BRPI0720282B1

BRPI0720282B1 - Construção proteica, composição farmacêutica, e, kit

Info

Publication number: BRPI0720282B1
Application number: BRPI0720282-2A
Authority: BR
Inventors: Michel Canavaggio (Falecido); Peter Turecek; Juergen Siekmann; Friedrich Scheiflinger
Original assignee: Baxalta Incorporated; Baxalta GmbH
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2021-03-30
Also published as: HK1198172A1; EP2532369B1; EP2532369A3; US20080221032A1; DK2101821T3; CA2670618A1; EP2101821B1; WO2008074032A1; US10251941B2; JP2017141305A; EP2101821A1; JP2010512753A; US20160129121A1; PT2101821E; CN101557830B; BRPI0720282B8; CN101557830A; ES2521490T3; US20110064714A1; US20140186323A1

Abstract

construção proteica, composição farmacêutica, método para controlar sangramento em um mamífero, e, kit a presente invenção refere-se a uma construção de proteica, compreendendo fator viia (f vha) recombinante ou seus derivados biologicamente ativos, que são ligados a uma porção carboidrato compreendendo 1 - 4 unidades de ácido siálico, em que a meia-vida in vivo da construção proteica é substancialmente prolongada no sangue de um mamífero, em comparação com a meia-vida in vivo de uma molécula fviia não ligada a uma porção carboidrato. a invenção também fornece um método para controlar o sangramento de um mamífero tendo um distúrbio de sangramento, devido a defeitos ou deficiências funcionais de fviia, fviii ou fix. a invenção também fornece um método para controlar sangramento em um mamífero durante cirurgia ou trauma.

Description

REFERÊNCIA A PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. No. 60/875.217, depositado em 15 de dezembro de 2006.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a uma construção proteica compreendendo o fator de coagulação VIIa (FVIIa) sendo ligado a uma porção carboidrato compreendendo uma cadeia de 1 - 4 unidades de ácido siálico. Além disso, a presente invenção refere-se a métodos para prolongar a meia-vida IN VIVO de proteínas de coagulação do sangue, especialmente FVIIa, no sangue de um mamífero tendo um distúrbio de sangramento associado com defeitos ou deficiências funcionais de pelo menos FVIIa, fator VIII (FVIII) e fator IX (FIX).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] A cascata de coagulação sanguínea é dividida em três distintos segmentos: intrínseco, extrínseco e trajetos comuns (Schenone et al., Curr Opin Hematol. 2004;11:272-7). A cascata envolve uma série de enzimas de serina protease (zimogênios) e cofatores de proteína. Quando necessário, um precursor de zimogênio inativo é convertido na forma ativa, que consequentemente converte a próxima enzima da cascata.

[004] O trajeto intrínseco requer os seguintes fatores de coagulação VIII, IX, X, XI e XII. A iniciação do trajeto intrínseco ocorre quando precalicreína, cininogênio de elevado peso molecular, fator XI (FXI) e fator XII (FXII) são expostos a uma superfície negativamente carregada. Também necessários são íons de cálcio e fosfolipídeos secretados de plaquetas.

[005] O trajeto extrínseco é iniciado quando o lúmen vascular dos vasos sanguíneos é danificado. O fator de tecido da glicoproteína da membrana é exposto e então liga-se ao fator VII (FVII) circulante e a pequenas quantidades preexistentes de sua forma FVIIa ativada. Esta ligação facilita a conversão total de FVII em FVIIa e, subsequentemente, na presença de cálcio e fosfolipídeos, a conversão do fator IX (FIX) em fator IXa (FIXa) e fator X (FX) em fator Xa (FXa). A associação de FVIIa com o fator de tecido aumenta a atividade proteolítica, ao trazer os sítios de ligação de FVII para o substrato (FX e FIX) em mais estreita proximidade, e ao induzir uma mudança conformacional, que aumenta a atividade enzimática de FVIIa. A taxa de ativação de FX pelo trajeto extrínseco é de aproximadamente 50 vezes mais lenta do que a taxa obtida pelo trajeto (intrínseco) de FIXa, FVIIIa, fosfolipídeo e íons cálcio.

[006] A ativação de FX é o ponto comum dos dois trajetos. Juntamente com fosfolipídeo e cálcio, os fatores Va (FVa) e Xa convertem protrombina em trombina (complexo de protrombinase), que então cliva fibrinogênio para formar monômeros de fibrina. Os monômeros polimerizam- se para formar filamentos de fibrina. O Fator XIIIa (FXIIIa) liga covalentemente estes filamentos entre si, para formar uma malha rígida.

[007] A conversão de FVII em FVIIa é também catalisada por numerosas proteases, incluindo trombina, FIXa, FXa, fator XIa (FXIa) e fator XIIa (FXIIa). Para inibição da fase inicial da cascata, o inibidor do trajeto de fator de tecido alveja o complexo FVIIa/fator de tecido/produto FXa.

[008] FVII (também conhecido como fator estável ou proconvertina) é uma glicoproteína de serina protease dependente da vitamina K, com um papel pivotal na hemostase e coagulação (Eigenbrot, Curr Protein Pept Sci. 2002;3:287-99).

[009] FVII é sintetizado no fígado e secretado como uma glicoproteína de cadeia simples de 48 kD. FVIIa compartilha com todas as glicoproteínas de protease serina dependentes da vitamina K uma estrutura de domínio de proteína similar, consistindo de um domínio de ácido gama- carboxiglutâmico Gla) de terminal amino, com 9 - 12 resíduos responsáveis pela interação da proteína com membranas lipídicas, um domínio de serina protease de terminal carbóxi (domínio catalítico) e dois domínios semelhantes a fator de crescimento epidérmico, contendo um sítio de ligação de íon cálcio, que medeia a interação com o fator de tecido.

[0010] A gama-glutamil carboxilase catalisa a carboxilação dos resíduos Gla na parte terminal-amino da molécula. A carboxilase é dependente de uma forma reduzida de vitamina K para sua ação, que é oxidada na forma peróxido. A vitamina K epóxido redutase é necessária para converter a forma epóxido da vitamina K de volta à forma reduzida.

[0011] A proporção principal de FVII circula no plasma na forma de zimogênio e a ativação desta forma resulta em clivagem da ligação peptídeo entre a arginina 152 e isoleucina 153. O FVIIa ativado resultante consiste de uma cadeia leve derivada de NH2 (20 kD) e uma cadeia pesada derivada do terminal COOH (30 kD) ligada via uma única ligação dissulfeto (Cys 135 a Cys 262). A cadeia leve contém o domínio Gla de ligação de membrana, enquanto a cadeia pesada contém o domínio catalítico.

[0012] A concentração de plasma de FVII, determinada pelos fatores genético e ambiental, é de cerca de 0,5 mg/ml (Pinotti et al., Blood. 200; 95 : 3423 - 8). Diferentes genótipos FVII podem resultar em diversas diferenças nos níveis médios de FVII. Os níveis de FVII do plasma são elevados durante a gravidez em fêmeas saudáveis e também aumentam com a idade e são mais elevados em fêmeas e em pessoas com hipertrigliceridemia. O FVII tem a meia vida mais curta de todos os fatores procoagulantes (3 - 6 h). A concentração média do plasma de FVIIa é de 3,6 ng/ml em indivíduos saudáveis e a meia-vida circulante de FVIIa é relativamente longa (2,5 h), comparada com a de outros fatores de coagulação.

[0013] A deficiência hereditária de FVII é um raro distúrbio de sangramento recessivo autossomal, com uma prevalência estimada como sendo 1 caso por 500.000 pessoas na população geral (Acharya et al., J Thromb Haemost 2004;2248 - 56). A deficiência adquirida de FVII de inibidores é também muito rara. Casos foram também relatados com a deficiência ocorrendo em associação com medicamentos tais como cefalosporinas, penicilinas e anticoagulantes orais. Além disso, a deficiência de FVII adquirida foi relatada ocorrer espontaneamente ou com outras condições, tais como mieloma, sépse, anemia aplástica, com terapia de interleucina-2 e globulina antitimócita.

[0014] A terapia de substituição é um apoio principal no tratamento de pacientes com deficiência de FVII (Mariani et al., Semin Hematol. 2006;43 (Suppl l):S42 - 7). Isto tem tradicionalmente sido conseguido usando-se plasma congelado fresco (FFP), concentrados de complexo de protrombina (PCCs) ou concentrados de FVII derivados de plasma. Entretanto, o FVIIa recombinante (rFVIIa) é agora largamente usado para terapia nestes pacientes.

[0015] O rFVIIa foi também desenvolvido para tratamento de sangramento em pacientes dom hemofilia A e B com inibidores e foi constatado induzir hemostase, mesmo durante cirurgia maior, tal como cirurgia ortopédica maior (Hedner, J Biotechnol. 2006; 124:747 - 57). RFVIIa está sendo produzido em culturas de células BHK e tem mostrado ser muito similar ao FVIIa derivado de plasma. O uso de rFVIIa em tratamento de hemofilia é baseado na ligação de baixa afinidade do FVIIa com a superfície de plaquetas ativadas por trombina. Pela administração de doses farmacológicas de rFVIIa exógeno, a geração de trombina na superfície de plaquetas no sítio da lesão é aumentada independentemente da presença do FVIII/FIX. Como resultado da aumentada e rápida formação de trombina, um tampão hemostático de fibrina estanque está sendo formado.

[0016] Embora originalmente desenvolvidas para o tratamento de deficiência de FVII e hemofilia A e B complicada por inibidor, novas indicações para rFVIIa (baseadas em relatos de casos e menores experimentos clínicos) incluem o uso em pacientes com doença de fígado, trombocitopenia ou disfunção plaquetária qualitativa e em pacientes sem distúrbios de coagulação, que estão sangrando como resultado de extensa cirurgia ou trauma maior.

[0017] Os medicamentos de polipeptídeo terapêuticos, tais como proteína de coagulação sanguínea, incluindo FVIIa, são rapidamente degradados pelas enzimas proteolíticas e neutralizados por anticorpos. Isto reduz sua meia-vida e tempo de circulação, desse modo limitando sua eficácia terapêutica. Doses relativamente elevadas e frequente administração são necessárias para alcançar e sustentar o desejado efeito terapêutico ou profilático de FVIIa. Como consequência, regulação de dose adequada é difícil de obter-se e a necessidade de frequentes administrações intravenosas impõe restrições no meio de vida do paciente. Assim, uma melhorada molécula de FVIIa, com uma mais longa meia-vida de circulação, diminuiria o número de administrações necessárias.

[0018] Principalmente, há quatro opções gerais para extensão de meia- vida de proteínas na circulação sanguínea: • Direta modificação química ou enzimática • Uso de moléculas veículo, para proteger as proteínas da circulação • Construção de mutantes para estender a meia-vida • Modificação do trajeto de degradação.

[0019] A presente invenção mostra uma melhoria das proteínas de coagulação sanguínea, especialmente a molécula de FVIIa, por modificação química. Para modificação química de polipeptídeos terapêuticos, diversas abordagens foram usadas no passado.

[0020] A PEGuilação de medicamentos de polipeptídeos protege-os e melhora seus perfis farmacodinâmico e farmacocinético (Harris e Chess, Nat Rev Drug Discov. 2003;2: 214 - 21). O processo de PEGuilação liga as unidades repetidoras de polietileno glicol (PEG) em um medicamento de polipeptídeo. As moléculas de PEG têm um grande volume hidrodinâmico (5 - 10 vezes o tamanho das proteínas globulares), são altamente solúveis em água e hidratadas, muito móveis, não tóxicas, não imunogênicas e rapidamente depurada do corpo. A PEGuilação de moléculas pode resultar em aumentada resistência dos medicamentos à degradação enzimática, aumentada meia-vida IN VIVO, reduzida frequência de dosagem, diminuída imunogenicidade, aumentadas estabilidades física e térmica, aumentada solubilidade, aumentada estabilidade em líquido e reduzida agregação. Os primeiros medicamentos PEGuilados foram aprovados pela FDA no início da década de 90. No ínterim, o FDA aprovou diversos medicamentos PEGuilados para administração oral, injetável e tópica.

[0021] A tecnologia da GlicoPEGuilação(TM) inclui métodos que suprem um conjugado de peptídeo entre um polímero PEG e um peptídeo, com o PEG covalentemente ligado ao peptídeo via um grupo de ligação glicosila intacto.

[0022] Os lipossomas têm sido usados para encapsular uma variedade de moléculas, tais como medicamentos de DNA, RNA antissentido, antibióticos, anti-câncer e anti-fúngicos, inibidores/ativadores, anticorpos (imunolipossomas) e antígenos (para vacinas).

[0023] Os fosfolipídeos podem também ser conjugados com PEGs (PEG-lipossoma), por exemplo, via uma ligação amida, fosfatidiletanolamina (PE) de soja carbóxi-PEG e purificada, ésteres e derivados de carbamatos, o derivado de carbamato sendo o mais largamente usado hoje em dia (Patente US No. 6.593.294). Os pesos moleculares dos PEG’s mais comumente usados são 2000 e 5000, porém são também usados PEG’s variando de 600 a 12,000.

[0024] As proteínas substituídas por monossacarídeo ácidos foram primeiro descritas na Patente US No. 3.847.890. Nesta patente, os monossacarídeos ácidos, isto é, ácido n-acetilneuramínico e gliconato foram substituídos nos grupos α-amino ou ε-amino da insulina, hormônio do crescimento humano ou albumina, para reduzir a antigenicidade dos polipeptídeos.

[0025] O ácido polissiálico (PSA), também referido como ácido colomínico (CA), é um polissacarídeo naturalmente ocorrente. É um homopolímero do ácido N-acetilneuramínico com ligação α(2 ^ 8) cetosídica e contém grupos diol vicinais em sua extremidade não-redutora. É negativamente carregado e um constituinte natural do corpo humano. Ele pode ser facilmente produzido de bactérias em grandes quantidades e com características físicas predeterminadas (Patente US No. 5.846.951). Sendo química e imunologicamente idêntico ao ácido polissiálico no corpo humano, o ácido polissiálico bacteriano não é imunogênico, mesmo quando acoplado a proteínas. Diferente de outros polímeros (p. ex., PE), o ácido polissiálico é biodegradável. O acoplamento covalente do ácido colomínico, a catalase e asparaginase resulta em um aumento da estabilidade da enzima, na presença de enzimas proteolíticas ou plasma sanguíneo. Estudos comparativos IN VIVO com asparaginase polissialilada e não modificada revelaram que a polissialilação aumentava a meia-vida da enzima (Fernandes e Gregoriadis, Int J Pharm. 2001 ;217:215-24)

[0026] Entretanto, até hoje nenhum composto terapêutico, consistindo de um polipeptídeo conjugado com um monossacarídeo ácido, como descrito na Patente US No. 3.847.890, é catalisador de deslocamento. Ao contrário, a Patente US No. 5.846.951 mostra que a parte polissacarídea do composto deve ter pelo menos 5 e, em outras formas de realização, pelo menos 20 ou 50 resíduos de ácido siálico na cadeia polimérica. Em razão de os polissacarídeos serem usualmente produzidos em bactérias contendo o risco inerente de copurificar endotoxinas, a purificação das longas cadeias poliméricas de ácido siálico pode aumentar a probabilidade de aumentado teor de endotoxina.

[0027] As moléculas de PSA curtas, com 1 - 4 unidades de ácido siálico, podem também ser sinteticamente preparadas (Kang et al., Chem Commun. 2000; 227 - 8; Ress and Linhardt, Current Organic Synthesis. 2004; 1: 31 - 46), assim minimizando o risco de altos níveis de endotoxina.

[0028] O WO 98/32466A1 sugere que FVII, entre muitas outras proteínas, pode ser PEGuilado, porém não contém quaisquer exemplos de trabalho suportando a revelação.

[0029] O WO 01/58935A3 mostra conjugados compreendendo pelo menos uma porção não polipeptídeo covalentemente ligado a um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo difere daquela do FVII ou FVIIa tipo selvagem, pelo fato de que pelo menos um resíduo de aminoácido, compreendendo um grupo de ligação para dita porção não-polipeptídeo, foi introduzido ou removido. Para as porções não- polipeptídeo especialmente PEG foi sugerido.

[0030] US20050113565A1 descreve um película FVII ou polipeptídeo relacionado com FVII, em que o polipeptídeo compreende uma ou mais cadeias de oligossacarídeo ligada por asparagina e/ou ligada por serina e em que pelo menos um de ditos grupos de oligossacarídeo é covalentemente ligado a pelo menos um grupo polimérico (PEG, “glicoPEGuilação”).

[0031] Assim, permanece uma necessidade na técnica de composições e métodos que supram preparações de proteína de coagulação, compreendendo polipeptídeo aperfeiçoado derivado de plasma ou rFVII, FVII modificado ou relacionado com FVII.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0032] A presente invenção fornece uma construção proteica compreendendo o fator VIIa (FVIIa) plasmático ou recombinante ou seus derivados biologicamente ativos, dito FVIIa ou ditos seus derivados biologicamente ativos sendo ligados a uma cadeia de 1 - 4 unidades de ácido siálico, em que a meia-vida IN VIVO da construção proteica é substancialmente prolongada no sangue de um mamífero, particularmente um humano, em comparação com FVIIa ou seus derivados sem uma cadeia de 1 - 4 unidades de ácido siálico. Adicionalmente, as composições farmacêuticas contendo dita construção proteica, bem como métodos para prolongar a meia-vida IN VIVO de FVIIa no sangue de um mamífero, tendo um distúrbio de sangramento associado com defeitos ou deficiências funcionais de pelo menos um de FVIIa, FVIII e FIX, empregando dita construção proteica, são providos de acordo com a presente invenção. A construção proteica da invenção pode também ser administrada para controlar o sangramento, no caso de trauma ou cirurgia em um mamífero com níveis normais de fatores de coagulação.

[0033] Em uma forma de realização da invenção, uma construção proteica é provida compreendendo (a) um fator ativado VII (FVIIa), molécula selecionada do grupo consistindo de FVIIa plasmático, FVIIa recombinante (rFVIIa) e um derivado biologicamente ativo de FVIIa; e (b) pelo menos uma porção carboidrato fisiologicamente aceitável, compreendendo 1 - 4 unidades de ácido siálico ligadas a dita molécula de FVIIa; em que a meia-vida IN VIVO de dita construção é prolongada no sangue de um mamífero, em comparação com a meia-vida IN VIVO de uma molécula FVIIa que não seja ligada a dita porção carboidrato.

[0034] Em outra forma de realização da invenção, a construção proteica supracitada é provida em que a meia-vida IN VIVO de dita construção é aumentada em pelo menos um fator de cerca de dois, em comparação com a meia-vida IN VIVO de uma molécula FVIIa, que não é ligada a dita porção carboidrato. Em outra forma de realização, a construção proteica supracitada é provida em que a meia-vida IN VIVO de dita construção á aumentada em pelo menos um fator de cerca de três, em comparação com a meia-vida IN VIVO de uma molécula FVIIa que não é ligada a dita porção carboidrato. Em ainda outra forma de realização, a construção proteica supracitada é provida em que a porção carboidrato fisiologicamente aceitável é diretamente ligada covalentemente a pelo menos um resíduo de aminoácido de dita molécula FVIIa.

[0035] Em ainda outra forma de realização da invenção, a construção proteica supracitada é provida em que a porção carboidrato fisiologicamente aceitável não é covalentemente ligado a pelo menos um resíduo de aminoácido de dita molécula FVIIa. Em ainda outra forma de realização, a construção proteica supracitada é provida em que dita porção carboidrato fisiologicamente aceitável é um ácido polissiálico ou um seu derivado.

[0036] Em uma forma de realização da invenção, uma composição farmacêutica é provida compreendendo uma quantidade eficaz da construção proteica supracitada e um ou mais compostos selecionados do grupo consistindo de um veículo, diluente, sal, tampão e excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0037] Em outra forma de realização da invenção, é provido um método para controlar o sangramento em um mamífero tendo um distúrbio de sangramento associado com defeitos ou deficiências funcionais de pelo menos um de FVIIa, FVIII e FIX, compreendendo administrar a supracitada construção proteica. Em ainda outra forma de realização, é provido um método para controlar o sangramento em um mamífero durante cirurgia ou trauma, compreendendo administrar a supracitada construção proteica.

[0038] Em ainda outra forma de realização da invenção, é provido um kit compreendendo uma quantidade eficaz da construção proteica supracitada, acondicionada em um recipiente, em que o kit opcionalmente contém um segundo agente terapêutico, e compreendendo ainda um rótulo fixado ao ou acondicionado com o recipiente, o rótulo descrevendo o conteúdo do recipiente e fornecendo indicações e/ou instruções referentes ao uso do conteúdo do recipiente, para controlar sangramento em um mamífero. Em ainda outra forma de realização, é provido o kit supracitado em que o recipiente é um frasco ou garrafa ou seringa pré-enchida.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0039] Deve ser entendido que esta invenção não é limitada às porções FVII descritos aqui. Em um aspecto da presente invenção, que refere-se a uma construção proteica compreendendo um membro da cascata de coagulação sanguínea, FVIIa plasmático (isto é, derivado de plasma) e/ou recombinante ou seus derivados biologicamente ativos (a seguir também designado como “conjugado-PSA-FVIIa”), dito FVII ou ditos seus derivados biologicamente ativos sendo ligado a uma a quatro porções de ácido siálico, em que a meia- vida IN VIVO de dito FVIIa ou ditos seus derivados biologicamente ativos é prolongada no sangue de um mamífero. Como aqui usada, a expressão “construção proteica” refere-se a uma molécula de fator VII ativado (FVIIa), selecionada do grupo consistindo de FVIIa plasmático, FVIIa recombinante (rFVIIa) e um derivado biologicamente ativo de FVIIa; e (b) pelo menos uma porção carboidrato fisiologicamente aceitável, compreendendo 1 - 4 unidades de ácido siálico ligadas a dita molécula de FVIIa. Como aqui usado, o termo “plasmático” refere-se a um “derivado de plasma”.

POLIPEPTÍDEOS FVIIa E POLINUCLEOTÍDEOS

[0040] As moléculas FVIIa, úteis para a presente invenção, incluem a proteína de comprimento total, precursores da proteína, subunidades biologicamente ativas ou funcionais ou fragmentos da proteína e seus derivados funcionais. Referência a FVIIa inclui todas as formas potenciais de tais proteínas.

[0041] De acordo com a presente invenção, a expressão “Fator VIIa recombinante” (rFVIIa) não subjaz uma restrição específica e pode incluir qualquer rFVIIa, heterólogo ou naturalmente ocorrente, obtido via tecnologia de DNA recombinante, ou um seu derivado biologicamente ativo. Em certas formas de realização, a expressão abrange proteínas e ácidos nucleicos, p. ex., gene, pré-mRNa, mRNA e polipeptídeos, variantes polimorficas, alelos, mutantes e homólogos interespécies que: (1) têm uma sequência de aminoácido que tem mais do que cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácido, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% maior identidade de sequência de aminoácido, em uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 300, 400, ou mais aminoácidos (até à sequência de comprimento total de 406 aminoácidos para a proteína madura), a um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico referenciado ou uma sequência de aminoácido descrita aqui; (2) especificamente ligam-se a anticorpos, p. ex., anticorpos policlonais, erguidos contra um imunógeno compreendendo uma sequência de aminoácido referenciada como descrito aqui, seus fragmentos imunogênicos e suas variantes conservativamente modificadas; (3) especificamente hibridizam sob condições de hibridização rigorosas em um ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácido referenciada, como descrito aqui e suas variantes conservativamente modificadas; (4) têm uma sequência de ácido nucleico que tem mais do que cerca de 95%, mais do que cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade de sequência de nucleotídeo, em uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000, ou mais nucleotídeos (até a sequência de comprimento total de 1218 nucleotídeos da proteína madura), a uma sequência de ácido nucleico de referência como descrito aqui.

[0042] Como aqui usado, “FVIIa endógeno” inclui FVIIa que se origina de dito mamífero. Ele também inclui FVIIa transcrito de um transgene ou qualquer outro DNA estranho presente em dito mamífero. Como aqui usado, “FVIIa exógeno” inclui FVIIa que não se origina de dito mamífero.

[0043] Polipeptídeos variantes (ou análogos) incluem variantes de inserção, em que um ou mais resíduos de aminoácido suplementam uma sequência de aminoácido de FVIIa. As inserções podem ser localizadas em um ou outro ou em ambos os términos da proteína ou podem ser posicionadas dentro das regiões internas da sequência de aminoácido de FVIIa. As variantes de inserção, com resíduos adicionais em um ou outro ou em ambos os términos, podem incluir, por exemplo, proteínas de fusão e proteínas incluindo etiquetas ou rótulos aminoácidos incluindo proteínas. Por exemplo, a molécula FVIIa pode opcionalmente conter um terminal-N Met, especialmente quando a molécula é expressa recombinantemente em uma célula bacteriana, tal como E. COLI.

[0044] Em variações de deleções, um ou mais resíduos de aminoácido de um polipeptídeo de FVIIa são removidos. As deleções podem ser realizadas em um ou ambos os términos do polipeptídeo FVIIa ou com remoção de um ou mais resíduos dentro da sequência de aminoácido de FVIIa. As variantes de deleções, portanto, incluem todos os fragmentos de uma sequência de polipeptídeo de FVIIa.

[0045] Nas variantes de substituição, um ou mais resíduos de aminoácido de um polipeptídeo de FVIIa são removidos e substituídos por resíduos alternativos. Em um aspecto, as substituições são conservativas por natureza e as substituições conservativas destes tipos são bem conhecidas na técnica. Alternativamente, a invenção abrange substituições que são também não-conservativas. Substituições conservativas exemplares são descritas em Lehninger, [Biochemistry, 2a. Edição; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp. 71 - 77] e expostas imediatamente abaixo. SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS

[0046] Alternativamente, substituições conservativas exemplares são expostas imediatamente abaixo.

[0047] Uma sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo é tipicamente de um mamífero incluindo mas não limitado a primata,, p. ex., humano; roedor, p. ex., rato, camundongo, hamster; vaca, porco, cavalo, carneiro ou qualquer mamífero. Os ácidos nucleicos e proteínas da invenção podem ser moléculas recombinantes (p. ex., heterólogas e codificando a sequência tipo selvagem ou uma sua variante, ou não naturalmente ocorrente). Referência a sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo incluem, p. ex., GenBank Accession Nos. J02933 para a sequência genômica, M 13232 para o cDNA (Hagen et al. PNAS 1986; 83: 2412-6) e P08709 para a sequência de polipeptídeo (referências incorporadas aqui em sua totalidade). Uma variedade de polimorfismos de FVII foram descritas, por exemplo, vide Sabater_Lleal et al. (Hum Genet. 2006; 118:741-51) (referência incorporada aqui em sua totalidade).

[0048] Como aqui usado, “derivado biologicamente ativo” ou “variante biologicamente ativa” inclui qualquer derivado ou variante de uma molécula tendo substancialmente as mesmas propriedades funcionais e/ou biológicas de dita molécula, tais como propriedades de ligação e/ou a mesma base estrutural, tal como uma cadeia principal peptídica ou uma unidade polimérica básica.

[0049] Como aqui usado, “FVIIa derivado de plasma” ou “plasmático” inclui todas as formas de proteína encontradas no sangue obtido de um mamífero, tendo a propriedade de ativar o trajeto de coagulação.

[0050] Como aqui usado, “FVIIa recombinante” inclui rFVIIa obtido via tecnologia de DNA recombinante. Pode ser produzido por qualquer método conhecido na técnica. Um exemplo específico é descrito na Patente US No. 4.784.950. Um exemplo de tal rFVIIa é NovoSeven manufaturado e vendido por Novo Nordisk. PRODUÇÃO E EXPRESSÃO DE FVIIa

[0051] A produção de rFVIIa pode incluir qualquer método conhecido na técnica para (i) a produção de DNA recombinante por engenharia genética, p. ex., via transcrição inversa de RNA e/ou amplificação de DNA, (ii) introdução de DNA recombinante dentro de células procarióticas ou eucarióticas por transfecção, p. ex., via eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivo de ditas células transformadas, p. ex., em uma maneira contínua ou em batelada, (iv) expressão de rFVIIa, p. ex., constitutivamente ou na indução e (v) isolamento de dito FVIIa, p. ex., do meio de cultura ou por colheita das células transformadas, a fim de (vi) obter-se um rFVIIa purificado, p. ex., via cromatografia de troca de ânion ou cromatografia de afinidade.

[0052] O rFVIIa pode ser produzido por expressão em um sistema hospedeiro procariótico ou eucariótico adequado, caracterizado pela produção de uma molécula de rFVIIa farmacologicamente aceitável. Exemplos de células eucarióticas são células de mamíferos, tais como CHO, COS, HEK 293, BHK, SI-Hep e HepG2. Não há limitação particular aos reagentes ou condições usados para produzir ou isolar rFVIIa de acordo com a presente invenção e qualquer sistema conhecido na técnica ou catalisador de deslocamento pode ser empregado.

[0053] Uma larga variedade de vetores pode ser usada para a preparação do rFVIIa e pode ser selecionada de vetores de expressão eucarióticos e procarióticos. Exemplos de vetores para expressão procariótica incluem plasmídeos tais como pRSET, pET, pBAD etc., em que os promotores usados em vetores de expressão procarióticos incluem lac, trc, trp, recA, araBAD etc. Exemplos de vetores para expressão eucariótica incluem: (i) para expressão em levedura, vetores tais como pAO, pPIC, pYES, pMET, empregando-se promotores tais como AOX1, GAP, GAL1, AUG1 etc.; (ii) para expressão em células de insetos, vetores tais como pMT, pAc5, pIB, pBAC etc., usando-se promotores tais como pH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh etc. e (iii) para expressão em células de mamíferos, vetores tais como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV etc. e vetores derivados de sistemas virais, tais como vírus vaccínia, vírus adeno-associado, vírus do herpes, retrovírus etc., empregando-se promotores tais como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, e β- actina. ÁCIDO SIÁLICO

[0054] Como aqui usado, “porções ácido siálico” incluem monômeros de ácido siálico ou polímeros que são solúveis em uma solução ou suspensão aquosa e não têm impacto negativo, tal como efeitos colaterais, em mamíferos na administração do conjugado-PSA-FVIIa em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. Não há limitação particular para a unidade de ácido siálico usada de acordo com a presente invenção. Os polímeros são caracterizados, em um aspecto, como tendo de 1 a 4 unidades. Diferentes unidades de ácido siálico podem ser também combinadas em uma cadeia.

[0055] As porções ácido siálico podem ser ligadas a FVIIa, por exemplo, pelo método descrito na Patente US No. 4.356.170, que é aqui incorporada por referência. Em uma forma de realização da invenção, o composto polissacarídeo pode ser um polissacarídeo naturalmente ocorrente, um derivado de um polissacarídeo naturalmente ocorrente ou um derivado de polissacarídeo naturalmente ocorrente. Geralmente, todos os resíduos sacarídeos do composto são resíduos de ácido siálico.

[0056] Outras técnicas para acoplar PSA a polipeptídeos são também conhecidas. Por exemplo, a Publicação U.S. No. 2007/0282096 descreve a conjugação de uma amina ou derivado hidrazida de, p. ex., PSA, com proteínas. Além disso, a Publicação US 2007/0191597 descreve derivados de PSA contendo um grupo aldeído para reação com substratos (p. ex., proteínas) na extremidade do terminal de redução.

[0057] Em uma forma de realização da invenção, a parte do ácido polissiálico do composto polissacarídeo é altamente hidrofílica e, em outra forma de realização, o inteiro composto é altamente hidrofílico. A hidrofilicidade é conferida principalmente pelos grupos carboxila pendentes das unidades de ácido siálico, bem como os grupos hidroxila. A unidade sacarídea pode conter outros grupos funcionais, tais como grupos amina, hidroxila ou sulfato ou suas combinações. Estes grupos podem estar presentes em compostos sacarídeos naturalmente ocorrentes ou introduzidos dentro de composto polissacarídeos derivados.

[0058] Os compostos polissacarídeos de particular uso para a invenção são aqueles produzidos por bactérias. Alguns destes polissacarídeos naturalmente ocorrentes são conhecidos como glicolipídeos. É particularmente vantajoso se os compostos polissacarídeos forem substancialmente livres de unidades de galactose terminais, que tendem a ser reconhecidas pelos receptores de galactose de hepatócitos e células de Kupffer. LIGAÇÃO

[0059] FVIIa pode ser covalentemente ligado aos compostos polissacarídeos por qualquer uma de várias técnicas conhecidas daqueles hábeis na técnica. Vários exemplos são identificados na coluna 7, linha 15, à coluna 8, linha 5 da Patente US No. 5.846.951.

[0060] Exemplos incluem a ligação através da ligação peptídeo entre um grupo carboxila de um de FVIIa ou polissacarídeo e um grupo amina do outro, ou uma ligação éster entre um grupo carboxila de um e um grupo hidroxila do outro. Outra ligação pela qual o ingrediente ativo, p. ex., FVIIa, poderia ser covalentemente ligado ao composto polissacarídeo é via uma base de Schiff, entre um grupo amino livre do ingrediente ativo sendo reagido com um grupo aldeído formado na extremidade não redutora do polímero por oxidação de periodato (Jennings e Lugowski, J Immunol. 1981 ;127: 1011-8; Fernandes e Gregoriadis, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341 ;26-34). A base Schiff gerada pode ser estabilizada por redução específica com NaCNBH3, para formar uma amina secundária. Uma abordagem alternativa é a geração de grupos amino livres terminais do ácido polissiálico (PSA) por aminação redutiva com NH4Cl, após oxidação anterior. Podem ser usados reagentes bifuncionais para ligar dois grupos amino ou dois hidroxila. Por exemplo, PSA contendo um grupo amino pode ser acoplado a grupos amino da proteína com reagentes como BS3 (Bis(sulfossuccinimidil)suberato / Pierce, Rockford, IL). Além disso reagentes de ligação cruzada heterobifuncionais como Sulfo- EMCS (N-e-Maleimidocaproilóxi) sulfossuccnimida éster / Pierce), podem ser usados por exemplo, para ligar grupos amina e tiol.

[0061] Em outra abordagem, uma hidrazida PSA pode ser preparada e acoplada à porção carboidrato da proteína após oxidação anterior e geração de funções aldeído.

[0062] Um grupo amina livre da proteína terapêutica pode ser reagido com o grupo 1-carboxila do resíduo de ácido siálico, para formar uma ligação peptidila, ou uma ligação éster pode ser formada entre o grupo ácido 1- carboxílico e uma hidroxila ou outro grupo ativo adequado de um ingrediente ativo. Alternativamente, um grupo carboxila pode formar uma ligação peptídeo com o grupo 5-amino diacetilado. Um grupo aldeído de uma molécula de um composto farmaceuticamente aceitável pode formar uma base de Schiff com o grupo 5-amino N-desacetilado de um resíduo de ácido siálico.

[0063] Alternativamente, o composto polissacarídeo pode ser associado em uma maneira não-covalente com o composto farmaceuticamente aceitável, p. ex., FVIIa. Por exemplo, o composto polissacarídeo e o composto farmaceuticamente aceitável podem ser ligados via interações hidrofóbicas, por exemplo, via componentes lipídicos do composto polissacarídeo com um composto farmaceuticamente aceitável hidrofóbico. Outras associações não-covalentes podem ser via interações eletrostáticas, com íons opostamente carregados atraindo-se.

[0064] O composto farmaceuticamente aceitável pode ser diretamente ligado covalentemente ao composto polissacarídeo em quantidades estequiométricas (p. ex., 1:1). Alternativamente, duas ou mais moléculas de composto polissacarídeo podem ser ligadas a uma molécula do ingrediente ativo. USO

[0065] A presente invenção é dirigida ao aumento a meia-vida IN VIVO de proteínas de coagulação sanguínea, especialmente FVIIa ou seus derivados biologicamente ativos, tendo um distúrbio de sangramento associado com defeitos ou deficiências funcionais de FVIIa, em comparação com a meia- vida IN VIVO de FVIIa não ligada a pelo menos uma porção de ácido siálico fisiologicamente aceitável. O conjugado-PSA-FVIIa da presente invenção pode ainda ser usado para o tratamento de distúrbios sanguíneos associados com defeitos funcionais ou deficiências congênitas ou adquiridas de pelo menos um de FVIII e FIX.

[0066] De acordo com o estado da técnica em terapia e de acordo com normas e regulamentos internacionais, as farmacocinéticas de FVIIa infundido são reconhecidas e aceitas como marcadores substitutos válidos para eficácia (Bjorkman e Bemtrop, Clin Pharmacokinet. 2001; 40:815- 32).

[0067] Isto é baseado na suposição validada de que um produto FVIIa infundido, que tenha sido caracterizado por testes de padronização para atividade funcional, seria encontrado na corrente sanguínea e atuaria ali como esperado como um componente da cascata de coagulação. Portanto, qualquer análise farmacocinética em modelos animais será preditiva da eficácia esperada em pacientes tratados com produtos FVIIa. MEIA-VIDA

[0068] Em uma forma de realização da presente invenção, a meia-vida IN VIVO da construção proteica é prolongada. Em uma forma de realização relacionada, a meia-vida IN VIVO da construção proteica é prolongada em pelo menos um fator de dois, enquanto em outra forma de realização a meia-vida IN VIVO é prolongada em pelo menos um fator de três, em comparação com FVIIa, que não é ligado ao ácido siálico. O prolongamento da meia-vida de FVIIa pode ser avaliada medindo-se a farmacocinética em ratos, como descrito nos exemplos abaixo.

ADMINISTRAÇÃO

[0069] A via de administração não exibe limitações particulares e em uma forma de realização a construção proteica da presente invenção pode ser administrada por injeção, tal como intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal.

[0070] Para administrar composições compreendendo uma construção proteica da presente invenção em humanos ou animais de teste, em um aspecto as composições compreendem um ou mais dos veículos farmaceuticamente aceitáveis. As expressões “farmaceuticamente” ou “farmaceuticamente aceitável” referem-se a entidades moleculares e composições que são estáveis, inibem a degradação da proteína, tal como produtos de agregação e clivagem e, além disso não produzem reações alérgicas ou outras adversas, quando administrados usando-se vias bem conhecidas na técnica, como descrito abaixo. “Veículos farmaceuticamente aceitáveis” incluem quaisquer e todos os solventes clinicamente úteis, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento isotônicos e de absorção e similares, incluindo aqueles agentes descritos acima.

[0071] Como usada aqui, “quantidade eficaz” inclui uma dose adequada para tratar um mamífero tendo um distúrbio de sangramento como resumido acima.

[0072] As composições podem ser administradas oral, tópica, transdérmica, parenteralmente, por spray de inalação, vaginal e retalmente ou por injeção intracraniana. O termo parenteral como usado aqui inclui injeções subcutânea, intravenosa, intramuscular, intracisternal ou técnicas de infusão. A administração por injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implante cirúrgico em um sítio particular é contemplada também. Geralmente, as composições são essencialmente livres de pirogênios, bem como outras impurezas que poderia ser danosas ao receptor.

[0073] Administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser realizadas com os níveis de dose o padrão sendo selecionado pelo médico encarregado. Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada dependerá do tipo de doença a ser tratado, como descrito acima, da severidade e curso da doença, quer o medicamento seja administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, a história clínica e resposta ao medicamento do paciente e o discernimento do médico atendendo.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0074] A presente invenção também refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de uma construção proteica como definido acima. A composição farmacêutica pode ainda compreender um veículo, diluente, sal, tampão ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser usada para tratar os distúrbios de sangramento definidos acima. A composição farmacêutica da invenção pode ser uma solução ou um produto liofilizado. Há muitos métodos conhecidos de formar soluções estáveis de proteínas e especificamente FVIIa. Um exemplo é descrito na Patente US No. 5.874.408. As soluções da composição farmacêutica podem ser submetidas a qualquer processo de liofilização.

KITS

[0075] Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits que compreendem uma composição da invenção acondicionada de uma maneira que facilite seu uso pra administração a indivíduos. Em uma forma de realização, tal kit inclui um composto ou composição descrita aqui (p. ex., uma composição compreendendo uma construção proteica), acondicionada em um recipiente, tal como um frasco ou vaso selado, com um rótulo afixado no recipiente ou incluído na embalagem, que descreva o uso do composto ou composição na prática do método. Em uma forma de realização, o kit contém um primeiro recipiente tendo uma composição compreendendo uma construção proteica e um segundo recipiente tendo uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a composição do primeiro recipiente. Em um aspecto, o composto ou composição é acondicionado em uma forma de dosagem unitária. O kit pode ainda incluir um dispositivo adequado para administração da composição de acordo com uma via específica de administração. Preferivelmente, o kit contém um rótulo que descreve o uso da proteína terapêutica ou composição de peptídeo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0076] A Fig. 1 mostra um SDS-PAGE de rFVIIa após conjugação com PSA.

[0077] A Fig. 2 mostra a farmacocinética do conjugado-rFVIIa-PSA e rFVIIa não modificado em ratos.

[0078] A Fig. 3 mostra a farmacocinética do conjugado-rFVIIa-PSA e rFVIIa não modificado em ratos (nível antígeno).

[0079] A Fig. 4 mostra um SDS-PAGE de rFVIIa após conjugação de terminal-N com PSA.

[0080] A Fig. 5 mostra uma eletroforese capilar de mono-SA rFVIIa e Tri-SA-rFVIIa.

[0081] As Figs. 6A e B mostram a farmacocinética dos conjugados- rFVIIa-PSA e RFVIIa não modificado em ratos, A: mono-SA-RFVIIa, B: tri- SA-RFVIIa.

[0082] A Figura 7 mostra uma eletroforese capilar de trímero do ácido N-acetilneuramínico

[0083] A presente invenção será ainda ilustrada nos seguintes exemplos, sem qualquer limitação. EXEMPLOS EXEMPLO 1: Modificação dos resíduos de lisina em rFVIIa com ácido colomínico

[0084] A modificação dos resíduos de lisina com ácido siálico (ácido colomínico,) foi realizada como descrito por Jennings e Lugowski (J Immunol, 1981; 127; 1011-8). Para este procedimento de Sigma (SigmaAidrich, St. Louis; MO) foi usado. Uma solução aquosa de (concentração: 20 mg/ml) contendo 0,1 M NaIO4 foi agitada por 15 min no escuro em temperatura ambiente para oxidar. Dois ml de etileno glicol por ml da solução de ativada foram adicionados e agitados por mais 30 min no escuro em temperatura ambiente. A solução foi dialisada durante a noite contra 0,05 M solução de fosfato de sódio, pH 7,2 no escuro em uma temperatura variando de 2 - 8 oC.

[0085] Subsequentemente, uma alíquota desta solução foi adicionada a uma solução de rFVIIa (30 μg/ml) em tampão de fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,2, para fornecer uma concentração final de 100 mg de ativado por mg de rFVIIa. Esta mistura foi agitada por 180 min em temperatura ambiente no escuro. NACNBH3 foi adicionado (concentração final 10 mg/mg rFVIIa) e a mistura foi incubada por 18 h em temperatura ambiente no escuro sob agitação suave. Em seguida 2,5 ml de uma solução-TRIS 1M aquosa, pH 7,2 foram adicionados por ml desta mistura e agitados por 60 min para terminar a reação.

[0086] Os três reagentes foram separados do conjugado de ácido rFVIIa- por cromatografia de troca de íons, empregando-se uma resina QHyperD F 50 μm (Pall BioSepara, Cergy, França) e uma coluna Pharmacia XK-10 (Pharmacia XK 10; h = 15 cm). A proteína conjugada foi eluída com tampão de eluição (20 mM HEPES / 1 M NaCl, pH 8,0). Em uma etapa final o eluato foi concentrado por ultrafiltragem/diafiltragem (UF/DF), empregando-se uma membrana 30 kD (celulose regenerada/ Millipore) contra tampão HEPES 20 mM, pH 7,4, contendo 150 mM de NaCl e 0,5% de sacarose. EXEMPLO 2: Caracterização bioquímica de rFVIIa polissililado

[0087] A atividade enzimática de rFVIIa-PSA foi determinada por um ensaio de coagulação, onde FVIIa foi adicionado a um plasma humano deficiente de FVII e a coagulação foi disparada por um fator de tecido truncado, reagindo com FVIIa, porém não com FVII (Staclot, Diagnostica Stago, Asnières, França).

[0088] A atividade de derivação-FVIII de rFVII-PSA foi medida por um ensaio de geração de trombina (TGA), onde FVIIa foi adicionado a um plasma de hemofilia A severa, contendo um elevado título de inibidor anti- FVIII, na presença de um substrato de peptídeo de fluorescência específica de trombina. A coagulação foi disparada com um complexo de fosfolipídeo de fator de tecido e a geração de trombina foi continuamente medida pela taxa de clivagem do fluoróforo do substrato. A atividade de geração de trombina foi calculada pela trombina pico, isto é, a máxima concentração de trombina observada durante o ensaio. Em ambos os casos uma preparação De FVIIa recombinante NovoSeven (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca) foi usada como referência.

[0089] Como visto na Tabela 1, a atividade específica de PSA-rFVIIa diminuiu após a modificação. Tabela 1: Atividade específica de rFVIIa antes e após conjugação com PSA

[0090] A modificação foi visualizada por SDS-PAGE realizado sob condições não redutoras. O imunotingimento foi realizado com um anticorpo anti-FVII policlonal (Affinity Biologicals; Ancaster, Canadá) e com um anticorpo anti-PSA monoclonal (Chemicon International, Temecula, USA). A modificação resultou em um aumento do MW de FVIIa demonstrado por uma área de esfregaço correlacionando-se com a proteína contendo PSA (Figura 1). EXEMPLO 3: Farmacocinética de conjugado-rFVIIa-PSA em ratos

[0091] Quatro ratos (Crl:CD(SD), Charles River Laboratories, Wilmington, MA) foram anestesiados e conjugado-rFVIIa-PSA (16500 U FVIIa/kg) em tampão (1,3 g/l glicilglicina, 3 g/l cloreto de sódio, 30 g/l manitol, 1,5 g/l CaCl2 x 2 H2O, 0,1 g/l Tween 80, pH 5,5) foi aplicado por injeção intravenosa dentro da veia da cauda em uma dose volumétrica de 20 ml por kg. rFVIIa não modificado em uma dose de 180000 U FVIIa/kg foi usado como controle em 6 ratos normais. Amostras de sangue foram tiradas do plexo venoso retrobulbar 5 min, 30 min, 1 h, 2, 4, 6, 8 e 24 h após aplicação da substância, plasma de citrato foi preparado e congelado para mais análise.

[0092] Em seguida a atividade FVIIa (Staclot, Diagnostica Stago, Asnières, França) no plasma foi medida. A meia-vida de rFVIIa não modificado era de 1,1 h e foi aumentada para 2,3 h com o conjugado-rFVIIa (Figura 2).

[0093] A farmacocinéticas dos níveis de antígeno de FVIIa foram medidas em um experimento adicional. Seis ratos foram anestesiados e conjugado-rFVIIa-PSA (450 μg/kg) em tampão (1,3 g/l glicilglicina, 3 g/l de cloreto de sódio, 30 g/l manitol, 1,5 g/l CaCl2.2H2O, 0,1 g/l Tween 80, pH 5,5) foi aplicado por injeção intravenosa dentro da veia da cauda em uma dose volumétrica de 10 ml por kg. rFVIIa não-modificado em uma dose de 390 μg/kg foi usado como controle em 6 ratos. Amostras de sangue foram tiradas do plexo venoso retrobulbar 5 min, 30 mi, 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 h após aplicação da substância. Plasma de citrato foi preparado e congelado para mais análise. Níveis de antígeno FVII no plasma foram medidos com um ELISA (anticorpo FVII anti-humano policlonal). Cálculo da meia-vida por regressão linear como determinado com MS Excel resultou em 1,1 h para rFVIIa nativo e 3,1 h para o conjugado-rFVIIa. Os dados para o antígeno FVII são normalizados ao nível médio do plasma obtido 5 min após a aplicação (Figura 3). EXEMPLO 4: Polissialilação terminal-N de FVIIa

[0094] A conjugação de no término-N de FVIIa foi realizada a pH 6,0. Para este procedimento, de Sigma (Sigama-Aldrich) foi usado, que foi ainda purificado por cromatografia de troca de ânion em Q-Sefarose FF (GE Healthcare, Munich, Alemanha). Uma solução aquosa de purificado (concentração: 23 mg/ml) contendo 0,04 Ma NaIO4 foi agitada por 15 min no escuro em temperatura ambiente para oxidar. Subsequentemente, uma alíquota desta solução foi adicionada a uma solução rFVIIa (740 μg/ml) em tampão de fosfato de sódio 0,05 M, pH 6,0, para fornecer uma concentração final de 60 mg de ativado por mg de rFVIIa (aproximadamente excesso molar de 150). Esta mistura foi agitada por 180 min em temperatura ambiente no escuro. NaCNBH3 foi adicionado (25 mg/mg rFVIIa) e a mistura foi incubada por 24 h a 4 oC no escuro sob agitação suave. Em seguida 2,5 ml de uma solução-TRIS 1 M aquosa, pH 7,2 foram adicionados por ml desta mistura e agitados no escuro a 4 oC por 60 min para terminar a reação.

[0095] Os reagentes livres foram separados do conjugado de ácido rFVIIa- por cromatografia de troca iônica usando-se uma resina QHyperD F 50 μm (Pall BioSepra, Cergy, França) e uma coluna Pharmacia XK-16 (Pharmacia XK 16; h = 14 cm). Em seguida a proteína conjugada foi eluída com tampão de eluição (20 mM HEPES / 0,5M NaCl, pH 8,0). Em uma etapa final o eluído foi concentrado por UF/DF usando-se uma membrana de 10 kD (celulose regenerada/ Millipore) contra tampão HEPES 20 mM, pH 7,4, contendo 150 mM NaCl. A cromatografia de troca de íons e a etapa UF/DF foram realizadas a 4 oC.

[0096] A atividade enzimática de rFVIIa-PSA modificado de terminal- N foi determinada por um ensaio de coagulação e por um ensaio de geração de trombina, como descrito no Exemplo 2. Os resultados são resumidos na Tabela 2. Tabela 2; Atividade específica de rFVIIa antes e após conjugação de terminal- N com PSA

[0097] A atividade específica de PSA-rFVIIa conjugado terminal-N diminuiu a aproximadamente 50%, conforme medido pelo ensaio STF e a 25% por TGA.

[0098] A modificação foi visualizada por SDS-PAGE realizado sob condições não redutoras, desenvolvidas por imunotingimento com um anticorpo anti-FVII policlonal e com um anticorpo anti-PSA policlonal, como descrito no Exemplo 2. A modificação resultou em um ligeiro aumento de MW de FVIIa correlacionando-se com as faixas mostradas na imunoblot tingida-anti-PSA (Figura 4). EXEMPLO 5: Conjugação de FVIIa com ácido N-acetilneuramínico sintético ativado por CNBr

[0099] RFVIIa foi conjugado com ácido N-acetilneuramínico como descrito na US 3.487.890. 350 mg de ácido N-acetilneuramínico sintético (Sigma-Aldrich) foram dissolvidos em 10 ml de tampão HEPES 0,1M, pH 9,0. Então 430 mg de CNBr (Fluka, Steinhamm, Alemanha) foram adicionados a esta solução e o pH foi ajustado para 9,5 com NaOH 0,5 M durante o procedimento de ativação. Após 30 minutos, o valor de pH foi 9,5. Então, o valor de pH foi ajustado para 8,4 por adição de HCl 0,1M. Durante o procedimento de ativação integral, a temperatura foi controlada pelo uso de um banho de gelo e mantida em 20 a 25°C. Para conjugação do ácido N- acetilneuramínico ativado com rFVIIa, uma solução de rFVIIIa (50 ml/0,44 mg rFVIIa/ml) em 50 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 foi adicionado e incubado sob agitação suave na temperatura ambiente por 30 min. Então 20 mL de Tris-tampão 0,2M foram adicionados para término da reação e bloqueio dos ésteres de cianato livre e a mistura foi incubada sob agitação suave por 15 minutos. Finalmente, a solução foi concentrada por UF/DF usando uma membrana 10 kD (celulose regenerada/Millipore) contra tampão de fosfato 50 Mm, pH 7,2. EXEMPLO 6: Conjugação de FVIIa com trímero de ácido N-acetilneuramínico sintético ativado por CNBr

[00100] RFVIIa foi conjugado a um trímero de ácido N- acetilneuramínico obtido de TimTec, LLC (Newark, USA) como descrito na US 3.487.890 para ácido N-acetilneuramínico. 350 mg do trímero de ácido N- acetilneuramínico foram dissolvidos em 10 ml de tampão HEPES 0,1M, pH 9,0. Então, 430 mg de CNBr (Fluka) foram adicionados a esta solução e o pH foi ajustado para 9,5 com NaOH 0,5 M durante o procedimento de ativação. Após 30 minutos, o valor de pH foi 9,5. O valor de pH foi ajustado para 8,4 por adição de HCl 0,1M. Durante o procedimento de ativação integral, a temperatura foi controlada pelo uso de um banho de gelo e mantida em 20 a 25°C. Então, a conjugação do trímero ativado com FVIIa foi realizada como descrita no Exemplo 5. EXEMPLO 7: Caracterização bioquímica de Mono-SA-FVIIa e Tri-SA-FVIIa

[00101] A atividade enzimática do conjugado-rFVIIa modificado para ácido N-acetilneuramínico (Mono-SA) descrito no Exemplo 5 ou N-trímero do ácido acetilneuramínico (Tri-SA) descrito no Exemplo 6 foi determinada por um ensaio de coagulação e por um ensaio de geração de trombina como descrito no Exemplo 2. Os resultados são resumidos na Tabela 3. Tabela 3: Atividade específica de rFVIIa antes e após conjugação terminal-N com PSA

[00102] A atividade específica de rFVIIa conjugado oligo-PSA diminuiu conforme medido pelo ensaio STF, porém mono-SA-rFVIIa reteve cerca de 50% de sua atividade de derivação-FVIII, medida por TGA.

[00103] Além disso Mono-SA rFVIIa e Tri-Sa-rFVIIa foram investigados por eletroforese capilar (CE) como descrito por Klausen e Kornfelt (J. Cromatogr. A. 1995; 718 : 195 - 202). Os resultados são ilustrados na Figura 5. Uma mudança clara para tempos de retenção mais elevados do Mono-SA rFVIIa e Tri-Sa-rFVIIa, devida a cargas negativas adicionais, em comparação com o rFVIIa nativo, é indicada. EXEMPLO 8: Farmacocinética de conjugado rFVIIa-mono SA e FVIIa-Tri SA em ratos

[00104] Doze ratos foram anestesiados e conjugado-rFVIIa-mono SA (400 μg proteína/kg) em tampão (1,3 g/l glicilglicina, 3 g/l cloreto de sódio, 30 g/l manitol, 1,5 g/l CaCl2.2 H2O, 0,1 g/l Tween 80, pH 5,5) foi aplicado por injeção intravenosa dentro da veia caudal em uma dose volumétrica de 10 ml por kg. Quatro ratos foram tratados com conjugado-rFVIIa-tri SA (400 μg proteína/kg). rFVIIa não modificado em uma dose de 400 μg proteína/kg foi usado como controle em 8 ratos normais. Amostras de sangue foram retiradas do plexo venoso retrobulbar, 5 min, 30 min, 1, 2, 4, 7, 10 e 22 h após aplicação da substância, plasma de citrato foi preparado e congelado para mais análise. Níveis de antígeno FVII do plasma foram medidos com um ELISA (anticorpo FVII anti-humano policlonal). Os dados foram normalizados em relação à concentração, encontrados no plasma 5 min após aplicação. 7 h após a aplicação, os níveis de plasma para rFVIIa-mono-SA e tri-SA-rFVIIa foram mais elevados do que para o controle rFVIIa nativo. Os resultados são ilustrados na Figura 6A (rFVIIa-mono SA) e Figura 6B (rFVIIa-tri SA). EXEMPLO 9: Acoplamento de trímero de ácido N-acetilneuramínico com rFVIIa por aminação redutiva

[00105] A conjugação de rFVIIa com trímero de ácido N- aceitilneuramínico por aminação redutiva foi realizada como descrito por Biessen et al. (Biochem J 1994; 299 : 291 - 6). 350 mg de trímero de ácido N- aceitilneuramínico (TimTec) foram dissolvidos em 10 ml de tampão HEPES 0,1 M, pH 7,0, e adicionados a 32 ml de uma solução de FVIIa recombinante em HEPES 20 mM, 70 mm NaCl, pH 7,4 (0,3 mg/ml). Em seguida NaCNBH3 foi adicionado para fornecer uma concentração final de 50 mg/ml e o pH foi corrigido a pH 7,0 pela adição de 0,1 M HCl. A mistura foi incubada a 37 oC sob agitação suave por 48. A solução foi concentrada por UF/DF usando-se uma membrana de 10 kD (celulose regenerada/ Millipore) contra tampão Hepes 20 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4.

[00106] A conjugação do trímero de ácido N-aceitilneuramínico com rFVIIa foi mostrada por CE realizada de acordo com Klausen e Kornfelt (J Chromatogr A. 1995, 718: 195 - 202). Os resultados são indicados na Figura 7. Uma mudança clara do derivado para tempos de retenção mais elevados, em comparação com o rFVIIa nativo, é indicada. EXEMPLO 10: Purificação e derivação de ácido colomínico

[00107] CA foi purificado por uma cromatografia de troca de ânions em Q-Sefarose FF como descrito em WO 0601616A1. Cinco g de CA foram dissolvidos em 50 ml de tampão de Trietanolamina a 10 mM, pH 7,4, contendo 25 mM NaCl (= tampão de partida). Esta solução foi aplicada sobre uma coluna Pharmacia XK50 enchida com Q-Sefarose FF (GE Healthcare), que foi equilibrada com tampão de partida. Em seguida a coluna foi lavada com tampão de partida de 8 volumes de coluna (CV) e o CA ligado foi eluído escalonadamente com 3CV 200 mM NaCl, 350 mM NaCl e 500 mM NaCl em tampão de partida. A fração eluída com 350 mM NaCl mostrou um peso molecular de 20 kDa, como indicado por eletroforese gel SDS. Esta fração foi concentrada por ultrafiltragem usando-se uma membrana de 5 kD produzida de celulose regenerada (Millipore) e subsequentemente diafiltrada contra tampão de fosfato 50 mM, pH 7,2. Em seguida o CA foi oxidado com NaIO2, como descrito no Exemplo 1 e um amino grupo primário terminal foi introduzido por aminação redutiva, como descrito em WO 05016973A1. Para aminação redutiva, 11 ml de uma solução de NH4Cl 2 M foram adicionados a 20 ml de uma solução contendo 58 mg de PSA oxidado / ml em tampão de fosfato 50 mM, pH 7,2. Em seguida uma solução de NaCNBH3 5 M em NaOH 1 M foi adicionada para fornecer uma concentração final de 75 mM. A reação foi realizada por 5 d em temperatura ambiente a pH 8,0. Em seguida a mistura foi dializada contra uma solução de (NH4)2CO3 (50 mg/l) contendo 10 mM NaCl e subsequentemente contra tampão de fosfato 50 mM, pH 8,0, contendo 5 mM EDTA. Em seguida um grupo sulfidrila foi introduzido por reação do grupo amino primário terminal com 2-iminotiolano (Traut’s reagent / Pierce). A reação foi realizada em tampão de fosfato 50 mM, pH 8,0, contendo 5 mM EDTA com excesso 20 vezes molar de reagente pro 1 h em temperatura ambiente. Finalmente a solução de PSA, contendo um grupo SH livre de terminal, foi submetida a ultrafiltragem/diafiltragem usando-se uma membrana com um corte de 5 kD e produzida de celulose regenerada (Millipore). EXEMPLO 11: Acoplamento de PSA com rFVIIa pelo uso de um reticulador heterobifuncional

[00108] PSA (Sigma-Aldrich) foi purificado por cromatografia de troca de ânion em Sefarose-Q FF (GE-Healthcare) e um grupo sulfidrila terminal foi introduzido por modificação química, para formar PSA-SH, como descrito no Exemplo 10. Para acoplamento de PSA-SH com rFVIIa, o reticulador solúvel em água, heterobifuncional, Sulfo-EMCS ((N-ε-maleimidocaproil0xi) sulfossuccinimida éster / Pierce) foi usado, contendo dois grupos reativos: um grupo maleimida para conjugação com grupos-SH e um grupo sulfo-NHS- éster para conjugação com amino grupos livres. Em 2 ml de uma solução rFVIIa (1,6 mg/ml) em tampão HEPES 20 mM, NaCl Sulfo-EMCS 150 mM contendo pH 7,4 foi adicionado para fornecer uma concentração final de 0,07 mg de reticulador / mg proteína). A reação foi realizada por 30 min em temperatura ambiente. Subsequentemente, 130 mg PSA-SH (excesso de 100 vezes), preparados de acordo com o Exemplo 10, foram adicionados e a reação de acoplamento do complexo intermediário ligado/rFVIIa com PSA- SH foi realizada por mais 2 h em temperatura ambiente. Em seguida a mistura foi purificada por cromatografia HIC em Butil-Sefarose (GE-Healthcare). Uma solução NaCl 5 M foi adicionada à mistura para fornecer uma concentração final de 3M NaCl. Em seguida esta mistura foi aplicada à coluna enchida com Butil-Sefarose (GE-Healthcare) e a eluição do conjugado rFVIIa-PSA foi realizada com tampão-HEPES 50 mM, pH 7,4, contendo CaCl2 6,7 mM. Após eluição do conjugado, o pH foi ajustado a pH 6,9. EXEMPLO 12: Conjugação de PSA - hidrazida com a porção carboidrato de rFVIIa

[00109] Para conjugação de PSA com a porção carboidrato de rFVIIa, uma solução de rFVIIa em tampão HEPES 20 mM, pH 6,0 (1,6 mg/ml) é preparada. Em 9 volumes desta solução 1 volume de uma solução NaIO4 5 mM é adicionado e suavemente misturado. A reação de oxidação é realizada por 1 h a 4 oC no escuro, para gerar grupos aldeído livres. Em seguida bissulfito de sódio (concentração final 5 mM) é adicionado para parar a reação. Subsequentemente, PSA-hidrazida (WO 0606168A2) é adicionado (concentração final 10 mM) e a reação de acoplamento com os grupos aldeído é realizada por 1 em temperatura ambiente. Em seguida o conjugado PSA- rFVIIa é purificado por cromatografia de troca de ânions em QHyperD (Pall BioSepra), como descrito no Exemplo 1.

Claims

1. Construção proteica quimicamente modificada, caracterizada pelo fato de compreender, (a) uma molécula de fator VII ativado (FVIIa), selecionada do grupo consistindo de FVIIa plasmático, FVIIa recombinante (rFVIIa); e (b) pelo menos um ácido polissiálico compreendendo de 1 a 4 unidades de ácido siálico ligadas a dita molécula de FVIIa; em que o ácido polissiálico é covalentemente ligado diretamente a pelo menos um resíduo de aminoácido da dita molécula de FVIIa; e em que a meia-vida in vivo de dita construção é prolongada no sangue de um mamífero, em comparação com a meia-vida in vivo de uma molécula FVIIa que não é quimicamente modificada.

2. Construção proteica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da meia-vida in vivo de dita construção ser aumentada em pelo menos um fator de cerca de dois, em comparação com a meia-vida in vivo de uma molécula de FVIIa que não é quimicamente modificada.

3. Construção protéica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da meia-vida in vivo de dita construção ser aumentada em pelo menos um fator de cerca três, em comparação com a meia-vida in vivo de uma molécula FVIIa que não é quimicamente modificada.

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender uma quantidade eficaz da construção proteica como definida na reivindicação 1 e um ou mais compostos selecionados do grupo consistindo de um veículo, diluente, sal, tampão e excipiente farmaceuticamente aceitáveis.

5. Construção proteica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser para uso para controlar sangramento em um mamífero tendo um distúrbio de sangramento associado com defeitos ou deficiências funcionais de pelo menos um de FVIIa, fator VIII (FVIII) e fator IX (FIX).

6. Construção proteica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser para uso para controlar sangramento em um mamífero durante cirurgia ou trauma.

7. Kit, caracterizado pelo fato de compreender uma quantidade eficaz da construção proteica como definida na reivindicação 1, acondicionada em um recipiente, dito kit opcionalmente contendo um segundo agente terapêutico e compreendendo ainda um rótulo fixado ao ou acondicionado com o recipiente, o rótulo descrevendo o conteúdo do recipiente e provendo indicações e/ou instruções referentes ao uso do conteúdo do recipiente para controlar sangramento em um mamífero.

8. Kit de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato do recipiente ser um frasco ou garrafa ou seringa pré-enchida.