CN103764668B - 白血病干细胞靶向配体及应用方法 - Google Patents

白血病干细胞靶向配体及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含氨基酸基序LR(S/T)的C型凝集素样分子1(CLL1)特异性配体肽及其应用方法，例如，用于诊断白血病和白血病干细胞(LSCs)存在的成像检测，以及针对至少部分地由表达CLL1的LSCs介导的白血病的靶向治疗。

Description

白血病干细胞靶向配体及应用方法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2011年7月9日递交的美国临时申请第61/506,058号的权益，为所有目地其通过引用全部并入本文。
发明领域
本发明涉及包含单独的或缀合至效应部分(effector moiety)的LR(S/T)氨基酸基序的肽和多肽，以及该类肽/多肽及其缀合物在治疗和预防白血病，尤其是急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia或acute myelogenous leukemia,AML)中的用途。
发明背景
癌症干细胞的概念与癌症的管理极为相关[Pan,et al.,Future Oncol(2006)2:723-731;和Misaghian,et al.,Leukemia(2009)23:25-42]。在血液和实体恶性肿瘤中均确认有癌症干细胞，这表明癌症干细胞的存在为大多数恶性肿瘤的共同特征。这些细胞能够自我更新并再生出更多癌细胞。为了有效地治疗和预防癌症，必须减少或消除癌症干细胞。然而，相比它们的子代癌细胞，癌症干细胞表现出较高水平的化学抗性[Terpstra,et al.,Blood(1996)88:1944-1950;和Copland,et al.,Blood(2006)107:4532-4539]。本发明部分基于以下证明，即使用经设计以高亲合性和特异性结合急性骨髓性白血病(AML)干细胞(LSC)的载药纳米颗粒的可行性。
按目前的方案，LSC的化学抗性可通过高剂量化疗以及随后的骨髓移植来克服。然而，高剂量化疗与严重的毒性和治疗相关的高死亡率有关。由于并存病，许多患者不符合该治疗的要求。对于诊断出的中值年龄为60-65岁的且通常与多种并存病有关的AML患者尤其如此。对于骨髓移植，由于被LSC污染通常不使用自体的骨髓或干细胞。同种异体的造血干细胞移植通常与严重的移植物抗宿主病有关，且一般不向老年患者提供。
在癌症干细胞类型中，AML LSC得到了最好的表征。LSC上许多细胞表面分子为已知的。例如，已知C型凝集素样分子1(CLL1)优先在大多数AML LSC上表达。尽管CLL1也表达于CD38(+)骨髓祖细胞上，但其不表达于CD34(+)/CD38(-)造血干细胞上[Bakker,et al.,Cancer Res(2004)64:8443-8450;和van Rhenen et al.,Blood(2007)110:2659-2666]。已经表明，CLL1可为用于治疗AML的潜在靶标[Zhao,et al.,Haematologica(2010)95:71-78]。
最近，研制出了一种生物相容性纳米胶束药物递送***，其由一种称为树状聚合物(telodendrimer)的独特两亲性聚合物组成[Xiao,et al.,Biomaterials(2009)30:6006-6016;Luo,et al.,Bioconjug Chem(2010)21:1216-1224]。树状聚合物由胆酸、赖氨酸和聚乙二醇(PEG)共价缀合在一起组成，其赋予了自组装为具有能够隔离许多种类药物的疏水核心的水溶性球体的能力。胆酸是胆汁酸的主要成分，其具有表面两亲性结构：刚性类固醇骨架，其一个表面上具有4个亲水基，且另一个表面上具有疏水甲基。赖氨酸为天然氨基酸。PEG为生物相容性的且已用于改善治疗性药物的药代动力学。该纳米载体***具有许多用于药物递送的诱人特征，如高药物载荷能力、窄的多分散度、规整结构、易于化学修饰、优异的物理和化学稳定性以及生物相容性。
本发明部分地基于通过噬菌体展示文库法发现了一系列特异性结合至CLL1的肽。CLL1-L1为这些配体之一，其被用于修饰纳米胶束的表面以形成我们称为“LSC靶向性纳米胶束”的靶向纳米平台。不同于主要位于血管外间隙且通过纳米治疗剂(nanotherapeutics)可及(主要通过提高的渗透性和保留效应)的实体瘤，LSC和白血病细胞主要位于血管和骨髓内，通过静脉内给予纳米治疗剂对其直接可及。本文提供的数据证明，展示有CLL1-L1的靶向纳米胶束可结合至表达CLL1的细胞表面，并将所述纳米胶束及其效应物递送至靶细胞内。
发明概述
本发明提供了优先或特异性地结合至C型凝集素样分子1(CLL1)的肽，所述肽包含氨基酸基序LR(S/T)。所述肽可用于减少、抑制和/或预防表达CLL1的白血病干细胞的增殖或生长。
因而，在一个方面，本发明提供了包含氨基酸序列基序LR(S/T)的肽，其中所述肽不超过10个氨基酸长度且结合至C型凝集素样分子1(CLL1)。在一些实施方案中，所述肽不超过9个氨基酸长度。在一些实施方案中，所述肽不超过8个氨基酸长度。在一些实施方案中，所述肽不超过7个氨基酸长度。
对于所述肽的实施方案，在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列X1LRX4X5X6X7(SEQ ID NO:1)，其中：
X1为任何氨基酸；
X4为S或T；
X5为A、S或F；
X6为A、G或S；且
X7为A、V、P或F。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列X1LRX4X5X6X7(SEQ ID NO:2)，其中：
X1为任何氨基酸；
X4为S或T；
X5为A或S;
X6为A或G；且
X7为A、V或P。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列X1LRX4AAV(SEQ ID NO:3)，其中：
X1为任何氨基酸；且
X4为S或T。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列X1LRX4AAX7(SEQ ID NO:4)，其中：
X1为任何氨基酸
X4为S或T；且
X7为A或V。在一些实施方案中，X1为P、D、L、T或A。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列X1LRSSGP(SEQ ID NO:5)，其中X1为任何氨基酸。在一些实施方案中，X1为V、S、P或T。
在一些实施方案中，X1为除半胱氨酸残基外的任何氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽选自PLRSAAA(SEQ ID NO:6)、DLRSAAV(SEQ ID NO:7)、LLRTAAV(SEQ ID NO:8)、LLRSAAV(SEQ ID NO:9)、TLRTAAV(SEQ ID NO:10)、ALRSAAV(SEQID NO:11)、VLRSSGP(SEQ ID NO:12)、SLRSSGP(SEQ ID NO:13)、PLRSSGP(SEQ ID NO:14)、TLRSSGP(SEQ ID NO:15)和PTPPFSF(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，所述肽为DLRSAAV(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，所述肽为CDLRSAAVC(SEQ ID NO:17)。
所述肽可被取代(例如，在一个或两个氨基酸位点)或修饰。例如，在一些实施方案中，本发明提供了如上述和本文描述的氨基酸序列的多肽或肽，其中：
i)一个或多个所述氨基酸残基为D-氨基酸；
ii)所述多肽或肽包含位于N-末端或C-末端或者N-末端和C-末端的保护基；
iii)所述多肽或肽为完全或部分逆反型(retro-inverso)；
iv)所述多肽或肽包含2个或更多个重复，例如，3、4、5、6个或更多个重复；
v)所述多肽或肽为环化(circularized)的；
vi)一个或多个氨基酸残基连接至类肽(peptoid)骨架；
vii)一个或多个氨基酸残基为β氨基酸残基；或
viii)所述多肽或肽用烃装订物(staple)来稳定。
在一些实施方案中，所述肽结合至表达于白血病干细胞(LSCs)表面上的C型凝集素样分子1(CLL1)。优选地，所述肽不结合或不大量结合至正常血细胞或正常造血干细胞。
在一些实施方案中，所述肽在氨基和/或羧基末端还包含1-5个侧翼氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽还包含位于氨基末端的半胱氨酸残基和位于羧基端的半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽(或其重复)可嵌入或位于较长的多肽序列内，例如，融合序列或另外的非天然存在的多肽序列。在一些实施方案中，所述肽连接(例如，通过化学连接或融合)至一个或多个其他的多肽，例如，在氨基端和/或羧基端。
在相关的实施方案中，本发明提供了融合蛋白，其包含含有如上述和本文中描述的氨基酸序列的肽和第二多肽(其不同于所述肽)。在一些实施方案中，所述第二多肽为免疫球蛋白例如IgG的Fc部分。在一些实施方案中，所述第二多肽为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的Fc区。在一些实施方案中，所述第二多肽为细胞毒素。
在一些实施方案中，所述肽连接至治疗性部分或可检测标记。例如，在一些实施方案中，所述可检测标记为成像标记、珠子、染料、荧光团、化学发光部分、量子点、纳米颗粒、磁性粒子(例如，氧化铁粒子)、金属粒子(例如，金粒子)或放射性同位素(例如，3H、32P、125I、123I、11C、13N、15O、18F、82Rb、锝-99m(Tc-99m)、铊-201)。在一些实施方案中，所述治疗性部分为免疫球蛋白的Fc部分、细胞毒素、纳米颗粒、脂质体或化疗剂。在不同的实施方案中，所述纳米颗粒可为纳米胶束。在一些实施方案中，所述抗癌剂或化疗剂被包封于脂质体或纳米颗粒内。在一些实施方案中，所述治疗性部分为包封于纳米颗粒或纳米载体内的化疗剂或抗肿瘤剂。
在另一方面，本发明提供了纳米颗粒或纳米载体，其连接至一个或多个如本文描述的CLL1特异性肽。在不同的实施方案中，所述CLL1特异性肽共价结合至所述纳米颗粒或纳米载体。所述纳米颗粒或纳米载体还可包封或连接至效应部分(例如，治疗性部分或可检测标记)。在一些实施方案中，所述纳米颗粒或纳米载体包封有化疗剂或抗肿瘤剂。在不同的实施方案中，所述纳米颗粒或纳米载体包含由两亲性树状聚合物例如聚乙二醇-嵌段-树状寡聚胆酸自组装形成的纳米颗粒。
在相关的方面，本发明提供了包含如本文描述的CLL1特异性多肽或肽配体和药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽配制为纳米颗粒。
在相关的方面，本发明提供了检测表达C型凝集素样分子1(CLL1)的白血病干细胞(LSC)存在的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使LSC与连接至可检测标记的、如上述和本文中描述的肽接触，和检测所述肽与所述LSC的接触。在不同的实施方案中，所述可检测标记可为珠子、荧光团、化学发光部分、量子点、纳米颗粒、磁性粒子、金属粒子或放射性同位素。在一些实施方案中，所述LSC在体外。在一些实施方案中，所述LSC在体内。在一些实施方案中，所述LSC在血细胞群中。
在一些实施方案中，可检测到所述CLL1特异性肽的结合信号，表明白血病和/或白血病干细胞存在。在一些实施方案中，不能检测到所述CLL1-特异性肽的结合信号，表明白血病和/或白血病干细胞不存在。在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽的结合信号大于一个阈值水平，表明白血病和/或白血病干细胞存在。在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽的结合信号小于一个阈值水平，表明白血病和/或白血病干细胞不存在。在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽的结合信号大于所述CLL1特异性肽与正常对照组织(例如，来自已知没有患白血病的对象的血液)的结合信号，表明白血病和/或白血病干细胞存在。在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽的结合信号约等于或小于所述CLL1特异性肽与正常对照组织(例如，来自已知没有患白血病的对象的血液)的结合信号，表明白血病和/或白血病干细胞不存在。
在又一个方面，本发明提供了抑制、减少或防止表达C型凝集素样分子1(CLL1)的白血病干细胞(LSC)生长或增殖的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使所述LSC与连接至治疗性部分的、如上述和本文中描述的肽接触，其中所述肽结合至LSC，并且所述治疗性部分可抑制或防止所述LSC生长或增殖。在一些实施方案中，所述LSC在体外。在一些实施方案中，所述LSC在体内。
在又一个方面，本发明提供了抑制、减少或防止有需要的对象的表达C型凝集素样分子1(CLL1)的白血病干细胞(LSC)生长或增殖的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使所述LSC与连接至治疗性部分的、如上述和本文中描述的肽接触，其中所述肽结合至LSC，并且所述治疗性部分的肽可抑制或防止所述LSC生长或增殖。在一些实施方案中，所述对象为哺乳动物，例如，人、非人的灵长类或犬。在一些实施方案中，将连接至所述治疗性部分的所述肽对所述对象进行静脉注射或骨髓内给药。在一些实施方案中，所述对象患有、怀疑患有急性骨髓性白血病(AML)或具有发展该疾病的风险。
在一些实施方案中，所述治疗性部分为免疫球蛋白的Fc部分、细胞毒素、纳米颗粒、脂质体或化疗剂。
定义
术语“C型凝集素样分子1”、“CLL1”、“CLEC12A”是指C型凝集素/C型凝集素样结构域(CTL/CTLD)超家族的一个成员。该家族的成员共享共同的蛋白质折叠子且具有不同的功能，如细胞粘附、细胞-细胞信号发送、糖蛋白转换和在炎症和免疫反应中的作用。功能上，CLL1为粒细胞和单核细胞功能的负调节物。结构上，CCL1是指核酸和多肽多态变体、等位基因、突变体和种间同系物，其：(1)具有的氨基酸序列与由CCL1核酸编码的氨基酸序列有大于约90%的氨基酸序列同一性，例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的氨基酸序列同一性，优选在至少约25、50、100、200、400个或更多个氨基酸的区域上或在全长上(参见，例如，GenBank登录号：NM_138337.5→NP_612210.4(同种型1)；NM_201623.3→NP_963917.2(同种型2)；NM_001207010.1→NP_001193939.1(同种型3)；(2)结合至抗体，例如，多克隆抗体，其针对包含CLL1多肽(例如，本文描述的CLL1多肽)的氨基酸序列或由CLL1核酸(例如，本文描述的CLL1多核苷酸)编码的氨基酸序列及其保守修饰变体的免疫原产生；(3)在严格杂交条件下，可与对应于编码CLL1蛋白的核酸序列及其保守修饰变体的反义链特异性杂交；(4)具有的核酸序列与CLL1核酸(例如，如本文描述的CLL1多核苷酸和如本文描述的编码CLL1多肽的CLL1多核苷酸)有大于约90%，优选大于约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸序列同一性，优选在至少约25、50、100、200、500、1000、2000个或更多个核苷酸的区域上或在全长上。基于CLL1同系物的知识，本领域技术人员能容易地确定较能容纳取代的残基位置。例如，在种间保守的氨基酸残基对取代或缺失容纳较少。类似地，在种间不保守的氨基酸残基在保留CLL1蛋白功能的同时对取代或缺失容忍较多。
“毒性部分”为使嵌合分子对目标细胞具有毒性的嵌合分子部分。
术语“效应部分”或“治疗性部分”是指预期对靶向部分(例如，本文描述的CLL1肽配体)所靶向的细胞具有效果或用于鉴定免疫缀合物的存在的嵌合分子部分。
术语“嵌合分子”包括关于效应分子与本发明的结合CLL1肽的共价连接。
术语“细胞毒素”通常包括关于相思豆毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素或其修饰的毒素。例如，PE和DT为高毒化合物，其通常通过肝中毒导致死亡。然而，PE和DT可修饰为用作免疫毒素的形式，即通过移除该毒素的天然靶向组分(例如，PE的Ia结构域或DT的B链)并用不同的靶向部分如本文描述的肽将其取代。
术语“接触”包括关于放置为直接物理结合(association)。
如本文所用，“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，且包括关于氨基酸残基的聚合物。如本文所用，术语“肽”以其最广含义使用，指常规的肽(即含有L-氨基酸或D-氨基酸的短多肽)，以及保留期望功能活性的肽等同物、肽类似物和模拟肽。肽等同物可以不同于常规的肽，其通过以相关的有机酸(如PABA)、氨基酸等取代一个或多个氨基酸，或者取代或修饰侧链或功能基。所述术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为对应的天然存在的氨基酸和天然存在的氨基酸聚合物的人工化学类似物。所述术语也适用于包含保守氨基酸取代以便该蛋白保留其功能的聚合物。
除非另有说明，术语“肽等同物”、“肽类似物”、“肽模拟物”和“模拟肽”可互换使用。肽类似物在医药行业通常用作非肽药物，其具有类似于模板肽的性能。(Fauchere,J.(1986)Adv.Drug Res.15:29;Veber and Freidinger(1985)TINS p.392;and Evans etal.(1987)J.Med.Chem30:1229)。肽类似物通常借助计算机化的分子模拟来研制。结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可用于产生等效的治疗性或预防性效果。通常，模拟肽结构上类似于模本(paradigm)多肽(例如，具有生物学或药理活性的多肽)，如天然存在的受体结合多肽，但具有被选自下述的连接任选取代的一个或多个肽连接：—CH2NH—、—CH2S—、—CH2—CH2—、—CH=CH—(顺式和反式)、—COCH2—、—CH(OH)CH2—和--CH2SO—，所述取代通过本领域已知的且进一步描述于以下参考文献中的方法进行：Spatola,A.F."Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins,"B.Weinstein,eds.,Marcel Dekker,New York,p.267(1983);Spatola,A.F.,Vega Data(March1983),Vol.1,Issue3,"Peptide Backbone Modifications"(综述);Morley,J.S.,Trends PharmSci(1980)pp.463-468(综述);Hudson,D.et al.,Int J Pept Prot Res(1979)14:177-185(---CH2NH—,CH2CH2—);Spatola,A.F.et al.,Life Sci(1986)38:1243-1249(—CH2S);Hann,M.M.,J Chem Soc Perkin Trans I(1982)307-314(—CH—CH—,顺式和反式);Almquist,R.G.et al.,J Med Chem(1980)23:1392-1398(—COCH2-—);Jennings-White,C.et al.,Tetrahedron Lett(1982)23:2533(—COCH2—);Szelke,M.et al.,EuropeanAppln.EP45665(1982)CA:97:39405(1982)(—CH(OH)CH2—);Holladay,M.W.et al.,Tetrahedron Lett(1983)24:4401-4404(--C(OH)CH2—);和Hruby,V.J.,Life Sci(1982)31:189-199(--CH2—S—)。所述肽骨架的部分或全部也可被构象受限的环烷基或芳基取代基所取代，以限制本文指定的功能性氨基酸侧链的移动性，如以下参考文献中所述：1.Bondinell et al.Design of a potent and orally active nonpeptide plateletfibrinogen receptor(GPIIb/IIIa)antagonist.Bioorg Med Chem2:897(1994).2.Keenanet al.Discovery of potent nonpeptide vitronectin receptor(alpha v beta3)antagonists.J Med Chem40:2289(1997).3.Samanen et al.Potent,selective,orallyactive 3-oxo-1,4-benzodiazepine GPIIb/IIIa integrin antagonists.J Med Chem39:4867(1996)。
本发明所述肽可通过已知方法制备，如本领域熟知的重组和合成方法。重组技术通常描述于：Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(3rd ed.)Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,(2001)。肽合成技术为大家所熟知，且包括以下文献中所描述的那些技术：Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2456(1963)，Atherton,et al.,SolidPhase Peptide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press(1989)，和Merrifield,Science232:341-347(1986)。也参见Lam,et al.,Nature(1991)354:82-84;Lam,et al.,Chem Rev(1997)97:411-448;和Zhang,et al.,Urol Oncol(2011)PMID:20888272。
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”包括关于整合至蛋白质、多肽或肽(通称“肽”)中的氨基酸。所述氨基酸可为天然存在的氨基酸，且除非另有限制，可包括能够以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的已知的天然氨基酸类似物。
本文所指氨基酸和类似物以缩写命名描述于如下表A中：
表A:氨基酸命名
当用“保守取代”描述蛋白质时是指蛋白质的氨基酸组成这样的变化，其基本上没有改变蛋白质活性。因而，特定氨基酸序列的“保守修饰的变体”是指对蛋白质活性不关键的那些氨基酸的氨基酸取代，或者用其他具有类似特性(例如，酸性、碱性、带正电荷或负电荷、极性或非极性等)的氨基酸进行的氨基酸取代，具有类似特性氨基酸的取代使得甚至关键氨基酸的取代也不大幅改变活性。提供了功能上类似的氨基酸的保守取代表为本领域熟知。表B中下列6组各自含有可彼此互相保守取代的氨基酸：
表B
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
也参见Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties,W.H.Freeman and Company,New York(2nd Ed.,1992)。
术语“基本上相似”在肽的上下文中指示肽包含通过7-10个氨基酸的比较窗与参考序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的序列。序列一致性的百分比是通过借助比较窗比较两个最佳比对序列来确定的，其中对于两个序列的最佳比对，相比参照序列(其不包含添加或缺失)，所述比较窗口中的多核苷酸序列部分可包含添加或缺失(例如，空位)。通过以下方式计算该百分比：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位点数目以产生匹配位点数目，用匹配位点的数目除以比较窗中的位点总数，该结果再乘以100即为序列同一性百分比。
如本文所用，术语“逆反肽(retro-inverso peptide)”是指一种肽，其通常包含与具有L-氨基酸的肽相同的氨基酸序列，但其序列部分或全部地由D-氨基酸组成，因而与用L-氨基酸合成的肽具有相反的立体化学。通过用D-氨基酸以逆序(即所述序列从左向右、从C-末端至N-末端氨基酸的表示与L-氨基酸情况下从N-末端至C-末端的书写或表示相反；见下文)构建肽，可获得恢复了与亲本L-氨基酸肽一样的侧链立体化学的逆反肽。使用逆反肽序列使酶降解最小化，因此，延长了所述肽部分的生物半衰期。同样，这些序列可有利地改变由正常L-氨基酸序列制备的类似缀合物的潜在免疫原性。所述逆反序列(作为游离肽或缀合物)尤其可用于那些需要或优选口服活性剂(由于酶解抗性)的应用。为了本发明的目的，逆反肽以“ri”表示，并从左向右、从C-末端至N-末端氨基酸书写，例如，通常的L-肽符号相反的位置。在一个实施方案中，本发明的逆反肽包括所有的D异构体氨基酸。当所述逆反肽包括所有D异构体氨基酸时，其称为“D-反转肽”。
当术语“基本上纯的”或“分离的”用于描述肽时，是指分离自蛋白质或其他与肽天然相关或在合成期间与肽相关的污染物的肽。在一个实施方案中，肽或多肽占含有所述肽的组合物中至少50%的总多肽含量，且在一个实施方案中至少60%，在一个实施方案中至少75%，在一个实施方案中至少90%，且在一个实施方案中至少95%的总多肽含量。
术语“缀合”、“连接(joining)”、“结合”或“连接(linking)”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子。在本发明的上下文中，该术语包括关于将靶向肽部分与效应分子或效应部分(EM)连接起来。该连接可通过化学或重组方法。化学方法是指靶向肽部分与效应分子间反应从而在这两个分子之间形成共价键以形成一个分子。
术语“体内”包括关于位于所述细胞源自的生物体体内。“离体”和“体外”是指位于所述细胞源自的生物体体外。
词语“恶性肿瘤细胞”或“恶性肿瘤”是指侵略性和/或能够进行转移的肿瘤或肿瘤细胞，例如癌细胞。
如本文所用，“哺乳动物细胞”包括关于源自哺乳动物包括人、大鼠、小鼠、豚鼠、黑猩猩或猕猴的细胞。所述细胞可在体内或体外培养。
关于抗原，术语“选择性反应(selectively reactive)”是指配体(本文为CLL1特异性肽配体)优先整体或部分地与带有该抗原的细胞或组织而非缺少该抗原的细胞或组织结合。当然，应理解，在分子和非靶细胞或组织之间可发生一定程度的非特异性相互作用。尽管如此，可以将选择反应性区别为是通过特异性识别抗原来介导。尽管选择性反应配体可结合抗原，它们可能以低亲和力进行结合。另一方面，特异性结合导致配体和带有该抗原的细胞之间的结合大大强于该结合配体和缺少该抗原的细胞之间的结合。特异性结合通常导致与带有靶抗原的细胞或组织结合的配体量(每单位时间)相比与缺少靶抗原的细胞或组织结合的配体量的增加大于2倍，优选大于5倍，更优选大于10倍，最优选大于100倍。在这样的条件下特异性结合至蛋白，要求所选择的配体针对特定蛋白具有特异性。多种分析形式适于选择与特定蛋白进行特异性免疫反应的配体。例如，固相分析通常用于特异性结合至抗原的配体。参见，Harlow&Lane,ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarbor Publications,New York(1988)，其描述了可用于确定特异性结合反应的分析形式和条件。
术语“阈值水平”是指预定的信号水平(本文为CLL1特异性肽与CLL1的结合信号水平，例如，表达于白血病干细胞上的信号结合水平)，超过该水平表明进行了结合且诊断为白血病阳性，而低于该水平表明没有结合且诊断为白血病阴性。信号水平可基于来自一群个体的测定。
术语“患者”、“对象”和“个体”可互换使用而指哺乳动物，例如，人或非人的灵长类、家养哺乳动物(例如，犬科或猫科)、农业哺乳动物(例如，牛、猪、羊、马)、实验哺乳动物(小鼠、大鼠、仓鼠、兔)。
如本文所用，“给予(administering)”是指局部和全身给予，例如包括，肠内、肠胃外、肺部和局部/经皮给药。可用于本文描述的方法的所述肽及其融合物和缀合物的给予途径包括，例如，经口(per os(P.O.))给予、经鼻或吸入给予、作为栓剂给予、局部接触、经皮递送(例如，通过透皮贴剂)、鞘内(IT)给予、静脉内(“iv”)给予、腹膜内(“ip”)给予、肌肉内(“im”)给予、病灶内给予(例如，瘤内)或皮下(“sc”)给予，或将缓释装置例如微渗透泵、长效制剂等植入对象内。可通过任何途径包括肠胃外和经粘膜(例如，经口、鼻、***、直肠或经皮)途径进行给予。肠胃外给予包括，例如，静脉内、肌肉内、动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、离子透入和颅内给予。其他递送方式包括但不限于，使用脂质体制剂、静脉内输入、经皮贴剂等。
术语“全身给予(systemic administration/systemically administered)”是指通过循环***将化合物或组合物给予至哺乳动物，从而将所述化合物或组合物递送至体内位点，包括药理作用的靶向位点的方法。全身给予包括但不限于，经口、鼻内、直肠和肠胃外(例如，除经消化道外，如肌肉内、静脉内、动脉内、经皮和皮下)给予。
术语“共给予”是指在个体的血液中同时存在两种活性剂。共给予的活性剂可同时或依次递送。
词语“导致被给予”是指由医疗专业人员(例如，医生)或控制对象的医疗护理的人所采取的行为，其控制和/或允许将关注的(at issue)药剂/化合物给予至所述对象。导致被给予可涉及诊断和/或确定合适的治疗或预防方案，和/或为对象开出特定药剂/化合物的药方。该开药方可包括例如，撰写药方表格、解释病历卡等。
术语“有效量”或“对…有效的量”或“治疗有效量”包括关于治疗剂的剂量足以产生期望的结果，如抑制、减少或防止白血病干细胞生长或肿瘤生长；促进白血病干细胞减少或消除；或阻止、减少、抑制或防止白血病干细胞生长、迁移或转移。所用术语“有效量”涉及药物组合物，通常是指活性成分的量，例如需要以其实现期望目标的本发明所述肽。例如，在医疗应用中，有效量为要求给予至患者的量，以导致寻求治疗的特定失调(例如，白血病)的治疗。术语“失调的治疗”表示特定失调症状的减少或消除。有效量通常取决于所述失调的性质、所用的肽、给予方式以及患者的尺寸和健康。在一个实施方案中，对于70kg的患者，本发明所述肽的有效量范围为1μg至1g的肽，且在一个实施方案中为1μg至10mg。在一个实施方案中，所给予的肽(或肽类似物)浓度范围为0.1μM至10mM，且在一个实施方案中为5μM至1mM，在一个实施方案中为5μM至100μM，且在一个实施方案中为5μM至40μM。
如本文所用，术语“治疗(treating/treatment)”是指延迟该术语所适用的疾病或病症(例如，白血病)，或该疾病或病症的一个或多个症状的发作、阻滞或逆转其发展，或对其的缓解或预防。
关于肿瘤或癌的生长或发展，术语“抑制”、“减少”和“降低”是指使用本领域已知的任何方法以可测量的量抑制对象内肿瘤或癌的生长、扩散、转移。如果所带有的肿瘤相比共给予例如作为嵌合分子部分的本发明肽之前所带有的肿瘤，其减少了至少约10%、20%、30%、50%、80%或100%，则肿瘤或癌的生长、发展或扩散得到了抑制、减少或降低。在一些实施方案中，相比给予所述肽之前所带有的肿瘤，肿瘤或癌的生长、发展或扩散被抑制、减少或降低了至少约1倍、2倍、3倍、4倍或更多。
附图说明
图1A-D说明了靶向CLL1的肽的鉴定。A.筛选鉴定CLL1靶向肽的策略。每轮筛选之前，用各种细胞消减C7C噬菌体肽展示文库，以去除能结合至这些混杂细胞类型的噬菌体。B.使噬菌体结合至表达CLL1的细胞。用CLL1-RFP(a)或RFP(b,对照)转染A549细胞，将其与表达CDLRSAAVC(SEQ ID NO:17)肽的噬菌体一起孵育，并用缀合有FITC的抗M13噬菌体抗体进行探测。观察到噬菌体结合至表达CLL1-RFP(c)的A549细胞，而非表达RFP(d)的A549细胞。C.使CDLRSAAVC(SEQ ID NO:17)肽结合至CLL1。合成生物素化的CDLRSAAVC(SEQ ID NO:17)肽并用于探测PBMC、仅用载体转染的A549和表达CLL1的A549细胞。观察到与表达CLL1的A549细胞的特异性结合，但观察到最小的与PBMC或仅用载体转染的A549细胞的结合，或当A549细胞表达CLL1但用膀胱癌特异性配体PLZ4探测时(最右侧图块(panel))。上部图块：用链霉亲和素(SA)-FITC探测的细胞。下部图块：用CLL1靶向肽和SA-FITC探测的细胞。D.CDLRSAAVC(SEQ ID NO:17)肽的结合特异性。将各种来源的细胞与生物素化的CLL1靶向肽或膀胱癌特异性肽(名为PLZ4，作为阴性对照)一起孵育，并用SA-PE探测。
图2A-C说明靶向纳米胶束的特征。A.示意图。B.具有动态光散射(DLS)的纳米胶束的粒径测定。装载有道诺霉素并涂覆有CLL1靶向肽的纳米胶束的中值粒径为约13.5nm且具有窄尺寸分布。C.靶向纳米胶束的透射电子显微镜图。条长度表示50nm。
图3A-C说明了靶向纳米胶束渗透至表达CLL1的A549细胞。A.表达CLL1的A549细胞优先吸收靶向纳米胶束。靶向纳米胶束装载有DiI且涂覆有CLL1靶向肽。将表达GFP-CLL1(图块a)或GFP(图块b，对照)的A549细胞与纳米胶束孵育30分钟。在表达GFP-CLL1的A549细胞(图块c)而非表达GFP的A549细胞(图块d)中观察到强的荧光。B.用来测定靶向纳米胶束的胞内分布的断层摄影分析。将表达GFP-CLL1(图块a)或GFP(图块b)的A549细胞与装载有DiI的靶向纳米胶束一起孵育15分钟，然后洗涤。C.优先将靶向纳米胶束递送至表达CLL1的A549细胞。将表达CLL1的A549细胞与装载有DiI(上部图块)或DNR(下部图块)的非-靶向或靶向纳米胶束一起孵育30分钟，然后洗涤。由于细胞非特异性吸收纳米胶束，随着纳米胶束浓度增加，不存在荧光强度的平稳期。*p<0.05。**p<0.001。
图4A-C说明了具有用CLL1靶向肽修饰的纳米胶束的靶向白血病细胞。A.PMBC、正常造血干细胞(NHSC)和白血病细胞之间的靶向性的比较。将细胞与装载有DNR的非靶向(上部图块)或靶向(下部图块)纳米胶束一起孵育30分钟，洗涤后用流式细胞仪分析。X轴：DNR荧光强度。Y-轴：细胞大小的侧向门(gate)。B.针对CD34(+)临床白血病细胞的药物递送。将CD34(+)临床白血病细胞与均装载有DNR的靶向(左侧图块)或非-靶向(右侧图块)纳米胶束在不同浓度下孵育30分钟，然后用流式细胞仪分析。C.针对CD34(+)临床白血病细胞的剂量依赖性靶向性。将CD34(+)临床白血病细胞与均装载有DiI的靶向(左侧图块)或非-靶向(右侧图块)纳米胶束在不同浓度下孵育30分钟，然后用流式细胞仪分析。对照：用没有装载DiI的纳米胶束处理细胞。每行左侧显示的浓度为DiI浓度。
图5说明了在Balb/c小鼠中，比较200mg/kg的空纳米胶束、5和10mg/kg的游离DNR、装载有DNR的5、10、20和28mg/kg的纳米胶束(每个图块中从左至右)的毒理学研究。在Balb/c小鼠中游离亲本DNR的治疗剂量和最大耐受剂量分别为5和10mg/kg体重。在接受空纳米胶束、游离DNR或装载有DNR的纳米胶束的Balb/c小鼠中，在随后多达10天期间没有观察到明显的重量变化。以高达20mg/kg接受装载有DNR的纳米胶束制剂的小鼠的全血球计数(CBC)和化学检查(AST、ALT、总胆红素、BUN和肌酸酐水平)与以5mg/kg接受游离DNR的小鼠没有统计意义上的不同。除了白血球减少症(图块A)，在用高达20mg/kg(4倍于治疗剂量)的装载有DNR的纳米胶束处理的小鼠中，没有观察到明显的血球计数或血清化学的变化。28mg/kg的剂量看来毒性太大，因为观察到了极大的白血球减少(图块A)、血小板减少(图块B)以及BUN增加。
图6说明了生物素化的肽的合成。
图7说明了CLL1配体的纳米颗粒的合成。
发明详述
1.引言
本发明部分基于下述发现，即包含LR(S/T)基序的肽和多肽特异性结合至C型凝集素样分子1(CLL1)，该分子为优先表达于急性骨髓性白血病干细胞(LSC)上的蛋白。因而，该类肽和多肽可用于优先靶向表达C型凝集素样分子1(CLL1)的急性骨髓性白血病干细胞(LSC)。在不同的实施方案中，包含LR(S/T)基序的肽和多肽包含靶向部分，其可缀合至效应部分。
在一些实施方案中，所述效应部分为纳米颗粒。由两亲性树状聚合物(聚乙二醇-嵌段-树状寡聚胆酸)自组装形成的胶束纳米颗粒可用CLL1靶向肽进行共价修饰，以在AML治疗和预防中用于抗肿瘤剂例如道诺霉素的靶向药物递送。本文描述的肽包膜纳米颗粒直径约为13.5nm，且每20mg树状聚合物可装载多达5mg道诺霉素。这些“靶向纳米胶束”将负载的药物运送至表达重组CLL1的细胞内和体外分离自临床样本的LSC，但不结合至正常血细胞或正常造血干细胞。相比未修饰的纳米胶束，存在于所述纳米胶束表面上的CLL1靶向肽能够改善结合并递送实质上更多的道诺霉素至表达CLL1的细胞和CD34+白血病细胞内。包覆有CLL1靶向肽的纳米胶束可用于去除LSC和改善白血病治疗。
2.C型凝集素样分子1(CLL1)靶向部分
本发明提供了优先和/或特异性结合至例如表达于白血病干细胞(LSC)表面上的C型凝集素样分子1(CLL1)的肽配体，并且其最小地结合或不结合至正常血细胞或正常造血干细胞。通常，所述CLL1特异性肽配体包含氨基酸基序LR(S/T)且约为7至10个或7至9个氨基酸长度。在一些实施方案中，所述肽不超过10个氨基酸长度，例如不大于9、8或7个氨基酸长度。
在不同的实施方案中，所述肽包含氨基酸序列X1LRX4X5X6X7(SEQ ID NO:1)，其中：
X1为任何氨基酸(例如，A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y和任选地C)；
X4为S或T；
X5为A、S或F；
X6为A、G或S；且
X7为A、V、P或F。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列X1LRX4X5X6X7(SEQ ID NO:2)，其中：
X1为任何氨基酸(例如，A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y和任选地C)；
X4为S或T；
X5为A或S；
X6为A或G；且
X7为A、V或P。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列X1LRX4AAX7(SEQ ID NO:4)，其中：
X1为任何氨基酸(例如，A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y和任选地C)；
X4为S或T；且
X7为A或V。在一些实施方案中，X1为P、D、L、T或A。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列X1LRX4AAV(SEQ ID NO:3)，其中：
X1为任何氨基酸(例如，A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y和任选地C)；且
X4为S或T。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列X1LRSSGP(SEQ ID NO:5)，其中X1为任何氨基酸(例如，A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y和任选地C)。
在一些实施方案中，X1为除半胱氨酸残基外的任何氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽选自PLRSAAA(SEQ ID NO:6)、DLRSAAV(SEQ ID NO:7)、LLRTAAV(SEQ ID NO:8)、LLRSAAV(SEQ ID NO:9)、TLRTAAV(SEQ ID NO:10)、ALRSAAV(SEQID NO:11)、VLRSSGP(SEQ ID NO:12)、SLRSSGP(SEQ ID NO:13)、PLRSSGP(SEQ ID NO:14)、TLRSSGP(SEQ ID NO:15)和PTPPFSF(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，所述肽为DLRSAAV(SEQ ID NO:7)。
所述肽还可在氨基和/或羧基端包含1-5个侧翼氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽还包含位于氨基端的半胱氨酸残基和位于羧基端的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述肽可在N-末端和C-末端具有1-5个侧翼L-或D-半胱氨酸残基，例如，以允许所述肽的环化和/或缀合。
例如，在不同的实施方案中，所述肽包含氨基酸序列CX1LRX4X5X6X7C(SEQ ID NO:18)，其中：
X1为除C以外的任何氨基酸(例如，A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y)；
X4为S或T；
X5为A、S或F；
X6为A、G或S；且
X7为A、V、P或F。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列CX1LRX4X5X6X7C(SEQ ID NO:19)，其中：
X1为除C以外的任何氨基酸(例如，A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y)；
X4为S或T；
X5为A或S;
X6为A或G；且
X7为A、V或P。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列X1LRX4AAX7(SEQ ID NO:20)，其中：
X1为除C以外的任何氨基酸(例如，A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y)；
X4为S或T；且
X7为A或V。在一些实施方案中，X1为P、D、L、T或A。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列CX1LRX4AAVC(SEQ ID NO:21)，其中：
X1为除C以外的任何氨基酸(例如，A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y)；且
X4为S或T。
在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列CX1LRSSGPC(SEQ ID NO:22)，其中X1为除C以外的任何氨基酸(例如，A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y)。
在一些实施方案中，所述肽选自CPLRSAAAC(SEQ ID NO:23)、CDLRSAAVC(SEQ IDNO:17)、CLLRTAAVC(SEQ ID NO:25)、CLLRSAAVC(SEQ ID NO:26)、CTLRTAAVC(SEQ ID NO:27)、CALRSAAVC(SEQ ID NO:28)、CVLRSSGPC(SEQ ID NO:29)、CSLRSSGPC(SEQ ID NO:30)、CPLRSSGPC(SEQ ID NO:31)、CTLRSSGPC(SEQ ID NO:32)和CPTPPFSFC(SEQ ID NO:33)。在一些实施方案中，所述肽为CDLRSAAVC(SEQ ID NO:17)。
所述肽可被取代(例如，在一个或两个氨基酸位点)或修饰。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含如上述和本文中描述的氨基酸序列的多肽或肽，其中：
i)一个或多个所述氨基酸残基为D-氨基酸；
ii)所述多肽或肽在N-末端或C-末端或N-末端和C-末端包含保护基；
iii)所述多肽或肽为完全或部分逆反型；
iv)所述多肽或肽包含2个或更多个重复，例如3、4、5、6个或更多个重复；所述重复可为相同或不同的肽；
v)所述多肽或肽为环化的；
vi)一个或多个所述氨基酸残基连接至类肽骨架；
vii)一个或多个所述氨基酸残基为β氨基酸残基；或
viii)所述多肽或肽用烃装订物稳定。
在所述CLL1特异性肽中，一个或多个所述氨基酸可为D-氨基酸。在一些实施方案中，所述肽配体中的所有氨基酸残基均为D-氨基酸。在不同的实施方案中，所述肽配体为部分逆反型或完全逆反型。
通常，所述CLL1特异性肽为基本上纯化的和/或分离的。
在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽(或其重复)可被嵌入或位于较长的多肽序列中，例如融合序列或另外的非天然存在的多肽序列。在一些实施方案中，所述肽被连接(例如，通过化学连接或融合)至一个或多个另外的多肽，例如，位于氨基和/或羧基端。在不同的实施方案中，所述多肽不大于300个氨基酸长度，例如，不大于250、200、150、100、75、50或25个氨基酸长度，且结合至CLL1，例如，表达于白血病干细胞(LSC)表面上的CLL1。
3.效应部分
在不同的实施方案中，所述肽被连接或缀合至效应部分。根据实际情况或需要，所述效应部分可为可检测标记和/或治疗性部分。
另外的氨基酸残基或多肽序列可任选地连接(例如，通过化学连接或融合)至所述肽配体的氨基和/或羧基端。在一些实施方案中，本文描述的CLL1特异性肽序列可嵌入或位于较长的多肽序列中，例如，融合序列或另外的非天然存在的多肽序列。例如，在不同的实施方案中，所述肽被连接至免疫球蛋白的Fc部分(例如，以促进抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC))或连接至细胞毒素。在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽配体被连接至IgG抗体的Fc区。在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽配体被连接至人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的Fc区。
在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽配体被缀合至治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂为抗肿瘤剂。可被包封于所述纳米载体内的示例性化疗剂为本领域已知，且包括但不限于，烷化剂(例如，氮芥、氮脲、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、烷基磺酸盐、卡氮芥、三氮烯)、铂配合物(例如，顺铂、卡铂和草酸铂)、抗代谢物(例如，叶酸类似物(例如，甲氨喋呤)、嘧啶类似物(例如，卡培他滨、5-氟尿嘧啶、5-氟脱氧尿苷、5-氟脱氧尿苷单磷酸盐、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、吉西他滨)、嘌呤类似物(例如，巯嘌呤、硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、喷司他汀、赤羟壬基腺嘌呤、氟达拉滨、克拉屈滨)、植物碱和/或萜类化合物、长春花生物碱(例如，长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛)、足叶草毒素(例如，依托泊苷和替尼泊苷)、喜树碱(例如，伊立替康和拓扑替康)、蒽环类药物、芳香酶抑制剂、紫杉烷(例如，紫杉醇、紫杉酚和多烯紫杉醇)、拓扑异构酶抑制剂(例如，(I型抑制剂：喜树碱包括伊立替康和拓扑替康；II型抑制剂：安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐和替尼泊苷)、抗生素(例如，放线菌D(dactinomycin)、道诺霉素、阿霉素(doxorubincin)、伊达比星(idarubicin)、表阿霉素(epirubicin)、博来霉素、丝裂霉素)、激素、分化剂、激酶抑制剂(例如，贝伐珠单抗、BIBW2992、西妥昔单抗、伊马替尼、曲妥单抗、易瑞沙、兰尼单抗、哌加他尼(Pegaptanib)、索拉非尼、达沙替尼、舒尼替尼、埃罗替尼、尼罗替尼、拉帕替尼、帕尼单抗、凡德他尼(Vandetanib)、E7080、帕唑帕尼、莫立替尼(Mubritinib)和福他替尼(Fostamatinib))和抗肿瘤剂(例如，(放线菌D、阿霉素、表阿霉素、氟达拉滨和博来霉素)。所用的化疗剂为本领域已知且描述于参考书中(例如，Physicians’Desk Reference,65th Ed.,2011,ThomsonHealthcare，或Brunton,et al.,Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics,12th edition,2010,McGraw-Hill Professional)。用于治疗目标癌症的任何化疗剂可缀合至包封于纳米载体中的膀胱癌-特异性肽配体。用于治疗目标癌症的任何化疗剂可直接缀合至所述CLL1特异性肽配体。在不同的实施方案中，所述化疗剂被包封于脂质体或纳米载体中。
在一些实施方案中，所述治疗剂为细胞毒素。可使用的示例性细胞毒素包括相思豆毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素或以上的修饰的毒素。也可使用其他细胞毒素。
在一些实施方案中，所述CLL1结合肽缀合至包封有治疗剂的脂质体或纳米颗粒。用于包封和递送治疗剂的纳米颗粒为本领域已知且可使用。示例性纳米颗粒包括但不限于，例如，用于受控递送抗癌剂的聚乳酸-乙醇酸共聚物(polylactide-co-glycolide)纳米颗粒(Dinarvand,et al.,Int J Nanomedicine.2011;6:877-95)；聚乙烯亚胺(PEI)-As(2)O(3)/Mn(0.5)Zn(0.5)Fe(2)O(4)磁性纳米脂质体(Wang,et al.,Int JNanomedicine.2011;6:871-5)；氧化还原反应响应性聚(乙二醇)-b-聚(乳酸)(MPEG-SS-PLA)纳米颗粒(Song,et al.,Colloids Surf B Biointerfaces.2011,PMID21719259)；硫醇化普朗尼克(Plu-SH)纳米颗粒(Abdullah-Al-Nahain,et al.,Macromol Biosci.2011,PMID21717576)；和介孔氧化硅纳米颗粒(MSNs)(Wu,et al.,Chem Commun(Camb).2011,PMID21716992)。在一个实施方案中，所述膀胱癌特异性结合肽缀合至由胆酸、赖氨酸和聚乙二醇(PEG)共价结合在一起组成的生物相容性纳米胶束，例如描述于，Xiao,et al.,Biomaterials(2009)30:6006-6016；和Luo,et al.,Bioconjug Chem(2010)21:1216-1224。可使用的其他纳米胶束描述于，例如PCT专利公开WO2010/039496。
在一个实施方案中，所述CLL1特异性结合肽缀合至由胆酸、赖氨酸和聚乙二醇(PEG)共价结合在一起组成的生物相容性纳米胶束，例如描述于，Xiao,et al.,Biomaterials(2009)30:6006-6016；和Luo,et al.,Bioconjug Chem(2010)21:1216-1224。最近，研制了由称为树状聚合物的独特两亲性聚合物组成的生物相容性纳米胶束药物递送***[Xiao,et al.,Biomaterials(2009)30:6006-6016;Luo,et al.,Bioconjug Chem(2010)21:1216-1224]。树状聚合物由胆酸、赖氨酸和聚乙二醇(PEG)共价结合在一起组成，其赋予了自组装为具有能够隔离许多种类药物的疏水核心的水溶性球体的能力。胆酸是胆汁酸的主要成分，其具有表面两亲性结构：刚性类固醇骨架，其在一个表面具有4个亲水基，且在该骨架的另一个表面具有疏水甲基。赖氨酸为天然氨基酸。PEG为生物相容性的且已用于改善治疗性药物的药代动力学。该纳米载体***具有许多用于药物递送的诱人特征，如高药物载荷能力、窄的多分散度、规整结构、易于化学修饰、优异的物理和化学稳定性以及生物相容性。
在一些实施方案中，所述肽被连接至可检测标记。例如，在一些实施方案中，所述可检测标记为成像标记、珠子、染料、荧光团、化学发光部分、量子点、纳米颗粒、磁性粒子(例如，氧化铁粒子)、金属粒子(例如，金粒子)或放射性同位素(例如，3H、32P、125I、123I、11C、13N、15O、18F、82Rb、锝-99m(Tc-99m)、铊-201)。在不同的实施方案中，所述CLL1特异性肽配体被缀合至放射性同位素，例如，125I、32P、14C、3H、35S、123I、11C、13N、15O、18F、82Rb、锝-99m(Tc-99m)或铊-201。在不同的实施方案中，所述CLL1特异性肽配体被缀合至磁性粒子，例如磁珠或氧化铁粒子(例如，用于磁共振成像(MRI))。在不同的实施方案中，缀合至所述CLL1特异性肽配体的靶向纳米载体或脂质体包封有成像剂或造影剂。
4.包含CLL1结合肽的组合物
所述CLL1特异性肽配体可制备为各种药物制剂用于给予至患者，包括液体和固体形式的制剂。
包含所述CLL1特异性肽配体的组合物可用于肠胃外、外用、经口或局部给予，包括通过气溶胶或经皮给予，以用于预防性和/或治疗性治疗。根据给予的方法，所述药物组合物可按各种单位剂量形式给予。例如，适于经口给予的单位剂量形式包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂和锭剂。应理解，本发明的多肽和药物组合物，当经口给予时，必须保护免于被消化。通常通过下述手段实现这一点，将所述多肽与组合物复合以使其抗酸性和酶水解，或将该蛋白包装到合适的抗性载体如脂质体中。保护蛋白免于被消化的手段为本领域熟知。
包含所述CLL1特异性肽配体的组合物尤其可用于肠胃外给予，如静脉内给予或给予至体腔或器官内腔(例如，骨髓)。用于给予的组合物通常包括含有溶解于药学上可接受的载体优选含水载体中的所述多肽的多肽溶液。可使用各种含水载体，例如，缓冲盐水等。这些溶液为无菌的且通常不含不良物质。这些组合物可通过常规的熟知的灭菌技术来灭菌。所述组合物可含有药学上可接受的助剂物质以符合近似于生理条件的要求，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。多肽在这些制剂中的浓度可有较大的变化，并且其可根据选定的具体给予方式和患者的需要，主要基于流体容积、粘度、体重等来选择。
液体形式的药物制剂可包括溶液、悬浮剂和乳剂，例如，水或水/丙二醇溶液。适于口服的含水溶液可通过将所述活性组分溶解于水中并根据需要添加合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。适于口服应用的含水悬浮剂可通过将细磨的所述活性组分分散于含有粘性材料的水中来制备，所述粘性材料如天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其他熟知的悬浮剂。对于肠胃外注射，液体制剂可在聚乙二醇水溶液中配制。可使用合适的载体来进行经皮给予。如需要，可使用设计的装置来促进经皮递送。合适的载体和装置为本领域熟知，其示例参见美国专利第6,635,274号、第6,623,457号、第6,562,004号和第6,274,166号。
在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽配制为纳米颗粒。肽纳米颗粒及其制备方法为本领域已知，且描述于，例如，美国专利公开第2006/0251726号、美国专利公开第2004/0126900号、美国专利公开第2005/0112089号、美国专利公开第2010/0172943号、美国专利公开第2010/0055189号、美国专利公开第2009/0306335号、美国专利公开第2009/0156480号和美国专利公开第2008/0213377号，为所有目的，其各自在此通过引用全部并入本文。可使用的其他纳米颗粒制剂描述于，例如Emerich and Thanos,Curr Opin Mol Ther(2008)10(2):132-9;Kogan,et al.,Nanomedicine(2007)2(3):287-306;Zhang,et al.,Bioconjug Chem(2008)19(1):145-152;Scarberry,et al.,J Am Chem Soc(2008)130(31):10258-10262;和Fraysse-Ailhas,et al.,Eur Cells Materials(2007)14(Suppl.3):115。根据实际情况，可将氨基酸序列添加至所述肽配体的N-末端或C-末端或者N-末端和C-末端，以允许所述肽纳米颗粒的组装和形成。
还包括固体形式的药物制剂，旨在于使用前不久将其转变为液体形式制剂用于口服给予。这类液体形式包括溶液、悬浮剂和乳剂。除活性组分外，这些制剂还可包含着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然增甜剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
药物制剂优选为单位剂量形式。所述制剂以这种形式细分为含有适量活性组分的单位剂量。所述单位剂量形式可为包装的制剂，该包装物含有离散量的制剂，如包装的片剂、胶囊剂和于玻璃小瓶或安瓶中的粉剂。同样，所述单位剂量形式本身可为胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂，或者其可为合适数量任何这些的包装形式。
如本说明书所用，术语“单位剂量形式”是指适于作为单一剂量用于人个体和动物的物理上离散的单位，每个单位含有计算的预定量活性物质以联合所需的药用稀释剂、载体或赋形剂一起产生期望的药效。本发明的新型单位剂量形式的规格(specifications)由以下决定且直接取决于：(a)活性物质的独特性质和要获得的具体效果，和(b)本领域混合该活性物质以用于人和动物的内在限制，如本说明书所详细公布，这些为本发明的特征。
在一个实施方案中，按治疗有效剂量将药物制剂给予至患者，以预防、治疗或控制疾病或恶性病症如癌症，例如白血病，尤其是靶向白血病干细胞的白血病。将足以在患者内产生有效的治疗或诊断响应的量的所述药物组合物或药剂给予至患者。有效的治疗或诊断响应是指该响应至少部分地阻止或延缓所述疾病或恶性病症的症状或并发症。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。
5.治疗和/或预防的方法
a.能治疗和/或预防的对象
本文描述的所述CLL1特异性肽配体可用于治疗和预防白血病，尤其是至少部分由表达CLL1的白血病干细胞介导的白血病。在一些实施方案中，所述对象患有、怀疑患有或具有发展急性骨髓性白血病(AML)的风险，尤其是至少部分由表达CLL1的白血病干细胞介导的AML。在一些实施方案中，所述对象可能患有或具有发展AML亚型的风险，包括例如，最低程度分化的急性骨髓性白血病(M0)、未成熟的急性骨髓性白血病(M1)、粒细胞成熟的急性骨髓性白血病(M2)、早幼粒细胞或急性早幼粒细胞白血病(APL)(M3)、急性粒单核细胞白血病(M4)、粒单核细胞伴骨髓嗜酸性粒细胞增多症(M4eo)、急性单核母细胞性白血病(acutemonoblastic leukemia)(M5a)、急性单核细胞性白血病(M5b)、急性红白血病包括红白血病(M6a)、纯红白血病(M6b)、急性巨核细胞白血病(M7)或急性嗜碱性白血病(M8)。
所述对象可为无症状的或表现有白血病症状。所述对象可能具有家族白血病史，例如父母、祖父母或兄弟姐妹曾被诊断为患有白血病。所述对象可为成人、青少年或儿童。
可将所述CLL1特异性肽配体给予至患者以实现抑制、减少、消除或防止在其细胞表面表达或过表达CLL1的白血病干细胞(LSC)的增殖或生长。在产生治疗作用的情况下，患者患有白血病，并且给予其所述CLL1特异性肽配体能够逆转、延迟或抑制疾病的发展。在产生预防作用的情况下，患者可能处于缓解期或可能接受了骨髓移植，并且给予其所述CLL1特异性肽配体能够延缓、减少、抑制或消除转移的生长或疾病的复发。
b.给予方法
i.给予途径
本文描述的CLL1特异性肽配体可配制为药物制剂用于给予至患者。可通过各种方法给予所述药物制剂。方法可包括全身给予，其中所述多肽或多肽组合物通过循环***递送至体内的位点，包括药物作用的靶位点。全身给予包括但不限于，经口和肠胃外(例如，除通过消化道外如肌肉内、静脉内、动脉内、经皮和皮下)给予。在其他实施方案中，局部给予所述CLL1特异性肽配体，例如直接给予至骨髓或瘤内给予。
ii.剂量
可给予所述CLL1特异性肽配体以用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，将包括所述CLL1特异性肽配体的组合物以足够的量给予至患有白血病或具有发展白血病风险的患者，以治愈或至少部分阻止该疾病及其并发症，例如，通过消除或减少白血病干细胞的数量，和/或阻止其增殖和/或生长。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。该应用的有效量将取决于疾病的严重性和患者健康的总体状况，且通常进行临床研究来确定给定癌症类型的最佳剂量。所述化合物的有效量为其提供主观上的症状缓解或者由临床医生或其他有资质的观察者可客观鉴定的改善。
在预防性应用中，将包括所述CLL1特异性肽配体的组合物给予至还未处于疾病状态的患者，以预防疾病的发作。该剂量被定义为“预防有效剂量”。在该应用中，准确的量还是取决于患者的健康状况。
确定有效量完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是基于本文提供的详细公开。通常，本发明一个或多个多肽的组合的有效量(efficacious amount或effectiveamount)是通过如下步骤来确定的：首先给予低剂量或少量的多肽或组合物，然后逐渐增加给予的剂量或用量，根据需要加入第二或第三药物，直到在接受治疗的对象体内观察到期望的效果以及最小的或无毒副作用。可用于确定给予本发明组合物的合适剂量和给药方案的方法描述于，例如，Brunton,et al.,Goodman and Gilman's The PharmacologicalBasis of Therapeutics,Twelfth Edition,2010,McGraw-Hill Professional；Physicians’Desk Reference(PDR),65thEdition,2011；Remington:The Science andPractice of Pharmacy,21stEd.,2006,同上；以及Martindale:The Complete DrugReference,Sweetman,2005,London:Pharmaceutical Press，和Martindale,Martindale:The Extra Pharmacopoeia,31st Edition.,1996,Amer Pharmaceutical Assn，其在此各自通过引用并入本文。
本文描述的药物制剂的示例性剂量包括每千克对象或样品重量的所述CLL1特异性肽配体毫克(mg)或微克(μg)量(例如，每千克约1μg至每千克约500mg、每千克约100μg至每千克约5mg，或每千克约1μg至每千克约50μg)。而且应理解，所述CLL1特异性肽配体的合适剂量取决于所述组合物对于要实现的期望效果的效力。当所述CLL1特异性肽配体要给予至哺乳动物时，医生、兽医或研究人员可，例如，先开出相对低的剂量处方，随后增加该剂量直至得到合适的响应。此外，应理解，任何特定哺乳动物对象的特定剂量水平将取决于各种因素，包括所用特定组合物的活性、所述对象的年龄、体重、总体健康、性别和饮食、给予时间、给予途径、***率、任何药物组合以及待调控的表达或活性的程度。
本发明多肽的合适剂量将根据一些因素而改变，包括所选的给药途径、组合物的配方、患者响应、病症的严重程度、对象体重和开处方医师的判断。根据个别患者的要求，该剂量可随时间增加或降低。通常，最初给予患者低剂量，然后增加至患者能够忍受的有效剂量。
所给予的CLL1特异性肽配体剂量取决于温血动物(哺乳动物)的种类、体重、年龄、个体状况、待治疗区域的表面积和给予形式。剂量大小还可通过伴随将特定化合物给予至特定对象的任何副作用的存在、性质和程度来确定。用于给予至约50-70kg的哺乳动物的单位剂量可含有约5-500mg的活性成分。通常，所述CLL1特异性肽配体的剂量为足以获得期望效果的剂量。
组合物的最佳剂量、毒性和治疗效果还可根据单个组合物的相对效力而改变，且可通过在细胞培养物或实验动物中进行的标准药学方案来确定，例如，通过确定LD50(50%群体的致死剂量)和ED50(50%群体的治疗有效剂量)。毒性效应和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，且可表示为比率LD50/ED50。优选展现大治疗指数的组合物。当可使用展现毒副作用的组合物时，应注意设计使该组合物靶向受影响组织位点的递送***，以使对正常细胞的潜在损害最小化，从而减小副作用。
获自例如动物研究(例如，啮齿动物和猴)的数据可用于制定用于人的剂量范围。本发明多肽的剂量优选位于包括很少或无毒性的ED50的循环浓度范围内。根据所用的剂型和给药途径，所述剂量可在该范围内变化。对于用于本发明方法的任何组合物，最初可从细胞培养分析中估计治疗有效量。可在动物模型中制定剂量以获得包括如在细胞培养中测得的IC50(实现对症状半最大抑制的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可用于更准确地确定用于人的剂量。可通过例如高效液相色谱(HPLC)来测量血浆中的水平。
通常，对于典型的对象，多肽或组合物的剂量当量为约1.0ng/kg至100mg/kg。本发明典型的多肽组合物用于静脉内给药可为每个患者每天约1ng/kg至100mg/kg，例如，每个患者每天约1.0μg/kg至10mg/kg。在不同的实施方案中，可使用每个患者每天约10μg/kg至1.0mg/kg的剂量。制备可给予的组合物的现有方法为本领域技术人员已知或显而易见，且更详细地描述于这类出版物中，如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21stEd.,2006,Lippincott Williams&Wilkins。
在本发明一个实施方案中，所给予的本发明药物制剂，例如，每日剂量范围为约1ng化合物/kg对象体重(1ng/kg)至约100mg/kg。在另一个实施方案中，该剂量为约1.0μg/kg至约50mg/kg范围内的剂量。在又一个实施方案中，该剂量为约10μg/kg至约25mg/kg。在另一个实施方案中，该剂量为约25μg/kg至约15mg/kg。
根据需要，所述药物制剂的示例性剂量可包括每日剂量100-500mg。药物制剂可按约25mg/mL至约50mg/mL的浓度给药。所述药物制剂的示例性剂量可包括每日剂量约5-20mg/kg，例如，每日剂量约10mg/kg。
在涉及给予缀合至包封有治疗剂(例如，化疗剂)的纳米颗粒的CLL1特异性结合肽的实施方案中，经修饰和装载的纳米颗粒可按约5mg/kg至约200mg/kg的剂量范围给予，例如，按约10mg/kg至约100mg/kg的剂量范围给予，例如按约5、10、15、25、50、75、100、150或200mg/kg的剂量给予。由于修饰的纳米颗粒通过缀合的CLL1特异性结合肽靶向LSCs，包封的化疗剂的剂量可能会高于如果单独给予(例如，未包封于所述纳米颗粒中)该化疗剂时的剂量。在一些实施方案中，相比给予的未包封于所述纳米颗粒内的同样的化疗剂的剂量，纳米颗粒包封的化疗剂的剂量为1倍、2倍、3倍、4倍或更多。未包封的化疗剂的剂量为本领域已知。参见，例如，Brunton,et al.,Goodman and Gilman's The Pharmacological Basisof Therapeutics,Twelfth Edition,2010,McGraw-Hill Professional and Physicians’Desk Reference(PDR),65thEdition,2011。
进行成功处理后，可取的是使对象接受维持治疗以防止治疗的疾病或恶性病症的复发。
iii.方案
给药方案可测量对象体内的多肽来计算。通常，剂量为1ng至1,000mg/kg体重，且其可根据需要或实际情况每日、每半周、每周、每两周、每半月、每月、每两月或每年给予一次或多次。本领域技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复频率。按照已有的本领域已知方案和本文的公开，本领域技术人员将能够确定将本发明的多肽或多肽组合物给予至人的最佳给药剂量。
根据所需的以及患者耐受的剂量和频率，可进行单次或多次给予所述药物制剂。在任何事件中，所述组合物应提供足够量的本发明的多肽以有效治疗患者。优选地，给予所述剂量一次，但可定期应用直至获得治疗结果或直至副作用使得需要中断治疗。通常，所述剂量足以治疗或缓解症状或病征而不产生患者不可接受的毒性。
每日剂量可每日给予一次，或分为亚剂量(subdose)并以多次剂量给予，例如每日2次、3次或4次。然而，如本领域技术人员所理解，本文描述的组合物可以不同的量和不同的次数给予。本领域技术人员还应理解，一些因素可影响有效治疗对象所需的剂量和方案，包括但不限于，疾病或恶性病症的严重性、先前的治疗、对象的总体健康和/或年龄和其他存在的疾病。而且，用治疗有效量的组合物治疗对象可包括一次治疗或，优选地，可包括一系列治疗。
因而，用于静脉内给予的其药物制剂为每患者每日约0.01至100mg/kg。可使用每患者每日0.1至多达约1000mg/kg的剂量，尤其是当将所述药物给予至隐蔽位点且不进入血液中时，如给予至体腔或器官内腔中。制备可经肠胃外给予的组合物的现有方法为本领域人员已知或显而易见，且更详细地描述于这类出版物中，如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,21stEd.,2006,Lippincott Williams&Wilkins。
为获得期望的治疗效果，可将药物制剂以治疗有效的每日剂量给予多日。因而，治疗有效地给予组合物以治疗本文描述的对象体内的疾病或恶性病症可能需要定期(例如，每日)给予，持续3天至2周或更长。通常，根据需要，可给予组合物至少3个连续日，通常至少5个连续日，更通常至少10个连续日，且有时20、30、40个或更多个连续日，或更长时间。当连续每日剂量为获得治疗有效剂量的优选途径时，甚至在所述化合物或组合物没有每日给予时也可获得治疗有益效果，只要将所述给药以足够频率重复，使得能够在对象内维持所述组合物的治疗有效浓度。例如，可每2天、每3天给予组合物，或者如果使用更高剂量范围且对象可耐受，则每周给予一次。
c.用现有抗癌疗法进行联合治疗
i.化学疗法
本文描述的CLL1特异性肽配体可与其他药剂共同给予作为联合治疗。
可与所述CLL1特异性肽配体共同给予的化疗剂实例包括但不限于，烷化剂(顺铂、卡铂和草酸铂)；抗-代谢物(嘌呤或嘧啶模拟物，包括例如咪唑硫嘌呤和巯嘌呤)；植物碱和萜类化合物(长春花生物碱和紫杉烷)；长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛)；足叶草毒素(包括依托泊苷和替尼泊苷)；紫杉烷(紫杉醇、紫杉酚和多烯紫杉醇)；拓扑异构酶抑制剂(I型抑制剂：喜树碱、伊立替康和拓扑替康；II型抑制剂：安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐和替尼泊苷)；抗肿瘤剂(阿糖胞苷(ara-C)、道诺霉素、伊达比星、放线菌素D、阿霉素、表阿霉素、氟达拉滨和博来霉素)。任何用于治疗目标癌症的化疗剂都可与所述CLL1特异性肽配体在复合治疗方案中共给予。
ii.放射疗法
所述CLL1特异性肽配体可结合放射操作步骤给予。有多种放射操作步骤可用于疾病治疗。本领域技术人员已知的任何这些操作步骤均可与本发明的所述多肽组合用于治疗患者。放射操作步骤包括用放射疗法治疗以破坏细胞DNA。可通过用光子、电子、质子、中子或离子束直接或间接地使构成DNA链的原子离子化来破坏细胞DNA。由于水的离子化而发生间接离子化，形成自由基，尤其是羟基，其接着可破坏DNA。在放射治疗的最常见形式中，放射效果大多数是通过自由基产生的。由于细胞的DNA修复机制，使用诱导DNA双链破裂的试剂，如放射疗法已经证明为一种非常有效的癌症治疗技术。通常，癌细胞为未分化的和干细胞样细胞，这类细胞复制更为快速，且相比健康和更分化细胞具有更小的修复亚致死损伤的能力。而且，DNA损伤通过细胞***遗传，导致癌细胞的损伤积累，使得复制更缓慢并通常引起死亡。
用于放射疗法操作步骤的放射量以戈瑞(Gy)度量，并且根据接受治疗的癌症类型和阶段以及患者的总体健康状况改变。剂量范围也可受到癌症类型的影响，例如，上皮实体肿瘤的典型治愈剂量范围为60-80Gy，而淋巴瘤的剂量范围为20-40Gy。
也可使用预防性(辅助性)剂量，且范围通常为45-60Gy，以1.8-2Gy的分割剂量给予(例如，对于乳腺癌、头颈癌)。许多其他因素是熟知的，且在选择剂量时本领域技术人员会予以考虑，包括患者是否在接受其他治疗(例如，但不限于给予所述CLL1特异性肽配体、给予化学治疗等)、患者并存病、放射治疗的时间安排(例如，放射治疗是在手术前还是手术后给予)，以及任何外科手术操作步骤的成功程度。
在治疗规划期间本领域技术人员可确定开出的放射剂量处方的递送参数。可在专门的计算机上应用专门的治疗规划软件来实施治疗规划。可根据放射递送方法，使用一些角度或来源来汇总总的需要剂量。通常，设计一个递送均匀处方剂量至肿瘤的计划，并使到周围健康组织的剂量最小化。
iii.外科手术
所述CLL1特异性肽配体可结合外科手术移除或肿瘤减积进行给予，例如，骨髓移植。本领域技术人员已知的任何操作步骤均可结合本发明的CLL1特异性肽配体的给予，以用于治疗和/或预防患者的白血病。
6.监测效力的方法
可使用各种方法测定用本文描述的CLL1特异性肽配体进行的治疗性和预防性治疗的效力。通常，效力是指产生效应而无明显毒性的能力。效力表明给定干预(干预的实例可包括但不限于给予药物制剂、应用医疗设备或采用外科手术操作步骤)的治疗提供了治疗性或预防性效果。可通过比较治疗的和未治疗的个体，或通过比较治疗前和治疗后的相同个体来测量效力。可使用各种方法测定治疗效力，包括药理学研究、诊断研究、预测性研究和预后性研究。效力指示的实例包括但不限于，肿瘤细胞生长的抑制和肿瘤细胞死亡的促进。
可通过本领域熟知的各种方法来评估抗癌治疗的效力。可在动物模型中与未治疗的或安慰剂对照比较来筛选所述CLL1特异性肽配体的预防性或治疗性效力。然后分析通过该筛选确定的所述CLL1特异性肽配体诱导肿瘤细胞死亡或提高免疫***激活的能力。例如，可针对培养物中的肿瘤细胞系检测血清的多个稀释液，且可使用检测细胞死亡或细胞生长抑制的标准方法。(参见，例如，Maniatis,et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Lab.,New York,1982;Ausubel,et al.Editor,CurrentProtocols in Molecular Biology,USA,1984-2008;和Ausubel,et al.Editor,CurrentProtocols in Molecular Biology,USA,1984-2008;Bonifacino,et al.,Editor,CurrentProtocols in Cell Biology,USA,2010;以上所有文献均通过引用全部并入本文)。
本发明提供了检测患有或怀疑患有各种癌症的患者的抑制疾病的方法。可使用各种方法监测有症状患者的治疗性治疗和无症状患者的预防性治疗。
在给予所述CLL1特异性肽配体的剂量之前，监测方法可能需要测定患者肿瘤负荷的基线值和/或白血病干细胞(LSC)的存在，并将其分别与治疗后的肿瘤负荷值和/或白血病干细胞(LSC)的存在比较。
关于使用所述CLL1特异性肽配体进行的治疗，肿瘤负荷值的明显降低(例如，大于同样样品的重复测量值的实验误差的典型容限，表示为该测量平均值的标准偏差)和/或白血病干细胞(LSC)存在，显示了阳性治疗结果(例如，给予所述CLL1特异性肽配体已经阻止或抑制，或者降低了肿瘤的进展和/或LSC生长和/或转移)。在一些实施方案中，例如通过比较治疗前和治疗后对象的肿瘤负荷和/或白血病干细胞(LSC)存在，如果在接受治疗的对象中肿瘤负荷和/或白血病干细胞(LSC)存在减少了至少约10%，例如，减少了至少约20%、30%、40%或50%，或完全消除了肿瘤负荷和/或白血病干细胞(LSC)存在，则用所述CLL1特异性肽配体进行的治疗被认为是有效的。
在其他方法中，从已经接受了所述CLL1特异性肽配体治疗的个体的对照群体测定肿瘤负荷的对照值(例如，均值和标准偏差)和/或白血病干细胞(LSC)存在。将患者肿瘤负荷的测量值和/或白血病干细胞(LSC)存在与所述对照值比较。如果患者的测量水平没有明显不同于(例如，大于一个标准偏差)所述对照值，则可中断治疗。如果患者的肿瘤负荷水平和/或白血病干细胞(LSC)水平明显大于所述对照值，则确保连续给予药剂。
在其他方法中，监测目前没有接受治疗但此前经历了治疗过程的患者的肿瘤负荷和/或白血病干细胞(LSC)存在，以确定是否需要恢复治疗。可将患者肿瘤负荷的测量值和/或白血病干细胞(LSC)存在与此前在先前的治疗过程后获得的患者的肿瘤负荷值和/或白血病干细胞(LSC)存在进行比较。肿瘤负荷和/或白血病干细胞(LSC)存在相对于此前的测量有明显降低(例如，大于同样样品的重复测量值误差的典型容限)表明可恢复该治疗。可选择地，可将患者的测量值与在经历治疗过程后的患者群体中测得的对照值(均值加上标准偏差)比较。可选择地，可将患者的测量值与接受了预防性治疗后保持无疾病症状或表现出疾病特征改善的患者群体的对照值比较。在所有这些情况下，肿瘤负荷和/或白血病干细胞(LSC)存在相对于对照水平明显增加(例如，大于一个标准偏差)表明应当恢复患者的治疗。
用于分析的组织样品通常为来自患者的血液、骨髓或***。可分析该样品用于指示瘤形成。可使用本领域已知的任何方法检测瘤形成或肿瘤负荷和/或白血病干细胞(LSC)存在，例如，由具有资格的病理学家进行活检样品的目测检查或其他可视化技术，例如，放射摄影术、超声波、磁共振成像(MRI)。
7.诊断方法
a.诊断的患者对象
所述CLL1特异性肽配体的结合可用于检测和诊断对象的白血病，尤其是急性骨髓性白血病(AML)。在一些实施方案中，所述对象可能患有或有发展AML亚型的风险，包括例如，最低程度分化的急性骨髓性白血病(M0)、未成熟的急性骨髓性白血病(M1)、粒细胞成熟的急性骨髓性白血病(M2)、早幼粒细胞或急性早幼粒细胞白血病(APL)(M3)、急性粒单核细胞白血病(M4)、粒单核细胞伴骨髓嗜酸性粒细胞增多症(M4eo)、急性单核母细胞性白血病(M5a)、急性单核细胞性白血病(M5b)、急性红白血病包括红白血病(M6a)、纯红白血病(M6b)、急性巨核细胞白血病(M7)或急性嗜碱性白血病(M8)。本发明的CLL1特异性配体可结合至细胞表面上的CLL1。可测定所述CLL1特异性肽配体在白血病干细胞上的结合水平。为了确定所述CLL1特异性肽配体是否结合至LSC，可进行生物样品取样，例如血液或骨髓。
因而，可从本发明方法受益的患者可能已经存在白血病症状。例如，可能存在白血病的证据(通过目测检查或触诊(例如，检查或诊断***、脾脏和/或肝脏)、检测白血细胞群或通过扫描技术例如，磁共振成像(MRI)或正电子发射断层(PET)扫描)。
本发明的诊断方法可与目前可用的用于白血病尤其是AML的诊断测试结合使用。患者可能初步诊断患有白血病，例如，基于升高的白血细胞数量和其他症状和/或本领域已知的诊断参数。在这类情况下，例如从血液、骨髓和/或***获得生物样品可能是恰当的，且检测所述CLL1特异性肽配体的结合水平或CLL1在怀疑为癌细胞的细胞表面上的表达水平，能够确认或否认至少部分由CLL1的表面表达介导的白血病尤其是AML的初步诊断。
在其他情况下，患者可能具有白血病或另一组织来源癌症的个人或家族病史。例如，在成功的白血病治疗性治疗后患者可能处于缓解状态。患者可能还具有检测为阳性的与白血病风险增加或白血病复发有关的基因。在不同的实施方案中，所述对象为成人、青少年或儿童。
b.获取生物样品
从中测量表达水平的生物样品取决于怀疑为癌组织的组织。通常，所述生物样品来自怀疑为癌组织和/或怀疑含有白血病干细胞的组织，例如血液、骨髓、***。
在一些实施方案中，所述生物样品来自活组织检查，例如骨髓或***。在一些情况下，例如，在测定癌症转移的存在中，可能是合适的是，生物样品来自除血液、骨髓或***外的组织。在一些实施方案中，可能合适的是，测量不同于怀疑为癌组织的组织中CLL1特异性肽配体结合水平的存在，例如，以确定转移的存在。
c.确定癌症的存在
可根据本领域熟知的和本文描述的方法，测量结合所述CLL1特异性肽配体的水平。例如，可使用直接或间接标记的检测试剂，例如，以荧光、放射性或酶法标记的CLL1特异性肽配体来检测肽配体结合的水平。例如，所述肽可缀合至标记的珠子，例如，所述珠子可通过荧光标记、化学发光标记、量子点标记或任何本领域已知的其他标记来检测。使用标记的珠子的分析为本领域熟知。
为了提供示例性实例，从对象获得了血液、骨髓或***组织样品。然后使所述血液、骨髓或***细胞与本文描述的CLL1特异性肽配体接触。所述肽可为直接标记的，例如，通过缀合或结合至标记的珠子。例如，可使用荧光团、化学发光部分或量子点或任何其他可检测的标记来标记珠子。缀合至珠子的肽有助于检测所述肽配体与血液、骨髓或***样品中癌细胞的结合和与所述肽配体结合的癌细胞的浓度。然后可对标记细胞的存在进行检测和定量。例如，可使用显微镜或通过流式细胞术来检测包覆有缀合至CLL1特异性肽配体的珠子的细胞。
在一些实施方案中，所述CLL1特异性配体连接(例如，通过化学连接或融合)至用于抗体结合的已知表位(例如，免疫球蛋白Fc、FLAG标签或c-myc表位)。可使用本领域已知的免疫分析包括免疫组织化学着色、蛋白质印迹法、ELISA等、利用选择性结合至抗体表位或其片段的抗体，测量单独的或连接至抗体表位的肽配体。使用抗体在免疫分析中检测肽为本领域已知(参见，例如，Harlow&Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual(1998);Coligan,et al.,eds.,Current Protocols in Immunology(1991-2010);Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(3rd ed.1996);和Kohler&Milstein,Nature256:495-497(1975)。
可使用本领域已知的任何方法检测所述CLL1特异性肽配体与LSC的结合水平。示例性方法包括流式细胞术、组织溶解产物检测、蛋白质免疫印迹和免疫组织化学检测。
为了提供示例性实例，将血液、骨髓或***组织样品(例如活组织检查样品)与单独的或连接至表位标签的、特异性结合至所述CLL1特异性肽配体的抗体一起孵育，孵育条件(例如，时间、温度、样品浓度)足以允许发生特异性结合。任选地将所述组织固定(例如，于甲醛中)并通透化，然后与抗体一起孵育。如需要，可将抗肽抗体暴露于组织样品约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0小时，或过夜约8、10或12小时。然而，根据例如抗原的组成、样品的稀释和孵育温度，孵育时间可更长或更短。利用较少稀释样品和较高温度的孵育可进行较短的时间。通常孵育在室温(约25℃)或生物学温度(约37℃)下进行，且可在冷箱(约4℃)中进行。洗涤以除去未结合的样品，然后按照已知的免疫分析方法执行第二抗体加入。
可直接标记所述CLL1特异性肽配体，或可将标记的第二抗体用于检测样品中已经结合至所述肽配体的抗体。第二抗体结合至免疫球蛋白的不同类型或同种型—IgM、IgD、IgG、IgA和IgE的恒定区或“C”区。通常，本发明方法使用针对IgG恒定区的第二抗体。针对IgG亚类例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的第二抗体也可用于本发明方法中。可用任何能够直接或间接检测的部分来标记第二抗体，包括荧光团(例如，荧光素、藻红蛋白、量子点、Luminex珠、荧光珠)、酶(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(例如，3H、32P、125I、123I、11C、13N、15O、18F、82Rb、锝-99m(Tc-99m)、铊-201)或化学发光部分。可使用生物素和生物素结合部分(例如，亲和素、链酶亲和素、中性链亲和素(neutravidin))的复合物来放大标记信号。荧光标记的抗人IgG抗体为可从分子探针公司(Molecular Probes,Eugene,OR)商购获得。酶标记的抗人IgG抗体可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO和Chemicon,Temecula,CA商购获得。
检测样品中所述CLL1特异性肽配体的结合水平的方法对应于第二抗体的标记的选择。例如，如果将含有与所述肽配体的粘合剂的组织裂解物转移至适合免疫印迹的膜基质上，如果使用了酶标记，则可使用数字成像仪来定量所述可检测的信号(例如，印迹(blots))，或者如果使用了放射性同位素标记，则可使用x-射线膜显影剂。同样，接受免疫组织化学检查的组织样品可使用免疫荧光显微镜或扫描显微镜和能够检测和定量荧光性、化学发光性和/或比色信号的自动扫描软件来评估。这类检测方法为本领域熟知且被描述于本文中。
常规免疫分析和免疫组织化学技术为本领域熟知。参数优化的指导可参见例如，Wu,Quantitative Immunoassay:A Practical Guide for Assay Establishment,Troubleshooting,and Clinical Application,2000,AACC Press;Principles andPractice of Immunoassay,Price and Newman,eds.,1997,Groves Dictionaries,Inc.;The Immunoassay Handbook,Wild,ed.,2005,Elsevier Science Ltd.;Ghindilis,Pavlovand Atanassov,Immunoassay Methods and Protocols,2003,Humana Press;Harlow andLane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,1998,Cold Spring Harbor LaboratoryPress;Immunoassay Automation:An Updated Guide to Systems,Chan,ed.,1996,Academic Press;Dabbs,Diagnostic Immunohistochemistry:Theranostic and GenomicApplications,2010,Saunders;Renshaw,Immunohistochemistry:Methods ExpressSeries,2007,Scion Publishing Ltd.;和Buchwalow andImmunohistochemistry:Basics and Methods,2010,Springer。
所述CLL1特异性肽配体的结合或增加的结合的存在，通过免疫分析或免疫组织化学分析中的可检测信号(例如，印迹、荧光、化学发光、颜色、放射性)来显示，其中将来自患者的生物样品与特异性结合至所述肽配体或表位标签的抗体或抗体片段接触。
可将可检测信号与来自正常或非癌症对照样品(例如，来自血液、骨髓或***)的信号或阈值比较。在一些实施方案中，例如，当相比正常或非癌症对照样品中肽配体结合水平的信号或预定的阈值，测试样品中肽配体结合水平的可检测信号至少大约10%、20%、30%、50%、75%时，检测到所述CLL1特异性肽配体结合或增加的结合的存在，且表明存在或具有增加的癌症风险。在一些实施方案中，当相比正常或非癌症对照样品中CLL1特异性肽配体结合水平的信号或预定的阈值，测试样品中CLL1特异性肽配体结合水平的可检测信号为至少约1倍、2倍、3倍、4倍或更多时，检测到CLL1特异性配体的增加的结合水平，且表明存在或具有增加的癌症风险。通常，所述样品和对照或预定的阈值水平来自相同的组织类型。
在一些实施方案中，将所述CLL1特异性肽配体结合水平与已知为癌症的对照组织或对照细胞中的CLL1特异性肽配体结合水平比较。在这种情况下，测试生物样品中所述CLL1特异性肽配体结合水平等于或大于已知为癌症样品的阳性对照样品的水平，表明患有癌症。通常，所述样品和对照或预定的阈值水平来自相同的组织类型(例如，血液、骨髓或***组织)。
可选择地，如果测试生物样品中所述CLL1特异性肽配体结合水平小于阳性癌症对照组织中所述CLL1特异性肽配体结合水平或预定的阈值水平，那么通常不表明为癌症诊断。同样，如果测试生物样品中所述CLL1特异性肽配体结合水平等于或小于正常或非癌症对照的水平或预定的阈值水平，那么不表明为癌症诊断。
在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽配体结合水平测定的结果记录在有形介质中。例如，本发明诊断分析的结果(例如，观察到CLL1特异性肽配体结合的存在或增加的存在)和确定是否存在或具有增加的癌症风险的诊断可被记录，例如，于纸质或电子介质(例如，录音带、计算机光盘、CD、闪存驱动等)。
在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述CLL1特异性肽配体结合水平测定结果，为患者提供患者是否存在或具有增加的癌症风险的诊断的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述CLL1特异性肽配体结合水平测定结果，为患者提供或推荐合适的治疗过程的步骤。
基于本文描述的CLL1特异性肽配体与怀疑含有LSC的生物样品(例如，血液、骨髓和/或***)的结合，确定对象内是否存在白血病和/或表达CLL1的白血病干细胞的方法，可结合其他诊断白血病的已知方法来进行。
8.原位成像方法
本文描述的所述CLL1特异性肽配体可用于白血病干细胞(LSC)局部可视化的方法中，例如，所述白血病干细胞可能存在于对象的血液、骨髓和/或***中。缀合至可检测标记例如荧光标记的CLL1特异性肽配体可用于该应用中。
所述CLL1特异性肽配体另一预期的应用是可补充或降低侵入性活体组织的LSC的成像检测。可在怀疑患有或已知患有白血病的对象内进行磁共振成像(MRI)和正电子发射断层扫描(PET)。MRI和PET扫描均已经广泛用于诊断恶性肿瘤，并可用于诊断和检测白血病恶性肿瘤。因此，MRI和PET或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)可用于促进使用缀合至成像剂的本文描述的CLL1特异性肽配体检测白血病，所述成像剂例如，用于MRI的铁氧化物和用于PET/SPECT的放射性同位素(例如，123I、11C、13N、15O、18F、82Rb、锝-99m(Tc-99m)、铊-201)。
为了允许能够在原位成像，将结合至合适的成像剂的CLL1特异性肽配体与对象(例如，血液、骨髓、***)内怀疑含有或已知含有白血病干细胞(LSC)的组织接触。通过对患者实施合适的成像方法，可确定成像组织中LSC的位置和范围。
在一些实施方案中，所述方法还包括例如，基于对所述CLL1特异性肽配体结合的检测，将LSC从所述组织中移除、切除或切割。缀合至CLL1特异性肽配体的磁性粒子还可用于去除和移除LSC。使用磁性纳米颗粒-肽缀合物用于体外和体内靶向并去除癌细胞被描述于，例如，Scarberry,et al.,J Am Chem Soc(2008)130(31):10258-10262。
9.试剂盒
本发明还提供了包含如本文描述的CLL1特异性肽配体的试剂盒。所述包含CLL1特异性肽配体的试剂盒的实施方案如本文所描述。在一些实施方案中，所述CLL1特异性肽配体缀合至或结合至标记的珠子。
此外，所述试剂盒通常包括揭示使用所述CLL1特异性肽配体的方法的指导材料。在所述试剂盒中，所述CLL1特异性配体可配制为用于给药，且以一个或多个单位剂量的形式提供。所述试剂盒还可包含其他组分以促进为所述试剂盒设计的特定应用。所述试剂盒可另外包含缓冲剂和实施特定方法常规使用的其他试剂。该试剂盒和合适的内含物为本领域技术人员所熟知。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和示例的方式相当详细地描述了上述发明，对本领域技术人员显而易见的是，鉴于本发明的教导，可在不背离所附权利要求的精神或范围下对其作出一些改变和修饰。
实施例
提供下述实施例用于说明而非限制本要求保护的发明。
实施例1
方法
鉴定靶向CLL1的配体
CLL1cDNA表达载体购自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection,Manassas,VA,USA)，并被亚克隆至pcDNA3.1表达载体。C7C噬菌体展示肽文库购自新英格兰Biolab公司(Ipswich,MA,USA)。使CLL1表达于5637(膀胱移行细胞癌)、A549(非小细胞肺癌)和HTB38(结肠癌)细胞用于连续筛选以确定结合至CLL1的肽。不能获得可商购的抗CLL1抗体以检测CLL1的表达。因此，构建了CLL1-RFP(红荧光蛋白)嵌合基因并克隆至pcDNA3.1表达载体，其中RFP替代了CLL1的胞内域的部分以允许监测CLL1的表达。为了去除可能在体内结合至混杂细胞的任何噬菌体和的肽，用全血、外周血单核细胞(PBMC)、从同种异体干细胞移植留下的正常健康造血干细胞、人脐带血管内皮细胞(HUVEC)、成纤维细胞、5637、A549和HTB38细胞中的每种细胞类型消减C7C文库4-6h，然后进行每一轮筛选(图1A)。随后按照生产商的方案针对表达CLL1-RFP的5637、A549和HTB38细胞对消减的噬菌体文库依次进行筛选。针对3种不同癌细胞类型筛选所述文库以便使分离出结合至除CLL1外的细胞上的固有表面分子的人工肽的可能性最小化。每轮筛选仅进行1h以选择对CLL1具有高亲和力的那些肽。3轮筛选以后，选出36个克隆，扩增并送交测序。比对氨基酸序列以用于比较(表1)。
表1
(按出现顺序分别为SEQ ID NOS23、17和25-33)
合成了具有CDLRSAAVC(SEQ ID NO:17)序列的一种肽CLL1-L1用于进一步分析。为测定结合特异性，从美国典型培养物保藏中心(ATCC)购买了细胞系如PC3N(***)、HepG2(肝脏)、Skov-3(卵巢)、5637(膀胱)、HCT-116(结肠)、RPMI8226(骨髓瘤)、A549(肺)、K562(白血病)、A549和K562细胞(两者均表达CLL1)，将其与缀合至生物素的CLL1-L1一起孵育，并用链霉亲和素-藻红蛋白(PE)(激发480nm,发射578nm)探测(图1D)。缀合至生物素的膀胱癌特异性配体PLZ4用作阴性对照。
合成靶向和非靶向纳米胶束
合成CLL1靶向肽的方法已公开[Lam,et al.,Nature(1991)354:82-84;Lam,etal.,Chem Rev(1997)97:411-448;和Zhang,et al.,Urol Oncol(2011)PMID:20888272]。简而言之，将(Alloc)赖氨酸(Fmoc)偶联至Rink酰胺树脂以便引入锚固基团(炔烃)用于裂解后CLL1靶向肽偶联至树状聚合物分子上。通过Fmoc肽化学在赖氨酸(Alloc)-Rink树脂上合成所述肽[Chan WC,White PD:Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A PracticalApproach.Oxford,UK,Oxford University Press,2000]。然后在用Pd(Ph3P)4处理树脂以去除Alloc基后，将己炔酸偶联至赖氨酸侧链上。合成赖氨酸(炔烃)-肽并从固相支持体上切割后，在活性炭存在下用空气饱和的50mM碳酸氢铵缓冲液处理粗制肽，其导致通过位于所述肽的羧基和氨基端的两个半胱氨酸氧化偶联形成的环化肽。通过过滤去除所述炭，并将溶液冻干。通过反相HPLC纯化所述粗制肽为至少95%纯度。通过MALDI-TOF MS定征所分离级分的分子量以确认肽序列。通过分析型HPLC测定产生的肽的纯度。
合成纳米胶束的细节已公开[Xiao,et al.,Biomaterials(2009)30:6006-6016]。简而言之，通过肽化学法将叠氮酸偶联至BocNH-PEG-NH2的游离N-末端。然后通过Fmoc肽化学法合成树状聚赖氨酸，并进一步通过NHS酯化学法用8个胆酸(CA)加帽。进行Kaiser测试以测定偶联的完整性[Kaiser,et al.,Anal Biochem(1970)34:595-598]。通过***沉淀收集终产物，并在二氯甲烷和冷***中使用重复溶解沉淀方案进行纯化，以去除偶联剂和杂质。将白色粉末的粗制树状聚合物溶于纯水并对大量的水透析(3500道尔顿的MWCO)。然后将所述树状聚合物溶液冻干以产生白色粉末。通过凝胶渗透色谱(GPC)和MALDI-TOF质谱分析来定征树状聚合物的多分散度和分子量，并通过核磁共振(NMR)来定征化学结构。通过分析型HPLC来测量所述树状聚合物的纯度。使用叠氮基和炔烃基之间的水相点击化学法并以亚铜离子催化来将CLL1靶向肽的炔烃基偶联至树状聚合物上PEG末端的叠氮基上。用HPLC分析来分析CLL1靶向树状聚合物的纯度，并通过MALDI-TOF MS测量其分子量。为了将道诺霉素(DNR)或荧光染料DiI载入至纳米胶束内，以不同比率将DNR和/或DiI与20mg树状聚合物混合，并溶解于10mL烧瓶内的氯仿(5mL)中。在旋转蒸发器上于真空下去除氯仿，并在高真空下进一步干燥30min。然后向该烧瓶中加入1mL USP盐水。于室温下将所述混合物涡旋并声处理30min。通过HPLC分析来分析终产物的载药能力，并用动态光散射(DLS,Microtrac)粒径测量仪和透射电子显微镜(TEM,Philips CM-120)分析纳米胶束粒径和多分散度。将其通过过滤器(0.22μm)过滤，然后注入至无菌小瓶中用于进一步研究。
表达CLL1细胞的载药纳米胶束的摄入
由于相比悬浮的AML细胞，贴壁细胞的细胞质伸展更宽且具有更窄的焦平面，因此将用CLL1表达载体转染的贴壁A549细胞用作模型***，以便于纳米胶束介导的药物递送的可视化。构建了所述表达载体，以便用绿色或红色荧光蛋白(GFP或RFP)替代CLL1的胞质域，以通过绿色或红色荧光显微镜来监测CLL1的表达。为了追踪细胞摄入，纳米胶束装载有红色荧光染料DiI(激发：549nm，发射：565nm)。将仅用GFP载体(对照细胞)或用CLL1-GFP(试验细胞)转染的A549细胞培养于腔式载玻片中过夜。将两种装载有DiI的纳米胶束用于该实验：(1)未用CLL1靶向肽修饰的非靶向纳米胶束；和(2)共价涂覆有CLL1靶向肽的靶向纳米胶束。将表达GFP或CLL1-GFP的A549细胞与这两种纳米胶束一起孵育10、20、30和60分钟，并用完全培养基洗涤3次以去除未结合的纳米胶束。然后通过荧光显微镜检查所述细胞。
为了进一步证明所述靶向纳米胶束透入至表达CLL1的细胞，用DeltaVision去卷积成像***(AppliedPrecision,WA,USA)进行了高分辨率活细胞成像。将表达GFP或表达CLL1-GFP的A549细胞于玻璃底培养皿(MatTek,MA,USA)上培养过夜，用完全培养基洗涤一次，并分别添加非靶向或靶向纳米胶束(二者均装载有DiI染料，0.4mg/ml)。将细胞于37℃孵育15min，并用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤3次。然后直接用DeltaVision成像***检查这些培养皿。
临床样本的靶向效力
获得同意后抽取来自AML患者的外周血样本用于该研究。该研究获得了加州大学戴维斯分校的机构审查委员会(the Institutional Review Board of the Universityof California Davis)的批准。采用Ficoll梯度分离白血病细胞和一些正常PBMC。然后使这些分离的细胞通过CD34(+)MACS柱(Miltenyi,Bergisch Gladbach,Germany)以富集CD34(+)白血病细胞。96%以上的分离细胞为CD34(+)细胞。从同种异体干细胞移植样本的剩余物中获得正常造血干细胞。为了测定涂覆有CLL1靶向肽的纳米胶束的靶向效率，将富集的CD34(+)细胞与不同浓度的非靶向或靶向纳米胶束于37℃一起孵育30min。用PBS缓冲液(pH7.4,0.5%BSA)洗涤这些细胞3次，并通过流式细胞术检测荧光密度。
结果
靶向CLL1的配体的研制
筛选PhD C7C噬菌体肽展示文库的策略如图1A所示。筛选后，总共测序了36个噬菌体克隆。经比对，确定了两个共有序列：CXLR(S/T)AAVC(SEQ ID NO:34)和CXLRSSGPC(SEQID NO:24)(表1)，其中“X”表示可被取代的一些氨基酸。丝氨酸(S)和苏氨酸(T)属于仅具有一个甲基差异的同样类型的亲水氨基酸。在这两个主序列中存在一个共同的基序：“LR(S/T)”。为了确认这些配体确实结合至CLL1，用CCL1-RFP表达载体(图1B图块a)或RFP(图1B图块b，对照)转染了A549细胞。可通过红色荧光的出现来可视化CLL1-RFP或RFP的表达。为了随后进行全面定征，我们选择了肽CDLRSAAVC(SEQ ID NO:17)而非CPLRSAAAC(SEQ ID NO:23)，因为天冬氨酸(D)比脯氨酸(P)更具亲水性，这使得所述肽水溶性更好且易于合成和操作。将表达CCL1-RFP或仅RFP的A549细胞与展示CDLRSAAVC(SEQ ID NO:17)肽的噬菌体孵育，并用抗M13单克隆抗体-FITC缀合物进行探测。在表达CLL1-RFP的A549细胞(图1B图块c)而非表达RFP的细胞(图1B图块d)表面上，检测到表达CDLRSAAVC(SEQ ID NO:17)肽的噬菌体。将该肽命名为CLL1-L1并用于所有后续实验。进行流式细胞术研究以测定细胞结合。将CLL1-L1通过聚乙二醇(PEG)连接臂缀合至生物素。将细胞与生物素化的CLL1-L1一起孵育并用链霉亲和素-PE探测。没有观察到CLL1-L1与PBMC和A549对照细胞的明显结合，而观察到了CLL1-L1与表达CLL1-GFP的A549细胞的明显结合(图1C)。
为了进一步测定结合特异性，用CLL1-L1或膀胱癌特异性配体PLZ4作为阴性对照探测了各种来源的细胞系。具体地，CLL1-L1结合至表达重组CLL1的A549和K562细胞，而不结合至亲本A549、K562或其他细胞系(图1D)。
靶向CLL1的纳米胶束的研制和定征
确定了CLL-L1是否可用于，通过在我们最近研制的纳米胶束表面上展示CLL-L1，开发靶向纳米疗法(图2A)。所述靶向纳米胶束的平均粒径为约13.5nm，并具有窄的粒径分布(图2B)。通过透射电子显微镜检查确定其粒径分布(图2C)。所述纳米胶束的粒径对于治疗LSC前景诱人，因为该颗粒足够小而易于通过脉管***和骨髓分布，但足够大以将所述纳米胶束阻止在血液循环中。DNR是仅有的两种用于AML的首要化疗药物(与阿糖胞苷一起)之一。测定了载药能力并发现，20mg树状聚合物能够装载多达5mg DNR。考虑到DNR的典型临床剂量为45mg/m2，这相当于225mg/m2的树状聚合物剂量(所述纳米胶束单体单位)。该树状聚合物剂量远低于细胞培养物中1mg/ml的树状聚合物无毒水平[Xiao,et al.,Biomaterials(2009)30:6006-6016]，小于当所述纳米胶束装载另一化疗药紫杉醇用于狗的研究中时树状聚合物剂量的四分之一。这表明我们的靶向纳米胶束的树状聚合物剂量在可耐受的范围之内，且该毒性受到DNR的总剂量的限制。将进行进一步的临床前和临床试验来确定所述纳米胶束制剂中DNR的毒性。
靶向CLL1的纳米胶束的细胞摄入
测定了CLL1-L1是否能够使得装载有药物的纳米胶束被吸收至表达CLL1的细胞，并递送该细胞毒性货物穿越细胞膜。这对于靶向纳米胶束克服LSC相对高的抗药性来说非常重要。由于在具有很少细胞质的悬浮细胞中将纳米胶束与LSC的结合和药物递送可视化的技术要求很高，我们选择用GFP-CLL1转染的贴壁A549细胞进行操作作为模型***(图3A图块a)。将仅用GFP载体转染的A549细胞用作阴性对照(图3A图块b)。装载有显示强红色荧光的DiI的纳米胶束作为DNR的模型以监测递送和胞内分布。孵育10分钟内，在表达GFP-CLL1的A549细胞中可见到强DiI荧光(图3A图块c)，但在表达GFP的对照A549细胞中则没有荧光(图3A图块d)。然而，这些实验缺乏足够的分辨率以区分DiI是在细胞表面还是在细胞内部。
为了测定装载DiI的靶向纳米胶束是否能够透入至细胞内，使用DeltaVision***进行高分辨率的三维显微镜检查。然后按照生产商的方案使用已知的光传递函数和DeltaVision软件算法对图像进行去卷积。为了模拟体内代谢和清除纳米胶束，将细胞与装载有DiI的靶向纳米胶束一起孵育15分钟，并用PBS洗涤以去除任何未结合的纳米胶束。红色荧光(装载有DiI的纳米胶束)不仅位于细胞膜上，而且明显地，DiI被输送至细胞内部，包括表达GFP-CLL1的细胞的细胞核(图3B图块a)，在仅用GFP载体转染的对照细胞中没有观察到明显的红色荧光(图3B图块b)。为了定量药物递送，将同样数目的表达GFP或CLL1-GFP的A549细胞用相同浓度的装载有DiI或DNR的纳米胶束进行处理。靶向和非靶向纳米胶束的药物递送均存在剂量依赖性，且它们的药物递送之间存在统计显著性差异(图3C，上部图块：装载有DiI的纳米胶束，下部图块：装载有DNR的纳米胶束)。这些数据表明，装载至靶向纳米胶束内的药物可优先递送至表达CLL1的细胞。
涂覆有CLL1-L1的靶向纳米胶束靶向来自临床样本的LSC
测定了用CLL1-L1修饰的靶向纳米胶束是否能够靶向来自AML患者的临床白血病样本。首先比较了白血病细胞、PBMC和正常造血干细胞之间的药物递送。将这些细胞与装载有DNR的非靶向或靶向纳米胶束一起孵育。观察到暴露于靶向纳米胶束的白血病细胞大量的DNR递送，而对于PBMC和正常造血干细胞则观察到很少的递送(图4A)。研究了非靶向和靶向纳米胶束剂量依赖性递送药物至CD34+白血病细胞之间存在的差异(图4B和C)。将CD34+细胞与不同浓度的非靶向或靶向纳米胶束孵育30分钟后，用PBS洗涤细胞并用流式细胞术分析。这两种类型的纳米胶束的药物递送之间存在剂量依赖性差异(图4，B：装载有DNR的纳米胶束；C：装载有DiI的纳米胶束)。目前，我们测试了4个白血病样本。所述靶向纳米胶束能够靶向4个样本中的3个，这与此前的并非所有LSC均表达CLL1的报道[Bakker,et al.,Cancer Res(2004)64:8443-8450]一致。讨论
本文首次报道证明了特异性结合至表达CLL1的细胞且以低非特异性结合至其他类型细胞的肽的筛选和合成。所述CLL1分子表达于LSC而非正常造血干细胞上，这使其成为用于LSC搜寻的纳米治疗颇具吸引力的细胞表面靶标。这还显示了用CLL1靶向肽修饰的纳米胶束结合至表达CLL1的细胞，而更重要的是，能够直接将装载的药物递送至靶细胞。
本项目中研制的靶向纳米胶束能够潜在地通过以下3种机制改善AML的治疗结果：(1)通过直接将药物递送至LSC内部来靶向LSC；(2)从纳米胶束中释放化疗药物至血液循环而杀死全身的白血病细胞；和(3)在所述纳米颗粒内部配制化疗药物使得允许给予高剂量化疗而不增加毒性。
靶向LSC中一个主要担心是所述靶向纳米胶束是否能够递送足够的药物浓度至LSC以克服AML的化学抗性并改善治疗结果。基于我们的计算和以下描述的现有数据，由靶向纳米胶束递送的药物浓度至少足以克服一些患者的抗性。已经表明，高剂量化疗本身能够改善治疗结果并延长总生存期，如美国东部肿瘤协作组织(ECOG)试验1900(90mg/m2的DNR相对于标准剂量45mg/m2)中所证明[Information NaPR:High Dose ChemotherapySignificantly Prolongs Survival for Patients with Acute Myeloid Leukemia.In,Cancer News on the(2008);Fernandez,N Engl J Med(2009)361:1249-1259;和Lowenberg,et al.,N Engl J Med(2009)361:1235-1248]。脂质体制剂中较高剂量(135mg/m2)的DNR和阿糖胞苷能够被递送并诱导难治的或复发性AML的彻底缓解[Cortes,et al.,Cancer(2001)92:7-14]。已经表明，另一化疗药物紫杉醇也可装载于我们的纳米胶束中，并以游离亲本药物最大耐受剂量的3倍给予，其大大改善了小鼠的治疗结果而没有增加毒性[Xiao,et al.,Biomaterials(2009)30:6006-6016]。用β-整合素靶向肽修饰装载有紫杉醇的纳米胶束的表面能够通过增加药物渗入至肿瘤组织中来诱导长期的缓解。相比小鼠中5mg/kg体重的治疗剂量的DNR，可以在纳米胶束中给予2-4倍治疗剂量(10-20mg/kg)的DNR而没有任何体重、CBC和血清化学平板的明显变化。这表明仅通过重新配制纳米胶束中的DNR，所述纳米胶束本身即可潜在地改善AML的治疗结果。所述纳米胶束覆盖有“潜在地(stealthy)”赋予其低非特异性吸收的PEG。该降低的毒性本身将改善治疗结果，因为在诱导化疗期间4周死亡率范围为5%至57%[Estey,Cancer(2001)92:1059-1073]。
本文提供的数据支持了使用靶向纳米胶束将DNR或其他药物递送至LSC作为克服由癌症干细胞介导抗性的手段的可行性。当用CLL1-L1修饰纳米胶束时，在表达CLL1-L1的细胞和临床白血病样本中观察到一致的高浓度的DNR(图3和4)。而且，在细胞核处观察到了药物装载(图3B)，表明所述靶向纳米胶束能够递送烷化剂DNR接近其DNA靶标。另外，所述纳米胶束平台能够允许我们将不同药物同时装载至同样的纳米胶束。例如，DNR可与靶向细胞凋亡的药物共同装载，或与小干扰RNA(siRNA)组合装载以靶向抗细胞凋亡或其他抗药机制，使得它们更具效力。然而，所述装载有DNR的靶向纳米胶束的体内抗白血病效力和毒性需要通过临床试验来确定。
除了在早幼粒细胞性白血病中，AML中的LSC是普遍现象。靶向LSC表面分子已经报道能在动物模型中降低AML的移植成活率[Feuring-Buske,et al,Cancer Res(2002)62:1730-1736;Hogge,et al.,Clin Cancer Res(2006)12:1284-1291;Jin,et al.,Cell StemCell(2009)5:31-42]，表明消除LSC为治疗AML中的重要步骤。然而，仅靶向和杀死LSC可能不足以消除AML。LSC占所有白血病细胞中的小部分群体。即便所有的LSC被去除，剩余的白血病细胞及其祖细胞可继续引起症状。而且，所述祖细胞可能仍然具有有限的增殖能力并产生更多白血病细胞，或甚至可能去分化还原为LSC。这得到了临床试验的支持，表明抗CD20抗体利妥昔单抗作为单一药剂在多发性骨髓瘤中无效，尽管骨髓瘤干细胞表达CD20细胞表面分子[Zojer,et al.,Leuk Lymphoma(2006)47:1103-1109;Matsui,et al.,Blood(2004)103:2332-2336]。我们的靶向纳米胶束的优势在于，不仅靶向LSC而且所装载的药物可潜在地释放进入全身血液循环，并杀死全身的白血病细胞。
到目前为止，还没有分子被确定为对癌症干细胞具有特异性。CLL1和CD123为表达于LSC而非正常造血干细胞上的两种分子。抗CD123疗法，使用中和抗体或免疫毒素优先杀死AML LSC而对正常干细胞作用很小，并降低了NOD-SCID小鼠中AML移植的效率[Feuring-Buske,et al,Cancer Res(2002)62:1730-1736;Hogge,et al.,Clin Cancer Res(2006)12:1284-1291;Jin,et al.,Cell Stem Cell(2009)5:31-42]。用抗CLL1抗体最近也观察到类似的抗白血病活性[Zhao,et al.,Haematologica(2010)95:71-78]。然而，这两种分子也表达于一些正常的造血细胞中。如果抗体用于靶向这两种分子，抗体的长半衰期(几周至几个月)将会杀死新产生的造血细胞，并可能影响血液恢复，因为CD123和CLL1也表达于正常造血细胞上。我们的靶向纳米胶束相对于基于抗体的疗法的优势在于，其小于24小时的短的体内半衰期。本文描述的靶向纳米胶束预期和任何其他化疗剂一样会杀死一些正常造血细胞，但短的半衰期意味着随后新产生的造血细胞将不受影响。
总之，已经确定了一些靶向CLL1的肽，所述CLL1是表达于LSC表面而非正常造血干细胞上的分子。用CLL1靶向肽修饰的纳米胶束使得能够直接将装载的药物递送至LSC内并消除LSC。
应理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，基于此将提议给本领域技术人员其各种修饰或改变，且其包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，为所有目的其在此通过引用全部并入本文。

Claims (20)

1.包含选自以下的氨基酸序列的肽：DLRSAAV(SEQ ID NO:7)、LLRTAAV(SEQ ID NO:8)、LLRSAAV(SEQ ID NO:9)、TLRTAAV(SEQ ID NO:10)、ALRSAAV(SEQ ID NO:11)、VLRSSGP(SEQID NO:12)、SLRSSGP(SEQ ID NO:13)、PLRSSGP(SEQ ID NO:14)、和TLRSSGP(SEQ ID NO:15)，其中所述肽不超过9个氨基酸长度，并且其中所述肽结合至表达于白血病干细胞表面上的C型凝集素样分子1(CLL1)，以及所述肽不结合至正常血细胞或正常造血干细胞。
2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽：
i)包含位于N-末端、或C-末端、或N-末端和C-末端的保护基；或
ii)为环化的。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的肽，其中所述肽还包含位于氨基端的半胱氨酸残基和位于羧基端的半胱氨酸残基。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的肽，其中所述肽连接至治疗性部分或可检测标记。
5.根据权利要求4所述的肽，其中所述可检测标记为珠子、荧光团、化学发光部分、纳米颗粒、磁性粒子、金属粒子或放射性同位素。
6.根据权利要求4所述的肽，其中所述治疗性部分为免疫球蛋白的Fc部分、细胞毒素、纳米颗粒、脂质体或化疗剂。
7.根据权利要求4所述的肽，其中所述治疗性部分为包封于纳米颗粒或脂质体内的化疗剂。
8.一种纳米载体或纳米颗粒，其连接至一个或多个权利要求1-4中任一项所述的肽。
9.根据权利要求8所述的纳米载体或纳米颗粒，其中所述纳米载体或纳米颗粒包封有化疗剂。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的纳米载体或纳米颗粒，其中所述纳米载体或纳米颗粒包括胆酸、赖氨酸和聚乙二醇(PEG)。
11.权利要求1-4中任一项所述的肽在制造用于检测表达C型凝集素样分子1(CLL1)的白血病干细胞(LSC)存在的药物中的用途，其中所述药物包含连接至可检测标记的权利要求1-4中任一项所述的肽。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述可检测标记选自珠子、荧光团、化学发光部分、纳米颗粒、磁性粒子、金属粒子或放射性同位素。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的用途，其中所述LSC在体外。
14.根据权利要求11-12中任一项所述的用途，其中所述LSC在体内。
15.根据权利要求11-12中任一项所述的用途，其中所述LSC在血细胞群中。
16.权利要求1-4中任一项所述的肽、或权利要求8-10中任一项所述的纳米颗粒或纳米载体在制造用于抑制、减少或防止有需要的对象的表达C型凝集素样分子1(CLL1)的白血病干细胞(LSC)生长或增殖的药物中的用途，其中所述药物包含：连接至治疗性部分的权利要求1-4中任一项所述的肽、或权利要求8-10中任一项所述的纳米颗粒或纳米载体。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述治疗性部分为免疫球蛋白的Fc部分、细胞毒素、纳米颗粒、脂质体或化疗剂。
18.根据权利要求16-17中任一项所述的用途，其中所述治疗性部分为包封于纳米颗粒内的化疗剂。
19.根据权利要求16-17中任一项所述的用途，其中所述对象为人。
20.根据权利要求16-17中任一项所述的用途，其中所述药物被制备成对所述对象进行静脉内或骨髓内给药。
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