BRPI0708748A2

BRPI0708748A2 - composições de óleo e semente de soja e métodos de preparação das mesmas

Info

Publication number: BRPI0708748A2
Application number: BRPI0708748-9A
Authority: BR
Inventors: Joanne J Fillatti; Greg E Keithly; Toni Voelker; Tim Ulmasov
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2006-03-10
Filing date: 2007-03-09
Publication date: 2011-06-28
Also published as: US20070214516A1; US20180087066A1; US9873887B2; EP3133162A1; AU2007226680B2; MX2008011625A; AR093018A2; US20140351996A1; AU2007226680A1; BRPI0708748B1; EP1993349A4; US20140082774A1; WO2007106728A2; EP2562260B1; WO2007106728A3; CA2645148A1; CA2645148C; EP2562260A1; EP1993349A2; US9410161B2

Abstract

COMPOSIçõES DE óLEO E SEMENTE DE SOJA E MéTODOS DE PREPARAçãO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se a métodos para obter plantas de soja que produzem semente com baixos níveis de ácido linolênico e níveis oléicos moderadamente aumentados. A invenção também refere-se a métodos para produzir semente com baixos níveis de ácido linolênico, níveis oléicos moderadamente aumentados e baixos níveis de ácido graxo saturado. Estes métodos vinculam a combinação de transgenes que fornecem níveis moderados de ácido oléico com idioplasma de soja que contém mutações em genes de soja que conferem baixos fenótipos de ácido linolênico. Estes métodos também vinculam a combinação de transgenes que fornecem tanto moderados níveis de ácido oléico quanto baixos níveis de gordura saturada com idioplasma de soja que contém mutações em genes de soja que conferem baixos fenótipos de ácido linolênico. A invenção também refere-se a plantas de soja e sementes produzidas por estes métodos são também descritas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"COMPOSIÇÕES DE ÓLEO E SEMENTE DE SOJA E MÉTODOS DEPREPARAÇÃO DAS MESMAS".

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica prioridade para a data de depósito de 10de março, de 2006 do Pedido de Patente Provisório U.S. Número60/781.519 que está aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Declaração com Respeito ao Desenvolvimento ou Pesquisa FederalmentePatrocinada

Não Aplicável.

Apêndice

Não Aplicável.

Incorporação da Listagem de Seqüência

Uma cópia de documento da Listagem de Seqüência e umaforma legível por computador da listagem de seqüência em disquete,contendo o arquivo chamado "38-77(54449) SEQ LIST" que é 71 278 bytesem tamanho (medido em MS-DOS), estão aqui incorporados por referência.Esta Listagem de Seqüência consiste em SEQ ID NOs:1-63.

Antecedentes Da Invenção

1. Campo da Invenção

Esta invenção geralmente se refere aos métodos parafabricação de plantas de soja que produzem semente de soja comcomposições de óleo alteradas e, mais particularmente, aos métodos onde asemente de soja com uma semente de soja ou fenótipo pouco linolênico,meio oléico com um fenótipo pouco linolênico, pouco saturado, meio oléico,é produzido.

2. Técnica relacionada

Os óleos de planta são usados em uma variedade deaplicações. Novas composições de óleo vegetal e abordagens melhoradassão necessárias para obter composições de óleo, de fontes de plantanaturais ou biossintéticas. Dependendo do uso de óleo pretendido, váriascomposições de ácido graxo diferentes são desejadas. As plantas,especialmente espécies que sintetizam quantidades grandes de óleos emsementes, são uma fonte importante de óleos tanto para uso comestívelquanto industrial. Os óleos de semente são quase completamentecompostos de triacilgliceróis nos quais os ácidos graxos são esterificadospara os três grupos hidroxila de glicerol.

O óleo de soja contém tipicamente cerca de 16-20% de ácidosgraxos saturados: 13-16% de palmitato e 3-4% de estearato. Geralmenteveja Gunstone e outros, The Lipid Handbook, Chapman & Hall, London(1994). Os óleos de soja foram modificados através de vários métodos dereprodução para criar benefícios para os mercados específicos. Entretanto,um óleo de soja que é amplamente benéfico a maioria dos usuários de óleode soja, tal como consumidores de óleo de salada, óleo de cozinha e óleo detritura, e mercados industriais, tal como biodiesel e mercados debiolubrificantes, não está disponível. Os óleos de soja anteriores foram oumuito caros ou necessitaram de uma propriedade de qualidade de comidaimportante tal como estabilidade oxidativa, bom sabor de comida frita ouconteúdo de gordura saturada, ou uma propriedade de biodiesel importantetal como emissões de óxido nítrico apropriadas ou tolerância ao frio ou fluxo frio.

As plantas mais altas sintetizam ácidos graxos por uma série dereações metabólica comum—a série de reação de ácido graxo sintetase(FAS), que fica localizada nos plastídeos. As β-cetoacil-ACP sintases sãoenzimas de limitação de taxa importantes na FAS de células de planta eexistem em várias versões. β-cetoacil-ACP sintase I catalisa alongamento decadeia para palmitoil-ACP (C16:0), considerando que β-cetoacil-ACP sintaseII catalisa alongamento de cadeia para estearoil-ACP (C18:0). β-cetoacil-ACP sintase IV é uma variante de β-cetoacil-ACP sintase II, e também podecatalisar alongamento de cadeia para 18:0-ACP. Em soja, os produtosprincipais de FAS são 16:0-ACP e 18:0-ACP. A dessaturação de 18:0-ACPpara formar 18:1-ACP é catalisada por uma delta-9 dessaturase solúvellocalizada em plastídeo (também chamada "estearoil-ACP dessaturase").Veja Voelker e outros, 52 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 335-61(2001).

Os produtos da FAS plastidial e delta-9 dessaturase, 16:0-ACP,18:0-ACP, e 18:1-ACP, são hidrolisados através de tioesterases específicas(FAT). As tioesterases de planta podem ser classificadas em duas famíliasde gene com base em homologia de seqüência e preferência de substrato. Aprimeira família, FATA, inclui acil-ACP tioesterases de cadeia longa que tematividade principalmente em 18:1-ACP. As enzimas da segunda família,FATB1 geralmente utilizam 16:0-ACP (palmitoil-ACP), 18:0-ACP (estearoil-ACP), e 18:1-ACP (oleoil-ACP). Tais tioesterases têm um papel importantena determinação do comprimento de cadeia durante biossíntese de ácidograxo de novo em plantas, e deste modo estas enzimas são úteis naprovisão de várias modificações de composições de acila graxa,particularmente com respeito às proporções relativas de vários grupos acilagraxa que estão presentes em óleos de armazenamento de semente.

Os produtos das reações de FATA e FATB, os ácidos graxoslivres, deixam os plastídeos e são convertidos para seus respectivos ésteresde acil-CoA. AciI-CoAs são substratos para a série de reações debiossíntese de lipídio (Série de Reação de Kennedy), que fica situada noretículo endoplásmico (ER). Esta série de reação é responsável pelaformação de lipídio de membrana como também pela biossíntese detriacilgliceróis que constitui o óleo de semente. No ER há dessaturasesadicionais ligadas à membrana, que podem também dessaturar 18:1 paraácidos graxos poliinsaturado. Uma delta-12 dessaturase (FAD2) catalisa ainserção de uma ligação dupla em 18:1 (ácido oléico), formando ácidolinoléico (18:2). Uma delta-15 dessaturase (FAD3) catalisa a inserção deuma ligação dupla em 18:2, formando ácido linolênico (18:3).

A inibição do gene FAD2 endógeno por uso de transgenes queinibem a expressão de FAD2 foi mostrada para conferir um fenótipo de ácidomeio oléico desejável (18:1) (isto é, a semente de soja que compreende 50%e 75% de ácido oléico em peso). Os transgenes e as plantas transgênicasque fornecem inibição da expressão de gene FAD2 endógena e um fenótipomeio oléico, são descritos na Patente U.S. 7.067.722. Em contraste, asplantas de soja tipo silvestre que necessitam de transgenes de inibição deFAD2 tipicamente produzem semente com composições de ácido oléico demenos do que 20%.

O óleo de soja contém tipicamente cerca de 8% de ácidolinolênico (18:3) que resulta em estabilidade e sabor reduzidos. Os níveis deácido linolênico (18:3) em óleo de soja podem ser reduzidos através dehidrogenação para melhorar tanto a estabilidade quanto o sabor (Dutton eoutros, 1951; Lui e White, 1992). Infelizmente, a hidrogenação resulta naprodução de ácidos graxos trans, que aumentam o risco para doençacardíaca coronária quando consumiu (Hu e outros, 1997).

A reprodução convencional também foi usada para gerarlinhagens de soja com os níveis linolênicos que variam de 1%-6% (Ross eoutros, Crop Science, 40:383; 2000; Wilson e outros J. Oleo Sci., 50:5, 87,2001; Wilson Lipid technology Sept. 1999). As variedades de soja de ácidopouco linolênico foram produzidas por mutação, peneiragem e reprodução(Fehr e outros, 1992; Rahman e Takagi, 1997; Ross e outros, 2000; Byrum eoutros, 1997; Stoisin e outros, 1998). Certas variedades de soja com umconteúdo de ácido linolênico de cerca de 1% ou mais baixo, foram obtidas (Patentes U.S. n- 5.534.425 e 5.714.670). Mais recentemente, os métodospara obter plantas de soja com ambos os níveis baixos de níveis de ácidolinolênico como também as características de produção e crescimento devariedades de soja agronomicamente elite foram descritos (Pedido dePatente U.S. 2006/0107348).

O ácido oléico tem uma ligação dupla, porém ainda érelativamente estável em temperaturas elevadas, e os óleos com níveiselevados de ácido oléico são adequados para cozimento e outros processosonde o aquecimento seja requerido. Recentemente, o consumo aumentadode óleos oléicos elevados foi recomendado, porque o ácido oléico parecereduzir os níveis de sangue de lipoproteínas de densidade baixa ("LDLs")sem afetar os níveis de lipoproteínas de densidade elevada ("HDLs").Entretanto, alguma limitação de níveis de ácido oléico é desejável, porquequando ácido oléico é degradado em temperaturas elevadas, ele criacompostos de sabor negativo e diminui os sabores positivos criados pelaoxidação de ácido linoléico. Neff e outros, JAOCS, 77 :1303-1313 (2000);Warner e outros, J. Agric. Food Chem. 49:899-905 (2001). É deste modopreferível usar óleos com níveis de ácido oléico que sejam 65-85% oumenos em peso, para limitar os sabores de má qualidade em aplicações decomida tal como óleo de fritura e comida frita. Outros óleos preferidos têmníveis de ácido oléico que são maiores do que 55% em peso para melhorara estabilidade oxidativa.

Para muitas aplicações de óleo, os níveis de ácido graxosaturado de menos do que 8% em peso ou até mesmo menos do que cercade 2-3% em peso são desejáveis. Os ácidos graxos saturados têm pontosde fusão elevados que são indesejáveis em muitas aplicações. Quandousados como uma carga de alimentação ou combustível, os ácidos graxossaturados causam turvação em baixas temperaturas, e conferempropriedades de fluxo frio pobres como pontos de derramamento e pontosde ligação de filtro frio, ao combustível. Os produtos de óleo que contêmníveis baixos de ácido graxo saturado podem ser preferidos pelosconsumidores e pela indústria de comida porque eles são percebidos comomais saudáveis e/ou podem ser rotulados como "sem gordura saturada" deacordo com diretrizes de FDA. Além disso, os óleos pouco saturadosreduzem ou eliminam a necessidade de trabalhar sob temperaturashibernais o óleo para aplicações de comida tal como óleos de salada. Emaplicações de biodiesel e lubrificante os óleos com baixos níveis de ácidograxo saturado conferem propriedades melhoradas de fluxo frio e nãoturvam em baixas temperaturas.

As linhagens de soja que produzem semente com conteúdo deácido meio oléico, pouco linoléico, seriam muito desejáveis. Infelizmente, astentativas de combinar as características meio oléicas e pouco linolênicaspor abordagens de engenharia genética, foram problemáticas. As linhagenstransgênicas onde ambos os genes de delta-12 dessaturase (FAD2) e delta-15 dessaturase (FAD3) foram suprimidos têm sementes com níveislinolênicos baixos, porém os níveis de ácido oléico são tipicamente acima dafaixa definida para meio oléico. Entretanto, os métodos descritos aquipermitem a produção de sementes de soja pouco linolênicas que tambémtêm níveis de ácido oléico na faixa de meio oléico de 55-80%. Além disso,estes métodos não requerem processos de hidrogenação e deste modoevitam a produção de gorduras trans indesejáveis.

As linhagens de soja que produzem semente com conteúdo deácido meio oléico, pouco saturado, pouco linoléico também seriam muitodesejáveis. Os métodos descritos aqui permitem a produção de sementes desoja pouco linolênicas que também têm níveis de ácido oléico na faixa oléicamoderada de 55-80% e níveis de ácido graxo saturado de menos do que 8%.

Sumário da Invenção

Devido aos problemas anteriores que a presente invenção foidesenvolvida. A primeira invenção se refere a um método para produzir umaplanta de soja que compreende um conteúdo de ácido linolênico de menosdo que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totais em peso e umconteúdo de ácido oléico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxosde semente totais em peso. Este método da invenção é praticado por umaprimeira etapa para a preparação de uma ou mais plantas de soja quecompreendem um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1de soja endógena e pelo menos uma mutação de perda de função em umgene FAD3 de soja endógena, uma segunda etapa para obter pelo menosuma semente da referida planta de soja obtida da primeira etapa, umaterceira etapa para determinar uma porcentagem do conteúdo de ácidograxo de semente total em peso de ácido linolênico e ácido oléico para asemente da segunda etapa, e então identificando uma planta de soja queproduz semente que tem uma composição de ácido graxo de semente quecompreende um conteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 6%de ácidos graxos de semente totais em peso e um conteúdo de ácido oléicode cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais empeso.

Em outras modalidades deste método, as plantas de soja quesão feitas na primeira etapa compreendem pelo menos duas mutações deperda de função em pelo menos dois genes de FAD3 de soja endógena.Esta perda de mutações de função pode ser localizada nos genes de FAD3-1B e FAD3-1C de soja endógena. Nesta modalidade do método, as plantasde soja identificadas na terceira etapa do método compreendem umconteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 3% de ácidosgraxos de semente totais em peso e um conteúdo de ácido oléico de cercade 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso.

Em certas modalidades deste método, o transgene podetambém compreender um transgene que confere tolerância ao herbicida. Otransgene de tolerância ao herbicida pode conferir tolerância ao glifosato.Em modalidades específicas da invenção, o transgene compreendeseqüências localizadas entre as seqüências fronteiras de T-DNA depMON68504, pCGN5469, pCGN5471, ou pCGN5485 que são integradas emum cromossomo da referida planta.

Na terceira etapa do método, a porcentagem do conteúdo deácido graxo de semente total em peso de ácido linolênico e ácido oléico édeterminada por uma técnica de análise de lipídio. Esta técnica de análisede lipídio compreende uma ou mais técnicas selecionadas do grupo queconsiste em cromatografia de gás/detecção de ionização por chama,cromatografia de gás/espectroscopia de massa, cromatografia de camadafina/detecção de ionização por chama, cromatografia líquida/espectrometriade massa, cromatografia líquida/espectrometria de massa de ionização poreletrovaporização e cromatografia líquida/espectroscopia de massa tandemde ionização por eletrovaporização.

A planta de soja que compreende um transgene que diminui aexpressão de um gene FAD2-1 de soja endógena e pelo menos umamutação de perda de função em um gene FAD3 de soja endógena pode serfeita cruzando uma primeira linhagem origem de soja compreendendo otransgene com uma segunda linhagem origem de soja compreendendo pelomenos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 de sojaendógena para obter uma planta de soja F1 que seja heterozigoto para otransgene e heterozigoto para pelo menos uma mutação de perda de funçãoem um gene FAD3 e então fertilizando de modo cruzado contínuo as plantasprogênies F1 do cruzamento para obter uma planta de soja F2 que sejahomozigoto para o referido transgene e homozigoto para pelo menos umamutação de perda de função em um gene FAD3. Em certas modalidadesdeste método, a segunda linhagem origem de soja compreende pelo menosduas mutações de perda de função em pelo menos dois genes FAD3 de sojaendógenos. Os dois genes FAD3 de soja endógenos podem ser FAD3-1B eFAD3-1C. Neste método, a planta de soja F1 que é heterozigoto para otransgene e para pelo menos uma mutação de perda de função em um geneFAD3 é obtida na etapa (i) submetendo-se uma pluralidade de plantas F1 apelo menos uma técnica de análise de DNA que permite a identificação deuma planta F1 que é heterozigoto para o referido transgene e para pelomenos uma mutação de perda de função em um gene FAD3.

Semelhantemente, a planta de soja F2 que é homozigoto para o transgene ehomozigoto para pelo menos uma mutação de perda de função em um geneFAD3 é obtida na etapa (ii) submetendo-se uma pluralidade de plantas F2 apelo menos uma técnica de análise de DNA que permite identificação deuma planta F2 que é homozigoto para o referido transgene e homozigotopara pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3. Atécnica de análise de DNA compreende uma ou mais técnicas selecionadasdo grupo que consiste em análise de PCR, análise de PCR quantitativa,análise de SNP, análise de AFLP, análise de RFLP e análise de RAPD. Emcertas modalidades desta invenção, a técnica de análise de DNAcompreende a detecção de pelo menos um polimorfismo de nucleotídeoúnico em uma posição na seqüência de gene FAD3-1C que corresponde aonucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62,detecção de uma deleção no gene FAD3-1C de SEQ ID NO:62, ou detecçãode pelo menos um polimorfismo de nucleotídeo único em uma seqüênciapromotora FAD3-1C de soja que corresponde a uma guanina no nucleotídeo334, uma citosina no nucleotídeo 364, uma timina no nucleotídeo 385, umaadenina no nucleotídeo 387, uma citosina no nucleotídeo 393, uma guaninano nucleotídeo 729 e uma citosina no nucleotídeo 747 de SEQ ID NO:63.Em outras modalidades desta invenção, a técnica de análise de DNAcompreende a detecção de um polimorfismo de nucleotídeo único em umgene FAD3-1B de soja que compreende uma substituição de um resíduo detimina para um resíduo de citosina em uma posição na seqüência de geneFAD3-1b que corresponde ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61. Nestemétodo, o transgene pode também compreender um transgene que conferetolerância ao herbicida e a planta de soja F1 que é heterozigoto para oreferido transgene é obtida na etapa (i) submetendo-se uma pluralidade deplantas F1 à seleção de herbicida para o referido transgene.Semelhantemente, quando o transgene também compreende um transgeneque confere tolerância ao herbicida, uma pluralidade de plantas F2enriquecidas para plantas de soja F2 que são homozigoto para o referidotransgene é obtida na etapa (ii) submetendo-se a referida pluralidade deplantas F2 à seleção de herbicida para o referido transgene. Este métodotambém pode ainda compreender a etapa iii) de fertilização cruzadacontínua da planta progênie F2 que é homozigoto para o transgene ehomozigoto para pelo menos uma mutação de perda de função em um geneFAD3 da etapa (ii) para obter uma planta de soja F3.

Um método alternativo de fazer plantas de soja quecompreendem um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1de soja endógena e pelo menos uma mutação de perda de função em umgene FAD3 de soja endógena envolve a transformação direta de plantas oucélulas de soja que compreendem a mutação com o transgene. Deste modoesta planta de soja é feita na primeira etapa da invenção transformando-seuma planta de soja ou célula de planta que compreende pelo menos umamutação de perda de função em um gene FAD3 de soja endógena com umtransgene que diminui a expressão de gene FAD2-1 de soja endógena paraobter uma planta de soja RO com menos uma mutação de perda de funçãoem um gene FAD3 que é heterozigoto para o referido transgene, porfertilização cruzada contínua da planta progênie RO da etapa anterior paraobter uma planta de soja R1 que é homozigoto para o transgene ehomozigoto para pelo menos uma mutação de perda de função em um geneFAD3, desse modo obtendo uma planta de soja que compreende umtransgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 de soja endógena epelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 de sojaendógena. Em certas modalidades deste método, o transgene tambémcompreende seqüências que conferem uma característica de tolerância aoherbicida. Em outras modalidades da invenção, o transgene tambémcompreende seqüências que conferem tolerância ao glifosato.

Esta invenção também abrange plantas de soja produzidaspelos métodos acima mencionados da invenção como também partes deplanta de plantas de soja produzidas pelos métodos da invenção. A parte deplanta de soja produzida pode ser pólen, um óvulo, um meristema, umafolha, um talo, uma raiz, ou uma célula. As plantas de soja progênies dasplantas de soja produzidas por estes métodos também são contempladaspor esta invenção. A invenção também abrange semente da planta de sojaproduzida pelos métodos da invenção onde esta semente tem umacomposição de ácido graxo que compreende um conteúdo de ácidolinolênico de menos do que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totaisem peso e um conteúdo de ácido oléico de cerca de 55% a cerca de 80% deácidos graxos de semente totais em peso. A invenção também abrangesemente da planta de soja produzida por métodos em que as plantas de sojacompreendendo pelo menos duas perdas de mutação de função em pelomenos dois genes FAD3 de soja endógenas, são usadas, a referida sementetendo uma composição de ácido graxo que compreende um conteúdo deácido linolênico de menos do que cerca de 3% de ácidos graxos de sementetotais em peso e um conteúdo de ácido oléico de cerca de 55% a cerca de80% de ácidos graxos de semente totais em peso.

Esta invenção também fornece um método para obter umaplanta de soja com uma composição de ácido graxo de óleo de sementealterada que compreende as etapas de: a) cruzar uma primeira linhagemorigem de soja tendo uma composição de ácido graxo de óleo de sementeque compreende um conteúdo de ácido linolênico de menos do cerca de 3%de ácidos graxos totais em peso com uma segunda linhagem origem de sojatendo uma composição de ácido graxo de óleo de semente em que oconteúdo de pelo menos um ácido graxo diferente de ácido linoléico éalterado em pelo menos 50% quando comparado ao conteúdo de ácidograxo correspondente de um óleo de soja de produto de consumo, a referidasegunda linhagem origem de soja que compreende um transgene que alterao conteúdo de pelo menos um ácido graxo diferente de ácido linoléico; e b)obter uma planta progênie que exibe uma composição de ácido graxo deóleo de semente que compreende um conteúdo de ácido linolênico demenos do que 3% de ácidos graxos totais em peso e um conteúdo de pelomenos um ácido graxo diferente de ácido linoléico que é alterado em pelomenos 50% quando comparado ao conteúdo de ácido graxo correspondentede um óleo de soja de produto de consumo, desse modo obtendo umaplanta de soja com uma composição de ácido graxo de óleo de sementealterada. Neste método, o ácido graxo diferente de ácido linolênico éselecionado do grupo que consiste em ácido láurico, ácido mirístico, ácidopalmítico, ácido esteárico, ácido estearidônico, ácido oléico, ácido linoléico,ácido γ-linoléico, ácido eicosapentanóico e ácido docosaexanóico.

A invenção também se refere a um método para produzir umaplanta de soja que compreende um conteúdo de ácido linolênico de menosdo que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totais em peso, umconteúdo de ácido graxo saturado de menos do que cerca de 8% em peso eum conteúdo de ácido oléico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidosgraxos de semente totais em peso. Este método da invenção é praticado poruma primeira etapa de preparação de uma ou mais plantas de soja quecompreendem um transgene que diminui a expressão de ambos um geneFAD2-1 de soja endógena e um gene de FATB endógeno, e pelo menosuma mutação de perda de função em um gene FAD3 de soja endógena,uma segunda etapa para obter pelo menos uma semente da referida plantade soja obtida da primeira etapa, uma terceira etapa de determinar umaporcentagem do conteúdo de ácido graxo de semente total em peso deácido linolênico, ácidos graxos saturados e ácido oléico para a semente dasegunda etapa, e então identificar uma planta de soja que produz sementeque tem uma composição de ácido graxo de semente que compreende umconteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 6% de ácidosgraxos de semente totais em peso, um conteúdo de ácido graxo saturado demenos do que cerca de 8% em peso e um conteúdo de ácido oléico de cercade 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso.

Em outras modalidades deste método, as plantas de soja quesão feitas na primeira etapa compreendem pelo menos duas mutações deperda de função em pelo menos dois genes FAD3 de soja endógena. Estaperda de mutações de função pode ser localizada nos genes FAD3-1B eFAD3-1C de soja endógena. Nesta modalidade do método, as plantas desoja identificadas na terceira etapa do método podem compreender umconteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 3% de ácidosgraxos de semente totais em peso, um conteúdo de ácido graxo saturado de menos do que cerca de 8% em peso e um conteúdo de ácido oléico de cercade 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso.

Em certas modalidades deste método, o transgene podetambém compreender um transgene que confere tolerância ao herbicida. Otransgene pode conferir tolerância ao glifosato. O transgene que confereresistência ao glifosato pode codificar um gene de EPSPS de CP4.

Na terceira etapa do método, a porcentagem do conteúdo deácido graxo de semente total em peso de ácido linolênico, ácidos graxossaturados e ácido oléico é determinada por uma técnica de análise de lipídio.Esta técnica de análise de lipídio compreende uma ou mais técnicasselecionadas do grupo que consiste em cromatografia de gás/detecção deionização por chama, espectroscopia de massa/cromatografia de gás,cromatografia de camada fina/detecção de ionização por chama,cromatografia líquida/espectrometria de massa, cromatografialíquida/espectrometria de massa de ionização por eletrovaporização ecromatografia líquida/espectroscopia de massa tandem de ionização poreletrovaporização.

A planta de soja que compreende pelo menos um transgene quediminui a expressão de ambos um gene FAD2-1 de soja endógena e umgene FATB endógeno e pelo menos uma mutação de perda de função emum gene FAD3 de soja endógena pode ser feita cruzando uma primeiralinhagem origem de soja compreendendo o transgene com uma segundalinhagem origem de soja compreendendo pelo menos uma mutação deperda de função em um gene FAD3 de soja endógena para obter uma plantade soja F1 que é heterozigoto para o transgene(s) e heterozigoto para pelomenos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 e entãofertilizando de modo cruzado contínuo as plantas progênies F1 docruzamento para obter uma planta de soja F2 que é homozigoto para oreferido transgene e homozigoto para pelo menos uma mutação de perda defunção em um gene FAD3. Em certas modalidades deste método, a segundalinhagem origem de soja compreende pelo menos duas mutações de perdade função em pelo menos dois genes FAD3 de soja endógena. Os doisgenes FAD3 de soja endógena podem ser FAD3-1B e FAD3-1C. Nestemétodo, a planta de soja F1 que é heterozigoto para o transgene e para pelomenos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 é obtida naetapa (i) submetendo uma pluralidade de plantas F1 a pelo menos umatécnica de análise de DNA que permite a identificação de uma planta F1 queé heterozigoto para o referido transgene e para pelo menos uma mutação deperda de função em um gene FAD3. Semelhantemente, a planta de soja F2que é homozigoto para o transgene e homozigoto para pelo menos umamutação de perda de função em um gene FAD3 é obtida na etapa (ii)submetendo-se uma pluralidade de plantas F2 a pelo menos uma técnica deanálise de DNA que permite a identificação de uma planta F2 que éhomozigoto para o referido transgene e homozigoto para pelo menos umamutação de perda de função em um gene FAD3. A técnica de análise deDNA compreende uma ou mais técnicas selecionadas do grupo que consisteem análise de PCR, análise de PCR quantitativa, análise de SNP, análise deAFLP, análise de RFLP e análise de RAPD. Em certas modalidades destainvenção, a técnica de análise de DNA compreende a detecção de pelomenos um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na seqüênciade gene FAD3-1C que corresponde ao nucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316,3292, 3360 ou 3743 da SEQ ID NO:62, ou detecção de uma deleção nogene FAD3-1C de SEQ ID NO:62, ou detecção de pelo menos umpolimorfismo de nucleotídeo único em uma seqüência promotora de sojaFAD3-1C que corresponde a uma guanina em nucleotídeo 334, uma citosinaem nucleotídeo 364, uma timina em nucleotídeo 385, uma adenina emnucleotídeo 387, uma citosina em nucleotídeo 393, uma guanina emnucleotídeo 729 e uma citosina dm nucleotídeo 747 de SEQ ID NO:63. Emoutras modalidades desta invenção, a técnica de análise de DNAcompreende a detecção de polimorfismo de nucleotídeo único em um geneFAD3-1B de soja que compreende uma substituição de um resíduo de timinapor um resíduo de citosina em uma posição na seqüência de gene Fad3-1 bque corresponde ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61. Neste método, otransgene também pode compreender um transgene que confere tolerânciaao herbicida e a planta de soja F1 que é heterozigoto para o referidotransgene é obtida na etapa (i) submetendo-se uma pluralidade de plantasF1 à seleção de herbicida para o referido transgene. Semelhantemente,quando o transgene também compreende um transgene que conferetolerância ao herbicida, uma pluralidade de plantas F2 enriquecida paraplanta de sojas F2 que são homozigoto para o referido transgene é obtida naetapa (ii) submetendo-se a referida pluralidade de plantas F2 à seleção deherbicida para o referido transgene. Este método também pode aindacompreender a etapa iii) de fertilização cruzada contínua da planta progênieF2 que é homozigoto para o transgene e homozigoto para pelo menos umamutação de perda de função em um gene FAD3 da etapa (ii) para obter umaplanta de soja F3.

Um método alternativo de fabricar plantas de soja quecompreendem pelo menos um transgene que diminui a expressão de ambosum gene FAD2-1 de soja endógena e um gene FATB de soja endógena eum gene FATB endógeno e pelo menos uma mutação de perda de funçãoem um gene FAD3 de soja endógena, envolve a transformação direta deplantas ou células de soja que compreendem a mutação com o transgene(s).Deste modo esta planta de soja é feita na primeira etapa da invençãotransformando-se uma planta ou célula de planta de soja que compreendepelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 de sojaendógena com um ou mais transgene(s) que diminui a expressão de ambosum gene FAD2-1 de soja endógena e um gene FATB de soja endógena paraobter uma planta de soja RO com pelo menos uma mutação de perda defunção em um gene FAD3 que é heterozigoto para o referido transgene,fertilizando de modo cruzado contínuo a planta progênie RO da etapaanterior para obter uma planta de soja R1 que é homozigoto para otransgene e homozigoto para pelo menos uma mutação de perda de funçãoem um gene FAD3, desse modo obtendo uma planta de soja quecompreende um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 desoja endógena e pelo menos uma mutação de perda de função em um geneFAD3 de soja endógena. Em certas modalidades deste método, o transgenetambém compreende seqüências que conferem uma característica detolerância ao herbicida. Em outras modalidades da invenção, o transgenetambém compreende seqüências que conferem tolerância ao glifosato.

Esta invenção também abrange plantas de soja produzidaspelos métodos acima mencionados da invenção como também partes deplanta de plantas de soja produzidas pelos métodos da invenção. A parte deplanta de soja produzida pode ser pólen, um óvulo, um meristema, umafolha, um talo, uma raiz, ou uma célula. As plantas de soja progênies dasplantas de soja produzidas por estes métodos também são contempladaspor esta invenção. A invenção também abrange semente da planta de sojaproduzida pelos métodos da invenção onde esta semente tem umacomposição de ácido graxo que compreende um conteúdo de ácidolinolênico de menos do que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totaisem peso, um conteúdo de ácido graxo saturado de menos que 8% em pesoe um conteúdo de ácido oléico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidosgraxos de semente totais em peso. A invenção também abrange semente daplanta de soja produzida por métodos em que as plantas de sojacompreendendo pelo menos duas mutações de perda de função em pelomenos dois genes FAD3 de soja endógena são usadas, a referida sementetendo uma composição de ácido graxo que compreende um conteúdo deácido linolênico de menos do que cerca de 3% de ácidos graxos de sementetotais em peso, um conteúdo de ácido graxo saturado de menos do que 8%em peso e um conteúdo de ácido oléico de cerca de 55% a cerca de 80% deácidos graxos de semente totais em peso.

As características e vantagens adicionais da presente invenção,como também a estrutura e operação de várias modalidades da presenteinvenção, são descritas em detalhes abaixo com referência para aosdesenhos acompanhantes.

Breve Descrição dos Desenhos

Os desenhos acompanhantes, que estão incorporados em eformam uma parte do relatório descritivo, ilustram as modalidades dapresente invenção e juntos com a descrição, servem para explicar osprincípios da invenção. Nos desenhos:

Figura 1 ilustra pCGN5469, um vetor de planta para diminuir aexpressão do gene FAD2-1 de soja;

Figura 2 ilustra pCGN5471, um vetor de planta para diminuir aexpressão do gene FAD2-1 de soja;

Figura 3 ilustra pCGN5485, um vetor de planta para diminuir aexpressão do gene FAD2-1 de soja; e

Figura 4 ilustra configurações de vetor de planta exemplarespara diminuir a expressão de um ou mais genes usando os elementos daseqüência de DNA dos genes de soja listados na Tabela 1.

Figura 5 ilustra as configurações de vetor de planta exemplarespara diminuir a expressão de um ou mais genes usando os elementos daseqüência de DNA dos genes FAD2-1 de soja e/ou FATB de soja listados naTabela 2.

Figura 6 ilustra vetores de planta exemplares para diminuir aexpressão de ambos os genes FAD2-1 e FATB de soja endógena.Descrição Detalhada da Invenção

A descrição das seqüências de ácido nucléicoSEQ ID NO: 1 é uma seqüência de ácido nucléico de um íntron 1de FAD2-1A.

SEQ ID NO: 2 é uma seqüência de ácido nucléico de um íntron 1de FAD2-1A.

SEQ ID NO: 3 é uma seqüência de ácido nucléico de umpromotor de FAD2-1B.

SEQ ID NO: 4 é uma seqüência de ácido nucléico de um clonegenômico de FAD2-1A.

SEQ ID NOs: 5 & 6 são seqüências de ácido nucléico de um 3 1UTR e 5'UTR de FAD2-1A, respectivamente.

SEQ ID NOs: 7-13 são seqüências de ácido nucléico de íntrons1, 2, 3A, 4, 5, 3B, e 3C de FAD3-1A, respectivamente.

SEQ ID NO: 14 é uma seqüência de ácido nucléico de um íntron4 de FAD3-1C.

SEQ ID NO: 15 é uma seqüência de ácido nucléico de um clonegenômico parcial de FAD3-1A.

SEQ ID NOs: 16 & 17 são seqüências de ácido nucléico de um3'UTR e 5'UTR FAD3-1 A, respectivamente.

SEQ ID NO: 18 é uma seqüência de ácido nucléico de um clonegenômico parcial de FAD3-1B.

SEQ ID NOs: 19-25 são seqüências de ácido nucléico de íntrons1, 2, 3A, 3B, 3C, 4, e 5 de FAD3-1B, respectivamente.

SEQ ID NOs: 26 & 27 são seqüências de ácido nucléico de um3'UTR e 5'UTR de FAD3-1B, respectivamente.

SEQ ID NO: 28 é uma seqüência de ácido nucléico de um clonegenômico de FATB-1.

SEQ ID NOS: 29-35 são seqüências de ácido nucléico de íntronsI1 II, III, IV, V, VI, e Vll de FATB-1, respectivamente.

SEQ ID NOs: 36 & 37 são seqüências de ácido nucléico de um3'UTR e 5'UTR FATB-1, respectivamente.SEQ ID NO: 38 é uma seqüência de ácido nucléico de um genede Cuphea pulcherrima KAS I.

SEQ ID NO: 39 é uma seqüência de ácido nucléico de um genede Cuphea pulcherrima KAS IV.

SEQ ID NOs: 40 & 41 são seqüências de ácido nucléico degenes de delta-9 dessaturase de Ricinus communis e Simmondsiachinensis, respectivamente.

SEQ ID NO: 42 é uma seqüência de ácido nucléico de um cDNAde FATB-2.

SEQ ID NO: 43 é uma seqüência de ácido nucléico de um clonegenômico de FATB-2.

SEQ ID NOs: 44-47 são seqüências de ácido nucléico de íntronsI, II, III, e IV de FATB-2 respectivamente.

SEQ ID NOs: 48-60 são seqüências de ácido nucléico deiniciadores de PCR.

SEQ ID NO:61 é uma seqüência de gene FAD3-1B quecorresponde à SEQ ID NO:1 do Pedido de Patente U.S. No. 10/176.149.

SEQ ID NO: 62 é uma seqüência de gene FAD3-1C quecorresponde à SEQ ID NO:2 do Pedido de Patente U.S. No. 10/176.149.

SEQ ID NO:63 é uma seqüência promotora de FAD3-1C quecorresponde à SEQ ID NO:3 do Pedido de Patente U.S. No. 10/176.149..

Definições

"ACP" se refere a uma porção de proteína veículo de acila."Composição de óleo de semente alterada" se refere a uma composição deóleo de semente de uma planta transgênica ou transformada da invençãoque alterou ou modificou os níveis dos ácidos graxos nesta, relativo a umóleo de semente de uma planta que tem uma base genética semelhanteporém que não foi transformada. "Supressão de anti-sentido" se refere aosilenciamento específico de gene que é induzido pela introdução de umamolécula de RNA anti-sentido.

"Agronomicamente elite", como usado aqui, significa umgenótipo que tem uma culminação de muitas características distinguíveis talcomo emersão, vigor, vigor vegetativo, resistência à doença, conjunto desemente, padronização e debulhabilidade que permitem um produtor colherum produto de significância comercial.

"Alelo" como usado aqui, se refere a qualquer de uma ou maisformas alternativas de um local de gene, todos dos quais alelos se referem aum traço ou característica. Em uma célula ou organismo diplóide, os doisalelos de um determinado gene ocupam lugares correspondentes em um parde cromossomos homólogos.

"Cruzamento reversível" como usado aqui, se refere a um processo no qual um criador cruza repetidamente a progênie híbrida, porexemplo, uma primeira geração híbrida (F1), de novo para um dos pares daprogênie híbrida. O cruzamento reversível pode ser usado para introduziruma ou mais conversões de local único de uma base genética em outra.

"Coexpressão de mais do que um agente tal como um mRNA ouproteína" se refere à expressão simultânea de um agente em estruturas detempo de sobreposição e na mesma célula ou tecido como outro agente."Expressão coordenada de mais de um agente" se refere à coexpressão demais do que um agente quando a produção de transcrições e proteínas detais agentes é realizada utilizando um promotor compartilhado ou o idêntico.

"Complemento" de uma seqüência de ácido nucléico se refereao complemento da seqüência ao longo de seu comprimento completo.

"Co-supressão" é a redução em níveis de expressão,normalmente no nível de RNA, de um gene endógeno particular ou famíliade gene pela expressão de um construto de sentido homólogo que é capazde transcrever mRNA da mesma fita como a cópia do gene endógeno.Napoli e outros, Plant Cell 2:279-289 (1990); van der Krol e outros, Plant Cell2:291-299 (1990).

Um gene de "CP4 EPSPS" ou "CP4 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase" codifica uma enzima (CP4 EPSPS) capaz de conferir umgrau significativo de resistência ao glifosato na célula de planta e plantasgeradas desta. A seqüência de EPSPS CP4 pode ser uma seqüência deEPSPS CP4 derivada de Agrobacterium tumefaciens sp. CP4 ou uma formavariante ou sintética deste, como descrito na Patente U.S. No. 5.633.435. Asseqüências de EPSPS CP4 representativas incluem, sem limitação, aquelasapresentadas nas Patentes U.S. Nos. 5.627.061 e 5.633.435.

"Cruzamento", como usado aqui, se refere ao acasalamento deduas plantas origem.

"Polinização cruzada", como usado aqui, se refere à fertilizaçãopela união de dois gametas de plantas diferentes.

"F1" ou "F1", como usado aqui, se refere à primeira progênie degeração do cruzamento das duas plantas.

"F1 Híbrido" ou F1 Híbrido", como usado aqui, se refere aprimeira progênie de geração do cruzamento de duas plantas não-isogênicas.

"F2" ou "F2", como usado aqui, se refere à segunda progênie degeração do cruzamento das duas plantas.

"F3" ou "F3", como usado aqui, se refere à segunda progênie degeração do cruzamento de duas plantas.

"Óleo de soja bruto" se refere ao óleo de soja que foi extraído desementes de soja, porém não foi refinado, processado, ou misturado,embora possa ser desengomado.

"CTP" se refere a um peptídeo de trânsito cloroplástico,codificado pela "seqüência de codificação de peptídeo de trânsitocloroplástico".

Ao se referir às proteínas e ácidos nucléicos aqui, "derivado" serefere ou diretamente (por exemplo, olhando na seqüência de uma proteínaou ácido nucléico conhecido e preparando uma proteína ou ácido nucléicoque tenha uma seqüência similar, pelo menos em parte, à seqüência daproteína ou ácido nucléico conhecido) ou indiretamente (por exemplo,obtendo uma proteína ou ácido nucléico de um organismo que estárelacionado com uma proteína ou ácido nucléico conhecido) obtendo umaproteína ou ácido nucléico de uma proteína ou ácido nucléico conhecido.Outros métodos "derivando" de uma proteína ou ácido nucléico de umaproteína ou ácido nucléico conhecido são conhecidos por alguém deexperiência na técnica.

RNA de filamento duplo ("dsRNA"), interferência de RNA defilamento duplo ("dsRNAi") e interferência de RNA ("RNAi") todos se referemao silenciamento específico de gene que é induzido pela introdução de umconstructo capaz de transcrever uma molécula de RNA pelo menosparcialmente de filamento duplo. Uma "molécula de dsRNA" e uma"molécula de RNAi" se referem a uma região de uma molécula de RNA quecontém segmentos com seqüências de nucleotídeo complementares eportanto podem hibridizar entre si e formar o RNA de filamento duplo. Taismoléculas de RNA de filamento duplo são capazes, quando introduzidas emuma célula ou organismo, de pelo menos parcialmente reduzir o nível deuma espécie de mRNA presente em uma célula ou uma célula de umorganismo. Além disso, o dsRNA pode ser criado após montagem in vivo defragmentos de DNA apropriados por recombinação ilegítima e recombinaçãoespecífica de sítio como descrito no Pedido Internacional No.PCT/US2005/004681, depositado em 11 de fevereiro de 2005, que estádesse modo incorporado pela referência em sua totalidade.

"Exon" se refere ao sentido normal do termo quando significandoum segmento de moléculas de ácido nucléico, normalmente DNA, quecodifica parte ou tudo de uma proteína expressa.

"FAD2" se refere a um gene ou proteína codificada capaz decatalisar a inserção de uma ligação dupla em uma porção de acila graxa nadécima segunda posição contada do terminal de carboxila. As proteínasFAD2 também são referidas como "Δ12 dessaturase" ou "omega-6dessaturase". O termo "FAD2-1" é usado para se referir a uma proteína ougene FAD2 que seja expresso naturalmente de uma maneira específica emtecido de semente, e o termo "FAD2-2" é usado para se referir a umaproteína ou gene FAD2 que seja (a) um gene diferente de uma proteína ougene FAD2-1 e (b) seja expresso naturalmente em tecidos múltiplos,incluindo a semente. As seqüências FAD2 representativas incluem, semlimitação, aquelas apresentadas no Pedido de Patente U.S. No. 10/176.149,depositado no dia 21 de junho de 2002, e em SEQ ID NOs: 1-6.Um gene "FAD3", "Δ15 dessaturase" ou "omega-3 dessaturase"codifica uma enzima (FAD3) capaz de catalisar a inserção de uma ligaçãodupla em uma porção de acila graxa na décima quinta posição contada doterminal de carboxila. Os termos "FAD3-1, FAD3-A, FAD3-B e FAD3-C" sãousados para se referir aos membros da família de gene FAD3 que sãoexpressos naturalmente em tecidos múltiplos, incluindo a semente. Asseqüências FAD3 representativas incluem, sem limitação, aquelasapresentadas no Pedido de Patente U.S. No. 10/176.149 depositado no dia21 de junho de 2002, e em SEQ ID NOs: 7-27.

Um "FATB" ou "palmitoil-ACP tioesterase" se refere a um geneque codifica uma enzima (FATB) capaz de catalisar a clivagem hidrolítica daligação de tioéster de enxofre ao carbono no grupo protético de pantoteno depalmitoil-ACP como sua reação preferida. A hidrólise de outros tioésteres deACP de ácido graxo também pode ser catalisada por esta enzima. Asseqüências FATB-1 representativas incluem, sem limitação, aquelasapresentadas no Pedido Provisório U.S. No. 60/390.185, depositado no dia21 de junho de 2002; as Patentes U.S. N2s 5.955.329; 5.723.761; 5.955.650;e 6.331.664; e SEQ ID NOs: 28-37. As seqüências FATB-2 representativasincluem, sem limitação, aquelas apresentadas nas SEQ ID NOs: 42-47.

"Ácido graxo" se refere aos ácidos graxos livres e grupos deacila graxa.

"Gene" se refere a uma seqüência de ácido nucléico queabrange uma região promotora 5 1 associada com a expressão do produto degene, quaisquer regiões de íntron e exon e regiões não transladadas 3' ou 5'associadas com a expressão do produto de gene.

"Silenciamento de gene" se refere à supressão de expressão degene ou sub-regulação de expressão de gene.

Uma "família de gene" é dois ou mais genes em um organismoque codifica as proteínas que exibem atributos funcionais similares, e um"membro de família de gene" é qualquer gene da família de gene encontradodentro do material genético da planta, por exemplo, um "membro da famíliade gene FAD2" é qualquer gene FAD2 encontrado dentro do materialgenético da planta. Um exemplo de dois membros de uma família de gene éFAD2-1 e FAD2-2. Uma família de gene pode ser adicionalmenteclassificada pela semelhança das seqüências de ácido nucléico. Um gene,FAD2, por exemplo, inclui alelos naquele local. Preferivelmente, um membroda família de gene exibe pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos70%, mais preferivelmente pelo menos 80% de identidade de seqüência deácido nucléico na porção de seqüência de codificação do gene.

"Genótipo", como usado aqui, se refere à constituição genéticade uma célula ou organismo.

Como usado aqui, "Heterológo" significa de ocorrência nãonatural junto.

Uma molécula de ácido nucléico é dita ser "introduzida" se forinserida em uma célula ou organismo como resultado de manipulaçãohumana, de qualquer forma indireta. Os exemplos de moléculas de ácidonucléico introduzidas incluem, porém não estão limitados aos ácidosnucléicos que foram introduzidos em células por transformação, transfecção,injeção, e projeção, e aqueles que foram introduzidos em um organismo pormétodos incluindo, porém não limitado a, conjugação, endocitose, efagocitose.

"Intron" se refere ao sentido normal do termo como significandoum segmento de moléculas de ácido nucléico, normalmente DNA, que nãocodifica parte ou tudo de uma proteína expressa, e que, em condiçõesendógenas, é transcrito em moléculas de RNA, porém que é removido doRNA endógeno antes do RNA ser transladado em uma proteína. Uma"molécula de dsRNA de íntron" e uma "molécula de RNAi íntron" ambos sereferem a uma molécula de RNA de filamento duplo capaz, quandointroduzido em uma célula ou organismo, de pelo menos parcialmentereduzir o nível de uma espécie de mRNA presente em uma célula ou umacélula de um organismo onde a molécula de RNA de filamento duplo exibeidentidade suficiente para um íntron de um gene presente na célula ouorganismo para reduzir o nível de um mRNA que contém aquela seqüênciade íntron.Uma composição de óleo de semente de soja "pouco saturada"contém entre 3,6 e 8 por cento de ácidos graxos saturados em peso.

Uma composição de óleo "pouco linolênico" contém menos doque cerca de 3% de ácido linolênico em peso dos ácidos graxos totais empeso.

Uma "semente de soja meio oléica" é uma semente que tementre 55% e 85% de ácido oléico presente na composição de óleo dasemente em peso.

O termo "não-codificação" se refere às seqüências de moléculasde ácido nucléico que não codificam parte ou tudo de uma proteínaexpressa. As seqüências de não-codificação incluem, porém não estãolimitadas a introns, regiões promotoras, regiões não transladadas 3 '(3'UTRs), e regiões não transladadas 5 ' (5'UTRs).

O termo "composição de óleo" se refere aos níveis de ácidosgraxos.

"Fenótipo", como usado aqui, se refere às característicasdetectáveis de uma célula ou organismo, cujas características são amanifestação de expressão de gene.

Um promotor que é "operavelmente ligado" a uma ou maisseqüências de ácido nucléico é capaz de direcionar a expressão de uma oumais seqüências de ácido nucléico, incluindo seqüências de ácido nucléicode codificação e não-codificação múltiplas dispostas em uma configuraçãopolicistrônica.

Seqüências de ácido nucléico "fisicamente ligadas" sãoseqüências de ácido nucléico que são encontradas em uma única moléculade ácido nucléico. Uma "planta" inclui referência a plantas inteiras, órgãos deplanta (por exemplo, folhas, talos, raízes, etc.), sementes, e células deplanta e progênie do mesmo. O termo "célula de planta" inclui, semlimitação, culturas de~ suspensão de semente, embriões, regiõesmeristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos,esporófitos, pólen, e microesporos. "Promotores de planta", incluem, semlimitação, promotores virais de planta, os promotores derivados de plantas, eos promotores sintéticos capazes de funcionar em uma célula de planta parapromover a expressão de um mRNA.

Um "gene policistrônico" ou "mRNA policistrônico" é qualquergene ou mRNA que contém seqüências de ácido nucléico transcritas quecorrespondem às seqüências de ácido nucléico de mais do que um genealvejado para supressão. É entendido que tais genes policistrônicos oumRNAs podem conter seqüências que correspondem aos introns, 5'UTRs,3'UTRs, seqüências de codificação de peptídeo de trânsito, exons, oucombinações destes, e que um gene policistrônico recombinante ou mRNApode, por exemplo sem limitação, conter seqüências que correspondem aum ou mais UTRs de um gene e um ou mais introns de um segundo gene.

Como usado aqui, o termo "RO", "RO", "geração de RO" ou"geração de RO" se refere a uma planta transformada obtida porregeneração de uma célula de planta transformada.

Como usado aqui, o termo "R1", "R1", "geração de R1" ou"geração de R1" se refere às sementes obtidas de uma planta ROtransgênica fertilizada de modo cruzado contínuo. As plantas de R1, sãocrescidas das sementes de R1.

Um "promotor específico de semente" se refere a um promotorque é preferencialmente ou exclusivamente ativo em uma semente.

"Atividade preferencial" se refere à atividade promotora que ésubstancialmente maior na semente do que em outros tecidos, órgãos ouorganelas da planta. "Específico de semente" inclui sem limitação atividadena camada de aleurona, endosperma, embrião e/ou da semente.

"Supressão de íntron de sentido" se refere ao silenciamento degene que é induzido pela introdução de um íntron de sentido ou fragmentodeste. Supressão de íntron de sentido é descrita, por exemplo, por Fillatti emPCT WO 01/14538 A2.

"Expressão simultânea" de mais do que um agente tal como ummRNA ou proteína se refere à expressão de um agente ao mesmo tempoque outro agente. Tal expressão pode somente se sobrepor em parte etambém pode ocorrer em tecido diferente ou em níveis diferentes."Nível de óleo total" se refere à quantidade de agregado total deácido graxo sem levar em conta o tipo de ácido graxo. Como usado aqui, onível de óleo total não inclui a cadeia principal de glicerol.

"Transgene" se refere a uma seqüência de ácido nucléicoassociada com a expressão de um gene introduzida em um organismo. Umtransgene inclui, porém não está limitado a, um gene endógeno ou um genede ocorrência não natural no organismo.

Uma "planta transgênica" é qualquer planta que estavelmenteincorpora um transgene de uma maneira que facilita a transmissão daqueletransgene de uma planta por qualquer método sexual ou assexual.

Uma composição de óleo de semente de soja "zero saturada"contém menos do que 3,6 por cento de ácidos graxos saturados em peso.

Uma "mutação de perda de função" é uma mutação naseqüência de codificação de um gene, que faz com que a função do produtode gene, normalmente uma proteína, ou seja reduzida ou completamenteausente. Por exemplo, uma mutação de perda de função pode ser causadapela truncação do produto de gene por causa de uma mutação dedeslocamento ou sem sentido. Um fenótipo associado com um alelo comuma mutação de perda de função pode ser recessivo ou dominante.

Uma célula ou organismo pode ter uma família de mais do queum gene que codifica uma enzima particular, e a letra maiúscula que seguea terminologia de gene (A, B, C) é usada para designar o membro da família,isto é, FAD2-1A é um membro da família de gene diferente de FAD2-1B.Semelhantemente, FAD3-1A, FAD3-1B, e FAD3-1C representam osmembros distintos da família de gene FAD3-1. A perda de alelos de funçãode vários genes é representada em minúscula seguida por um sinal demenos (isto é, fad3-1b - e fad3-1c - representa perda de alelos de funçãodos genes FAD3-1B e FAD3-1C, respectivamente).

Como usado aqui, qualquer faixa apresentada é inclusiva dospontos finais da faixa a menos que de outro modo declarado.

A. Transgene que diminui a expressão do gene FAD2-1 de sojaendógenaVários transgenes que diminuem a expressão do gene FAD2-1de soja endógena podem ser usados para praticar os métodos da invenção.Ao suprimir, pelo menos parcialmente reduzir, reduzir, substancialmentereduzir, ou eliminar a expressão do gene de FAD2 endógeno efetivamente, aquantidade de proteína FAD2 disponível em uma célula de planta édiminuída, isto é, os níveis de estado constante da proteína FAD2 sãoreduzidos. Deste modo, uma diminuição na expressão de proteína FAD2 nacélula de soja pode resultar em uma proporção aumentada de ácidos graxosmono-insaturados tal como oleato (C18:1). As plantas de soja que contêmtransgenes que diminuem a expressão da soja endógena FAD2-1 eproduzem semente com ácido oléico aumentado são descritas na PatenteU.S. N9 7.067.722.

Vários transgenes que diminuem a expressão tanto de uma sojaendógena FAD2-1 quanto um gene FATB de soja endógena podem serusados para praticar os métodos da invenção para produção de plantas desoja com um fenótipo de ácido pouco linolênico, pouco saturado, meiooléico. Ao suprimir, pelo menos parcialmente reduzir, reduzir,substancialmente reduzir, ou efetivamente eliminar a expressão do geneFATB endógeno, a quantidade de proteína FATB disponível em uma célulade planta é diminuída, isto é os níveis de estado constante da proteína FATBsão reduzidos. Quando a quantidade de FATB é diminuída em uma célula deplanta, uma quantidade diminuída de ácidos graxos saturados tal comopalmitato e estearato, pode ser fornecida. Deste modo, uma diminuição deFATB pode resultar em uma proporção aumentada de ácidos graxos nãosaturados tal como oleato (18:1).

Vários métodos para diminuir a expressão de qualquer um: 1) ogene(s) FAD2-1 de soja endógeno ou 2) ambos os genes de FAD2-1 eFATB de soja endógena em plantas de soja e semente são contempladospor esta invenção, incluindo, porém não limitado a, supressão de anti-sentido, co-supressão, ribozimas, combinações de sentido e anti-sentido(RNAi de filamento duplo), silenciamento de promotor, e uso de proteínas deligação de DNA tal como proteínas de ligador de zinco. A prática geraldestes métodos com respeito aos vários genes de planta endógenos édescrita em WO 98/53083, WO 01/14538, e Patente U.S. 5.759.829. Asupressão de expressão de gene em plantas, também conhecida comosilenciamento de gene, ocorre tanto no nível transcricional quanto no nívelpós-transcricional. Certo destes mecanismos de silenciamento de gene, sãoassociados com homologia de ácido nucléico no nível de DNA ou RNA. Talhomologia se refere à semelhança em seqüências de DNA ou proteínadentro das mesmas espécies ou entre espécies diferentes. O silenciamentode gene ocorre se a seqüência de DNA introduzida em uma célulahospedeira for suficientemente homóloga a um gene endógeno cujatranscrição da seqüência de DNA introduzida induzirá ao silenciamento degene transcricional ou pós-transcricional do gene endógeno. Para praticaresta invenção, as seqüências de DNA com pelo menos 50%, cerca de 60%,ou cerca de 70% idênticas no comprimento total de uma seqüência de DNAde uma região de codificação ou região de não-codificação de FAD2-1 ouFATB de soja, ou para uma seqüência de ácido nucléico que écomplementar a uma região de codificação ou não-odificação FAD2-1 ouFATB de soja, têm homologia suficiente para supressão de níveis deexpressão de estado constante de FAD2-1 ou FATB quando introduzidos emplantas de soja como transgenes. Os transgenes da invenção compreendemseqüências de DNA que são, em seu comprimento total, maispreferivelmente pelo menos 80% idênticas; pelo menos 85% idênticas; pelomenos 90% idênticas; pelo menos 95% idênticas; pelo menos 97% idênticas;pelo menos 98% idênticas; pelo menos 99% idênticas; ou 100% idênticas auma região de codificação ou região de não-codificação do gene FAD2-1 ouFATB de soja, ou a uma seqüência de ácido nucléico que é complementar auma região de codificação ou não-codificação de gene de FAD2-1 ou FATBde soja. As seqüências de DNA com os níveis indicados acima de identidadepara o gene(s) FAD2-1 ou FAT de soja podem ser seqüências decodificação, seqüências de íntron, seqüências 3'UTR, seqüências 5'UTR,seqüências promotoras, outras seqüências de não-codificação, ou qualquercombinação dos anteriores. O íntron pode ser localizado entre os exons, oulocalizado em um UTR 5 1 ou 3' de um gene de planta. A seqüência decodificação é preferivelmente uma fração de uma estrutura de codificação deproteína que não codifica uma proteína com atividade enzimática de FAD2.

Entretanto, é reconhecido que em certos casos, tal como em co-supressão,as seqüências de DNA que codificam uma proteína de FATB ou FAD2enzimaticamente ativa podem ser usadas para diminuir a expressão dogene(s) FAD2-1 ou de FATB de soja endógena.

Também é entendido que as seqüências de DNA com os níveisindicados acima de identidade para o gene FAD2-1 de soja que são úteisnos métodos desta invenção podem ser derivadas de qualquer gene FAD2de soja, o gene FAD2-1A de soja (SEQ ID NO:4), o íntron FAD2-1A de soja(SEQ ID NO:1), íntrons FAD2-1B de soja (SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3), ogene FAD2-2 de soja, alelos do gene FAD2-1 de soja, alelos do gene FAD2-2 de soja, e de genes FAD2 derivados de outras plantas Ieguminosas talcomo Medicago sp., Pisum sp., Vicia sp., Phaseolus sp., e Pisum sp. Estádeste modo claro que a seqüência de DNA com os níveis indicados deidentidade para a seqüência de FAD2-1 de soja pode ser derivada demúltiplas fontes. As seqüências de DNA com os níveis indicados deidentidade de seqüência também podem ser obtidas sinteticamente.

Semelhantemente, também é entendido que as seqüências deDNA com os níveis indicados acima de identidade para o gene FATB de sojaque são úteis nos métodos desta invenção podem ser derivadas de qualquergene FATB de soja, um gene FATB-1 de soja (SEQ ID NO:28), íntronsFATB-1 de soja (SEQ ID NOS:29-35), FATB-1 5'UTR de soja (SEQ IDNO:36), FATB-1 3'UTR de soja (SEQ ID NO:37), o gene FATB-2 de soja(SEQ ID NO:43), alelos do FATB-1 soja, alelos do gene FATB-2 de soja, ede genes FATB derivados de outras plantas Ieguminosas tal como Medicagosp., Pisum sp., Vicias sp., Phaseolus sp., e Pisum sp. Está deste modo claroque a seqüência de DNA com os níveis indicados de identidade para aseqüência FAD2-1 de soja pode ser derivada de fontes múltiplas. Asseqüências de DNA com os níveis indicados de identidade de seqüênciatambém podem ser obtidas sinteticamente.Nos métodos desta invenção, os transgenes especificamentedesignados para produzir as moléculas de RNA de filamento duplo (dsRNA)com homologia para o gene FAD2-1 também podem levar ao silenciamentoespecífico de seqüência FAD2-1 e podem ser usados para diminuir aexpressão do gene FAD2-1 de soja endógena. As seqüências de filamentode sentido do dsRNA podem ser separadas das seqüências de anti-sentidopor uma seqüência espaçadora, preferivelmente uma que promova aformação de uma molécula de dsRNA. Os exemplos de tais seqüênciasespaçadoras incluem aqueles apresentados em Wesley e outros, Plant J., 27(6):581-90 (2001), e Hamilton e outros, Plant J., 15:737-746 (1988). Emum aspecto preferido, a seqüência espaçadora é capaz de formar umaestrutura de grampo como ilustrado em Wesley e outros, supra. Asseqüências espaçadoras particularmente preferidas neste contexto sãoíntrons de planta ou partes destes. Um íntron de planta particularmentepreferido é um íntron ligável. Os íntrons ligáveis incluem, porém não estãolimitados a, um íntron selecionado do grupo que consiste em íntron PDK,íntron No. 5 FAD3-1A ou FAD3-1B, íntron No. 1FAD3, íntron No. 3A deFAD3, íntron No. 3B de FAD3, íntron No. 3C de FAD3, íntron No. 4 de FAD3,íntron No. 5 de FAD3, íntron No. 1 de FAD2, e íntron de FAD2-2. Asmoléculas de sentido orientado de não-codificação podem ser,opcionalmente separadas das moléculas anti-sentido orientadascorrespondentes por um segmento espaçador de DNA. O segmentoespaçador pode ser um fragmento de gene ou o DNA artificial. O segmentoespaçador pode ser curto para facilitar a formação do dsRNA de grampo decabelo ou longo para facilitar dsRNA sem uma estrutura de grampo decabelo. O espaçador pode ser fornecido estendendo-se o comprimento deuma das moléculas de sentido ou anti-sentido como descrito na US2005/0176670 A1. Alternativamente, uma seqüência borda direita - bordadireita ("RB-RB") pode ser criada após a inserção no genoma de plantacomo descrito no Pedido de Patente U.S. 2005/0183170.

Os transgenes da invenção tipicamente incluirão um promotorfuncional em uma célula de planta, ou um promotor de planta que éoperavelmente unido a uma seqüência de DNA acima mencionada quediminui a expressão de um gene FAD2-1 ou FATB de soja endógena. Oprojeto de um tal vetor geralmente está dentro da capacidade da técnica(Veja, por exemplo, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark(ed.), Springer, Nova Iorque (1997)). Entretanto, é reconhecido que osconstructos ou vetores também podem conter um gene sem promoto quepode utilizar um promotor endógeno em inserção. Vários promotores quesão ativos em células de planta foram descritos na literatura tal como ospromotores de CaMV 35S e FMV. As versões realçadas ou duplicadas dospromotores CaMV 35S e FMV 35S também podem ser usadas paraexpressar uma seqüência de DNA acima mencionada que diminui aexpressão de um gene FAD2-1 endógeno (Odell e outros, Nature 313: 810-812 (1985); Patente U.S. No. 5.378.619). Os promotores adicionais quepodem ser utilizados são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S.5.378.619; 5.391.725; 5.428.147; 5.447.858; 5.608.144; 5.608.144;5.614.399; 5.633.441; 5.633.435; e 4.633.436. Além disso, um realçadorespecífico de tecido pode ser usado com um promotor de planta basal. Ospromotores basais compreendem tipicamente uma caixa "TATA" e um sítiode estrutura de mRNA porém necessita de elementos realçadoresrequeridos para níveis elevados de expressão.

Os promotores particularmente preferidos para uso nostransgenes da presente invenção são promotores que expressam umaseqüência de DNA que diminui a expressão de um gene FAD2-1 ou FATBde soja endógena em sementes ou frutas. Realmente, em uma modalidadepreferida, o promotor usado é um promotor específico de semente. Osexemplos de tais promotores específicos de semente incluem as regiõesreguladoras 5' de tais genes como napin (Kridl e outros, Seed Sei. Res.1:209-219 (1991)), faseolina, estearoil-ACP dessaturase, 7Sa, 7Sa' (Chen eoutros, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:8560-8564 (1986)), USP1 arcelin e oleosina.

Os promotores preferidos para expressão na semente são promotores de7Sa, 7a', napin, e FAD2-1A.

Os constructos ou vetores também incluirão tipicamente umterminador transcricional 3' ou sinal de poliadenilação 3' que éoperavelmente ligado a uma seqüência de DNA acima mencionada quediminui expressão de um gene FAD2-1 ou FATB de soja endógena. O sinalde terminação transcricional pode ser qualquer sinal de terminaçãotranscricional funcional em uma planta, ou qualquer sinal de terminaçãotranscricional de planta. Os sinais de terminação transcricionais preferidosincluem, porém não estão limitados a, uma seqüência de ervilha Rubisco E93 uma seqüência de Brassica napin 3 ', uma seqüência de tml 3 ', e umaseqüência de gene 3' de nopalina sintase (NOS) de plasmídeo de induçãode tumor (Ti) de Agrobactéria. É entendido que este grupo de regiões depoliadenilação exemplares seja não Iimitante e alguém versado na técnicapoderia empregar outras regiões de poliadenilação que não são citadas aquiexplicitamente na prática desta invenção.

Finalmente, também é reconhecido que podem ser inseridostransgenes da invenção em vetores de transformação de planta que tambémcompreendem genes que codificam marcadores selecionáveis ou declassificáveis. O gene marcador selecionável pode ser um gene que codificauma proteína de neomicina fosfotransferase, uma proteína de fosfinotricinaacetiItransferase, uma proteína de 5-enol-piruvilchiquimato-3-fosfato sintaseresistente ao glifosato (EPSPS), uma proteína de higromicinafosfotransferase, uma proteína de diidropteroato sintase, uma proteína deacetolactato sintase insensível à sulfoniluréia, uma proteína Q insensível àatrazina, uma proteína de nitrilase capaz de degradar bromoxinila, umaproteína de dealogenase capaz de degradar dalapon, uma proteína de 2,4-diclorofenoxiacetato monoxigenase, uma proteína de diidrofolato reductaseinsensível a metotrexato, e uma proteína de octopina sintase insensível aaminoetilcisteína. Os agentes seletivos correspondentes usados junto comcada gene podem ser: neomicina (para seleção de proteína neomicinafosfotransferase), fosfinotricina (para seleção de proteína fosfinotricinaacetiltransferase), glifosato (para seleção de proteína 5-enol-piruvilchiquimato-3-fosfato sintase resistente ao glifosato (EPSPS)),higromicina (para seleção de proteína higromicina fosfotransferase),sulfadiazina (para uma seleção de proteína diidropteroato sintase),clorsulfurona (para uma seleção de proteína acetolactato sintase insensívelà sulfoniluréia), atrazina (para uma seleção de proteína Q insensível àatrazina), bromoxinila (para uma seleção de proteína nitrilase), dalapon (parauma seleção de proteína dealogenase), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (parauma seleção de proteína 2,4-diclorofenoxiacetato monoxigenase),metotrexato (para uma seleção de proteína diidrofolato reductase insensívela metotrexato), ou aminoetilcisteína (para uma seleção de proteína octopinasintase insensível à aminoetilcisteína). Um gene marcador selecionávelpreferido é um gene de EPSPS de CP4 que confere resistência ao glifosatoherbicida. O gene de marcador classificável pode ser um gene que codificauma proteína beta-glicuronidase, uma proteína verde fluorescente, umaproteína amarela fluorescente, uma proteína beta-galactosidase, umaproteína Iuciferase derivada de um gene luc, uma proteína de Iuciferasederivada de um gene lux, uma proteína sialidase, proteína de estreptomicinafosfotransferase, uma proteína de nopalina sintase, uma proteína deoctopina sintase ou uma proteína cloranfenicol acetil transferase.

As moléculas de ácido nucléico descritas acima sãomodalidades que alcançam os objetivos, características e vantagens dapresente invenção. Não é pretendido que a presente invenção fique limitadaàs modalidades ilustradas. A disposição das seqüências nos primeiro esegundo grupo D de seqüências de DNA na molécula de ácido nucléico nãoé limitada às disposições ilustradas e descritas, e pode ser alterada dequalquer maneira adequada para alcançar os objetivos, características evantagens da presente invenção como descrito aqui e ilustrado nosdesenhos acompanhantes.

B. Organismos Transgênicos, e Métodos para Produzir o Mesmo

Quaisquer das moléculas de ácido nucléico e constructos dainvenção podem ser introduzidas em uma planta de soja ou célula de plantade uma maneira permanente ou transiória. Os métodos e tecnologia paraintrodução de DNA em células de planta de soja são bem conhecidas poraqueles de experiência na técnica, e virtualmente qualquer método pelo qualmoléculas de ácido nucléico podem ser introduzidas em uma célula éadequado para uso na presente invenção. Os exemplos não Iimitantes demétodos adequados incluem: métodos químicos; métodos físicos tal comomicroinjection, eletroporação, a pistola de gene, bombardeio de microprojétil,e infiltração a vácuo; vetores virais; e mecanismos mediados por receptor.Outros métodos de transformação de célula também podem ser usados epodem ser incluídos porém não estão limitados a introdução de DNA emplantas através de transferência de DNA direta em pólen, por injeção diretade DNA em órgãos reprodutivos de uma planta, ou por injeção direta deDNA nas células de embriões imaturos seguido pela reidratação deembriões dessecados.

A transferência mediada por Agrobactéria é um sistemaextensamente aplicável para introduzir genes em células de planta. Veja, porexemplo, Fraley e outros, Bio/Technology 3:629-635 (1985); Rogers eoutros, Methods Enzymol. 153:253-277 (1987). A região de DNA a sertransferida é definida pelas seqüências fronteiras e o DNA interveniente énormalmente inserido no genoma de planta. Spielmann e outros, Mol. Gen.Genet. 205:34 (1986). Os novos vetores de transformação de Agrobactériasão capazes de réplica em E. coli como também Agrobactéria, permitindomanipulações convenientes. Klee e outros, Em: Plant DNA InfectiousAgents, Hohn e Schell (eds.), Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 179-203(1985). A transformação mediada por Agrobactéria de soja especificamenteé descrita na Patente U.S. No. 7.002.058.

As plantas transgênicas são obtidas tipicamente ligando-se ogene de interesse (isto é, neste caso um transgene que diminui a expressãode um gene FAD2-1 de soja endógena ou que diminui a expressão tanto deum gene FAD2-1 quanto gene FATB) a um gene marcador selecionável,introduzindo os transgenes ligados em uma célula de planta, um tecido deplanta ou uma planta antes de qualquer um dos métodos descritos acima, eregenerando ou de outro modo recuperando a planta transgênica sobcondições que requerem expressão do referido gene marcador selecionávelpara crescimento de planta. Os genes marcadores selecionávéis exemplarese os agentes seletivos correspondentes foram descritos em seçõesanteriores desta descrição da invenção.

As plantas transgênicas também podem ser obtidas ligando-seum gene de interesse (isto é, neste caso um transgene que diminuiexpressão de um gene FAD2-1 de soja endógena ou que diminui aexpressão de ambos um gene FAD2-1 ou gene FATB) a um gene marcadorclassificável, introduzindo os transgenes ligados em uma célula de plantaantes de qualquer um dos métodos descritos acima, e regenerando asplantas transgênicas de células de planta transformadas que testam positivopara expressão do gene marcador classificável. Os genes marcadoresclassificáveis exemplares foram descritos em seções anteriores destadescrição da invenção.

A regeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas detransformantes de protoplasto de planta única ou de vários explantestransformados, são bem-conhecidos na técnica. Geralmente veja, Maliga eoutros, Methods in Plant Biologia Molecular, Cold Spring Harbor Press(1995); Weissbach and Weissbach, In: Methods for Plant Biology Molecular,Academic Press, San Diego, CA (1988). As plantas da presente invençãopodem ser parte de ou podem ser geradas de um programa de reprodução,e podem ser reproduzidas também usando apomixia. Os métodos para aprodução de plantas apomíticas são conhecidos na técnica. Veja, porexemplo, Patente U.S. 5.811.636.

Um método particular de obter plantas de soja poucolinolênicas/meio oléicas contemplado aqui requer a transformação direta devariedades de soja que compreendem pelo menos uma mutação de perdade função em um gene FAD3 de soja endógena com um transgene quediminui a expressão de um gene FAD2-1 de soja endógena. Os exemplos devariedades de soja que compreendem pelo menos uma mutação de perdade função em um gene FAD3 de soja endógena incluem A5, C1640, 6P248,N98-44, T27111, T27190, T26767, T26830, e soja de Soyola® (veja Pedidode Patente U.S. 20060107348 e Burton e outros, Crop Sei. 44:687-688,2004). Também é contemplado que outras linhagens de soja quecompreendem pelo menos uma mutação de perda de função em um geneFAD3 de soja endógena e que possuem crescimento agronomicamente elitee/ou produzem características produzidas pelos métodos de reproduçãoajudados pelo marcador descritos em, veja Pedido de Patente U.S.20060107348 poderiam ser transformadas diretamente com um transgeneque diminui a expressão de um gene FAD2-1 de soja endógena.Alternativamente, também é contemplado que as linhagens de soja quecompreendem pelo menos uma mutação de perda de função em um geneFAD3 de soja endógena e que são sensíveis à transformação podem serproduzidas pelos métodos de reprodução ajudados pelo marcador descritosem, veja Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676. As plantas de sojacompreendendo pelo menos uma mutação de perda de função em um geneFAD3 de soja endógena e que são sensíveis à transformação tambémpodem ser transformadas diretamente com um transgene que diminui aexpressão de um gene FAD2-1 de soja endógena. Três outras sojas poucolinolênicas que poderiam ser transformadas diretamente pelos métodos dainvenção incluem BARC12 que é uma linhagem No. 3 de grupo dematuridade determinante, linhagens de soja Vistive® (Monsanto, St.Louis,MO., USA), ou 0137648/01AHKW-38, que é uma linhagem hilum amarelo L2 NUL.

Também é contemplado que as plantas de soja poucolinolênicas que são transformadas diretamente com o transgene nosmétodos da invenção podem ser derivadas de germplasma de soja quecompreende regiões genômicas de planta de soja que contêm fad3-1bfad3-1c-, ou ambos os alelos fad3-1 b- e fad3-1c - que conferem conteúdo deácido linolênico diminuído. Tais polimorfismos de nucleotídeo únicoassociados com o fenótipo de soja pouco linolênico são descritos no Pedidode Patente U.S. No. 11/239.676. Em certas modalidades, uma regiãogenômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico écaracterizada por um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição naseqüência de gene FAD3-1B que corresponde ao nucleotídeo 2021 de SEQID NO:61. Em outra modalidade, a região genômica de soja que confere ofenótipo de baixo teor de ácido linolênico, é caracterizada por umpolimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na seqüência de geneFAD3-1C que corresponde ao nucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292,3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62. Em outra modalidade, a região genômicade soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico écaracterizada por um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição nopromotor de FAD3-1C que corresponde ao nucleotídeo 334, 364, 385, 387,393, 729 ou 747 de SEQ ID NO:63. Em outra modalidade, a regiãogenômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico écaracterizada por uma deleção no gene FAD3-1C. As regiões genômicas desoja que conferem o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico tambémpodem ser caracterizadas por ambos um polimorfismo de nucleotídeo únicoem uma posição na seqüência de gene FAD3-1B que corresponde aonucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61 e uma deleção na seqüência de geneFAD3-1c. As regiões genômicas de soja que conferem o fenótipo de baixoteor de ácido linolênico também podem ser caracterizadas por ambos umpolimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na seqüência de geneFAD3-1B que corresponde ao nucleotídeo 2021 da SEQ ID NO:61 e umpolimorfismo no promotor de FAD3-1C, tal como um polimorfismo denucleotídeo único em uma posição que corresponde ao nucleotídeo 334,364, 385, 387, 393, 729 ou 747 de SEQ ID NO:63. Germplasma de soja quecompreende uma deleção no gene de soja de FAD3-1C é útil na práticadestes métodos e pode ser obtido de linhagens de soja que incluem porémnão são limitadas às linhagens de soja 6P248, T27111, T27190, T26767,T26830 e A5, descritas no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676.

A detecção dos polimorfismos de nucleotídeo único pode serrealizada por qualquer método, incluindo PCR, análise de polimorfismoconformacional de filamento único, eletroforese de gel de gradiente dedesnaturação, análise de polimorfismo de fragmento de comprimento declivagem e/ou seqüenciamento de DNA como descrito no Pedido de PatenteU.S. No. 11/239.676. Alternativamente, o polimorfismo de nucleotídeo únicopode ser detectado por qualquer ensaio que seja selecionado do grupo queconsiste em extensão de base única (SBE), seqüenciamento de extensão deiniciador específico de alelo (ASPE), seqüenciamento, PCR universal,extensão específica de alelo, hibridização, espectrometria de massa,ligação, ligação por extensão, e ensaios mediados por Flap Endonuclease.

Os iniciadores e métodos para detecção dos polimorfismos genéticos FAD3-1B e FAD3-1C acima mencionados são descritos no Pedido de Patente U.S.No. 11/239.676. As deleções tal como aquelas no gene FAD3-1C podemser detectadas por métodos que incluem porém não estão limitados à PCR,hibridização, análise de polimorfismo de fragmento de comprimento declivagem e/ou os métodos com base em seqüenciamento de DNA.

Os métodos de transformação diretas como descrito acimatambém podem ser usados para obter plantas de soja poucolinolênicas/pouco saturadas/meio oléicas. Nestes métodos, as plantas desoja pouco linolênicas acima mencionadas são transformadas diretamentecom transgenes que diminuem a expressão tanto de um gene FAD2-1 desoja endógena quanto um gene FATB de soja endógena para produção deplantas de soja com um fenótipo de ácido pouco linolênico, pouco saturado,meio oléico.

Os transgenes que podem ser usados na transformação outransfecção de planta podem ser quaisquer dos transgenes que diminuem aexpressão de qualquer um: 1) o gene(s) FAD2- 1 de soja endógena ou 2)ambos gene(s) FAD2-1 e FATB de soja endógena. É contemplado tambémque vetores que compreendem transgenes que diminuem a expressão dequalquer um: 1) o gene(s) FAD2-1 de soja endógena ou 2) ambos os genesFAD2-1 e FATB de soja endógena também podem compreender ou sergeneticamente combinados com transgenes adicionais. Por exemplo, ostransgenes adicionais que expressam outros genes que afetam acomposição de óleo, resistência de patógeno, produção, morfologia,composição de proteína, composição de aminoácido, composição de amido,e nível de fitato são descritos no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676 epodem ser combinados com os transgenes e mutantes poucos linolênicosdescritos aqui.Não é pretendido que a presente invenção seja limitada àsmodalidades ilustradas. As moléculas de ácido nucléico exemplares foramdescritas na parte A da Descrição Detalhada, e moléculas de ácido nucléicoexemplares não-limitantes também são descritas e ilustradas abaixo nasFiguras 1-4, e nos Exemplos.

C. Cruzamentos de Plantas de Soja que Contêm Transgenes

Em outro aspecto, uma planta da invenção pode ser cruzadacom outra planta que seja transgênica ou não-transgênica. Uma planta podeser cruzada com outra planta que tenha uma composição de óleo quecontém níveis modificados de ácidos graxos, por exemplo sem limitação,uma variedade com uma composição de óleo que tem um nível de ácidolinolênico mais baixo. Em uma modalidade preferida, uma planta da presenteinvenção é cruzada com uma variedade com menos do que 3% em peso deácido linolênico. Em outra modalidade da invenção, uma planta da presenteinvenção é cruzada com outra planta que tem mais do que 20% em peso doácido esteárico. Tal planta, tendo níveis modificados de ácidos graxos, éconhecida e descrita na técnica, por exemplo, em Hawkins e Kridl (1998)Plant Journal 13(6):743-752 e Patente U.S. No. 6.365.802.

Em particular, os cruzamentos de plantas de soja quecompreendem um transgene qualquer que diminua a expressão de um geneFAD2-1 de soja endógena ou diminua a expressão de ambos os genesFAD2-1 e FATB de soja endógena com variedades de soja quecompreendem pelo menos uma mutação de perda de função em um geneFAD3 de soja endógena, são contemplados pelos métodos desta invenção.

Os exemplos de variedades de soja que compreendem pelo menos umamutação de perda de função em um gene FAD3 de soja endógena incluemA5, C1640, 6P248, N98-44, T27111, T27190, T26767, T26830, e soja deSoyola® (veja Pedido de Patente U.S. 20060107348 e Burton e outros, CropSei. 44:687-688, 2004). Também é contemplado que outras linhagens desoja que compreendem pelo menos uma mutação de perda de função emum gene FAD3 de soja endógena e que possuem crescimentoagronomicamente elite e/ou produzem características produzidas pelosmétodos de reprodução ajudados pelo marcador descritos em, veja Pedidode Patente U.S. 20060107348 poderiam ser cruzadas com plantas de sojaque compreendem um transgene que diminui a expressão de um geneFAD2-1 de soja endógena. Três outros pares de cruzamento poucolinolênico que poderiam ser usados nos métodos da invenção incluemBARC12 que é uma linhagem No. 3 de grupo de maturidade determinante,linhagem de soja Vistive®, ou 0137648/01AHKW-38, que é uma linhagemhilum amarelo L2 NUL.

Também é contemplado que as plantas de soja pouco linolênicausadas no cruzamento com o transgene(s) podem ser derivadas degermplasma de soja que compreende regiões genômicas de planta de sojaque contêm fad3-1b -, fad3-1c-, ou ambos alelos fad3-1b- e fad3-1c- queconferem teor de ácido linolênico diminuído. Tais polimorfismos denucleotídeo único, associados com o fenótipo de soja pouco linolênico sãodescritos no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676. Em certasmodalidades, uma região genômica de soja que confere o fenótipo de baixoteor de ácido linolênico é caracterizada por um polimorfismo de nucleotídeoúnico em uma posição na seqüência de gene FAD3-1B que corresponde aonucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61. Em outra modalidade, a regiãogenômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico écaracterizada por um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição naseqüência de gene FAD3-1C que corresponde ao nucleotídeo 687, 1129,1203, 2316, 3292, 3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62. Em outra modalidade, aregião genômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácidolinolênico é caracterizada por um polimorfismo de nucleotídeo único em umaposição no promotor de FAD3-1C que corresponde ao nucleotídeo 334, 364,385, 387, 393, 729 ou 747 de SEQ ID NO:63. Em outra modalidade, a regiãogenômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico écaracterizada por uma deleção no gene FAD3-1C. As regiões genômicas desoja que conferem o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico tambémpodem ser caracterizadas por ambos um polimorfismo de nucleotídeo únicoem uma posição na seqüência de gene FAD3 -1B que corresponde aonucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61 e uma deleção na seqüência de geneFAD3-1C. As regiões genômicas de soja que conferem o fenótipo de baixoteor de ácido linolênico também podem ser caracterizadas por ambos umpolimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na seqüência de geneFAD3-1B que corresponde ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61 e umpolimorfismo no promotor de FAD3-1C, como um polimorfismo denucleotídeo único em uma posição que corresponde ao nucleotídeo 334,364, 385, 387, 393, 729 ou 747 de SEQ ID NO:63. Germplasma de soja quecompreende uma deleção no gene FAD3-1C de soja é útil na prática destesmétodos e pode ser obtido de linhagens de soja que incluem porém nãoestão limitadas à linhagem de soja 6P248, T27111, T27190, T26767,T26830 e A5, descrita no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676. AsTabelas 3 e 4 dos Exemplos descrevem a associação de polimorfismosespecíficos com germplasma de soja específico ou linhagens de soja queexibem fenótipos de ácido pouco linolênico.

Sem estar limitado por teoria, é também notado que certospolimorfismos e deleções em certos genes FAD3-1C são potencialmente emparte responsáveis pelos fenótipos de ácidos pouco linolênicos exibidos porplantas de soja que carregam estes polimorfismos ou deleções. O SNP na2021 posição em SEQ ID NO:61 é uma mutação de sentido que muda umresíduo de aminoácido de Histidina para Tirosina. O resíduo de histidina foiconstatado ser crítico em vários genes envolvidos com a dessaturação.Constatou-se que este SNP particular causou uma mutação no motivo His-Val-Ile-His-His a His-Val-Ile-His-Tyr nas linhagens pouco linolênicas. O motiffoi associado com um fenótipo pouco linolênico e é uma causa provável parao fenótipo de ácido linolênico reduzido observado em sojas com estepolimorfismo.

A detecção do polimorfismo de nucleotídeo único pode serrealizada por qualquer método, incluindo PCR, análise de polimorfismoconformacional de filamento único, eletroforese de gel de gradiente dedesnaturação, análise de polimorfismo de fragmento de comprimento declivagem e/ou seqüenciamento de DNA como descrito no Pedido de PatenteU.S. No. 11/239.676. Alternativamente, o polimorfismo de nucleotídeo únicopode ser detectado por qualquer ensaio que seja selecionado do grupo queconsiste em extensão de base única (SBE)1 seqüenciamento de extensão deiniciador específico de alelo (ASPE), seqüenciamento, PCR universal,extensão específica de alelo, hibridização, espectrometria de massa,ligação, ligação por extensão, e ensaios mediados por Flap Endonuclease.Iniciadores e métodos para detecção dos polimorfismos genéticos de FAD3-1B e FAD3-1C acima mencionados são descritos no Pedido de Patente U.S.No. 11/239.676. As deleções tal como aquelas no gene FAD3-1C podem serdetectadas por métodos que incluem porém não podem ser limitados à PCR,hibridização, análise de polimorfismo de fragmento de comprimento declivagem e/ou métodos com base em seqüenciamento de DNA.

Os métodos de cruzamento como descrito acima tambémpodem ser usados para obter planta de soja pouco linolênicas/poucosaturadas/meio oléicas. Nestes métodos, as plantas de soja poucolinolênicas, acima mencionadas são cruzadas com plantas de soja quecompreendem transgenes que diminuem a expressão de ambos um geneFAD2-1 de soja endógena e um gene FATB de soja endógena paraprodução de plantas de soja com um fenótipo de ácido pouco linolênico,pouco saturado, meio oléico.

É contemplado também que os cruzamentos do transgene(s)com as linhagens de soja pouco linolênicas, podem ser facilitados poracoplamento de um marcador selecionável que confere resistência a umherbicida. Por exemplo, em cruzamentos de plantas de soja que sãoheterozigoto para o transgene com plantas que são homozigoto ouheterozigoto para o alelo(s) conferindo a característica de pouco linolênico,progênie de F1 que é heterozigoto para o transgene pode ser selecionadaatravés de tratamento de herbicida. Também, as plantas F2 derivadas deplantas F1 que são heterozigoto para o transgene podem ser enriquecidaspara planta de soja F2 que são homozigoto para referido transgenesubmetendo-se a referida pluralidade de plantas F2 à seleção de herbicidapara o transgene. Os marcadores moleculares que podem distinguir plantasde soja que são heterozigoto ou homozigoto para o transgene tambémpodem ser usados para identificar plantas de soja que são homozigoto paraa inserção de transgene.

As plantas de soja (Glycine max L.) podem ser cruzadas atravésde qualquer técnica natural ou mecânica. A polinização natural ocorre emsojas ou por polinização propriamente dita ou polinização cruzada natural,que tipicamente é ajudada pela polinização dos organismos. Emcruzamentos naturais ou artificiais, florescência e tempo de florescência sãouma consideração importante. A soja é uma planta de dia curto, porém hávariação genética considerável quanto à sensibilidade ao fotoperíodo. Aduração de dia crítico para florescer varia de cerca de 13 h para genótiposadaptados a latitudes tropicais a 24 h para genótipos insensíveis afotoperíodo crescidos em latitudes mais altas. As sojas parecem serinsensíveis à duração do dia por 9 dias após a emersão. Os fotoperíodosmais curtos que o comprimento de dia crítico são requeridos durante 7 a 26dias para completar a indução de flor.

As flores da soja tipicamente são autopolinizadas no dia que acorola abre. O estigma é receptivo ao pólen cerca de 1 dia antes da antese epermanece receptivo durante 2 dias após antese, se as pétalas de flor nãoforem removidas. Os filamentos de nove estames são fundidos, e o maispróximo do padrão é livre. Os estames formam um anel abaixo do estigmaaté cerca de 1 dia antes da antese, então os seus filamentos começam a seprolongar rapidamente e elevar as anteras ao redor do estigma. As anterasdescem no dia da antese, os grãos de pólen caem no estigma, e dentro de10 h os tubos de pólen alcançam o ovário e a fertilização é completada. Aautopolinização ocorre naturalmente em soja sem manipulação das flores.Para o cruzamento de duas plantas de soja, é tipicamente preferível, emboranão exigido, utilizar hibridização artificial. Na hibridização artificial, a florusada como uma fêmea em um cruzamento é manualmente polinizadacruzada antes da maturação de pólen da flor, desse modo prevenindo aauto-fertilização, ou alternativamente, as partes masculinas da flor sãocastradas usando uma técnica conhecida na técnica. As técnicas paracastrar as partes masculinas de uma flor de soja incluem, por exemplo,remoção física das partes masculinas, uso de um fator genético que confereesterilidade masculina, e aplicação de uma gametocida química às partesmasculinas.

Ou com ou sem emasculação da flor feminina, a polinizaçãomanual pode ser realizada removendo os estames e pistilo com um fórcepsde uma flor origem masculino e escovando as anteras suavemente contra oestigma da flor feminina. O acesso para os estames pode ser alcançadoremovendo a sépala dianteira e pétalas de quilha, ou perfurando a quilhacom fórceps fechado e os permitindo-a abrir para empurrar as pétalas. Aescovação das anteras no estigma faz com que ele rompe, e a porcentagemmais alta de cruzamentos prósperos é obtida quando pólen é claramentevisível no estigma. O pólen caído pode ser verificado batendo as anterasantes de escovar o estigma. Várias flores masculinas podem ter que serusadas para obter pólen adequado caído quando as condições sãodesfavoráveis, ou o mesmo macho pode ser usado para polinizar váriasflores com bom pólen caído.

A esterilidade masculina genética está disponível em sojas epode ser útil para facilitar a hibridização no contexto da invenção atual,particularmente para programas de seleção periódica. A distância requeridapara isolamento completo de um bloco de cruzamento não está clara;porém, a herança de material genético é menor do que 0,5% quando plantasmacho-estéreis forem 12 m ou mais de uma fonte de pólen estrangeira(Boerma e Moradshahi, Crop Sci., 15:858-861, 1975). As plantas nos limitesde um bloco de cruzamento provavelmente sustentam a maior parte daherança de material genético com pólen estrangeiro e podem ser eliminadasna colheita para minimizar contaminação.

Uma vez colhidas, as vagens são tipicamente secadas a ar emnão mais do que 38°C até que as sementes contenham 13% de umidade oumenos, então as sementes são removidas manualmente. A semente podeser armazenada adequadamente em cerca de 25°C durante até um ano se aumidade relativa for 50% ou menos. Em climas úmidos, a porcentagem degerminação declina rapidamente, a menos que a semente seja secada a 7%de umidade e armazenada em um recipiente hermético em temperaturaambiente. O armazenamento em longo prazo em qualquer clima é melhorrealizado secando a semente a 7% de umidade e armazenando em 10°C oumenos em um ambiente mantido a 50% de umidade relativa ou em umrecipiente hermético.

F. Produtos da Presente invenção

As plantas da presente invenção podem ser usadas em todo ouem parte. As partes de planta preferidas incluem partes reprodutoras ou dearmazenamento. O termo "partes de planta" como usado aqui inclui, semlimitação, semente, endosperma, óvulo, pólen, raízes, tubérculos, talos,folhas, talos, fruta, bagas, nozes, cascas, vagens, sementes e flores. Emuma modalidade particularmente preferida da presente invenção a parte deplanta é uma semente.

Quaisquer das plantas ou partes desta da presente invençãopode ser processada para produzir um alimento, refeição, proteína, oupreparação de óleo. Uma parte de planta particularmente preferida para estepropósito é uma semente. Em uma modalidade preferida o alimento,refeição, proteína ou preparação de óleo é designada para animais de gado,peixes ou humanos, ou qualquer combinação. Métodos para produziralimento, refeição, proteína e preparações de óleo são conhecidos natécnica. Veja, por exemplo, Patentes U.S. 4.957.748. 5.100.679. 5.219.596.5.936.069. 6.005.076. 6.146.669. e 6.156.227. Em uma modalidadepreferida, a preparação de proteína é uma preparação de alto teor deproteína. Uma tal preparação de alto teor de proteína tem um conteúdo deproteína preferivelmente maior do que 5% em peso/volume, maispreferivelmente 10% em peso/volume, e até mesmo mais preferivelmente15% em peso/volume.

Em uma preparação de óleo preferida, a preparação de óleo éuma preparação com alto teor de óleo com um conteúdo de óleo derivado deuma planta ou parte desta da presente invenção maior do que 5% empeso/volume, mais preferivelmente 10% em peso/volume, e até mesmo maispreferivelmente 15% em peso/volume. Em uma modalidade preferida apreparação de óleo é um líquido e de um volume maior que 1,5, 10 ou 50litros. A presente invenção fornece óleo produzido de plantas da presenteinvenção ou gerado por um método da presente invenção. Tal óleo podeexibir estabilidade oxidativa aumentada. Também, tal óleo pode ser umcomponente secundário ou principal de qualquer produto resultante.

Além disso, tal óleo pode ser misturado com outros óleos. Emuma modalidade preferida, o óleo produzido de plantas da presenteinvenção ou gerado por um método da presente invenção constitui mais doque 0,5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 90% em volume ou peso docomponente de óleo de qualquer produto. Em outra modalidade, apreparação de óleo pode ser misturada e pode constituir mais do que 10%,25%, 35%, 50% ou 75% da mistura em volume. O óleo produzido de umaplanta da presente invenção pode ser misturado com um ou mais solventesorgânicos ou destilados de petróleo.

As sementes das plantas podem ser colocadas em umrecipiente. Como usado aqui, um recipiente é qualquer objeto capaz deguardar tal semente. Um recipiente contém mais do que cerca de 500,1,000, 5,000, ou 25,000 sementes preferivelmente onde pelo menos cercade 10%, 25%, 50%, 75% ou 100% das sementes são derivados de umaplanta da presente invenção. A presente invenção também fornece umrecipiente de mais do que cerca de 10.000, mais preferivelmente cerca de20.000, e até mesmo mais preferivelmente cerca de 40.000 sementes ondemais do que cerca de 10%, mais preferivelmente cerca de 25%, maispreferivelmente 50% e até mesmo mais preferivelmente cerca de 75% ou90% das sementes são sementes derivadas de uma planta da presenteinvenção. A presente invenção também fornece um recipiente de mais doque cerca de 10 kg, mais preferivelmente cerca de 25 kg, e até mesmo maispreferivelmente cerca de 50 kg de sementes onde mais do que cerca de10%, mais preferivelmente cerca de 25%, mais preferivelmente cerca de50% e até mesmo mais preferivelmente cerca de 75% ou 90% das sementessão sementes derivadas de uma planta da presente invenção.As sementes de soja produzidas pelos métodos da invençãopodem compreender várias composições de óleo. Um óleo produzido porsementes de soja produzidas pelos métodos da invenção é referido abaixocomo um "óleo da presente invenção".

Um óleo preferido da presente invenção tem uma composiçãode óleo pouco saturada, ou uma composição de óleo zero saturada. Emoutras modalidades preferidas, os óleos da presente invenção aumentaramos níveis de ácido oléico, reduziram os níveis de ácido graxo saturado, ereduziram os níveis de ácido graxo poliinsaturado. Em modalidades preferidas adicionais, os óleos da presente invenção aumentaram os níveisde ácido oléico e reduziram os níveis de ácido graxo saturado. Em umamodalidade preferida, o óleo é um óleo de soja. As porcentagens deconteúdo de ácido graxo, ou níveis de ácido graxo, usados aqui se referemàs porcentagens em peso.

Em uma primeira modalidade, um óleo da presente invençãotem uma composição de óleo que é 55 a 80% de ácido oléico, cerca de 12 a43% de poliinsaturados, preferivelmente e 2 a 8% de ácidos graxossaturados; mais preferivelmente tem uma composição de óleo que é 55 a80% de ácido oléico, cerca de 14 a 42% de poliinsaturados, e 3 a 6% de ácidos graxos saturados; e até mesmo mais preferivelmente tem umacomposição de óleo que é 55 a 80% de ácido oléico, cerca de 16,5 a 43% depoliinsaturados, e 2 a 3,6% de ácidos graxos saturados.

Em uma segunda modalidade, um óleo da presente invençãotem uma composição de óleo que é 65 a 80% de ácido oléico, cerca de 12 a33% de poliinsaturados, preferivelmente e 2 a 8% de ácidos graxossaturados; mais preferivelmente tem uma composição de óleo que é 65 a80% de ácido oléico, cerca de 14 a 32% de poliinsaturados, e 3 a 6% deácidos graxos saturados; e até mesmo mais preferivelmente tem umacomposição de óleo que é 65 a 80% de ácido oléico, cerca de 16,5 a 33% depoliinsaturados, e 2 a 3,6% de ácidos graxos saturados.

Em uma terceira modalidade, um óleo da presente invençãopreferivelmente tem uma composição de óleo que é cerca de 42 a cerca de85% de ácido oléico e cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxossaturados.

Em uma quarta modalidade, um óleo da presente invenção temuma composição de óleo que é cerca de 42 a cerca de 85% de ácido oléico,cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados, cerca de 6% acerca de 15% em peso de ácido linolênico; mais preferivelmente tem umacomposição de óleo que é cerca de 42 a cerca de 85% de ácido oléico,cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados, menos do que35% em peso de ácido linolênico; e até mesmo mais preferivelmente temuma composição de óleo que é cerca de 42 a cerca de 85% de ácido oléico,cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados, cerca de 9% empeso de ácido linolênico.

Em uma quinta modalidade, um óleo da presente invenção temuma composição de óleo que é cerca de 50% a cerca de 85% de ácidooléico e cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados; maispreferivelmente cerca de 50% a cerca de 85% de ácido oléico, cerca de 8%a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados, cerca de 4% a cerca de 14%em peso de ácido linolênico; mais preferivelmente tem uma composição deóleo que é cerca de 50% a cerca de 85% de ácido oléico, cerca de 8% acerca de 1,5% de ácidos graxos saturados, menos do que 35% em peso deácido linolênico; e até mesmo mais preferivelmente tem uma composição deóleo que é cerca de 42 a cerca de 85% de ácido oléico, cerca de 8% a cercade 1,5% de ácidos graxos saturados, cerca de 2% a cerca de 45% em pesode ácido linolênico.

Em outra modalidade, um óleo da presente invenção tem umacomposição de óleo que é cerca de 65-80% de ácido oléico, cerca de 3-8%de saturados, e cerca de 12-32% de poliinsaturados. Em outra modalidade,um óleo da presente invenção tem uma composição de óleo que é cerca de65-80% de ácido oléico, cerca de 2-3,5% de saturados, e cerca de 16,5-33%de poliinsaturados.

Em uma modalidade particularmente preferida, um óleo dapresente invenção tem uma composição de óleo que é cerca de 47-83% deácido oléico e cerca de 5% de saturados; cerca de 60-80% de ácido oléico ecerca de 5% de saturados; cerca de 50-85% de ácido oléico e cerca de 2-7%de saturados; cerca de 55-85% de ácido oléico e cerca de 2,5-7% desaturados; cerca de 47-88% de ácido oléico e cerca de 3-7% de saturados;cerca de 43-85% de ácido oléico e cerca de 5-7% de saturados; cerca de 81 -85% de ácido oléico e cerca de 5% de saturados; cerca de 74-83% de ácidooléico e cerca de 6% de saturados; cerca de 65-87% de ácido oléico e cercade 6% de saturados; cerca de 66-80% de ácido oléico e cerca de 6% desaturados; cerca de 42-77% de ácido oléico e cerca de 5-8% de saturados;cerca de 60-77% de ácido oléico e cerca de 6% de saturados; cerca de 70-81% de ácido oléico e cerca de 5-7% de saturados; cerca de 52-71% deácido oléico e cerca de 5-7% de saturados; cerca de 44-71% de ácido oléicoe cerca de 6% de saturados; cerca de 61-71% de ácido oléico e cerca de 8%de saturados; cerca de 57-71 % de ácido oléico e cerca de 7% de saturados;cerca de 23-58% de ácido oléico e cerca de 8-14% de saturados; cerca de20-70% de ácido oléico e cerca de 6% de saturados; cerca de 21-35% deácido oléico e cerca de 5-6% de saturados; ou cerca de 19-28% de ácidooléico e cerca de 5% de saturados.

Em outras modalidades, a porcentagem de ácido oléico é 50%ou maior; 55% ou maior; 60% ou maior; 65% ou maior; 70% ou maior; 75%ou maior; ou 80% ou maior; ou é uma faixa de 50 a 80%; 55 a 80%; 55 a75%; 55 a 65%; 60 a 85%; 60 a 80%; 60 a 75%; 60 a 70%; 65 a 85%; 65 a80%; 65 a 75%; 65 a 70%; ou 69 a 73%. As faixas de porcentagemadequadas para o conteúdo de ácido oléico em óleos da presente invençãotambém incluem faixas nas quais o limite mais baixo é selecionado dasseguintes porcentagens: 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63,64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, ou 80 por cento;e o limite superior é selecionado das seguintes porcentagens: 60, 61, 62, 63,64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83,84, 85, 86, 87, 88, 89, ou 90 por cento.

Em outras modalidades, a porcentagem de ácido linolênico emum óleo da presente invenção é 10% ou menos; 9% ou menos; 8% oumenos; 7% ou menos; 6% ou menos; 5% ou menos; 4.5% ou menos; 4% oumenos; 3,5% ou menos; 3% ou menos; 3,0% ou menos; 2,5% ou menos; ou2% ou menos; ou é uma faixa de 0,5 a 2%; 0,5 a 3%; 0,5 a 4,5%; 0,5% a6%; 3 a 5%; 3 a 6%; 3 a 8%; 1 a 2%; 1 a 3%; ou 1 a 4%.

Nestas outras modalidades, a porcentagem de ácidos graxossaturados em uma composição de óleo da presente invenção é 15% oumenos; 14% ou menos; 13% ou menos; 12% ou menos, 11% ou menos;10% ou menos; 9% ou menos; 8% ou menos; 7% ou menos; 6% ou menos;5% ou menos; 4% ou menos; ou 3,6% ou menos; ou é uma faixa de 2 a 3%;2 a 3.6%; 2 a 4%; 2 a 8%; 3 a 15%; 3 a 10%; 3 a 8%; 3 a 6%; 3,6 a 7%; 5 a8%; 7 a 10%; ou 10 a 15%.

Em outras modalidades, os ácidos graxos saturados em um óleoda presente invenção incluem a combinação dos ácidos graxos esteáricos epalmíticos. Em uma modalidade, a porcentagem de ácidos graxos saturadosvaria de cerca de 10% ou menos; cerca de 9% ou menos; cerca de 8% oumenos; cerca de 7% ou menos; cerca de 6% ou menos; cerca de 5% oumenos; cerca de 4,5% ou menos; cerca de 4% ou menos; cerca de 3,5% oumenos; cerca de 3% ou menos; cerca de 3,0% ou menos; cerca de 2,5% oumenos; ou cerca de 2% ou menos; ou é uma faixa de 0,5 a 2%; 0,5 a 3%;0,5 a 4,5%; 0,5 a 6%; 0,5 a 7%; 0,5 a 8%; 0,5 a 9%; 1 a 4%; 1 a 5%; 1 a 6%;1 a 7%; 1 a 8%; 1 a 9%; 1,5 a 5%; 1,5 a 6%; 1,5 a 7%; 1,5 a 8%; 1,5 a 9%; 2a 5%; 2 a 6%; 2 a 7%; 2 a 8%; 2 a 9%; 3 a 5%; 3 a 6%; 3 a 7%; 3 a 8%; 3 a9%; 4 a 7%; 4 a 8%; 4 a 9%; 5 a 7%; 5 a 8%; e 5 a 9%. Nestas modalidades,as faixas de porcentagem adequadas para conteúdo de ácido graxosaturado em óleos da presente invenção também incluem faixas nas quais olimite mais baixo é selecionado das seguintes porcentagens: 0,5, 1, 1,5, 2,0,2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, ou 6,5 por cento; e o limite superior éselecionado das seguintes porcentagens: 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3,2,5, 2, 1,5, 1, ou 0,5 por cento.

G. Modulação de Supressão

Outra modalidade da invenção é voltada a um método paramodular níveis de supressão de gene. A modulação de supressão de genepode resultar em mais ou menos supressão de gene. A supressão de umproduto de gene pode ser o resultado de inserção de um constructo dapresente invenção em um genoma de planta. Semelhantemente, amodulação de supressão de gene pode ser o resultado de inserção de um constructo da presente invenção em um genoma de planta. Outros exemplosde métodos para modular supressão de gene incluem, sem limitação,técnicas de anti-sentido, co-supressão, interferência de RNA (dsRNAi),animais transgênicos, híbridos, e ribozimas que usam uma construção dapresente invenção. Os seguintes exemplos são fornecidos como forma deilustração, e não é pretendido serem Iimitantes da presente invenção.

A supressão de um gene pode ser modulada alterando-se ocomprimento do DNA que pode ser transcrito usado para supressão, cujaseqüência é derivada do gene alvo para supressão. Muitos métodos podemser usados para suprimir um gene que usa mecanismos de silenciamento degene pós-transcricional. Sem estar limitado à teoria, acredita-se que estesmétodos tenham em comum a expressão de uma molécula de RNA quehibridiza para outra molécula de RNA. Surpreendentemente, pode servantajoso usar uma molécula de RNA de comprimentos particulares paramodular ou moderar a supressão dos níveis de expressão de estado constante de um gene endógeno alvo.

Supressão de gene de FAD2-1 leva a níveis elevados de ácidooléico e redução de níveis de ácido linoléico. Quando FAD2-1 é suprimidopesadamente, os níveis de ácido oléico podem ser maiores do que 65%, quecausa uma redução em níveis de ácido palmítico e ácido linolênico. Porexemplo, quando FAD2-1 é suprimido, os níveis de ácido oléico podemalcançar 85% e os níveis de ácido palmítico e esteárico combinados sãoreduzidos em cerca de 10%. Semelhantemente, a sub-regulação de FATBresulta em níveis diminuídos de ácidos graxos saturados, principalmentepalmitato. Quando FAD2 e FATB são suprimidos, então aqueles níveisoléicos são de cerca de 85%, os níveis de saturados são de cerca de 10%.Quando FAD2 e FATB são suprimidos, então aqueles níveis de oléico sãocerca de 85%, os níveis de saturados podem cair para abaixo de 10%.Levando em conta a presente invenção, os níveis de saturadospodem ser reduzidos para menos do que 10% sem aumentar os ácidosoléicos acima de 85%. Em uma modalidade, a supressão de FAD2 émodulada reduzindo o comprimento de íntron de FAD2-1 introduzido naplanta. Menos supressão de FAD2 resulta em níveis moderados de ácidooléico, aproximadamente 40-85% de ácido oléico. A supressão de FAD2 éreduzida quando o comprimento do fragmento de íntron de FAD2-1introduzido é reduzido. Por exemplo, um íntron de FAD2-1 reduzido emcomprimento em pelo menos 100 nucleotídeos contíguos pode reduzir asupressão de FAD2 e o aumento correspondente em ácido oléico e diminuirem níveis de ácido linoléico.

A relação entre a diminuição em supressão de gene endógeno ea diminuição em comprimento de DNA homólogo pode ser determinadaempiricamente introduzindo comprimentos diferentes de DNA. Por exemplo,a quantidade de redução em supressão obtenível por redução docomprimento de DNA introduzido homólogo pode ser determinadadeletando-se as porções crescentes do DNA homólogo sendo introduzido eensaiando para expressão do gene alvo.

Incluído na presente invenção é um método para moderar asupressão de FAD2 ao mesmo tempo em que ainda tendo uma reduçãoforte de níveis saturados em uma planta. Em tal planta, os níveis de ácidooléico podem variar de 40-85%. Semelhantemente, menos do que asupressão completa de FATB ocorre quando as regiões não transladadascombinadas 3 1 e 5 1 são introduzidas quando comparadas quando o geneFATB de tamanho natural é introduzido em uma célula hospedeira. Damesma maneira, os níveis de supressão de FATB são reduzidos quando aparte 5 1 da estrutura de leitura aberta, que principalmente codifica opeptídeo de trânsito de cloroplasto, é introduzida em uma célula hospedeira.

Em células com FAD2 e FATB suprimiu usando métodos de acordo com apresente invenção, níveis de ácido oléico podem ser 40-85% ao mesmotempo em que os níveis saturados podem estar entre 1 a 9 por cento.

Em uma modalidade, a presente invenção está voltada a ummétodo de modular a supressão de gene para reduzir a supressão relativa àsupressão de um elemento de gene inteiro, onde um elemento de geneinteiro pode ser um gene inteiro, um exon inteiro, um íntron inteiro, umaseqüência de sinal inteira, ou um UTR inteiro, em seguida construindo umamolécula de ácido nucléico recombinante que compreende um fragmento daseqüência endógena do elemento de gene; iniciando a expressão damolécula de ácido nucléico recombinante em uma célula hospedeira; esuprimindo o gene endógeno com a molécula de ácido nucléicorecombinante. O gene que é suprimido pode ser qualquer gene, incluindoFAD2 e FATB. Em uma modalidade, a presente invenção está voltada a ummétodo para modular supressão de FAD2 ou FATB que compreende:expressar uma seqüência de elemento de gene FAD2 ou FATB parcial emuma célula hospedeira onde um elemento de gene FAD2 ou FATB é de umgene FAD2 ou FATB endógeno na célula hospedeira e uma seqüência deelemento de gene FAD2 ou FATB pode ser um gene FAD2 ou FATB, umexon de FAD2 ou FATB, um íntron de FAD2 ou FATB, uma região decodificação de peptídeo de trânsito FAD2 ou FATB, ou um UTR de FAD2 ouFATB; e a seqüência de elemento de gene FAD2 ou FATB parcial é menordo que a seqüência de elemento de gene FAD2 ou FATB inteira; esuprimindo um FAD2 ou FATB endógeno com a seqüência de elemento degene FAD2 ou FATB parcial onde os níveis de supressão do gene FAD2 ouFATB endógeno na célula hospedeira são menores do que os níveis desupressão do gene FAD2 ou FATB endógeno em uma célula hospedeiracom uma base genética similar e uma segunda seqüência de ácido nucléicode FAD2 ou FATB que compreendem a seqüência de elemento de geneFAD2 ou FATB inteira do elemento de gene FAD2 ou FATB.

Em outra modalidade, a presente invenção está voltada a ummétodo para alterar a composição de óleo de uma célula de plantatransformando-se uma célula de planta com uma molécula de ácido nucléicorecombinante que compreende uma seqüência de DNA que suprimeexpressão endógena de FAD2, FATB, ou FAD2 e FATB onde a seqüênciade DNA compreende uma seqüência de ácido nucléico de FAD2, FATB, ouFAD2 e FATB que é mais curta do que a seqüência inteira de um elementogenético inteiro selecionado de um gene, um exon, um íntron, uma região decodificação de peptídeo de trânsito, um 3'-UTR, um 5'-UTR, e uma estruturade leitura aberta; e cultivando a célula de planta sob condições onde areferida transcrição de seqüência de DNA é iniciada, por meio da qual acomposição de óleo é alterada relativa a uma célula de planta com umabase genética semelhante porém necessitando da molécula de ácidonucléico recombinante. Um elemento de gene FAD2 ou FATB pode serencurtado em comprimento por 50, 75, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350,400, 450, 500, 600, 800, 1000, 2000, 3000, ou 4000 nucleotídeos. Umcomprimento de um elemento de gene FAD2 ou FATB pode ser 50, 75, 100,150, 175, 200, 220, 250, 300, 320, 350, 400, 420, 450, 500, 550, 600, 800,ou 1000 nucleotídeos.

Em outra modalidade, a presente invenção está voltada a ummétodo para aumentar o conteúdo de ácido oléico e reduzir o conteúdo deácido graxo saturado em uma semente de planta: i) encurtando-se ocomprimento de uma seqüência de DNA de FAD2 exógena em uma célulahospedeira até que a quantidade de supressão de expressão de FAD2 deuma planta transformada seja reduzida pelo menos parcialmente relativa àsupressão de expressão de FAD2 em uma célula hospedeira com uma basegenética similar e uma seqüência de DNA de gene FAD2 exógeno inteiro; eii) cultivando-se uma planta com uma molécula de ácido nucléico quecompreende a seqüência de DNA de FAD2 encurtada onde a seqüência deDNA de FAD2 encurtada pelo menos parcialmente suprime a expressãoendógena de FAD2; e iii) cultivando-se uma planta que produz semente comum conteúdo de ácido graxo saturado reduzido relativo a semente de umaplanta tendo uma base genética similar porém necessitando de seqüênciade DNA de FAD2 encurtada. A quantidade que a seqüência de DNA deFAD2 exógena é encurtada para pelo menos parcialmente reduzir asupressão do FAD2 endógeno pode ser determinada empiricamenteintroduzindo-se comprimentos diferentes de DNA. Por exemplo, aquantidade de redução em supressão obtenível reduzindo-se o comprimentode DNA introduzido homólogo, pode ser determinada deletando-se asporções crescentes do DNA homólogo sendo introduzido e ensaiandoquanto à expressão do gene alvo. A quantidade de supressão de expressãode FAD2 pode ser obtida como uma média de três ou mais, seis ou mais,dez ou mais, quinze ou mais, ou vinte ou mais sementes de uma planta.

Em outra modalidade, a presente invenção está voltada a ummétodo para produzir uma planta transformada que tem semente com umconteúdo de ácido graxo saturado reduzido transformando-se uma célula deplanta com uma molécula de ácido nucléico recombinante que compreendeuma seqüência de DNA que suprime a expressão endógena de FAD2 eFATB onde a seqüência de DNA compreende uma seqüência de ácidonucléico de FAD2 que é mais curta do que a seqüência inteira de umelemento genético inteiro selecionado de um gene, um exon, um íntron, umaregião de codificação de peptídeo de trânsito, e um UTR; e cultivando aplanta transformada onde a planta transformada produz semente com umteor de ácido graxo saturado reduzido relativo à semente de uma plantatendo uma base genética similar porém necessitando da referida moléculade ácido nucléico recombinante.

Em outra modalidade, a presente invenção está voltada a ummétodo de modular a composição de ácido graxo de óleo de uma sementede uma colheita de semente de óleo temperada isolando-se um elementogenético de pelo menos 40 nucleotídeos em comprimento que é capaz desuprimir a expressão de um gene endógeno na série de reação de síntesede ácido graxo; gerando-se mais do que um fragmento encurtado doelemento genético; introduzindo-se cada do mais que um fragmentoencurtado em uma célula de planta da colheita de semente de óleotemperada para produzir planta transgênica; e selecionando-se uma plantatransgênica que compreende um fragmento encurtado de determinadocomprimento e seqüência que efetuam uma mudança desejável nacomposição de ácido graxo de óleo de semente. Em uma modalidadepreferida, o método acima também inclui construir uma construção de DNArecombinante tendo pelo menos dois fragmentos encurtados de dois genesendógenos diferentes que efetuam mudanças desejáveis diferentes emcomposição de ácido graxo de óleo de semente; introduzir o constructo deDNA recombinante em uma célula de planta da colheita de semente de óleotemperada para produzir plantas transgênicas; e selecionar uma plantatransgênica que compreende o pelo menos dois fragmentos encurtados euma composição de ácido graxo de óleo de uma semente que tem mais doque uma mudança desejável efetuada pelo, pelo menos dois fragmentosencurtados.

Em outra modalidade, a presente invenção está voltada a umasemente de soja que exibe uma composição de óleo que tem um conteúdode ácido graxo saturado fortemente reduzido e um conteúdo de ácido oléicomoderadamente aumentado que tem uma seqüência de DNA que suprime aexpressão endógena de FAD2 em uma célula hospedeira onde a seqüênciade DNA tem uma seqüência de ácido nucléico de FAD2 que é mais curta doque a seqüência inteira de um elemento genético inteiro selecionado de umgene, um exon, um íntron, uma região de codificação de peptídeo detrânsito, e um UTR.

Exemplos

Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrarmodalidades preferidas da invenção. Deveria ser apreciado por aquelesversados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que seguemrepresentam técnicas descritas pelo inventor para funcionar bem na práticada invenção, e deste modo podem ser consideradas constituírem modospreferidos para sua prática. Entretanto, aqueles de experiência na técnicadeveriam, levando em conta a presente descrição, apreciar que podem serfeitas muitas mudanças nas modalidades específicas que são descritas eainda obtêm um resultado igual ou similar sem afastar-se do conceito,espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente quecertos agentes que são ambos quimicamente e fisiologicamenterelacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui ao mesmotempo em que os mesmos resultados ou resultados similares seriam obtidos.Todos tais substitutos e modificações similares evidentes para aquelesversados na técnica são julgados estar dentro do espírito, escopo e conceitoda invenção como definido pelas reivindicações apensas.Exemplo 1. Isolamento de Seqüências de FATB-2

Tecido de folha é obtido de variedade de soja Asgrow A3244,moído em nitrogênio líquido e é armazenado em 80°C até uso. Seis ml detampão de extração de SDS (650 ml de ddH20 estéril, 100 ml de 1M de Tris-Cl pH 8, 100 ml de 0,25M de EDTA, 50 ml de SDS a 20%, 100 ml de 5M deNaCI1 4μΙ de beta-mercaptoetanol) são adicionados a 2 ml de tecido de folhacongelada/moída, e a mistura é incubada a 65°C durante 45 minutos. Aamostra é agitada a cada 15 minutos. 2 ml de 5M de acetato de potássiogelado são adicionados à amostra, a amostra é agitada, e então é incubadaem gelo durante 20 minutos. 3 ml de CHCI3 são adicionados à amostra e aamostra é agitada durante 10 minutos.

A amostra é centrifugada em 10.000 rpm durante 20 minutos e osobrenadante é coletado. 2 ml de isopropanol são adicionados aosobrenadante e misturados. A amostra é então centrifugada a 10.000 rpmdurante 20 minutos e o sobrenadante é escoado. O pélete é novamentesuspenso em 200 μΙ de RNase e incubado a 65°C durante 20 minutos. 300μL de acetato de amônio/isopropanol (1:7) são adicionados e misturados. Aamostra é então centrifugada em 10.000 rpm durante 15 minutos e osobrenadante é descartado. O pélete é enxaguado com 500 μΙ de etanol a80% e permitido secar a ar. O pélete de DNA genômico é então novamentesuspenso em 200 μΙ de T10E1 (10 mM de Tris:1mM de EDTA).

Uma seqüência contígua de cDNA de FATB-2 de soja (SEQ IDNO: 42) é usada para designar treze oligonucleotídeos que ampliam o gene:F1 (SEQ ID NO: 48), F2 (SEQ ID NO: 49), F3 (SEQ ID NO: 50), F4 (SEQ IDNO: 51), F5 (SEQ ID NO: 52), F6 (SEQ ID NO: 53), F7 (SEQ ID NO: 54), R1(SEQ ID NO: 55), R2 (SEQ ID NO: 56), R3 (SEQ ID NO: 57), R4 (SEQ IDNO: 58), R5 (SEQ ID NO: 59), e R6 (SEQ ID NO: 60). Os oligonucleotídeossão usados em pares para amplificação de PCR do DNA genômico de sojaisolada: par 1 (F1 + R1), par 2 (F2 + R1), par (F3 + R2), par 4 (F4 + R3), par5 (F5 + R4), par 6 (F6 + R5), e par 7 (F7 + R6). A amplificação de PCR parapar 5 é realizada como segue: 1 ciclo, 95°C durante 10 minutos; 30 ciclos,95°C durante 15 segundos, 43°C durante 30 segundos, 72°C durante 45segundos; 1 ciclo, 72°C durante 7 minutos. Para todos os outros pares deoligo, as amplificações de PCR são realizadas como segue: 1 ciclo, 95°Cdurante 10 minutos; 30 ciclos, 95°C durante 15 segundos, 48°C durante 30segundos, 72°C durante 45 segundos; 1 ciclo, 72°C durante 7 minutos,fragmentos positivos São obtidos de pares de iniciador 1, 2, 4, 5, 6 e 7. Cadafragmento é clonado no vetor pCR2.1 (Invitrogen). Os fragmentos 2, 4, 5 e 6são confirmados e seqüenciados. Estas quatro seqüências são alinhadaspara formar uma seqüência genômica para o gene de FATB-2 (SEQ ID NO: 43).

Quatro íntrons são identificados no gene FATB-2 de soja porcomparação da seqüência genômica com a seqüência de cDNA: íntron I(SEQ ID NO: 44) amplia base 119 a base 1333 da seqüência genômica(SEQ ID NO: 43) e é 1215 pares de base em comprimento; íntron Il (SEQ IDNO: 45) amplia base 2231 a base 2568 da seqüência genômica (SEQ IDNO: 43) e é 338 pares de base em comprimento; íntron Ill (SEQ ID NO: 46)amplia a base 2702 a base 3342 da seqüência genômica (SEQ ID NO: 43) eé 641 pares de base em comprimento; e íntron IV (SEQ ID NO: 47) amplia abase 3457 a base 3823 da seqüência genômica (SEQ ID NO: 43) e é 367pares de base em comprimento.

Exemplo 2. Constructos de Supressão

2A. Constructos de FAD2-1

O íntron de FAD2-1A No. 1(SEQ ID NO: 1) é clonado no cassetede expressão, pCGN3892, em orientações de sentido e anti-sentido. O vetorpCGN3892 contém o promotor 7S de soja e uma ervilha rbcS 3'. Ambas asfusões de gene são então separadamente ligadas em pCGN9372, um vetorque contém o gene de EPSPS de CP4 regulado pelo promotor de FMV. Osconstructos de expressão resultantes (sentido de pCGN5469 e anti-sentidode pCGN5471, descritos nas figuras 1 e 2, respectivamente) são usadaspara transformação de soja.

O íntron de FAD2-1B (SEQ ID NO: 2) é fundido no terminal de 3'do íntron de FAD2-1A No.1 em plasmídeo pCGN5468 (contém o promotor7S de soja fundido ao íntron de FAD2-1A (sentido) e uma ervilha rbcS 3 ') oupCGN5470 (contém o promotor 7S de soja fundido ao íntron de FAD2-1A(anti-sentido) e uma ervilha rbcS 3') em orientação de sentido e anti-sentido,respectivamente. As fusões de combinação de íntron resultantes são entãoseparadamente ligadas em pCGN9372, um vetor que contém o gene deEPSPS de CP4 regulado pelo promotor de FMV. As construções deexpressão resultantes (sentido de íntron de pCGN5485, FAD2-1A & FAD2-1B e pCGN5486, FAD2-1A & anti-sentido de íntron de FAD2-1B) são usadospara transformação de soja.2B. Constructos de FAD3-1

íntrons de FAD3-1A No. 1, No. 2, No. 4 e No. 5 (SEQ ID NOs: 7,8, 10 e 11, respectivamente), íntrons de FAD3-1B No. 3C (SEQ ID NO: 23) eNo. 4 (SEQ ID NO: 24), são todos separadamente ligados em pCGN3892,em orientação de sentido ou anti-sentido. pCGN3892 contém o promotor 7Sde soja e uma ervilha rbcS 3'. Estas fusões são ligadas em pCGN9372, umvetor que contém o gene de EPSPS de CP4 regulado pelo promotor de FMVpara transformação em soja. Os constructos de expressão resultantes(pCGN5455, sentido de íntron de FAD3-1A No. 4; pCGN5459, anti-sentidode íntron de FAD3-1A No. 4; pCGN5456, sentido de íntron de FAD3 No. 5;pCGN5460, anti-sentido de íntron de FAD3-1A No. 5; pCGN5466, anti-sentido de íntron de FAD3-1A No. 2; pCGN5473, anti-sentido de íntron deFAD3-1A No. 1) são usados para transformação de soja.2C. Constructos de FatB

A seqüência de íntron Il de FATB-1 de soja (SEQ ID NO: 30) éampliada por PCR que usa um clone genômico parcial de FATB-1 como ummodelo. A amplificação de PCR é realizada como segue: 1 ciclo, 95°Cdurante 10 min; 25 ciclos, 95oC durante 30 segundos, 62°C durante 30segundos, 72°C durante 30 segundos; 1 ciclo, 72°C para 7 min. Aamplificação de PCR resulta em um produto que é 854 pares de base longo,incluindo sítios de restrição reconstruídos em ambos os terminais. O produtode PCR é clonado diretamente no pCGN3892 de cassete de expressão emorientação de sentido, por via de sítios de Xhol construídos sobre osterminais 5' dos iniciadores de PCR, para formar pl\/10N70674. PCGN3892de vetor contém o promotor 7S de soja e uma ervilha rbcS 3'. pMON70674 éentão cortado com Notl e ligado em pMON41164, um vetor que contém ogene de EPSPS de CP4 regulado pelo promotor de FMV. O constructo deexpressão de gene resultante, pMON70678, é usado para transformação desoja que usa métodos de Agrobactéria.

2D Constructos de Combinação

Os constructos de expressão são feitos contendo váriaspermutações de: 1) umas seqüências de FAD2-1 sozinhas (para métodos deprodução de soja pouco linolênica, meio oléica) e 2) combinaçõesseqüências de DNA de FAD2-1 e FATB. As seqüências de DNA sãoquaisquer daquelas descritas, ou ilustradas na Tabela 2, ou qualquer outrogrupo de seqüências de DNA que contém várias combinações de regiões denão-codificação ou codificação de FAD2 e/ou FATB de sentido, anti-sentido,ou sentido e anti-sentido de forma que eles sejam capazes de formar osconstructos de dsRNA, constructos de co-supressão de sentido, constructode anti-sentido, ou várias combinações do anterior.

Figura 4 descreve seqüências de DNA que são capazes deexpressar a co-supressão de constructos de sentido ou anti-sentido deacordo com a presente invenção, as seqüências de não-codificação que sãodescritas nas Tabelas 1 e 2 abaixo. As seqüências de não-codificaçãopodem ser seqüências únicas, combinações de seqüências (por exemplo, o5'UTR ligado ao 3'UTR), ou qualquer combinação dos anteriores. Paraexpressar uma construção de co-supressão de sentido, todas as seqüênciasde não-codificação são seqüências de sentido, e para expressar umconstructo de anti-sentido, todas as seqüências de não-codificação sãoseqüências de anti-sentido. Para expressar constructos de sentido e anti-sentido, são fornecidas seqüências de não-codificação de sentido e anti-sentido.

Figura 5 descreve vários primeiros grupos de seqüências deDNA que são capazes de expressar constructo de dsRNA de acordo com apresente invenção, as seqüências de não-codificação das quais sãodescritas nas Tabelas 1 e 2 abaixo. O primeiro grupo de seqüências de DNAdescrito na figura 5 compreende pares de seqüências de sentido e anti-sentido relacionadas, organizadas tal que, por exemplo, o RNA expressopela primeira seqüência de sentido seja capaz de formar um RNA defilamento duplo com o RNA de anti-sentido expresso pela primeira seqüênciade anti-sentido. Por exemplo, se referindo ao vetor mais alto da figura 5 ecombinação ilustrativa N9 1 (da Tabela 1), o primeiro grupo de seqüênciasde DNA compreende uma seqüência de FAD2-1 de sentido, uma seqüênciade FAD3-1 de sentido, uma seqüência de FAD2-1 de anti-sentido e umaseqüência de FAD3-1 de anti-sentido. Ambas as seqüências de anti-sentidocorrespondem às seqüências de sentido de forma que os produtos deexpressão do primeiro grupo de seqüências de DNA sejam capazes deformar um RNA de filamento duplo com cada outro. As seqüências de sentido podem ser separadas das seqüências de anti-sentido por umaseqüência espaçadora, preferivelmente uma que promova a formação deuma molécula de dsRNA. Os exemplos de tais seqüências espaçadorasincluem aqueles apresentados em Wesley e outros, supra, e Hamilton eoutros, Plant J., 15:737-746 (1988). O promotor é qualquer promotorfuncional em uma planta, ou qualquer promotor de planta. Os exemplos nãoLimitantes de promotores adequados são descritos na Parte A da Descrição

Detalhada.

O primeiro grupo de seqüências de DNA é inserido em umconstructo de expressão na orientação de sentido ou anti-sentido usandouma variedade de técnicas de manipulação de DNA. Se for conveniente ossítios de restrição estarem presentes nas seqüências de DNA, eles serãoinseridos no constructo de expressão digerindo-se com as endonucleases derestrição e ligação no constructo que foi digerido em um ou mais dos sítiosde clonagem disponíveis. Se sítios de restrição convenientes não estão disponíveis nas seqüências de DNA, o DNA ou do constructo ou dasseqüências de DNA é modificado em uma variedade de modos para facilitara clonagem das seqüências de DNA no constructo. Os exemplos demétodos para modificar o DNA incluem por PCR1 Iigador sintético ou ligaçãode adaptador, mutagênese de sítio direcionado in vitro, carregamento em ouredução de terminais de 5' ou 3' de projeção, e similares. Estes e outrosmétodos de manipulação de DNA são bem-conhecidos por aqueles deexperiência ordinária na técnica.

Tabela 1

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Tabela 2

<table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>

Exemplo 3

3A. Constructos de Anti-sentido

Se referindo agora à figura 7, as seqüências de não-codificaçãode FATB-2 de soja (SEQ ID NOs: 44-47), seqüências de não-codificação deFATB-1 (SEQ ID NOs: 29-37), e seqüências de não-codificação de FAD2-1(SEQ ID NOs: 1 e 5-6) são ampliadas por PCR para resultar em produtos dePCR que incluem sítios de restrição re-construídos em ambos os terminais.

Os produtos de PCR são clonados diretamente em orientação de sentido eanti-sentido em um vetor que contém o promotor 7Sa' de soja de umaseqüência de terminação tml 3'. O vetor é então cortado com umaendonuclease de restrição apropriada e ligado em pMON80612 um vetorque contém o gene de EPSPS de CP4 regulado pelo promotor de FMV euma seqüência de terminação de ervilha Rubisco E9 3'. O constructo deexpressão de gene resultante é descrita na maioria da constructo de base dafigura 7 e é usado para transformação usando métodos como descrito aqui.3B. Montagem In Vivo

Um aspecto da presente invenção inclui um constructo de DNAque monta em uma unidade de transcrição recombinante em umcromossomo de planta em planta que é capaz de formar o RNA de filamentoduplo. A montagem de tais constructos e os métodos para montagem in vivode uma unidade de transcrição recombinante para supressão de gene sãodescritos no Pedido Internacional No. PCT/US2005/00681, desse modoincorporado por referência em sua totalidade.

pMON95829 é um constructo usado para montagem in vivo quetem dois segmentos de T-DNA1 cada flanqueado por elementos de borda deT-DNA de Agrobactéria, isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de bordaesquerda (LB). O primeiro T-DNA contém um promotor 7Soc' de sojaoperavelmente ligando-se a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO:1), que é reduzido em 100 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado aos42 nucleotídeos contíguos de um 5' UTR de FATB-la, seguido pela regiãode codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto de FATB-1A ("CTP"), eum gene de EPSPS de CP4 operavelmente ligado a um promotor de FMVaumentado e uma seqüência de terminação de ervilha Rubisco E9 3' tudoflanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobactéria, isto é DNAde borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). No mesmo vetor nosegundo segmento de T-DNA1 flanqueado por outro RB e LB, está umaseqüência de terminação H6 3' operavelmente ligada a um íntron 1 deFAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), que é reduzido em 100 nucleotídeoscontíguos do terminal 3' e ligado aos 42 nucleotídeos contíguos de um 5 'UTR de FATB-la, seguiu pela região de codificação de peptídeo de trânsitode cloroplasto ("CTP") de FATB-1 A. Os constructos de expressão de generesultantes são usados para transformação usando métodos como descritoaqui.

pMON97595 é um constructo usado para montagem in vivo quetem dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por Elementos de borda deT-DNA de Agrobactéria , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de bordaesquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor de 7Sa'de soja operavelmente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ IDNO: 1) que é reduzido através de 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3'e ligado aos 42 nucleotídeos contíguos de um 5 ' UTR de FATB-la seguidopela região de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto ("CTP") deFATB-1A, e um Gene de EPSPS de CP4 operavelmente ligado a umpromotor de FMV aumentado e uma seqüência de terminação 3' de ervilharubisco E9 3', tudo flanqueado por Elementos de borda de T-DNA deAgrobactéria , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda(LB). No segundo segmento de T-DNA, flanqueado por outro RB e LB1 éuma seqüência de terminação 3' H6 operavelmente ligada a um íntron 1 deFAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), que é reduzido em 320 nucleotídeoscontíguos do terminal 3 1 e ligado aos 42 nucleotídeos contíguos de um 5 'UTR de FATB-la seguido pela região de codificação de CTP de FATB-1A. Oconstructo de expressão de gene resultante é usado para transformação queusa métodos como descrito aqui.

pMON97581 é um constructo usado para montagem in vivo quetem dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por elementos de borda deT-DNA de Agrobactéria, isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de bordaesquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor de 7Soc'de soja operavelmente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ IDNO: 1) que é reduzido em 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligadoà região de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto ("CTP") deFATB-1 A, e um gene de EPSPS de CP4 operavelmente ligado a umpromotor de FMV aumentado e uma seqüência de terminação 3' de ervilhaRubisco E9, tudo flanqueado por elementos de borda de T-DNA deAgrobactéria , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda(LB). No mesmo constructo, no segundo segmento de T-DNA, flanqueadopor outro RB e LB, está uma Seqüência de terminação 3' H6 operavelmenteligada a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em320 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado a região de codificaçãode CTP de FATB-la. O constructo de expressão de gene resultante é usadopara transformação que usa métodos como descrito aqui.

pMON97596 é um constructo usado para montagem in vivotendo dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por elementos de bordade T-DNA de Agrobactéria, isto é DNA de borda direita (RB) e DNA deborda esquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotorde 7Sa' de soja operavelmente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja(SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 320 nucleotídeos contíguos do terminal 31 e ligado a 5 1 180 pares de base da região de codificação de peptídeo detrânsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1 A, e um gene de EPSPS de CP4operavelmente ligado a um promotor de FMV aumentado e uma seqüênciade terminação 3' de ervilha Rubisco E9, tudo flanqueado por elementos deborda de T-DNA de Agrobactéria, isto é DNA de borda direita (RB) e DNA deborda esquerda (LB). No mesmo constructo, no segundo segmento de T-DNA, flanqueado por outro RB e LB, está uma seqüência de terminação 3'H6 operavelmente ligada a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1)que é reduzido em 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado ao 5 '180 pares de base da região de codificação de CTP de FATB-la. Oconstructo de expressão de gene resultante é usado para transformação queusa métodos como descrito aqui.

pMON97597 é um constructo usado para montagem in vivo quetem dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por elementos de borda deT-DNA de Agrobactéria , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de bordaesquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor de 7Soc'de soja operavelmente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ IDNO: 1) que é reduzido em 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligadoao 5 ' 120bp da região de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto("CTP") de FATB-1, e um gene de EPSPS de CP4 operavelmente ligado aum promotor de FMV aumentado e uma seqüência de terminação 3' deervilha Rubisco E9, tudo flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobactéria , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda(LB). No mesmo constructo, no segundo segmento de T-DNA, flanqueadopor outro RB e LB, está uma seqüência de terminação 3' H6 operavelmenteligada a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em320 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado ao 5 1 120 pares de baseda região de codificação de CTP de FATB-la. O constructo de expressão degene resultante é usado para transformação que usa métodos como descritoaqui.

pMON97598 é um constructo usado para montagem in vivo quetem dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por elementos de borda deT-DNA de Agrobactéria , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de bordaesquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor de 7Soc'de soja operavelmente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ IDNO: 1) que é reduzido em 340 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligadoà região de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto ("CTP") deFATB-1A, e um gene de EPSPS de CP4 operavelmente ligado a umpromotor de FMV aumentado e uma seqüência de terminação 3' de ervilhaRubisco E9, tudo flanqueado por elementos de borda de T-DNA deAgrobactéria , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda(LB). No mesmo constructo, no segundo segmento de T-DNA1 flanqueadopor outro RB e LB, está uma seqüência de terminação 3' H6 operavelmenteligada a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em340 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado à região de codificação deCTP de FATB-la. O constructo de expressão de gene resultante é usadapara transformação que usa métodos como descrito aqui.

Quando os dois segmentos de T-DNA de qualquer uma dasconstructos acima (isto é, pMON95829, pMON97595, pMON97581,pMON97597, pMON97598) são inseridos em um único lugar docromossomo de um organismo hospedeiro em uma orientação de RB paraRB, a unidade de transcrição montada tem um promotor de 7Sa' de sojaoperavelmente ligando o íntron 1 de FAD2-1A de soja orientado em sentidoe anti-sentido e fragmentos de DNA de FATB-la. Quando transcritas, asseqüências de RNA operavelmente ligadas orientadas em sentido e anti-sentido são capazes de formar o RNA de filamento duplo efetivo parasupressão de FAD2-1A e FATB.Exemplo 4. Transformação e Análise de Planta

Os constructos dos Exemplos 2 e 3 são estavelmenteintroduzidos em soja (por exemplo, variedade Asgrow A4922 ou variedadeAsgrow A3244 ou variedade Asgrow A3525) pelos métodos descritosanteriormente, incluindo os métodos de McCabe e outros, Bio/Technology,6:923-926 (1988), ou transformação mediada por Agrobactéria. As plantasde soja transformadas são identificadas através de seleção em meios quecontêm agente selecionável ou herbicidas. O herbicida pode ser glifosatoquando um transgene que confere resistência ao glifosato for usado.Composições de ácido graxo são analisadas de linhagens de semente desoja transformadas com o constructo usando cromatografia de gás.

Para algumas aplicações, são descritas composições de ácidograxo modificadas em sementes em desenvolvimento, considerando que emoutros exemplos, tal como para análise de perfil de óleo, a detecção demodificações de ácido graxo que ocorre depois na série de reação de FAS,ou para detecção de modificações secundárias para a composição de ácidograxo, a análise de ácido graxo ou óleo de sementes maduras é realizada.

Além disso, análise de conteúdo de óleo e/ou ácido graxo de sementesindividuais pode ser desejável, especialmente na detecção da modificaçãode óleo na segregação de populações de semente R1. Como usado aqui, ageração de RO indica a planta que surge de protocolos de transformação /regeneração descritos aqui, a geração de R1 indica sementes crescidas naplanta RO transgênica fertilizada de modo cruzado contínuo. As plantas R1são crescidas das sementes R1.

As composições de ácido graxo são determinadas para asemente de linhagens de soja transformadas com o constructo do Exemplo3. Uma a dez sementes de cada das linhagens de soja de controle etransgênicas são moídas usando um homogenizador de tecidoindividualmente (Pro Scientific) para extração de óleo. O óleo de semente desoja moída é extraído durante a noite em 1,5 ml de heptano que contêmtrieptadecanoína (0,50 mg/ml). As alíquotas de 200 μl do óleo extraído sãoderivadas para ésteres de metila com a adição de 500 μl de metóxido desódio em metanol absoluto. A reação de derivatização é permitida progredirdurante 20 minutos em 50°C. A reação é parada pela adição simultânea de500 μl de 10% (peso/volume) de cloreto de sódio e 400 μl de heptano. Osésteres de metila de ácido graxo resultantes extraídos em hexano sãoresolvidos através de cromatografia de gás (GC) em um modelo 6890 GCHewlett-Packard (Paio Alto, CA). A GC foi ajustada com uma colunaSupelcowax 250 (30 m, 0,25 mm de id, 0,25 mícrons de espessura depelícula) (Supelco, Bellefonte1 PA). A temperatura de coluna é 175°C eminjeção e a temperatura programada de 175°C a 245°C a 175°C em40°C/min. As temperaturas do Injetor e detector são 250°C e 270°C,respectivamente.

Exemplo 5.

Este exemplo ilustra transformação de planta para produzirplantas de soja com genes suprimidos.

Um pMON68537 de vetor de transformação é usado paraintroduzir um constructo de formação de RNA de filamento duplo deíntron/3'UTR em soja para suprimir os genes de Δ12 dessaturase, Δ15dessaturase, e FATB. O vetor PMON68537 também contém os genes dedelta-9 dessaturase (FAB2) e os genes de CP4. O vetor pMON68537 édesignado para transformação de planta para suprimir os genes de FAD2,FAD3, e FATB e super-expressar delta-9 dessaturase em soja. Emparticular, o constructo compreende um promotor 7S alfa operavelmenteligado ao íntron orientado em sentido de soja e 3'UTRs, isto é, um íntron No.1 de FAD2-1A, um 3'UTR de FAD3-1A, um 3'UTR de FATB-1, um íntronligável de formação de alça de grampo, e uma série complementar de íntronorientado em anti-sentido de soja e 3'UTR, isto é, um 3'UTR de FATB-1, um3'UTR de FAD3-1A e um íntron No. 1 de FAD2-1A e o promotor de FAD2 desoja que direciona a delta-9 dessaturase. O vetor é estavelmente introduzidona soja (variedade Asgrow A4922) por ABI de cepa de Agrobacteriumtumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6.384.301). O marcadorselecionável de CP4 permite as plantas de soja transformadas seremidentificadas através de seleção em meios que contêm herbicida deglifosato.

As composições de ácido graxo são analisadas de semente delinhagens de soja transformadas com os constructos de expressão dedsRNAi de intron/3'UTR usando cromatografia de gás. As composições deóleo de semente R1 agrupada e semente R1 única demonstram que ascomposições de ácido graxo mono- e poliinsaturadas são alteradas no óleode sementes de linhagens de soja transgênica quando comparadas comaquelas da semente de soja não transformada, (Veja Tabela 3). Porexemplo, a supressão de FAD2 fornece plantas com quantidade aumentadade compostos de éster de ácido oléico; supressão de FAD3 fornece plantascom compostos de éster de ácido linolênico diminuído; e supressão de FATBfornece plantas de compostos de éster graxo saturado reduzido, porexemplo, palmitatos e estearatos. As seleções podem ser feitas de taislinhagens dependendo da composição de ácido graxo relativa desejada. Ascomposições de ácido graxo são analisadas de semente de linhagens desoja transformadas com constructos usando cromatografia de gás.Tabela 3. Composição de ácido graxo de sementes únicas de R1 de Eventosde pMON68537

<table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table>Constructo Evento 18:1 18:3 16:0 18:0 18:2ΡΜΟΝ68537 GM. _A36313 78,76 3,92 5,44 2,91 7,82ΡΜΟΝ68537 GM. _A36313 77,64 4,22 5,88 2,9 8,25ΡΜΟΝ68537 GM. _A36313 76,15 4,14 6,06 3,13 9,42ΡΜΟΝ68537 GM. _A36313 19,05 8,87 13,45 3,71 54,03ΡΜΟΝ68537 GM. _A36313 18,47 8,46 13,13 3,63 55,41ΡΜΟΝ68537 GM. _A36314 80,27 3,17 5,77 3,4 6,03ΡΜΟΝ68537 GM. _A36314 79,66 3,24 5,72 3,19 6,91ΡΜΟΝ68537 GM. _A36314 79,5 3,45 5,83 3,23 6,74ΡΜΟΝ68537 GM. _A36314 77,42 3,52 5,76 3,57 8,42ΡΜΟΝ68537 GM. _A36314 77,33 3,71 6,36 3,34 8,01ΡΜΟΝ68537 GM. _A36314 76,83 3,71 6,38 3,24 8,59ΡΜΟΝ68537 GM. _A36314 16,6 9,3 12,63 4,43 55,99ΡΜΟΝ68537 GM. _A36314 15,26 8,59 13,71 4,54 56,84ΡΜΟΝ68537 GM. _A36315 20,21 8,25 13,61 3,59 53,37ΡΜΟΝ68537 GM. _A36315 17,47 9,22 13,46 3,35 55,57ΡΜΟΝ68537 GM. _A36315 16,75 9,3 13,61 3,66 55,75ΡΜΟΝ68537 G Μ. .A36315 16,54 9,18 13,54 3,88 55,9ΡΜΟΝ68537 G Μ. .A36315 16,06 10,07 13,44 4,01 55,42ΡΜΟΝ68537 GM. .A36315 16,05 9,58 12,82 4,25 56,29ΡΜΟΝ68537 GM. .A36315 15,95 10,42 13,12 3,63 55,91ΡΜΟΝ68537 GM_ .A36315 15,5 10,22 13,25 3,78 56,3ΡΜΟΝ68537 GM_ .A36316 79,61 3,56 5,79 2,94 6,87ΡΜΟΝ68537 GM_ .A36316 75,11 4,01 6,45 3,44 9,76ΡΜΟΝ68537 GM_ .A36316 75,07 4,25 6,74 3,09 9,64ΡΜΟΝ68537 GM_ A36316 73,92 3,97 6,53 3,56 10,75ΡΜΟΝ68537 GM_ A36316 17,26 9,59 13,1 4,26 54,78ΡΜΟΝ68537 GM_ A36316 17,15 9,03 12,81 4,04 55,97ΡΜΟΝ68537 GM_ A36316 16,62 9,2 13,15 3,99 56,03ΡΜΟΝ68537 GM_ A36316 16,6 9,44 13,19 3,95 55,84ΡΜΟΝ68537 GM_ A36317 18,96 7,55 13,2 3,75 55,51ΡΜΟΝ68537 GM_ A36317 16,19 9,43 13,33 3,96 56,04<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>Constructo Evento 18:1 18:3 16:0 18:0 18:2ΡΜΟΝ68537 GM. _A36361 82,13 2,83 5,67 3,13 4,81ΡΜΟΝ68537 GM. _A36361 80,99 3,2 5,79 3,01 5,64ΡΜΟΝ68537 GM. _A36361 74,39 3,85 6,33 3,5 10,59ΡΜΟΝ68537 GM. _A36361 18,01 8,46 13,18 3,92 55,41ΡΜΟΝ68537 GM. _A36361 17,99 8,11 13,05 4,09 55,7ΡΜΟΝ68537 GM. _A36361 17,35 8,31 13,4 4 55,88ΡΜΟΝ68537 GM. _A36361 16,81 10,2 12,9 4,32 54,87ΡΜΟΝ68537 GM. _A36361 16,55 8,5 13,21 4,22 56,45ΡΜΟΝ68537 GM. _A36362 78,05 3,89 6,29 2,81 7,76ΡΜΟΝ68537 GM. _A36362 76,89 3,69 6,32 3,12 8,76ΡΜΟΝ68537 GM. _A36362 76,1 4 6,57 3,02 9,24ΡΜΟΝ68537 GM. _A36362 76,01 4,08 6,24 3,03 9,48ΡΜΟΝ68537 GM. _A36362 75,86 3,76 5,68 3,56 9,95ΡΜΟΝ68537 GM. _A36362 75,79 4,07 6,43 3,15 9,34ΡΜΟΝ68537 GM. .A36362 74,89 4,14 6,63 3,11 10,07ΡΜΟΝ68537 G Μ. .A36362 17,22 8,8 13,75 3,77 55,54ΡΜΟΝ68537 GM. .A36363 79,15 3,57 6,2 3,03 6,84ΡΜΟΝ68537 G Μ. .A36363 75,69 3,83 7,07 2,73 9,53ΡΜΟΝ68537 GM_ .A36363 73,97 4,22 6,82 3,39 10,33ΡΜΟΝ68537 GM_ .A36363 72,53 4,31 6,64 3,7 11,59ΡΜΟΝ68537 G Μ. .A36363 68,42 4,5 7,05 3,95 14,79ΡΜΟΝ68537 GM_ .A36363 18,39 8,7 13,61 4,1 54,28ΡΜΟΝ68537 GM_ A36363 17,54 8,87 14,08 4,07 54,56ΡΜΟΝ68537 GM_ .A36363 15,87 9,66 14,56 4,2 54,69ΡΜΟΝ68537 GM_ A36365 78,79 3,11 5,87 1,27 9,9ΡΜΟΝ68537 GM_ A36365 76,76 3,86 5,79 1,66 10,91ΡΜΟΝ68537 GM_ A36365 75,41 3,49 6,06 1,83 12,15ΡΜΟΝ68537 GM_ A36365 73,57 3,65 6,11 1,5 14,19ΡΜΟΝ68537 GM_ A36365 71,55 3,56 6,62 1,24 16,08ΡΜΟΝ68537 GM_ A36365 70,41 4 6,07 2,15 16,33ΡΜΟΝ68537 GM_ A36365 66,66 3,9 6,84 1,5 20,21<table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table>

Exemplo 6. Constructo de dsRNAi de FAD2-1/FATB em soja transgênica

O constructo de pMON95829 como descrito no Exemplo 3D éusado para introduzir um íntron de FAD2-1, FATB, constructo de formaçãode RNA de filamento duplo em soja para suprimir o gene FAD2 e geneFATB. O vetor é estavelmente introduzido em soja (variedade de AsgrowA4922) por ABI de cepa de Agrobacterium tumefaciens (Martinell, PatenteU.S. No. 6.384.301). O marcador selecionável CP4 permite que as plantasde soja transformadas sejam identificadas através de seleção em meioscontendo herbicida de glifosato. Subseqüentemente, os genomas de plantastransformadas são avaliados para inserção tandem simultânea do primeiroT-DNA e do segundo T-DNA1 isto é na montagem da "borda direita paraborda direita". A avaliação é feita com métodos de mapeamento dehibridização do Sul. As plantas de soja transformadas contendo aconfiguração preferida no seu genoma são transferidas para uma estufapara produção de semente.

Por exemplo, tecido de folha foi tomado das plantas ROtransformadas com constructo pMON95829 e análise do Sul é realizada. Assondas e digestões de enzima de restrição são escolhidas para identificareventos que contêm uma montagem de borda-direita-borda-direita ("RB-RB")de ambos os T-DNAs. Tipicamente, cerca de 25% de todos ostransformantes tem T-DNAs de RB-RB apropriadamente montados.As composições de ácido graxo são analisadas de semente delinhagens de soja transformadas com uma constructo de pMON95829usando cromatografia de gás como descrito no Exemplo 4 para identificarésteres de metila de compostos de ácido graxo extraídos de sementes.

Primeiro, seis sementes R1 tomadas de plantas de soja transformadas comconstructo de pMON95829 são colhidas, e a composição de ácido graxo decada semente única é determinada. Por conseguinte as plantas R1 de cadaevento estão segregando para os transgenes e, portanto, produzemsementes com composição de soja convencional, como também versõesmodificadas. As sementes positivas são agrupadas e pesadas para cadaevento. As médias positivas agrupadas demonstram que as composições deácido graxo mono- e poliinsaturadas são alteradas no óleo de sementes delinhagens de soja transgênica quando comparadas com aquelas da sementede soja não transformada (Veja Tabela 4). Por exemplo, a supressão deFAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster deácido oléico e supressão de FATB fornece plantas com compostos de éstergraxo saturado reduzido, por exemplo, palmitatos e estearatos.

Tabela 4. Composição de ácido graxo de sementes únicas R1 de eventos dePMON95829.

Construção No. Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3PMON95829 GM_A94247 2,1 2,8 83,0 6,0 5,5PMON95829 GM_A94296 2,6 2,9 80,6 7,1 5,8PMON95829 GM_A93590 2,5 2,8 80,4 7,4 5,8PMON95829 GM_A93437 2,6 2,8 79,8 7,9 6,0PMON95829 GM_A93517 2,9 2,8 79,5 7,7 6,0PMON95829 GM_A93647 2,3 3,0 78,6 9,0 6,5PMON95829 GM_A93670 3,1 2,9 77,3 10,1 6,2PMON95829 GM_A92396 2,9 2,6 76,0 11,1 7,0PMON95829 GM_A92455 3,6 3,1 74,9 12,0 5,5PMON95829 GM_A93678 2,8 3,4 74,0 11,9 7,4PMON95829 GM_A93640 2,5 2,7 71,6 14,6 7,6PMON95829 GM A94937 4,5 3,3 67,2 17,7 7,1PMON95829 GM_A92481 4,9 2,8 58,1 25,3 8,1PMON95829 GM_A94306 3,1 3,2 55,9 29,0 7,9PMON95829 GM_A94211 3,0 2,7 47,0 38,3 8,7

Exemplo 7

pMON93505 é um constructo usado para montagem in vivo etem dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por elementos de borda deT-DNA de Agrobactéria , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de bordaesquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor 7Sa' desoja operavelmente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO:1) que é reduzido em 100 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado ao3'UTR de FATB-Ia seguidos por um 5 ' UTR de FATB-Ia1 um gene de KASIV C. pulcherrima (SEQ ID NO: 39) operavelmente ligando-se a um promotorde Brassica napin e uma seqüência terminação 3 1 de Brassica napin, umgene de delta 9 dessaturase Ricinus communis (Publicação de Pedido dePatente U.S. No. 2003/00229918 A1) operavelmente ligando-se a umpromotor 7Sa de soja e uma seqüência de terminação 3' nos, e um gene deEPSPS de CP4 que operavelmente se liga a um promotor eFMV e umaseqüência de terminação 3' de ervilha Rubisco E9 tudo flanqueado porelementos de borda de T-DNA de Agrobactéria, isto é DNA de borda direita(RB) e DNA de borda esquerda (LB). No mesmo constructo, no segundosegmento de T-DNA, flanqueado por outro RB e LB, está uma seqüência determinação 3' H6 operavelmente ligando-se a um íntron 1 de FAD2-1A desoja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 100 nucleotídeos contíguos doterminal 3' e ligado ao 3 ' UTR de FATB-1A seguido por um 5 ' UTR deFATB-la.

O constructo de pMON93505 é estavelmente introduzido emsoja (variedade de Asgrow A4922) por ABI de cepa de Agrobacteriumtumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6.384.301). O marcadorselecionável de CP4 permite que a planta de soja transformada sejaidentificada através de seleção em meios que contêm herbicida de glifosato.Subseqüentemente, os genomas de plantas transformadas são avaliadosquanto à inserção tandem simultânea do primeiro T-DNA e do segundo T-DNA, isto é na montagem de "borda direita para borda direita". A avaliação éfeita com métodos de mapeamento de hibridização do sul. As plantas desoja transformadas contendo a configuração preferida no seu genoma sãotransferidas para uma estufa para produção de semente.

Por exemplo, o tecido de folha foi tomado das plantas ROtransformadas com constructo de pMON93505 e a análise do Sul érealizada. As sondas e digestões de enzima de restrição são escolhidas paraidentificar eventos que contêm uma montagem de borda-direita- borda-direita ("RB-RB") de ambos os T-DNAs. Tipicamente, aproximadamente 25%de todo o transformante tem T-DNAs de RB-RB apropriadamente montados.

As composições de ácido graxo são analisadas de semente delinhagens de soja transformadas com um constructo de pMC>N93505 usandocromatografia de gás como descrito no Exemplo 4 para identificar ésteres demetila de compostos de ácido graxo de sementes. Primeiro, seis sementesR1 tomadas de plantas de soja transformadas com constructo depMON93505 são colhidas, e a composição de ácido graxo de cada sementeúnica é determinada. Por conseguinte, as plantas R1 de cada evento estãosegregando para os transgenes e, portanto, produzem as sementes comcomposição de soja convencional, como também versões modificadas. Assementes positivas são agrupadas e pesadas para cada evento. As médiaspositivas agrupadas demonstram que as composições de ácido graxo demono- e poliinsaturado são alteradas no óleo de sementes de linhagens desoja transgênica quando comparadas com aquelas da semente de soja nãotransformada (Veja Tabela 10). Por exemplo, a supressão de FAD2 forneceplantas com quantidade aumentada de compostos de éster de ácido oléico.

Por exemplo, a supressão de FAD2 fornece plantas com quantidadeaumentada de compostos de éster de ácido oléico, supressão de FAD3fornece plantas com compostos de éster de ácido linolênico reduzido, esupressão de FATB fornece plantas de compostos de éster graxo saturadoreduzido, por exemplo palmitatos e estearatos.

Tabela 5. Composição de ácido graxo de sementes únicas de R1 de eventosde pMQN93505<table>table see original document page 85</column></row><table>

Exemplo 8. Sojas Transgênicas com Composições de Ácido Graxo Alteradas

pMON97563 contém um promotor de 7Sa' de sojaoperavelmente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) queé reduzido em 100 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado a um5'UTR de FAD3-1A, seguido por um 3'UTR de FAD3-1A, ligado a um 5'UTRde FAD3-1B, seguido por um 3'UTR de FAD3-1B, ligado a um 5'UTR deFAD3-1C, seguiu por um 3'UTR de FAD3-1C, seguido por uma região decodificação de CTP de FATB-la, seguido por uma região de codificação deCTP de FATB-2a operavelmente ligando-se a 70 nucleotídeos de íntron 4 deFAD3-1A, operavelmente ligando-se a uma região de codificação de CTP deFATB-2a na orientação de anti-sentido seguido por uma região decodificação de CTP de FATB-Ia na orientação de anti-sentido, ligado a um3'UTR de FAD3-1C em anti-sentido, seguido por um 5'UTR de FAD3-1C emanti-sentido, ligado a um 3'UTR de FAD3-1B em anti-sentido, seguido porum 5'UTR de FAD3-1B em anti-sentido, ligado a um 3'UTR de FAD3-1A emanti-sentido, seguido por um 5'UTR de FAD3-1A em anti-sentido, seguidopor um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 400nucleotídeos contíguos do terminal 3' e na orientação de anti-sentido,operavelmente ligado a um segmento de poliadenilação 3' H6 que com umgene de EPSPS de CP4 operavelmente ligando-se a um promotor de eFMVe uma seqüência de terminação 3' de ervilha Rubisco E9 tudo flanqueadopor RB e LB na mesma molécula de DNA. O constructo de expressão degene resultante é usada para transformação de planta que usa métodoscomo descrito aqui. As composições de ácido graxo são determinadas desemente de linhagens de soja transformadas com este constructo usandocromatografia de gás como descrito no Exemplo 4. A Tabela 26 determinaas composições de sementes representativas. O nível de 18:3 é reduzidopara aproximadamente 1 %.

Tabela 6. Composição de ácido graxo de sementes únicas R1 de eventos de

Constructo Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3PMON97563 GM_A109156 2,21 2,78 85,05 8,48 0,69PMON97563 GM_A109196 2,07 2,31 84,4 9,42 0,97PMON97563 G M_A109207 2,24 2,78 83,98 9,36 0,82PMON97563 GM_A103543 2,21 2,63 83,94 10,28 0,95PMON97563 G M_A103547 2,06 2,47 83,67 10,47 0,89PMON97563 GM_A109146 1,71 2,34 81,14 13,71 0,91PMON97563 GM_A109155 2,33 2,7 80,76 12,28 1,11PMON97563 GM_A109164 2,07 2,61 78,8 14,6 1PMON97563 GM_A109170 2,68 1,95 78,78 14,14 1,55PMON97563 G M_A109277 2,49 3,19 78,19 14,51 0,93PMON97563 GM_A109194 2,46 2,81 76,62 16,26 0,92<table>table see original document page 87</column></row><table>

Exemplo 9. Cruzamentos de soja transgênica meio oléica com soja poucolinolênica

Uma planta de soja de uma linhagem com sementes que têmníveis moderados de ácido oléico é cruzada com uma planta de umalinhagem com níveis normais de ácido oléico porém cerca de 2,8% de ácidolinolênico (18:3). Este cruzamento resulta em uma linhagem de soja queproduz óleo com as propriedades combinadas, ácido meio oléico e ácidopouco linolênico.

Resumidamente, a reprodução de planta foi realizada comodescrito abaixo. Uma linhagem origem, uma linha de soja transgênica,evento GM_A22234 rotulado, contém o pMON68504 de plasmídeo em umcromossomo. pMON68504 é um constructo de 2T-DNA tendo um promotor7S operavelmente ligado a um íntron No. 1 de FAD2-1A (SEQ ID NO: 2;Publicação PCT WO 2001014538) em orientação de sentido paraparcialmente suprimir o gene FAD2 endógeno e um gene marcadorselecionável de CP4. O óleo extraído das sementes desta linhagem contémaproximadamente 65% de ácido oléico, acima dos 20% de óleo de sojaconvencional (veja, Tabela 25). Outra linhagem origem é uma variedade nãotransgênica 6p248-5 (linhagem C1640) que tem um conteúdo de ácidolinolênico de cerca de 3% em peso de ácidos graxos totais em suassementes, quando comparado ao 8-9% de ácido linolênico convencionalencontrado em óleo de soja normal (veja, Tabela 25). A redução em ácidolinolênico é causada por um mutante duplo fad3-1b-/fad3-1c-. (Veja Wilcox,J.R. e J.F. Cavins, Inheritance of Iow Iinolenic acid content of the seed of amutant of Glycine max., Theoretical and Applied Genetics 71: 74-78, 1985).

As plantas da linhagem transgênica GM_A22234 (usadas comofêmea) e a linhagem mutante 6p248-5 (usada como o macho) foramcruzadas. Trinta sementes F1 foram produzidas e plantadas para produzir1 kg (2,3 Ibs) de sementes F2 fertilizadas de modo cruzado contínuo. Assementes homozigoto triplas putativas foram identificadas de 200 sementesF2 por análise de metil-éster de ácido graxo de semente única (FAME) delascas de semente. Vinte e sete sementes com cerca de 60% de 18:1, cercade 20% de 18:2, e cerca de 2-3% de 18:3 foram identificadas e plantadaspara produzir sementes F3 fertilizadas de modo cruzado contínuo.

Para análise do marcador, as amostras de tecido de folha F2foram coletadas e marcadores moleculares estabelecidos para os alelosmutantes de FAD3 foram usados para identificar as plantas positivas duplas(plantas que têm ambas as mutações de FAD3-1B e FAD3-1C). Trêsgenótipos foram direcionados para recuperação desta experiência: 1)mutantes homozigotos fad3-1b - / fad3-1c-duplos; 2) plantas homozigotoúnicas para o fad3-1c-alelo sozinho; e 3) homozigoto único para fad3-1b-alelo sozinho.

As plantas F2 foram plantas únicas colhidas, e as 10subamostras de semente F3 foram analisadas. De 27 sementes com cercade 60% de 18:1 (ácido oléico), cerca de 20% de 18:2 (ácido linoléico), ecerca de 2-3% de 18:3 (ácido linolênico), 5 plantas foram identificadas comomutante de FAD3 duplo putativo e foram aumentadas juntas paracrescimento adicional. A Tabela 25 resume os dados da composição desemente F3 de 120 plantas F2.

Tabela 7. Composição de ácido graxo de semente F3 empilhada mutantefad3/fenótipo de ácido meio oléico

Ácido Graxo, % em mol Relativo

<table>table see original document page 88</column></row><table>

A linhagem de ácido meio oléico tripla fad3-1b-, fad3-1c-,(GM_AA22234) tem 1,9% de 18:3 linolênico e 74,3% de ácido oléico. Acombinação de mutantes fad3-1b- e fad3-1c- com o local transgênico meiooléico (GM_AA22234) leva à outra redução de linolênico e aumento deoléico relativo às linhagens origens respectivas.

Para avaliar a eficácia de campo da linhagem meio oléica triplafad3-1b-, fad3-1c- (GM_AA22234), as entradas de pilha de reproduçãoforam plantadas em um projeto de bloco de grupo com as pilhas e controlesorigens agrupados e aleatorizados no bloco de teste, e as amostras desemente foram analisadas. Um perfil de ácido graxo para a pilha meio oléicatripla fad3-1b-, fad3-1c- (GM_AA22234) foi gerado com semente crescida nocampo F4 que usa FAME de semente única. O perfil de ácido graxo F4demonstrou aproximadamente 68% de 18:1, 13% de saturados totais, 16%de 18:2 e 2,3% de 18:3. Os níveis de proteína e óleo foram similares àslinhagens origem.

Exemplo 10. Cruzamentos de soja transgênica pouco saturada, meio oléicacom soja pouco linolênica

Uma planta de soja de uma linhagem com sementes que temnível pouco saturado e ácido meio oléico em seu óleo é cruzada com umaplanta de uma linhagem com níveis saturados e oléicos normais porémcerca de 2,8% de ácido linolênico (18:3). Este cruzamento resulta em umalinhagem de soja que produz óleo com as propriedades combinadas, níveisde ácido graxo meio oléico, pouco saturado e pouco linolênico.

Resumidamente, a reprodução de planta foi realizada comodescrito abaixo. Uma linhagem origem é uma linhagem de soja transgênicaque abriga DNA recombinante para supressão parcial dos genes FAD2-1 eFATB endógenos como também um gene de marcador selecionável de CP4que torna a planta tolerante ao glifosato. O óleo extraído das sementes destalinhagem contém aproximadamente 55-85% de ácido oléico, acima dos 20%de óleo de soja convencional. Também contém menos do que 8% de ácidosgraxos saturados (16:0 mais 18:0), reduzido dos 14-16% convencionais deóleo de soja normal. Outra linhagem origem é uma variedade nãotransgênica 6p248-5 (linhagem C1640) que tem cerca de 3% de níveis deácido linolênico em suas sementes, quando comparado aos 8-9% de ácidolinolênico convencional encontrado em óleo de soja normal. A redução emácido linolênico é causada por um mutante fad3-1b-/fad3-1c-duplo. (VejaWilcox, J.R. e J.F. Cavins, Inheritance of Iow Iinolenic acid content of theseed of a mutant of Glycine max., Theoretical and Applied Genetics 71: 74-78, 1985.)

As plantas da linhagem transgênica meio - muito oléica/poucosaturada são cruzadas com plantas da linhagem de mutante 6p248-5. Assementes F1 são produzidas e plantadas para produzir semente F2fertilizada de modo cruzado contínuo. As sementes homozigoto triplasputativas são identificadas de sementes F2 por análise de metil-éster deácido graxo de semente única (FAME) de lascas de semente. As sementescom características de óleo combinadas são identificadas e plantadas paraproduzir sementes F3 fertilizadas de modo cruzado contínuo. Para análisede marcador, as amostras de tecido de folha F2 são coletadas e osmarcadores moleculares estabelecidos para os alelos mutantes FAD3 sãousados para identificar plantas positivas duplas (plantas que têm ambasdeleções de FAD3). Os lotes de semente F3 que indicam homozigosidadepara o local de transgene como também as duas mutações de FAD3 sãoselecionados e usados para estabelecimento de linhagem.

Para avaliar a eficácia de campo das linhagens fad3-1b-, fad3-1c-, meio oléicas/pouco saturadas, as entradas de pilha de reprodução sãoplantadas em um projeto de bloco de grupo com as pilhas e controlesorigens agrupados e aleatorizados no bloco de teste, e as amostras desemente são analisadas. Um perfil de ácido graxo para a pilha tripla fad3-1 b-fad3-1c-, meio oléica/pouco saturada é determinado com semente crescidaem campo F4 usando FAME de semente única. O perfil de ácido graxo F4mostra 55-85% de 18:1, menos do que 8% de saturados, e 2-3% de 18:3. Osníveis de óleo e proteína são similares às linhagens origens.

Exemplo 11. Uso de Polimorfismos em FAD3-1 b

Para praticar os métodos da invenção, os polimorfismosassociados com o gene FAD3-1B de soja podem ser usados para identificara presença de regiões genômicas de soja associadas com certos fenótiposde ácido pouco linolênico. Um polimorfismo de nucleotídeo único em umaposição que corresponde à posição 2021 de SEQ ID NO:61 é detectadoentre todas as linhagens em um comprimento de seqüência inteiro de 2683pares de base (Tabela 3) e é associado com um fenótipo de ácido poucolinolênico. A linhagem pouco linolênica 6P248, T27111, T27190, T26767 eT26830 carrega um alelo "C" nesta posição ao mesmo tempo em que todasas outras linhagens carregam um "T". Conseqüentemente, a presença deum alelo "C" pode ser usada para identificar a presença das regiõesgenômicas de soja pouco linolênicas em cruzamentos onde o germplasmapouco linolênico derivado de 6P248, T27111, T27190, T26767 e T26830 éusado. Outras linhagens pouco linolênicas tal como A5, Soyola, e N98-4445carregam um alelo tipo silvestre neste lugar, indicando que um ou maisoutros lugares contribuem com o fenótipo pouco linolênico nas linhagens deA5, Soyola, e N98-4445.

Tabela 8. Polimorfismos no lugar de FAD3-1B

<table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table>

Exemplo 12. Identificação de Polimorfismos no gene FAD3-1C

Para praticar os métodos da invenção, são usadospolimorfismos associados com o gene FAD3-1C de soja para identificar apresença de regiões genômicas de soja associadas com certos fenótipos deácido pouco linolênico. Quatro SNPs e um indel (inserção/deleção) sãoidentificados em FAD3-1C que é associado com certos fenótipos de ácidopouco linolênico (Tabela 4). Os SNPs que correspondem às posições 687,2316, 3743, como também o indel em 1129 de SEQ ID NO:62 sãoassociados com o fenótipo pouco linolênico. As linhagens pouco linolênicas,Soyola e N98-4445 carregam um alelo diferente nas posições 687 e 1129 detodas as outras linhagens.

As linhagens de mutante 6P248, T27111, T27190, T26767,T26830 e A5 deixarão de amplificar com certos iniciadores específicos delugar de FAD3-1C uma vez que há uma deleção grande no lugar de FAD3-1C nestas linhagens. A falha destas regiões a serem amplificadas,acopladas com reações de controle positivas apropriadas (isto é, usandoDNA genômico de soja que contém um gene FAD3-1C intacto cominiciadores de FAD3-1C da região deletada como também uso de iniciadorespara outros genes de não FAD3-1C com o DNA genômico de soja dadeleção de FAD3-1C), é diagnóstico para deleções de FAD3-1C.Tabela 9. Polimorfismos no lugar de FAD3-1CPosição da Seqüência

<table>table see original document page 93</column></row><table>

Nota: 1. NA significa nenhuma amplificação

Exemplo 13. Identificação de Polimorfismos de Promotor de FAD3-1C deSoja

Para praticar os métodos da invenção, polimorfismos associadoscom o promotor de FAD3-1C de soja são usados para identificar a presençade regiões genômicas de soja associadas com certos fenótipos de ácidopouco linolênico. Como notado na Tabela 5, as linhagens pouco linolênicasSoyola e N98-4445 carregaram um alelo diferente em todas as seteposições das outras linhagens tipo silvestre. A presença destespolimorfismos poderia ser usada para identificar a presença de Soyola ougermplasma N98-4445 em cruzamentos para germplasma tipo silvestre.

Tabela 10. Polimorfismos em Região Promotora de FAD3-1C

<table>table see original document page 94</column></row><table>

Todos os métodos e/ou composições descritos e reivindicadosaqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida levandoem conta a presente descrição. Ao mesmo tempo as composições emétodos desta invenção foram descritos em termos de modalidadespreferidas, será evidente para aqueles de experiência na técnica quevariações podem ser aplicadas aos métodos e/ou composições e nas etapasou na seqüência de etapas do método descrito aqui sem afastar-se doconceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, seráevidente que certos agentes que são tanto quimicamente quantofisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentesdescritos aqui ao mesmo tempo em que os mesmos ou resultados similaresseriam obtidos. Todos tais substitutos similares e modificações evidentespara aqueles versados na técnica são julgados estarem dentro do espírito,escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações anexas.

Todas as publicações e pedidos de patente citados nesterelatório descritivo estão aqui incorporados por referência como se cadapublicação ou pedido de patente individual especificamente eindividualmente fosse indicado serem incorporados por referência.Listagem de Seqüência

<110> Fillatti, JoanneVoelker, ToniUlmasov, Tim N.Keithly, Greg E.

<120> COMPOSIÇÕES DE ÓLEO E SEMENTE DE SOJA E MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DASMESMAS

<130> 38-77(54449JB<150> US 60/781,519<151> 2006-03-10<160> 63

<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 420<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> intron 1 de FAD2-1A<400> 1

gtaaattaaa ttgtgcctgc acctcgggat atttcatgtg gggttcatca tatttgttga 60

ggaaaagaaa ctcccgaaat tgaattatgc atttatatat cctttttcat ttctagattt 120cctgaaggct taggtgtagg cacctagcta gtagctacaa tatcagcact tctctctatt 180gataaacaat tggctgtaat gccgcagtag aggacgatca caacatttcg tgctggttac 240tttttgtttt atggtcatga tttcactctc tctaatctct ccattcattt tgtagttgtc 300attatcttta gatttttcac tacctggttt aaaattgagg gattgtagtt ctgttggtac 360atattacaca ttcagcaaaa caactgaaac tcaactgaac ttgtttatac tttgacacag 420<210> 2<211> 405<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> íntron 1 de FAD2-1B<400> 2

gtatgatgct aaattaaatt gtgcctgcac cccaggatat ttcatgtggg attcatcatt 60

tattgaggaa aactctccaa attgaatcgt gcatttatat tttttttcca tttctagatt 120

tcttgaaggc ttatggtata ggcacctaca attatcagca cttctctcta ttgataaaca 180

attggctgta ataccacagt agagaacgat cacaacattt tgtgctggtt accttttgtt 240

ttatggtcat gatttcactc tctctaatct gtcacttccc tccattcatt ttgtacttct 300

catatttttc acttcctggt tgaaaattgt agttctcttg gtacatacta gtattagaca 360

ttcagcaaca acaactgaac tgaacttctt tatactttga cacag 405<210> 3<211> 1704<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> promotor de FAD2-1B

<400> 3

actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtcctc ggtgtgactc agccccaagt 60

gacgccaacc aaacgcgtcc taactaaggt gtagaagaaa cagatagtat ataagtatac 120

catataagag gagagtgagt ggagaagcac ttctcctttt tttttctctg ttgaaattga 180

aagtgttttc cgggaaataa ataaaataaa ttaaaatctt acacactcta ggtaggtact 240

tctaatttaa tccacacttt gactctatat atgttttaaa aataattata atgcgtactt 300

acttcctcat tatactaaat ttaacatcga tgattttatt ttctgtttct cttctttcca 360

cctacataca tcccaaaatt tagggtgcaa ttttaagttt attaacacat gtttttagct 420

gcatgctgcc tttgtgtgtg ctcaccaaat tgcattcttc tctttatatg ttgtatttga 480

attttcacac catatgtaaa caagattacg tacgtgtcca tgatcaaata caaatgctgt 540

cttatactgg caatttgata aacagccgtc cattttttct ttttctcttt aactatatat 600

gctctagaat ctctgaagat tcctctgcca tcgaatttct ttcttggtaa caacgtcgtc 660

gttatgttat tattttattc tatttttatt ttatcatata tatttcttat tttgttcgaa 720

gtatgtcata ttttgatcgt gacaattaga ttgtcatgta ggagtaggaa tatcacttta 780

aaacattgat tagtctgtag gcaatattgt cttctttttc ctcctttatt aatatatttt 840

gtcgaagttt taccacaagg ttgattcgct ttttttgtcc ctttctcttg ttctttttac 900

ctcaggtatt ttagtctttc atggattata agatcactga gaagtgtatg catgtaatac 960

taagcaccat agctgttctg cttgaattta tttgtgtgta aattgtaatg tttcagcgtt 1020ggctttccct gtagctgcta caatggtact gtatatctat tttttgcatt gttttcattt 1080

tttcttttac ttaatcttca ttgctttgaa attaataaaa caatataata tagtttgaac 1140

tttgaactat tgcctattca tgtaattaac ttattcactg actcttattg tttttctggt 1200

agaattcatt ttaaattgaa ggataaatta agaggcaata cttgtaaatt gacctgtcat 1260

aattacacag gaccctgttt tgtgcctttt tgtctctgtc tttggttttg catgttagcc 1320

tcacacagat atttagtagt tgttctgcat acaagcctca cacgtatact aaaccagtgg 1380

acctcaaagt catggcctta cacctattgc atgcgagtct gtgacacaac ccctggtttc 1440

catattgcaa tgtgctacgc cgtcgtcctt gtttgtttcc atatgtatat tgataccatc 1500

aaattattat atcatttata tggtctggac cattacgtgt actctttatg acatgtaatt 1560

gagtttttta attaaaaaaa tcaatgaaat ttaactacgt agcatcatat agagataatt 1620

gactagaaat ttgatgactt attctttcct aatcatattt tcttgtattg atagccccgc 1680

tgtccctttt aaactcccga gaga 1704<210> 4<211> 4497<212> DNA

<213> Glycine max<220>

<223> Clone genômico de FAD2-1A<400> 4

cttgcttggt aacaacgtcg tcaagttatt attttgttct tttttttttt atcatatttc 60

ttattttgtt ccaagtatgt catattttga tccatcttga caagtagatt gtcatgtagg 120

aataggaata tcactttaaa ttttaaagca ttgattagtc tgtaggcaat attgtcttct 180

tcttcctcct tattaatatt ttttattctg ccttcaatca ccagttatgg gagatggatg 240

taatactaaa taccatagtt gttctgcttg aagtttagtt gtatagttgt tctgcttgaa 300

gtttagttgt gtgtaatgtt tcagcgttgg cttcccctgt aactgctaca atggtactga 360

atatatattt tttgcattgt tcattttttt cttttactta atcttcattg ctttgaaatt 420

aataaaacaa aaagaaggac cgaatagttt gaagtttgaa ctattgccta ttcatgtaac 480

ttattcaccc aatcttatat agtttttctg gtagagatca ttttaaattg aaggatataa 540

attaagagga aatacttgta tgtgatgtgt ggcaatttgg aagatcatgc gtagagagtt 600

taatggcagg ttttgcaaat tgacctgtag tcataattac actgggccct ctcggagttt 660

tgtgcctttt tgttgtcgct gtgtttggtt ctgcatgtta gcctcacaca gatatttagt 720

agttgttgtt ctgcatataa gcctcacacg tatactaaac gagtgaacct caaaatcatg 780gccttacacc tattgagtga aattaatgaa cagtgcatgt gagtatgtga ctgtgacaca 840

acccccggtt ttcatattgc aatgtgctac tgtggtgatt aaccttgcta cactgtcgtc 900

cttgtttgtt tccttatgta tattgatacc ataaattatt actagtatat cattttatat 960

tgtccatacc attacgtgtt tatagtctct ttatgacatg taattgaatt ttttaattat 1020

aaaaaataat aaaacttaat tacgtactat aaagagatgc tcttgactag aattgtgatc 1080

tcctagtttc ctaaccatat actaatattt gcttgtattg atagcccctc cgttcccaag 1140

agtataaaac tgcatcgaat aatacaagcc actaggcatg gtaaattaaa ttgtgcctgc 1200

acctcgggat atttcatgtg gggttcatca tatttgttga ggaaaagaaa ctcccgaaat 1260

tgaattatgc atttatatat cctttttcat ttctagattt cctgaaggct taggtgtagg 1320

cacctagcta gtagctacaa tatcagcact tctctctatt gataaacaat tggctgtaat 1380

gccgcagtag aggacgatca caacatttcg tgctggttac tttttgtttt atggtcatga 1440

tttcactctc tctaatctct ccattcattt tgtagttgtc attatcttta gatttttcac 1500

tacctggttt aaaattgagg gattgtagtt ctgttggtac atattacaca ttcagcaaaa 1560

caactgaaac tcaactgaac ttgtttatac tttgacacag ggtctagcaa aggaaacaac 1620

aatgggaggt agaggtcgtg tggcaaagtg gaagttcaag ggaagaagcc tctctcaagg 1680

gttccaaaca caaagccacc attcactgtt ggccaactca agaaagcaat tccaccacac 1740

tgctttcagc gctccctcct cacttcattc tcctatgttg tttatgacct ttcatttgcc 1800

ttcattttct acattgccac cacctacttc cacctccttc ctcaaccctt ttccctcatt 1860

gcatggccaa tctattgggt tctccaaggt tgccttctca ctggtgtgtg ggtgattgct 1920

cacgagtgtg gtcaccatgc cttcagcaag taccaatggg ttgatgatgt tgtgggtttg 1980

acccttcact caacactttt agtcccttat ttctcatgga aaataagcca tcgccgccat 2040

cactccaaca caggttccct tgaccgtgat gaagtgtttg tcccaaaacc aaaatccaaa 2100

gttgcatggt tttccaagta cttaaacaac cctctaggaa gggctgtttc tcttctcgtc 2160

acactcacaa tagggtggcc tatgtattta gccttcaatg tctctggtag accctatgat 2220

agttttgcaa gccactacca cccttatgct cccatatatt ctaaccgtga gaggcttctg 2280

atctatgtct ctgatgttgc tttgttttct gtgacttact ctctctaccg tgttgcaacc 2340

ctgaaagggt tggtttggct gctatgtgtt tatggggtgc ctttgctcat tgtgaacggt 2400

tttcttgtga ctatcacata tttgcagcac acacactttg ccttgcctca ttacgattca 2460

tcagaatggg actggctgaa gggagctttg gcaactatgg acagagatta tgggattctg 2520

aacaaggtgt ttcatcacat aactgatact catgtggctc accatctctt ctctacaatg 2580

ccacattacc atgcaatgga ggcaaccaat gcaatcaagc caatattggg tgagtactac 2640

caatttgatg acacaccatt ttacaaggca ctgtggagag aagcgagaga gtgcctctat 2700gtggagccag atgaaggaac atccgagaagtggagcaacc aatgggccat agtgggagttttagtagaat gttataaata agtggatttgcagcttgttg cgatcatggt tataatgtaaagtgttctgc ttatagcttt ctgcctaaaaatttttttaa aatctgaatt gaggctactcgttgcattga ctttaagcag aggttcatctgtaatttaag ggacgagagc aactttagcttcaaattgat cttattaaaa ctgaaaattttagcaaacac ctaaattgga ctgatttttaacttaaattt tataatatat gtcttgtaattggaaacata taataaggaa cattagttaattacagtatt tggatgattt gtatgagataaaaagttaat actgatggtg gagaaaaaaaacggataaaa atatgctgca gcctggagaggacaactatt catgatgaga acacaataatctgattttaa taatgatgat aaataatgataaggaaaaca taaatattct catggaaaaaataattttaa tcaagtttaa ttcattctttttgaatttag agatgtatgt tgtagcttaaaagcagtcaa atttcatcca aataatcgtgatcttaatat acacgcaaag gaaaaaataatgataccacg ttggttgacg aaactgataaatcttcacaa tcacatctcc agaacacaaattgcgttagg tttctacttt cttctctctcctcaaacaat caatcaattt tcattcagataggtctccca ctttatcttt tcccaagccttaaaattcag gatcggaaac gaactgggttcgaagtgtgc atgcactgat gcgacccacttgaggttttt cttgcgatca tcattgcttg<210> 5<211> 206

ggcgtgtatt ggtacaggaa caagtattga 2760

atggaagttt tgtcatgtat tagtacataa 2820

ccgcgtaatg actttgtgtg tattgtgaaa 2880

aaataattct ggtattaatt acatgtggaa 2940

tgcacgctgc acgggacaat atcattggta 3000

ataatactat ccataggaca tcaaagacat 3060

agaggattac tgcataggct tgaactacaa 3120

ctaccacgtc gttttacaag gttattaaaa 3180

gtaataaaat gctattgaaa aattaaaata 3240

gattcaaatt taataattaa tctaaattaa 3300

atatcaagtt ttttttttta ttattgagtt 3360

tattgataat ccactaagat cgacttagta 3420

ttcaaacttc actcttatca taatagagac 3480

aatgttattg ggagcatatg gtaagataag 3540

ctaatgtatt ttttggtgaa gttttcaagt 3600

attttctact tacctatccc acataaaata 3660

taaaatattt gattctttgt taagagaaat 372 0

tcagcttgta ggagtagaaa ctttctgatt 3780

taattttatt attagtacaa aatcattctc 3840

tagtaatttt ttatttttat aataaaattc 3900

ttcgtgggtg taagtcagtt attccttctt 3960

aaataaaatt cgaggaagcg cagcagcagc 4020

aaagcgctgt cattgtgtct ttgtttgatc 4080

gaagagtgac ccttcttctt gttattccac 4140

tctctctctc tcttcattcc tcatttttcc 4200

tcgtaaattt ctcgattaga tcacggggtt 4260

ttctctttcc ccctttccct gtctgcccca 4320

cttgaatttc actctagatt ttgacaaatt 43 80

cccccttttt tgcattaaac aattatgaat 4440

aattgaatca tattaggttt agattct 4497<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<223> 3'UTR de FAD2-1A

<400> 5

tggagcaacc aatgggccat agtgggagtt atggaagttt tgtcatgtat tagtacataa 60

ttagtagaat gttataaata agtggatttg ccgcgtaatg actttgtgtg tattgtgaaa 120cagcttgttg cgatcatggt tataatgtaa aaataattct ggtattaatt acatgtggaa 180agtgttctgc ttatagcttt ctgcct 206

<210> 6

<211> 125

<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<223> 51UTR de FAD2-1A<400> 6

ccatatacta atatttgctt gtattgatag cccctccgtt cccaagagta taaaactgca 60

tcgaataata caagccacta ggcatgggtc tagcaaagga aacaacaatg ggaggtagag 120gtcgt 125

<210> 7

<211> 191

<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<223> íntron 1 de FAD3-1A<400> 7

gtaataattt ttgtgtttct tactcttttt tttttttttt tgtttatgat atgaatctca 60cacattgttc tgttatgtca tttcttcttc atttggcttt agacaactta aatttgagat 120ctttattatg tttttgctta tatggtaaag tgattcttca ttatttcatt cttcattgat 180tgaattgaac a 191

<210> 8<211> 346<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<223> íntron 2 de FAD3-1A<400> 8

ttagttcata ctggcttttt tgtttgttca tttgtcattg aaaaaaaatc ttttgttgat 60

tcaattattt ttatagtgtg tttggaagcc cgtttgagaa aataagaaat cgcatctgga 120atgtgaaagt tataactatt tagcttcatc tgtcgttgca agttctttta ttggttaaat 180ttttatagcg tgctaggaaa cccattcgag aaaataagaa atcacatctg gaatgtgaaa 240gttataactg ttagcttctg agtaaacgtg gaaaaaccac attttggatt tggaaccaaa 300ttttatttga taaatgacaa ccaaattgat tttgatggat tttgca 346

<210> 9<211> 142<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> íntron 3A de FAD3-1A<400> 9

gtatgtgatt aattgcttct cctatagttg ttcttgattc aattacattt tatttatttg 60gtaggtccaa gaaaaaaggg aatctttatg cttcctgagg ctgttcttga acatggctct 120tttttatgtg tcattatctt ag 142

<210> 10<211> 1228<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> íntron 4 de FAD3-1A<400> 10

taacaaaaat aaatagaaaa tagtgggtga acacttaaat gcgagatagt aatacctaaa 60aaaagaaaaa aatataggta taataaataa tataactttc aaaataaaaa gaaatcatag 120agtctagcgt agtgtttgga gtgaaatgat gttcacctac cattactcaa agattttgtt 180gtgtccctta gttcattctt attattttac atatcttact tgaaaagact ttttaattat 240tcattgagat cttaaagtga ctgttaaatt aaaataaaaa acaagtttgt taaaacttca 300

aataaataag agtgaaggga gtgtcatttg tcttctttct tttattgcgt tattaatcac 360

gtttctcttc tctttttttt ttttcttctc tgctttccac ccattatcaa gttcatgtga 420

agcagtggcg gatctatgta aatgagtggg gggcaattgc acccacaaga ttttattttt 480

tatttgtaca ggaataataa aataaaactt tgcccccata aaaaataaat attttttctt 540

aaaataatgc aaaataaata taagaaataa aaagagaata aattattatt aattttatta 600

ttttgtactt tttatttagt ttttttagcg gttagatttt tttttcatga cattatgtaa 660

tcttttaaaa gcatgtaata tttttatttt gtgaaaataa atataaatga tcatattagt 720

ctcagaatgt ataaactaat aataatttta tcactaaaag aaattctaat ttagtccata 780

aataagtaaa acaagtgaca attatatttt atatttactt aatgtgaaat aatacttgaa 840

cattataata aaacttaatg acaggagata ttacatagtg ccataaagat attttaaaaa 900

ataaaatcat taatacactg tactactata taatattcga tatatatttt taacatgatt 960

ctcaatagaa aaattgtatt gattatattt tattagacat gaatttacaa gccccgtttt 1020

tcatttatag ctcttacctg tgatctattg ttttgcttcg ctgtttttgt tggtcaaggg 1080

acttagatgt cacaatatta atactagaag taaatattta tgaaaacatg taccttacct 1140

caacaaagaa agtgtggtaa gtggcaacac acgtgttgca tttttggccc agcaataaca 1200

cgtgtttttg tggtgtacta aaatggac 122 8

<210> 11

<211> 625

<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<223> íntron 5 de FAD3-1A

<400> 11

gtacatttta ttgcttattc acctaaaaac aatacaatta gtacatttgt tttatctctt 60

ggaagttagt cattttcagt tgcatgattc taatgctctc tccattctta aatcatgttt 120

tcacacccac ttcatttaaa ataagaacgt gggtgttatt ttaatttcta ttcactaaca 180

tgagaaatta acttatttca agtaataatt ttaaaatatt tttatgctat tattttatta 240

caaataatta tgtatattaa gtttattgat tttataataa ttatattaaa attatatcga 300

tattaatttt tgattcactg atagtgtttt atattgttag tactgtgcat ttattttaaa 360

attggcataa ataatatatg taaccagctc actatactat actgggagct tggtggtgaa 420

aggggttccc aaccctcctt tctaggtgta catgctttga tacttctggt accttcttat 480atcaatataa attatatttt gctgataaaa aaacatggtt aaccattaaa ttcttttttt 540aaaaaaaaaa ctgtatctaa actttgtatt attaaaaaga agtctgagat taacaataaa 600ctaacactca tttggattca ctgca 625

<210> 12<211> 98

<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<223> íntron 3Β de FAD3-1A<400> 12

ggtgagtgat tttttgactt ggaagacaac aacacattat tattataata tggttcaaaa 60

caatgacttt ttctttatga tgtgaactcc atttttta 98

<210> 13<211> 115<212> DNA

<213> Glycine max<220>

<223> íntron 3C de FAD3-1A<400> 13

ggtaactaaa ttactcctac attgttactt tttcctcctt ttttttatta tttcaattct 60

ccaattggaa atttgaaata gttaccataa ttatgtaatt gtttgatcat gtgca 115

<210> 14<211> 1037<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> íntron 4 de Fad3-lC<400> 14

gtaacaaaaa taaatagaaa atagtgagtg aacacttaaa tgttagatac taccttcttc 60ttcttttttt tttttttttt gaggttaatg ctagataata gctagaaaga gaaagaaaga 120caaatatagg taaaaataaa taatataacc tgggaagaag aaaacataaa aaaagaaata 180atagagtcta cgtaatgttt ggatttttga gtgaaatggt gttcacctac cattactcaa 240agattctgtt gtctacgtag tgtttggact ttggagtgaa atggtgttca cctaccatta 300

ctcagattct gttgtgtccc ttagttactg tcttatattc ttagggtata ttctttattt 360

tacatccttt tcacatctta cttgaaaaga ttttaattat tcattgaaat attaacgtga 420

cagttaaatt aaaataataa aaaattcgtt aaaacttcaa ataaataaga gtgaaaggat 480

catcattttt cttctttctt ttattgcgtt attaatcatg cttctcttct tttttttctt 540

cgctttccac ccatatcaaa ttcatgtgaa gtatgagaaa atcacgattc aatggaaagc 600

tacaggaacy ttttttgttt tgtttttata atcggaatta atttatactc cattttttca 660

caataaatgt tacttagtgc cttaaagata atatttgaaa aattaaaaaa attattaata 720

cactgtacta ctatataata tttgacatat atttaacatg attttctatt gaaaatttgt 780

atttattatt ttttaatcaa aacccataag gcattaattt acaagaccca tttttcattt 840

atagctttac ctgtgatcat ttatagcttt aagggactta gatgttacaa tcttaattac 900

aagtaaatat ttatgaaaaa catgtgtctt accccttaac cttacctcaa caaagaaagt 960

gtgataagtg gcaacacacg tgttgctttt ttggcccagc aataacacgt gtttttgtgg 102 0

tgtacaaaaa tggacag 1037

<210> 15

<211> 4010<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> clone genômico parcial de FAD3-1A<400> 15

acaaagcctt tagcctatgc tgccaataat ggataccaac aaaagggttc ttcttttgat 60

tttgatccta gcgctcctcc accgtttaag attgcagaaa tcagagcttc aataccaaaa 120

cattgctggg tcaagaatcc atggagatcc ctcagttatg ttctcaggga tgtgcttgta 180

attgctgcat tggtggctgc agcaattcac ttcgacaact ggcttctctg gctaatctat 240

tgccccattc aaggcacaat gttctgggct ctctttgttc ttggacatga ttggtaataa 300

tttttgtgtt tcttactctt tttttttttt ttttgtttat gatatgaatc tcacacattg 360

ttctgttatg tcatttcttc ttcatttggc tttagacaac ttaaatttga gatctttatt 420

atgtttttgc ttatatggta aagtgattct tcattatttc attcttcatt gattgaattg 480

aacagtggcc atggaagctt ttcagatagc cctttgctga atagcctggt gggacacatc 540

ttgcattcct caattcttgt gccataccat ggatggttag ttcatactgg cttttttgtt 600

tgttcatttg tcattgaaaa aaaatctttt gttgattcaa ttatttttat agtgtgtttg 660gaagcccgtt tgagaaaata agaaatcgcattcatctgtc gttgcaagtt cttttattggttcgagaaaa taagaaatca catctggaataacgtggaaa aaccacattt tggatttggaattgattttg atggattttg caggagaattcacattgaga aggatgagtc atgggttccattcttgattc aattacattt tatttatttgcttcctgagg ctgttcttga acatggctctgaagatttac aagaatctag acagcatgacatgtttgtgt atccaattta tttggtgagttattattata atatggttca aaacaatgacagttttcaag aagccccgga aaggaaggctcacccagtga gagaaaagga atagcaatattgcttatcta tctctcattc attaactagtccatattggg taactaaatt actcctacattcaattctcc aattggaaat ttgaaatagtgcagatgttt gttatgtggc tggactttgtgaaactgcct tggtaccgcg gcaaggtaacttaaatgcga gatagtaata cctaaaaaaaactttcaaaa taaaaagaaa tcatagagtcacctaccatt actcaaagat tttgttgtgtcttacttgaa aagacttttt aattattcattaaaaaacaa gtttgttaaa acttcaaatactttctttta ttgcgttatt aatcacgtttttccacccat tatcaagttc atgtgaagcaaattgcaccc acaagatttt attttttattcccataaaaa ataaatattt tttcttaaaaagaataaatt attattaatt ttattattttgatttttttt tcatgacatt atgtaatcttaaataaatat aaatgatcat attagtctcataaaagaaat tctaatttag tccataaatattacttaatg tgaaataata cttgaacatt

tctggaatgt gaaagttata actatttagc 720

ttaaattttt atagcgtgct aggaaaccca 780

gtgaaagtta taactgttag cttctgagta 840

accaaatttt atttgataaa tgacaaccaa 900

agccacagaa ctcaccatga aaaccatgga 960

gtatgtgatt aattgcttct cctatagttg 1020

gtaggtccaa gaaaaaaggg aatctttatg 1080

tttttatgtg tcattatctt agttaacaga 1140

aagactcatt agattcactg tgccatttcc 1200

gattttttga cttggaagac aacaacacat 1260

tttttcttta tgatgtgaac tccatttttt 1320

ctcacttcaa tccctacagc aatctgtttc 1380

caacactgtg ttgggctacc atgttttctc 1440

ccacttctag tgctcaagct ctatggaatt 1500

tgttactttt tcctcctttt ttttattatt 1560

taccataatt atgtaattgt ttgatcatgt 1620

cacatacttg catcaccatg gtcaccacca 1680

aaaaataaat agaaaatagt gggtgaacac 1740

gaaaaaaata taggtataat aaataatata 1800

tagcgtagtg tttggagtga aatgatgttc 1860

cccttagttc attcttatta ttttacatat 1920

tgagatctta aagtgactgt taaattaaaa 1980

aataagagtg aagggagtgt catttgtctt 2040

ctcttctctt tttttttttt cttctctgct 2100

gtggcggatc tatgtaaatg agtggggggc 2160

tgtacaggaa taataaaata aaactttgcc 2220

taatgcaaaa taaatataag aaataaaaag 2280

gtacttttta tttagttttt ttagcggtta 2340

ttaaaagcat gtaatatttt tattttgtga 2400

gaatgtataa actaataata attttatcac 2460

agtaaaacaa gtgacaatta tattttatat 2520

ataataaaac ttaatgacag gagatattac 2580atagtgccat aaagatattt taaaaaataa aatcattaat acactgtact actatataat 2640

attcgatata tatttttaac atgattctca atagaaaaat tgtattgatt atattttatt 2700

agacatgaat ttacaagccc cgtttttcat ttatagctct tacctgtgat ctattgtttt 2760

gcttcgctgt ttttgttggt caagggactt agatgtcaca atattaatac tagaagtaaa 2820

tatttatgaa aacatgtacc ttacctcaac aaagaaagtg tggtaagtgg caacacacgt 2880

gttgcatttt tggcccagca ataacacgtg tttttgtggt gtactaaaat ggacaggaat 2940

ggagttattt aagaggtggc ctcaccactg tggatcgtga ctatggttgg atcaataaca 3000

ttcaccatga cattggcacc catgttatcc accatctttt cccccaaatt cctcattatc 3060

acctcgttga agcggtacat tttattgctt attcacctaa aaacaataca attagtacat 3120

ttgttttatc tcttggaagt tagtcatttt cagttgcatg attctaatgc tctctccatt 3180

cttaaatcat gttttcacac ccacttcatt taaaataaga acgtgggtgt tattttaatt 3240

tctattcact aacatgagaa attaacttat ttcaagtaat aattttaaaa tatttttatg 3300

ctattatttt attacaaata attatgtata ttaagtttat tgattttata ataattatat 3360

taaaattata tcgatattaa tttttgattc actgatagtg ttttatattg ttagtactgt 3420

gcatttattt taaaattggc ataaàtaata tatgtaacca gctcactata ctatactggg 3480

agcttggtgg tgaaaggggt tcccaaccct cctttctagg tgtacatgct ttgatacttc 3540

tggtaccttc ttatatcaat ataaattata ttttgctgat aaaaaaacat ggttaaccat 3600

taaattcttt ttttaaaaaa aaaactgtat ctaaactttg tattattaaa aagaagtctg 3660

agattaacaa taaactaaca ctcatttgga ttcactgcag acacaagcag caaaaccagt 3720

tcttggagat tactaccgtg agccagaaag atctgcgcca ttaccatttc atctaataaa 3780

gtatttaatt cagagtatga gacaagacca cttcgtaagt gacactggag atgttgttta 3840

ttatcagact gattctctgc tcctccactc gcaacgagac tgagtttcaa actttttggg 3900

ttattattta ttgattctag ctactcaaat tacttttttt ttaatgttat gttttttgga 3960

gtttaacgtt ttctgaacaa cttgcaaatt acttgcatag agagacatgg 4010

<210> 16

<211> 184<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> 3'UTR de FAD3-1A<400> 16

gtttcaaact ttttgggtta ttatttattg gattctagct actcaaatta cttttttttt 60aatgttatgt tttttggagt ttaacgtttt ctgaacaact tgcaaattac ttgcatagag 120agacatggaa tatttatttg aaattagtaa ggtagtaata ataaattttg aattgtcagt 180ttca 184

<210> 17<211> 143<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> 5'UTR de FAD3-1A<400> 17

tgcggttata taaatgcact atcccataag agtatttttc gaagatttcc ttcttcctat 60tctaggtttt tacgcaccac gtatccctga gaaaagagag gaaccacact ctctaagcca 120aagcaaaagc agcagcagca gca 143

<210> 18<211> 2683

<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<223> clone genômico parcial de FAD3-1B

<400> 18

gttcaagcac agcctctaca acatgttggt aatggtgcag ggaaagaaga tcaagcttat 60

tttgatccaa gtgctccacc acccttcaag attgcaaata tcagagcagc aattccaaaa 120

cattgctggg agaagaacac attgagatct ctgagttatg ttctgaggga tgtgttggta 180

gtgactgcat tggtagctgc agcaatcggc ttcaatagct ggttcttctg gccactctat 240

tggcctgcac aaggcacaat gttttgggca ctttttgttc ttggacatga ttggtaacta 300

attattatta caaattgtta tgttatgtta tgttatgttg ttgtgccttt ttctcagtga 360

tgctttagtc atttcatttc acttggttat gcatgattgt tcgttcatat gttctgtcat 420

ggtgagttct aatttgattg atgcatggaa cagtggtcat ggaagttttt caaacagtcc 480

tttgttgaac agcattgtgg gccacatctt gcactcttca attcttgtac cataccatgg 540

atggtcggtt ccttttagca acttttcatg ttcactttgt ccttaaattt ttttttatgt 600

ttgttaaaaa atctttggtc tgatttaaca acctaaccat ttttacaact catggatttt 660

ttgcaggaga attagccaca ggactcacca tcagaaccat ggccatgttg agaaggatga 720atcatgggtt ccggtattac tatgagtttg cttgattaat ttccacattt tttctttctt 780

cttaatttta atcagtggtt agatttggtt gtgttccgat agaagaaaag ggggtatcta 840

gagagatgtg aatttcatga agtggttcat gattatgtgt ctttatgcct ttatgtcagc 900

ttacagagaa agtttacaag aatctagaca acatgacaag aatgatgaga ttcactcttc 960

ctttccccat ctttgcatac cccttttatt tggtgagacc ctctttttcc agaatgacag 1020

cattatttta ctatatagta cctcaatttt tatatttcta aaattttgaa ttcttgaaat 1080

tgaaaggaaa ggactttatt gggtctagca tctcactctc tctttgtgat atgaaccata 1140

tatttcagtg gagcagaagc cctggaaaag aaggctctca tttcaaccct tacagcaact 1200

tgttctctcc tggtgagaga agagatgtgc taacttcaac tctatgttgg ggcatcatgc 1260

tttctgtgct tctctatctt tccctcacaa tgggtccact ttttatgctc aagctctatg 1320

gggttcccta tttggtaatc tcactctcac actttcttta tacatcgcac gccagtgtgg 1380

gttatttgca acctacaccg aagtaatgcc ctataattaa tgaggttaac acatgtccaa 1440

gtccaatatt ttgttcactt atttgaactt gaacatgtgt agatcttcgt catgtggctg 1500

gatttcgtca cgtacttgca tcatcatggt tacaagcaga aactgccttg gtaccgtggc 1560

caggtatccc atttaacaca atttgtttca ttaacatttt aagagaattt ttttttcaaa 1620

atagttttcg aaattaagca aataccaagc aaattgttag atctacgctt gtacttgttt 1680

taaagtcaaa ttcatgacca aattgtcctc acaagtccaa accgtccact attttatttt 1740

cacctacttt atagcccaat ttgccatttg gttacttcag aaaagagaac cccatttgta 1800

gtaaatatat tatttatgaa ttatggtagt ttcaacataa aacatactta tgtgcagttt 1860

tgccatcctt caaaagaagg tagaaactta ctccatgtta ctctgtctat atgtaatttc 1920

acaggaatgg agttatctaa ggggtggtct tacaacagta gatcgcgact atggttggat 1980

caacaacatt caccatgaca ttggcaccca tgttatccat caccttttcc ctcaaattcc 2040

acattatcat ttaatcgaag cggtattaat tctctatttc acaagaaatt attgtatgtc 2100

tgcctatgtg atctaagtca attttcacat aacacatgat caaactttct taattctttc 2160

ttctaaattg aaaaagtgga ttatatgtca attgaaaatt ggtcaagacc acaaacatgt 2220

gatgatctcc caccttacat ataataattt ctcctattct acaatcaata atccttctat 2280

ggtcctgaat tgttcctttc ttttttcatt ttcttattct ttttgttgtc ccacaataga 2340

ctaaagcagc aaaggcagtg ctaggaaagt attatcgtga gcctcagaaa tctgggccat 2400

tgccacttca tctaataaag tacttgctcc acagcataag tcaggatcac ttcgttagcg 2460

actctggcga cattgtgtac taccagactg attcccagct ccacaaagat tcttggaccc 2520

agtccaacta aagtttttga tgctacattt acctatttca ctcttaaata ctatttccta 2580

tgtaatatgt aatttagaat atgttaccta ctcaaatcaa ttaggtgaca tgtataagct 2640ttcataaatt atgctagaaa tgcacttact tttcaaagca tgc 2683

<210> 19<211> 160<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> íntron 1 de FAD3-1B<400> 19

gtaactaatt attattacaa attgttatgt tatgttatgt tatgttgttg tgcctttttc 60tcagtgatgc tttagtcatt tcatttcact tggttatgca tgattgttcg ttcatatgtt 120ctgtcatggt gagttctaat ttgattgatg catggaacag 160

<210> 20<211> 119<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> íntron 2 de FAD3-1B<400> 20

gttcctttta gcaacttttc atgttcactt tgtccttaaa ttttttttta tgtttgttaa 60aaaatctttg gtctgattta acaacctaac catttttaca actcatggat tttttgcag 119

<210> 21<211> 166<212> DNA<213> Glycine max

<220>

<223> íntron 3a de FAD3-1B<400> 21

gtattactat gagtttgctt gattaatttc cacatttttt ctttcttctt aattttaatc 60

agtggttaga tttggttgtg ttccgataga agaaaagggg gtatctagag agatgtgaat 120ttcatgaagt ggttcatgat tatgtgtctt tatgccttta tgtcag 166

<210> 22<211> 156<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> íntron 3b de FAD3-1B<400> 22

gtgagaccct ctttttccag aatgacagca ttattttact atatagtacc tcaattttta 60tatttctaaa attttgaatt cttgaaattg aaaggaaagg actttattgg gtctagcatc 120tcactctctc tttgtgatat gaaccatata tttcag 156

<210> 23

<211> 148

<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<223> íntron 3c de FAD3-1B

<400> 23

gtaatctcac tctcacactt tctttataca tcgcacgcca gtgtgggtta tttgcaacct 60

acaccgaagt aatgccctat aattaatgag gttaacacat gtccaagtcc aatattttgt 120tcacttattt gaacttgaac atgtgtag 148

<210> 24<211> 351

<212> DNA

<213> Glycine max<220>

<223> íntron 4 de FAD3-1B

<400> 24

taacacaatt tgtttcatta acattttaag agaatttttt tttcaaaata gttttcgaaa 60

ttaagcaaat accaagcaaa ttgttagatc tacgcttgta cttgttttaa agtcaaattc 120

atgaccaaat tgtcctcaca agtccaaacc gtccactatt ttattttcac ctactttata 180

gcccaatttg ccatttggtt acttcagaaa agagaacccc atttgtagta aatatattat 240

ttatgaatta tggtagtttc aacataaaac atacttatgt gcagttttgc catccttcaa 300

aagaaggtag aaacttactc catgttactc tgtctatatg taatttcaca g 351<210> 25<211> 277

<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<223> íntron 5 de FAD3-1B<400> 25

gtattaattc tctatttcac aagaaattat tgtatgtctg cctatgtgat ctaagtcaat 60

tttcacataa cacatgatca aactttctta attctttctt ctaaattgaa aaagtggatt 120atatgtcaat tgaaaattgg tcaagaccac aaacatgtga tgatctccca ccttacatat 180aataatttct cctattctac aatcaataat ccttctatgg tcctgaattg ttcctttctt 240ttttcatttt cttattcttt ttgttgtccc acaatag 277

<210> 26<211> 158<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> 3'UTR de FAD3-1B<400> 26

agtttttgat gctacattta cctatttcac tcttaaatac tatttcctat gtaatatgta 60atttagaata tgttacctac tcaaatcaat taggtgacat gtataagctt tcataaatta 120tgctagaaat gcacttactt ttcaaagcat gctatgtc 158

<210> 27<211> 83<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> 5'UTR de FAD3-1B<400> 27

tctaatacga ctcactatag ggcaagcagt ggtatcaacg cagagtacgc gggggtaaca 60gagaaagaaa catttgagca aaa 83

<210> 28<211> 4083<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> clone genômico de FATB-I

<400> 28

gggaaacaac aaggacgcaa aatgacacaaccttctctct ctccatcttc ttcttcttcttattcattca ttcattcctc tttctctctgtctcattttc tcttcctttc tcgcttctcaacccgctttt tctgcatttc tagactagacctcttttaac tttattttta aaataataataatttcgagg caatggggtt ctcattttcgctcttctccc ttgtttcttt gccttgtctgtttggggatg gatatttttt ctgcatttttccgagtcaga tctgcgccgg cttatacgacgattggcttg ttttacctct ggaatctcacgaagtagaat ttgttcttta tcggaaagaactgtttcgag ttgctatttt ttttagtagttttttttcct ttgcttttgc caaaagttttctgatgtgct gtgctgttat tatttgttatttggagcatt tttagtccga ttgatttctcccacgcgttt gcgtttgatg ttttttccatttgcctattt gcatttctct tctttatcccattttttttt tctcttctaa cttgcgtataatggtggcaa cagctgctac ttcatcatttggtggagcag gcagcaaact tggtggtgggtctgcgtctt ctggtggctt gaaggcaaagacagttgtta catctaaaga aggcttcaagagaactttta tcaaccagtt gcctgattggttcttggccg ctgaaaagca gtggatgatgcttattgacc cctttgggat aggaaaaattttttctatta gatcatatga gattggtgct

tagcccttct tccctgtttc cagcttttct 60

tcactcagtc aggtacgcaa acaaatctgc 120

atcgcaaact gcacctctac gctccactct 180

gatccaactc ctcagataac acaagaccaa 240

gttctaccgg agaaggttct cgattctttt 300

aatgagagct ggatgcgtct gttcgttgtg 360

ttacagttac agattgcatt gtctgctttc 420

atttttcgtt tttatttctt acttttaatt 480

tcggtttgcg atgttttcag gattccgatt 540

gaatttgttc ttattcgcaa cttttcgctt 600

acgtgatcaa ataagcctgc tattttagtt 660

ttctatggat ctgttctgaa attggagcta 720

attaagaaca agtttgcctt ttattttaca 780

tatgatcact ctcttctgtt tgtgatataa 840

ttggggtgaa gtataatttt ttgggtgaac 900

gatatcattt aaggctaagg ttgacctcta 960

ttttttttta tctcatatct tttacagtgt 1020

ctttctgtgg aaaggtggga gggaaaatgt 1080

ttttgcatgc agcgacctta gaaattcatt 1140

ttccctgtta cttcaccctc gccggactct 1200

cctgcaaacc ttggaggact aaaatccaaa 1260

gcgcaagccc cttcgaaaat taatggaacc 1320

catgatgatg atctaccttc gcctcccccc 1380

agcatgcttc ttgctgctat cacaacaatt 1440

cttgattgga agccacggcg acctgacatg 1500

gttcaggatg gtcttgtgtt ccgtgaaaac 1560

gatcgtaccg catctataga aacagtaatg 1620aaccatttgc aagtaagtcc gtcctcatac aagtgaatct ttatgatctt cagagatgag 1680

tatgctttga ctaagatagg gctgtttatt tagacactgt aattcaattt catatataga 1740

taatatcatt ctgttgttac ttttcatact atatttatat caactatttg cttaacaaca 1800

ggaaactgca cttaatcatg ttaaaagtgc tgggcttctt ggtgatggct ttggttccac Í860

gccagaaatg tgcaaaaaga acttgatatg ggtggttact cggatgcagg ttgtggtgga 1920

acgctatcct acatggttag tcatctagat tcaaccatta catgtgattt gcaatgtatc 1980

catgttaagc tgctatttct ctgtctattt tagtaatctt tatgaggaat gatcactcct 2040

aaatatattc atggtaatta ttgagactta attatgagaa ccaaaatgct ttggaaattt 2100

gtctgggatg aaaattgatt agatacacaa gctttataca tgatgaacta tgggaaacct 2160

tgtgcaacag agctattgat ctgtacaaga gatgtagtat agcattaatt acatgttatt 2220

agataaggtg acttatcctt gtttaattat tgtaaaaata gaagctgata ctatgtattc 2280

tttgcatttg ttttcttacc agttatatat accctctgtt ctgtttgagt actactagat 2340

gtataaagaa tgcaattatt ctgacttctt ggtgttgggt tgaagttaga taagctatta 2400

gtattattat ggttattcta aatctaatta tctgaaattg tgtgtctata tttgcttcag 2460

gggtgacata gttcaagtgg acacttgggt ttctggatca gggaagaatg gtatgcgtcg 2520

tgattggctt ttacgtgact gcaaaactgg tgaaatcttg acaagagctt ccaggtagaa 2580

atcattctct gtaattttcc ttcccctttc cttctgcttc aagcaaattt taagatgtgt 2640

atcttaatgt gcacgatgct gattggacac aattttaaat ctttcaaaca tttacaaaag 2700

ttatggaacc ctttcttttc tctcttgaag atgcaaattt gtcacgactg aagtttgagg 2760

aaatcatttg aattttgcaa tgttaaaaaa gataatgaac tacatatttt gcaggcaaaa 2820

acctctaatt gaacaaactg aacattgtat cttagtttat ttatcagact ttatcatgtg 2880

tactgatgca tcaccttgga gcttgtaatg aattacatat tagcattttc tgaactgtat 2940

gttatggttt tggtgatcta cagtgtttgg gtcatgatga ataagctgac acggaggctg 3000

tctaaaattc cagaagaagt cagacaggag ataggatctt attttgtgga ttctgatcca 3060

attctagaag aggataacag aaaactgact aaacttgacg acaacacagc ggattatatt 3120

cgtaccggtt taagtgtatg tcaactagtt tttttgtaat tgttgtcatt aatttctttt 3180

cttaaattat ttcagatgtt gctttctaat tagtttacat tatgtatctt cattcttcca 3240

gtctaggtgg agtgatctag atatcaatca gcatgtcaac aatgtgaagt acattgactg 3300

gattctggag gtatttttct gttcttgtat tctaatccac tgcagtcctt gttttgttgt 3360

taaccaaagg actgtccttt gattgtttgc agagtgctcc acagccaatc ttggagagtc 3420

atgagctttc ttccgtgact ttagagtata ggagggagtg tggtagggac agtgtgctgg 3480

attccctgac tgctgtatct ggggccgaca tgggcaatct agctcacagt ggacatgttg 3540agtgcaagca tttgcttcga ctcgaaaatg gtgctgagat tgtgaggggc aggactgagt 3600

ggaggcccaa acctatgaac aacattggtg ttgtgaacca ggttccagca gaaagcacct 3660

aagattttga aatggttaac ggttggagtt gcatcagtct ccttgctatg tttagactta 3720

ttctggcctc tggggagagt tttgcttgtg tctgtccaat caatctacat atctttatat 3780

ccttctaatt tgtgttactt tggtgggtaa gggggaaaag ctgcagtaaa cctcattctc 3840

tctttctgct gctccatatt tcatttcatc tctgattgcg ctactgctag gctgtcttca 3900

atatttaatt gcttgatcaa aatagctagg catgtatatt attattcttt tctcttggct 3960

caattaaaga tgcaattttc attgtgaaca cagcataact attattctta ttatttttgt 4020

atagcctgta tgcacgaatg acttgtccat ccaatacaac cgtgattgta tgctccagct 4080

cag 4083<210> 29<211> 109<212> DNA<213> Glycine max

<220>

<223> íntron I de FATB-I<400> 29

gtacgcaaac aaatctgcta ttcattcatt cattcctctt tctctctgat cgcaaactgc 60

acctctacgc tccactcttc tcattttctc ttcctttctc gcttctcag 109

<210> 30

<211> 836<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> íntron II de FATB-I<400> 30

gttctcgatt cttttctctt ttaactttat ttttaaaata ataataatga gagctggatg 60cgtctgttcg ttgtgaattt cgaggcaatg gggttctcat tttcgttaca gttacagatt 120gcattgtctg ctttcctctt ctcccttgtt tctttgcctt gtctgatttt tcgtttttat 180ttcttacttt taatttttgg ggatggatat tttttctgca ttttttcggt ttgcgatgtt 240ttcaggattc cgattccgag tcagatctgc gccggcttat acgacgaatt tgttcttatt 300cgcaactttt cgcttgattg gcttgtttta cctctggaat ctcacacgtg atcaaataag 360cctgctattt tagttgaagt agaatttgtt ctttatcgga aagaattcta tggatctgtt 420

ctgaaattgg agctactgtt tcgagttgct atttttttta gtagtattaa gaacaagttt 480

gccttttatt ttacattttt ttcctttgct tttgccaaaa gtttttatga tcactctctt 540

ctgtttgtga tataactgat gtgctgtgct gttattattt gttatttggg gtgaagtata 600

attttttggg tgaacttgga gcatttttag tccgattgat ttctcgatat catttaaggc 660

taaggttgac ctctaccacg cgtttgcgtt tgatgttttt tccatttttt ttttatctca 720

tatcttttac agtgtttgcc tatttgcatt tctcttcttt atcccctttc tgtggaaggt 780

gggagggaaa atgtattttt tttttctctt ctaacttgcg tatattttgc atgcag 836

<210> 31

<211> 169

<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<223> íntron III de FATB-I

<400> 31

gtaagtccgt cctcatacaa gtgaatcttt atgatcttca gagatgagta tgctttgact 60

aagatagggc tgtttattta gacactgtaa ttcaatttca tatatagata atatcattct 120gttgttactt ttcatactat atttatatca actatttgct taacaacag 169

<210> 32

<211> 525

<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> íntron IV de FATB-I

<400> 32

gttagtcatc tagattcaac cattacatgt gatttgcaat gtatccatgt taagctgcta 60

tttctctgtc tattttagta atctttatga ggaatgatca ctcctaaata tattcatggt 120

aattattgag acttaattat gagaaccaaa atgctttgga aatttgtctg ggatgaaaat 180

tgattagata cacaagcttt atacatgatg aactatggga aaccttgtgc aacagagcta 240

ttgatctgta caagagatgt agtatagcat taattacatg ttattagata aggtgactta 300

tccttgttta attattgtaa aaatagaagc tgatactatg tattctttgc atttgttttc 360

ttaccagtta tatataccct ctgttctgtt tgagtactac tagatgtata aagaatgcaa 420ttattctgac ttcttggtgt tgggttgaag ttagataagc tattagtatt attatggtta 480ttctaaatct aattatctga aattgtgtgt ctatatttgc ttcag 525

<210> 33<211> 389<212> DNA

<213> Glycine max<220>

<223> íntron V de FATB-I<400> 33

gtagaaatca ttctctgtaa ttttccttcc cctttccttc tgcttcaagc aaattttaag 60

atgtgtatct taatgtgcac gatgctgatt ggacacaatt ttaaatcttt caaacattta 120caaaagttat ggaacccttt cttttctctc ttgaagatgc aaatttgtca cgactgaagt 180ttgaggaaat catttgaatt ttgcaatgtt aaaaaagata atgaactaca tattttgcag 240gcaaaaacct ctaattgaac aaactgaaca ttgtatctta gtttatttat cagactttat 300catgtgtact gatgcatcac cttggagctt gtaatgaatt acatattagc attttctgaa 360ctgtatgtta tggttttggt gatctacag 389

<210> 34<211> 106<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> íntron VI de FATB-I<400> 34

tatgtcaact agtttttttg taattgttgt cattaatttc ttttcttaaa ttatttcaga 60

tgttgctttc taattagttt acattatgta tcttcattct tccagt 106

<210> 35<211> 82<212> DNA<213> Glycine max

<220>

<223> íntron VII de FATB-I<400> 35gtatttttct gttcttgtat tctaatccac tgcagtcctt gttttgttgt taaccaaagg 60

actgtccttt gattgtttgc ag 82

<210> 36

<211> 208

<212> DNA

<213> Glycine max<220>

<223> 3'UTR de FATB-I

<400> 36

gatttgaaat ggttaacgat tggagttgca tcagtctcct tgctatgttt agacttattc 60tggttccctg gggagagttt tgcttgtgtc tatccaatca atctacatgt ctttaaatat 120atacaccttc taatttgtga tactttggtg ggtaaggggg aaaagcagca gtaaatctca 180ttctcattgt aattaaaaaa aaaaaaaa 208

<210> 37

<211> 229

<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> 5'UTR de FATB-I<400> 37

acaattacac tgtctctctc ttttccaaaa ttagggaaac aacaaggacg caaaatgaca 60

caatagccct tcttccctgt ttccagcttt tctccttctc tctctctcca tcttcttctt 120cttcttcact cagtcagatc caactcctca gataacacaa gaccaaaccc gctttttctg 180catttctaga ctagacgttc taccggagaa gcgaccttag aaattcatt 229

<210> 38

<211> 1398

<212> DNA

<213> Cuphea pulcherrima<220>

<223> gene de KAS I

<400> 38

atgcattccc tccagtcacc ctcccttcgg gcctccccgc tcgacccctt ccgccccaaa 60tcatccaccg tccgccccct ccaccgagcaaccgtctccg ctcccaagcg cgagaccgacggccttgtct ccgttttcgg ctccgacgtcgagagcggga tcggcccaat cgaccgcttcggccagattc gtggcttcaa ctccatgggagatgattgcc ttcgctactg cattgtcgccggtgccgacc gcctctccaa gatcgacaagatgggtggtc tgactgtctt ctctgacgggaaaatcaccc ctttcttcat cccctatgccattgaactcg gtctgatggg cccaaactattactgcttcc atgctgctgc taatcatatcggaggcactg aggccgcaat cattccaattctgtctcaaa ggaacgatga ccctcagactggttttgtga tgggtgaagg tgctggagtgaaacgaggag cacctattat tgcagagtatcacatgactg acccaagggc tgatggtctcgaagatgctg gcgtctcacc tgaagaggtcctagctgggg atctcgccga gataaatgccatcaaaatta atgcaactaa gtcaatgatcgaagctatag cgactattaa gggaataaacttcaatcctg agccatccgt ggagttcgacgttaatgttg cgatctcgaa ttcatttggatcggctttca agccatga<210> 39

<211> 1218

<212> DNA

<213> Cuphea pulcherrima<400> 39

atgggtgtgg tgactcctct aggccatgacggaacgagtg gcataagcga gatagagaccgctggagaga tcaagtcttt ctccacagatatggacaagt tcatgctata catgctgacc

tcaattccca acgtccgggc cgcttccccc 120

cccaagaagc gcgtcgtgat caccggaatg 180

gatgcgtact acgacaagct cctgtcaggc 240

gacgcctcca agttccccac caggttcggc 300

tacattgacg gcaaaaacga caggcggctt 360

gggaagaagt ctcttgagga cgccgatctc 420

gagagagccg gagtgctggt tgggacagga 480

gttcaatctc ttatcgagaa gggtcaccgg 540

attacaaaca tggggtctgc cctgctcgct 600

tcaatttcca ctgcatgtgc cacttccaac 660

cgccgtggtg aggctgatct tatgattgct 720

gggttgggag gctttgtggc ttgcagggct 780

gcctctaggc cctgggataa agaccgtgat 840

ttggtgctgg agagcttgga acatgcaatg 900

ttgggaggtg caatcaactg tgatgcttat 960

ggtgtctcct cttgcattga gagtagcctt 1020

aattacataa atgctcatgc gacttctact 1080

atcaagaagg ttttcaagaa cacaaaggat 1140

ggacactgtc ttggagcctc tggaggtctt 12 00

accggctggc ttcatcccag cattaatcaa 1260

actgttgcca acaagaagca gcaacacgaa 1320

ttcggaggcc acaactcagt cgtggctttc 13 80

1398

cctgatgttt tctacaataa tctgcttgat 60

tttgattgtg ctcaatttcc tacgagaatt 120

ggttgggtgg ccccgaagct ctctaagagg 180

gctggcaaga aagcattaac agatggtgga 240atcaccgaag atgtgatgaa agagctagat aaaagaaaat gcggagttct cattggctca 300

gcaatgggtg gaatgaaggt attcaatgat gccattgaag ccctaaggat ttcatataag 360

aagatgaatc ccttttgtgt acctttcgct accacaaata tgggatcagc tatgcttgca 420

atggacttgg gatggatggg gcccaactac tcgatatcta ctgcttgtgc aacgagtaac 480

ttttgtataa tgaatgctgc gaaccatata atcagaggcg aagcagatgt gatgctttgc 540

gggggctcag atgcggtaat catacctatt ggtatgggag gttttgttgc atgccgagct 600

ttgtcccaga gaaattccga ccctactaaa gcttcaagac catgggacag taatcgtgat 660

ggatttgtta tgggggaagg agctggagtg ctactactag aggagttgga gcatgcaaag 720

aaaagaggtg cgactattta cgcagaattt ctaggtggga gtttcacttg cgatgcctac 780

cacatgaccg agcctcaccc tgatggagct ggagtgattc tctgcataga gaaggctttg 840

gctcagtcag gagtctctag ggaagacgta aattacataa atgcccatgc cacatccact 900

ccggctggag atatcaaaga gtaccaagct cttatccact gtttcggcca aaacagagag 960

ttaaaagtta attcaaccaa atcaatgatt ggtcaccttc tcggagcagc cggtggtgtg 1020

gaagcagttt cagtagttca ggcaataagg actgggtgga tccatccgaa tattaatttg 1080

gaaaacccag atgaaggcgt ggatacaaaa ttgctcgtgg gtcctaagaa ggagagactg 1140

aacgttaagg tcggtttgtc taattcattt gggtttggtg ggcacaactc gtccatactc 1200

ttcgcccctt acatctag 1218<210> 40<211> 1191<212> DNA

<213> Ricinus communis<220>

<223> Desaturase delta-9<400> 40

atggctctca agctcaatcc tttcctttct caaacccaaa agttaccttc tttcgctctt 60

ccaccaatgg ccagtaccag atctcctaag ttctacatgg cctctaccct caagtctggt 120

tctaaggaag ttgagaatct caagaagcct ttcatgcctc ctcgggaggt acatgttcag 180

gttacccatt ctatgccacc ccaaaagatt gagatcttta aatccctaga caattgggct 240

gaggagaaca ttctggttca tctgaagcca gttgagaaat gttggcaacc gcaggatttt 300

ttgccagatc ccgcctctga tggatttgat gagcaagtca gggaactcag ggagagagca 360

aaggagattc ctgatgatta ttttgttgtt ttggttggag acatgataac ggaagaagcc 420

cttcccactt atcaaacaat gctgaatacc ttggatggag ttcgggatga aacaggtgca 480agtcctactt cttgggcaat ttggacaagggacctcctca ataagtatct ctacctatctacaattcaat atttgattgg ttcaggaatggggttcatct atacatcatt ccaggaaaggcgacaagcca aagagcatgg agacataaaggatgagaagc gccatgagac agcctacacacctgatggaa ctgttttggc ttttgctgatcacttgatgt atgatggccg agatgataatcgtcttggag tctacacagc aaaggattattggaaggtgg ataaactaac gggcctttcatgtcggttac ctccaagaat tagaaggctggcacccacca tgcctttcag ctggattttc<210> 41<211> 1194<212> DNA

<213> Simmondsia chinensis<220>

<223> Desaturase delta-9<400> 41

atggcgttga agcttcacca cacggccttccttcctcgat cgtatcacct cagatctcacattacttcta aggagatacc caatgccaaagtgcaaaaga cccattcaat gccgcctcaatgggctgagg agaatgtctt ggtgcatcttgattttctac ccgacccggc ctccgagggaagaaccaaag aaatcccgga tgagtaccttgaagctcttc cgacctacca gacgatgctaggtgccagcc ttacttcttg ggctatctggcacggtgatc ttttgaacaa gtatctttacgagaagacaa tccagtatct aatcggatcttatctaggct tcatctacac ttccttccaaaccgctaggc tcgccaaaga ccacggcgac

gcatggactg cggaagagaa tagacatggt 540

ggacgagtgg acatgaggca aattgagaag 600

gatccacgga cagaaaacag tccatacctt 660

gcaaccttca tttctcatgg gaacactgcc 720

ttggctcaaa tatgtggtac aattgctgca 780

aagatagtgg aaaaactctt tgagattgat 840

atgatgagaa agaaaatttc tatgcctgca 900

ctttttgacc acttttcagc tgttgcgcag 960

gcagatatat tggagttctt ggtgggcaga 1020

gctgagggac aaaaggctca ggactatgtt 1080

gaagagagag ctcaaggaag ggcaaaggaa 1140

gataggcaag tgaagctgta g 1191

aatccttcca tggcggttac ctcttcggga 60

cgcgttttca tggcttcttc tacaattgga 120

aagcctcaca tgcctcctag agaagctcat 180

aagattgaga ttttcaaatc cttggagggt 240

aaacctgtgg agaagtgttg gcaaccacaa 300

tttatggatc aagtcaagga gttgagggaa 360

gtggtgttgg ttggcgatat gatcactgaa 420

aacacgctcg atggagtacg tgatgagacg 480

acccgggcat ggaccgctga agagaatagg 540

cttactggtc gagttgacat gaagcagata 600

ggaatggacc ctcgaagtga aaacaacccc 660

gagagagcaa ccttcatctc ccatggaaac 720

tttcaactag cacaagtatg tggcatcatc 780gctgcagatg agaagcgcca cgaaactgccatcgacccag acggcgctgt tctagcactaccagcccact taatgtatga tggcaaagatgctcaacaaa ttggagttta caccgcgaagaatcgctgga aagtcgagaa tttaatgggtttcgtatgtg ggttggcccc gaggatcaggaaaccggtat ctcttgtccc cttcagctgg<210> 42<211> 2077<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Contig de cDNA FATB-2<400> 42

gagggaaaca aggaagcgaa atgacacaatttttctcctt ctcgtttgtt gagcgcttttgctgccgtag aaattcatta tggtggcaacttcaccctcg ccggactctg gtggacatgccacattattg ttaatattct tcccttctttacaacaccac ccagaattgt tgggttccatagagagagag tgaaaacggg aaaagcaaaagaatcatcat cagccacttc ttcccgtttctggttcagta aggcgaagag ggttaacgttgtcgtttctt cccgtgcctt tgccagacgctggtggcggt ggcggtggcg gttctgtgaagtgcggtggc ttgcaggtca aggcaaacgctgagaatgat ttgtcgtcgt cgtcctcgtcccagttacct gactggagca tgcttctggcgaagcagtgg atgatgctgg attggaagcctgggattggg aagatcgtgc aggatgggctctatgagatt ggcgccgata aaaccgcgtcgactgcactt aatcatgtta agactgctgg

tacacaaaaa ttgtcgaaaa gctctttgaa 840

gctgacatga tgagaaagaa ggtttccatg 900

gacaatctct ttgagaacta ctcagccgtc 960

gactacgctg acatcctcga acacctcgtt 1020

ctgtctggcg agggacataa ggctcaagat 1080

aaactcgggg agagagctca gtcgctaagc 1140

attttcaaca aggaattgaa ggtt 1194

agtccttctt ccctgtttcc actttccagg 60

ctctccctct ccctcttctt cactcagtca 120

agctgcaact tcatcatttt tccctgttac 180

aaagttactc aaaataatcg ctggccctat 240

accttctact ttccgaatcc agaaaacacc 300

tctcaaaaca gagaacaaga agaagaagaa 360

agttgtttct gtgattgatt ctctgcaacc 420

atctctccca tttcttcttt tcttccgctc 480

attcataatg gttgcaacag ccgctacggc 540

tggaaaaggg aaacccaaga aactgggtgg 600

cctcggagga ctcaaacaga aacaaggttt 660

acaagcccct ccgaagaccg tggagaaggt 720

gatttcgcac gccccgagga ctttcatcaa 780

cgccatcacc accgtgttcc tggcggcgga 840

gcggcgcccc gacatgctca ttgacccctt 900

tgtgttcagg cagaacttcc ccattaggtc 960

tatcgagact ttaatgaatc atttgcagga 1020

gcttcttggt gatggatttg gttccacgcc 1080tgaaatgtgc aaaaagaacc tgatatgggtatatcccaca tggggtgatg ttgttcaagttggtatgtgt cgtgattggc ttgtgcgtgactccagtgtt tgggtcatga tgaataaagtagtcagggca gagataagct cttattttgtcagaaaacta accaaacttg atgaatccgcatggaatgat ctagatgtga atcagcatgtggagagtgct ccacagccac ttttggagagcaggagggag tgtggcagga acagtgtgcttgtaggaaac ttggcagatg gtggattttttggtgctgag attgtgaggg gtaggactcatggtcatgtt ttgagtcagg ttccagttccattggcatca ctggaggagg agtggcataaaatctacgta tcttaaaata tatataaaagggggaagtag aaagtaaaaa aaaaaaaaaaaatagctcct agcactactt tctcctacctctgctgcttg gtgtcatcaa tatttaattg<210> 43<211> 4634<212> DNA

<213> Glycine max<400> 43

ggaaacaagg aagcgaaatg acacaatagttctccttctc gtttgttgag cgcttttctcacgctaacaa atctgctatt caatcaattccaaactgcac ctccactctc cactcattcccaactcctca tataattcaa gacaaaatccctacaaggtt ctcgattctt cttttttctttaaaaataat aatgagagct ggatgcgtctctgattttcg ttacagattg cattgtttgctttttatttt taattttggg gatgttttcgggtttgcgat gttttcagat ctgcgctggc

ggtgactaag atgcaggttg tggttgataa 1140

agacacttgg gtatctgcat cagggaagaa 1200

cgcgaaatct ggtgaaatct tgacaagagc 1260

gacaagaaga ctgtctaaaa ttcccgaaga 1320

ggactctgct ccagttgtgc cagaggataa 1380

taatttcatt cgcactggtt taagtcccag 1440

taacaatgtg aagtatgttg ggtggattct 1500

ccatgagctg tgtgccatga cattggagta 1560

ggattccctc tctgatctct ctggtgctga 1620

tgagtgcaag cacttgcttc gacttgatga 1680

atggaggccc aaacctttaa gcagcaactt 1740

agcagaaagc acctgaatct tatcttattg 1800

attcatagag agctttgctt gtttttatca 1860

aaagtgtgtt actttggcta aaaaagggga 1920

aatctcgctc tcatgatttt gtaattaaaa 1980

gctccatttt ctgtttcact tatggttatg 2040

tttcatc 2077

ccttcttccc tgtttccact ttccaggttt 60

tccctctccc tcttcttcac tcagtcaggt 120

ctctttctct ctgatctacg tacgtgtccg 180

atctaatctt cccttttcgc ttcagagatc 240

cgcgttttct gcatttctag acgttctacc 300

tttttttaga ctattattat tttaaaaaaa 360

gttcgttgtg aatttcgagg caatggggtt 420

tttcctcctc tccgtttttt ctttgccttg 480

gtcttgcctt tgtttctgca tttttttttc 540

ttatacgacg aatttgttct tattcgtgac 600tttccgcttg attgacctgt tttacctctgattttagttg aagtagaatc tatacacactgggtggtttt taatcaggct ttttttgtggccgataaaag cttaattgga ttataggaagtgtttttcgt aggttaaact tgcaggtttagctgggggca taaaaaaaga gaattctatggagttgctat ttttttacta gtattaataatcccgtttct tttgccaaaa gtatttatgaaagtgctgtg ctgtaattat ttgttatttgagcgttttta gttagattga tttctcgatatcgtttgtgg ttgattgttt tttttttttttatttttttc attatcccct ttcgtgaaagattttgcatg cagctgccgt agaaattcattttccctgtt acttcaccct cgccggactccgctggccct atcacattat tgttaatattccagaaaaca ccacaacacc acccagaattgaagaagaag aaagagagag agtgaaaacgttctctgcaa ccgaatcatc atcagccacttttcttccgc tctggttcag taaggcgaagagccgctacg gcgtcgtttc ttcccgtgccgaaactgggt ggtggtggcg gtggcggtgggaaacaaggt ttgtgcggtg gcttgcaggtcgtggagaag gttgagaatg atttgtcgtcgactttcatc aaccagttac ctgactggagcctggcggcg gagaagcagt ggatgatgctcattgacccc tttgggattg ggaagatcgtccccattagg tcctatgaga ttggcgccgatcatttgcag gtcagctttt gcaaaaaattatataacttt taataaatta ttatagaagtatttagagaa taattgcata ggacaaaactcgtttttaaa tcaaaattaa aattttatctcaatttcgat caaagaacaa tgccaaaaac

gaatctcaca cgtgatcaaa taaggctgct 660

ttgtagcatt ctttttacga tcacttacac 720

gggtataaac atcttcctcc tcgattcttt 780

tgggaaacaa tgcgtgggag ctctttggtt 840

agttctgaat caggagttcc aaatatagag 900

gatctgttct gaaattggag ccactgtttc 960

gaacaagttt gctttttatt ttacattttt 1020

tcactctctt ctgtttgtga tattacttat 1080

gggtgaagta taatttttgg gtgaacttgg 1140

tcatttaagg tttaggttga ccccttccac 1200

atctcttatc atttacagtg cttctttgcc 1260

gtaggagaag aaaaacaatg acttgcgtaa 132 0

tatggtggca acagctgcaa cttcatcatt 1380

tggtggacat gcaaagttac tcaaaataat 1440

cttcccttct ttaccttcta ctttccgaat 1500

gttgggttcc attctcaaaa cagagaacaa 1560

ggaaaagcaa aaagttgttt ctgtgattga 1620

tcttcccgtt tcatctctcc catttcttct 1680

agggttaacg ttattcataa tggttgcaac 1740

tttgccagac gctggaaaag ggaaacccaa 1800

cggttctgtg aacctcggag gactcaaaca 1860

caaggcaaac gcacaagccc ctccgaagac 1920

gtcgtcctcg tcgatttcgc acgccccgag 1980

catgcttctg gccgccatca ccaccgtgtt 2040

ggattggaag ccgcggcgcc ccgacatgct 2100

gcaggatggg cttgtgttca ggcagaactt 2160

taaaaccgcg tctatcgaga ctttaatgaa 2220

gctgagaatt gcattcagca atcacgataa 2280

taagtaactt atcacgggtt gtcaacaaaa 2340

tacctacagt tcgtttgaca ttttttgtgt 2400

tggtaatttg cagattatta gatacaactc 2460

acctatggaa tctaagtttt gtgcaattgc 2520ttattgatga ttttatttta ttgcctaaataatcatgtta agactgctgg gcttcttagtaaaagaacct gatatgggtg gtgactaagaggtaagttgg tgtgactaag aagaaccttttgctcagctg tgaaatcttc ttttgccttatggttgaatt attttgtact tctgcatttgaaattggtat gatagttagg aacttgggattgaattattt ttaaaaatat tttcacttttagaataaaaa ataaaactac tgtaatgtgtctgataagca catgcttttt acataatgaaagactgggta tgagatatgg tagtaaattcttctgtctta ttattgtaaa atgttggatgtaccatgtgc ccttttctgc attttggtctaatctgttca tctgaagttg agtgaatctaagacacttgg gtatctgcat cagggaagaacgccaaatct ggtgaaatct tgacaagagcttttttctgt tgcctatagà catgttttgatggtgatttg gcactgcttt taatctcacgtactttctct taatacacca ctattgaaagttttgttgat gataattttt taatctaccataagtaccag ccttcaactt gtgtacatgttttctgattg gttgagtttg attttgatttataaagtgac aagaagactg tctaaaattcattttgtgga ttctgctcca gttgtgccagattcagctaa tttcattcgc actggtttaaagcatgttaa caatgtgaag tatgttgggttggagagcca tgagctgtgt gccatgacatgtgtgctgga ttccctctct gatctctctggattttttga gtgcaagcac ttgcttcgacggactcaatg gaggcccaaa cctttaagcacagttccagc agaaagcacc tgaatcttatggcataaatt catagagagc tttgcttgtt

tgtctgtttt ccaaacagga gactgcactt 2580

gatggatttg gttccacgct gaaatgtgca 2640

tgcaggttgt ggttgataaa tatcccacat 2700

ttgatgtgtg aagaattgca aaggcgtcca 2760

ctcatcttta ctttgacttt atatagtatc 2820

tttctgtcac ttgtgctttt ttgtttcaca 2880

taaaggcatg tttggaatat attgtgattg 2940

caaaatctat ctcatgaatc tgtaaaaata 3000

ataaaaaatt cttcttggat ggtaattgat 3060

ttatatgaag tcctttgcct taagtctgtt 3120

tttttacatt ccgtacattt ttttgcatat 3180

catatacagg ttttcaaaag aagcaactta 3240

gttcgagaat aatctcttta gtaaattctg 3300

tatttgcttc aggggtgatg ttgttcaagt 3360

tggtatgtgt cgtgattggc ttgtgcgtga 3420

ctccaggtag atatcagttt caggaatcct 3480

agagtttttc tgaatctgaa tgtttctctc 3540

aggctgtgtg aagttatcta ttatcatatt 3600

gcaattcatt acagatttaa gcatacaaaa 3660

acagtatcta atatcttctt aatttgttat 3720

tgcaccttgg tgctacgaac ttataagcat 3780

tgatgttatg cagtgtttgg gtcatgatga 3840

ccgaagaagt cagggcagag ataagctctt 3900

aggataacag aaaactaacc aaacttgatg 3 960

gtcccagatg gaatgatcta gatgtgaatc 4020

ggattctgga gagtgctcca cagccacttt 4080

tggagtacag gagggagtgt ggcaggaaca 4140

gtgctgatgt aggaaacttg gcagatggtg 4200

ttgatgatgg tgctgagatt gtgaggggta 4260

gcaactttgg tcatgttttg agtcaggttc 4320

cttattgatt ggcatcactg gaggaggagt 4380

tttatcaaat ctacgtatct taaaatatat 4440ataaaagaaa gtgtgttact ttggctaaaa aaggggaggg gaagtagaaa gtaaaaaaaa 4500

aaaaaaaaat ctcgctctca tgattttgta attaaaaaat agctcctagc actactttct 4560

cctacctgct ccattttctg tttcacttat ggttatgctg ctgcttggtg tcatcaatat 4620

ttaattgttt catc 4634<210> 44<211> 1215<212> DNA<213> Glycine max<400> 44

gtacgctaac aaatctgcta ttcaatcaat tcctctttct ctctgatcta cgtacgtgtc 60

cgcaaactgc acctccactc tccactcatt ccatctaatc ttcccttttc gcttcagaga 120

tccaactcct catataattc aagacaaaat cccgcgtttt ctgcatttct agacgttcta 180

ccctacaagg ttctcgattc ttcttttttc ttttttttta gactattatt attttaaaaa 240

aataaaaata ataatgagag ctggatgcgt ctgttcgttg tgaatttcga ggcaatgggg 300

ttctgatttt cgttacagat tgcattgttt gctttcctcc tctccgtttt ttctttgcct 360

tgtttttatt tttaattttg gggatgtttt cggtcttgcc tttgtttctg catttttttt 420

tcggtttgcg atgttttcag atctgcgctg gcttatacga cgaatttgtt cttattcgtg 480

actttccgct tgattgacct gttttacctc tggaatctca cacgtgatca aataaggctg 540

ctattttagt tgaagtagaa tctatacaca ctttgtagca ttctttttac gatcacttac 600

acgggtggtt tttaatcagg ctttttttgt gggggtataa acatcttcct cctcgattct 660

ttccgataaa agcttaattg gattatagga agtgggaaac aatgcgtggg agctctttgg 720

tttgtttttc gtaggttaaa cttgcaggtt taagttctga atcaggagtt ccaaatatag 780

aggctggggg cataaaaaaa gagaattcta tggatctgtt ctgaaattgg agccactgtt 840

tcgagttgct atttttttac tagtattaat aagaacaagt ttgcttttta ttttacattt 900

tttcccgttt cttttgccaa aagtatttat gatcactctc ttctgtttgt gatattactt 960

ataagtgctg tgctgtaatt atttgttatt tggggtgaag tataattttt gggtgaactt 1020

ggagcgtttt tagttagatt gatttctcga tatcatttaa ggtttaggtt gaccccttcc 1080

actcgtttgt ggttgattgt tttttttttt ttatctctta tcatttacag tgcttctttg 1140

cctatttttt tcattatccc ctttcgtgaa aggtaggaga agaaaaacaa tgacttgcgt 1200

aaattttgca tgcag 1215<210> 45<211> 338<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 45

gtcagctttt gcaaaaaatt gctgagaatt gcattcagca atcacgataa atataacttt 60

taataaatta ttatagaagt taagtaactt atcacgggtt gtcaacaaaa atttagagaa 120

taattgcata ggacaaaact tacctacagt tcgtttgaca ttttttgtgt cgtttttaaa 180

tcaaaattaa aattttatct tggtaatttg cagattatta gatacaactc caatttcgat 240

caaagaacaa tgccaaaaac acctatggaa tctaagtttt gtgcaattgc ttattgatga 300

ttttatttta ttgcctaaat tgtctgtttt ccaaacag 338

<210> 46

<211> 641<212> DNA<213> Glycine max<400> 46

gtaagttggt gtgactaaga agaacctttt tgatgtgtga agaattgcaa aggcgtccat 60gctcagctgt gaaatcttct tttgccttac tcatctttac tttgacttta tatagtatct 120ggttgaatta ttttgtactt ctgcatttgt ttctgtcact tgtgcttttt tgtttcacaa 180aattggtatg atagttagga acttgggatt aaaggcatgt ttggaatata ttgtgattgt 240gaattatttt taaaaatatt ttcacttttc aaaatctatc tcatgaatct gtaaaaataa 300gaataaaaaa taaaactact gtaatgtgta taaaaaattc ttcttggatg gtaattgatc 360tgataagcac atgcttttta cataatgaat tatatgaagt cctttgcctt aagtctgtta 420gactgggtat gagatatggt agtaaattct ttttacattc cgtacatttt tttgcatatt 480tctgtcttat tattgtaaaa tgttggatgc atatacaggt tttcaaaaga agcaacttat 540accatgtgcc cttttctgca ttttggtctg ttcgagaata atctctttag taaattctga 600atctgttcat ctgaagttga gtgaatctat atttgcttca g 641

<210> 47<211> 367<212> DNA<213> Glycine max<400> 47

gtagatatca gtttcaggaa tccttttttt ctgttgccta tagacatgtt ttgaagagtt 60

tttctgaatc tgaatgtttc tctctggtga tttggcactg cttttaatct cacgaggctg 120tgtgaagtta tctattatca tatttacttt ctcttaatac accactattg aaaggcaatt 180cattacagat ttaagcatac aaaattttgt tgatgataat tttttaatct accaacagta 240tctaatatct tcttaatttg ttattaagta ccagccttca acttgtgtac atgttgcacc 300ttggtgctac gaacttataa gcattttctg attggttgag tttgattttg attttgatgt 360tatgcag 367

<210> 48<211> 18<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR<400> 48

ctgtttccac tttccagg 18

<210> 49

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 49

cttctcgttt gttgagc 17

<210> 50

<211> 16

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 50

cagctgcaac ttcatc 16

<210> 51<211> 16<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 51cttccccatt aggtcc

<210> 52

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 52

cacttaatca tgttaaga

<210> 53

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 53

gtcgtgattg gcttgtg

<210> 54

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 54

ctctgctcca gttgtgc

<210> 55

<211> 18

<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 55

gcgagggtga agtaacag

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 56

gcacaaacct tgtttctg

<210> 57

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 57

caagaagccc agcagtc

<210> 58

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 58

gatttcacca gatttcg

<210> 59

<211> 17

<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 59

gtgcgaatga aattagc 17

<210> 60

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 60

ctttctgctg gaactgg 17

<210> 61

<211> 2683

<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<223> FAD3-1B gene

<400> 61

gttcaagcac agcctctaca acatgttggt aatggtgcag ggaaagaaga tcaagcttat 60

tttgatccaa gtgctccacc acccttcaag attgcaaata tcagagcagc aattccaaaa 120

cattgctggg agaagaacac attgagatct ctgagttatg ttctgaggga tgtgttggta 180

gtgactgcat yggtagctgc agcaatcggc ttcaatagct ggttcttctg gccactctat 240

yggcctgcac aaggcacaat gttttgggca ctttttgttc ttggacatga ttggtaacta 300

attattatta caaattgtta tgttatgtta tgttatgttg ttgtgccttt ttctcagtga 360

tgctttagtc atttcatttc acttggttat gcatgattgt tcgttcatat gttctgtcat 420

ggtgagttct aatttgattg atgcatggaa cagtggtcat ggaagttttt caaacagtcc 480

tttgttgaac agcattgtgg gccacatctt gcactcttca attcttgtac cataccatgg 540

atggtcggtt ccttttagca acttttcatg ttcactttgt ccttaaattt ttttttatgt 600

ttgttaaaaa atctttggtc tgatttaaca acctaaccat ttttacaacw catggatttw 660

ttgcaggaga attagccaca ggactcacca tcagaaccat ggccatgttg agaaggatga 720atcatgggtt ccggtattac tatgagtttgcttaatttta atcagtggtt agatttggttgagagatgtg aatttcatga agtggttcatttacagagaa agtttacaag aatctagacactttccccat ctttgcatac cccttttattcattatttta ctatatagta cctcaatttttgaaaggaaa ggactttatt gggtctagcatatttcagtg gagcagaagc cctggaaaagtgttctctcc tggtgagaga agagatgtgctttctgtgct tctctatctt tccctcacaagggttcccta tttggtaatc tcactctcacgttatttgca acctacaccg aagtaatgccgtccaatatt ttgttcactt atttgaacttgatttcgtca cgtacttgca tcatcatggtcaggtatccc atttaacaca atttgtttcaatagttttcg aaattaagca aataccaagctaaagtcaaa ttcatgacca aattgtcctccacctacttt atagcccaat ttgtcatttggtaaatatat tatttatgaa ttatggtagttgccatcctt caaaagaaga tagaaacttaacaggaatgg agttatctaa ggggtggtctcaacaacatt caccatgaca ttggcacccaacattatcat ttaatcgaag cggtattaattgcctatgtg atctaagtca attttcacatttctaaattg aaaaagtgga ttatatgtcagatgatctcc caccttacat ataataatttggtcctgaat tgttcctttc ttttttcattctaaagcagc aaaggcagtg ctaggaaagttgccacttca tctaataaag tacttgctccactctggcga cattgtgtac taccagactgagtccaacta aagtttttga tgctacattttgtaatatgt aatttagaat atgttaccta

cttgattaat ttccacattt tttctttctt 780

gtgttccaat agaagaaaag ggggtatcta 840

gattatgtgt ctttatgcct ttatgtcagc 900

acatgacaag aatgatgaga ttcactcttc 960

tggtgagacc ctctttttcc agaatgacag 1020

tatatttcta aaattttgaa ttcttgaaat 1080

tctcactctc tctttgtgat atgaaccata 1140

aaggctctca tttcaaccct tacagcaact 1200

taacttcaac tctgtgttgg ggcatcatgc 1260

tgggtccact ttttatgctc aagctctatg 1320

actttcttta tacatcgcac accagtgtgg 1380

ctataattaa tgaggttaac acatgtccaa 1440

gaacatgtgt agatcttcgt catgtggctg 1500

tacaagcaga aactgccttg gtaccgtggc 1560

ttaacatttt aagagaattt ttttttcaaa 1620

aaattgttag atctacgctt gtacttgttt 1680

acaagtccaa accgtccact attttatttt 1740

gttacttcag aaaagagaac cccatttgta 1800

ttcaacataa aacatattta tgtgcagttt 1860

ctccatgtta ctctgtctat atgtaatttc 1920

tacaacagta gatcgcgact atggttggat 1980

tgttatccat caccttttcc ctcaaattcc 2040

tctctatttc acaagaaatt attgtatgtc 2100

aacacatgat caaactttct taattctttc 2160

attgaaaatt ggtcaagacc acaaacatgt 2220

ctcctattct acaatcaata atccttctat 2280

ttcttattct ttttgttgtc ccacaataga 2340

attatcgtga gcctcagaaa tctgggccat 2400

acagcataag tcaggatcac ttcgttagcg 2460

attcccagct ccacaaagat tcttggaccc 2520

acctatttca ctcttaaata ctatttccta 2580

ctcaaatcaa ttaggtgaca tgtataagct 2640ttcataaatt atgctagaaa tgcacttact ttacaaagca tgc 2683<210> 62<211> 4160<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> gene de FAD3-1C<400> 62

aaagatttca ttcttcctct tctaggttat tacgcaccac ccaccacgta tccctgaaag 60

agagaaaaac acactaagcc aaagccaaag cagcaatggt taaagacaca aagcctttag 120

cctatgctgc taataatgga taccaaaagg aagcttttga tcccagtgct cctccaccgt 180

ttaagattgc agaaatcaga gttgcaatac caaaacattg ctgggtcaag aatccatgga 240

gatccctcag ttatgttctc agggatgtgc ttgtaattgc tgcattgatg gctgctgcaa 300

gtcacttcaa caactggctt ctctggctaa tctattggcc cattcaagga acaatgttct 360

gggctctgtt tgttcttgga catgattggt aattaattat ttgttgttac ttttttgtta 420

taatatgaat ctcacacact gctttgttat gcctacctca tttcatttgg ctttagacaa 480

cttaaatttg agatctttat tatgtttttt gcttatatgg taaagtgatt cattcttcac 540

attgaattga acagtggcca tggaagcttt tcagacagcc cttttctaaa tagcctggtg 600

ggacacatct tgcattcctc aattcttgtg ccataccatg gatggttagt tcatcccggc 660

ttttttgttt gtcattggaa gttcttttat tgattcaatt tttatagcgt gttcggaaac 72 0

gcgtttcaga aaataatgaa atacatcttg aatctgaaag ttataacttt tagcttcatt 780

gtcattgaaa gttcttttat taattatatt tttattgcgt gtttggaatc ccatttgaga 840

aataagaaat cacgtttaaa atgtgaaagt tataactatt aacttttgac taaacttgaa 900

aaaatcacat ttttgatgtg gaaccaaatc tgatttgaga accaagttga ttttgatgga 960

ttttgcagga gaattagcca cagaactcac catcaaaatc atggacacat tgagaaggat 1020

gaatcctggg ttccagtatg tgattaacta cttcctctat agttattttt gattcaatta 1080

aatttattta tttaataagt tcaagaaaaa aggaatcttt atacttcatg ataaagctgt 1140

tcttgaacat ttttttttgt cattatctta gttaaccgag aagatttaca agaatctaga 1200

caacatgaca agacttgtta gattcactgt gccatttcca ttgtttgtgt atccaattta 1260

tttggkgagk gctttttttt ttttacttgg aagactacaa cacattatta ttattataat 1320

atggttcaaa tcaatgactt ttaatttctt tgtgatgtgc actccatttt cagttctcaa 1380

gaagccccgg aaaggaaggt tctcacttca atccctacag caatctgttc ccacccagtg 1440agagaaaggg aatagcaata tcaacactgt gttgggttac catgttttct atgcttatct 1500atctctcctt cataactagt ccagttctat tgctcaagct ctatggaatt ccatattggg 1560taattaaatt actcttacat tactttttcc tctttttttt tatgggtctt aactagtatc 1620acaaaaatat tggttaaaaa attttaaaaa aatatttatt atgtaaatca taaaagaaca 1680taaaaaaaat gatgaataac ataattttcg tctcttatta aaaatatttt tattttaaat 1740ttcttaatca atatatttaa aatctggtta acattttttg aatatttcaa ttctccaatt 1800aaaaatttga aatagtcacc attaattatg taattgtttg aacacgtgca gatatttgtt 1860atgtggctgg actttgtcac atacttgcat caccatggtc atcatcagaa actgccttgg 1920tatcgcggca aggtaacaaa aataaataga aaatagtgag tgaacactta aatgttagat 1980actaccttct tcttcttctt tttttttttt ttgaggttaa tgctagataa tagctagaaa 2040gagaaagaaa gacaaatata ggtaaaaata aataatataa cctgggaaga agaaaacata 2100aaaaaagaaa taatagagtc tacgtaatgt ttggattttt gagtgaaatg gtgttcacct 2160accattactc aaagattctg ttgtctacgt agtgtttgga ctttggagtg aaatggtgtt 2220cacctaccat tactcagatt ctgttgtgtc ccttagttac tgtcttatat tcttagggta 2280tattctttat tttacatcct tttcacatct tacttkaaaa gatttttaat tattcattga 2340aatattaacg tgacagttaa attaaaataa taaaaaattc gttaaaactt caaataaata 2400agagtgaaag gatcatcatt tttcttcttt cttttattgc gttattaatc atgcttctct 2460tctttttttt cttcgctttc cacccatatc aaattcatgt gaagtatgag aaaatcacga 2520ttcaatggaa agctacagga actttttttg ttttgttttt ataatcggaa ttaatttata 2580ctccattttt tcacaataaa tgttacttag tgccttaaag ataatatttg aaaaattaaa 2640aaaattatta atacactgta ctactatata atatttgaca tatatttaac atgattttct 2700attgaaaatt tgtatttatt attttttaat caaaacccat aaggcattaa tttacaagac 2760ccatttttca tttatagctt tacctgtgat catttatagc tttaagggac ttagatgtta 2820caatcttaat tacaagtaaa tatttatgaa aaacatgtgt cttacccctt aaccttacct 2880caacaaagaa agtgtgataa gtggcaacac acgtgttgct tttttggccc agcaataaca 2940cgtgtttttg tggtgtacaa aaatggacag gaatggagtt atttaagagg tggtctcaca 3000actgtggatc gtgactatgg ttggatcaat aacattcacc atgacattgg cacccatgtt 3060attcaccatc ttttccctca aattcctcat tatcacctcg ttgaagcggt atattttact 3120attattactc acctaaaaag aatgcaatta gtacatttgt tttatctctt ggaagttagt 3180cattttcagt tgcatgattg taatgttctc tctattttta aaccatgttt tcacacctac 3240ttcgtttaaa ataagaatgt ggatactatt ctaatttcta ttaacttctt ttaaaaaata 3300atgtaaaact agtattaaaa aagaggaaat agattacact ctactaatac taatagtata 3360aaaaaaatta cattgttatt ttatcacaaa taattatata taattaattt ttacaatcat 3420

tatcttaaaa gtcatgtatg atatacagtt tttacatgct ttggtactta ttgtaaagtt 3480

agtgatttat tcattattta tgttatataa ttggcataaa tatcatgtaa ccagctcact 3 540

atactataat gggaacttgg tggtgaaagg ggtttacaac cctcttttct aggtgtaggt 3600

gctttgatac ttctggtccc tttttatatc aatataaatt atattttgct gataaaaaaa 3660

acattattaa tatataatca ttaacttctt taaaaaccgt acctaaaact ttatattatt 3720

aaaaagaaga ttgagatcag caaaagaaaa aaaaattaac agtcatttga attcactgca 3780

gacacaagca gcaaaatcag ttcttggaga gtattaccgt gagccagaaa gatctgcaca 3840

ttaccatttc atctaataaa gtatttaatt cagagtatga gacaagacca cttcgtaagt 3900

gacactggag atgtggttta ttatcagact gattctctgc accttcactc gcaccgagac 3960

tgagtttcaa tttttgggtt atttattgga ttctagctac tcaaattact ttttttttaa 4020

tgttacgttt ttggagtttt aacgttttct gaacaacttg caaattacat gcatagagag 4080

acaggaattc atagtgggcc tcaatggaat atttatttga aattagtaag gtggtaatta 4140

ataaatattg aattgtcagt 4160

<210> 63

<211> 994<212> DNA<213> Glycine max<220>

<223> promotor de FAD3-1C<400> 63

tgctacgaag caatttgcat gctaggaagc aaagtaaaat tctcaaactg tataacttat 60

tttctcttgt tgtatataaa actagtcatt tttcattaaa aagcattgta taatagttta 120

atgggtcatt gaaattatta taattaatgt cattctattt ttaatactcc ttttgtttga 180

taatgattat cgtttcatgt tattttctat acatatcaag acaaattaat aaatggataa 240

aaaagtatca attttataaa attaatatta ttattattaa tttatttata attttttgtt 300

atcatttata ttataagtaa tatattattg gcaaaaataa tttttgatca attatattta 360

cctgtcggtc gaactctaga ttatgctggg tatcttctcc aaatgaatcc aaagattaaa 42 0

ataaaataaa attataagta atataaataa aaaacaatta atactagatt aacaagacta 480

aaataataat tattttataa tttattttct tcaataattg tagaatacaa ggagtaatat 540

ttaatgttgt ttaattcttg tttcaataat tgagatgttt tgaacaaatt aaataattat 600

tgtaaataga ataacattaa ttacaataat aaaatcattt taacgatcca ttaaacttaa 660atgataaaat tcaactaact aatttggagt aattaagaaa aatagttaat ttagacaaca 720

atattaaatt tttgctaaat tatatgtttt tctcaaaatt acctataaca ttaataagac 780

atacttttat ttttcaaaga tttctactta attaaccgcc acaaattcat cctcgctggt 840

ttgtcctaca ccgtatgttt tttgacgtca gctaggcaaa ccaacataaa taggaagcag 900

tagaagtaaa agtagaatgt ggtagtgtta ttattattta ctactgtttc accttggtgt 960

tatataaatg cactacccca taattgaatt tttc 994

Claims

1. Método de produzir uma planta de soja compreendendo umteor de ácido linolênico menor do que cerca de 6% de ácidos graxos desemente totais em peso e um teor de ácido oléico de cerca de 55% a cercade 80% de ácidos graxos de semente totais em peso, compreendendo asetapas de:a) criar uma ou mais plantas de soja que compreendem umtransgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 de soja endógena epelo menos uma mutação de perda-de-função em um gene FAD3 de sojaendógena;b) obter pelo menos uma semente da referida planta de sojaobtida na etapa (a);c) determinar uma percentagem do teor de ácido graxo desemente total em peso de ácido linolênico e ácido oléico para a referidasemente de etapa (b); e,d) identificar uma planta de soja que produz semente tendo umacomposição de ácido graxo de semente compreendendo um teor de ácidolinolênico menor do que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totais empeso e um teor de ácido oléico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidosgraxos de semente totais em peso.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as referidasplantas de soja que são criadas na etapa (a) compreendem pelo menosduas perdas de mutações de função em pelo menos dois genes FAD3 desoja endógena.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que os referidosgenes de FAD3 de soja endógena são FAD3-1 B e FAD3-1 C.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a referidaplanta de soja identificada na etapa 3 compreende um teor de ácidolinolênico menor do que cerca de 3% de ácidos graxos de semente totais empeso e um teor de ácido oléico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidosgraxos de semente totais em peso.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referidaplanta de soja é criada na etapa (a) por:i) cruzamento de uma primeira linhagem origem de sojacompreendendo o referido transgene, com uma segunda linhagem origemde soja compreendendo pelo menos uma mutação de perda-de-função emum gene FAD3 de soja endógena para obter uma planta de soja F1 que sejaheterozigoto para o referido transgene e heterozigoto para pelo menos umamutação de perda-de-função em um gene de FAD3; eii) fertilização cruzada contínua de plantas de progênie F1 de (i)para obter uma planta de soja F2 que é homozigoto para o referidotransgene e homozigota para pelo menos uma mutação de perda-de-funçãoem um gene de FAD3, desse modo obtendo uma planta de sojacompreendendo tanto um transgene que diminui a expressão de um geneFAD2-1 de soja endógena e pelo menos uma mutação de perda-de-funçãoem um gene FAD3 de soja endógena.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a referidasegunda linhagem origem de soja compreende pelo menos duas mutaçõesde perda de função em pelo menos dois genes FAD3 de soja endógena.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que os referidosgenes de FAD3 de soja endógenas são FAD3-1B e FAD3-1C.

8. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a referidaplanta de soja F1 que seja heterozigoto para o referido transgene e parapelo menos uma mutação de perda-de-função em um gene de FAD3 éobtida na etapa (i) submetendo uma pluralidade de plantas F1 a pelo menosuma técnica de análise de DNA permitindo a identificação de uma planta F1que seja heterozigoto para o referido transgene e para pelo menos umamutação de perda-de-função em um gene de FAD3.

9. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a referidaplanta de soja F2 que é homozigota para o referido transgene e homozigotopara pelo menos uma mutação de perda-de-função em um gene de FAD3 éobtida na etapa (ii) submetendo uma pluralidade de plantas F2 a pelo menosuma técnica de análise de DNA permitindo identificação de uma planta F2que é homozigoto para o referido transgene e homozigoto para pelo menosuma mutação de perda-de-função em um gene de FAD3.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a referidatécnica de análise de DNA compreende uma ou mais técnicas selecionadasdo grupo consistindo em análise de PCR1 análise quantitativa de PCR,análise de SNP1 análise de AFLP, análise de RFLP e análise de RAPD.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referidatécnica de análise de DNA compreende uma ou mais técnicas selecionadasdo grupo consistindo em análise de PCR, análise quantitativa de PCR,análise de SNP, análise de AFLP, análise de RFLP e análise de RAPD.

12. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a referidatécnica de análise de DNA compreende a detecção de pelo menos um únicopolimorfismo de nucleotídeo em uma posição na seqüência de gene deFAD3-1 C correspondendo ao nucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292,- 3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62, detecção de uma deleção no gene FAD3-1C de SEQ ID NO:62, ou detecção de pelo menos um único polimorfismo denucleotídeo em uma seqüência promotora de FAD3-1 C de sojacorrespondendo a uma guanina no nucleotídeo 334, uma citosina nonucleotídeo 364, uma timina no nucleotídeo 385, uma adenina nonucleotídeo 387, uma citosina no nucleotídeo 393, uma guanina nonucleotídeo 729 e uma citosina no nucleotídeo 747 de SEQ ID NO:63.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referidatécnica de análise de DNA compreende a detecção de pelo menos um únicopolimorfismo de nucleotídeo em uma posição na seqüência de gene deFAD3-1 C correspondendo ao nucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292,- 3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62, detecção de uma deleção no gene FAD3-1C de SEQ ID NO:62, ou detecção de pelo menos um único polimorfismo denucleotídeo em uma seqüência promotora de FAD3-1C de sojacorrespondendo a uma guanina no nucleotídeo 334, uma citosina nonucleotídeo 364, uma timina no nucleotídeo 385, uma adenina nonucleotídeo 387, uma citosina no nucleotídeo 393, uma guanina nonucleotídeo 729 e uma citosina no nucleotídeo 747 de SEQ ID NO:63.

14. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a referidatécnica de análise de DNA compreende a detecção de um únicopolimorfismo de nucleotídeo no referido gene de FAD3-1B de sojacompreendendo uma substituição de um resíduo de timina para um resíduode citosina em uma posição na seqüência de gene de FAD3-1Bcorrespondendo ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61.

15. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referidatécnica de análise de DNA compreende a detecção de mutação no referidogene de FAD3-1 B de soja compreendendo uma substituição de um resíduode timina para um resíduo de citosina em uma posição na seqüência degene de FAD3-1B correspondendo ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referidotransgene também compreende um transgene que confere tolerância aoherbicida.

17. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o referidotransgene também compreende um transgene que confere tolerância aoherbicida e em que a referida planta de soja F1 que seja heterozigoto para oreferido transgene é obtida na etapa (i) submetendo uma pluralidade deplantas F1 à seleção de herbicida para o referido transgene.

18. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o referidotransgene também compreende um transgene que confere tolerância aoherbicida e em que uma pluralidade de plantas F2 enriquecidas para plantasde soja F2 que são homozigotos para o referido transgene é obtida na etapa(ii) submetendo a referida pluralidade de plantas F2 à seleção de herbicidapara o referido transgene.

19. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o referidoherbicida é glifosato.

20. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o referidotransgene compreende seqüências localizadas entre as seqüênciaslimítrofes de T-DNA de pMON68504, pCGN5469, pCGN5471, ou pCGN5485que são integradas em um cromossoma da referida planta.

21. Método de acordo com a reivindicação 1, a referida planta desoja é criada na etapa (a) por:a) transformação de uma planta de soja ou célula de planta desoja compreendendo pelo menos uma mutação de perda-de-função em umgene FAD3 de soja endógena com um transgene que diminui a expressãode gene FAD2-1 de soja endógena para obter uma planta de soja RO compelo menos uma mutação de perda-de-função em um gene de FAD3 queseja heterozigoto para o referido transgene;b) fertilização cruzada contínua da referida planta de progênieR0 de (i) para obter uma planta de soja R1 que é homozigoto para o referidotransgene e homozigoto para pelo menos uma mutação de perda-de-funçãoem um gene de FAD3, desse modo obtendo uma planta de sojacompreendendo o transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1de soja endógena e pelo menos uma mutação de perda-de-função em umgene FAD3 de soja endógena.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o referidotransgene também compreende seqüências que conferem umacaracterística de tolerância ao herbicida.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o referidoherbicida é glifosato.

24. Método de acordo com a reivindicação 5, tambémcompreendendo a etapa iii) fertilização cruzada contínua da referidaprogênie F2 que é homozigoto para o referido transgene e homozigoto parapelo menos uma mutação de perda-de-função em um gene de FAD3 de (ii)para obter uma planta de soja F3.

25. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referidapercentagem do teor de ácido graxo de semente total em peso de ácidolinolênico e ácido oléico é determinada na etapa (c) por uma técnica deanálise de lipídeo.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a referidatécnica de análise de lipídeo compreende uma ou mais técnicasselecionadas do grupo consistindo em detecção de cromatografia degás/ionização de chama, cromatografia de gás/espectroscopia de massa,detecção de cromatografia de camada fina/ionização de chama,cromatografia líquida/espectrometria de massa, cromatografialíquida/ionização por eletrovaporização - espectrometria de massa ecromatografia líquida/ionização por eletrovaporização - espectroscopiaaleatória de massa.

27. Planta de soja produzida por um método como definido nareivindicação 1.

28. Parte da planta da planta de soja como definida nareivindicação 27.

29. Parte de planta de acordo com a reivindicação 28, em que areferida parte da planta é pólen, um óvulo, um meristema, uma folha, umcaule, uma raiz, ou uma célula.

30. Planta de soja de progênie da planta de soja como definidana reivindicação 27.

31. Semente da planta de soja produzida por um método comodefinido na reivindicação í, a referida semente tendo uma composição deácido graxo compreendendo um teor de ácido linolênico menor do que cercade 6% de ácidos graxos de semente totais em peso e um teor de ácidooléico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totaisem peso.

32. Semente da planta de soja produzida por um método comodefinido na reivindicação 4, a referida semente tendo uma composição deácido graxo compreendendo um teor de ácido linolênico menor do que cercade 3% de ácidos graxos de semente totais em peso e um teor de ácidooléico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totaisem peso.

33. Método de obter uma planta de soja com uma composiçãode ácido graxo de óleo de semente alterada compreendendo as etapas de :a) cruzamento de uma primeira linhagem origem de soja tendouma composição de ácido graxo de óleo de semente compreendendo umteor de ácido linolênico menor do que cerca de 3% do total de ácidos graxosem peso com uma segunda linhagem origem de soja tendo uma composiçãode ácido graxo de óleo de semente onde o teor de pelo menos um ácidograxo exceto ácido linoléico é alterado em pelo menos 50% quandocomparado ao correspondente teor de ácido graxo de um óleo de soja deutilidade, a referida segunda linhagem origem de soja compreendendo umtransgene que altera o teor de pelo menos um ácido graxo exceto ácidolinoléico; eb) obtenção de uma planta de progênie exibindo umacomposição de ácido graxo de óleo de semente compreendendo um teor deácido linolênico menor do que 3% do total de ácidos graxos em peso e umteor de pelo menos um ácido graxo exceto ácido linoléico que é alterado empelo menos 50% quando comparado ao correspondente teor de ácido graxode um óleo de soja de utilidade, desse modo obtendo uma planta de sojacom uma composição de ácido graxo de óleo de semente alterada.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o referidoácido graxo exceto ácido linolênico é selecionado do grupo consistindo emácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácidoestearidônico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido y-linoléico, ácidoeicosapentaenóico e ácido docosaexaenóico.

35. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o referidoácido graxo exceto ácido linolênico é selecionado do grupo consistindo emácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácidoestearidônico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido y-linoléico, ácidoeicosapentaenóico e ácido docosaexaenóico.

36. Método de produzir uma planta de soja compreendendo umteor de ácido linolênico menor do que cerca de 6% de ácidos graxos desemente totais em peso, um teor de ácido graxo saturado menor do quecerca de 8% em peso e um teor de ácido oléico de cerca de 55% a cerca de- 80% de ácidos graxos de semente totais em peso, compreendendo asetapas de :a) criar uma ou mais plantas de soja que compreendam pelomenos um transgene que diminui a expressão tanto de um gene FAD2-1 desoja endógeno, quanto um FATB endógeno, e pelo menos uma mutação deperda-de-função em um gene FAD3 de soja endógena;b) obter pelo menos uma semente da referida planta de sojaobtida na etapa (a);c) determinar uma percentagem do teor de ácido graxo desemente total em peso de ácido linolênico, ácidos graxos saturados e ácidooléico para a referida semente de etapa (b); e,d) identificar uma planta de soja que produz semente tendo umacomposição de ácido graxo de semente compreendendo um teor de ácidolinolênico menor do que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totais empeso, um teor de ácido graxo saturado menor do que cerca de 8% em peso,e um teor de ácido oléico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxosde semente totais em peso.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que asreferidas plantas de soja que são criadas na etapa (a) compreendem pelomenos duas perdas de mutações de função em pelo menos dois genesFAD3 de soja endógena.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que osreferidos genes de FAD3 de soja endógenas são FAD3-1B e FAD3-1C.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, em que a referidaplanta de soja identificada na etapa 3 compreende um teor de ácidolinolênico menor do que cerca de 3% de ácidos graxos de semente totais empeso, um teor de ácido graxo saturado menor do que cerca de 8% em pesoe um teor de ácido oléico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxosde semente totais em peso.

40. Método de acordo com a reivindicação 36, em que a referidaplanta de soja é criada na etapa (a) por:i) cruzamento de uma primeira linhagem origem de sojacompreendendo o referido transgene, com uma segunda linhagem origemde soja compreendendo pelo menos uma mutação de perda-de-função emum gene FAD3 de soja endógena para obter uma planta de soja F1 que sejaheterozigoto para o referido transgene e heterozigoto para pelo menos umamutação de perda-de-função em um gene de FAD3; eii) fertilização cruzada contínua de plantas de progênie F1 de (i)para obter uma planta de soja F2 que é homozigoto para o referidotransgene e homozigoto para pelo menos uma mutação de perda-de-funçãoem um gene de FAD3, desse modo obtendo uma planta de sojacompreendendo pelo menos um transgene que diminui a expressão tanto deum gene FAD2-1 de soja endógena, quanto um FATB endógeno e pelomenos uma mutação de perda-de-função em um gene FAD3 de sojaendógena.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, em que a referidaplanta de soja F1 que seja heterozigoto para o referido transgene e parapelo menos uma mutação de perda-de-função em um gene de FAD3 éobtida na etapa (i) submetendo uma pluralidade de plantas F1 a pelo menosuma técnica de análise de DNA permitindo identificação de uma planta F1que seja heterozigota para o referido transgene e para pelo menos umamutação de perda-de-função em um gene de FAD3.

42. Método de acordo com a reivindicação 40, em que a referidaplanta de soja F2 que é homozigoto para o referido transgene e homozigotopara pelo menos uma mutação de perda-de-função em um gene de FAD3 éobtida na etapa (ii) submetendo uma pluralidade de plantas F2 a pelo menosuma técnica de análise de DNA permitindo identificação de uma planta F2que é homozigoto para o referido transgene e homozigoto para pelo menosuma mutação de perda-de-função em um gene de FAD3.

43. Método de acordo com a reivindicação 41, em que a referidatécnica de análise de DNA compreende a detecção de pelo menos um únicopolimorfismo de nucleotídeo em uma posição na seqüência de gene deFAD3-1 C correspondendo ao nucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292,- 3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62, detecção de uma deleção no gene FAD3-1C de SEQ ID NO:62, ou detecção de pelo menos um único polimorfismo denucleotídeo em uma seqüência promotora de FAD3-1C de sojacorrespondendo a uma guanina no nucleotídeo 334, uma citosina nonucleotídeo 364, uma timina no nucleotídeo 385, uma adenina nonucleotídeo 387, uma citosina no nucleotídeo 393, uma guanina nonucleotídeo 729 e uma citosina no nucleotídeo 747 de SEQ ID NO:63.

44. Método de acordo com a reivindicação 42, em que a referidatécnica de análise de DNA compreende a detecção de pelo menos um únicopolimorfismo de nucleotídeo em uma posição na seqüência de gene deFAD3-1 C correspondendo ao nucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292,-3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62, detecção de uma deleção no gene FAD3--1C de SEQ ID NO:62, ou detecção de pelo menos um único polimorfismo denucleotídeo em uma seqüência promotora de FAD3-1C de sojacorrespondendo a uma guanina no nucleotídeo 334, uma citosina nonucleotídeo 364, uma timina no nucleotídeo 385, uma adenina nonucleotídeo 387, uma citosina no nucleotídeo 393, uma guanina nonucleotídeo 729 e uma citosina no nucleotídeo 747 de SEQ ID NO:63.

45. Método de acordo com a reivindicação 41, em que a referidatécnica de análise de DNA compreende a detecção de um únicopolimorfismo de nucleotídeo no referido gene de FAD3-1 B de sojacompreendendo uma substituição de um resíduo de timina para um resíduode citosina em uma posição na seqüência de gene de FAD3-1 Bcorrespondendo ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61.

46. Método de acordo com a reivindicação 42, em que a referidatécnica de análise de DNA compreende a detecção de um únicopolimorfismo de nucleotídeo no referido gene de FAD3-1B de sojacompreendendo uma substituição de um resíduo de timina para um resíduode citosina em uma posição na seqüência de gene de FAD3-1Bcorrespondendo ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61.

47. Método de acordo com a reivindicação 36, em que o referidotransgene também compreende um transgene que confere tolerância aoherbicida.

48. Método de acordo com a reivindicação 40, em que o referidotransgene também compreende um transgene que confere tolerância aoherbicida e em que a referida planta de soja F1 que é heterozigoto para oreferido transgene é obtida na etapa (i) submetendo uma pluralidade deplantas F1 à seleção de herbicida para o referido transgene.

49. Método de acordo com a reivindicação 40, em que o referidotransgene também compreende um transgene que confere tolerância aoherbicida e em que uma pluralidade de plantas F2 enriquecidas para plantasde soja F2 que são homozigotos para o referido transgene é obtida na etapa(ii) submetendo a referida pluralidade de plantas F2 à seleção de herbicidapara o referido transgene.

50. Método de acordo com a reivindicação 47, em que o referidoherbicida é glifosato.

51. Método de acordo com a reivindicação 47, em que o referidotransgene compreende um gene CP4 EPSPS.

52. Método de acordo com a reivindicação 36, a referida plantade soja é criada na etapa (a) por:a) transformação de uma planta de soja ou célula de planta desoja compreendendo pelo menos uma mutação de perda-de-função em umgene FAD3 de soja endógena com pelo menos um transgene que diminui aexpressão de tanto de um gene FAD2-1 de soja endógena quanto um FATBde soja endógena para obter uma planta de soja RO com pelo menos umamutação de perda-de-função em um gene de FAD3 que seja heterozigotopara o referido transgene;b) fertilização cruzada contínua da referida planta de progênieR0 de (i) para obter uma planta de soja R1 que é homozigoto para o referidotransgene e homozigoto para pelo menos uma mutação de perda-de-funçãoem um gene de FAD3, desse modo obtendo uma planta de sojacompreendendo o referido transgene, e pelo menos uma mutação de perda-de-função em um gene FAD3 de soja endógena.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, em que o referidotransgene também compreende seqüências que conferem umacaracterística de tolerância ao herbicida.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o referidoherbicida é glifosato.

55. Método de acordo com a reivindicação 40, tambémcompreendendo a etapa iii) de fertilização cruzada contínua da referidaprogênie F2 que é homozigoto para o referido transgene e homozigoto parapelo menos uma mutação de perda-de-função em um gene de FAD3 de (ii)para obter uma planta de soja F3.

56. Método de acordo com a reivindicação 36, em que a referidapercentagem do teor de ácido graxo de semente total em peso de ácidolinolênico, ácidos graxos saturados e ácido oléico é determinada na etapa (c)por uma técnica de análise de lipídeo.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, em que a referidatécnica de análise de lipídeo compreende uma ou mais técnicasselecionadas do grupo consistindo em detecção de cromatografia degás/ionização de chama, cromatografia de gás/espectroscopia de massa,detecção de cromatografia de camada fina/ionização de chama,cromatografia líquida/espectrometria de massa, cromatografialíquida/ionização por életrovaporização - espectrometria de massa ecromatografia líquida/ionização por eletrovaporização - espectroscopiaaleatória de massa.

58. Planta de soja produzida por um método como definido nareivindicação 36.

59. Parte de planta da planta de soja como definida nareivindicação 58.

60. Parte de planta de acordo com a reivindicação 59, em que areferida parte da planta é pólen, um óvulo, um meristema, uma folha, umcaule, uma raiz, ou uma célula.

61. Planta de soja de progênie da planta de soja como definidana reivindicação 58.

62. Semente da planta de soja produzida por um método comodefinida na reivindicação 36, a referida semente tendo uma composição deácido graxo compreendendo um teor de ácido linolênico menor do que cercade 6% de ácidos graxos de semente totais em peso, um teor de ácido graxosaturado menor do que cerca de 8% em peso e um teor de ácido oléico decerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso.

63. Semente da planta de soja produzida por um método comodefinido na reivindicação 39, a referida semente tendo uma composição deácido graxo compreendendo um teor de ácido linolênico menor do que cercade 3% de ácidos graxos de semente totais em peso, um teor de ácido graxosaturado menor do que cerca de 8% em peso e um teor de ácido oléico decerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso.