoras, tais como ativação do complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo, tais atividades podem não ser desejáveis para todos os usos do anticorpo. Em tais circunstâncias, um domínio constante de IgG4, por exemplo, pode ser usado. V. Atividade Biológica de Anti-IL-23 Humanizado

[0106] Anticorpos que têm as características aqui identificadas como sendo desejáveis em um anticorpo anti-IL-23 humanizado podem ser rastreados quanto a atividade biológica inibitória in vitro ou quanto a afinidade de ligação adequada. Para rastrear anticorpos que se ligam ao epítopo sobre IL-23 humana (isto é, a subunidade p19) ligado por um anticorpo de interesse (por exemplo, aqueles que bloqueiam a ligação da citocina ao seu receptor), um ensaio de bloqueio cruzado de rotina tal como aquele descrito em ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1998), pode ser realizado. Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo são passíveis de bloqueio cruzado em tais ensaios, mas nem todos os anticorpos com bloqueio cruzado necessariamente se ligarão precisamente sobre o mesmo epítopo já que o bloqueio cruzado pode resultar de impedimento estérico da ligação de anticorpo por anticorpos que se ligam a epítopos superpostos ou até mesmo a epítopos próximos não superpostos.

[0107] Alternativamente, o mapeamento de epítopo, por exemplo, como descrito em Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394, pode ser realizado para determinar se o anticorpo se liga a um epítopo de interesse. A "mutagênese por rastreamento de alanina", como descrita por Cunningham e Wells (1989) Science 244:1081-1085, ou alguma outra forma de mutagênese pontual de resíduos de aminoácidos na IL-23 humana também podem ser usadas para determinar o epítopo funcional para um anticorpo anti-IL-23 humana da presente invenção. Estudos de mutagênese, entretanto, também podem revelar resíduos de aminoácidos que são cruciais para a estrutura tridimensional global de IL-23, mas que não estão envolvidos diretamente nos contatos de anticorpo-antígeno, e assim outros métodos podem ser necessários para confirmar um epítopo funcional determinado usando esse método.

[0108] O epítopo ligado por um anticorpo específico também pode ser determinado pela avaliação da ligação do anticorpo a peptídeos que compreendem fragmentos de IL-23p19 humana (SEQ ID N° 47). A sequência da subunidade p40 de IL-12 e IL-23 é encontrada no GenBank N° de Acesso P29460. Uma série de peptídeos superpostos abrangendo a sequência de IL-23p19 pode ser sintetizada e rastreada quanto a ligação, por exemplo, em um ELISA direto, um ELISA competitivo (onde o peptídeo é avaliado quanto a sua habilidade em prevenir a ligação de um anticorpo a IL-23p19 ligado a um poço de uma placa de microtitulação) ou sobre um chip. Tais métodos de rastreamento de peptídeo podem não ser capazes de detectar alguns epítopos funcionais descontínuos, isto é, epítopos funcionais que envolvem resíduos de aminoácidos que não são contíguos ao longo da sequência primária da cadeia de polipeptídeos de IL-23p19.

[0109] O epítopo ligado por anticorpos da presente invenção também pode ser determinado por métodos estruturais, tais como determinação da estrutura cristalina por raio X (por exemplo, WO2005/044853), modelagem molecular e espectroscopia por ressonância nuclear magnética (NMR), incluindo determinação por NMR das taxas de troca de hidrogênios de amida lábil em IL-23 quando livre e quando ligada em um complexo com um anticorpo de interesse (Zinn-Justin et a/. (1992) Biochemistry 31:11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884-6891).

[0110] Com relação a cristalografia por raio X, a cristalização pode ser obtida usando qualquer um dos métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23), incluindo "microbatch" (por exemplo Chayen (1997) Structure 5:1269-1274), difusão de vapor com gota suspensa (por exemplo, McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303), semeadura e diálise. É desejável usar uma preparação de proteína que tem uma concentração de pelo menos cerca de 1 mg/ml e preferivelmente cerca de 10 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. A cristalização pode ser melhor obtida em uma solução precipitante contendo polietileno glicol 1000-20.000 (PEG; peso molecular médio variando entre cerca de 1000 a cerca de 20.000 Da), preferivelmente cerca de 5000 a cerca de 7000 Da, mais preferivelmente cerca de 6000 Da, com concentrações que variam entre cerca de 10% a cerca de 30% (peso/volume). Também pode ser desejável incluir um agente estabilizador de proteína, por exemplo, glicerol em uma concentração que varia entre cerca de 0,5% a cerca de 20%. Um sal adequado, tal como cloreto de sódio, cloreto de lítio ou citrato de sódio também pode ser desejável na solução precipitante, preferivelmente em uma concentração que varia entre cerca de 1 mM a cerca de 1000 mM. O precipitante é preferivelmente tamponado para um pH entre cerca de 4.0 a cerca de 10.0, frequentemente entre cerca de 7.0 a 8.5, por exemplo, pH 8.0. Tampões específicos úteis na solução precipitante podem variar e são bem conhecidos na técnica. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) SpringerVerlag, New York. Exemplos de tampões úteis incluem, mas não são limitados a HEPES, Tris, MES e acetato. Os cristais podem se desenvolver em uma ampla faixa de temperaturas, incluindo 2°C, 4°C, 8°C e 26°C.

[0111] Cristais de anticorpo:antígeno podem ser estudados usando técnicas de difração com raio X bem conhecidas e podem ser refinadas usando programas de computador tais como X-PLOR (Yale University, 1992, distribuído por Molecular Simulations, Inc.; veja, por exemplo, Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al. eds., Academic Press; Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2004/0014194), e BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323).

[0112] Anticorpos adicionais que se ligam sobre o mesmo epítopo como um anticorpo da presente invenção podem ser obtidos, por exemplo, pelo rastreamento de anticorpos construídos contra IL-23 pela ligação ao epítopo ou pela imunização de um animal com um peptídeo que compreende um fragmento de IL-23 humana que compreende a sequência do epítopo. Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo funcional podem ser esperados exibir atividades biológicas similares, tais como bloqueio da ligação ao receptor e tais atividades podem ser confirmadas pelos ensaios funcionais dos anticorpos.

[0113] Afinidades de anticorpo (por exemplo, por IL-23 humana) podem ser determinadas usando análises padronizadas. Anticorpos humanizados preferidos são aqueles que se ligam a IL-23p19 humana com um valor de Kd de não mais do que cerca de 1 x 10-7, preferivelmente não mais do que cerca de 1 x 10-8, mais preferivelmente não mais do que cerca de 1 x 10-9, e o mais preferivelmente não mais do que cerca de 1 x 10-10, ou até 1 x 10-11 M.

[0114] Os anticorpos e seus fragmentos úteis nas presentes composições e métodos são anticorpos e fragmentos biologicamente ativos. Como usada aqui, a expressão "biologicamente ativo" refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é capaz de se ligar com o epítopo antigênico desejado e, direta ou indiretamente, exercer um efeito biológico. Tipicamente, esses efeitos resultam da falha de IL-23 se ligar ao seu receptor. Como usada aqui, a expressão "específica" refere-se a ligação seletiva do anticorpo ao epítopo antigênico alvo. Anticorpos podem ser testados quanto a especificidade de ligação pela comparação da ligação a IL-23 com a ligação a antígeno ou mistura de antígeno irrelevantes sob um dado grupo de condições. Se o anticorpo se liga a IL-23 pelo menos 10 e, preferivelmente, 50 vezes mais do que ao antígeno ou mistura de antígeno irrelevantes, então ele é considerado ser específico. Um anticorpo que se liga a IL-12 não é um anticorpo específico para IL-23. Um anticorpo que "se liga especificamente" a IL-23p19 não se liga a proteínas que não compreendem as sequências derivadas de IL-23p19, isto é, "especificidade" como usada aqui refere-se a especificidade a IL-23p19 e não a quaisquer outras sequências que possam estar presentes na proteína em questão. Por exemplo, como usado aqui, um anticorpo que "se liga especificamente" a IL- 23p19, tipicamente se ligará a FLAG®-hIL-23p19, que é uma proteína de fusão que compreende IL-23p19 e um peptídeo marcador FLAG®, mas não se liga ao peptídeo marcador FLAG® isolado ou quando ele está fundido a uma outra proteína diferente de IL-23p19.

[0115] Compostos de ligação específicos para IL-23 da presente invenção, tais como anticorpos inibitórios específicos para IL-23p19, podem inibir sua atividade biológica de qualquer maneira incluindo, mas não limitada a produção de IL-1β e TNF por macrófagos peritoneais e IL-17 por células T TH17. Veja Langrish et al. (2004) Immunol. Rev. 202:96-105. Anticorpos anti-IL-23p19 também serão capazes de inibir a expressão do gene de IL-17A, IL-17F, CCL7, CCL17, CCL20, CCL22, CCR1, e GM-CSF. Veja Langrish et al. (2005) J. Exp. Med. 201:233-240. Os compostos de ligação específicos para IL-23 da presente invenção, tais como anticorpos anti-IL-23p19, também bloquearão a habilidade de IL-23 de intensificar a proliferação ou a sobrevivência de células TH17. Cua e Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559. A atividade inibitória de anti-IL-23p19 manipulado será útil no tratamento de distúrbios inflamatórios, autoimunes e proliferativos. Exemplos de tais distúrbios estão descritos nas publicações de pedido de patente PCT WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; e WO 01/18051. VI. Composições Farmacêuticas

[0116] Para preparar composições farmacêuticas ou estéreis que incluem o anticorpo para IL-23p19, o análogo da citocina ou muteína, o anticorpo para isso ou ácido nucleico do mesmo, é misturado com um veículo ou excipiente farmaceuticamente adequado. Veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

[0117] Formulações de agentes terapêuticos ou de diagnóstico podem ser preparadas pela mistura com veículos, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis na forma de, por exemplo, pós liofilizados, pastas, soluções aquosas ou suspensões. Veja, por exemplo, Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY.

[0118] A toxicidade e a eficácia terapêutica das composições de anticorpo, administradas sozinhas ou em combinação com um agente imunossupressor, podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padronizados em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A faixa de dose entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode ser expresso como a proporção de LD50 para ED50. Anticorpos que exibem altos índices terapêuticos são preferidos. Os dados obtidos do mesmos ensaios com cultura celular e estudos em animais podem ser usados para formular uma faixa de dosagens para uso em humanos. A dosagem de tais compostos está, preferivelmente, dentro de uma faixa de concentrações circulantes que inclui a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro da mesma faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada.

[0119] O modo de administração não é particularmente importante. Vias de administração adequadas podem incluir, por exemplo, a administração oral, retal, transmucosa ou intestinal; liberação parenteral, incluindo injeções intramusculares, intradérmicas, subcutâneas, intramedulares, assim como injeções intratecais, intraventriculares diretas, intravenosas, intraperitoneais, intranasais ou intraoculares. A administração de anticorpo usado na composição farmacêutica ou na prática do método da presente invenção pode ser realizada em uma variedade de meios convencionais, tais como a ingestão oral, inalação, aplicação tópica ou cutânea, subcutânea, intraperitoneal, parenteral, intra-arterial ou injeção intravenosa.

[0120] Alternativamente, pode-se administrar o anticorpo em um local e não de uma maneira sistêmica, por exemplo, através da injeção do anticorpo diretamente na articulação artrítica ou na lesão induzida pelo patógeno caracterizada pela imunopatologia, geralmente em uma formulação de depósito ou de liberação sustentada. Além disso, pode-se administrar o anticorpo em um sistema de liberação de fármaco direcionado, por exemplo, em um lipossoma revestido com um anticorpo específico para tecido, direcionando-o, por exemplo, para a articulação artrítica ou para a lesão induzida pelo patógeno caracterizada pela imunopatologia. Os lipossomas serão direcionados e absorvidos seletivamente pelo tecido afetado.

[0121] Selecionar um regime de administração para um terapêutico depende de vários fatores, incluindo a taxa de circulação sérica ou tecidual da entidade, o nível dos sintomas, a imunogenicidade da entidade e a acessibilidade das células- alvo na matriz biológica. Preferivelmente, um regime de administração maximiza a quantidade de terapêutico liberado para o paciente consistente com um nível aceitável de efeitos colaterais. Consequentemente, a quantidade do biológico liberada depende, em parte, da entidade em particular e da severidade da condição a ser tratada. Guias para selecionar as doses apropriadas de anticorpos, citocinas e moléculas pequenas estão disponíveis. Veja, por exemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602.

[0122] A determinação da dose apropriada é feita pelo clínico, por exemplo, usando parâmetros ou fatores conhecidos ou suspeitos na técnica por afetar o tratamento ou preditos afetar o tratamento. Geralmente, a dose começa com uma quantidade as vezes menor do que a dose ótima e é aumentada com pequenos incrementos a partir daí, até o efeito desejado ou ótimo ser atingido em relação a qualquer efeito colateral negativo. Medidas de diagnóstico importantes incluem aquelas de sintomas, por exemplo, de inflamação ou do nível de citocinas inflamatórias produzidas. Preferivelmente, um biológico que será usado é derivado substancialmente da mesma espécie do animal objetivado para o tratamento (por exemplo, um anticorpo humanizado para o tratamento de indivíduos humanos), minimizando da mesma maneira qualquer resposta imune ao reagente.

[0123] Anticorpos, fragmentos de anticorpo e citocinas podem ser fornecidos por infusão contínua ou em doses com intervalos, por exemplo, de um dia, 1 a 7 vezes por semana, uma semana, duas semanas, mensalmente, bimestralmente, etc. As doses podem ser fornecidas intravenosamente, subcutaneamente, topicamente, oralmente, nasalmente, retalmente, intramuscular, intracerebral, intra-espinhal ou por inalação. Um protocolo de dose preferido é aquele que envolve a dose máxima ou a frequência de dose que evita efeitos colaterais indesejáveis significativos. Uma dose semanal total é geralmente de pelo menos 0,05 μg/kg, 0,2 μg/kg, 0,5 μg/kg, 1 μg/kg, 10 μg/kg, 100 μg/kg, 0,2 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg de peso corporal ou mais. Veja, por exemplo, Yang et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144. A dose desejada de uma molécula pequena terapêutica, por exemplo, um mimético de peptídeo, produto natural ou químico orgânico é cerca da mesma como para um anticorpo ou polipeptídeo, em uma base de mols/kg.

[0124] Como usado aqui, "inibir" ou "tratar" ou "tratamento" inclui um adiamento do desenvolvimento dos sintomas associados com a doença autoimune ou imunopatologia induzida por um patógeno e/ou a redução na severidade de tais sintomas se desenvolverão ou são esperados que se desenvolvam. As expressões ainda incluem melhorar os sintomas descontrolados ou indesejados existentes da imunopatologia relacionados com a auto-imunidade ou induzidos por patógeno, prevenir sintomas adicionais e melhorar ou prevenir as causas subjacentes de tais sintomas. Assim, as expressões denotam que um resultado benéfico foi conferido a um indivíduo vertebrado com uma doença ou sintoma autoimune ou imunopatológico induzido por patógeno ou com o potencial de desenvolver tal doença ou sintoma.

[0125] Como usada aqui, a expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de composto de ligação específico para IL-23p19, por exemplo, um anticorpo, que quando é administrado sozinho ou em combinação com um agente terapêutico adicional a uma célula, tecido ou indivíduo, é eficaz para prevenir ou melhorar a doença autoimune ou a doença ou condição associada com a imunopatologia induzida pelo patógeno ou a progressão da doença. Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se ainda àquela quantidade do composto que é suficiente para resultar na melhora dos sintomas, por exemplo, tratando, curando, prevenindo ou melhorando a condição médica relevante ou em um aumento na taxa de tratamento, cura, prevenção ou melhora de tais condições. Quando aplicada a um ingrediente ativo individual administrado sozinho, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se àquela do ingrediente sozinho. Quando aplicada a uma combinação, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se a quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, administrados em combinação, em série ou simultaneamente. Uma quantidade eficaz de um terapêutico diminuirá os sintomas tipicamente em pelo menos 10%; comumente em pelo menos 20%; preferivelmente em pelo menos cerca de 30%; mais preferivelmente em pelo menos 40% e o mais preferivelmente em pelo menos 50%.

[0126] Métodos para coadministração ou tratamento com um segundo agente terapêutico, por exemplo, uma citocina, anticorpo, esteróide, agente quimioterapêutico, antibiótico ou radiação são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Hardman et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA. A composição farmacêutica da invenção também pode conter outros agentes imunossupressores ou imunomoduladores. Qualquer agente imunossupressor pode ser empregado incluindo, mas não limitados a agentes anti-inflamatórios, corticosteróides, ciclosporina, tacrolimus (isto é, FK-506), sirolimus, interferons, receptores solúveis de citocina (por exemplo, sTNRF e sIL-1R), agentes que neutralizam a atividade de citocina (por exemplo, inflixmab, etanercept), micofenolato de mofetila, 15-desoxipergualina, talidomida, glatiramer, azatioprina, leflunomida, ciclofosfamida, metotrexate e semelhantes. A composição farmacêutica também pode ser empregada com outras modalidades terapêuticas tais como fototerapia e radiação.

[0127] Indivíduos veterinários, experimentais ou de pesquisa típicos incluem macacos, cães, gatos, camundongos, coelhos, porcos da guiné, cavalos e humanos. VII. Produção de Anticorpo

[0128] Em uma modalidade, para a produção recombinante dos anticorpos da presente invenção, os ácidos nucleicos que codificam as duas cadeias são isolados e inseridos em um ou mais vetores replicáveis para clonagem posterior (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA que codifica o anticorpo monoclonal é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Vários vetores estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não se limitam a um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. Em uma modalidade, ambas as cadeias leve e pesada do anticorpo humanizado anti-IL-23p19 da presente invenção são expressas a partir do mesmo vetor, por exemplo, um plasmídeo ou um vetor adenoviral.

[0129] Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica. Em uma modalidade, os anticorpos são expressos em células de mamífero ou de inseto em cultura, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células 293 de rim embrionário humano (HEK), células NOS de mieloma de camundongo, células de rim de filhote de hamster (BHK), células ovarianas de Spodoptera frugiperda (Sf9). Em uma modalidade, os anticorpos secretados a partir de células CHO são recuperados e purificados por métodos cromatográficos padronizados, tais como cromatografia com proteína A, por troca de cátion, troca de ânion, por interação hidrofóbica e com hidroxiapatita. Os anticorpos resultantes são concentrados e armazenados em acetato de sódio 20 mM, pH 5,5.

[0130] Em outra modalidade, os anticorpos da presente invenção são produzidos em levedura de acordo com os métodos descritos em WO2005/040395. Resumidamente, os vetores que codificam as cadeias leve ou pesada individuais de um anticorpo de interesse são introduzidos em diferentes células haplóides de levedura, por exemplo, diferentes tipos de cruzamento da levedura Pichia pastoris, cujas células haplóides de levedura são opcionalmente auxotróficas complementares. As células haplóides de levedura transformadas podem então ser cruzadas ou fundidas para dar uma célula diplóide de levedura capaz de produzir ambas as cadeias leve e pesada. A cepa diplóide é então capaz de secretar o anticorpo completamente agrupado e biologicamente ativo. Os níveis de expressão relativa das duas cadeias pode ser otimizado, por exemplo, pelo uso de vetores com diferentes números de cópias, usando promotores transcricionais de diferentes forças ou induzindo a expressão de promotores induzíveis que direcionam a transcrição dos genes que codificam uma ou ambas as cadeias.

[0131] Em uma modalidade, as respectivas cadeias pesada e leve de uma pluralidade de anticorpos anti-IL-23p19 diferentes (os anticorpos "originais") são introduzidas em células haplóides de levedura para criar uma biblioteca de cepas de levedura com um tipo de cruzamento que expressam uma pluralidade de cadeias leves e uma biblioteca de cepas de levedura com um tipo de cruzamento diferente que expressam uma pluralidade de cadeias pesadas. Essas bibliotecas de cepas haplóides podem ser cruzadas (ou fundidas como esferoplastos) para produzir uma série de células diplóides de levedura que expressam uma biblioteca combinatória de anticorpos compreendida das várias permutações possíveis das cadeias leve e pesada. A biblioteca combinatória de anticorpos pode então ser rastreada para determinar qual dos anticorpos têm propriedades que são superiores (por exemplo, maior afinidade por IL-23) àquelas dos anticorpos originais. Veja, por exemplo, WO2005/040395.

[0132] Em outra modalidade, os anticorpos da presente invenção são anticorpos com domínio humano nos quais porções de um domínio variável de anticorpo estão ligadas em um polipeptídeo de peso molecular de aproximadamente 13 kDa. Veja, por exemplo, Publicação de Pat. U.S. N° 2004/0110941. Como o domínio simples, agentes de baixo peso molecular fornecem numerosas vantagens em termos de facilidade de síntese, estabilidade e via de administração. VIII. Usos

[0133] A presente invenção fornece métodos para usar anticorpo anti-IL-23 manipulados e seus fragmentos para o tratamento de e diagnóstico de distúrbios e condições inflamatórias, por exemplo do sistema nervoso central, sistema nervoso periférico e trato gastrointestinal, assim como distúrbios auto-imunes e proliferativos.

[0134] São fornecidos métodos para o tratamento de, por exemplo, esclerose múltipla (MS), incluindo MS recidivante-remissiva e MS primária progressiva, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica (a.k.a ALS; doença de Lou Gehrig), lesão cerebral isquêmica, doenças do príon, e demência associada a HIV. Também são fornecidos métodos para tratar dor neuropática, neuropatias pós-traumáticas, síndrome de Guillain-Barre (GBS), polineuropatia periférica e regeneração nervosa.

[0135] São fornecidos métodos para tratar ou melhorar um ou mais das seguintes características, sintomas, aspectos, manifestações ou sinais de esclerose múltipla, ou outros distúrbios ou condições inflamatórias do sistema nervoso central: lesões cerebrais, lesões da mielina, desmielinização, placas desmielinizantes, distúrbios visuais, perda do equilíbrio ou coordenação, espasticidade, distúrbios sensoriais, incontinência, dor, fraqueza, fadiga, paralisia, deficiência cognitiva, bradifrenia, diplopia, neurite óptica, parestesia, marcha atáxica, fadiga, sintoma de UHtoff, nevralgia, afasia, apraxia, convulsões, perda do campo visual, demência, fenômenos extrapiramidais, depressão, sensação de bem estar ou outros sintomas emocionais, mielopatia crônica progressiva, e um sintoma detectado pela ressonância nuclear magnética (MRI), incluindo lesões intensificadas pelo gadolínio, registros de potencial evocado ou exames do fluido cérebro-espinhal. Veja, por exemplo, Kenealy et al. (2003) J. Neuroimmunol. 143:7-12; Noseworthy et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:938-952; Miller et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:15-23; Chang et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:165-173; Bruck and Stadelmann (2003) Neurol. Sci. 24 Suppl.5:S265-S267.

[0136] Além disso, a presente invenção fornece métodos para tratar e diagnosticar distúrbios inflamatórios do intestino, por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença celíaca e síndrome do intestino irritável. São fornecidos métodos para tratar ou melhorar um ou mais dos seguintes sintomas, aspectos, manifestações ou sinais de um distúrbio inflamatório do intestino: má-absorção do alimento, motilidade intestinal alterada, infecção, febre, dor abdominal, diarréia, sangramento retal, perda de peso, sinais de má nutrição, doença perianal, massa abdominal, e falha de crescimento, assim como complicações intestinais tais como estreitamentos, fístulas, megacolon tóxico, perfuração e câncer e incluindo achados endoscópicos, tais como fragilidade, úlceras aftosas ou lineares, aspecto pavimentoso, pseudopólipos e envolvimento retal e, além disso, anticorpos antilevedura. Veja, por exemplo, Podolsky, supra; Hanauer, supra; Horwitz e Fisher, supra.

[0137] Também é considerado o tratamento de distúrbios inflamatórios tais como psoríase, dermatite atópica, artrite, incluindo artrite reumatóide, osteoartrite, e artrite psoriásica, distúrbios autoimunes, tais como lúpus eritematoso sistêmico e diabetes tipo I, e doenças proliferativas tais como câncer. Veja, por exemplo, publicações de pedido de patente PCT WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; e WO 01/18051.

[0138] Os compostos de ligação a IL-23p19 da presente invenção também podem ser usados em combinação com um ou mais antagonistas de outras citocinas (por exemplo, anticorpos), incluindo mas não limitado a IL-17A, IL-17F, IL-1β, IL-6 e TGF-β. Veja, por exemplo, Veldhoen (2006) Immunity 24:179-189; Dong (2006) Nat. Rev. Immunol. 6(4):329-333. Em várias modalidades, um composto de ligação a IL- 23p19 da invenção é administrado antes, concomitantemente ou após a administração de outro antagonista ou antagonistas, tais como um anticorpo anti-IL- 17. Em uma modalidade, um composto de ligação a IL-17 é usado no tratamento da fase aguda precoce de uma resposta imune adversa (por exemplo, MS, doença de Crohn) sozinho ou em combinação com um anticorpo antagonista de IL-23 da presente invenção. No último caso, o composto de ligação a IL-17 pode ser gradualmente diminuído e o tratamento com o antagonista de IL-23 é continuado para manter a supressão da resposta adversa. Alternativamente, antagonistas de IL- 1β, IL-6 e/ou TGF-β podem ser administrados concomitantemente, antes ou depois de um composto de ligação a IL-23p19 da presente invenção. Veja, Cua and Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato and O'Shea (2006) Nature 441:166168; Iwakura and Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:1218-1222.

[0139] O amplo escopo da mesma invenção é melhor compreendido com relação aos seguintes exemplos, que não são pretendidos limitar a invenção às modalidades específicas. As modalidades específicas aqui descritas são oferecidas como meio de exemplo apenas e a invenção é limitada pelos termos das reivindicações anexas, junto com o escopo completo de equivalentes aos quais tais reivindicações são designadas. Exemplos Métodos Gerais

[0140] São descritos métodos usuais de biologia molecular. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA. Métodos usuais também aparecem em Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nova Iorque, NY, que descreve clonagem em células bacterianas e mutagênese de DNA (Vol. 1), clonagem em célula de mamífero e levedura (Vol. 2), expressão de glicoconjugados e proteína (Vol. 3), e bioinformática (Vol. 4).

[0141] São descritos métodos para purificação de proteína incluindo imunoprecipitação, cromatografia, eletroforese, centrifugação, e cristalização. Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque. Análise química, modificação química, modificação pós- traducional, produção de proteínas de fusão, glicosilação de proteínas são descritos. Vide, por exemplo, Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque; Ausubel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 4589; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384391. Production, purification, and fragmentation of polyclonal and monoclonal antibodies are described. Coligan et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque; Harlow e Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow e Lane, supra. Técnicas usuais para caracterizar interações ligante/receptor estão disponíveis. Vide, por exemplo, Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nova Iorque.

[0142] Métodos para citometria de fluxo, incluindo sistemas de detecção de classificação celular ativada por fluorescência (FACS®), estão disponíveis. Veja, por exemplo, Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ. Reagentes fluorescentes adequados para modificar ácidos nucleicos, incluindo iniciadores de ácidos nucleicos e sondas, polipeptídeos, e anticorpos, para uso, por exemplo, como reagentes de diagnóstico, estão disponíveis. Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO.

[0143] Métodos usuais de histologia do sistema imune são descritos. Vide, por exemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nova Iorque, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, e Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology:Text and Atlas, McGraw-Hill, Nova Iorque, NY.

[0144] Pacotes de programas e bases de dados para determinar, por exemplo, fragmentos antigênicos, sequências líder, enovelamento de proteínas, domínios funcionais, sítios de glicosilação e alinhamentos de sequência estão disponíveis. Vide, por exemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690. Exemplo 2 Geração e humanização de anticorpos anti- IL-23p19 humana

[0145] Os anticorpos anti-IL-23p19 humana foram gerados pela imunização de camundongos nocauteados para IL-23p19 com IL-23 quimérica (p19 humano : p40 de camundongo). Os anticorpos monoclonais foram preparados por métodos padronizados.

[0146] A humanização dos domínios variáveis de anticorpo murino 13B8 (IgG1/kappa de camundongo) foi realizada essencialmente como descrito nas publicações de pedido de patente PCT WO 2005/047324 e WO 2005/047326.

[0147] Resumidamente, a sequência de aminoácido do domínio VH não humano do anticorpo 13B8 foi comparado a um grupo de cinco sequências de aminoácido de linhagem germinativa de VH humana; um representante dos subgrupos IGHV1 e IGHV4 e três representantes do subgrupo IGHV3. Os subgrupos de VH estão listados em M.-P. Lefranc (2001) "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavy (IGH) Genes", Experimental and Clinical Immunogenetics 18:100-116. O anticorpo 13B8 pontuou mais contra DP-14 de linhagem germinativa de cadeia pesada no subgrupo VH1.

[0148] A sequência de VL do anticorpo 13B8 é da subclasse kappa de VL. A sequência de aminoácido do domínio VL não humano foi comparado a um grupo de quatro sequências de aminoácido de linhagem germinativa de VL kappa humanos. O grupo de quatro é compreendido de um representante de cada um dos quatro subgrupos de VL humana estabelecidas listadas em V. Barbie & M.-P. Lefranc (1998) "The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments", Experimental and Clinical Immunogenetics 15:171-183 e M.-P. Lefranc (2001) "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experimental and Clinical Immunogenetics 18:161-174. Os quatro subgrupos também correspondem aos quatro subgrupos listados em Kabat et al. (1991 - 5a Ed.) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Departamento de Saúde e Serviços Humanos Americano, Pub. NIH 91-3242, pp. 103-130. O anticorpo 13B8 pontuou mais contra Z-012 de linhagem germinativa de cadeia leve humana no subgrupo VLkI.

[0149] Substituições de aminoácido adicionais foram feitas na CDRH2, como discutido supra e descritos nas SEQ ID NOs: 24-26. Os domínios variáveis de cadeia pesada e leve de 13B8 humanizados foram clonados em vetores que codificam um domínio constante de Y1 humano (IgG1) e um domínio constante de cadeia leve kappa, respectivamente. O anticorpo 13B8 humanizado resultante (IgG1/kappa) se liga a IL-23 humana e de macaco cinomolgo mas não a IL-12 humana, p40 humano ou IL-23 de camundongo.

[0150] Uma vez que as sequências de aminoácido alvo das cadeias pesada e leve variáveis são determinadas, podem ser gerados plasmídeos que codificam o anticorpo humanizado de extensão completa. As sequências de plasmídeos podem ser alteradas usando mutagênese de Kunkel (Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82:488-492) para alterar a sequência de DNA para as sequências de anticorpo humanizado alvo. Simultaneamente, pode ser realizada otimização de códon para fornecer expressão potencialmente ótima.

[0151] Formas humanizadas de outros anticorpos descritos aqui podem ser construídas por substituir arcabouços humanos descritos para o anticorpo 13B8 humanizado, ou por repetir o procedimento para seleção dos melhores arcabouços humanos pelos métodos descritos neste Exemplo. A substituição dos arcabouços humanos descritos aqui como parte do anticorpo humanizado 13B8 é o mais apropriado para anticorpos com sequências de CDR similares a 13B8. Exemplo 3

[0152] Determinação da Constante de Dissociação de Equilíbrio (Kd) para o anti-IL-23 humana humanizado usando a tecnologia de KinExA

[0153] A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) para anticorpos anti IL- 23 humana é determinada usando o instrumento KinExA 3000. Sapidyne Instruments Inc., Boise Idaho, USA. O KinExA usa o princípio do método de Ensaio de Exclusão Cinética que se baseia na medição da concentração de anticorpo não- complexado em uma mistura de anticorpos, antígeno e complexo anticorpo- antígeno. A concentração de anticorpo livre é medida por expor a mistura a um antígeno imobilizado em fase sólida por um período de tempo muito rápido. Na prática, isto é obtido por fazer fluir a mistura antígeno-anticorpo em fase de solução por partículas revestidas com antígeno aprisionadas em uma célula de fluxo. Os dados gerados pelo instrumento são analisados usando um programa padrão. As constantes de equilíbrio são calculadas usando uma teoria matemática baseada nas seguintes suposições: 1. A ligação segue a equação de ligação reversível para o equilíbrio: kon [Ab] [Ag] = koff[AbAg] 2. O anticorpo e o antígeno se ligam a 1:1 e o anticorpo total se iguala ao complexo antígeno-anticorpo mais o anticorpo livre. 3. O sinal do instrumento é relacionado de forma linear com a concentração de anticorpo livre.

[0154] Partículas de PMMA de 98 micrômetros, (Sapidyne, N° Cat 440198) são revestidas com IL-23 biotinilada de acordo com protocolo "Protocol for coating PMMA particles with biotinylated ligands having short or nonexistent linker arms" da Sapidyne. Neste experimento, a IL-23 biotinilada compreende um complexo de IL- 12p40 de camundongo e IL-23p19 humana. EZ-link TFP PEO-biotin (Pierce, N° Cat. 21219) é usado para fazer IL-23 biotinilada de acordo com as recomendações do fabricante (Boletim da Pierce 0874). Todos os procedimentos experimentais são feitos de acordo com o manual do KinExA 3000.

[0155] A ligação dos anticorpos anti-IL-23p19 é avaliada em um ensaio de ligação por competição, no qual os anticorpos são pré-incubados com IL-23 humana não-ligada (nativa) compreendendo duas cadeias ligadas por dissulfeto, p19 humano (SEQ ID NO: 47) e p40 humano (No. de acesso do GenBank P29460), em uma série de concentrações. As amostras resultantes compreendendo uma mistura de anticorpos não ligados e anticorpos ligados a IL-23, são então feitas fluir sobre as partículas de PMMA de rhIL-23 ("elastikine") descritas no parágrafo anterior. A quantidade de anticorpos capturados pelas partículas de PMMA é então detectada usando um anticorpo secundário marcado com fluorescência.

[0156] A tabela 3 mostra os resultados das análises de KinExA, incluindo determinações em replicata para cada anticorpo. Tabela 3 Valores de Kd Determinados por KinExA

Exemplo 4

[0157] Determinação da constante de dissociação de equilíbrio (Kd) para anticorpos humanizados anti-IL23p19 humana usando tecnologia BIAcore.

[0158] As determinações por BIAcore são realizadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 4 da Publicação de Pedido de Patente U.S comumente designada N° 2007/0048315. Resumidamente, os ligantes (mAbs anti- IL-23) são imobilizados em um chip sensor BIAcore CM5 usando procedimento de acoplamento de amina padronizado. A IL-23 é diluída em PBS para produzir várias concentrações. As constantes de cinética para as várias interações são determinadas usando o programa BIAevaluation 3.1. A Kd é determinada usando as constantes da taxa de dissociação e associação calculadas.

[0159] A tabela 4 fornece os valores de Kd conforme determinados por BIAcore, incluindo determinações em replicata. Determinação de Kd por BIAcore

Exemplo 5

[0160] Ensaios de proliferação para a avaliação de anticorpos anti-IL23 neutralizantes

[0161] A habilidade de um anticorpo monoclonal neutralizar biologicamente IL-23 foi avaliada pela aplicação de bioensaios de proliferação em curto prazo que empregam células que expressam receptores de IL-23 recombinantes. A linhagem celular transfectante IL-23R (Ba/F3-2.2lo-hIL-23R) expressa tanto hIL-23R como hIL- 12Rβ1, e responde tanto a IL-23 humana como IL-23 de macaco cinomolgo. As células Ba/F3-2.2lo transfectantes proliferam em resposta à IL-23 humana e a resposta pode ser inibida por um anticorpo anti-IL-23 neutralizante. Um anticorpo é titulado contra uma concentração de IL-23 escolhida dentro da região linear curva dose-resposta, próximo do platô e acima EC50. A proliferação, ou a falta da mesma, é medida por meios colorimétricos usando Alamar Blue, um corante indicador de crescimento baseado na detecção da atividade metabólica. A habilidade de um anticorpo neutralizar IL-23 é avaliada pelo seu valor de IC-50, ou a concentração do anticorpo que induz metade da inibição máxima da proliferação de IL-23.

[0162] Os transfectantes Ba/F3 são mantidos em meio RPMI-1640, 10% de soro fetal bovino 50 μM de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-Glutamina, 50 μg/mL de penicilina-estreptomicina, e 10 ng/mL de IL-3 de camundongo. Os bioensaios de proliferação de Ba/F3 são realizados em meio RPMI-1640, 10% de soro fetal bovino, 50 μM de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-Glutamina, e 50 μg/mL de penicilina- estreptomicina. Procedimento

[0163] Os ensaios são realizados em placas de 96 poços de fundo chato (Falcon 3072 ou similar) em 150 μL por poço. Os anticorpos anti-IL-23 são pré- incubados com IL-23 por 30 a 60 min, seguido pela adição de células e incubação por 40 a 48 horas. Alamar Blue (Biosource Cat #DAL1100) é adicionado deixado revelar por 5 a 12 horas. A absorbância é então lida a 570 nm e 600 nm (Leitor de Microplacas VERSAmax, Molecular Probes, Eugene, Oregon, EUA), e uma OD570-600 é obtida.

[0164] As células são então usadas em um estado de crescimento saudável, geralmente em densidades de 3 a 8 x 105/mL. As células são contadas, peletizadas, lavadas, duas vezes em meio de bioensaio, e suspensas para a densidade apropriada para plaqueamento. Uma resposta da dose de IL-23 é realizada usando diluições seriadas a 1:3 (25:50 μL em meio de bioensaio) de IL-23. Uma concentração de IL-23 de 3 ng/ml (50 pM) é selecionada para uso nos ensaios de anticorpo. Uma resposta da dose neutralizante de anticorpo também é realizada usando diluições seriadas a 1:3 (25:50 μL em meio de bioensaio).

[0165] Os valores de IC50 são determinados usando o programa GraphPad Prism® 3.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA), no qual a absorbância é plotada contra a concentração de citocina ou anticorpo e os valores de IC50 são determinados usando regressão não-linear (ajuste de curva) de dose- resposta sigmóide.

[0166] A tabela 5 mostra os valores de IC50 para o bloqueio da proliferação de célula Ba/F3 por anticorpos anti-IL-23p19. Os valores para determinações múltiplas estão incluídos para alguns anticorpos. Tabela 5

[0167] Valores de IC50 para bloqueio de proliferação de célula Ba/F3 por anticorpos anti-IL-23

Exemplo 6

[0168] Ensaio com Esplenócito de Camundongo para IL-23 Baseado na Produção de IL-17

[0169] A atividade biológica de anticorpos anti-IL-23p19 da presente invenção é avaliada usando o ensaio com esplenócito essencialmente como descrito por Aggarwal et al (2003) J. Biol. Chem. 278:1910 e Stumhofer et al (2006) Nature Immunol. 7:037. O ensaio com esplenócito de camundongo mede a atividade de IL- 23 em uma amostra como um nível da produção de IL-17 por esplenócitos de murino. A atividade inibitória de anticorpos anti-IL-23p19 é então avaliada pela determinação da concentração de anticorpo necessária para reduzir a atividade de IL-23 em uma dada amostra em 50% (a IC50). A IC50 como medida por esse ensaio é maior ou igual a constante de equilíbrio da dissociação (Kd), isto é, a Kd pode ser igual ou menor do que a IC50. Como sempre, valores inferiores de IC50 e Kd refletem atividades e afinidades superiores.

[0170] Resumidamente, os baços são obtidos de camundongos fêmeas C57BL/6J com 8 a 12 semanas de idade (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA). Os baços são triturados, peletizados duas vezes e filtrados através de um filtro celular (nylon, 70 μm). As células recuperadas são cultivadas em placas de 96 poços (4 X 105 células/poço) na presença de IL-23 humana (10 ng/ml, ~170 pM) e anticorpos anti-CD3e de camundongo (1 μg/ml) (BD Pharmingen, Franklin Lakes, New Jersey, USA), com ou sem o anticorpo anti-IL-23p19 a ser ensaiado. Anticorpos anti- IL-23p19 são adicionados em 10 μg/ml e em uma série de diluições de três vezes. As células são cultivadas por 72 horas, peletizadas e o sobrenadante é ensaiado quanto aos níveis de IL-17 por "sandwich ELISA".

[0171] ELISA para IL-17 é realizado como se segue. As placas são revestidas com um anticorpo de captura anti-IL-17 (100 ng/poço) durante a noite a 4°C, lavadas e bloqueadas. Amostras e modelos são adicionados e incubados por duas horas em temperatura ambiente com agitação. As placas são lavadas e um anticorpo de detecção biotinilado anti-IL-17 (100 ng/poço) é adicionado e incubado por uma hora em temperatura ambiente com agitação. Os anticorpos de captura e detecção são anticorpos diferentes que se ligam a IL-17 de camundongo mas não fazem bloqueio cruzado. As placas são lavadas e a detecção do anticorpo ligado é detectada usando estreptavidina-HRP (peroxidase de rábano silvestre) e TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina). A placa é então lida a 450-650 nm e a concentração de IL-17 nas amostras é calculada pela comparação com padrões.

[0172] Os valores de IC50 do ensaio com esplenócitos são fornecidos na Tabela 6, incluindo algumas determinações em duplicata. Tabela 6 IC50s de Ensaio com Esplenócito

Exemplo 7 Caracterização de uma Preparação de Anticorpo 13B8-b anti-IL-23p19

[0173] O anticorpo13B8-b humanizado anti-IL-23p19 é preparado a partir de células de mamífero usando um vetor que abriga sequencias de DNA que codificam as cadeias pesada e leve de 13B8-b, como fornecidas nas SEQ ID N° 49 e 50, respectivamente.

[0174] Hum13B8-b tem uma Kd de 297 pM para IL-23 humana quando ensaiada usando a análise BIAcore, essencialmente como descrita no Exemplo 4 (supra).

[0175] A atividade biológica de hum13B8-b é avaliada usando o ensaio de proliferação de Ba/F3, essencialmente como descrita no Exemplo 5 (supra), exceto que 340 pM de IL-23 são usados para estimular a proliferação, ao invés de 50 pM. A atividade inibitória de anticorpos anti-IL-23p19 (a IC50) é avaliada pela determinação da concentração de anticorpo necessária para reduzir a atividade de IL-23 em uma dada amostra em 50%. Como sempre, valores inferiores de IC50 refletem atividades superiores. Hum13B8-b exibe uma IC50 de 187 pM no ensaio de proliferação de Ba/F3.

[0176] A atividade biológica de hum13B8-b também é avaliada usando um ensaio com esplenócito humano, essencialmente como descrito no Exemplo 6 (supra), com a exceção de que os esplenócitos são obtidos de baços humanos ao invés de camundongos, nenhum anticorpo anti-CD3e é usado e que IFN-Y é lida ao invés de IL-17. O ensaio mede a atividade de IL-23 em uma amostra pela determinação do nível de produção de IFN-Y pelos esplenócitos primários humanos. Os esplenócitos humanos são expostos a IL-23 humana (170 pM) na presença de várias concentrações de anticorpo hum13B8-b anti-IL-23p19, ou na ausência do anticorpo. IFN-y é detectado por "sandwich ELISA". Hum13B8-b exibe uma IC50 de 59-144 pM no ensaio com esplenócito humano.

[0177] A atividade biológica de hum13B8-b é avaliada adicionalmente usando o ensaio de fosforilação KIT225 STAT-3, essencialmente como descrito em Parham et al. (2002) J. Immunol. 168:5699. Células KIT225 humanas, uma linhagem de célula T leucêmica, são estimuladas com 138 pM de IL-23 humana na presença de várias concentrações de anticorpo hum13B8-b anti-IL-23p19, ou na ausência do anticorpo. A atividade de IL-23 é medida pela detecção do nível de fosforilação de STAT3. Hum13B8-b exibe uma IC50 de 130 pM no ensaio com KIT225. Exemplo 8

[0178] Epitopo para o Anticorpo 13B8-b Humanizado Anti-IL-23p19

[0179] O epítopo para a ligação do anticorpo humanizado 13B8-b para IL- 23p19 humana (SEQ ID NO: 47) foi determinado por cristalografia com raio X. As coordenadas foram determinadas para um complexo de um fragmento Fab do anticorpo humanizado 13B8-b para IL-23p19 humana e IL-23 humana não ligada, que compreende as subunidades p19 e p40. A subunidade p40 na IL-23, usada para determinar a estrutura cristalina, tem uma substituição N222Q, na qual Asn222 é substituída por Gln. A sequência de IL-23p19 humana é encontrada na SEQ ID N° 47 e a sequência da forma madura de p40 de IL-12/IL-23 humanas é encontrada nos resíduos 23-328 do GenBank N° de Acesso P29460. O anticorpo humanizado 13B8- b para IL-23p19 humana compreende a cadeia pesada de 13B8-b humanizado (SEQ ID N° 7) e a cadeia leve de 13B8-b humanizado (SEQ ID N° 14). As condições de cristalização são polietileno glicol 4000 15%, acetato de sódio 60 mM, TRIS-HCl 100 mM (pH 8). Os cristais podem ser obtidos também com outros tampões em pH8 ou próximo de 8.

[0180] Resíduos de aminoácidos de IL-23 a 4,0 A de resíduos sobre o anticorpo 13B8-b incluem K20, T23, W26, S27, P30, E82, S95, L96, L97, P98, D99, P101, G103, Q104, H106, A107 e L110. Os resíduos adicionais L24, L85, T91, S100 e V102 estão a 5,0 A. Um resíduo de aminoácido sobre sobre IL-23p19 é considerado estar dentro de uma dada distância do anticorpo (por exemplo, 4,0 A ou 5,0 A) se as coordenadas de qualquer átomo do resíduo estiverem dentro da dada distância das coordenadas de qualquer átomo do anticorpo.

[0181] A maioria do mesmos resíduos contatados está dentro de dois aglomerados principais ao longo da estrutura primária de IL-23p19, com o primeiro aglomerado compreendendo os resíduos 20-30 (dos quais 6 de 11 resíduos estão dentro de 5,0 A do anticorpo e 5 de 11 estão dentro de 4,0 A) e o segundo aglomerado compreende os resíduos 82-110 (dos quais 16 de 29 resíduos estão dentro de 5,0 A do anticorpo e 12 de 29 estão dentro de 4,0 A). Esses aglomerados definem epítopos que compreendem fitas de 11 ou mais resíduos de aminoácidos contíguos de IL-23p19 dos quais 30%, 40%, 45%, 50% ou 54% ou mais dos resíduos estão dentro de 4,0 A ou 5,0 A do anticorpo.

[0182] Os anticorpos que se ligam a um ou ambos os aglomerados são esperados bloquear a ligação do anticorpo 13B8-b, e são esperados exibir atividades biológicas similares.

[0183] A Tabela 7 fornece uma breve descrição das sequências na listagem de sequência. Tabela 7 Identificadores de Sequência

Claims

1. Anticorpo que se liga a IL-23p19 humana CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) um domínio variável de cadeia leve do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que: CDRL1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 36; CDRL2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 41; e CDRL3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 46; e b) um domínio variável de cadeia pesada, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo CDRH1, CDRH2 e CDRH3, em que: CDRH1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 19; CDRH2 compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 24 a 26; e CDRH3 compreende a sequência de SEQ ID NO: 31

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que CDRH2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 24.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que CDRH2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 25.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que CDRH2 compreende a sequência de SEQ ID NO: 26.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio variável de cadeia leve, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende os resíduos 1 a 108 de SEQ ID NO: 14.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste nos resíduos 1 a 116 de SEQ ID NOs: 6 a 8.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que: a cadeia leve compreende a sequência de SEQ ID NO: 14; e a cadeia pesada compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6 a 8.

8. Anticorpo que se liga a IL-23 humana, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: um domínio variável de cadeia leve do anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo a sequência de resíduos 1 a 108 de SEQ ID NO: 14 ou uma variante da mesma; e um domínio variável de cadeia pesada do anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste nos resíduos 1 a 116 de SEQ ID NOs: 6 a 8 ou uma variante da mesma; em que cada variante compreende até 20 substituições de aminoácidos conservativamente modificados.

9. Anticorpo que se liga a IL-23 humana, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: um domínio variável de cadeia leve do anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que consiste essencialmente nas sequências dos resíduos 1 a 108 de SEQ ID NO: 14; e um domínio variável de cadeia pesada do anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que consiste essencialmente em uma sequência selecionada do grupo que consiste nos resíduos 1 a 116 de SEQ ID NOs: 6 a 8.

10. Anticorpo que se liga a IL-23 humana em um epítopo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende os resíduos 20 a 30 ou resíduos 82 a 110 de SEQ ID NO 47.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de ligação se liga a um epítopo que compreende os resíduos 20 a 30 e resíduos 82 a 110 de SEQ ID NO 47.

12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de ligação se liga a um epítopo que compreende os resíduos K20, T23, W26, S27, P30, E82, S95, L96, L97, P98, D99, P101, G103, Q104, H106, A107 e L110 de SEQ ID NO: 47.

13. Anticorpo CARACTERIZADO pelo fato de que é capaz de bloquear a ligação do composto de ligação, como definido na reivindicação 7, a IL-23 humana em um ensaio de bloqueio cruzado.

14. Ácido nucleico isolado CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um do domínio variável da cadeia leve ou domínio variável da cadeia pesada do anticorpo, como definido na reivindicação 1, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o domínio variável da cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 52 e a sequência de nucleotídeos que codifica o domínio variável da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 51.

15. Vetor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 14, operativamente ligado a sequências de controle que são reconhecidas por uma célula hospedeira microbiana quando a célula hospedeira é transfectada com o vetor.

16. Célula hospedeira microbiana CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 15.

17. Método de produção de um polipeptídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: cultivar a célula hospedeira microbiana, como definida na reivindicação 16, em um meio de cultura sob condições nas quais a sequência de ácido nucleico é expressa, produzindo assim polipeptídeos que compreendem os domínios variáveis de cadeia leve e pesada; e recuperar os polipeptídeos da célula hospedeira microbiana ou do meio de cultura.

18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de ligação é um fragmento de anticorpo selecionado dentre o grupo que consiste em Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 e um diacorpo.

19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é para suprimir uma resposta imune em um indivíduo.

20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a resposta imune é uma resposta inflamatória.

21. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um distúrbio selecionado dentre o grupo que consiste em artrite, psoríase e doença inflamatória do intestino.

22. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a resposta imune é uma resposta autoimune.

23. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um distúrbio selecionado dentre o grupo que consiste em esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico e diabetes.

24. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem câncer e a resposta imune é uma resposta Th17.

25. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido na reivindicação 1, em combinação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um agente imunossupressor ou anti-inflamatório.