BRPI0707645A2 - detecÇço de cÂncer por nÍveis elevados de bcl-2 - Google Patents

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Abstract

DETECÇçO DE CÂNCER POR NÍVEIS ELEVADOS DE BCL-2. A presente invenção refere-se a um método para o diagnóstico, prognóstico e monitoração de câncer, tal como câncer ovariano de estágio precoce ou tardio, em um indivíduo por detecção de Bcl-2 em uma amostra biológica a partir do indivíduo, de preferência uma amostra de urina ou de sangue. Bcl-2 pode ser medido usando-se um agente que detecta ou se liga à proteína de Bcl-2 ou a um agente que detecta ou se liga a ácidos nucléicos de codificação, tais anticorpos especificamente reativos com proteína de Bcl-2 ou uma sua porção. A invenção ulteriormente refere-se a kits para a realização dos métodos da invenção. A invenção ulteriormente refere-se a um dispositivo para a detecção rápida de Bcl-2 em um fluido corpóreo e métodos para rapidamente medir BcI-2 em um fluido corpóreo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETECÇÃODE CÂNCER POR NÍVEIS ELEVADOS DE BCL-2".
Referência Cruzada a Pedido Relacionado
O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisórioU.S. Ne de série 60/771.677, depositado em 9 de fevereiro de 2006, que éincorporado por referência aqui em sua totalidade, incluindo quaisquer figu-ras, tabelas, seqüências de ácidos nucléicos, seqüências de aminoácidos edesenhos.
Antecedentes da Invenção
Marcadores de câncer são substâncias que podem ser encon-trados no corpo (usualmente no sangue ou na urina) quando câncer estápresente. Eles podem ser produtos das próprias células de câncer ou docorpo em resposta a câncer ou outras condições. Por várias razões, os pró-prios marcadores de câncer não são usualmente suficientes para diagnosti-car (ou excluir) um tipo específico de câncer. A maioria dos marcadores decâncer pode ser produzida por células normais bem como por células decâncer, ainda que em quantidades menores. Algumas vezes, doenças nãocancerosas podem também levar níveis de certos marcadores de câncer aserem mais altos dõ que normais. Além disso, nem toda pessoa com câncerpode ter níveis mais altos de um marcador de câncer. Por essas razões, a-penas uma pequena quantidade de marcadores de câncer é comumenteusada pela maioria dos doutores. Quando um doutor examina o nível de umcerto marcador de câncer, ele ou ela tipicamente considerará-lo(a) juntamen-te com os resultados do exame físico e da história do paciente, e outros tes-tes de laboratório ou testes de formação de imagem.
Triar refere-se procurar câncer em indivíduos os quais não têmnenhum sintoma da doença, enquanto detecção precoce é encontrar câncera um estágio precoce da doença, quando é menos provável de ter se espa-lhado (e é mais provável ser tratado eficazmente). Embora marcadores decâncer fossem originalmente investigados e desenvolvidos para testar quan-to a câncer em pessoas sem sintomas, muito poucos marcadores demons-traram ser úteis desse modo.Câncer ovariano tem a mortalidade mais alta entre os cânceresginecológicos. A falta de sintomas precoce e da ausência de um teste detriagem confiável para detectar câncer ovariano resultam em acima de 70%de mulheres diagnosticadas depois que a doença se espalhou além do ová-rio de modo que o prognóstico é pobre com cerca de 12.000 mortes devido acâncer ovariano anualmente (sobrevivência de 5 anos não é melhor do que37%). Atualmente, exame pélvico físico por um médico, ultra-som ou medi-ção de níveis de sangue para CA125 são os únicos métodos-padrão dispo-níveis para a detecção de câncer ovariano. No entanto, nenhum desses mé-todos provê um um método exato e com confiança consistente para detectarcâncer ovariano. Por exemplo, embora acima dè 80% de mulheres com cân-cer ovariano tivessem níveis de CA125 elevados no sangue, níveis deCA125 no sangue são apenas cerca de 50% exatos para a detecção da do-ença no estágio precoce. O desenvolviento de um novo teste ou um testealternativo para detectar com segurança e com exatidão todos os cânceresovarianos é imperativo. Assim, o que é necessário é uma tecnologia que su-pere a falta corrente de um teste confiável, exato, seguro e de custo eficazpara câncer ovariano. Além do mais, o que é necessário é um tecnologiaque exatamente detecte todos os cânceres ovarianos, muitos dos quais ago-ra são não-detectados, bem como monitoram carga da doença através detodo o curso do câncer ovariano.
Um teste exato, seguro, simples e confiável para diagnosticarcâncer ovariano beneficiaria todas as mulheres, nos Estados Unidos e nomundo todo, incluindo áreas geográficas de oferta medicalmente insuficien-tes e especialmente mulheres em alto risco para o desenvolvimento de cân-cer ovariano. Dado que cerca de 25.000 mulheres são diagnosticadas comcâncer ovariano anualmente nos EUA, um biomarcador de câncer ovarianoque é detectável tanto em estágios precoces quanto em estágios tardios dedoença não apenas confirmaria o diagnósticos de câncer ovariano, mas po-deria também potencialmente detectar milhares de cânceres ovarianos ante-riormente não diagnosticados. Isso é especialmente importante para a de-tecção de câncer ovariano em estágios precoces onde a doença está confi-nada ao ovário, mas atualmente é responsável por menos do que 10% decânceres ovarianos diagnosticados. Nessas situações, remoção cirúrgica doovário doente aumenta a sobrevivência do paciente para acima de 90% eseria esperado reduzir os custos médicos. A capacidade de exatamente de-tectar e monitorar câncer ovariano em cada paciente através do curso desua doença, não apenas serveria para diagnóstico de câncer ovariano inicial,mas também indicaria eficácia terapêutica e/ou doença recorrente. O desen-volvimento de um teste à base de ELISA aprovado pela FDA, por exemplo,poderia tornar padrão de ouro para diagnóstico clínico de câncer ovariano.
Enqúanto apoptose é um processo biológico essencial para de-senvolvimento e manutenção normal de homeostase, está também envolvi-do em numerosas condições patológicas incluindo lesão de tecido, doençasdegenerativas, doenças imunológicas, e câncer (Lowe, S.W. and Lin, A.W.Carcinogenesis, 2000, 21:485-495). Se ativado por morte de receptores Iiga-dos à membrana (Ashkenazi, A. e outros J. Clin. Invest., 1999, 104:155-162;Walczak1 H. Krammer, P.H. Exp. Cell Res, 2000, 256:58-66) ou pela pertur-bação mitocondrial induzida por estresse com subseqüente liberação de ci-tocromo c (Loeffler, M. and Kroemer, G. Exp. Cell Res., 2000, 256:19-26;Wernig, F. and Xu, Q. Prog. Biophys. Mol. Biol., 2002, 78:105-137; Takano,T. e outros Antiox. Redox. Signal, 2002, 4:533-541), ativação de caspases ajusante leva à destruição celular por etapas por rompimento do citoesquele-to, paralisação de replicação e reparo de DNA, degradação de DNA cromos-somal, e, finalmente, desintegração da célula em corpos apoptóticos (Naga-ta, S. Exp. Cell Res., 2000, 256:12-18). Os reguladores-chave de apoptoseincluem membros da família de proteína de bcl-2 (Farrow, S.N. and Brown,R. Curr. Opin. Gen. Dev., 1996, 6:45-49).
A família de proteína de bcl-2 consiste em tanto membros dafamília de proteína pró- quanto antiapoptótica que agem a níveis diferentesda cascata apoptótica para regular apoptose. Os membros da família de bcl-2 contêm um domínio de homologia de Bcl-2 (BH) (Farrow, S.N. and Brown,R. Curr. Opin. Gen. Dev., 1996, 6:45-49). Embora todos os membros da fa-mília de bcl-2 demonstrem atividade de formação de canal de membrana,canais de Bcl-2 (o membro da família de bcl-2 original) são cátion (Ca+"1") se-letivo e, devido a sua exclusiva localização mitocondrial e ER (Thomenius,M.J. and Distelhorst1 C.W. J. Cell Sci., 2003, 116:4493-4499), a função anti-apoptótica de Bcl-2 é pelo menos parcialmente mediada por sua capacidadede evitar liberaçãode cálcio do ER e perturbação da membrana mitocondriale liberação de citocromo c. Uma vez que Bcl-2 é ultra-expresso em muitostipos de tumores incluindo câncer ovariano (Sharma, H. e outros Head Neck,2004, 26:733-740; Hanaoka, T. e outros Intl. J. Clin. Oncol., 2002, 7:152-158;Trisciuoglio, D. e outros J. Cell Physiol., 2005, 205:414-421; Khalifeh1 I. eoutros Int. J. Gynecol. Pathol., 2004, 23:162-169; O1NeiII, C.J. e outros Am.J. Surg. Pathol., 2005, 29:1034-1041), ele contribui para quimiorresistênciapor estabilização de membrana mitocondrial contra insultos apoptóticos. A-tualmente, estudos pré-clínicos focalizam o desenvolvimento de agentes pa-ra inibir Bcl-2, incluindo oligonucleotídeos e anti-sentido tais como G3,139(Ackermann, E.J. e outros J. Biol. Chem., 1999, 274:11245-11252), e inibido-res moleculares de Bcl-2 (Lickliter, J.D. e outros Leukemia, 2003, 17:2074-2080). Embora tais estudos direcionem Bcl-2 para a intervenção terapêutica,quantificação de Bcl-2 urinário não foi anteriormente relatado na literatura.
Seria vantajoso ter ensaios disponíveis que provêem métodosseguros, sensíveis, específicos e econômicos para a detecção de câncerestal como câncer ovariano que beneficiaria mundialmente a sociedade.
Breve Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se à triagem de câncer. Bcl-2 consti-tui um biomarcador para o prognóstico, diagnóstico e monitoração de cân-cer, tal como câncer reprodutivo. Por exemplo, Bcl-2 pode ser usado paradiagnosticar e monitorar câncer ovariano de estágio precoce ou de estágiotardio. Bcl-2 pode ser usado como um biomarcador para câncer antes dacirurgia e depois da recaída. Bcl-2, e agentes que ligam polipeptídeos e poli-nucleotídeos de Bcl-2 podem ser usados para detectar e monitorar câncerovariano, e outros canceres reprodutivos e não reprodutivos.
Assim, mais particularmente, essa invenção refere-se à detec-ção de câncer por triagem quanto a níveis elevados de Bcl-2 em amostrasbiológicas, tais como fluido de urina, sangue (por exemplo, plasma, soro ousangue total), e ascites. Em uma concretização, o câncer é o câncer ovaria-no. Em uma outra concretização, o câncer é um tipo selecionado do grupoque consiste em mama, endometrial, cervical, pulmão, cólon, próstata, Me-lanoma gioblastoma, sarcoma, bexiga, cabeça e pescoço. Opcionalmente, ométodo ulteriormente compreende a verificação que o indivíduo está sofren-do do câncer detectado (por exemplo, por avaliação quanto a presença deum ou mais sintomas de câncer, detecção dos marcadores de câncer adi-cionais, detecção da presença do câncer através de uma modalidade de i-magem tais como raios X, CT, imagem nuclear (PET e SPECT), ultra-som,MRI) e/ou tratamento do indivíduo para o câncer detectado (por exemplo,cirurgia, quimioterapia e/ou radiação).
A presente invenção refere-se a kits para a realização dos méto-dos da invenção.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um dis-positivo para a rápida detecção de Bcl-2 em um fluido de corpo tal comosangue ou urina. De preferência, o dispositivo é um dispositivo de fluxo late-ral. Em uma concretização, o dispositivo compreende uma zona de aplica-ção para receber uma amostra de fluido do corpo tal como sangue ou urina;uma zona de marcação contendo um agente de ligação que se liga a Bcl-2na amostra; e uma zona de detecção onde agente de ligação ligado a Bcl-2é retido para dar um sinal, em que o sinal dado para uma mostra de um indi-víduo com um nível de Bcl-2 mais baixo do que uma concentração limiar édiferente do sinal dado para uma amostra de um paciente com um nível deBcl-2 igual a ou maior do que uma concentração limiar.
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um teste simples,rápido, confiável, exato e de custo eficaz para Bcl-2 em um fluido do corpotal como sangue ou urina, similar a testes de gravidez feitos em casa atual-mente disponíveis que poderiam ser usados por indivíduos em sua própriacasa, em um consultório médico, ou em uma cabeceira do paciente.
Em uma concretização, o teste é um método para medição deBcl-2 em um fluido de corpo compreendendo: (a) obtenção de uma amostrade fluido do corpo, tal como sangue ou urina, a partir de um indivíduo; (b)contato da amostra com um agente de ligação que se liga a qualquer Bcl-2na amostra; separação da ligação Bcl-2 de agente de ligação (c); e (e) com-paração do sinal detectado na etapa (d) com um sinal de referência que cor-responde ao sinal dado por uma amostra de um indivíduo com um nível deBcl-2 igual a uma concentração limiar. Em uma concretização, o fluido docorpo é urina e a concentração limiar está entre 0 ng/ml e 2,0 ng/ml. Em umaoutra concretização, o fluido do corpo é urina, e a concentração limiar é de1,8 ng/ml.
Para avaliar se níveis urinários de Bcl-2 poderiam ser usadospara detectar câncer ovariano, urina foi coletada a partir de voluntários sau-dáveis normais, a partir de pacientes com câncer ovariano e foi medidaquanto a Bcl-2 por ELISA. A quantidade média de Bcl-2 na urina de pacien-tes com câncer era em geral pelo menos 10x maior do que de controlessaudáveis. Além disso, nenhuma das amostras de urina coletada a partir de35 mulheres com doença ginecológica benigna (incluindo teratomas, cistosovarianos, leiomiomas, doença de ovário policístico, adenofibroma ou cista-denomas) tinham níveis de Bcl-2 acima daquele encontrado em voluntáriossaudáveis, normais. Níveis urinários de Bcl-2 diminuíram até 100% em paci-entes com câncer ovariano após cirurgia de remoção. A sensibilidade e es-pecificidade para Bcl-2 urinário elevado associadas a câncer ovariano eraquase 100% dos níveis de sangue total de CA125 > 35 U/ml apenas identifi-cavam 68% dos pacientes com câncer ovariano. Comparação de parâmetrosclínicos indicavam que níveis urinários de Bcl-2 se correlacionaram bem comgrau e estágio de tumor. No entanto, níveis urinários de Bcl-2 não estavamrealcionados com idade do paciente ou tamanho de tumor. Portanto quantifi-cação de Bcl-2 urinário por ensaios à base de ELISA provê um método se-guro, específico e econômico para detectar câncer ovariano, para monitorarcâncer ovariano através de todo o curso de doença e prever o resultado te-rapêutico e de prognóstico.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 é um histograma que mostra níveis urinários de Bcl-2.Níveis urinários de Bcl-2 são mais altos em pacientes com câncer ovaríanoem comparação com voluntários saudáveis normais. Urina foi coletada apartir de voluntários saudáveis normais e a partir de pacientes com câncerovariano (incluindo subtipos histológicos serosos, que contém mucina) ecâncer peritoneal. Cânceres ovarianos serosos foram ulteriormente subdivi-didos em estágio 1 (o primeiro três barras na esquerda no grupamento sero-so), estágio 2 (o próximo oito barras nenhum grupamento seroso (isto é, bar-ras de 4-11 oriundas da esquerda do grupamento seroso)) e o estágio 3 (asonze barras na seção à direta do grupamento seroso (isto é, barras de 12-22oriundas da esquerda do grupamento seroso). A urina foi testada em triplica-ta para Bcl-2 por ELISA (kits ELISA oriundos de Bender MedSystems1 catá-logo Ne BMS244/3) e os resultados expressos como a média de ng/ml deBcl-2 ± S.E.. Os dados indicam níveis consistentemente elevados de Bcl-2na urina de pacientes com câncer. Análise de teste t de Student revelaramuma diferença estatística entre amostras de câncer e normal a ρ < 0,00001.
A Figura 2 é um histograma que mostra níveis urinários de Bcl-2em pacientes normais e com câncer. Amostras de urina adicionais foramcoletadas a partir de voluntários saudáveis normais e a partir de pacientescom câncer ovariano (incluindo do endometróide, soro e mucina de subtiposhistológicos) e câncer peritoneal. Cânceres ovarianos serosos foram ulteri-ormente subdivididos em estágio 1 (7 barras mais a esquerda no grupamen-to seroso), estágio 2 (barras de 8-17 da esquerda no grupamento seroso) eestágio 3 (12 barras mais a direita no grupamento seroso). A urina foi testa-da em triplicata para Bcl-2 por ELISA (kits ELISA oriundos de Bender MedSystems), os resultados expressos como a média de ng/ml Bcl-2 e represen-tam todas as amostras de urina normais e com câncer pré-cirúrgico testadasaté agora. De acordo com a Figura 1, os dados indicam níveis consistente-mente elevados de Bcl-2 na urina de pacientes com câncer. Análise de testet de Student revelam uma diferença estatística entre amostras de câncer enormal a ρ < 0,00001.
As Figuras 3A e 3B são histogramas que demonstram que Bcl-2urinário está relacionado com estágio e grau de tumor, respectivamente. Ni-veis de Bcl-2 urinário foram representados graficamente contra tumor está-gio a partir de todos os subtipos de câncer ovariano histológicos disponíveis(seroso, de endométrio, que contém mucina). Estágios I, II, Ill e V são repre-sentados por numerais Romanos com grupamentos de baixo. Embora aindaconsideravelmente mais alto do que os controles normais, Figura 3A ilustraque níveis urinários de Bcl-2 fossem mais baixos nos tumores de estágio I eII (média de ng/ml Bcl-2 = 2,2) onde a doença está localizada para dentro dacavidade ovariana e peritoneal, respectivamente. Níveis urinários de Bcl-2eram maiores entre o estágio Ill e V (média de ng/ml Bcl-2 = 4,22) quando adoença espalhou bem além do ovário ou é doença recorrente, respectiva-mente.
As Figuras 4A e 4B são um par de histogramas que mostra acapacidade de Bcl-2 urinário (Figura 4A) em relação às medições de níveisde CA125 no plasma (Figura 4B) na detecção de câncer ovariano. Ondequer que possível, níveis de Bcl-2 urinário como anteriormente mostradosnas Figuras 1-3 eram em comparação com plasma níveis de CA125 dosmesmos voluntários saudáveis normais e pacientes com câncer. O últimogrupo incluia pacientes com câncer ovariano que contém mucina (Muc),câncer peritoneal primário (PP) e câncer ovariano seroso (Seroso). Níveis deCA125 foram determinados por ELISA (kits oriundos de Bio-Quant, San Die-go, CA, Catálogo N9 BQ1013T) em triplicata. Os dados são expressos comoa média dé ng/ml Bcl-2 (A) e média de U/ml CA125 (Figura 4B). A sensibilia-de e especificidade para detectar câncer ovariano por níveis elevados deBcl-2 urinário eram quase 100%. Em contraste com isso, níveis no sanguede CA125 > 35 U/ml, o padrão atual para a detecção de câncer ovariano,apenas corretamente identificou 68% de pacientes com câncer ovariano.
A Figura 5 é um histograma mostrando que Bcl-2 urinário nãocorrelaciona com idade do paciente. Para examinar se níveis elevados uriná-rios de Bcl-2 em pacientes com câncer correlacionados com idade do paci-ente, níveis de Bcl-2 urinário (como determinado anteriormente nas Figuras1 -3 e 4A-4B) eram em comparação contra a idade do paciente em anos.Embora a média de idade de voluntários saudáveis normais nesse estudoera um pouco mais baixa (54,8 anos) do que pacientes com câncer (66,2anos), não há diferença estatística na idade entre os grupos devido à amplafaixa na idade (vide o inserto na Figura 5). Além disso, a média de idade depacientes com câncer está de acordo com a literatura e dados clínicos indi-cando que câncer ovariano em geral direciona mulheres peri- e pós-menopausa. No entanto, não pareceu ser uma correlação entre níveis uriná-rios de Bcl-2 com idade do paciente.
A Figura 6 é um histograma mostrando que Bcl-2 urinário nãocorrelaciona com tamanho de tumor ovariano. Para examinar se níveis ele-vados urinários de Bcl-2 em pacientes com câncer correlacionados com ta-manho de tumor, níveis de Bcl-2 urinário (como determinado anteriormentenas Figuras 1-3 e 4A-4B) estavam em comparação contra tamanho de tu-mor. Tumores foram agrupados como: 1= microscópico de tamanho; 3 = tu-mores menores do que 3 cm; 6 = tumores entre 3 e 6 cm; 10 = tumores mai-ores do que 6 cm e até 10 cm; 11 = tumores maiores do que 10 cm. Os da-dos indicam que não pareceu haver uma correlação entre níveis urinários deBcl-2 com tamanho de tumor.
As Figuras 7A e 7B são um par de histogramas mostrando queBcl-2 urinário diminui depois de cirurgia de remoção de câncer ovariano. Pa-ra ulteriormente testar a exatidão de Bcl-2 urinário para detectar câncer ova-riano, níveis de Bcl-2 urinário em comparação naqueles pacientes de câncerovariano disponíveis imediatamente antes de (barras pretas) e no período de2 semanas após (barras cinzas) a cirurgia de remoção inicial (remoção detodo o tumor visível) (Figura 7A). Para aqueles 7 pacientes onde amostrasde urina foram coletadas antes e depois da cirurgia inicial, níveis de Bcl-2diminuíram até 100% após remoção cirúrgica de tumor. Esses dados, então,sugerem que o tumor é a fonte de Bcl-2 encontrada elevada na urina de pa-cientes com câncer ovariano e que níveis de Bcl-2 urinário são paralelos àpresença de câncer ovariano. Além disso, amostras dè urina foram coleta-das a partir de 5 dos 7 pacientes na Figura 7A nas visitas clínicas de acom-panhamento subsqüente variam de 7 a 11 meses após cirurgia inicial e me-diam quanto a Bcl-2 (barras azuis) (Figura 7B). Níveis de Bcl-2 urináriospermaneceram baixos em 3 pacientes de acompanhamento (Ns 41, 43, 54) ese tornaram elevados em 2 pacientes (NQ 5, 27). Revisão de mapa prelimiarindicava que pacientes Ne 41, 43, 54 estavam sofrendo quimioterapia na ho-ra das visitas de acompanhamento e que sua doença de câncer ovarianodisease estava sob controle. Em contraste com isso, revisão de mapa suge-re que pacientes Nq 5, 27 tinham doença recorrente (5B, 27B) e que pacien-te N5 27b sofria de cirurgia de remoção de tumor adicional. De acordo com ainformação clínica, níveis de Bcl-2 urinário permaneceram reduzidos em pa-cientes que sofrem quimioterapia e os quais não tinham doença residual mí-nima ou aparente (Ns 41, 43, 54). Do mesmo modo, níveis de Bcl-2 urinárioelevados correlacionados com a presence de doença recorrente (Ns 5b,27B) e diminuíram com remoção de doença subseqüente (Ne 27c).
As Figuras 8A e 8B mostram resultados de testagem de Bcl-2em pacientes com doença ginecológica benigna. Amostras urinárias foramexaminadas por ELISA quanto a Bcl-2 em pacientes com doença ginecológi-ca benigna. Amostras foram examinadas em triplicata e os dados expressoscomo a média de ng/ml de Bcl-2 ± S.E. (Figura 8A). Amostras de doençaginecológica benigna foram subdivididas por tipo (teratoma cístico benigno,cisto simples, leiomioma, ovário policístico, adenofibroma, cistadenoma demucina e seroso) com amostra de paciente com câncer ovariano Ns 41 (bar-ra branca) que serve como um controle positivo interno. Média de Bcl-2 uri-nário ng/ml ± S.E. entre doença benigna são indicadas abaixo de seu res-pectivo cabeçalho. Amostras oriundas da Figura 2 e da Figura 3A foram rea-presentadas graficamente para mostrar a distribuição de expressão de Bcl-2para esse grupo de estudo (n=92), mostradas na Figura 8B. Níveis de Bcl-2em indivíduos com câncer, benigno e normais variavam de 0,115-1,016ng/ml, 1,12-9,8 ng/ml e 0-1,26 ng/ml e média 0,614 ng/ml, 3,4 ng/ml and 0,21ng/ml, respectivamente.
A Figura 9 é um histograma mostrando que Bcl-2 pode ser se-cretado em meio condicionado de cultura de célula. Meio condicionado (CM)foi coletado a partir de linhas de células de câncer estabelecidas que repre-tam cânceres ovariano (QV2008, SKOV3, PA1), cervical (Hela), de próstata(LNCap, DU145, PC-3), de cabeça e pescoço (HN5a) e de Iinfoma (Raji) efoi examinado por ELISA quanto a presença de Bcl-2. Dados são expressoscomo a média de amostras em triplicatas. A presença de Bcl-2 no CM deculturas de células de câncer ovariano, cervical e de próstata sugere queessas células de câncer produzem e secretam Bcl-2.
A Figura 10 mostra que Bcl-2 é ultra-expresso em algumas célu-las de câncer. Usados de células oriundos de linhas de células de câncerestabelecidas que representam cânceres ovariano (SW626, C13), de cabeçae pescoço (HN5a), cervical (HeIa) e de próstata (DU145) eram western im-munoblotted para Bcl-2. Actina serviu como um controle de carregamento ecélulas de FHI0SE118 (células epiteliais de superfície ovariana humanastransfectadas com antígeno T grande de SV-40) serviam como células decontrole epiteliais de superfície ovariana não maligna, normais. Após análisedensitométrica, o nível de Bcl-2 foi normalizado para actina, observado abai-xo das manchas. Células normais continham quantidades desprezíveis debcl-2 enquanto células de câncer ovariano e cervical continham a quantidademaior de Bcl-2.
A Figura 11 mostra concentrações de proteína de Bcl-2 após aarmazenagem. Amostras de urina oriundas de indivíduos saudáveis (Ne 506,508) e pacientes com câncer ovariano (Ns 77, 97) foram originalmente testa-dos quanto a Bcl-2 como parte desse estudo (controle) e após armazena-gem por 4 dias ou a temperatura ambiente (25°C), em uma geladeira (4°C),em um freezer -20°C (-20°C) ou em um freezer -80°C (-80°C). Todas as a-mostras foram testadas em duplicata para níveis urinários de Bcl-2 usando-se de kit ELISA (BenderMed Systems).
A Figura 12 mostra concentrações de proteína de Bcl-2 em meiocondicionado (CM) de linhas de células de câncer após o tratamento comácido lisofosfatídico (LPA), incluindo DU145, uma linha de célula de câncerde próstata. A figura mostra que tratamento com LPA, que freqüentementeretro-alimenta nas células de câncer do modo de um Ioop autócrino, estimulasecreção de Bcl-2 no CM de alguns tipos de célula de câncer. Uma vez queessas linhas de células de câncer secretam Bcl-2 em seu CM, como fazemlinhas de célula de câncer ovariano, os correspondentes de tumor in vivo detais linhas de células potencialmente secretam Bcl-2 em fluidos biológicostais como urina e/ou sangue e podem ser detectadas usando-se a presenteinvenção.
Breve Descrição das Seqüências
SEQ ID NO: 1 é DNA de Bcl-2 humano (GenBank N9 de acessoM14745); região de codificação (CDS): bases 32-751.
SEQ ID NO: 2 é proteína de Bcl-2 humana (GenBank N9 de a-cesso AAA35591).
SEQ ID NO: 3 é DNA de Bcl-2 humano, variante de transcritoalfa (GenBank N9 de acesso NM_000633); CDS: bases 494-1213.
SEQ ID NO: 4 é proteína de Bcl-2 humana, variante de transcritoalfa (GenBank N9 de acesso NP_000624).
SEQ ID NO: 5 é DNA de Bcl-2 humano, variante de transcritobeta (GenBank N9 de acesso NM_000657); CDS: bases 494-1111.
SEQ ID NO: 6 é proteína de Bcl-2 humana, variante de transcritobeta (GenBank N9 de acesso NP_000648).
Descrição Detalhada da Invenção
Bcl-2 é um marcador molecular eficaz para câncer tal como cân-cer ovariano. Marcadores de câncer (também chamados de marcadores detumor) são moléculas tais como hormônios, enzimas, e imunoglobulinas en-contrados no corpo que estão associados a câncer e cuja medição ou identi-ficação é útil em diagnóstico de paciente ou controle clínico. Eles podem serprodutos das próprias células de câncer, ou do corpo em resposta a câncerou outras condições. A maioria dos marcadores de câncer são proteínas.Alguns marcadores de câncer são vistos apenas em um único tipo de cân-cer, enquanto outros podem ser detectados em vários tipos de câncer. Comocom outros marcadores de câncer, Bcl-2 pode ser usado para uma varieda-de de finalidades, tal como: triagem de uma população saudável ou uma po-pulação de alto risco quanto a presença de câncer; produção de um diag-nóstico de câncer ou de um tipo específico de câncer, tal como câncer ovari-ano; determinação do prognóstico de um indivíduo; e monitoração do cursoem um indivíduo em remissão ou enquanto recebendo tratamento cirúrgico,radiação, quimioterapia ou outro tratamento de câncer.
Para avaliar se níveis urinários de Bcl-2 poderiam ser usadospara detectar câncer ovariano, urina foi coletada a partir dos voluntáriossaudáveis normais (N = 21) e a partir de pacientes com câncer ovariano (N =34) e peritoneal primário (N = 2) e mediam em triplicata para Bcl-2 usando-se kits ELISA comercialmente disponíveis (BenderMedSystems, católogo NsBMS244/3) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados foramexpressos como a média de ng/ml de Bcl-2 ± S.E.. A quantidade média deBcl-2 na urina de voluntários saudáveis era de 0,204 ng/ml enquanto queoriundos de pacientes pré-cirúrgicos com câncer produziram em médio 3,12ng/ml, em geral pelo menos 10X mais alta do que encontrada em controlesnormais. Análise de teste t de Student revelou uma diferença estatística en-tre amostras normais e de câncer a p< 0,00001. Comparação de parâmetrosclínicos indicavam que níveis urinários de Bcl-2 correlacionavam bem comestágio e grau de tumor (figuras 3A e 3B).
Amostras no plasma oriundos desses mesmos indivíduos acimaforam examinados em triplicata quanto a níveis de CA125 por ELISA comer-cialmente disponível (Bio-Quant, catálogo N9 BQ1013T) de acordo com asinstruções do fabricante. A sensibilidade e a especificidade para Bcl-2 uriná-rio elevado associadas com detecção de câncer ovariano foi quase 100%enquanto níveis sangüíneos de CA125 >35 U/mL, o padrão atual para de-tecção de câncer ovariano, somente corretamente identificado 68% de paci-entes com câncer ovariano, apenas corretamente identificavam 68% de pa-cientes com câncer ovariano.
Para ulteriormente testar a exatidão para níveis de Bcl-2 urináriopara detectar câncer ovariano, níveis de Bcl-2 urinário foram comparadoscom aqueles pacientes de câncer ovariano disponíveis imediatamente antesde e no período de 2 semanas após a cirurgia de remoção inicial (remoçãode todo o tumor visível). Para aqueles 7 pacientes onde amostras de urinaforam coletadas antes e depois da cirurgia incial, níveis de Bcl-2 dimimuíramaté 100% após a remoção cirúrgica de tumor. Esses dados, então, sugeremque o tumor é a fonte de Bcl-2 encontrado elevada na urina de pacientescom câncer ovariâno. Além disso, amostras de urina foram coletados a partirde 5 desses 7 pacientes nas visitas clínicas de acompanhamento subse-qüentes que variam de 7 a 11 meses após a cirurgia inicial e foram medidasquanto a Bcl-2. Níveis de Bcl-2 urinário permanceram baixo em 3 pacientesde acompanhamento (Ne 41, 43, 54) e se tornaram elevados em 2 pacientes(N9 5, 27). Revisão de mapa prelimiar indicavam que pacientes Ne 41, 43 e54 estavam sofrendo quimioterapia na hora das visitas de acompanhamentoe que sua doença de câncer ovariano estava sob controle. Em contrate comisso, revisão de mapa sugere que pacientes Ns 5, 27 tinham doença recor-rente e que o paciente N9 27 sofreu cirurgia de remoção de tumor adicional.De acordo com a informação clínica, níveis de Bcl-urinário permaneceramreduzidos em pacientes que sofrem quimioterapia e os quais não tinham do-ença residual mínima ou evidente (N9 41, 43, 54). Do mesmo modo, níveisde Bcl-2 urinário correlacionados com a presença de doença recorrente (N-5, 27) e diminuíram com remoção da doença subseqüente (N9 27c).
Tomados juntos, esses dados indicam que quantificação de Bcl-2 urinário por ensaios à base de ELISA parece prover um método novo, sen-sível, específico e econômico para a detecção de câncer ovariano. Além dis-so, níveis urinários de Bcl-2 podem ser usados para monitorar a presença decâncer ovariano através de todo o curso da doença e pode prever resultadosterapêuticos e prognósticos.
Em um aspecto, a invenção inclui um método para a detecçãode câncer em um indivíduo, compreendendo a detecção da presença de Bcl-2 em uma amostra biológica a partir do indivíduo, tal como urina, sangue,fluido peritoneal ou fluido de ascites, e em que um nível de Bcl-2 acima deum limiar predetrminado é indicativo de câncer no indivíduo. De preferência,a detecção não é realizada por um ensaio slot-blot qualitativo (tal como a-quele comercialmente disponível da BioRad).
A detecção e/ou a monitoração de câncer usando os métodos,dispositivos e kits da invenção incluem mas não são limitados a, câncer demama (por exemplo, infiltração (invasivo), pré-invasivo, inflamatório, doençade Paget1 metastático ou recorrente); câncer gastrointestinal/digestivo (porexemplo, apêndice, duto biliar, cólon, esofageano, vesícula biliar, gástrico,intestinal, fígado, pancreático, retal e do estômago); câncer genitouriná-rio/urinário (por exemplo, adrenal, bexiga, rim, pênis, próstata, testicular eurinário); câncer ginecológico (por exemplo, cervical, endomemtrial, tubafalopiano, ovariano, uterino, vaginal e vulvar); câncer de cabeça e de pesco-ço (por exemplo, olho, cabeça e pescoço, mandíbula, laríngeo, cavidade na-sal, câncer oral, faríngeo, glândula salivar, sino, tiróide, língua e amígdala);câncer hematológico/sangüíneo (por exemplo, doença de Hodgkins, Ieuce-mia (leucemia linfocítica aguda, leucemia granulocítica aguda, leucemia mie-lógena aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica),mieloma crônico, Iinfoma e nódulo linfático); câncer de músculo esquelético/tecido mole (por exemplo, osteossarcoma, Melanoma pele (célula basal, cé-lula escamosa), sarcoma (sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi)); câncerneurológico (por exemplo, cérebro (atrocitoma, glioblastoma, glioma), glân-dula pituitária, medula espinhal)); e câncer respiratório/pulmão (por exemplo,pulmão (adenocarcinoma, célula em grão de aveia, célula não pequena, cé-lula pequena, célula escamosa) e mesotelioma). Em uma concretização, ocâncer é um câncer ovariano. Em uma outra concretização, o câncer é umtipo selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer endo-metrial, câncer cervical, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de prós-tata, Melanoma glioblastoma, sarcoma, câncer de bexiga e câncer de cabe-ça e pescoço.
Em uma concretização do método da invenção, a detecçãocompreende: (a) contato da amostra biológica com um agente de ligaçãoque liga proteína Bcl-2 para formar um complexo; e (b) detecção do comple-xo; e correlação do complexo detectado com a quantidade de proteína deBcl-2 na amostra, em que a presença de proteína de Bcl-2 elevada é indica-tiva de câncer. Em uma concretização específica, a detecção de (b) ulterior-mente compreende a ligação ou incorporação de um rótulo sobre o agente,ou o uso de detecção imunoenzimática à base de ELISA.
Opcionalmente, os métodos da invenção ulteriormente compre-endem a detecção de um biomarcador de câncer na mesma amostra bioló-gica ou uma amostra biológica diferente obtida a partir do indivíduo, antes,durante ou depois da dita detecção de Bcl-2. Em uma concretização, o bio-marcador de câncer é um biomarcador de câncer reprodutivo, tal como cân-cer ginecológico. Em uma outra concretização, o biomarcador é CA125 ouOVXI. O indivíduo pode ter nível de CA125 elevado no sangue na hora quea detecção de Bcl-2 é realizada, ou o indivíduo pode não ter um nível deCA125 elevado no sangue na hora que a detecção de Bcl-2 é realizada.
Em algumas concretizações, o indivíduo está sofrendo de cân-cer, tal como câncer ovariano, e a detecção é realizada em vários pontos detempo em tempo, como parte de uma monitoração do indivíduo antes, du-rante ou depois do tratamento do câncer.
Opcionalmente, os métodos da invenção ulteriormente compre-endem a comparação do nível de Bch2 na amostra biológica com o nível deBcl-2 presente em uma amostra de controle normal, em que um nível maisalto de Bcl-2 na amostra biológica quando comparada com o nível na amos-tra de controle normal é indicativo de câncer tal como câncer ovariano.
Em algumas concretizações, o indivíduo não exibe nenhum sin-toma de câncer na hora que a detecção de Bcl-2 é realizada. Em outrasconcretizações, o indivíduo exibe um ou mais sintomas de câncer na horaque a detecção de Bcl-2 é realizada. Por exemplo, com relação a câncerginecológico (por exemplo, câncer ovariano), um ou mais sintomas de cân-cer ginecológico incluem aqueles selecionados do grupo que consiste emdor pélvica, sangramento vaginal anormal, inchamento ou intumescimentoabdominal, dor nas costas persistentes, indisposição de estômago persisten-te, mudança em padrão de bexiga ou de intestino (tal como constipação,diarréia, sangue nas fezes, gás, fezes mais finas, freqüência ou urgência deurinação, constipação), dor durante a relação sexual, perda de peso não in-tencional de 4,53 kg ou mais (dez libras ou mais), anormalidade de vulva ouvaginal (tal como bolha, mudança na cor da pele ou descarga, mudança namama (tal como um caroço, úlcera, saíde de líquido do mamilo, covinha,vermelhidão ou inchamento), fadiga.Em uma outra concretização, a invenção inclui um método paraa avaliação de prognóstico de um indivíduo tendo ou suspeito de ter, câncer,compreendendo: a) determinação do nível de Bcl-2 em uma amostra biológi-ca obtida a partir do indivíduo tal como fluido de ascites, sangue ou urina; b)comparação do nível determinado na etapa (a) com uma faixa de Bcl-2 co-nhecida como estando presente em uma amostra biológica obtida a partir deum indivíduo normal que não tem câncer; e c) determinação do prognósticodo indivíduo com base na comparação da etapa (b), em que um nível alto deBcl-2 na etapa (a) indica uma forma agressiva de câncer e, portanto, umprognóstico pobre.
Os termos "detecção" ou "detectar" incluem analisar ou de outramaneira estabelecer a presença ou ausência do Bcl-2 alvo (seqüência deácido nucléico de codificação de Bcl-2 ou produto de gene de Bcl-2 polipep-tídeo)), suas subunidades, ou combinações de alvos ligados a agente e simi-lares, ou analisar quanto a, interrogar, verificar, estabelecer ou de outra ma-neira determinar um ou mais características reais de câncer ginecológico,metástase, estágio ou condições similares. O termo inclui diagnóstico, prog-nóstico e aplicações por monitoração para Bcl-2 e outros biomarcadores decâncer. O termo inclui metodologias quantitativas, semiquantitativas e quali-tativas. Em concretizações da invenção que envolvem a detecção de proteí-na de Bcl-2 (em oposição a moléculas de ácido nucléico que codificam pro-teína de Bcl-2), o método de detecção é de preferência um método à basede ELISA. De preferência, nas várias concretização da invenção, o métodode detecção provê uma saída (isto é leitura ou sinal) com a informação comrelação a presença, a ausência ou a quantidade de Bcl-2 em uma amostrade um indivíduo. Por exemplo, a saínda pode ser qualitativa (por exemplo,"positiva" ou "negativa"), ou quantitativa (por exemplo, uma concentraçãotais como nanogramas por mililitro).
Em uma concretização, a invenção refere-se a um método paraa detecção de câncer em um indivíduo por quantificação de proteína de Bcl-2 ou codificação de ácidos nucléicos (DNA ou RNA) em uma amostra bioló-gica tal como urina oriunda do indivíduo, compreendendo (a) contato (rea-ção) da amostra biológica com um anticorpo específico para Bcl-2, que estádiretamente ou indiretamente marcada com uma substância detectável; e (b)detecção da substância detectável.
Em uma concretização, a invenção refere-se a um método parao diagnóstico e/ou a monitoração de câncer em um indivíduo por quantifica-ção de Bcl-2 em uma amostra biológica, tal como urina ou sangue, oriundode um indivíduo, compreendendo (a) reação da amostra biológica com umanticorpo específico para Bcl-2 que está diretamente ou indiretamente mar-cado com uma substância detectável; e (b) detecção da substância detectá-vel.
Concretizações dos métodos da invenção envolvem (a) contatoda amostra biológica a partir de um indivíduo com um anticorpo específicopara Bcl-2 que está diretamente ou indiretamente marcado com uma enzi-ma; (b) adição de um substrato para a enzima em que o substrato é selecio-nado de modo que o substrato, ou um produto de reação da enzima e dosubstrato, forme complexos fluorescentes; (c) quantificação de Bcl-2 na a-mostra por medição de fluorescência dos complexos fluorescentes; e (d)comparação dos níveis quantificados com aquele de um padrão.
Uma concretização preferida da invenção compreende as se-guintes etapas:
(a) incubação de uma amostra biológica com um primeiro anti-corpo específico para Bcl-2 que está diretamente ou indiretamente marcadocom a substância detectável, e um segundo anticorpo específico para Bcl-2que está imobilizado
(b) separação do primeiro anticorpo do segundo anticorpo paraprover uma primeira fase de anticorpo e uma segunda fase de anticorpo;
(c) detecção da substância detectável na primeira ou segundafase de anticorpo desse modo quantificação de Bcl-2 na amostra biológica; e
(d) comparação do Bcl-2 quantificado com um padrão.
Um padrão usado em um método da invenção pode corresponder a níveisde Bcl-2 obtidos para amostras de indivíduos de controle saudáveis, a partirde indivíduos com doença benigna (por exemplo, doença ginecológica be-nigna), indivíduos com câncer ginecológico de estágio tardio, ou a partir deoutras amostras do indivíduo. Níveis aumentados de Bcl-2 quando compara-dos com o padrão pode ser indicativo de câncer, tal como câncer ovarianode estágio precoce ou tardio.
A invenção também contempla usando-se os métodos, dispositi-vos, e kits descritos aqui em combinação com um ou mais marcadores adi-cionais ("biomarcadores") para câncer. Portanto, a invenção contempla ummétodo para a análise de uma amostra biológica quanto a presença de Bcl-2e análise da mesma amostra, ou uma outra amostra biológica oriunda domesmo indivíduo, para outros marcadores que são indicadores específicosde um câncer. Um ou mais marcadores adicionais podem ser detectadosantes, durante e/ou após a detecção de Bcl-2 ser realizada. Exemplos demarcadores incluem CA125, LPA, e OVXI. Em uma concretização preferida,os marcadores são Bcl-2 e CA125. Os métodos, dispositivos, e kits descritosaqui podem ser modificados por inclusão de agentes para detectar os mar-cadores adicionais, ou ácidos nucléicos que codificam os marcadores.
Marcadores dè câncer que podem ser usados em combinaçãocom a invenção incluem, mas não são limitados a: alfa-fetoproteína (AFP),por exemplo, para cânceres pancreático, rim, ovariano, cervical, e testicular;antígeno embriônico carcinogênico (CEA), por exemplo, para cânceres depulmão, pancreático, rim, mama, uterino, de fígado, gástrico, e de colorretal;antígeno de carboidrato 15-3 (CA15-3), por exemplo, para cânceres de pul-mão, pancreático, de mama, ovariano, e de fígado; antígeno de carboidrato19-9 (CA19-9), por exemplo, para cânceres de pulmão, ovariano, uterino,fígado, gástrico, de colorretal, e de duto biliar; antígeno de câncer 125(CA125), por exemplo, para cânceres de pulmão, de pâncreas, de mama,ovariano, cervical, uterino, de fígado, gástrico, e colorretal; antígeno especí-fico de próstata livre e antígeno-alfa(l) específico de próstata (PSA), paracâncer de próstata; antígeno específico de próstata livre (PSAF), para cân-ceres de próstata e de colorretal; complexo de antiquimotripsina de antíge-no-alfa(1) específico de próstata (PSAC), para câncer de próstata; fosfatasede ácido prostático (PAP), para câncer de próstata; tiroglobulina humana(hTG), para câncer de tiróide ou tumor de Wilm's; gonadaotropina beta cori-ônica humana (hCGb), por exemplo, para cânceres de pulmão, pancreático,de rim, ovariano, uterino, testicular, de fígado, colorretal, de bexiga, e de cé-rebro; ferritina (Ferr), por exemplo, para câncer de câncer, câncer testicular,câncer da laringe, Iinfoma de Burkitt1S, neuroblastoma, e leucemia; enolaseespecífica de neurônio (NSE), para câncer de pulmão, câncer de tiróide, tu-mor de WiIm1S e neuroblastoma; interleucina 2 (IL-2), para câncer do rim emieloma múltiplo; interleucina 6 (IL-6), para câncer de rim, câncer de mama,câncer ovariano, e mieloma múltiplo; microglobulina de beta 2 (B2M), paracâncer de rim, câncer ovariano, câncer de próstata, leucemia, mieloma múl-tiplo, e linfoma; e microglobulina de alfa 2 (A2M), para câncer de próstata. Aseleção de amostra biológica (tal como sangue ou urina) em que os marca-dores de câncer acima mencionados são diagnósticos e/ou prognósticospodem ser prontamente determinados por aqueles versados na técnica.
Como indicado acima, a presente invenção provê um métodopara a monitoração, diagnóstico ou para o prognóstico de câncer, tal comocâncer ovariano, em um indivíduo por detecção de Bcl-2 em uma amostrabiológica oriunda do indivíduo. Em uma concretização, o método compreen-de contato da amostra com um anticorpo específico para Bcl-2 que está dire-tamente ou indiretamente marcado com a substância detectável, e detecçãoda substância detectável.
Os métodos da invenção podem ser usados para a detecção deou uma ultra- ou uma subabundância de Bcl-2 em relação a um estado denão distúrbio ou a presença de um Bcl-2 modificado (por exemplo, menos doque o comprimento total) que se correlaciona com um estado de distúrbio(por exemplo, câncer ovariano), ou uma progressão em relação a um estadode distúrbio. Os métodos descritos aqui podem ser usados para avaliar aprobabilidade da presença de célula malignas ou pré-maligas. Tais métodospodem ser usados para detectar tumores, quantificar seu crescimento e au-xiliar no diagnóstico e prognóstico de câncer ginecológico. Os métodos po-dem ser usados para detectar a presença de metástase de câncer, bem co-mo confirmar a ausência ou remoção dè todos tecido de tumor após a cirur-gia, terapia de radiação e/ou quimioterapia de câncer. Eles podem ulterior-mente ser usados para monitorar quimioterapia de câncer e reaparecimentode tumor.
Os métodos da invenção são particularmente úteis no diagnósti-co de câncer ovariano de estágio precoce (por exemplo, quando o indivíduoé assintomático) e para o prognóstico de progressão e mortalidade de doen-ça de câncer ovariano. Como ilustrado aqui, níveis aumentados de Bcl-2 de-tectados em uma amostra (por exemplo, urina, soro, plasma, sangue total,ascites) em comparação com um padrão (por exemplo, níveis para distúrbiosnormal ou benigna) são indicativos de estágio de doença avançado, tipo his-tológico seroso, remoção subótima, tumor residual grande e/ou risco aumen-tado de progressão e mortalidade de doença.
Os termos "amostra", "amostra biológica" e similares referem-sea um tipo de material conhecido como ou suspeito de expressar ou conterBçl-2, tal como urina. A amostra de teste pode ser usada diretamente comoobtida a partir da fonte ou após um pré-tratamento para modificar o caráterda amostra. A amostra pôde ser derivada de qualquer fonte biológica, taiscomo tecidos ou extratos, incluindo células (por exemplo, células de tumor) efluidos fisiológicos, tais como, por exemplo, sangue total, plasma, soro, fluidoperitoneal, ascites e similares. A amostra pode ser obtida a partir de animais,de preferência mamífero, mais preferivelmente seres humanos. A amostrapode ser pré-tratada por qualquer método e/ou pode ser preparada de qual-quer meio conveniente que não interfere com o ensaio. A amostra pode sertratada antes do uso, tais como preparação de plasma a partir de sangue,diluição de fluidos viscosos, aplicação de um ou mais inibidores de proteasea amostras tais como urina (por exemplo, f Iuoreto de 4-(2 aminoetil)-benzenósulfonila, EDTA, leupeptina, e/ou pepstatina) e similares. Tratamento comamostra podem envolver filtração, destilação, extração, concentração, inati-vação de interferência dos componentes, a adição de reâgentes e similares.
A presença de bcl-2 pode ser detectada em uma variedade deamostras biológicas, incluindo tecidos ou seus extratos. De preferência, Bcl-2 é detectado em urina humana.Em concretizações da invenção, o método descrito aqui é adap-tado para o diagnóstico e monitoração de câncer ginecológico por quantifi-cação de Bcl-2 em amostras biológicas oriundas a indivíduo. De preferência,a quantidade dè Bcl-2 quantificada em uma amostra oriunda de um indivíduosendo testada está em comparação com níveis quantificados para uma outraamostra ou uma amostra inicial oriunda do indivíduo, os níveis quantificadospara uma amostra de controle. Níveis para amostras de controle oriundas deindivíduos saudáveis podem ser estabelecidos por estudos estatísticos pros-pectivos e/ou retrospectivos. Indivíduos saudáveis os quais não têm anorma-lidades ou doenças clinicamente evidentes podem ser selecionados paraestudos estatísticos. Diagnósticos podem ser feitos por uma constatação deníveis estatisticamente diferentes de Bcl-2 em comparação com uma amos-tra de controle ou níveis quantificados precoces para o mesmo indivíduo.
O termo "Bcl-2" refere-se à proteína 2 de Iinfoma de célula Bhumana (também conhecida como célula B CLL/linfoma 2), uma proteínamitocondrial externa integral que bloqueia a morte apoptótica de algumascélulas tais como linfócitos (Cleary M.L. e outros, Cell, 1986, 47(1):19-28;Tsujimoto Y and Croce C.M., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1986, 83:5214-5218, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade). O termo"Bcl-2" inclui seqüências de ácidos nucléicos (por exemplo, N-de acesso deGenBank M14745; SEQ ID NO: 1) que codifica o produto de gene de Bcl-2(polipeptídêo), bem como o polipeptídeo de Bcl-2 (por exemplo, N9 de aces-so de GenBank AAA35591; SEQ ID NO: 2). O termo inclui todos os homólo-gos, variantes alélicas de ocorrência natural, isoformas e precursores de Bcl-2 de ser humano NsS de acesso de GenBank M14745 e AAA35591. Em ge-ral, variantes alélicas de ocorrência antural de Bcl-2 humana partilharamhomologia de seqüência significativa (70-90%) às seqüências mostradas nosNes de acesso de GenBank M14745 e AAA35591. Variantes alélicas podemconter substituições de aminoácidos conservadores da seqüência de Bcl-2ou conterão uma substituição de um aminoácido de uma posição correspon-dente em um homólogo de Bcl-2. Duas variantes de transcrito, alfa e beta,produzidas por união alternativa, diferem em suas extremidades C-terminais.A variante alfa (no. de acesso de GenBank NP_000624 (SEQ ID NO:4); e Nsde acesso de GenBank NM_000633 (SEQ ID NO:3)) representa o transcritomais longo e codifica o isoforma mais longa (alfa), e beta sendo mais curto(no. de acesso de GenBank NM_000648 (SEQ ID NO:6); N9 de acesso deGenBank NP_000657 (SEQ ID NO:5). A variante beta difere na região decodificação e 3' UTR em comparação com a variante alfa, bem como a ex-tremidade C-terminal. Em uma concretização particular, os métodos, disposi-tivos, e kits da invenção são específicos para Bcl-2 (por exemplo, SEQ IDNOs: 1, 2, 3, 4, 5, e/ou 6), mas molécula de não ácido nucléico ou polipeptí-deos conhecidos na técnica como moléculas "de tipo Bcl-2" (por exemplo,empregando agentes de ligação específicos para (por exemplo, imunoreativocom) Bcl-2, mas não reativos com moléculas de tipo de Bcl-2), tais comoaquelas descritas em Ruben e outros, no pedido de patente U.S.2002/0106731 A1, publicado em 8 de agosto de 2002, que é incorporadoaqui por referência em sua totalidade.
Os termos "indivíduo" e "paciente" são usados intercambeavel-mente aqui para referir-se a um animal de sangue quente, tal como um ma-mífero, que pode ser afligido com câncer. Em alguns câncers, o indivíduo éuma fêmea de mamífero humana ou não humana. Em outros cânceres, oindivíduo é um macho de mamífero humano ou de não humano.
Agentes que são capazes de detectar Bcl-2 nas amostras bioló-gicas de indivíduos são aqueles que interagem ou ligam com o polipeptídode Bcl-2 ou a molécula de ácido nucléico que codifica Bcl-2. Exemplos detais agentes (também chamado aqui de agentes de ligação) incluem, masnão são limitados a, anticorpos de Bcl-2 ou seus fragmentos que ligam Bcl-2,padrões de ligação de Bcl-2, e moléculas de ácido nucléico que hibridizampara dar moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos de Bcl-2.De preferência, o agente de ligação é marcado com uma substância detec-tável (por exemplo, uma porção detectável). O agente de ligação pode elepróprio funcionar como um rótulo.
Anticorpos de Bcl-2
Anticorpos específicos para Bcl-2 que são usados nos métodosda invenção podem ser obtidos a partir de fontes científicos ou comerciais.Alternativamente, Bcl-2 recombinante ou Bcl-2 nativo isolado pode ser utili-zado para preparar anticorpos, anticorpos monoclonais ou policlonais efragmentos imunologicamente ativos (por exemplo, um fragmento de Fab oude (Fab)2), uma cadeia pesada de anticorpo, uma cadeia leve de anticorpo,anticorpos humanizados, uma moléculas de Fv de cadeia simples genetica-mente engenheirada (Ladne e outros, patente U.S. Nq 4.946.778), ou umanticorpo quimérico, por exemplo, um anticorpo que contém a especificidadede ligação de um anticorpo de camundongo, mas em que as porções restan-tes são de origem humana. Anticorpos incluindo anticorpos monoclonais oupoliclonais, fragmentos e quimeras, podem ser preparados usando-se méto-dos conhecidos por aqueles versados na técnica. De preferência, anticorposusados nos métodos da invenção são reativos contra Bcl-2 se eles se ligamcom um Ka de mais do que ou igual a 107 M. Em um imunoensaio tipo san-duíche da invenção, anticorpos policlonais de camundongo e anticorpos po-liclonais de coelho são utilizados.
A fim de produzir anticorpos monoclonais, um mamífero hospe-deiro é inoculado com um peptídeo ou proteína de Bcl-2 e então é reforçado.Baços são coletados a partir de mamíferos inoculados alguns dias depois doreforço final. Suspensão de células oriundas dos baços são fundidas comuma célula de tumor de acordo com o método geral descrito por Kohler andMilstein (Náture, 1975, 256:495-497). A fim de ser útil, um fragmento de pep-tídeo pode conter resíduos de aminoácidos suficientes para definir o epitopoda molécula de Bcl-2 a ser detectado.
Se o fragmento for demasiadamente curto para ser imunogênico,ele pode ser conjugado com uma molécula de veículo. Algumas moléculasde veículo adequadas incluem hemocianina "keyhole limpet" e albumina desoro bovino. Conjugação pode ser realizada por métodos conhecidos natécnica. Um tal método é combinar um resíduo de cisteína do fragmento comum resíduo de cisteína na molécula de veículo. Os fragmentos de peptídeopodem ser sintetizados por métodos conhecidos na técnica. Alguns métodosadequados são descritos por Stuart and Young in "Solid Phase Peptide Syn-thesis," segunda edição, Pierce Chemical Company (1984).
Purificação dos anticorpos ou fragmentos podem ser realizadaspor uma variedade de métodos conhecidos por aqueles versados incluindo,precipitação por sulfato de amônio ou sulfato de sódio seguido por diálisecontra solução salina, cromatografia de troca de íons, cromatografia por afi-nidade ou por imunoafinidade bem como filtração de gel, eletroforese de zo-na, etc. (Goding in, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, 2- ed.,pp. 104-126, Orlando, Fla., Academic Press). É preferível usar anticorpospurificados ou fragmentos purificados dos anticorpos tendo pelo menos umaporção de uma região de ligação de Bcl-2, incluindo tal como fragmento deFab1 Fv, F(ab')2 (Harlow and Lane, 1988, Antibody Cold Spring Harbor) paraa detecção de Bcl-2 em fluidos de pacientes com câncer ginecológico ouaqueles em risco, de preferência na urina ou sangue de pacientes com cân-cer ovariano.
Para o uso em detecção e/ou monitoração de câncer, os anti-corpos purificados podem ser covalentemente ligados, ou diretamente ou vialigador, a um composto que serve como um grupo repórter para permitir de-tecção da presença de Bcl-2. Uma variedade de diferentes tipos de substân-cias pode servir como o grupo repórter, incluindo mas não limitado a enzi-mas, corantes, isótipos de metal radioativos, e de não metais, compostosfluorogênicos, compostos fluorescentes, etc. Métodos para a preparação deconjugados de anticorpo dos anticorpos (ou seus fragmentos) da invençãoúteis para a detecção, monitoração são descritos nas patentes U.S. N2S4.671.958; 4.741.900 e 4.867.973.
Em um aspecto da invenção, epitopos preferidos podem ser i-dentificados de uma seqüência de genes Bcl-2 conhecida e sua seqüênciade aminoácidos codificada e usados para gerar anticorpos de Bcl-2 com altaafinidade de ligação. Também, identificação de epitopos de ligação no Bcl-2pode ser usada no projeto e construção de anticorpos preferidos. Por exem-pio, um DNA que codifica um epitopo preferido no Bcl-2 pode sr recombinan-temente expresso e usado para selecionar um anticorpo que se liga seleti-vamente àquele epitopo. Os anticorpos selecionados então são expostos àamostra sob condições suficientes para permitir ligação específica do anti-corpo ao epitopo de ligação específico no Bcl-2 e a quantidade de complexoformada então detectada. Metodologias de anticorpo específicas são bem-conhecidas e descritas na literatura. Uma descrição mais detalhada de suapreparação pode ser encontrada, por exemplo, em Practical Immunology,Butt, W. R., ed., Mareei Dekker, New York, 1984.
A presente invenção também contempla a detecção de anticor-pos de Bcl-2. Bcl-2 é um marcador específico de câncer ginecológico. Assim,detecção de anticorpos de Bcl-2 em fluidos biológicos de um indivíduo podepermitir o diagnóstico de câncer ginecológico.
Ensaios de proteína de ligação
Anticorpos especificamente reativos com Bcl-2 ou derivados, taiscomo conjugados de enzima ou derivados marcados, podem ser usados pa-ra detectar Bcl-2 em várias amostras biológicas, por exemplo, eles podemser usadas em quaisquer imunoensaios conhecidos que contam com a inte-ração de ligação entre um determinante antigênico de uma proteína e osanticorpos. Exemplos de tais ensaios são radioimunoensaios, imunoensaiode enzima (por exemplo, ELISA), imunofluorescência, imunoprecipitação,aglutinação por látex, hemaglutinação e testes histoquímicos.
Um anticorpo específico para Bcl-2 pode ser marcado com umasubstância detectável e localizado em amostras biológicas com base na pre-sença da substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis inclu-em, mas não são limitadas aos radioistótopos (por exemplo, 3H, 14C, 35S,125I, 131I), rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos delantanídeo) rótulos Iuminescentes tal como luminol; rótulos enzimáticos (porexemplo, peroxidase de rábano picante, beta-galactosidase, fosfatase alcali-na, acetilcolinesterase), grupos biotinila (que podem ser detectados por avi-dina marcada, por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluores-cente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos óticos oucalorimétricos), epitopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos porum repórter secundário (por exemplo, seqüências de par de zíper de leucina,sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal,marcadores de epitopo). Métodos indiretos podem também ser empregadosem que a reação de anticorpo-antígeno primário é ampliada pela introduçãode um anticorpo secundário, tendo especificidade para o anticorpo reativocontra Bcl-2. A título de exemplo, se o anticorpo tendo especificidade contraBcl-2 é um anticorpo de IgG de coelho, o segundo anticorpo pode ser gama-globulina de anticoelho de cabra marcado com uma substância detectávelcomo descrito aqui.
Métodos para a conjugação ou marcação dos anticorpos discuti-dos acima podem ser prontamente realizados por aquele versado na técnica.(Vide, por exemplo, lmman, Methods In Enzymology, Vol. 34, Affinity Tech-niques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wichek (eds.), AcademicPress, New York, p. 30, 1974; and Wilchek and Bayer, "The Avidin-BiotinComplex in Bioanalytical Applications," Anal. Biochem. 171:1-32, 1988, emrelação a métodos para a conjugação ou marcação dos anticorpos com umaenzima ou par de ligação de ligante).
Fluorometria resolvida no tempo pode ser usada para detectarum sinal. Por exemplo, o método descrito em Christopoulos T.K. and Dia-mandis E.P., Anal. Chem., 1992:64:342-346 pode ser usado com um fluorô-metro resolvido no tempo convencional.
Portanto, de acordo com uma concretização da invenção, ummétodo é provido em que um anticorpo de Bcl-2 é marcado com uma enzi-ma, um substrato para a enzima é adicionado em que o substrato é selecio-nado de modo que o substrato ou um produto de reação da enzima e subs-trato, forme complexos fluorescentes com um metal de lantanídeo. Um metalde lantanídeo é adicionado e Bcl-2 é quantificado na amostra por mediçãode fluorescência dos complexos fluorescentes. Os anticorpos específicospara Bcl-2 podem ser diretamente ou indiretamente marcados com uma en-zima. Enzimas são selecionados com base na capacidade de um substratoda enzima, ou um produto de reação da enzima e do substrato, para com-plexar com metais de lantanídeo tais como európio e térbio. Exemplos deenzimas adequadas incluem fosfatase alcalina e beta-glactosidase. De pre-ferência, a enzima é fosfatase alcalina. Os anticorpos de Bcl-2 podem tam-bém ser indiretamente marcados com uma enzima. Por exemplo, os anticor-pos podem ser conjugados com um par de um par de ligação de ligante, e aenzima pode ser acoplada com outro par do par de ligação de ligante. E-xemplos representativos incluem avidina-biotina, e proteína de ligação deriboflavina-riboflavina. De preferência os anticorpos são biotinilados, e a en-zima é acoplada à estreptavidina.
Em uma concretização do método, anticorpo ligado a Bcl-2 emuma amostra é detectado por adição de um substrato para a enzima. Osubstrato é selecionado de modo que na presença de um metal de lantaní-deo (por exemplo, európio, térbio, samário, e disprósio, de preferência euró-pio e térbio), o substrato ou um produto de reação da enzima e do substrato,forma um complexo fluorescente com o metal de lantanídeo. Exemplos deenzimas e substratos para enzimas que provêem tais complexos fluorescen-tes são descritos na patente U.S. Nq 5.3112.922 pro Diamandis. A título deexemplo, quando o anticorpo é diretamente ou indiretamente marcado comfosfatase alcalina, o substrato empregado no método pode ser fosfato de 4-metilumbeliferila ou fosfato de 5-fluorpsalicila. A intensidade de fluorescênciados complexos é tipicamente medida usando-se um fluorômetro resolvido notempo, por exemplo, um Imunoanalisador CyberFIuor 615 (Nordion Internati-onal, Kanata Ontario).
A amostra, anticorpo específico para Bcl-2, ou Bcl-2, pode serimobilizado em um veículo. Exemplos de veículos adequados são agarose,celulose, dextrano, Sephadex, Sepharose, lipossomas, carboximetil celulosepoliestireno, papel de filtro, resina de troca de íon, película plástica, tuboplástico, contas de vidro, copolímero de ácido poliamina-metil éter vinil-maléico, copolímero de aminoácido, copolímero de ácido etileno-maléico,nylon, seda etc. O veículo pode estar na forma de, por exemplo, um tupo,placa de teste, cavidade, contas, disco, esfera, etc. O anticorpo imobilizadopode ser preparado por reação do material com um veículo insolúvel usan-do-se métodos químicos ou físicos, por exemplo, acoplamento de brometode cianogênio.
De acordo com uma concretização, a presente invenção provêum modo para a determinação de Bcl-2 em uma amostra apropriada tal co-mo urina por medição de Bcl-2 por imunoensaio. Será evidente por aqueleversado que uma variedade de métodos de imunoensaio pode ser usadapara medir Bcl-2. Em geral, um método de imunoensaio de Bcl-2 pode sercompetitivo ou não competitivo. Métodos competitivos tipicamente empre-gam um anticorpo imobilizado ou imobilizável em Bcl-2 (anti-Bcl-2) e umaforma marcada de Bcl-2. Bcl-2 de amostra e Bcl-2 marcado competem paraa ligação a anti-Bcl-2. Depois da separação do Bcl-2 marcado resultante quese tornou ligado a anti-Bcl-2 (fração ligada) daquilo que permaneceu nãoligado (fração não ligada), a quantidade do rótulo ou fração ligada ou nãoligada é medida e pode estar correlacionada com a quantidade de Bcl-2 naamostra biológica de qualquer modo, por exemplo, por comparação comuma curva-padrão.
De preferência, um método não competitivo è usado para a de-terminação de Bcl-2, com o método mais comum sendo o método de "san-duíche". Nesse ensaio, dois anticorpos de anti-Bcl-2 são empregados. Umdos anticorpos de anti-Bcl-2 está diretamente ou indiretamente marcado(também chamado do "anticorpo de detecção") e o outro é imobilizado ouimobilizável (também chamado do "anticorpo de captura"). Os anticorpos decaptura e detecção podem ser postos em contato simultaneamente ou se-qüencialmente com a amostra biológica. Métodos seqüenciais podem serrealizados por incubação do anticorpo de captura com a amostra, e adiçãodo anticorpo de detecção a um tempo predeterminado depois disso (algu-mas vezes chamado do método "avançado"); ou anticorpo de detecção podeser incubado com a amostra primeiramente e então o anticorpo de capturaadicionado (algumas vezes chamado do método "reverso"). Depois que a(s)incubação(ões) necessária(s) ocorrereu(am), para completar o ensaio, o an-ticorpo de captura é separado da mistura de teste líquida, e o rótulo é medi-do em pelo menos uma porção da fase de anticorpo de captura separada ouo restante da mistura de teste líquida. Em geral, é medida na fase de anti-corpo de captura uma vez que compreende Bcl-2 ligado pelos anticorpos decaptura e deteção (entre intercalados).Em um ensaio imunométrico de dois sítios para Bcl-2, um ouambos dos anticorpos de captura e de detecção são anticorpos policlonais.O rótulo usado no anticorpo de detecção pode ser selecionado de qualquerum daquelee conhecidos convencionalmente na técnica. Como com outrasconcretizações do ensaio de detecção de proteína, o rótulo pode ser umaenzima ou uma porção quimioluminescente, por exemplo, um isótopo radioa-tivo, uma fluorofora, um Iigante detectável (por exemplo, detectável por umaligação secundária por um par de ligação marcado para o ligante) e simila-res. De preferência, o anticorpo é marcado com uma enzima que é detecta-da por adição de um substrato que é selecionado de modo que um produtode reação da enzima e do subrato forme complexos fluorescentes. O anti-corpo de captura é selecionado de modo que ele proveja um modo para serseparado do restante da mistura de teste. Correspondentemente, o anticorpode captura pode ser introduzido ao ensaio em uma forma já imobilizada ouinsolúvel, ou pode estar em uma forma imobilizável, isto é, uma forma quepermita que a imobilização seja realizada subseqüente a introdução do anti-corpo de captura para dentro do ensaio. Um anticorpo de captura imobiliza-do pode compreender um anticorpo covalentemente ou não covalentementeligado a uma fase sólida tal como uma partícula magnética, uma partícula delátex, um placa de múltiplas cavidades de microtítulo, uma conta, uma cube-ta, ou outros recipientes de reação. Um exemplo de um anticorpo de capturaimobilizável é um anticorpo que foi quimicamente modificado com uma por-ção de ligante, por exemplo, um hapteno, biotina ou similares, e que podeser subsrefere-semente imobilizado por contato com uma forma imobilizadade um par de ligação para o ligante, por exemplo, um anticorpo, avidina ousimilares. Em uma concretização, o anticorpo de captura pode ser imobiliza-do usando-se um anticorpo específico de espécie para o anticorpo de captu-ra que está ligado à fase sólida.
Um método de imunoensaio de tipo sanduíche particular da in-venção emprega dois anticorpos reativos contra Bcl-2, um segundo anticor-po tendo especificidade contra um anticorpo reativo contra Bcl-2 marcadocom um rótulo enzimático, e um substrato fluorogênico para a enzima. Emuma concretização, a enzima é fosfatase alcalina (ALP) e o substrato é fos-fato de 5-fluorossalicila. ALP cliva fosfato para fora do substrato fluorogêni-co, fosfato de 5-fluorossalicila, para produzir ácido 5-fluorossalicílico (FSA).Ácido 5-fluorossalicílico pode então formar um complexo ternário altamentefluorescente da forma FSA-Tb(3+)-EDTA, que pode ser quantificado por me-dir a fluorescência de Tb+3 em um modo resolvido no tempo. Intensidade defluorescência é tipicamente medida usando-se uma fluorometria resolvida notempo como descrito aqui.
Pretende-se que os métodos e formatos de imunoensaio descri-tos acima sejam exemplares e não sejam Iimitantes uma vez que, em geral,será entendido que qualquer formato ou método de imunoensaio pode serusado na presente invenção.
Os métodos, dispositivos e kits de detecção de proteína da in-venção podem utilizar tecnologia de sensor de nanocondutor (Zhen e outros,Nature Biotechnology, 2005, 23(10): 1294-1301; Lieber e outros, Anal.Chem., 2006, 78(13):4260-4269, que são incorporados aqui por referência)ou tecnologia de microcantiléver (Lee e outros, Biosens. Bioelectron, 2005,20(10):2157-2162; Wee e outros, Biosens. Bioelectron., 2005, 20(10): 1932-1938; Campbell and Mutharasan, Biosens. Bioelectron., 2005, 21(3):462-473; Campbell and Mutharasan, Biosens. Bioelectron., 2005, 21(4):597-607;Hwang e outros, Lab Chip, 2004, 4(6):547-552; Mukhopadhyay e outros, Na-no. Lett., 2005, 5(12):2835-2388, que são incorporados aqui por referência)para detecção de Bcl-2 em amostras. Além disso, Huang e outros descre-vem um imunoensaio de antígeno específico para próstata em um biossen-sor de ressonância de plasmônio superficial comercialmente disponível (Bio-sens. Bioelectron., 2005, 21 (3):483-490, que é incorporado aqui por referên-cia) que pode ser adaptado para detecção de Bcl-2. Imunoensaios miniaturi-zados de alta sensibilidade podem também ser utilizados para detecção deBcl-2 (Cesaro-Tadic e outros, Lab Chip, 2004, 4(6):563-569; Zimmerman eoutros, Biomed. Microdevices, 2005, 7(2):99-110, que são incorporados aquipor referência).Ácidos nucléicos
Ácidos nucléicos incluindo ácidos nucléicos de ocorrência natu-ral, oligonucleotídeos, oligonucleotídeos anti-sentido e oligonucleotídeos sin-téticos que hibridizam para dar o ácido nucléico que codifica Bcl-2, são úteiscomo agentes para detectar a presença de Bcl-2 nas amostras biológicas depacientes com câncer de próstata ou aqueles em risco de câncer ginecológi-co, de preferência na urina de pacientes com câncer ovariano ou aqueles emrisco de câncer ovariano. A presente invenção contempla o uso de seqüên-cias de ácidos nucléicos que corresponde à seqüência de codificação deBcl-2 e à sua seqüência complementar, bem como seqüências complemen-tares às seqüências de transcrito de Bcl-2 que ocorrem ulteriormente a mon-tante ou a jusante da seqüência de codificação (por exemplo, seqüênciascontidas em, ou estendendo para dentro das regiões não traduzidas 5'e 3')para o uso como agentes para a detecção da expressão de Bcl-2 nas amos-tras biológicas de pacientes com câncer ginecológico, ou aqueles em riscode câncer ginecológico, de preferência na urina de pacientes com câncerovariano ou aqueles em risco de câncer ovariano.
Os oligonucleotídeos preferidos para a detecção da presença deBcl-2 em amostras biológicas são aqueles que são complementares a pelomenos parte da seqüência de cDNA que codifica Bcl-2. Essas seqüênciascomplementares são também conhecidas na técnica como "seqüências anti-sentido". Esses oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos ou oligode-soxirribonucleotídeos. Além disso, oligonucleotídeos podem ser oligômerosnaturais constituídos dos nucleotídeos biologicamente significativos, isto é, A(adenina), dA (desoxiadenina), G (guanina), dG (desoxiguanina), C (citosi-na), dC (desoxicitosina), T (timina) e U (uracila) ou espécie de oligonucleotí-deos modificado, usando como substituto, por exemplo, um grupo metila ouum átomo de enxofre para um oxigênio de fosfato na ligação de fosodiésterde internucleotídeo. Adiconalmente1 esses próprios nucleotídeos, e/ou asporções de ribose podem ser modificados.
Os oligonucleotídeos podem ser sintetizados quimicamente, u-sando-se qualquer um dos métodos de síntese de oligonucleotídeo químicasconhecidas bem-descritas na técnica. Por exemplo, os oligonucleotídeospodem ser preparados por uso de qualquer um dos sintetizadores de ácidonucléico automatizados, comercialmente disponíveis. Alternativamente, osoligonucleotídeos podem ser criados por técnicas de DNA recombinante pa-drão, por exemplo, indução da transcrição do filamento de não codificação. Aseqüência de DNA que codifica Bcl-2 pode ser invertida em um sistema deDNA recombinante, por exemplo, inserida em orientação inversa a jusantede um promotor adequado, de modo que o filamento de não codificação ago-ra seja transcrito.
Embora qualquer comprimento de oligonucleotídeo possa serutilizado para hibridizar para dar ácido nucléico que codifica Bcl-2, oligonu-cleotídeos tipicamente dentro da faixa de 8-100 nucleotídeos são preferidos.Oligonucleotídeos mais preferíveis para o uso na detecção de Bcl-2 em a-mostra de urina são aqueles dentro da faixa de 15-20 nucleotídeos.
o oligonucleotídeo selecionado para hibridizar para molécula deácido nucléico de Bcl-2, se sintetizado quimicamente ou por tecnologia deDNA recombinante, é então isolado e purificado usando-se técnicas-padrãoe então de preferência é marcado (por exemplo, 35S ou 32P) usando-se pro-tocolos de marcação padrão.
A presente invenção também contempla o uso de pares de oli-gonucleotídeos nas reações de cadeia polimerase (PCR) para detectar aexpressão de Bcl-2 em amostras biológicas. Os pares de oligonucleotídeosincluem um inciador de Bcl-2 avante e um iniciador de Bcl-2 reverso.
A presença de Bcl-2 em uma amostra oriunda de um pacientepode ser determinada por hibridização do ácido nucléico, tal como, mas nãolimitada a análise de Northern blot, dot blotting, análise de Southern blot,hibridização in situ de fluorescência (FISH), e PCR. Cromatografia, de prefe-rência HPLC, e outros ensaios conhecidos podem também ser usados paradeterminar níveis de RNA mensageiro de Bcl-2 em uma amostra.
As moléculas de ácido nucléico que codificam Bcl-2 concebivel-mente podem ser encontradas nos fluidos biológicos dentro da célula decâncer positiva a Bcl que está sendo espalhada ou liberada no fluido sobinvestigação.
Em um aspecto, a presente invenção contempla o uso de ácidosnucléicos como agentes para a detecção de Bcl-2 em amostras biológicasde pacientes, ém que os ácidos nucléicos são marcados. Os agentes nucléi-cos podem ser marcados com um rótulo radioativo, um rótulo fluorescente,uma enzima, um marcador quimioluminescente, um marcador colorimétricoou outros rótulos ou marcadores que são discutidos acima ou que são co-nhecidas na técnica.
Em um outro aspecto, a presente invenção contempla o uso deanálise de Northen blot para detectar a presença de mRNA de Bcl-2 em umaamostra de fluido de corpo. A primeira etapa dá análise envolve a separaçãode uma amostra contendo ácido nucléico de Bcl-2 por eletroforese de gel.Os ácidos nucléicos dispersos são então transferidos para um filtro de nitro-celulose ou um outro filtro. Subsqüentemente, o oligonucleotídeo marcado éexposto ao filtro sob condições de hibridização adequadas, por exemplo,50% de formamida, 5 χ SSPE, 2 χ solução de Denhardfs, 0,1% de SDS a42° C., como descrito em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatise outros (1982, CSH Laboratory). Outros procedimentos úteis conhecidos natécnica incluem hibridização de solução, hibridização de RNA de slot e dot, emicroensaios com base em sonda. Medição da radioatividade de fragmentoshibridizados, usando-se procedimentos-padrão conhecidos na técnica quan-tifica a quantidade de ácido nucléico de Bcl-2 presente no fluido biológico deum paicente.
Dot blotting envolve a aplicação das amostras contendo o ácidonucléico de interesse a uma membrana. O ácido nucléico pode ser desnatu-rado antes ou depois da aplicação à membrana. A membrana é incubadacom uma sonda rotulada. Procedimentos de Dot blot são bem-conhecidospelo técnico versado e são descritos mais totalmente nas patentes U.S. NeS4.582.789 e 4.617.261, cujas descrições são incorporados aqui por referên-cia.
Reação de cadeia polimerase (PCR) é um processo para a am-pliação de uma ou mais seqüências de ácidos nucléicos específicas presen-tes em uma amostra de ácido nucléico usando-se iniciadores e agentes paraa polimerização e então a detecção da seqüência ampliada. O produto deextensão de um iniciador quando hibridizado para dar outro torna-se o mo-delo para a produção da seqüência de ácidos nucléicos específicos deseja-dos, e vice-versa, e o processo é repetido tão freqüentemente quanto é ne-cessário para produzir a quantidade desejada da seqüência. O técnico ver-sado para detectar a presença da seqüência desejada (patente U.S. Ns4.683.195) rotineiramente usa reação de cadeia de polimerase.
Um exemplo específico de PCR que é rotineiramente realizadopelo técnico versado para detectar seqüências desejadas é PCR de transcri-to reverso (RT-PCR; Saiki e outros, Science, 1985, 230:1350; Scharf e ou-tros, Science, 1986, 233:1076). RT-PCR envolve o isolamento do RNA totaldo fluido biológico, desnaturação do RNA ná presença de iniciadores quereconhecem a seqüência de ácidos nucléicos desejada, usando-se os inicia-dores para gerar uma cópia de cDNA do RNA pela transcrição reversa, am-pliação do cDNA por PCR usando-se iniciadores específicos, e detecção docDNA ampliado por eletroforese ou outros métodos conhecidos pelo técnicoversado.
Em uma concretização preferida, os métodos de detecção deácido nucléico de Bcl-2 em fluidos biológicos por pacientes com câncer gine-cológico ou aqueles em risco do mesmo, de preferência urina de pacientescom câncer ovariano ou aqueles em risco do mesmo, incluem análise deNorthern blot, dot blotting, análise de Southern blot, FISH, e PCR.Dispositivos
Os métodos da invenção podem ser realizados em um suportesólido. Os suportes sólidos podem ser aqueles que são convencionais paraa finalidade de análise de um análito em uma amostra biológica, e são tipi-camente construído de materiais tal como celulose, polissacarídeo tais comoSephadex e similares, e podem ser parcialmente envolvidos por uma cober-tura para a proteção e/ou manipulação do suporte sólido. O suporte sólidopode ser rígido, semi-rígido, flexível, elástico (tendo memória de forma), etc.dependendo da aplicação desejada. Bcl-2 pode ser detectado em uma a-mostra in vivo ou in vitro (ex vivo). Quando, de acordo com uma concretiza-ção, a quantidade de Bcl-2 em uma amostra deve ser determinada sem re-mover a amostra do corpo (isto é, ex vivo), o suporte seriam um que é ino-fensivo ao indivíduo e pode estar em qualquer forma conveniente para a in-serção para dentro da parte apropriada do corpo. Por exemplo, o suportepode ser uma sonda produzida de politetrafluoroetileno, poliestireno ou outromaterial plástico inofensivo rígido e tendo um tamanho e forma para permitirque ele seja introduzido para dentro de um indivíduo. A seleção de um su-porte de inserto apropriado está dentro da competência daqueles versadosna técnica, como são suas dimensões para a finalidade pretendida.
Uma etapa de contato no ensaio (método) da invenção podeenvolver o contato, combinação ou misturação da amostra biológica e dosuporte sólido, tal como um recipiente, microrecipiente, tubo, microtubo, ca-vidade, placa de múltiplas camadas ou outro suporte sólido de reação. Emuma concretização da invenção, o suporte sólido a ser posto em contatocom a amostra biológica (por exemplo, urina) tem uma membrana ou almo-fada absorvente para fluxo lateral do meio líquido a ser analisado, tais comoaquelas disponíveis de Millipore Corp. (Bedford, MA), incluindo mas não limi-tados a membranas Hi-Flow Plus® e cartões de membrana, e materiais dealmofada SureWick®.
O dispositivo de diagnóstico útil na realização dos métodos dainvenção pode ser construído de qualquer forma adaptado para o uso pre-tendido. Assim, em uma concretização, o dispositivo da invenção pode serconstruído como uma vareta ou tira de teste reusável ou descartável paraser posta em contato com uma amostra biológica tal como urina ou sanguepara o qual o nível de Bcl-2 deve ser determinado. Em uma outra concreti-zação, o dispositivo pode ser construído usando-se técnicas de fabricaçãoem microescala reconhecidas na técnica para produzir concretizações detipo agulha capaz de ser implantada ou injetada para dentro de um sítio ana-tômico, tal como a cavidade peritoneal, para intumescimento de aplicaçõesde diagnóstico. Em outras concretizações, os dispositivos pretendidos parauso repetido pode ser construído na forma de uma sonda alongada.Em concretizações preferidas, os dispositivos da invenção com-preendem um suporte sólido (tal como um tira ou vareta de mergulhamento),com uma superfície que funcione como uma matriz de fluxo lateral definindouma trajetória de fluxo para uma amostra biológica tais como urina, sanguetotal, soro, plasma, fluido peritoneal ou ascites.
Ensaios imunocromatográficos, também conhecidos como tirasde teste de fluxo lateral ou simplismente testes de tira, para a detecção devários análitos de interesse, foram conhecidos por algum tempo, e podemser usados para a detecção de Bcl-2. Os benefícios de testes de fluxo lateralincluem um formato favorável ao usuário, resultados rápidos, estabilidade delongo prazo sobre uma ampla faixa de ctimas.e custo relativamente baixopara fabricar. Essas características produzem testes de fluxo lateral idealpara aplicações que envolvem testagem em casa, ponto rápido de testagemcuidadosa, e testagem no campo quanto a vários análitos. O pricípio por trásdo teste é evidente. Essencialmente, qualquer Iigante que possa ser ligado aum suporte sólido visualmente detectável, tais como microesferas tingidas,pode ser testado quanto á, qualitivamente, e em muitos casos ainda semi-quantitivamente. Por exemplo, uma imunotira de fluxo lateral de uma etapapara a detecção dê antígeno específico de próstata total e livre no soro édescrita em Fernandez-Sanchez e outros (J. Immuno. Methods, 2005, 307(1 -2): 1-12, que é incorporado aqui por referência) e pode ser adaptado para adetecção de Bcl-2 em uma amostra biológica tal como sangue ou urina.
Alguns dos ensaios imunocromatográficos mais comuns atual-mente no mercado são testes para gravidez (como um kit de teste vendidono balcão (OTC)), garganta Strep, e Clamídia. Muitos novos testes para an-tígenos bem-conhecidos foram recentemente desenvolvidos usando-se ométodo de ensaio imunocromatográfico. Por exemplo, o antígeno para acausa mais comum de pneumonia adquirida na comunidade era conhecidadesde 1917, mas um ensaio simples foi desenvolvido apenas recentemente,e isso foi feito usando-se essa método de tira de teste simples (Murdoch,D.R. e outros J Clin Microbiol, 2001, 39:3495-3498). Vírus da imunodeficiên-cia humana (HIV) foi detectado rapidamente em sangue combinado usando-se um ensaio similar (Soroka, S.D. e outros J Clin Virol, 2003, 27:90-96). Umcartão de membrana de nitrocelulose também foi usado para diagnosticaresquistossomíase por detecção do movimento e ligação de nanopartículasde carbono (van Dam, G.J. e outros J Clin Microbioll 2004, 42:5458-5461).
As duas abordagens comuns para o ensaio imunocromatográficosão os esquemas de reação não competitiva (ou direto) ou competitiva (ouinibição competitiva) (TechNote N5 303, Rev. Ns 001, 1999, Bangs Laborato-ries, Inc., Fishers, IN). O formato direto (sanduíche de anticorpo duplo) é tipi-camente usado quando testagem quanto a análitos maiores com sítios anti-gênicos múltiplos tais como hormônio de luteinização (LH), gonadotropinacoriônica humana (hCG), e HIVi Nesse caso, menos do que um excesso deanálito de amostra é desejado, de modo que algumas das microesferas nãoserão capturadas na linha de captura, e continuará fluir na direção da se-gunda linha de anticorpo imobilizados, a zona de controle. Essa linha decontrole usa anticorpos de antiimunoglobulina específicos de espécie, espe-cíficos para os anticorpos conjugados nas microesferas. Antígeno livre, sepresente, é introduzido sobre o dispositivo por adição de amostra (urina, so-ro, etc.) sobre uma almofada de adição de amostra. Antígeno livre então seliga a complexos de anticorpo-microesfera. Anticorpo 1, específico para epi-topo 1 do antígeno da amostra, é acoplado a microesferas de corante e éseco sobre o dispositivo. Quando a amostra é adicionada, complexo de mi-croesfera-ánticorpo é reiidratado e é transportado para uma zona de capturae linhas de controle por líquido. Anticorpo 2, específico para um segundosítio antigênico (epitopo 2) do antígeno de amostra, é seco sobre uma mem-brana na linha de captura. Anticorpo 3, um anticorpo de antiimunoglobulina,específico de espécie que reagirá com o anticorpo 1, é seco sobre umamembrana na linha de controle. Se antígeno estiver presente na amostra(isto é, um teste positivo), ligará por seus dois sítios antigênicos, a tanto an-ticorpo 1 (conjugado com microesferas) e anticorpo 2 (seco sobre a mem-brana na linha de captura). Microesferas revestidas com anticorpo 1 são li-gadas pelo anticorpo 3 na linha de controle, se antígeno está presente ounão. Se antígeno não estiver presente na amostra (um teste negativo), mi-croesferas passam na linha de captura sem ficar aprisionadas mas são cap-turadas pela linha de controle.
O esquema de reação competitiva é tipicamente não usadoquando testagem quanto a células pequenas com determinantes antigênicossimples, que não podem estar ligadas a dois anticorpos simultaneamente.Como com ensaio de tipo sanduíche de anticorpo duplo, livre de antígeno,se presente for introduzido sobre o dispositivo por adição de amostra sobreuma almofada de amostra. Antígeno livre presente na amostra se liga a umcomplexo de anticorpo-microesfera. Anticorpo 1 é específico para antígenode amostra e acoplam às microesferas pigmentadas. Um conjugado de mo-lécula de antígeno-veículo (tipicamente BSA) é seco sobre uma membranana linha de captura. Anticorpo 2 (Ab2) é seco sobre a membrana na linha decontrole e é uma antiimunoglobulina específica de espécie que capturará aspartículas de reagente e confirmam que o teste está completo. Se antígenoestiver presente na amostra (um teste positivo), anticorpo nas microesferas(Ab1) já saturado com antígeno a partir da amostra e, portanto, conjugadode antígeno ligado na linha de captura não se liga a ele. Quaisquer microes-feras não capturadas pela molécula de veículo de antígeno podem ser cap-turadas pelo Ab2 na linha de controle. Se antígeno estiver presente na a-mostra (um teste negativo), microesferas secas revestidas com anticorposão deixadas que sejam capturadas por cojugado de antígeno ligado na li-nha de captura.
Normalmente, as membranas usadas para manter os anticorposno lugar nesses dispositivos são produzidas de materiais hidrofóbicos primá-rios, tal como nitrocelulose. Tanto as microesferas usadas como os suportesde fase sólida quanto os anticorpos de conjugado são hidrofóbicos, e suainteração com a membrana permite-os que sejam eficamente secos sobre amembrana.
Amostras e/ou agentes de ligação específicos de Bcl-2 podemser dispostos no suporte sólidos, ou múltiplos suportes podem ser utilizados,para análise ou detecção multíplex. "Disposição" refere-se à ação de organi-zação ou disposição de membros de uma biblioteca (por exemplo, um con-junto de amostras diferentes ou um conjunto de dispositivos que direcionamas mesmas moléculas-alvo ou moléculas-alvo diferentes), ou outras coleção,em um conjunto lógico ou físico. Assim, um "conjunto" refere-se a uma dis-posição física òu lógica de, por exemplo, amostras biológicas. Um conjuntofísico pode ser qualquer "formato espacial" ou "formato fisicalmente de gra-de" em que manifestações físicas de membros de biblioteca corresponden-tes são dispostos de um modo ordenado, levando ele próprio a triagemcombinatória Por exemplo, amostras correspondentes a membros combina-dos ou individuais de uma biblioteca de amostra podem ser dispostas emuma série de fileiras e colunas, por exemplo, em uma placa de múltiplas ca-vidades. Similarmente, agentes de ligação podem ser laminados ou de outramaneira depositados em placas (ou bandejas) microtituladas, por exemplo,96 cavidades, 384 cavidades ou 1536 cavidades. Opcionalmente, agentesde ligação específicos de Bcl-2 podem ser imobilizados no suporte sólido.
Detecção de Bcl-2 e biomarcadores de câncer e outros ensaiosque devem ser realizados nas amostras, podem ser realizados simultanea-mente ou seqüencialmente com a detecção de outras moléculas-alvo, e po-dem ser realizados em uma forma automática, em um formato de alta capa-cidade de produção.
Os agentes de ligação específicos de Bcl-2 podem ser deposita-dos mas "livres" (não imobilizados) na zona de conjugado/e ser imobilizadosna zona dé captura de um suporte sólido. Os agentes de ligação específicosde Bcl-2 podem ser imobilizados por adsorção não específica sobre o supor-te ou por ligação covalente ao suporte, por exemplo. Técnicas para a imobi-lização de agentes de ligação nos suportes são conhecidas na técnica e sãodescritas, por exemplo, nas patentes U.S. NQs 4.399.217, 4.381.291,4.357.311, 4.343.312 e 4.260.678, que são incorporados aqui por referência.Tais técnicas podem ser usadas para imobilizar os agentes de ligação nainvenção. Quando o suporte sólido é politetrafluoroetileno, é possível acoplaranticorpos de hormônio sobre o suporte por ativação do suporte usando-sesódio e amônia para aminá-los e ligação covalente do anticorpo ao suporteativado por meio de uma reação de cárbodiimida reaction (yon Klitzing, S-chultek, Strasburger, Fricke and Wood in "Radioimmunoassay and RelatedProcedures in Medicine 1982", International Atomic Energy Agency, Vienna(1982), pp. 57-62.).
O dispositivo de diagnóstico da invenção pode utilizar tecnologiade tira de fluxo lateral (LFS), que foi aplicada a numerosos sistemas de en-saio de tira rápidos, tais como tiras de teste de gravidez precoce vendidas nobalcão com base em anticorpos a gonadotropina coriônica humana (hCG).Como com muitos outros dispositivos de diagnóstico, o dispositivo utiliza umagente de ligação para ligar a moléculaalvo (Bcl-2). O dispositivo tem umazona de aplicação para receber uma amostra biológica tal como sangue ouurina, um rótulo contendo zona de marcação que se liga a Bcl-2 na amostra,e uma zona de detecção onde rótulo de Bcl-2 é retido.
Agente de ligação retido na zona de detecção dá um sinal, e osinal difere dependendo de se níveis de Bcl-2 na amostra biológica são me-nores do que, iguais a, ou maiores do que uma dada concentração de limiar.Por exemplo, no caso de Bcl-2 urinário para a detecção de câncer ovariano,a concentração de limiar pode estar entre O ng/ml e 2,0 ng/ml. Em uma outraconcretização, no caso de Bcl-2 urinário para a detecção de câncer ovaria-no, a concentração limiar é de 1,8 ng/ml. Uma amostra oriunda de um indiví-duo tendo um nível de Bcl-2 igual a ou maior do que a dada concentração deBcl-2 de referência pode ser chamada de um "nível de limiar" ou "quantidadede limiar" ou "amostra de limiar". A zona de aplicação no dispositivo é ade-quada para receber a amostra biológica a ser analisada. É tipicamente for-mada a partir de material absorvente tal como papel de blotting. A zona demarcação contém agente de ligação que se liga a qualquer Bcl-2 na amos-tra. Em uma concretização, o agente de ligação é um anticorpo (por exem-plo, anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, fragmento de anticorpo). Pa-ra facilidade de detecção, o agente de ligação está de preferência em asso-ciação com um rótulo que provê um sinal que é visível ao olho nu, por e-xemplo, é marcado com um marcador fluorescente ou uma marcador colori-do tal como ouro coloidal conjugado, que é visível como uma cor rosa.
A zona de detecção retém Bcl-2 ao qual o agente de ligação seligou. Isso tipicamente será alcançado usando-se um agente de ligação imo-bilizado tal como um anticorpo imobilizado. Onde o agente de ligação na zo-na de marcação e a zona de detecção são ambos anticorpos, eles tipica-mente reconhecerão diferentes epitopos na molécula-alvo (proteína de Bcl-2). Isso permite a formação de um "sanduíche" compreendendo anticorpo-Bcl-2-anticorpo.
A zona de detecção está a jusante da zona de aplicação, com azona de marcação tipicamente localizada entre as duas. Uma amostra assimmigrará da zona de aplicação para dentro da zona de marcação, onde qual-quer uma na amostra se liga ao rótulo. Complexos de agente de ligação deBcl-2 continuam a migrar para dentro da zona de detecção juntamente comexcesso de agente de ligação. Quando o complexo de agente de ligação deBcl-2 encontra o reagente de captura, o complexo é retido enquanto a amos-tra e excesso de agente de ligação continuam a migrar. Como níveis de Bcl-2 na amostra aumentam, a quantidade de agente de ligação (na forma decomplexos de agente de ligação de Bcl-2) retida na zona de detecção au-menta proporcionalmente.
Em concretizações preferidas, o dispositivo da invenção tem acapacidade de distinguir entre amostras de acordo com a concentração Iimi-ar. Isso pode ser alcançado de vários modos.
Um tipo de dispositivo inclui uma zona de referência que incluium sinal dé intensidade fixa contra a qual a quantidade de agente de ligaçãoretida na zona de detecção pode ser comparada quando o sinal da zona dedetecção é igual ao sinal na zona de referência, a amostra é uma amostrade limiar; quando o sinal da zona de detecção é menos intenso do que a zo-na de referência, a amostra contém menos Bcl-2 do que uma amostra delimiar; quando o sinal na zona de detecção é mais intenso do que a zona dereferência, a amostra contém mais Bcl-2 do que uma amostra de limiar.
Uma zona de referência adequada pode ser preparada e cali-brada sem dificuldade. Por esse tipo de dispositivo, o agente de ligação emgeral estará presente em excesso a Bcl-2 na amostra, e a zona de referênciapode ser a montante ou, de preferência, a jusante da zona de detecção. Osinal na zona de referência será do mesmo tipo que o sinal na zona de de-tecção, isto é, elas tipicamente serão visíveis ao olho nu, por exemplo, elasusam o mesmo marcador. Uma zona de referência preferida em um disposi-tivo desse tipo compreende proteína imobilizada (por exemplo, albumina desoro bovino) que é marcada com ouro coloidal.
Em um outro dispositivo da invenção, a zona de referência estáa jusante da zona de detecção e inclui um reagente que captura agente deligação (por exemplo, anticorpo de agente de antiligação imobilizado). Agen-te de ligação que flui através do dispositivo não está presente em excesso,mas está a uma concentração tal que 50% dele está ligado por uma amostratendo Bcl-2 na concentração limiar. Em uma amostra de limiar, portanto,50% do agente de ligação serão retidos na zona de detecção e 50% na zonade referência. Se o nível de Bcl-2 na amostra for maior do que em uma a-mostra de limiar, menos do que 50% do agente de ligação alcançarão a zo-na de referência e a zona de detecção dará um sinal mais intenso do que azona de referência; de modo inverso, se o nível de Bcl-2 na amostra for me-nor do que em uma amostra de limiar, menos do que 50% do agente de liga-ção reterão na zona de detecção e a zona de referência dará um sinal maisintenso do que a zona de detecção.
Em um outro dispositivo da invenção que opera de acordo comprincípios similares, a zona de referência está a jusante da zona de detecçãoe inclui uma quantidade Iimitante de um reagente de captura agente de liga-ção (por exemplo, um anticorpo de agente de antiligação imobilizado). O re-agente está presente a um nível tal que ele retém a mesma quantidade derótulo que se ligaria à zona de detecção para uma amostra de limiar, comrótulo em excesso continuando a migrar além da zona de referência.
Nesses três tipos de dispositivo, portanto, uma comparação en-tre a zona de detecção e a zona de referência é usada para comparar a a -mostra com a concentração limiar. A razão de ligação de detecção: referên-cia pode de preferência ser determinada pelo olho. Justaposição próxima dadetecção e zonas de referência é preferida a fim de facilitar comparação vi-sual das intensidades de sinal nas duas zonas.Em um quarto tipo de dispositivo, nenhuma zona de referência énecessária, mas à zona de detecção é configurada tal que ela dê uma res-posta essencial e intermitentemente, por exemplo, nenhum sinal é dado a-baixo da concentração limiar mas, a ou acima do limiar, sinal é dado.
Em um quinto tipo de dispositivo, nenhuma zona de referência énecessária, mas uma referência externa é usada, a qual corresponde à con-centração limiar. Essa pode tomar várias formas, por exemplo, um cartãoimpresso contra o qual o sinal na zona de detecção pode ser comparado, ouuma leitora de máqina que compara um valor absoluto medido na zona dedetecção (por exemplo, um sinal calorimétrico) contra um valor de referênciaarmazenado na máquina.
Em algumas concretizações da invenção, o dispositivo incluiuma zona de controle a jusante da zona de detecção. Esse em geral seráA usado para capturar agente de ligação em excesso que passa através daszonas de detecção e/ou de referência (por exemplo, usando-se atividade deagente de antiligação imobilizado). Quando o agente de ligação é retido nazona de controle, isso confirma que mobilização do agente de ligação e mi-gração através do dispositivo têm ambos ocorridos. Será apreciado que essafunção pode ser alcançada pela zona de referência.
Em uma concretização preferida, as zonas de detecção, de refe-rência e de controle são de preferência formadas em um suporte de nitroce-lulose.
Migração a partir da zona de aplicação à zona de detecção emgeral será auxiliada por uma mecha a jusante da zona de detecção para au-xiliar movimento capilar. Essa mecha é tipicamente formada a partir de ma-terial absorvente tal como papel de cromatografia ou blotting.
O dispositivo da invenção pode ser produzido de modo simples eeconômico, conveniente na forma de uma vareta de mergulhamento. Alémdo mais, ele pode ser usado muito facilmente, por exemplo, pelo usuáriodoméstico. A invenção provê assim um dispositivo que pode ser usado emcasa como uma triagem quanto a câncer, tal como câncer ovariano.Kits para Diagnóstico ou Monitoramento do Câncer Ginecolóqico
Em um aspecto, a presente invenção inclui kits compreendendoos elementos exigidos para o diagnóstico ou monitoração de câncer. De pre-ferência, os kits compreendem um recipiente para a coleta de fluido biológicoa partir de um paciente e um agente para a detecção da presença de Bcl-2ou sua codificação de ácido nucléico no fluido. Os componentes dos kits po-dem ser embalados ou em meio aquoso ou em forma liofilizada.
Os métodos da invenção podem ser realizados usando-se um kitde diagnóstico para Bcl-2 de detecção qualitativa ou quantitativa em umaamostra tal comò sangue ou urina. A título de exemplo, o kit pode conter a-gentes de ligação (por exemplo, anticorpos) específicos para Bcl-2, anticor-pos contra os anticorpos marcados com uma enzima; e um substrato para aenzima. O kit pode também conter um suporte sólido tal como placas demúltiplas cavidades de microtítulo, padrões, diluente de ensaio, tampão delavagem, coberturas de placa adesiva, e/ou instruções para a realização deum método da invenção usando-se o kit. Em uma concretização, o kit incluium ou mais inibidores de protease (por exemplo, coquetel de inibidor de pro-tease) a serem aplicados à amostra biológica a ser analisada (tal como urinaou sangue).
Kits para o diagnóstico ou monitoração de câncer ginecológicocontendo um ou mais agentes que detectam a proteína de Bcl-2, tais comomas não limitados a anticorpos de Bcl-2, seus fragmentos ou padrões deligação de Bcl-2, podem ser preparados. 0(s) agente(s) pode(m) ser emba-lado(s) com um recipiente para a coleta do fluido biológico a partir de umpaciente. Quando os anticorpos ou padrão ligação são usados nos kits naforma de conjugados em que um rótulo é ligado, tal como íon de metal ra-dioativo ou uma porção, os componentes de tais conjugados podem ser for-necidos ou em forma totalmente conjugada, na forma de intermediários oucomo porções separadas a serem conjugadas pelo usuário no kit.
Kits contendo um ou mais agentes que detectam ácido nucléicode Bcl-2, tais como mas não limitados ao ácido nucléico de Bcl-2 de com-primento total, oligonucleotídeos de Bcl-2 e pares de iniciadores de Bcl-2podem também ser preparados. 0(s) agente(s) pode(m) ser embalado(s)com um recipiente para coleta de amostras biológicas a partir de um pacien-te. O ácido nucléico pode estar na forma marcada ou ser a forma marcada.
Outos componentes do kit podem incluir mas não são limitadosa, meio para a coleta de amostras biológicas, meio para a marcação do a-gente de detecção (agente de ligação), membranas para a imobilização daproteína de Bcl-2 ou ácido nucléico de Bcl-2 na amostra biológica, meio paraa aplicação da amostra biológica a uma membrana, meio para a ligação doagente a Bcl-2 na amostra biológica de um indivíduo, um segundo anticorpo,um meio para o isolamento de RNA total de um fluido biológico de um indiví-duo, meio para a realização de eletroforese de gel, meio para a geração decDNA a partir do RNA total isolado, meio para a realização de ensaios dehibridização e meio para a realização de PCR, etc.
Como usado aqui, o termo "ELISA" inclui um ensaio imunossor-vente ligado a enzima que emprega um anticorpo ou um antígeno ligado auma fase sólida e um conjugado de enzima-antígeno ou enzima-anticorpopara detectar e quantificar a quantidade de um antígeno (por exemplo, Bcl-2)ou anticorpo presente em uma amostra. Uma descrição da técnica ELISA éencontrada no capítulo 22 das 4a ed. de Basic and Clinicai Immunology byD.P. Sites e outros, 1982, publicado por Lange Medicai Publications of LosAltos, Calif. e nas patentes U.S. N9S 3.654.090; 3.850.752; e 4.016.043, cu-jas descrições são aqui incorporadas por referência. ELISA é um ensaio quepode ser usado para quantificar a quantidade de antígeno, proteínas, ou ou-tras moléculas de interesse em uma amostra. Em particular, ELISA pode serrealizado por ligação em um suporte sólido (por exemplo, cloreto de polivini-la) de um anticorpo específico para um anticorpo ou proteína de interesse.Extrato de célula ou outra amostra de interesse tal como urina pode ser adi-cionado para a formação de um complexo de anticorpo-antígeno, e a amos-tra não ligada extra é removida por lavagem. Um anticorpo ligado a enzima,específico para um diferente sítio no antígeno é adicionado. O suporte é la-vado para remover o segundo anticorpo ligado a enzima não ligada. O anti-corpo ligado a enzima pode incluir, mas não é limitado a, fosfatase alcalina.A enzima no segundo anticorpo pode converter um substrato incolor adicio-nado em um produto colorido ou pode converter um substrato não fluores-cente em um produto fluorescente. O método com base em ELISA providoaqui pode ser conduzido em uma câmara simples ou em um conjunto decâmaras e pode ser adaptado para processos automáticos.
Nessas concretizações exemplares, os anticorpos podem sermarcados com pares de corantes FRET, proteína de transferência de ener-gia de ressonância de bioluminescência (BRET), combinações de corantesseqüestrantes de corante fluorescente, fragmentos de proteína de ensaiosde complementação de beta-gal. Os anticorpos podem participar em FRET,BRET, tratamento por seqüestro de fluorescência ou complementação beta-gal para gerar sinais quimioluminescente aumentado (ECL), calorimétrico oufluorescência, por exemplo.
Esses métodos são rotineiramente empregados na detecção derespostas de anticorpo específicas de antígeno, e são bem-descritos em li-vros de texto de imunologia geral tais como Immunology by Ivan Roitt, Jona-than Brostoff and David Male (London: Mosby, c1998. 5th ed. e Immunobio-logy: Immune System in Health and Disease/Charles A. Janeway e Paul Tra-vers. Oxford: Blackwell Sei. Pub., 1994), cujo conteúdo é aqui incorporadopor referência.
Definições
Como usado aqui, os termos "câncer" e "canceroso" referem-sea ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente ca-racterizada por crescimento de célula desregulado, isto é, distúrbios prolife-rativos. Exemplos de tais distúrbios proliferativos incluem cânceres tais comocarcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia, bem como outros cânce-res descritos aqui. Mais particularmente, exemplos de tais cânceres incluemcâncer de mama, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de célula es-camosa, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célulanão pequena, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer cervical,câncer ovariano, câncer peritoneal, câncer de fígado, por exemplo, carcino-ma hepático, câncer de bexiga, câncer de colorretal, carcinoma endometrial,câncer de rim e câncer de tiróide.
Outros exemplos não Iimitantes de cânceres são carcinoma decélula basal, câncer do trato biliar, câncer ósseo, câncer cerebral e de CNS;coriocarcinomá; câncer de tecido conectivo; câncer esofageano; câncer deolho; câncer da cabeça e do pescoço; câncer gástrico; neoplasma epitelial;câncer de laringe; linfoma incluindo Iinfoma de Hodgkin e de não-Hodgkin;melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer de cavidade oral (por exemplo,lábio, língua, boca e faringe); câncer pancreático, retinoblastoma; rabdomi-ossarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; sarcoma; câncer depele; câncer de estômago; câncer testicular; câncer uterino; câncer do sis-tema urinário, bem como outros carcinomas e sarcomas. Exemplos de tiposde câncer são listados na tabela 1.
Tabela 1 Exemplos de tipos de câncer
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Como usado aqui, o termo "tumor" refere-se a todo o crescimen-to e proliferação de célula neoplásica, se maligno ou benigno, e todas ascélulas cancerosas e pré-cancerosas e tecidos. Por exemplo, um câncer par-ticular pode ser caracterizado por um tumor de massa sólida. A massa detumor sólida, se presente, pode ser uma massa de tumor primária. Umamassa de tumor primária refere-se a um crescimento de células de câncerem um tecido resultante da transformação de uma célula normal daqueletecido. Na maioria dos casos, a massa de tumor primária é identificada pelapresença de um cisto, que pode ser encontrado através de métodos visuaisou palpação ou por irregularidade na forma, na textura ou peso do tecido. Noentanto, alguns tumores primários não são palpáveis e podem ser detecta-dos apenas através das técnicas de imagem médica tais comò os raios X(por exemplo, mamografia), utrassom, CT, e MRI, ou por aspirações de agu-lha. O uso dessas últimas técnicas é mais comum na detecção precoce. A-nálise molecular e fenotípica de células de câncer dentro de um tecido usu-almente confirma se o câncer é endógeno ao tecido ou se a lesão é devido àmetástase oriunda de um outro sítio.
Uma "amostra" (amostra biológica) pode ser qualquer composi-ção de material de interesse de um indivíduo humano ou não humano, emqualquer estado físico (por exemplo, sólido, líquido, semi-sólido, vapor) e dequalquer complexidade. A amostra pode ser qualquer composição razoa-velmente suspeita de conter Bcl-2 que pode ser analisada pelos métodos,dispositivos e kits da invenção. De preferência, a amostra é um fluido (fluidobiológico). Amostras podem incluir amostras humanas ou de animais. A a-mostra pode ser contida dentro do tubo de teste, recipiente de cultura, placade múltiplas cavidades, ou qualquer outro recipiente ou substrato de suporte.A amostra pode ser, por exemplo, uma cultura de célula, tecido humano oude animal. Homogeneizados de fluido de tecidos celulares são fluidos bioló-gicos que podem conter Bcl-2 para a detecção da invenção.
A "complexidade" de uma amostra refere-se ao número relativode diferentes espécies moleculares que estão presentes na amostra.
Os termos "fluido de corpo" e "fluido corpóreo", como usado a-qui, referem-se a uma composição obtida a partir de um indivíduo humanoou de animal. Fluidos corpóreos incluem, mas não são limitados a, urina,sangue total, plasma de sangue, soro, lágrimas, sêmen, saliva, escarro, res-piração exalada, secreções nasais, exudatos faríngeos, lavagem broncoal-veolar, aspirações de traquéia, fluido intersticial, fluido de linfa, fluido de me-ninge, fluido amnióitico, fluido glandular, fezes, transpiração, muco, secreçãovaginal ou uretral, fluido cerebroespinhal e exudato transdérmico. Fluido cor-póreo também inclui frações experimentalmente separadas de todas as so-luções e misturas precedentes contendo material sólido homogeneizado, taiscomo fezes, tecidos e amostras de biopsia.
O termo "ex vivo", como usado aqui, refere-se a um ambienteexterno de um indivíduo. Correspondentemente, uma amostra de fluido cor-póreo coletada a partir de um indivíduo é uma amostra ex vivo do fluido cor-póreo como contemplado pela presente invenção. Modalidades na residên-cia do método e dispositivo da invenção obtêm amostras in vivo.
Como usado aqui, o termo "conjugado" refere-se a um compostocompreendendo duas ou mais moléculas ligadas entre si, opcionalmenteatravés de um grupo de ligação, para formar uma estrutura única. A ligaçãopode ser produzida por uma ligação direta (por exemplo, uma ligação quími-ca) entre as moléculas ou por uso de um grupo de ligação.
Como usado aqui, os termos "suporte", "substrato" e "superfície"sólidos referem-se a uma fase sólida que é um material insolúvel em águaporoso ou não poroso que pode ter qualquer de numerosas formas, tal comotira, vareta, partícula, contas ou placas de múltiplas cavidades. Em algumasconcretizações, o suporte tem uma matriz de suporte organizacional que depreferência funciona como uma matriz de organização, tal como uma bande-ja de microtítulo. Materiais de suporte sólidos incluem, mas não são Iimita-dos a, celulose, polissacarídeo tal como Sephadex, vidro, poliacriloilmorfolí-deo, sílica, vidro de poro controlado (CPG), poliestireno, poliestireno/látex,polietileno tal como polietileno de peso molecular ultra-alto (UPE), poliamida,fluoreto de polivinilidina (PVDF), politetrafluoroetileno (PTFE; TEFLON), te-flon modificado por carboxila, nylon, nitrocelulose e metais e ligas tais comoouro, platina e paládio. O suporte sólido pode ser biológico, não biológio,orgânico, inorgânico ou uma combinação de qualquer uma dessas, existindocomo partículas, filamentos, precipitados, géis, folhas, almofadas, cartões,tiras, varas, tiras de teste, cano, esferas, recipientes, capilares, almofadas,fatias, películas, placas, lâminas, etc., dependendo da aplicação particular.De preferência, o suporte sólido é de forma planar, para facilitar o contatocom uma amostra biológica tal como urina, sangue total, plasma, soro, fluidoperitoneal ou fluido de ascites. Outros materiais de suporte sólidos adequa-dos serão prontamente evidentes àqueles versados na técnica. O suportesólido pode ser uma membrana, com ou sem um apoio (por exemplo, apoiode cartão poliéster ou poliestireno), tal como aqueles disponíveis de MilliporeCorp. (Bedford, MA), por exemplo, Hi-Flow® mais cartões de membrana. Asuperfície do suporte sólido pode conter grupos reativos, tais como carboxi-la, amino, hidroxila, tiol ou similares para a ligação de ácidos nucléicos, pro-teínas etc. Superfícies no suporte sólido algumas vezes, embora nem sem-pre, serão constituídas do mesmo material que o suporte. Assim, a superfí-cie pode ser constituída de qualquer uma de uma variedade de materiais,tais como polímeros, plásticos, resinas, polissacarídeos, sílica, ou materiaisà base de sílica, carbono, metais, vidros orgânicos, membranas, ou qualquerum dos materiais de suporte acima mencionados (por exemplo, como umacamada ou um revestimento).
Como usado aqui, os termos "rótulo" e "marcador" referem-se asubstâncias que podem conferir um sinal detectável e incluem, mas não sãolimitadas a, enzimas tais como fosfatase alcalina, glicose-6-fosfato desidro-genase, e peroxidase de rábano silvestre, ribozima, um substrato para umareplicase tal como replicase de QB, promotores, corantes, fluorescedores,tais como fluoresceína, isotiocianato, compostos de rodamina, ficoeritrina,ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamina, quimioluminescedo-res tais como isoluminol, sensibilizadores, coenzimas, substratos de enzima,radiorrótulos, partículas tais como partículas de carbono ou látex, liposso-mas, células etc, que podem ser ulteriormente marcadas com um corante,catalisador ou outro grupo detectável.
Como usado aqui, os termos "receptor" e "proteína de receptor"são usados aqui para indicar uma molécula proteinácea biologicamente ativaque especificamente se liga a (ou com) outras moléculas tal como Bcl-2.
Como usado aqui, o termo "ligante" refere-se a uma moléculaque contém uma porção estrutural que está ligada por interação específicacom uma proteína de receptor particular.
Como usado aqui, o termo "anticorpo" refere-se a moléculas deimunoglobulina é porções imunologicamente ativas (fragmentos) de molécu-las de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um paratopo ou sítio decombinação de anticorpo. O termo é inclusive de anticorpos monoclonais eanticorpos policlonais.
Como usado aqui, os termos "anticorpo monoclonal" ou "compo-sição de anticorpo monoclonal" referem-se a uma molécula de anticorpo quecontém apenas uma espécie de sítio de combinação de anticorpo de imunor-reação com um antígeno particular. Uma composição de anticorpo monoclo-nal assim tipicamente exibe uma afinidade de ligação simples para qualquerantígeno com o qual ele reage. Uma composição de anticorpo monoclonal étipicamente constituído de anticorpos produzidos por clones de uma únicacélula chamada de um hibridoma que secreta (produz) apenas um tipo demolécula de anticorpo. A célula de hibridoma é formada por fusão de umacélula produtora de anticorpo e um mieloma ou outra linha de célula de au-toperpetuação. Tais anticorpo foram primeiramente descritos por Kohler andMilstein, Nature, 1975, 256:495-497, cuja descrição é incorporada por refe-rência. Uma tecnologia de hibridoma exemplar é descrita por Niman e ou-tros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1983, 80:4949-4953. Outros métodos deprodução de anticorpos monoclonais, uma célula de hibridoma, ou uma cul-tura de célula de hibridoma são também bem-conhecidos. Vide, por exem-pio, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e outros, Cold Spring HarborLaboratory, 1988; ou o método de isolamento de anticorpos monoclonais deum reportório imunológico como descrito por Sasatry, e outros, Proc. Natl.Acad. Sei. USA1 1989, 86:5728-5732; e Huse e outros, Science, 1981,246:1275-1281. As referências citadas são aqui incorporadas aqui por refe-rência.
Como usado aqui, uma membrana semi-permeável refere-se aum material biocompatível que é impermeável a líquidos e capaz de permitira transferência de gases através dele. Tais gases incluem, mas não são limi-tados a, oxigênio, vapor de água, e dióxido de carbono. Membranas semi-permeáveis são um exemplo de um material que pode ser usado para formarpelo menos uma porção de um recinto que define uma cavidade da câmarade fluxo. A membrana semi-permeável pode ser capaz de excluir a contami-nação microbiana (por exemplo, o tamanho dé poro é caracteristicamentepequeno o suficiente para excluir a passagem de micróbios que podem con-taminar o análito, tal como células). Em um aspecto particular, uma mem-brana semi-permeável pode ter uma transparência ótica e claridade suficien-te para permitir observação de um análito, tal como células, quanto a cor,crescimento, tamanho, morfologia, imagem e outras finalidades bem-conhe-cidas na técnica.
Como usado aqui, o termo "ligação" refere-se a qualquer ligaçãofísica ou associação próxima, que pode ser permanente ou temporária. Aligação pode resultar de ligação de hidrogênio, forças hidrofóbicas, forças devan der Waals, covalente, ou ligação tônica, por exemplo.
Como usado aqui, o termo "partícula" inclui materiais insolúveisde qualquer configuração, incluindo, mas não limitados a, formas esféricas,de tipo de filamento, de tipo escova e irregulares. Partículas podem ser po-rosas com canais regulares ou aleatórios dentro. Partículas podem ser mag-néticas. Exemplos de partículas, incluem, mas não são limitadas a, sílica,celulose, contas de Sepharose, contas de poliestireno (sólidas, porosas, de-rivatizadas), vidro de poro controlado (protozoários, bactérias, levedura, ví-rus e outros agentes infecciosos), micelas, lipossomas, ciclodextrinas e ou-tros materiais insolúveis.
Uma "seqüência de codificação" ou "região de codificação" éuma seqüência de polinucleotídeos quê é transcrita em mRNA e/ou traduzi-da em um polipeptídeo. Por exemplo, uma seqüência de codificação podecodificar um polipeptídeo de interesse. Os limites da seqüência de codifica-ção são determinados por uma tradução de códon inicial no terminal 5' euma tradução de códon de parada no terminal 3'. Uma seqüência de codifi-cação pode incluir, mas não é limitada a, mRNA, cDNA, e seqüências depolinucleotídeos recombinantes.
Como usado aqui, o termo "polipeptídeo" refere-se a qualquerpolímero compreendendo qualquer número de dois ou mais aminoácidos, eé usado intercambeavelmente aqui com os termos "proteína", "produto degene" e "peptídéo".
Como usado aqui, o termo "nucleosídeo" refere-se a uma molé-cula tendo uma base de purina ou de pirimidina covalentemente ligada a umaçúcar de desoxirribose ou ribose. Nucleosídeos exemplares incluem ade-nosina, guanosina, citidina, uridina e timidina.
O termo "nucleotídeo" refere-se a um nucleosídeo tendo um oumais grupos fosfato unidos em ligações de éster à porção de açúcar. Nu-cleotídeos exemplares incluem monofosfatos, difosfato e trifosfatos de nu-cleosídeo.
Os termos "polinucleotídeo", "molécula de ácido nucléico" e "mo-lécula de nucleotídeo" são usados intercambeavelmente aqui e referem-se aum polímero de nucleotídeos unidos entre si por uma ligação de fosfodiésterentre átomos de carbono 5' e 3'. Polinucleotídeos podem codificar um poli-peptídeo tal como polipeptídeo de Bcl-2 (se expresso ou não expresso), oupodem ser RNA de interferência curto (siRNA), ácidos nucléicos de anti-sentido (oligonucleotídeos de anti-sentido), aptâmeros, ribozimas (RNA cata-lítico), ou oligonucleotídeos formação triplex (isto é, antígeno), por exemplo.
Como usado aqui, o termo "RNA" ou "molécula de RNA" ou "mo-lécula de ácido ribonucléico" refere-se em geral a um polímero ou ribonucle-otídeos. O termo "DNA" ou "molécula de DNA" ou "molécula de ácido deso-xirribonucléico" refere-se em geral a um polímero de desoxirribonucleotí-deos. Moléculas de DNA e de RNA podem ser sintetizadas naturalmente(por exemplo, replicação de DNA ou transcrição de DNA, respectivamente).Moléculas de RNA podem ser pós-transcritivamente modificadas. Moléculasde DNA e RNA podem também ser quimicamente sintetizadas. Moléculas deDNA e RNA podem ser de filamento único (isto é, ssRNA e ssDNA, respecti-vamente) ou dé múltiplos filamentos (por exemplo, de filamento duplo, dsR-NA e dsDNA, respectivamente). Com base na natureza da invenção, no en-tanto, o termo "RNA" ou "molécula de RNA" ou "molécula de ácido ribonu-cléico" pode também referir-se a um polímero compreendendo principalmen-te ribonucleotídeos (isto é, maior do que 80% ou, de preferência maior doque 90%) mas opcionalmente incluindo pelo menos uma molécula de nãoribonucleotídeo, por exemplo, pelo menos desoxirribonucleotídeo e/ou pelomenos um análogo de nucleotídeo.
Como usado aqui, o termo "análogo de nucleotídeo" ou "análogode ácido nucléico", também chamado aqui de ácido nucléico/nucleotídeoalterado ou ácido nucléico/nucleotídeo modificado, refere-se a um nucleotí-deo não padrão, incluindo desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos deocorrência não natural. Análogos de nucleotídeos preferidos são modificadosa qualquer posição de modo a alterar certas propriedades químicas do nu-cleotídeo ainda retêm a capacidade do análogo de nucleotídeo para realizarsua função pretendida. Por exemplo, ácidos nucléicos fechados (LNA) sãouma classe de análogos de nucleotídeo que possuem excelente especifici-dade e afinidade muito alta em relação a DNA e RNA complementar. Oligo-nucleotídeos de LNA foram ampliados como moléculas de anti-sentido tantoin vitro quanto in vivo (Jepsen J.S. e outros, Oligonucleotides, 2004,14(2):130-146).
Como usado aqui, o termo "análogo de RNA" refere-se a um po-linucleotídeo (por exemplo, um polinucleotídeo quimicamente sintetizado)tendo pelo menos um nucleotídeo alterado ou modificado quando compara-do com RNA não modificado ou não alterado correspondente mas retendo amesma ou natureza similar ou fração que o RNA não alterado ou não modifi-cado correspondente. Como discutido acima, os oligonucleotídeos podemser ligados, que resulta em uma taxa mais baixa de hidrólise do análogo deRNA quando comparado com uma molécula de RNA com ligações de fosfo-diéster. Análogos de RNA exemplares incluem desoxirribonucleotídeos e/ouribonucleotídeos modificados pelo açúcar e/ou cadeia principal. Tais altera-ções ou modificações podem ulteriormente incluir adição de material nãonucleotídeo, tal como a(s) extremidade(s) do RNA ou internamente (a um oumais nucleotídeos da RNA).
Os termos "compreendendo", "que consiste em" e "que consisteessencialmente em" são definidos de acordo com seu meio padrão. Os ter-mos podem ser usados como substitutos de um com outro através de todo opresente pedido a fim de ligar o meio específico associado a cada termo.
Os termos "isolado" ou "biologicamente puro" referem-se a ma-terial que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes osquais normalmente acompanham o material como é encontrado no seu es-tado nativo.
Como usado nesse relatório, as formas singulares "um", "uma","a" e "o" incluem referência em plural a não ser que o contexto claramentedite de outra maneira. Assim, por exemplo, uma referência a "um anticorpo"inclui mais do que um tal anticorpo. Uma referência a "uma molécula" incluimais do que uma tal molécula, e assim por diante.
A prática da presente invenção pode empregar, a não ser que deoutra maneira indicada, técnicas convencionais de biologia molecular, mi-crobiologia, tecnologia de DNA recombinante, eletrofisiologia e farmacologiaque estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas to-talmente na literatura (vide, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Mo-lecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning,Vols. I and Il (D. N. Glover Ed. 1985); Perbal, B., A Practical Guide to Mole-cular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N.Kaplan Eds., Academic Press, Inc.); Transcription and Translation (Hames eoutros Eds. 1984); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Millere outros Eds. (1987) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y.); Scopes, Protein Purification: Principies and Praetice (2nd ed., Sprin-ger-Verlag); and PCR: A Practical Approach (McPherson e outros Eds.(1991) IRL Press)), cada um dos quais são incorporados aqui por referênciaem sua totalidade.
O quê se segue são exemplos que ilustram materiais, métodos eprocedimentos para a prática da invenção. Os exemplos são ilustrativos enão seriam interpretados como limitantes.
Materiais e Métodos
Coorte de paciente. Com aprovação institucional anterior, amos-tras de urina e de sangue foram coletadas a partir de voluntários de controlesaudáveis normais (N = 21), mulheres com distúrbios ginecológicos benig-nos (N = 35) e pacientes com câncer ovariano (N - 34) no H. Lee MoffittCâncer Center. Todas exceto 8 amostras foram coletadas antes da cirurgiade de "Debulk" inicial, enquanto as últimas 8 amostras apresentavam comdoença recorrente na hora do protocolo no estudo. Blocos de parafina foramidentificados, onde possível, e as lâminas revistas para confirmar o diagnós-tico histológico de acordo com as classificações de FIGO. Os registros médi-cos dessas mulheres foram também revistos e informação em relação a ida-de do paciente, tipo de tumor, estágio, grau, tamanho e tratamento cirúrgicoabstraído onde disponível.
Preparação de amostra. Com paciente conciente informado,amostras de urina e de sangue foram coletadas a partir dos pacientes, foramtornados anônimos e foram codificados para proteger a identidade do paci-ente, e foram liberados a partir de H. Lee Moffitt Câncer Center para esseprotocolo de pesquisa. Todas as amostras foram mantidas em gelo. Amos-tras de urina foram tratadas com um coquetel de inibidor de protease padrão(de 80 pg/ml de fluoreto de 4-(2-aminoetil)-benzeno sulfonila, 200 pg/ml deEDTA, 0,2 pg/ml de leupeptina, de 0,2 pg/ml de pepstatina, Sigma Scientific,St. Louis, Ml) e foram centrifugadas a 3000 χ g. Sobrenadantes de urinaeamostras de plasma foram então dividas em alíquotas e foram armazenadasa -20°C.
Ensaio de imunossorvente ligado a enzima
Para medir níveis de Bcl-2 em urina de pacientes, amostras fo-ram analisadas usando-se ensaio imunossorvente ligado a enzima de tiposanduíche quantitativa (ELISA; R&D Systems, Minneapolis, MN) de acordocom as instruções do fabricante. Para medir níveis de CA125 em plasma doindivíduo, amostras foram analisadas por ELISA (Bio-Quant, San Diego, CA)de acordo com as instruções do fabricante. As reações enzimáticas foramdetectadas a 450 nm usando-se uma leitora de placa de Dynex MRX (DynexTechnologies, Chantilly, VA) e resultados de Bcl-2 expressos como a absor-bância média dè amostras em triplicata ± S.E. enquanto resultados deCA125 fossem expressos como a média de amostras em duplicata.
Análise estatística. Amostras para ELISA de Bcl-2 foram realiza-das em triplicata e os dados foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallisquanto a distribuição normal. Dados foram então analisados por teste U deMann-Whitney para determinar a significância estatística entre amostras decontroles normais, pacientes com doença benigna e pacientes com câncerovariano. Do mesmo modo, análises de determinação usando-se o sistemade SAS foram empregadas para determinar associação apropriada em cadagrupo (normal vs benigno vs câncer).
Exemplo 1 Níveis de Bcl-2 urinário são elevados em pacientes com câncerovariano
Urina e sangue foram coletados a partir de 90 indivíduos comamostras coletadas a partir de controles normais (N=21), mulheres com do-ença benigna (N = 35) e mulheres com câncer ovariano (N = 34). A últimacategoria consistia em mulheres diagnosticadas com endometrióide (N = 1),mucina (N = 7) bem como câncer ovariano seroso (N = 24) e câncer perito-neal primário, que está freqüentemente relacionado com câncer ovariano, (N= 2). As amostras coletadas a partir de mulheres com doença ginecológicabenigna consistia em mulheres com teratomas císticos benignos (N = 2),cistos simples (N = 10), Ieiomiomas (N = 8), doença ovariana policísticas (N= 1), adenofibromas ovarianos (N = 4), cistadenomas mucinoso(N = 2) e cis-tadenomas serosas (N = 8). Embora essa coorte compreenda um estudopiloto pequeno, ele é representativo de uma prática clínica típica com rela-ção a distribuição de estágio, grau e histologia.
Para determinar a adequabilidade potencial de níveis de Bcl-2urinário como um novo marcador molecular para câncer ovariano, amostrasde urina oriunda de controles normais, mulheres com doença ginecológicabenigna e pacientes com amostras de câncer ovariano foram triados por a-nálise de ELISA (figura 1). A quantidade de Bcl-2 urinário era em geral des-prezível (0,21 hg/ml médio) em amostras de controle normais. Em contrastecom isso, Bcl-2 urinário associado a câncer peritoneal primário ou ovarianoera em geral >10x (3,4 ng/ml) foram encontrados em amostras de controlenormais (Figura 1 A). Nenhuma amostra de urina normal continha Bcl-2 >1,8ng/ml, equanto apenas duas das amostras de câncer exibiam Bcl-2 menosdo que 1,8 ng/ml (de 1,12 ng/ml e 1,78 ng/ml). Uma vez que carcinoma se-roso representa a maioria de cânceres ovarianos epiteliais, níveis de Bcl-2urinário em pacientes com adenocarcinoma seroso foram examinados porgrau (Figura 1 A) e estágio (Figura 1B) da doença. Embora haja uma tendên-cia para níveis de Bcl-2 elevados com aumento de grau e estágio de tumor,a diferença em níveis de Bcl-2 entre estágio e grau de tumor não era estatis-ticamente significativo. Do mesmo modo, creatinina do soro foi medida nahora da coleta de urina e indicava que níveis de Bcl-2 urinários não estavamrelacionados com disfunção renal (dados não mostrados). Notavelmente, umúnico paciente (Ne 77) demonstrou níveis de Bcl-2 urinário extremamenteelevados (>9 ng/ml) na ausência de outros sintomas clínicos notáveis.
Tabela 2 sumariza os resultados apresentados nas figuras 1 e 2para níveis médios de Bcl-2 na amostra de urina. Números entre parêntesesindicam o número de amostras em cada grupo respectivo. Adicionalmente,os dados são agrupados para mostrar níveis de Bcl-2 médios (ng/ml) entreindivíduos normais e subtipos histológicos de câncer ovariano, grau de tumore estágio de tumor. Os dados mostram que enquanto o nível médio de Bcl-2na urina de voluntários saudáveis é de 0,204 ng/ml, que de todos os pacien-tes com câncer é em geral 10X maior (3,12 ng/ml). Além disso, níveis de Bcl-2 urinário parecem fortemente relacionados com estágio de tumor e mode-radamente relacionados com grau de tumor entre cânceres ovarianos sero-sos (o tipo de ocorrência mais freqüente de câncer ovariano).Tabela 2. Níveis de Bcl-2 urinários em normal e câncer ovariano
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Exemplo 2- Bcl-2 urinário em pacientes com doença ainecolóaica benignanão é elevado
Medição de ELISA de Bcl-2 urinário de 35 mulheres com doençaginecológica benigna (urina coletada exatamente antes do tratamento dopaciente) indicava níveis médios de Bcl-2 de 0,02 ng/ml como nenhuma a-mostra >1,8 ng/ml de Bcl-2, como mostrado na figura 8A. Essas doençasbenignas incluíam teratomas benignos, cistos simples, leiomiomas, ováriopoliestrônico, fibromas, e adenomas. Esses valores eram similares a contro-les normais, mas significativamente menores do que amostras de câncerovariano sugerindo que níveis de Bcl-2 urinário elevados maiores do que 1,8ng/ml estavam associados a câncer ovariano.
O teste de Kruskal-Wallis foi usado para testar a distribuiçãonormal dos dados. Uma vez que o grupo "normal" falhou para satisfazer dis-tribuição, provavelmente devido a pequeno número de amostra, as diferen-ças entre grupos foram analisados pelo teste U de Mann-Whitney. Os resul-tados indicavam nenhuma diferença significativa entre grupos normal e be-nigno (p<0,5), mas p<0,001 entre normal e câncer ou benigno e câncer. Umsumário de nível de Bcl-2 urinário para este grupo de estudo é apresentadona Figura 8B. Do mesmo modo, análises de discriminação usando-se os sis-temas de SAS revelaram que a probabilidade de associação apropriada nogrupo normal/benigno ou câncer foi >90%.
Exemplo 3 - Bcl-2 urinário não correlaciona com idade do paciente ou tama-nho do tumor
Comparação de parâmetros clínicos sugeriu que níveis de Bcl-2urinário não relacionam com a idade do paciente (vide a Figura 5). Embora afaixa de idade e idade média dos controles normais (de 29-81 anos, 48,5 ±D.P. 12,7 anos em média) e mulheres com doença ginecológica benigna (de28-84 anos, 55,9 ± D.P 13,9 anos em média) era um pouco mais baixo quedas mulheres com câncer ovariano (de 26-92 anos, 62,2 ± D.P. 13,8 anosem média), as diferenças não foram estatisticamente significativas nesseestudo. Similarmente, níveis de Bcl-2 urinário não se correlacionam com ta-manho de tumor medido na cirurgia de remoção (Figura 6), variando de mi-croscópico até >10 cm e pode refletir variação biológica entre indivíduos ouvariação de composição de tumor.
Exemplo 4- Bcl-2 urinário detecta câncer ovariano mais exatamente do queCA125 no sangue
Para explicar se Bcl-2 urinário elevado é um indicador de diag-nóstico melhor para câncer ovariano do que antígeno de câncer 125(CA 125), Bcl-2 urinário foi comparado com níveis de CA125 em 12 controlesnormais e 23 pacientes com câncer ovariano (Figuras 4A e 4B). Dos pacien-tes examinados, Bcl-2 urinário elevado associado com detecção de câncerovariano era quase 100%. Bcl-2 urinário elevado (>i,8 ng/ml) identificava17/17 pacientes com adenocarcinoma seroso, 4/4 pacientes com câncer o-variano de mucina e 1/2 pacientes com câncer peritoneal primário como po-sitivo para câncer ovariano (Figura 4A). Nenhum dos controles normais ti-nham níveis de Bcl-2 urinário >1,8 ng/ml e foram, então, corretamente classi-ficados como negativo para câncer. Em contraste com isso, níveis de san-gue de CA125 >35 U/ml, o padrão corrente para detecção de câncer ovaria-no, identificavam 13/17 ou 76% de pacientes com adenocarcinoma seroso(Figura 4B). Do mesmo modo, análises de CA125 identificavam 3/4 ou 75%de pacientes com câncer ovariano de mucina, embora níveis de CA125 nes-ses pacientes variassem entre 41 -43 U/ml, e 1/2 ou 50% odef pacientes comcâncer peritoneal primário como positivo para câncer. Níveis CA125 eleva-dos também incorretamente identificavam 2/12 ou 16% de indivíduos saudá-veis como positivo para câncer sugerindo que Bcl-2 urinário elevado parecedetectar câncer ovariano mais exatamente do que CA125.
Exemplo 5- Bcl-2 urinário diminui depois da cirurgia de remoção
Para ulteriormente testar a exatidão para níveis altos de Bcl-2urinário para detectar câncer ovariano, níveis de Bcl-2 urinário foram compa-rados em 7 pacientes com câncer ovariano imediatamente antes do (Figuras7A e 7B, barras pretas) e no período de 2 semanas após a cirurgia de remo-ção inicial para a remoção de todo o tumor visível (barras brancas). Paraaqueles pacientes onde amostras de urina foram coletadas antes e depoisda cirurgia inicial, níveis de Bcl-2 diminuíram até 100% após a remoção ci-rúrgica do tumor sugerindo que a presença de tumor se correlaciona bemcom Bcl-2 urinário elevado em pacientes com câncer ovariano.
Atualmente, estudos pré-clínicos foram no desenvolvimento deagentes para inibir Bcl-2, incluindo oligonucleotídeo de anti-sentido e inibido-res moleculares pequenos de Bcl-2. Embora tais estudos direcionam Bcl-2para a intervenção terapêutica, os presentes dados indicam que a quantifi-cação de Bcl-2 urinário por ensaios com base em ELISA podem prover mé-todo novo, seguro, sensível, específico e econômico para a detecção decâncer ovariano que beneficiaria todas as mulheres não apenas nos EstadosUnidos, mas mundialmente, incluindo áreas geográficas de oferta medical-mente insuficiente e especialmente mulheres em alto risco para desenvolvercâncer ovariano. Além disso, dado que cerca de 25.000 mulheres são diag-nosticadas com câncer ovariano anualmente nos EUA, detecção de Bcl-2urinário de câncer ovariano tanto em estágios precoces quanto tardios dedoenças não confirmariam o diagnóstico de câncer ovariano, mas poderiatambém potencialmente detectar milhares de cânceres ovarianos anterior-mente não diagnosticados. Isso é especialmente importante para a detecçãode câncer ovariano em estágios precoces que explicam menos do que 10%de cânceres ovarianos diagnosticados, mas onde remoção cirúrgica do ová-rio doente aumenta sobrevivência de paciente para mais de 90% e seria es-perado reduzir custos médicos para uma vida longa. Finalmente, além deservindo uma nova função de diagnóstico, níveis de Bcl-2 urinário podem serusados para monitorar a presença de câncer ovariano através do curso dadoença que pode impactar resultado terapêutico e prognóstico. Claramente,estudos de população maiores são justiçados para verificar o potencial paraníveis de Bcl-2 urinário para servir como um biomarcador para câncer ovari-ano bem como investigações no(s) mecanismo(s) molecular(es) responsá-vel(áveis) para Bcl-2 urinário elevado em câncer ovariano. No entanto, umavez que não há relatos que empregam tanto detecção urinária ou Bcl-2 comoum biomarcador para câncer ovariano, esse estudo de diagrama sugere quea medição de Bcl-2 urinário por ELISA pode prover um método simples, ino-vador para detectar todos os cânceres ovarianos e, possivelmente, reduzir amortalidade de uma doença insidiosas que mata milhares de mulheres anu-almente.
Exemplo 6- Condições de armazenagem de urina para testaaem de Bcl-2
Estudos que examinam a estabilidade de armazenagem de bcl-2urinário indicam que quando amostras são preparadas com a adição de co-quetel de inibidores de protease essas amostras de urina podem ser arma-zenadas por período de 1 ano a -20°C sem perda da detecção de bcl-2 (vide'Control' &.'-20oC' na Figura 11). Isso seria benéfico para indivíduos ondepode ser desejável retestar amostras anteriores com aquelas atuais. Alterna-tivamente, essas amostras podem também ser armazenadas a 4°C por até 4dias sem adversamente afetar detecção de Bcl-2 urinário. Esses são resul-tados importantes uma vez que eles indicam que o tempo possivelmenteexigido para transportar amostras de urina do paciente (das áreas geográfi-cas potencialmente distantes) para um laboratório para testagem de Bcl-2não adversamente afetaria o resultado de detecção de bcl-2 urinária se inibi-dores de protease forem adicionados às amostras de urina e as amostras deurina são mantidas frias. No entanto, Bcl-2 reduzido foi medido nas amostrasarmazenadas a temperatura ambiente por 4 dias e Bcl-2 não poderia serdetectado em amostras de urina armazenadas a -80°C; portanto, parece pro-ibitivo armazenar amostras urinárias para a detecção de Bcl-2 ou a tempera-tura ambiente ou a -80°C.
Todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos provisórios epublicações mencionados ou citados aqui, supra ou infra, são incorporadospor referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, namedida de que elas não são inconsistentes com os ensinamentos explícitosdesse relatório.
Será entendido que os exemplos e concretizações descritos aquisão apenas para as finalidades ilustrativas e que várias modificações oumudanças à sua luz serão sugeridas por pessoas versadas na técnica e de-vem ser incluídas dentro do espírito e campo de ação desse pedido.
Listagem de seqüência
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gttggccccc gttacttttc ctctgggaaataaccgggag atagtgatga agtacatcca
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<210> 2<211> 239<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2
Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15
Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala
20 25 30
Gly Asp vai Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile35 40 45
Phe ser ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Thr Ala Ala Ser Arg Asp50 55 60
Pro vai Ala Arg Thr ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala65 · 70 75 80
Ala Ala Gly Pro Ala Leu ser Pro vai Pro Pro Val Val His Leu Thr 85 90 95
Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe
100 105 110
Ala Glu Met Ser Arg Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly115 120 125
Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp130 135 140
Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu145
Ser Val
Met Thr
Gly Gly
Leu Phe210Leu Val225
150 155 160
Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp
165 170 175
Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn
180 185 190
Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro195 200 205
Asp Phe ser Trp Leu ser Leu Lys Thr Leu Leu ser Leu Ala215 220Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys230 235
<210> 3<211> 6492<212> DNA<213> Homo sapiens<300><301> Saltman.B., singh.B., Hedvat.C.V., Wreesmann1V.B. eGhossein,R.
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<306> 599-604<307> 2006<400> 3tttctgtgaa gcagaagtct gggaatcgat ctggaaatcc tcctaatttt tactccctct 60ccccgcgact cctgattcat tgggaagttt caaatcagct ataactggag agtgctgaag 120attgatggga tcgttgcctt atgcatttgt tttggtttta caaaaaggaa acttgacaga 180ggatcatgct gtacttaaaa aatacaacat cacagaggaa gtagactgat attaacaata 240cttactaata ataacgtgcc tcatgaaatacctgcatctc atgccaaggg ggaaacaccacccctcgtcc aagaatgcaa agcacatccattctctgggg gccgtggggt gggagctgggtcctctggga aggatggcgc acgctgggaggaagtacatc cattataagc tgtcgcagagcgccgcgccc ccgggggccg cccccgcaccgccccatcca gccgcatccc gggacccggttgcccccggc gccgccgcgg ggcctgcgctcctccgccag gccggcgacg acttctcccgcagccagctg cacctgacgc ccttcaccgcgctcttcagg gacggggtga actgggggagcatgtgtgtg gagagcgtca accgggagatgatgactgag tacctgaacc ggcacctgcatgcctttgtg gaactgtacg gccccagcattctgaagact ctgctcagtt tggccctggtgggccacaag tgaagtcaac atgcctgcccagtagaaata atatgcattg tcagtgatgtaaaaaataac acacatataa acatcacacaaacagtcttc aggcaaaacg tcgaatcagctttttacatt attaagaaaa aaagatttattctttggaaa tccgaccact aattgccaagctgtgcctgt aaacatagat tcgctttccaagacggatgg aaaaaggacc tgatcattgggggagaaggt gttcattcac ttgcatttctgagggttcct gtggggggaa gtccatgccttgactcacat gatgcatacc tggtgggaggtacccactga gatttccacg ccgaaggacaaaagtatttt tttaagctac caattgtgcctcatccagta ccttaagccc tgattgtgtaactcccaata ctggctctgt ctgagtaagaacatttcggt gacttccgca tcaggaaggc
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agaacctgcc tgtgtcccag cttggaggcc 2220ggcctcctcc agggatgatc aacagggcag 2280agctcagaat tccactgtca agaaagagca 2340ggggccctcc aggtaggccc gttttcacgt 2400catgtatcac tgtagaggga aggaacágag 2460gtgaaggctg ggaacgtgag gagaggcaat 2520gcacgttggc tgtgtggcct tggcccacct 2580tggagagggt cacaaatcct aaaagaagca 2640cctgtctatg gaattacatg taaaacatta 2700aacctgacaa aaaaaaagtt ccaggtgtgg 2760attaaaaaaa aaatcaatgg tggggaacta 2820agcaaataaa ctaggaaatt tttttttctt 2880ggaataactc tgtggcatta ttgcattata 2940actctgttca atgtttaatg ctgtggttga 3000gcatctcagc gtttttttgt ttttaattgt 3060gcaaaggtga tcgttttctg tttgagattt 3120gaaggtgaga taagccctga gtctcagcta 3180tgaggagctt tgtttcaacc aagtcatgtg 3240gacagttata tctgttgtcc ctttgacctt 3300attccgcatt taattcatgg tattcaggat 3360tcattcagtt aaaaatccag atggcaaatg 3420cctttagaga gttgctttac gtggcctgtt 3480cctccttccg cgggggcttt ctcatggctg 3540gcttacgctc caccaagaaa gcaggaaacc 3600cctcagggaa cagaatgatc agacctttga 3660ttatgaaagg tttacattgt caaagtgatg 3720cctgccaaaa tcattttaat ggagtcagtt 3780aagctgcttt agaagtaaca atgaagaacg 3840cttttgttgt tgttcaaacg ggattcacag 3900gtcacggggg ctaattgctg gctggctgcc 3960aataacagta aatgtgccca gcctcttggc 4020tgctctaaga gtagttgatg ttgcattttc 4080cttattgtta aaaacatgtt agaagcaatgttttctcctc ttcttttttt tcattatatccatccctatt ttgtattgaa gagggattcaaaaaaacagt cctctgtatg tactcctctttatatgcact ttccaaattg gggacaagggatctgagaac ctcctcggcc ctcccagtcccagaatgaca gctgacaggg tctatggccaagaaaactct ggcaggctta agatttggaatttagttcaa acaagacgcc aacattctcttgtggccttc catttatatg tgatctttgtgtagctctgg cccagtggga aaaattaggaatcaagatta aatgtaaata atcagggcaagatctattga gtgaacagaa ttgcaaatagcaaatagttt ataaatgtga acttaaactctggctgtttt tagactttct tatcacttataaaaacagga aaggctcgaa atacaagccatctattctga tcttattctg tggtgtcttttttaagaaat acaattctac attgtcaagctattcaattt ggatctttca gggattttttgttggagggg tgggagggag gaagaattttgggagttgga agttttcaga ataaccagaagatgtgatgc ctctgcgaag aaecttgtgttacgaccttt agattccaga gacatcagcacaatggtata aatttcaagc tggatatgtctttaactaac aggatattta atgacaacctgtttattatg tacaatacag aaaaaaatttgagagtgata atacaagtcc tttagtcttagacaaccatg accttggaca atcatgaaatatggagcatg aatggtactg taccggttcacaaacatcct atcaacaaca aggttgttctcactggtgga ggatggaaag gctcgctcaaagactgtagt gtagatactg agtaaatcca
aatgtatata aaagcctcaa ctagtcattt 4140taattatttt gcagttgggc aacagagaac 4200catctgcatc ttaactgctc tttatgaatg 4260tacactggcc agggtcagag ttaaatagag 4320ctctaaaaaa agccccaaaa ggagaagaac 4380ctcgctgcac aaatactccg caagagaggc 4440tcgggtcgtc tccgaagatt tggcaggggc 4500taaagtcaca gaattaagga agcacctcaa 4560ccacagctca cttacctctc tgtgttcaga 4620tttattagta aatgcttatc atctaaagat 4680agtgattata aatcgagagg agttataata 4740tcccaacaca tgtctagctt tcacctccag 4800tctctatttg taattgaact tatcctaaaa 4860taattaattc caactgtact tttaaggcag 4920agttagtaat gtacacctac tctatcagag 4980ttctaaggaa attagggagt cagttgaaat 5040tgcagcccag acaaatgtgg ttacacactt 5100ttatgaaggt tccaatcaga tctttattgt 5160ttttaaatta ttatgggaca aaggacattt 5220taaatgtaaa acattcccaa gtttggàtca 5280ctaagggtat gaaggacctg tattggggtc 5340gacaaatgag aaacattttg aagtttgtgg 5400tggctcaaag tgcagctccg tttggcagtg 5460taatgggtat ttaaacaata aatgtgcagt 5520tctggttggt agggacatct gtttctaaat 5580tataaaatta agcaatgtga aactgaattg 5640cccagtgaat cattctgttc catgtctttg 5700atgcatctca ctggatgcaa agaaaatcag 5760tctggactgc cccagaaaaa taacttcaag 5820gcataccaag ctgagcacag aagatgggaa 5880tcaagaaaat tctgagacta ttaataaata 5940tgcacctaaa ccttttggaa aatctgccgt 6000gggccctcca gatagctcat ttcattaagt ttttccctcc aaggtagaat ttgcaagagt 6060gacagtggat tgcatttctt ttggggaagc tttcttttgg tggttttgtt tattatacct 6120tcttaagttt tcaaccaagg tttgcttttg ttttgagtta ctggggttat ttttgtttta 6180aataaaaata agtgtacaat aagtgttttt gtattgaaag cttttgttat caagattttc 6240atacttttac cttccatggc tctttttaag attgatactt ttaagaggtg gctgatâttc 6300tgcaacactg tacacataaa aaatacggta aggatacttt acatggttaa ggtaaagtaa 6360gtctccagtt ggccaccatt agctataatg gcactttgtt tgtgttgttg gaaaaagtca 6420cattgccatt aaactttcct tgtctgtcta gttaatattg tgaagaaaaa taaagtacag 6480tgtgagatac tg 6492
<210> 4<211> 239<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 4
Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met1 5 10 15
Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala
20 25 30
Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 35 40 45
Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp50 55 60
Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala65 70 75 80
Ala Ala Gly Pro Ala Leu ser Pro vai Pro Pro vai vai His Leu Thr
85 90 95
Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe
100 105 110
Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 115 120 125
Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp130 135 140Gly Arg Ile vai Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly vai Met Cys vai Glu
145 150 155 160
Ser vai Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp165 170 175
Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn180 185 190
Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro
195 200 205
Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala210 215 220
Leu vai Gly Ala Gys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys
225 230 235
<210> 5<211> 1207<212> DNA
<213> Homo sapiens<400> 5
tttctgtgaa gcagaagtct gggaatcgat ctggaaatcc tcctaatttt tactccctct 60
ccccgcgact cctgattcat tgggaagttt caaatcagct ataactggag agtgctgaag 120
attgatggga tcgttgcctt atgcatttgt tttggtttta caaaaaggaa acttgacaga 180
ggatcatgct gtacttaaaa aatacaacat cacagaggaa gtagactgat attaacaata 240
cttactaata ataacgtgcc tcatgaaata aagatccgaa aggaattgga ataaaaattt 300
cctgcatctc atgccaaggg ggaaacacca gaatcaagtg ttccgcgtga ttgaagacac 360
cccctcgtcc aagaatgcaa agcacatcca ataaaatagc tggattataa ctcctcttct 420
ttctctgggg gccgtggggt gggagctggg gcgagaggtg ccgttggccc ccgttgcttt 480
tcctctggga aggatggcgc acgctgggag aacagggtac gataaccggg agatagtgat 540
gaagtacatc cattataagc tgtcgcagag gggctacgag tgggatgcgg gagatgtggg 600
cgccgcgccc ccgggggccg cccccgcacc gggcatcttc tcctcccagc ccgggcacac 660
gccccatcca gccgcatccc gggacccggt cgccaggacc tcgccgctgc agaccccggc 720
tgcccccggc gccgccgcgg ggcctgcgct cagcccggtg ccacctgtgg tccacctgac 780
cctccgccag gccggcgacg acttctcccg ccgctaccgc cgcgacttcg ccgagatgtc 840
cagccagctg cacctgacgc ccttcaccgc gcggggacgc tttgccacgg tggtggagga 900gctcttcagg gacggggtga actgggggag gattgtggcc ttctttgagt tcggtggggt 960catgtgtgtg gagagcgtca accgggagat gtcgcccctg gtggacaaca tcgccctgtg 1020gatgactgag tacctgaacc ggcacctgca cacctggatc caggataacg gaggctgggt 1080aggtgcactt ggtgatgtga gtctgggctg aggccacagg tccgagatgc gggggttgga 1140gtgcgggtgg gctcctgggg caatgggagg ctgtggagcc ggcgaaataa aatcagagtt 1200gttgcta 1207
<210> 6<211> 205<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 6
Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met1 5 10 15
Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala20 25 30
Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile
35 40 45
Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp50 55 60
Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala65 70 75 80
Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr
85 90 95
Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe100 105 HO
Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly
115 120 125
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Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu145 150 155 160
Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp165 170 175
Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn180 185 190
Gly Gly Trp Val Gly Ala Leu Gly Asp vai Ser Leu Gly
195 200 205

Claims (41)

1. Método de detecção de câncer em um indivíduo, compreen-dendo a detecção da presença de Bcl-2 em uma amostra biológica a partirdo indivíduo, em que um nível de Bcl-2 acima de um limiar predeterminado éindicativo de câncer no indivíduo.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita de-tecção compreende a detecção de proteína de Bcl-2 na amostra biológica.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita de-tecção compreende detectar uma seqüência de ácidos nucléicos que codifi-ca proteína de Bcl-2 na amostra biológica.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita de-tecção compreende:(a) contato da amostra biológica com um agente de ligação queliga proteína de Bcl-2 para formar um complexo;(b) detecção do complexo; e correlação do complexo detectadocom a quantidade de proteína de Bcl-2 na amostra, em que a presença deproteína de Bcl-2 elevada é indicativa de câncer.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostrabiológica é um fluido biológico selecionado do grupo que consiste em urina,sangue total, soro, plasma, fluido de ascites, e fluido peritoneal.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostrabiológica é urina.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o câncer éselecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer peritonealprimário, e câncer endometrial.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o câncer écâncer ovariano.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a amostrabiológica é urina ou sangue, e o câncer é um câncer ovariano.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o câncer éselecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer endometrial,câncer cervical, câncer de pulmão, câncer cólon, câncer de próstata, Mela-noma glioblastoma, sarcoma, câncer de bexiga, e câncer de cabeça e depescoço.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostrabiológica é urina ou sangue, e o câncer é um câncer de próstata.
12. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o agentede ligação é imobilizado em um suporte.
13. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o agentede ligação é um anticorpo monoclonal ou policlonal.
14. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a dita de-tecção de (b) ufteriormente compreende a ligação ou incorporação de umrótulo sobre o agente de ligação.
15. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a dita de-tecção de (b) usa detecção imunoenzimática com base em ELISA.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, ulteriormente com-preendendo a detecção de um biomarcador de câncer na mesma amostrabiológica ou uma amostra biológica diferente obtida a partir do indivíduo, an-tes, durante ou depois da dita detecção de Bcl-2.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o biomar-cador de câncer é um biomarcador de câncer ginecológico.
18. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o biomar-cador é CA125, LPA, ou OVXI.
19. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito indi-víduo está sofrendo de câncer, e em que a dita detecção é realizada em vá-rios pontos de tempo em intervalos, como parte de uma monitoração do indi-víduo antes, durante ou depois do tratamento do câncer.
20. Método de acordo com a reivindicação 1, ulteriormente com-preendendo comparação do nível de Bcl-2 na amostra biológica com o nívelde Bcl-2 presente em uma amostra de controle normal, em que um nívelmais alto de Bcl-2 na amostra biológica quando comparado com o nível naamostra de controle normal é indicativa de câncer.
21. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduonão está exibindo nenhum sintoma de câncer na hora que a dita detecção érealizada.
22. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduoestá exibindo um ou mais sintomas de câncer na hora que a dita detecção érealizada.
23. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduoestá exibindo um ou mais dos sintomas selecionados do grupo que consisteem dor pélvica, sangramento vaginal anormal, inchamento ou intumescimen-to abdominal, dor nas costas persistentes, indisposição de estômago persis-tente, mudança em padrão de bexiga ou de intestino, dor durante a relaçãosexual, perda de peso não intencional de dez ou mais libras (1 L = 0,454 kg),anormalidade na vulva ou vaginal, mudança na mama e fadiga.
24. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduotem um nível de CA125 elevado no sangue na hora da dita detecção.
25. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduonão tem um nível de CA125 elevado no sangue na hora da dita detecção.
26. Método para a avaliação de prognóstico de um indivíduotendo, ou suspeito de ter, câncer, compreendendo: a) determinação do nívelde Bcl-2 em uma amostra biológica obtida a partir do indivíduo; b) compara-ção do nível determinada na etapa (a) com uma faixa de Bcl-2 conhecidacomo estando presente em uma amostra biológica obtida a partir de um indi-víduo normal que não tem câncer; e c) determinação do prognóstico do indi-víduo baseado na comparação da etapa (b), em que um alto nível de Bcl-2na etapa (a) indica uma forma agressiva de câncer e, portanto, um prognós-tico pobre.
27. Dispositivo para a detecção rápida de Bcl-2 em uma amostrade fluido corpóreo, compreendendo uma zona de aplicação para o recebi-mento de uma amostra de fluido corpóreo; uma zona de marcação contendoum agente de ligação que se liga a Bcl-2 na amostra; e uma zona de detec-ção onde agente de ligação ligado a Bcl-2 está retido para dar um sinal, emque o signal dado para uma amostra oriunda de um indivíduo com um nívelde Bcl-2 mais baixo do que uma concentração limiar seja diferentes do sinaldado para uma amostra oriunda de um paciente com um nível de Bcl-2 mai-or do que uma concentração limiar.
28. Dispositivo de acordo com a reivindicação 27, em que o flui-do corpóreo é urina e a dita concentração limiar está entre 0 ng/ml e 2,0ng/ml.
29. Dispositivo de acordo com a reivindicação 27, em que o flui-do corpóreo é urina e a dita concentração limiar é de 1,8 ng/ml.
30. Dispositivo de acordo com a reivindicação 27, em que o dis-positivo tem uma zona de referência que dá um sinal que tem a mesma in-tensidade que o sinal dado na zona de detecção para uma amostra a partirde um indivíduo tendo um nível de Bcl-2 igual à concentração limiar.
31. Dispositivo de acordo com a reivindicação 27, em que o a-gente de ligação é um anticorpo marcado.
32. Dispositivo de acordo com a reivindicação 31, em que o an-ticorpo é marcado com ouro coloidal.
33. Dispositivo de acordo com a reivindicação 27, em que a zo-na de detecção compreende um anticorpo de anti-Bcl-2 imobilizado.
34. Dispositivo de acordo com a reivindicação 27, em que o dis-positivo tem uma zona de controle a jusante da zona de detecção que retémagente de ligação que passa através da zona de detecção.
35. Dispositivo de acordo com a reivindicação 27, em que a zo-na de controle e a zona de referência são a mesma zona.
36. Dispositivo de acordo com a reivindicação 27, em que o a-gente de ligação é um anticorpo monoclonal marcado.
37. Método para a medição de Bcl-2 em um fluido corpóreo,compreendendo: (a) obtenção de uma amostra de um fluido corpóreo a partirde um indivíduo; (b) contato da amostra com um agente de ligação que seliga a qualquer Bcl-2 na amostra; (c) separação do agente de ligação ligadoa Bcl-2; (d) detecção de um sinal associado ao agente de ligação separadode (c); e (e) comparação do signal detectado na etapa (d) com um sinal dereferência que corresponde ao sinal dado por uma amostra a partir de umindivíduo com um nível de Bcl-2 igual à concentração limiar.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o fluidocorpóreo é urina e a dita concentração limiar está entre 0 ng/ml e 2,0 ng/ml.
39. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o fluidocorpóreo é urina e a dita concentração limiar está entre 1,8 ng/ml.
40. Kit para a detecção de câncer em uma amostra biológica,compreendendo um agente de ligação específico para Bcl-2, e instruçõesimpressas para a detecção de câncer usando-se um fluido biológico usando-se o agente de ligação.
41. Kit de acordo com a reivindicação 40, ulteriormente compre-endendo um ou mais inibidores de protease a serem aplicados a uma amos-tra biológica.
BRPI0707645A 2006-02-09 2007-02-09 métodos in vitro para detecção de câncer em um indivíduo e para avaliação de prognóstico de um indivíduo tendo, ou suspeito de ter, câncer ovariano BRPI0707645B8 (pt)

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