BRPI0705744B1 - Composition of enzymes, use of composition in enzymatic hydrolysis of lignocellulose material, process of production of enzymes that degrades the fraction of polymacarides of the biomass, process of alcohol production using enzyme composition - Google Patents

Abstract

composição de enzimas, uso da composição na hidrólise enzimática de material lignocelulôsico, processo de produção de enzimas que degradam a fração de polissac.arídeos da biomassa, processo de produção de álcool utilizando a composição de enzimas. a presente invenção se refere a uma composição de enzimas compreendendo (a) enzimas celulolíticas obtidas por fermentação com trichoderrna reesei; (b) enzimas celulolíticas, hemicelulolíticas, <225>-glicosidase e enzimas acessórias obtidas por fermentação com aspergilius awamori; (c) adicionalmente, pelo menos uma espécie molecular selecionada do grupo de enzimas e/ou peptideos com atividade cmcase, ditas espécies moleculares estando presentes nos sobrenadantes do cultivo de t. reesei e/ou a. awamori como apresentado no zimograma da figura 6; e (d) opcionalmente, um veículo compatível com ditas enzimas, sendo que as ditas enzimas (a) e (b) interagem de modo a resultar em efeito sinérgico dado pela ação das enzimas acessórias que, entre outras atividades, rompem as ligações entre a lignina e os polissacarídeos da biomassa, notadamente a hemicelulose. a presente invenção compreende, ainda, uma composição de enzimas compreendendo: (a) enzimas celuloliticas obtidas por fermentação com trichoderma .reesei; (b) enzimas celuloliticas, hemicelulolíticas, <225>-glicosidase e enzimas acessórias obtidas por fermentação com aspergilius awamori; e (c) opcionalmente um veículo compatível com ditas enzimas, sendo que as ditas enzimas (a) e (b) interagem de modo a resultar em efeito sínérgíco dado pela ação das enzimas acessórias e espécies moleculares que atuam de forma diferenciada nos polissacarideos da biomassa e também nas ligações entre a lignina e a hemicelulose. a invenção ainda inclui um processo de produção de ditas enzimas celuloliticas e hemícelulolítícas, <225>- glicosidase e enzimas acessórias e ditas espécies moleculares que compõem a composição da invenção e um processo de produção de álcool a partir de biomassa utilizando, na etapa de hidrólise enzímática, a composição da invenção.

Description

COMPOSIÇÃO DE ENZIMAS, USO DA COMPOSIÇÃO NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ENZIMAS QUE DEGRADAM A FRAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS DA BIOMASSA, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ÁLCOOL UTILIZANDO A COMPOSIÇÃO DE ENZIMAS

Campo d3 Invençao A presente invenção refere-se a uma composição de enzimas aperfeiçoadas para degradar celulose, hemicelulose e outros polissacarideos da biomassa e separar eficientemente a lignina contida em material lignocelulósico, ditas enzimas sendo obtidas a partir de linhagens especificas dos microrganismos Trichoderma reesei e Aspergillus awamori e que compreendem, além das celulases (endoglucanases e exoglucanases), β-glicosidase e enzimas acessórias que promovem a degradação da hemicelulose e de outros polissacarideos, promovendo ainda e separação da lignina e facilitando, por esse meio, a ação principal das celulases majoritárias e aumentando o rendimento de obtenção de glicose e, conseqüentemente, do processo de produção de álcool a partir de biomassa. A invenção inclui um processo de produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas, da β-glicosidase e de enzimas acessórias que compõem a composição da invenção e um processo de produção de álcool a partir de biomassa utilizando, na etapa de hidrólise enzimática, a composição da invenção.

Fundamentos da Invenção 0 esgotamento progressivo das reservas mundiais de petróleo está impulsionando uma nova "corrida do ouro" - a busca de combustíveis renováveis e economicamente viáveis, especialmente porque a queima de combustíveis fósseis é responsável pelo acúmulo de CCu, um dos gases responsáveis pelo efeito estufa. 0 uso de fontes alternativas de energia, produzidas a partir de matérias-primas renováveis, como a biomassa, transformou-se em alvo prioritário a nível internacional por permitir o desenvolvimento sustentável e não contribuir para o acúmulo de gases responsáveis pelo aquecimento global; o C02 proveniente da queima dos biocombustívies é reciclado no processo de fotossíntese para a biosfera (ver Lín Y, Tanaka S (2006) . "Ethanol fermetation from biomass resources; Current State and prospects". Applied Microbiology and Biotechnology; 69: 627-642). A produção de etanol de segunda geração (a partir da biomassa lignocelulósica) vem sendo mundialmente considerada como a principal tecnologia de produção de combustível líquido como alternativa à gasolina produzida a partir do petróleo. O Brasil possui uma posição privilegiada em relação à produção de etanol de segunda geração (destacando-se a biomassa da cana - bagaço e palha que estão estrategicamente localizados) devido à extensão de área agrícola disponível, clima favorável, água em abundância e por sua vasta experiência na produção e uso do etanol de cana-de-açúcar (primeira geração). Estima-se que o setor sucro-alcooleiro gere cerca de 16 milhões de toneladas de bagaço de cana excedente e 6 milhões de toneladas de palha (ver MAPA, Misnistéric da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (2005). Plano Nacional de Agroenergía, Brasília, MAPA, 118p, disponível em http://www.agricultura.gov.br (acesso em 24 de março de 2006)). A expansão do cultivo da cana, motivada pela crescente demanda por etanol acarretará um aumento proporcional do bagaço excedente, que aumentará com a melhoria da eficiência das caldeiras. Adicionalmente a queima da palha está atualmente proibida, devendo ser banida gradativamente no estado de São Paulo em um prazo de 30 anos (Lei 11.241 e Decreto 47.700, de março de 2003) .

Os resíduos lignocelulósicos, como o bagaço e a palha, são basicamente constituídos de celulose, hemicelulose e lignina em diferentes proporções. A celulose é um polímero linear formado por moléculas de glicose. 0 dissacarídeo celobiose é a unidade repetitiva do polímero. Nas celuloses naturais, as cadeias se alinham de modo a formar fibrilas organizadas de forma complexa e que apresentam regiões com estrutura cristalina e regiões com estrutura amorfa. As hemiceluloses pertecem a um grupo misto de polissacarídeos não celulósicos lineares e/ou ramificados que podem ser constituídas de unidades de pentoses ou hexoses. A lignina é constituída de cadeias aromáticas heterogêneas, com uma estrutura tridxmensional muito complexa. A produção de etanol a partir do componente celulósico da biomassa baseia-se na transformação da celulose, principal constituinte do bagaço, em glicose através de reação de hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado, sendo a glicose resultante fermentada por leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae (fermentação alcoólica). Este processo de obtenção de etanol aumenta o rendimento da produção sem, no entanto, aumentar a área de plantação de cana-de-açúcar.

Como qualquer outro resíduo 1ignoceluiósico, a biomassa precisa ser pré-tratada antes de ser utilizada como matéria-prima para a produção de etanol. 0 pré-tratamento visa alterar as interações nativas entre a celulose, a hemicelulose e a lignina de forma a diminuir a recalcitrância da biomassa à hidrólise enzimática. 0 pré-tratamento visa também reduzir a cristalinidade da celulose e aumentar a porosidade da biomassa (ver Almeida JR, Modig T, Petersson A, Hahn-Hãgerdal B, Liden G, Gorwa-Grauslund M-F (2007). "Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae". J Chem Technol Biotechnol.; 82: 340-349). Na tecnologia de pré-tratamento, a explosão a vapor é o método mais utilizado para desestruturar a biomassa lignocelulósica, causando ainda a parcial depolimerizaçào da hemicelulose por meio do emprego de alta temperatura e pressão. Entretanto, devido à formação de inibidores para as etapas subseqüentes, principalmente no que se refere à hidrólise enzimática e ao crescimento celular e fermentação alcoólica, a biomassa pré-tratada deve ser lavada para remoção do material inibitório, sendo removida também parte da hemicelulose e açúcares dela derivados (ver Prasad S, Singh A e Joshi HC. (2007). "Ethanol as an alternative fuel from agricultural, industrial and urban residues". Resources, Conservation and Recycling; 50: 1-39). A opção pela hidrólise enzímática da celulose decorre da ausência de condições severas que, diferentemente da hidrólise química, não gera hídrolisados com alta toxicidade (furfurais e substâncias aromáticas derivadas da lignina) os quais impedem o metabolismo celular e a fermentação alcoólica do hidrolisado. Adicionalmente, o custo útil da hidrólise enzímática é baixo quando comparado com a hidrólise ácida ou alcalina tendo em vista que a hidrólise enzímática é, geralmente, conduzida em condições brandas (pH 4,8 e temperatura na faixa de 45-50°C) e não apresenta problemas de corrosão no equipamento (ver Prasad et al, 2007, acima). Embora a hidrólise enzímática da bíomassa seja a única opção internacionalmente aceita, o custo e a pouca disponibilidade das enzimas a serem usadas nesse processo constituem-se no maior gargalo para a utilização desta tecnologia, não só no Brasil como em outros países.

As celulases, conjunto de enzimas que degradam a celulose, são classificadas em três grupos: as endoglicanases (EC 3.2.1.4) que clivam ligações internas da fibra celulósica; as exoglicanases (EC 3.2.1.91) que atuam progressivamente nas extremidades redutoras e não-redutoras da celulose liberando pequenos oligossacarídeos de celulose; e as β-glicosidases (EC 3.2.1.21) que degradam a celobiose (dímero de glicose) até glicose (ver Lynd LR, Weimer PJ, van Zyl WH, Pretorius IS (2002) . "Microbial Celiulose Utili zation: Fundamentais and Bictechnoiogy". Microb. Mol. Biol. Rev.; 66: 506-577). A ação enzimática é geralmente iniciada por uma ação randômica das endoglicanases que clivam a cadeia de celulose nas regiões amorfas. Em seguida, as exoglicanases atuam removendo unidades de celobiose dos terminais redutores e não redutores das cadeias na região cristalina. Finalmente, as β-glicosidases hídrolisam a celobiose em duas moléculas de glicose. Individualmente, uma única enzima do complexo celulolítico é incapaz de hidrolisar a celulose de maneira eficiente, sendo necessária uma atuação sinérgica do complexo celulolítico (ver Béguin, P e Aubert, JP (1994). "The biological degradation of celiulose". FEMS Microbiol. Rev.; 13: 25 - 58).

Por exemplo, no documento PI 8204206 é descrito um método de hidrólise de substrato celulósico para a produção de mono e di-sacarídeos usando enzimas celulases. Nesse documento é mencionada a existência de um efeito sinérgico quando a enzima celulase de fungo ou de actinomiceto é adicionada à cultura de bactéria dos gêneros Cellulomonas ou Pseudomonas. Como enzima celulase de fungo é preferida a obtida a partir de Trichoderma reesei.

Entretanto, o elevado custo das enzimas celulolíticas tem dificultado a aplicação da hidrólise enzimática da biomassa. Para suplantar as dificuldades de viabilização da hidrólise enzimática na produção de biocumbustível, uma das alternativas para sua utilização em grande escala é a produção de enzimas no local do uso ao invés de utilizar enzimas comerciais.

No caso do Brasil, país com todas as condições favoráveis de produção de bioetanol (etanol de bimassa) a partir de material lignocelulósico, a produção de tal biocombustível pode ocorrer no mesmo local das usinas onde é produzido o etanol a partir de caldo de cana e, simultaneamente ao aproveitamento dos açúcares solúveis do caldo de cana, pode-se tirar o máximo proveito de todas as facilidades existentes, tais como os processos de tratamento de caldo, de fermentação, de destilação, de geração de vapor e energia elétrica, sistemas de tratamento e reciclo de resíduos, captação e a reutilização de água, laboratórios, controles automáticos e gerenciamento, entre outros. Em resumo, o conjunto de condições pré-existentes associado à produção de celulases in situ favorece de maneira impar o estabelecimento desta tecnologia no Brasil. Adicionalmente, os hidrolisados enzimáticos da biomassa podem ser misturados ao caldo-de-cana ou ao melaço, sendo usados todos os equipamentos pré-existentes e o microrganismo Saccharomyces cerevis iae no processo de fermentação alcoólica.

Alguns fungos possuem a capacidade de produzir complexos celulolíticos completos e em grandes quantidades. A maior parte dos estudos é focada em fungos com superior capacidade de produzir celulases, tais como Trichoderma, Penicillium, Aspergíllus, Fusaríum e Humicola, sendo o gênero Trichoderma relatado como o mais eficiente na degradação da celulose (ver Lynd et al., 2002, acima) . No documento EP 0448430 é descrita uma composição de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas produzidas por um processo de fermentação utilizando como micrcrganisir.o pelo menos uma cepa dc fungo Trichoderma reesei, sendo uma das preferidas, a linhagem Trichoderma reesei RUT C30 (ATCC 56765). A composição de enzimas é utilizada como catalisador na hidrólise de um substrato lignocelulósico pré-tratado.

No entanto, os fungos desse gênero produzem baixos níveis de β-glicosidase, sendo necessária a complementação dessa enzima que é produzida em grande quantidade por outros fungos para a obtenção de uma mistura que hidrólise eficientemente a celulose até glicose. De fato, os microrganismos do gênero Trichoderma produzem quantidades relativamente grandes de endo-p-glucanase e exo-β-glucanase, mas somente baixos níveis de β-glicosidase, enquanto que os microrganismos do gênero Aspergillus produzem quantidades relativamente grandes de endo-β-glucanase e β-glicosidase, mas baixos níveis de produção de exo^-glicanase. (ver "3.2 Cellulase Production" - FAO Corporate Document Repository, disponível na Web em http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm, acessado em 07/10/2007) .

As celulases, assim como as demais enzimas extracelulares de hidrólise, são expressas apenas quando há a necessidade de serem secretadas pelos microrganismos para que estes cresçam em celulose (ver Kubicek CP, Messner R, Gruber F, Mach RL, Kubicek-Pranz EM (1993) . "The Trichoderma reesei cellulase regulatory puzzle: from the interior life of a secretory fungus". Enzyme Microb Technol; 15: 90-99). As condições de cultivo afetam significativamente a produção de enzimas extraceluiares em geral, incluindo as celulases, hemiceiulases e da β-glícosidase. A fonte de carbono desempenha um importante papel na produção de enzimas porque os carboidratos ou seus derivados podem induzir ou reprimir a expressão dos genes que codificam para as enzimas celulolíticas (ver Kubicek CP, Penttila, ME, (1998). "Regulation of production of piant poiysaccharide degrading enzymes by Trichoderma". In: Harman, GE, Kubicek, CP, editors. Trichoderma and Gliocladium, Enzymes, biological control and commercial applicatíons, vol. 2. Bristol: Taylor & Francis Ltd. [Capitulo 3] p. 49-67). A produção de enzimas do fungo hipercelulolítico Trichoderma reesei tem sido estudada detalhadamente (ver Persson I, Tjerneld F, Ha''gerdal BH (1991) . "Fungai cellulolitic enzyme production: an overview". Proc Biochem; 26: 65-74). Muitas substâncias são reconhecidas como indutores desse complexo celulolítico tais como a celobiose (ver Fritscher C, Messner R, Kubicek CP (1990). "Cellobiose metabolism and cellobiohydrolase I biosynthesis by Trichoderma reesei". Exp Mycol; 14: 405-15), a lactose (ver Morikawa Y, Ohashi T, Mantani O, Okada H (1995). "Cellulase induction by lactose in Trichoderma reesei PC-3-7". Appl Biochem Bíotechnol; 44: 106-11) e, principalmente, a soforose (ver Mach RL, Seiboth B, Myasnikov A, Gonzalez R, Strauss J, Harkki AM, Kubicek CP (1995). "The bgll gene of Trichoderma reesei QM9414 encodes an extracellular, cellulose-inducible bglucosidase involved in cellulase induction by sophorose". Mol Microbiol; 16: 687-697).

Elevadas atividades enzimáticas de celulases pedem ser encontradas nos estudos sobre materiais contendo celulose como fonte de carbono (ver 3hal MK, Bhat S. (1997) . "Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications". Biotechnol Adv; 15: 583-620; Kubicek e Penttiia, 1998, acima; Juhász T, Szengyel Z, Réczey K, Siika-Ahc M e Viikari L. (2005). "Characterization of cellulases and hemicellulases produced by Trichoderma reesei on various carbon sources". Process Biochemistry; Vol. 40(11): 3519-3525).

Mais recentemente, as pesquisas sobre enzimas celulolíticas têm se concentrado na obtenção de misturas de celulases que aperfeiçoem a hidrólise das ligações glicosídicas da celulose, da hemicelulose, mantendo a estrutura da lignina contida nos materiais lignocelulósicos. Rosgaard, L et al. (ver Rosgaard L., Andric P., Dam-Johansen K., Pedersen S. e Meyer A.B.S. (2006). "Effects of Fed-Batch Loading of Substrate on Enzymatic Hydrolysis and Viscosity of Pretreated Barley Straw". The Forest Products Division, apresentação feita no "The 2006 Annual Meeting" e Rosgaard L., Pedersen S, Cherry J., Harris P., e Meyer A. (2006). "Efficiency of New Fungai Cellulase Systems in Boosting Enzymatic Degradation of Barley Straw Lignocellulose". Biotechnol Prog, 22 (2) : 493498 16599567) . Novos trabalhos vêm estudando a melhoria na eficiência de hidrólise enzimática de material lignocelulósico de palha de cevada com a utilização de uma mistura de enzimas composta de Celluclast® (preparação de enzimas celulolíticas a partir de Trichoderma reesei) e Novozym 188 (preparação de β-glicosidade a partir de Aspergillus niger) . Esses pesquisadores chegaram à conclusão de que a atividade enzimática adicional ao sistema de enzimas de T. reesei acelera a degradação da lignocelulose.

Sendelius, J (Sendeiius, J. (2005) "Steam Pretreacmenr. Optimisation for Sugarcane Bagasse in Bioethanol Production"; Dissertação de MSc, Departamento de Engenharia Química da Universidade de Lund, Suécia) também trabalhou com uma mistura de enzimas Celluclast© e Novozym 188 na hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com vapor e concluiu que o rendimento de glicose é dependente da remoção de hemicelulose na etapa de pré-tratamento. É também amplamente reconhecido que o pré-tratamento do material lignocelulósico, antes do processamento da hidrólise enzimática, tem um papel preponderante na eficácia da atuação das enzimas na desagregação da celulose e da hemicelulose e na separação da lignina, de natureza poliaromática e hídrofóbica. Um dos pré-tratamentos mais utilizados é o método de explosão a vapor, método esse amplamente conhecido dos técnicos em produção de biocombustível a partir de material lignocelulósico (ver, por exemplo, Sun, Ye (2002) "Enzymatic Hydrolysís of Rye Straw and Bermudagrass for Ethanol Production". Dissertação de Tese de PhD, Universidade do Estado da Carolina do Norte).

Na hidrólise enzimática, além das celulases majoritárias (endoglucanases, exoglucanases) e a β- gl icosidase, outras enzimas desempenham: um papel importante no ataque â fração polissacarídica da biomassa e na sua separação da lignina e outros componentes da biomassa como os de natureza prctéica (ver Saha B.C. (2003) . "Hemicellulose bioconversion". Journal Ind. Mícrobiology Biotechnology 30: 279-291). São as chamadas enzimas acessórias, tais como, glucuronidases, acetilesterases, xilanases, β-xilosidades, gaiactomanases, glicomanases, poligalacturonases, glicoamilases, amilogalactosidases, tanases, feruil esterases, proteases, dentre outras. Na literatura tem sido reportada a produção de diversas destas enzimas acessórias pela cepa Aspergillus awamori, incluindo a linhagem A. awamori B.361U2/1, entre as quais podem ser citadas: • Xilanase (E.C. 3.2.1.8) de A. awamori B.361U2/1 (ver Botella, C., Diaz, A., Ory, I., Webb, C., Blandino, A. (2007) "Xylanase and pectinase production by Aspergillus awamori on grape pomace in solid State fermentation". Process Biochemistry, Vol. 42(1):98-101) ; • Poligalacturonase (E.C. 3.2.1.67) de A. awamori B.361U2/1 (ver Botella, C., Ory, I., Webb, C., Blandino, A. (2005) "Hydrolytic enzyme production by Aspergillus awamori on grape pomace". Biochemical Engineering Journal Vol. 26: 100-106); • β-xilosidase (E.C. 3.2.1.37) de A. awamori (ver Kurakake, M., Fujii, T., Yata, M., Okazaki, T., Komaki, T. (2005) "Characteristics of transxylosylation by beta-xylosidase from Aspergillus awamori K4". Biochim. Biophys. Acta Vol. 1726:372-9); • α-glicosi da se (F.. C. 3.2.1.20) de A. awamori (ver Anindyawati, T., Ann, Y.G., Ito, K., lizuka, M., Minamiura, N. (1998) "Two kinds of novel alpha-glucosidases frora Aspergilius awamori K-ll: Their puríficatíon properties ans specificities". Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 85:465-469); • Glicoamilase (E.C. 3.2.1.3) de A. awamori B.361U2/1 (ver Bon, E. & Webb, C. (1993) "Glucomylase production and Nitrogen Nutrition m Aspergilius awamori". Applied Biochemmistry and Biotecnology 39: 349-369. Bon, E. & Webb, C. (1989) "Passive immobilization of Aspergillus-awamori spores for subsequent glucoamylase production" Enzyme and Microbial Technology 11 (8): 495-499); • β-D-Mannosidase (E.C. 3.) de A. awamori (ver de Vries, R. P. e Visser, J. (2001) "Aspergilius Enzymes Involved in Degradation of Plant Cell Polysaccharides". Microbiology and Molecular Biology Reviews. Vol. 65(4):497-522); • Arabinoxilana arabinofurano hidrolase de A. Awamori (ver de Vries, R.P. e Visser, J. (2001) "Aspergilius Enzymes Involved in Degradation of Plant Cell Polysaccharides". Microbiology and Molecular Biology Reviews. Vol. 65{4) ;497-522) ; • Acetilxilana esterase (ver de Vries, R.P. e Visser, J. (2001) "Aspergilius Enzymes Involved in Degradation of Plant Cell Polysaccharides". Microbiology and Molecular Biology Reviews. Vol. 65(4):497-522; Koseki, T., Furuse, S. , Iwano, K. , Sakai,H., Matsuzawa, H. (1997) "An Aspergilius awamori acetylesterase: purification of the enzyme, and cloning and sequencing of the gene" BiochemicaI Journal 326: 485-490); • Feruil esterase (ver Topakas, E., Vafiadi, C., Christakopoulos, P. (2007) "Mícrobíal production, characterization and applicatíons of feruloyl esterases" Process Biochemistry Vol. 42:497-509; Koseki, T., Takahashi, K., Handa, T., Yamane, Y., Fushinobu, S., Hashizume, K. (2006) "N-linked oligosaccharides of Aspergíllus awamori feruloyl esterase are important for thermostability and catalysis" Bioscience Biotechnology and Biochemistry 70 (10) :2476-2480; Koseki, T., Takahashi, K., Fushinobu, S., Iefuji, H., Iwano, K., Hashizume, K., Matsuzawa, H. (2005) "Mutational analysis of a feruloyl esterase from Aspergíllus awamori involved in substrate discrimination and pH dependence" Biochimica et Biophysica Acta-general subjects 1722 (2) :200 — 208; de Vries, R.P. e Visser, J. (2001) "Aspergíllus Enzymes Involved in Degradation of Plant Cell Polysaccharides". Microbiology and Molecular Biology Reviews. Vol. 65(4):497-522; Koseki, T., Furuse, S-, Iwano, K., Matsuzawa, H. (1998) "Purification and characterization of a feruloylesterase from Aspergíllus awamori" Bioscience Biotechnology and Biochemistry 62 (10):2032-2034).

Além dessas referências, merece destaque o documento EP 1511848 que descreve composições de enzimas para hidrólise enzimática de material lignocelulósico compreendendo celulases e enzimas auxiliares, por exemplo, xilanases. Vale destacar que nos exemplos fornecidos nesse documento é mencionado como microrganismo produtor de xilanase (auxiliar) o fungo Trichoderma vi ride e come microrqanismo produtor de celulase c funge Trichoderma reesei (mutante do Trichoderma viride) , os quais não produzem β-glicosidase em quantidades suficientes para tornar a hidrólise enzimática de material lignocelulósico eficaz.

Muitas têm sido as propostas de aperfeiçoamento nas composições de enzimas e nos métodos de hidrólise enzimática para degradar a celulose e a hemicelulose contida em material celulósico, visando aperfeiçoar os processos de obtenção de biocombustívelf em especial bioálcool. Entretanto, ainda existem, limitações com relação à disponibilidade em termos de quantidade e de tipos de enzimas que degradem tipos diferenciados de material lignocelulósico e a sua eficácia na preparação de glicose adequada para posterior fermentação alcoólica. Adicionalmente a diversidade na composição da biomassa de diferentes origens e dos tipos de interações químicas que os seus diferentes componentes estabelecem entre si, indica a necessidade do desenvolvimento de misturas enzimáticas "tailored made" não apenas para as diferentes biomassas, mas também para o binômio biomassa - pré-tratamento. Estudos recentes também indicam que os parâmetros usuais de determinação do nivel das diferentes atividades de celulases, hemicelulases e enzimas acessórias, não são indicadores completos para a definição da efetividade das misturas nas diferentes biomassas, sendo necessário o desenvolvimento de testes de hidrólise (ver Zhang, Y.H.P., Himmel, M.E., Mielenz, J. R. (2006). "Outlook for cellulase improvement: Screening and selecticn strategies" Biotechnology Advances 24:4 52-481) .

Adicionaimente, atividades enzimáticas ainda não caracterizadas podem atuar sinérgicamente na eficiência das misturas enzimáticas. Os problemas do estado da técnica acima relatados motivaram o desenvoicimento da presente invenção visando à obtenção de uma mistura eficiente para a hidrólise da biomassa da cana, em que não são utilizados microorganismos geneticamente modificados (GMO), com todas as vantagens de natureza legal e ambiental para a prática do processo da invenção. A invenção é detalhada seguir.

Sumário da Invenção A invenção visa o provimento de composição de enzimas desenvolvida para degradar os polissacarideos contidos em material lignocelulósico, e em especial a celulose e a hemicelulose da biomassa da cana, separando e mantendo as características químicas da lignina, no que se refere à sua hidrofobilidade, ditas enzimas sendo obtidas a partir de linhagens específicas dos microrganismos Trichoderma reesei e Aspergillus awamori e que compreendem, além das enzimas celulolíticas majoritárias (endoglucanases e exoglucanases) a β-glicosidase e enzimas acessórias que promovem a degradação dos polissacarídeos, exceto a celulose, promovendo a separação da lignina e facilitando a ação das celulases majoritárias e aumentando o rendimento de obtenção de glicose e conseqüentemente do processo de produção de álcool a partir de biomassa.

Em uma primeira concretização, é provida uma composição de enzimas compreendendo (a) enzimas celulolíticas obtidas por fermentação com Tnchoderma reeseí; (b) enzimas celuloiiticas, hemiceluioi íticas, β-glicosidase e enzimas acessórias obtidas por fermentação com Aspergillus awamori; (c) adicionalmente, pelo menos uma espécie moiecular selecionada do grupo de enzimas e/ou peptídeos com atividade CMCase, ditas espécies moleculares estando presentes nos sobrenadantes do cultivo de T. reesei e/ou A. awamori como apresentado no zimograma da Figura 6; e (d) opcionalmente, um veiculo compatível com ditas enzimas, sendo que as ditas enzimas (a) e (b) interagem de modo a resultar em efeito sinérgico dado pela ação das enzimas acessórias que, entre outras atividades, rompem as ligações entre a lignina e os polissacarideos da biomassa, notadamente a hemicelulose. As enzimas celuloiiticas obtidas a partir de T. reesei, preferencialmente a partir da linhagem T. reesei RUT C30, compreendem substancialmente endoglucanases e exoglucanases. As enzimas celuloiiticas, hemicelulolíticas e a β-glicosidase obtidas a partir de A. awamori, preferencialmente a partir de uma linhagem de A. awamori com alta capacidade de produção das enzimas acessórias, xilanases, pectinase e feruil esterases, entre outras, mais de preferência a partir da linhagem A. awamori B.361U2/1, compreendem e enzimas acessórias que incluem predominantemente as xilanases e feruil esterases.

Uma segunda concretização da invenção se refere a uma composição de enzimas compreendendo: (a) enzimas celuloiiticas obtidas por fermentação com Trichoderma reesei; (b) enzimas celuiolíticas, hemiceluiolíticas, β-glicosidase e enzimas acessórias obiidas por fermentação com Aspergillus awamori; e (c) opcionalmente um veiculo compatível com ditas enzimas, sendo que as ditas enzimas (a) e (b) interagem de modo a resultar em efeito sinérgico dado pela ação das enzimas acessórias e espécies moleculares que atuam em outros polissacarídeos da biomassa e também nas ligações entre a lignina e a hemicelulose.

Uma terceira concretização da invenção diz respeito ao uso da composição de enzimas na hidrólise enzimática de material lignocelulósico com alto rendimento em glicose.

Uma quarta concretização da invenção diz respeito a um processo de produção de enzimas celuiolíticas e hemicelulolíticas compreendendo as etapas de: (a) cultivar, em separado, em meio apropriado de cultura, uma linhagem de T. reesei não afetada pelo efeito de repressão catabólica e uma linhagem de A. awamori com alta capacidade de produção de β-glicosidase e das enzimas acessórias, incluindo xilanases e feruil esterases; (b) separar os sobrenadantes de cada cultura de T. reesei e A. awamori contendo as enzimas celulases, a β-glicosidase e as enzimas acessórias; (c) opcionalmente, concentrar e reunir os sobrenadantes contendo ditas enzimas celulases, a β-glicosidase e enzimas acessórias para obtenção da mistura de enzimas e (d) opcionalmente, secar a suspensão para obter a mistura de enzimas seca. Preferencialmente, são empregadas a linhagem T, reesei RUT C30 e a linhagem A. awamori B.361U2/1 para a obtenção da mistura de enzimas celulases, β-glicosidase e acessórias. A concentração da suspensão de sobrenadantes é feita, de preferência, utilizando um processo brando de concentração, por exemplo, ultrafiltração.

Uma quinta concretização da invenção diz respeito a um processo de produção de álcool a partir de bioir.assa compreendendo as etapas de: (a) pré-tratamento do material lignocelulósico; (b) hidrólise er.zimática do material pré-tratado na etapa (a) com uma composição de enzimas compreendendo substancialmente celulases obtidas por fermentação com uma linhagem de T. reeseí não afetada pelo efeito de repressão catabólica e celulases, β-glicosidase e enzimas acessórias obtidas por fermentação com uma linhagem de A. awamorl com alta capacidade de produção das enzimas acessórias, pectinase, xilanases e feruil esterases; e (c) hidrólise alcoólica da glicose obtida na etapa (b) para obtenção de álcool. Preferencialmente, o pré-tratamento do material lignocelulósico é feito por explosão a vapor, opcionalmente precedido por uma etapa de compostagem, visando alterar a estrutura da lignocelulose como um todo e as interações nativas que estabelecem entre si a celulose, a hemicelulose, outros polissacarideos e a lignina de forma a diminuir a recalcitrância da biomassa à hidrólise enzimática. Este processo também facilita a degradação da hemicelulose e a separação da lignina. Ainda, preferencialmente, o pré-tratamento inclui pelo menos uma operação de lavagem do material lignocelulósico explodido. De preferência, a fermentação alcoólica da glicose obtida na etapa (b) é realizada com o microrganismo Saccharomyces cerevisae.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 ilustra a comparação er.tre o efeito da mistura de enzimas da invenção na hrdrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar não tratado. A Figura 2 mostra a comparação da estabilidade operacional das celulases da invenção e das celulases comerciais (preparação da Genencor) durante a hidró]ise. A Figura 3 mostra a comparação de desempenho entre a mistura de enzimas comercial (preparação da Genencor} e a mistura de enzimas da presente invenção, utilizando a mesma concentração da atividade FPAse (10 FPU/g) na hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. A Figura 4 ilustra, graficamente, o sinergismo para diferentes atividades enzimáticas em misturas com diferentes proporções das enzimas produzidas pelas linhagens de Trichoderma reesei e Aspergillus awamori utilizadas na presente invenção através da determinação das atividades de CMCase (atividade em carboximetilcelulose -CMC), FPase (atividade em papel de filtro - FPÜ), β-glicosidade (atividade em celobiose - BGU) e xilanase (atividade em xilana) nas duas preparações enzimáticas separadamente e após a sua mistura em diferentes proporções. A Figura 5 corresponde ao zimograma (eletroforese de proteínas em gel com identificação de bandas protéicas com atividade enzimática) correspondente a bandas com atividade de CMCase presente no sobrenadante do cultivo de T. reesei RUT C30, crescido em meio contendo farelo de trigo. Os valores indicam a quantidade de unidades enzimát icas, em rJI aplicada em cada poço. A Figura 6 mostra o zimograma com bandas protéicas com atividade de CMCase: no canal 1 as bandas presentes em celulase comercial diluída 1000 vezes (CMCase: 4 UI/mL); no canal 2 aquelas presentes no sobrenadante do cultivo de Aspergillus awamori(CMCase: 1,46 UI/mL); no canal 5 aquelas presentes no sobrenadante do cultivo de T. reesei RUT C30 (CMCase: 6,59 UI/mL) e no canal 6 este mesmo sobrenadante diluído 10 vezes; no canal 3 aquelas presentes na mistura dos sobrenadantes das culturas de T. reesei RUT C30 e Aspergillus awamori /CMCase: 6,59 UI/mL) e no canal 4 esta mesma nistura diluída 10 vezes. A Figura 7 apresenta vários experimentos de cinética de hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar, pré-tratado, comparando os níveis de produção de glicose observados com diferentes preparações de enzimas, contendo a mesma carga de atividade FPAse (10 Ul/g de bagaço) a saber: (a) celulase comercial, (b) sobrenadante da cultura de T. reesei RUT C30, contendo celulases e outras enzimas, (c) sobrenadante da cultura A. awamori B.361U2/1 contendo celulases, β-glicosidade e enzimas acessórias, (d) misturas dos sobrenadantes das culturas de T. reesei RUT C30 e de A. awamori B.361U2/1 nas proporções de: (i) 25% do sobrenadante enzimático (celulases) de T. reesei RUT C30 + 75% sobrenadante enzimático de A. awamori B.361U2/1 (celulases, β-glicosidade e enzimas acessórias); (ii) 50% do sobrenadante enzimático de T. reesei RUT C30 + 50% de sobrenadante enzimático de A. awamori B.361U2/1 e (iii) 75% d c sobrenadante enzimático de T. reesei RUT C3C i 25% cio sobrenadante enzimático A. awamori B.36irJ2/l. A Figura 8 apresenta as fotografias do bagaço original, do bagacilho, do bagaço tratado por explosão a vapor, do xarope de glicose com concentração de 65 g/L íhidroi isado enzimático; e dc resíduo de 1 igrina, Descrição Detalhada da Invenção A composição de enzimas da presente invenção tem como característica primordial o efeito sinergístico resultante da associação de enzimas obtidas por fermentação com uma linhagem de T.reesei que não sofre o efeito de repressão catabólica, por exemplo, a linhagem T.reesei RUT C30, com enzimas obtidas por fermentação com uma linhagem A. awamori com alta capacidade de produção de β-glicosidade e enzimas acessórias, especialmente as xilanases e as feruil esterases, por exemplo, a linhagem A. awamori B.361U2/1. Embora as enzimas produzidas por esta linhagem não sejam capazes de atacar a celulose da biomassa pré-tratada, elas apresentam uma importante ação sinérgica em relação às celulases produzidas pelo T.reesei RUT C30.

Até recentemente, a atenção das pesquisas relativas à hidrólise enzimática de material lignocelulósico voltava-se para os microrganismos que tivessem alta capacidade de produção de celulases. Assim, o fungo Tríchoderma reesei foi, desde a sua descoberta, considerado altamente eficiente na produção de celulases que degradam material lignocelulósico, sendo a linhagem mutante T. reesei RUT C30 vista como uma das mais importantes na degradação desse tipo de material. Entretanto, devido a limitações relacionadas ao rendimento em glicose, as preparações enzímáticas baseadas unicamente nas celulases obtidas de T. reesei não atendiam às necessidades em razão do baixo teor de β-glicosidase observada nas fermentações com esse fungo. Assim, o passo seguinte na busca pelo aumento da eficiência da hidrólise enzimática foi o de associar enzimas de diferentes microrganismos para a obtenção de preparações balanceadas nas atividades enzímáticas necessárias, e não apenas de exo- e endo-glucanases. Até a presente invenção, a combinação julgada ótima era a de enzimas obtidas por fermentação com Trichoderma reesei com enzimas obtidas por fermentação com Aspergillus niger ou seus mutantes, por exemplo, a mistura do produto de marca Celluclast® com o produto Novozym 188®.

Foi agora surpreendentemente verificado que o desempenho da mistura de enzimas na hidrólise enzimática de material lignocelulósico é aperfeiçoado quando a mistura de enzimas compreende, além das enzimas celulolíticas majoritárias (endoglucanases, exoglucanases) mais a β-glicosidase, enzimas com atividades acessórias selecionadas do grupo consistindo de xilanases, feruil esterases, acetilesterases, β-xilosidades , galactomanases, glicomanases, poligalacturonases, glicoamilases, amilogalactosidases e tanases, entre outras. Preferencialmente, de acordo com a invenção a enzima acessória é pelo menos uma dentre xilanases e esterases, mais preferencialmente a enzima acessória é pelo menos uma dentre xilanases e feruil esterases.

Sem pretender ficar restrito a uma explicação teórica, acredita-se que as enzimas acessórias (principalmente as xilanases e feruil esterases - E.C.3.1.1.73 e E.C.3.1.1.72, respectivamente), entre outras enzimas, "limpam" as microfibrilas da celulose e as tornam acessíveis ao ataque das exoglucanases e endoglucanases (celulases majoritárias). As enzimas feruil esterases clivam a ligação entre a lignina e a hemicelulose (ligação -C-0-C-) fazendo com que a lignina "desgrude-se" das fibrilas da celulose, abrindo espaço para o ataque das celulases. Além disto, a linhagem de A. awamori com alta capacidade de produção das enzimas acessórias xilanases, feruil esterases e pectinases, por exemplo, A. awamori B.361U2/1, também produz altos níveis de β-glicosidase que hidrolia a celobiose em glicose. 0 sinergismo observado entre as enzimas produzidas pelo T.reesei e o A. awamori pode estar também relacionado às novas bandas com atividade de celulase e memores massas moleculares, presentes nos canais 3 e 4 do zimograma apresentado na Figura 6. Estas novas bandas podem ser o resultado do processamento proteolítico de enzimas pré-existentes.

As composições de enzimas da presente invenção compreendem (a) enzimas celulolíticas obtidas a partir de uma linhagem de T. reesei que não sofre o efeito de repressão catabólica; (b) enzimas celulolíticas, hemicelulolíticas e acessórias obtidas a partir de uma linhagem de A. awamori com alta capacidade de produção de β-glicosidase e das enzimas acessórias xilanases e feruil esterases; íc) adicionaimente, pelo menos uma espécie molecular selecionada do grupo de enzimas e/ou peptideos com atividade CMCase, diLas espécies moleculares estando presentes nos sobrenadantes do cultivo de T. reesei e/ou A. awamori como apresentado no zimograma da Figura 6; e (d) um veículo apropriado para manter a estabilidade e atividade das ditas enzimas na hidrólise enzímátíca de material lignocelulósico.

Preferencialmente, a linhagem de T. reesei que não sofre o efeito de repressão catabólica utilizada na obtenção das enzimas celulolítícas da composição da invenção é a linhagem T. reesei RUT C30 que reconhecidamente pode produzir celulases mesmo em presença de glicose, não sofrendo, portanto, o efeito da repressão catabólica. As ditas enzimas celulolíticas (celulases) são obtidas por fermentação com T. reesei em condições conhecidas na técnica, por exemplo, por fermentação submersa, sendo que o sobrenadante obtido é posteriormente concentrado por um método brando, por exemplo, por ultrafiltração, para manter a estabilidade e atividade das celulases. Alternativamente, o sobrenadante é submetido a um processo de secagem brando, por exemplo, liofilização, "spray drying" ou semelhante, para obtenção das celulases, hemícelulases, β-glicosidase e enzimas acessórias sólidas com atividade enzimática preservada.

De preferência, também, a linhagem de A. awamori com alta capacidade de produção de β-glicosidase e das enzimas acessórias, incluindo xilanases e feruil esterases é a linhagem A. awamori B.361U2/1. As enzimas celulolíticas, hemicelulolí11cas , β-glicosidase e acessórias da composição da invenção são obtidas por fermentação, por exemplo, fermentação submersa, com a dita linhagem de A. ãwamori. 0 sobrenadante resultante também pode ser concentrado ou secado nas mesmas condições utilizadas no tratamento do sobrenadante de fermentação com T. reesei.

Alternativamente, os sobrenadantes das fermentações com T. reesei e A. awamori podem ser reunidos e submetidos à concentração ou secagem como acima descrito.

As composições de enzimas da invenção podem estar na forma de suspensão aquosa, preferencialmente para uso imediato após sua obtenção ou, alternativamente, podem estar na forma seca. Na forma seca, as composições da invenção podem compreender, além das enzimas, um veiculo apropriado que mantenha a estabilidade e atividade das mesmas.

Exemplos de tais veículos podem ser: sais neutros, como sulfato de amônio, fosfato de potássio ou cloreto de sódio (por exemplo, a 20%) que impedem o crescimento microbiano devido ao efeito osmótico. Polióis de baixo peso molecular como glicerol, sorbitol e manitol que além de estabilizarem as enzimas também reprimem o crescimento microbiano devido à redução da atividade da água. Em uma outra concretização, as várias enzimas podem ser mantidas na forma líofilizada por longos períodos de tempo na presença de estabilizadores, tais como, por exemplo, sais, carboidratos ou proteínas inertes, predomínantemente albumina bovina sérica (BSA). Outras substâncias que podem ser adicionadas às preparações de enzimas da invenção para sua estabilização incluem: substratos, tióis para manter um ambiente redutor, antibióticos, ésteres de ácidos benzóicos como preservativos de preparações enzimáticas liquidas, inibidores de enzimas contaminantes e agentes quelantes. Os aditivos devem ser compatíveis com o uso final da enzima em questão.

As composições de enzimas da invenção são especialmente úteis na hídrólise enzimática de material lignocelulósico, hidrólise essa que é potencializada pela sinergia entre as celulases de T. reeseí e celulases, hemicelulases, β-glicosidase e enzimas acessórias de A. ãwamori. Essa sinergia é o resultado, em um primeiro momento, da atuação das enzimas acessórias, especialmente as xilanases e feruil esterases sobre a hemicelulose e as ligações entre a hemicelulose e a lignina e também entre outros polissacarídeos e a lignina enfraquecendo as ligações inter- e intra-moleculares desses componentes e, conseqüentemente, disponibilizando a celulose para a hidrólise enzimática. Em seguida, é a vez da ação das celulases e hemicelulases para quebrar as ligações glicosídicas e degradação dessas substâncias até glicose e xilose. A presente invenção também contempla um processo de produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas compreendendo as etapas de: (a) cultivar, em separado, em meio apropriado de cultura, uma linhagem de T. reesei não afetada pelo efeito de repressão catabólica e uma linhagem de A. awamori com alta capacidade de produção de β-glicosidase e das enzimas acessórias xilanases e feruil esrerases; (b) separar os sobrenadant.es de cada cultura de T. reeseí e A. awamori contendo as enzimas celulases a β-glicosidase e enzimas acessórias; (c) opcionaimente, concentrar e reunir os sobrenadantes contendo ditas enzimas celulases, β-glicosidase e enzimas acessórias para obtenção da mistura de enzimas e (d) opcionalmente, secar a suspensão para obter uma mistura seca de enzimas.

Como meio de cultura apropriado para a realização das fermentações de T. reesei e A. awamori, podem ser utilizados aqueles conhecidos no estado da técnica, por exemplo, o meio de Mandeis (ver MANDELS, M. e WEBER, J. (1969) "Production of cellulases" Adv. Chem. Ser. 95: 391- 414) ou o meio de Mandeis modificado. Podem ser também utilizados meios como os utilizados na presente invenção contendo substâncias potencialmente indutoras ou que favorecem a produção das enzimas de interesse, como a lactose e o farelo de trigo. Preferencialmente, são empregadas a linhagem T. reesei RUT C30 e a linhagem A. awamori B.361U2/1 para a obtenção da mistura de enzimas celulases, β-glicosidase e acessórias. A concentração e a secagem da suspensão de sobrenadantes são feitas, de preferência, utilizando processos brandos, por exemplo, ultrafiltraçào, liofilização, spray drying, dentre outros. A presente invenção também inclui um processo de produção de álcool a partir de biomassa compreendendo as etapas de: (a) pré-tratamento do material lignocelulósico; (b) hidrólise enzimática do material pré-tratado na etapa (a) com uma composição de enzimas compreendendo substancialmente celulases obtidas por fermentação com uma Linhagem de T. reesei não afetada pelo efeito de repressão catabólica e ceiulases β-glicosidase e enzimas acessórias obtidas por fermentação com uma linhagem de A. awâmori com alta capacidade de produção das enzimas acessórias, como exemplo xilanases e feruil esterases; e (c) fermentação alcoólica da glicose obtida na etapa (b) para obtenção de álcool .

Os métodos de pré-tratamento de material ligno celulósico para subseqüente hidrólise enzimática são amplamente conhecidos do estado da técnica. Podem ser citados: explosão com vapor (ou auto-hidrólise), explosão de fibras com amônia, explosão com CO2, dentre outros (para maiores detalhes, ver Sun Ye, (2002) acima). Preferencialmente, de acordo com a presente invenção, é utilizado o método de explosão a vapor que pode ser antecedido por uma etapa de "compostagem" que favorece o crescimento de microrganismos no seio do bagaço estocado no meio-ambiente, crescimento esse que é favorecido pela sacarose residual, produzindo CO2 o qual se transforma em ácido carbônico, constituindo, desse modo, um pré-tratamento natural com CO2 - Mais preferivelmente, o pré-tratamento por explosão com vapor é seguido de lavagem do material lignocelulósico explodido. Esse procedimento não só facilita a hidrólise da hemicelulose como também auxilia a separação da lignina na etapa subseqüente de hidrólise enzimática. A hidrólise enzimática, de acordo com a invenção é realizada pela adição da composição de enzimas da invenção ao material lignocelulósico pré-tratado para a obtenção de glicose que é, a seguir, submetida à fermentação alcoólica com Saccharomyces cerevisae. As condições utilizadas na hidrólíse enzimática e na fermentação alcoólica são conhecidas no estado da técnica (ver, por exemplo, US 5628830; EP 0448430; Sun Ye (2002), acima; Sendelius J (2 005) , acima) .

Deve ser entendido que os exemplos e concretizações aqui descritas são somente para finalidade ilustrativa e que várias modificações ou mudanças, à luz das mesmas, serão sugestivas aos especialistas na técnica e devem estar incluídas dentro do espírito e alcance desta descrição e escopo das reivindicações que a acompanham.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Fermentações para a Produção de Celulases A propagação dos microrganismos para a obtenção de esporos foi efetuada através de cultivo em meio sólido utilizando o meio de cultura PDA (Potato Dextrose Agar) .

Suspensões de esporos foram obtidas através da adição de solução salina (0,85% p/v) e raspagem das placas esporuladas. As suspensões obtidas foram centrifugadas e preservadas em solução de glicerol a 10 % p/v a -20°C.

Fermentações submersas - condições de fermentação e meios de cultivo: Para o preparo do pré-inóculo, 3mL da suspensão de esporos foi inoculada em 300mL de meio de Mandeis (ver Tabela 1), contidos em frascos Erlenmeyers de lOOOmL. Variações do meio de Mandeis, principalmente em relação às fontes de nitrogênio fazem também parte dc escopo da presente invenção. 0 cultivo foi mantido a 30°C e 200 RPM por quatro dias.

Os cultivos destinados à produção de ceiuiases foram realizados em frascos Erlenmeyers de lOOOmL, contendo 300mL de meio de Mandeis modificado (Tabela I';,. (ver MA.NDELS e WEBER, (1969), acima) ou suas variações. Após esterilização, os meios de cultivo foram inoculados com 30 mL de pré-inóculo. O pH inicial de todos os meios foi ajustado para 4,8 e controlado durante todo o cultivo. Os frascos foram incubados a- 30°C e 200 RPM, por um período máximo de nove dias. Foi utilizado o equipamento marca New Brunswick Scientific modelo Innova 4340.

Tabela 1: Meio de Mandeis (1); Meio de Mandeis modificado (2) Reagente (l)Concentração (2)Concentração Uréia 0,3 g/L 0,3 g/L

(NH4)2S04 1,4 g/L 1,4 g/L

KH2P04 2,0 g/L 2,0 g/L

CaCI2 0,3 g/L 0,3 g/L

MgS04 7 H20 0,3 g/L 0,3 g/L

FeS04 7 H20 5 mg/L 5 mg/L

CoCI2 6 H20 20 mg/L 20 mg/L

MnS04 4 H20 1,6 mg/L 1,6 mg/L

ZnS04 7 HzO 1,4 mg/L 1,4 mg/L

Peptona 0,75 g/L * Celulose (Avicet) 7,5 g/L - Extrato de Levedura 0,25 g/L 6,0 g/L

Milhocina - 0,6% p/v Fonte de Carbono - 30 g/L

No meio de Mandeis modificado, a celulose foi substituída pela fonte de carbono desejada, na concentração de 30 g/L (3% p/v) . As fontes de carbono escolhidas para avaliação foram farelo de trigo e iactose. G meio também foi acrescido de uma fonte de vitaminas e nitrogênio, a milhocina e/ou extrato de lêvedo.

Acompanhamento das fermentações: Amostras de sobrenadante das fermentações submersas foram obtidas diariamente (não excedendo um total de 20% do volume inicial), e centrifugadas a 3000 RPM durante 15 minutos na centrifuga Beckman Coulter Allegra 6R.

Os sobrenadantes foram utilizados para a determinação da concentração de açúcares redutores, da concentração das enzimas do complexo celulolítico (CMCase, FPase e β-glicosidase), de enzimas acessórias e pH. O pH foi determinado no aparelho Beckman φ390.

Exemplo 2: Ensaios enzimáticos: Os sobrenadantes das fermentações foram utilizados para determinação das atividades CMCase, FPase, β- glicosidases e opcionalmente também xilanase. Todos os ensaios foram realizados em duplicatas. Uma unidade de atividade enzimática é definida pela produção de um μπιοί de produto/minuto.

Atividade CMCase: Foi determinada de acordo com a metodologia padrão descrita pela IUPAC (ver Ghose TK (1987) Measurement of cellulase activíties. Pure Appl Chem; 59: 257-268) . O método se baseia na dosagem da concentração de açúcares redutores liberados durante a degradação de carboxímet. i 1 celu 1 ose (CMC! . 0 meio reacional é formado por 3,0 mL de uma solução de CMC 4% p/v em tampão citrato de sódio 50mM pH 4,8 e 3,0 mL do sobrenadante das fermentações, contendo as enzimas da invenção (diluído em tampão cifrato de sódio 5QmM pH 4,8, quando necesário}. A mistura reacional é incubada a S0°C, durante 10 minutos, sob agitação. A cada dois minutos, alíquotas de 0,5 mL são retiradas para a determinação da concentração de açúcares redutores. A reação enzimática das alíquotas é interrompida pela adição imediata das amostras em um tubo contendo 0,5 mL de DNS (ácido 3,5-dinitro salicílico) . O reagente DNS, além de interromper a reação enzimática, possibilita a realização da dosagem da concentração de açúcares redutores produzidos pela ação enzimática (ver Miller GL (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Biochem; 31: 426-428).

Atividade FPase: Foi determinada de acordo com a metodologia padrão descrita pela IUPAC (ver Ghose (1987), acima). O método se baseia na dosagem da concentração de açúcares redutores liberados durante a degradação de uma fita de papel de filtro. O meio reacional é formado por 0,5mL do sobrenadante da fermentação(diluído em tampão citrato de sódio 50mM pH 4,8, quando necessário) contendo as enzimas da invenção, 1,0 mL de tampão citrato de sódio 50mM pH 4,8 e uma tira de papel de filtro Whatman n° 1 medindo 1,0 cm X 6,0cm (aproximadamente 50mg). A mistura reacional é incubada a 50°C, durante 60 minutos, sob agitação. A reação é interrompida pela adição de 0,5 mL da mistura reacional a um tubo contendo 0,5mL de DNS. A determinação da concentração de açúcares redutores é realizada em seguida.

Atividade β-qlicosidase: A atividade de β-glicosidase foi determinada de acordo com a metodologia padrão descrita pela IUPAC (Ghose, 1987) . O ensaio se baseia na determinação da concentração de glicose liberada quando a enzima hidrolisa celobiose. O meio reacional é formado por 1,0 mL de sobrenadante, contendo as enzimas da invenção (diluído em tampão citrato de sódio pH 4.8, 50mM quando necessário) e 1,0 mL de solução do substrato (celobiose 15mM em tampão citrato de sódio pH 4.8, 50mM ) . A mistura reacional é incubada a 50°C por 30 minutos, sob agitação. A reação é terminada por imersão dos tubos em água fervente por 5 minutos.

Atividade de xilanase: A atividade da xilanase se baseia na determinação da concentração de açúcares redutores liberados durante a degradação da xilana. O meio reacional é formado por 0,5mL do sobrenadante da fermentação (diluído em tampão citrato de sódio 50mM pH 4,8, quando necessário) contendo as enzimas da invenção e por 1,0 mL de solução 1% (p/v) de xilana (do tipo oat spelt, Sigma código X-0627). A mistura reacional é incubada a 50°C, durante 5 minutos. A reação é interrompida pela adição de 0,5 mL da mistura reacional a um tubo contendo 0,5mL de DNS. A determinação da concentração de açúcares redatores é realizada em seguida.

Exemplo 3: Ensaios analíticos: iJosagem da Concentração de Açúcares Redutores A concentração de açúcares redutores foi determinada de acordo com Miller (1959). Neste método, os tubos contendo 0,5 mL da mistura reacional e 0,5 mL de DNS são colocados em um banho a 100°C durante 5 minutos. Logo após, a mistura é diluída com 6,5mL de água destilada. A leitura é realizada em espectrofotômetro a 540nm. As absorbâncias obtidas são transformadas em concentração de açúcares redutores através de uma curva padrão de glicose.

Dosagem da Concentração de Glicose A determinação da concentração de glicose foi feita através do uso de um kit de análise de concentração de glicose baseado na reação das enzimas glicose oxidase e peroxidase. Neste processo, a glicose é transformada em ácido glucônico e peróxido de hidrogênio pela ação da glicose oxidase. 0 peróxido de hidrogênio formado em combinação com 4-aminoantipirina e fenol é transformado, pela ação da peroxidase, em quínonaímina, composto que apresenta coloração. Ao final da reação, cada mol de glicose é transformado em um mol de quinonaimina. Para tal, 10 pL da mistura reacional são pipetados em tubos de ensaio contendo 1 mL do reagente de glicose oxidase e peroxidase (BioSystems©). Os tubos são incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente (25°C), tempo nc qual ocorre a reação enzimática. A coloração formada é lida no espectrofotômetro a 500 nm.

Dosagem de açúcares totais e etanol Para determinar a concentração de açúcar total, inicialmente procedeu-se a uma hidrólise química com HCi 2N a 100°C/10 min, seguida de neutralização com NaOH. Desta forma os açúcares não redutores foram convertidos em redutores. A seguir, foi efetuada a dosagem de açúcar pelo método do dinitrosalicilato (DNS) {Miller, 1959}. A determinação da concentração de etanol no mosto fermentado foi feita pelo método enzimático da álcool desidrogenase (ver Bernt, E., Gutmann, I., 1974. Determination with alcohol Dehydrogenase and NAD, in: Hans, U.B. (Ed.), Methods of Enzymatic Analysis. Academic Press Inc., New York, pp. 1499-1502). Este ensaio se baseia na formação de NADH, medida pelo aumento da absorvância a 34 0 nm, que é proporcional a concentração de etanol. O meio reacional contém: 3,5 ml de Tampão glicina-NaOH 100 mM pH 9,0, semi-carbazida 75 mM; 0,2 ml NAD+ (16 mM) ; 0,1 ml de álcool desidrogenase de S. cerevisiae (120 U) em tampão fosfato 20 mM, pH 9,0 contendo BSA 0,1%. Esta mistura foi usada para zerar o espectofotômetro. A seguir, adicionou-se 0,2 ml de mosto fermentado, homogeneizou-se e acompanhou-se a absorvância a 340 nm até que não houvesse aumento de absorvância. O mosto fermentado foi diluído previamente para ficar em torno de 0,1% de etanol.

Avaliação do crescimento celular de Saccharomyces cerevisiae nos hidrolisados enzimáticos de bagaço de cana A avaliação da concentração celular foi determinada através da medida de absorvância a 570nm de uma suspensão de células convertida em concentração de células (em mg de peso seco/mL) . 0 fator de conversão em peso seco foi calculado a partir da fiitração de um volume adequado da suspensão de células em filtro Millipore (0,4 5!_;m) que, posteriormente, foi colocado em estufa a 80°C até atingir o peso constante.

Exemplo 4: Produção de Celulases por Trichoderma reeseí RUT C30 A linhagem T. reesei RUT C30 (ATCC 567 65) é uma das mais utilizadas no desenvolvimento de pesquisas científicas devido à sua disponibilidade em coleções de cultura e pelo fato do seu uso não estar restringido por direitos de propriedade, o que é comum para outras linhagens de T. reesei. Mais importante ainda para a concretização da presente invenção é o fato de que a linhagem T. reesei RUT C30 pode produzir celulases mesmo em presença de glicose, não sofrendo o efeito da repressão catabólica.

Composições de meios testados, em relação às fontes principais de carbono ou nitrogênio, para a produção em frasco agitado - 3% Farelo de trigo + 0,6% milhocína + 0,6% extrato de levedura - 3% Farelo de trigo + 0,6% milhocina - 3% Farelo de trigo + 1,2% milhocina - 3% DDG + 0,6% milhocina + 0,6% extrato de levedura - 3% Bagaço de cana-de-açúcar + 0,6% milhocina + 0,6% extrato de levedura - 31 Lactose + 0,6% milhocina + 0,6¾ extrato de levedura - 3% Lactose + 1,2% milhocina.

Produção em frasco agitado Os níveis máximos de atividades CMCase, FPase e beta-glicosídase obtidos por T. reesei RUT C30 em frascos agitaaos estão mostrados na Tabela 2 . É importante ressaltar que nem todas as fermentações foram acompanhadas até o 9o dia. Sendo assim os picos reais de produção podem aparecer em outros dias.

Tabela 2: Dados de atividade máxima das celulases e Beta-glicosidase nos sobrenadantes de cultivo de T. reesei RUT C30 Na Tabela 2, as siglas têm os seguintes significados: WB = farelo de trigo; MC = milhocina; YE = extrato de levedura; DDG = dried destilled grains; BCS = bagaço de cana-de-açúcar; LAC = lactose.

Exemplo 5: Produção de Celulases por Aspergillus av/amori B._361U2/ 1 (Commonwealth Mycoloqical Institute -_UKJ_ Esta linhagem é um mutante seqüencial da linhagem NRRL 3112, que é uma linhagem classificada como Aspergillus niger. Os fungos Aspergillus niger são conhecidos por sua maior capacidade de produzir 3-glicosidase, uma enzima necessária e geralmente produzida em menores quantidades pelos fungos do gênero Trichoderina.

Composições de meios testados - 3% farelo de trigo - 3% farelo de trigo + 0,7% extrato de levedura - 3% farelo de trigo + 0,3% milhocina - 3% farelo de trigo + 1,2% milhocina - 3% DDG - 3% DDG + 0,7% extrato de levedura - 3% DDG + 1,2% milhocina - 3% bagaço de cana-de-açúcar + 1,2% milhocina.

Os níveis máximos de atividades CMCase, FPase e beta-glicosidase obtidos por fermentação com A. awamori em frascos agitados estão na Tabela 3. A maior atividade CMCase atingida foi de 10,0 UI/mL em meio contendo 3% de farelo de trigo e 0,7% de extrato de levedura. A maior produção de β-glicosidase foi alcançada em meio contendo 3% DDG e 0,7% extrato de levedura, sendo este 2,9 UI/mL. Já a maior atividade de FPase atingida foi de apenas 0,18 UI/mL.

Tabela 3. ricos de concentração de celulases nos sobrenadantes de cultivo de A. awamori B.361U2/1 Meios CMCase Dia FPase Dia β-glicosidase Dia (UI/mL) (UI/mL) (UI/mL) 3% WB_____________7,8 4° * ND________:________2,0______4°* 3% WB + 0,7% YE 10,0 4° * ND________:________f0_______4° * 3% WB + 0,3% MC 5,9 4° * ND________-________09_______4° * 3% WB + 1,2% MC 4,7 7n Nu________;________08_______7ΰ 3% PPG____________5,8 4° * ND________;________t6_______4° * 3% PPG + 0,7% YE 6,8 4° * ND________-________2$_______4° * 3% PPG+ 1,2% MC 4,0 7° ND_________________1J________7° 3% BGC + 1,2% MC 0,4 7° 0,18_______T________03_______7° ‘ só foi dosado o quarto dia; NP = não determinado.

Na Tabela 3, as siglas têm os seguintes significados: WB = farelo de trigo; MC = milhocina; YE = extrato de levedura; DDG = dried destílled grains; BCS = bagaço de cana-de-açúcar.

Exemplo 6: Separação e Concentração das Enzimas Celulolíticas Depois de produzidas as enzimas, os sobrenandantes contendo as enzimas celulolíticas, a β-glicosidase e as enzimas acessórias foram separados dos microrganismos por filtração a vácuo utilizando microfiltro de fibra de vidro. Com estes sobrenandantes foram preparadas as misturas enzimáticas e as atividades das enzimas foram medidas.

Nos experimentos de hidrólise enzimática, onde se deve utilizar 10 FPU/g de biomassa, a mistura enzimática teve de ser concentrada por ultrafiltração utilizando, inicialmente, uma membrana com corte de 30.000 (Míllípore®) , que retém proteínas com peso molecular acima de 30.000 Daltons, ficando tais proteínas no concentrado.

Para os experimentos de ultrafi 1 t. ração foi utilizado o sistema da AMICON modelo 8400 de filtração convencional (módulo circular com área da membrana de 41,8 cm2) . A filtração foi realizada em batelada com agitação branda. A pressão utilizada (linha de ar comprimido} foi de 2 bar em todos os experimentos. Por este procedimento, pode-se concentrar até 25 vezes a mistura enzimática.

Exemplo 7: Estabilidade das enzimas FPase, β-qlicosidase, CMCase e xilanase presentes nos sobrenadantes de fermentação com T.reesel RUT C30 e das enzimas CMCase e xilanase provenientes da fermentação com A. awamori B.361U2/1 A estabilidade térmica das enzimas FPase e β-glicosidase presentes nos sobrenadantes de T. reesei foi avaliada a 50 °C, 60 °C e 70 °C por um período de até 24 horas. Os resultados estão apresentados na Tabela 4.

Tabela 4: Termoestabilidade das atividades de FPase e β -glícosidase dos extratos brutos de T. reesei RUT C30 incubados a 50°C, 60°C e 70°C.

As atividades FPase e β-glicosidase mostram-se estáveis quando incubadas a temperatura de 50 °C mantendo mais de 80 % de sua atividade inicial. Quando a temperatura foi elevada a 60 °C a FPase manteve 25% da atividade inicial e a atividade β-glicosidase foi reduzida a apenas 22%. As enzimas mostraram-se instáveis a 70 °C, apresentando atividade reduzida ou nula após 30 minutos de incubação. A estabilidade térmica das enzimas CMCase e Xilanase foi avaliada a 50 e a 60° C na presença ou não de cisteína e triptcfano. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 5, 6 e 7.

Tabela 5: Termoestabilidade das atividades de xilanase e CMCase dos extratos brutos de T. reesei RUT C30 e A. awamori, incubados a 50°C e 60°C. * a enzima manteve 100% da atividade após 288 h de incubação Tabela 6: Termoestabilidade das atividades de xilanase e CMCase dos extratos brutos de T. reesei RUT C30 e A. awamori, incubados a 50°C e 60°C na presença de L-cisteina. Γ I* a enzima manteve 100% da atividade após 144 h de incubação Tabela 7: Termcestafcilidade das atividades de xiianase e CMCase dos extratos brutos de T. reesei RUT C30 e A. awamori, incubados a 50°C e 60°C na presença de L-triptofano As atividades de xiianase e CMCase foram estáveis a 50°C e 60°C, com exceção da xiianase de A.awamori a 60°C, não sendo identificada necessidade da adição de substancias para a estabilização destas atividades. Foi, entretanto, observado um afeito benéfico do uso de cisteina e triptofano, na meia vida de xiianase e CMCase de A. awamori.

Exemplo 8: Hidrólise Enzimática do Bagaço de Cana-de-açúcar 0 bagaço de cana-de-açúcar utilizado na hidrólise enzimática foi: (i) oriundo do Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) e pré-tratado por passagem por peneira com Tyler 20 resultando num bagaço com partículas tendo tamanho inferior a 0,84 mm, conhecido como bagacilho ou bagaço integral ou í i i) pré-tratado por explosão com vapor (origem: usina Vale do Rosário} e lavado com água. A lavagem do bagaço explodido com água morna visa à retirada de possíveis inibidores das etapas de hidrólise enzimática e fermentação e, em seguida, submetido à hidrólise enzimática utilizando a composição de enzimas da presente invenção. 0 objetivo desses dois pré-tratamentos foi o de comparar os desempenhos da hidrólise enzimática subseqüente a cada um deles.

Os ensaios de hidrólise enzimática foram realizados utilizando o bagaço integral e o bagaço explodido nas seguintes condições: as preparações de enzimas da presente invenção, opcionalmente concentradas, foram adicionadas ao bagaço seco em uma concentração especificada. A temperatura utilizada nos ensaios de hidrólise foi de 50°C com uma agitação de 200 rpm tendo sido retiradas amostras de 1 mL em tempos diversos até 72 h para análise da concentração de açúcares. A Figura 1 mostra a superioridade do pré-t ratamento por explosão com vapor na otimização da hidrólise enzimática que se segue ao pré-tratamento.

Exemplo 9: Hidrólise Enzimática com Bagaço de Cana-de-açúcar Foram realizados experimentos de hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão vapor, lavado e seco utilizando as seguintes composições de enzimas: (a) composição da presente invenção correspondendo à mistura dos sobrenadantes de fermentação corr. T.reesei RUT C30 e de fermentação com A. awamcri B.361U2/1; (c) produto adquirido da empresa GENENCOR (Spezyme CP, contendo atividades CMCase, FPase e B-glicosidase) . A Tabela 8 mostra a caracterização das amostras testadas segundo a atividade de FPAse, CMCase e β-glicosidase.

Tabela 8: Caracterização das preparações enzimáticas utilizadas na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar Para se obter xaropes concentrados de glicose foram realizados experimentos utilizando tanto o produto adquirido da empresa GENENCOR como a composição de enzimas da invenção, ambas as misturas de enzimas tendo uma mesma atividade, 10 FPU/g de bagaço de cana-de-açúcar. A concentração de bagaço pré-tratado a vapor utilizado foi de 130 g/L. A Figura 2 mostra que a hidrólise enzimática do bagaço utilizando a composição da presente invenção teve melhor desempenho (obtidos 65 g/L de glicose). Este resultado parece indicar que a composição da invenção possui enzimas com maior especificidade com relação ao bagaço pré-tratado a vapor em comparação com o produto comercial.

Exemplo 10: Avaliação da Estabilidade Operacional das Enzimas Celulolíticas durante a Hidrólise Enzimática Durante os experimentos realizados de acordo com o Exemplo 8, também houve o acompanhamento da estabilidade operacional das enzimas celulóliticas durante a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar. Os resultados apresentados na Figura 3 mostraram que as celulases (FPase, CMCase e β-glicosidase) são também bastante estáveis nas condições operacionais utilizadas. Tanto o produto comercial, adquirido da empresa GENENCOR, quanto a composição de enzimas da presente invenção se mostraram estáveis durante o período de até 72 horas em que o experimento foi realizado.

Exemplo 11: Sinerqismo entre as Enzimas Presentes nos Sobrenadantes de Fermentação com T, reeseí RUT C30 e A. ãwamori B.361U2/1 Foi avaliado o efeito de sinergia de misturas apresentando diferentes proporções dos sobrenandantes de culturas de T. reesei Rut C30 e A. awamori B.361U2/1 nas atividades CMCase, FPase e B-glicosidase e xilanase. A Figura 4 mostra que, com exceção da atividade de xilanase, foi observada sinergia nas atividades de CMCase, β-glicosidase e FPase, com preponderância para as duas primeiras. A sinergia para a atividade de CMCase foi maior na proporção 30% T. reesei e 70% A. awamori e para a atividade de β-glicosidase na proporção de 70% T. reesei e 30% A.awamori, sendo este resultado representativo considerando a importância da obtenção de xaropes de glicose para a fermentação alcoólica e da degradação da celobiose para evitar a inibição das celulases.

Exemplo 12: Zimograma do Perfil Eletroforético de CMCase Presente no Sobrenadante do Cultivo de T. reesei RUT C3Q O zimograma foi realizado com c sc-brenadaxile do oitavo dia do cultivo de T. reesei RUT C30 em meio de cultura contendo farelo de trigo. 0 objetivo deste experimento foi o de identificar as bandas protéicas correspondentes à atividade CMCase. Foram realizadas diluições do sobrenadante de forma a serem aplicadas no gel preparações contendo atividade total de CMCase de 0,13, 0,026, 0,013, 0,006 UI, por poço. A melhor visualização ocorreu na aplicação de 0,026 UI. A Figura 5 mostra duas bandas de forte intensidade correspondentes à atividade CMCase.

Exemplo 13: Zimograma do Perfil Eletroforético de CMCase Presente no Sobrenadante do Cultivo de T. reesei RUT C30, no Sobrenadante do Cultivo de A. awamori B.361U2/1 e de CMCase Presente na Mistura dos Sobrenadantes de T. reesei RUT C30 e de A. awamori B.361U2/1 0 zimograma, mostrado na Figura 6, foi realizado em condições desnaturantes, usando SDS e B-mercaptoetanol. Após a corrida houve uma etapa de renaturação (30 minutos) antes de incubar o gel a 50°C para a ocorrência da reação de hidrólise enzimática do CMC presente no gel. As diluições do produto da empresa GENENCOR, do sobrenadante de A. awamori e da mistura de sobrenadantes de T. reesei RUT C30 e de A. awamori B.361U2/1 resultaram na separação de bandas de CMCases de pesos moleculares diferentes. Já a diluição da amostra das enzimas presentes no sobrenadante de fermentação com Trichoderma não foi suficiente para a separação das proteínas, impossibilitando a visualização de bandas bem definidas. Não foi possível inferir o peso molecular aproximado dessas enzimas devido à ausência do marcador de peso molecular. Desta forma, neste gel, foi feita a identificação qualitativa dos pesos moleculares como "baixo" e "alto" peso molecular, usando o centro do gel como divisor.

Como ilustrado na Figura 8, o produto de enzimas comercial (da empresa ENGENCOR) analisado (canal 1) apresentou uma banda bem definida na parte superior do gel, com peso molecular "alto" e próximo ao encontrado para as enzimas de Trichoderma (canais 5 e 6) . As enzimas com atividade de CMCase do Aspergillus awamori apresentaram um total de quatro bandas bem definidas, com "alto" e "baixo" peso molecular. Nos canais onde foi aplicada a mistura de enzimas da presente invenção, foram observadas três novas bandas de "baixo" peso molecular. Acredita-se que duas explicações são possíveis: Io - houve interação entre as enzimas de T. reesei RUT C30 e A. awamori, possivelmente devido à divagem de algumas enzimas por proteases, havendo, no entanto, a manutenção da atividade biológica das enzimas ou devido à desglicosilação e 2° - o sobrenadante de Aspergilus awamori (canal 2 - conc. de 1,46 U/mL) estava mais diluído que a mistura de enzimas (3 -6,59 U/mL) e não foi possível detectar bandas em menores pesos moleculares. Entretanto, nc canal 4, com uma carga de 0,65 U/mL ainda é possível a visualização de sete bandas.

Exemplo 14 Avaliação de Desempenho de Diferentes Proporções de sobrenadantes do Cultivo de T, reesei RUT C3Q e do Cultivo de A. awamori B.361U2/1 na Hidrólise Enzimática de Bagaço de Cana-de-açúcar Foi avaliado o efeito de sinergia de misturas apresentando diferentes proporções dos sobrenandantes de culturas de T. reesei Rut C30 e A. awamori B.361U2/1 em relação ao seu desempenho na hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar. As hidrólises foram realizadas, paralelamente, com: (a) 100% A. awamori; (b) 100% T. reesei RUT C30; (c) 75% T. reesei RUT C30 + 25% A. awamori; (d) 50% T. reesei RUT C30 t 50% A. awamori; (e) 25% T. reesei RUT C30 + 75% A. awamori; (f) produto comercial (adquirido da empresa GENENCOR).

Como mostrado na Figura 7, as concentrações de glicose na mistura apresentando 50% de sobrenadante de T. reesei + 50% de sobrenadante de A. awamori e 75% de sobrenadante de T. reesei + 25% de sobrenadante de A. awamori apresentaram valores equivalentes, mostrando que essa mistura é a ideal para se obter um melhor rendimento.

Exemplo 15: Fermentação alcoólica do xarope obtido da hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor Inicialmente foi verificado se os hidrolisados de bagaço obtidos provocariam algum efeito inibitório no crescimento de Saccharomyces cerevis íae. Nos experimentos foi usada uma cepa isolada de fermento de panificaçâo. Segundo os resultados, as células cresceram, no hidrolisado sem nenhum problema, mostrando não haver inibidores de crescimento no xarope obtido. 0 rendimento celular após 24h de crescimento em melaço e no hidrolisado foi similar (cerca de 3 mg células/ml), partindo-se do mesmo inóculo e da mesma concentração de açúcar total. A seguir, usando uma cepa industrial, avaliou-se a produção de etanol a partir dos hidrolisados de bagaço produzidos. Para efeito de comparação, foi usado melaço diluído tendo a concentração de açúcar total aproximadamente igual à dos hidrolisados (em torno de 400 mM). Os resultados são apresentados na tabela 9.

Tabela 9: Resultados da produção de etanol no hidrolisado e no melaço Avaliando os resultados obtidos no hidrolisado, observou-se que dos 274 mM de açúcar total consumido, 233 mM foi glicose consumida. Esta glicose veio da hidrólise da celulose do bagaço. O restante (41mM) foi de hexoses de outros políssacarídeos do bagaço, inclui rdc a hemicelulose, que apesar de apresentar principalmente açúcares com cinco carbonos na sua composição, também apresenta açúcares de seis carbonos. A conversão dos açúcares consumidos em etanol durante o processo fermentativo pode ser calculada pela seguinte equação: Conversão(%) = [Produto formado/Substrato consumido] * 100 0 melaço contém praticamente sacarose (açúcar não redutor), glicose e frutose (açúcares redutores) . Sabe-se que todos estes açúcares podem ser fermentados a etanol. No entanto, apesar de ser possível determinar o teor em glicose no hidrolisado ainda não se sabe a composição completa dos seus açúcares e nem a proporção de açúcares fermentáveis. Desta forma, decidiu-se calcular a conversão em termos do açúcar total consumido (ao invés da glicose), já que no caso do melaço, o etanol produzido também é resultante da sacarose e da frutose presente.

De acordo com os resultados obtidos após 24 horas de fermentação, obteve-se maior conversão em etanol, (cerca de 40%), a partir do mosto hidrolisado. A conversão em etanol a partir do hidrolisado de bagaço foi cerca de 2 vezes maior que a obtida a partir de melaço de cana (24%), uma fonte usual para produção de etanol nas destilarias brasileiras.

Exemplo 16: Visualização do bagaço de cana "in natura", do pré-tratado, do resíduo de liqnina depois da hidrólise enzimática da celulose e de outros políssacarídeos, ut i]i zando a mistura de sobrenadantes do cultive de T. reesei RUT C30 e do Cultivo de Ά. awamori B.361U2/1 e ainda do xarope de glicose obtido.

As fotografias apresentadas servem para ilustrar visualmente o aspecto do bagaço e dos produtos da hidrólise enzimática, xarope de açúcares e iignína.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na descrição são indicativos do nível daqueles especialistas na técnica à qual a invenção se refere. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados a título de referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou cada pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

Apesar de a invenção precedente ter sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplos para finalidade de clareza e entendimento, ficará óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações que acompanham esta descrição.

REIVINDICAÇÕES

Claims (13)

1. Composição de enzimas caracterizada por compreender; (a) enzimas celulolíticas obtidas por fermentação com Trichoderma reesei linhagem RUT C3G; (b) enzimas celulolíticas, hemiceluloliticas, β-glicosidase e enzimas acessórias obtidas por fermentação com Aspergillus awamori 2B361U2/1; e (c) três espécies moleculares com atividade CMCase e menor massa molecular do que as espécies moleculares com atividade CMCase presentes nos sobrenadantes individuais do cultivo de T. reesei linhagem RUT C30 e A, awamori 2B361U2/1; e (d) um veiculo compatível com ditas enzimas (a) e (b) e espécie molecular (c).

2. Composição de enzimas caracterizada por compreender: (a) enzimas celulolíticas obtidas por fermentação com Trichoderma reesei linhagem RUT C3G; {b) enzimas celulolíticas, hemiceluloliticas, β-glicosidase e enzimas acessórias obtidas por fermentação com Aspergillus awamori 2B361U2/1; e (c) um veiculo compatível com ditas enzimas (a) e (b) .

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de que dito veiculo compatível com ditas enzimas é selecionado do· grupo consistindo de sais neutros, como sulfato de amônio, fosfato de potássio ou cloreto de sódio, polióis de baixo peso molecular como giicerol, sorbítol e manitol.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de estar na forma líquida ou sólida.

5. Processo de produção de composição de enzimas conforme definido na reivindicação 1, dito processo sendo caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) cultivar, em separado, em meio apropriado de cultura, a linhagem T. reesei RUT C30 e a linhagem Ά. awamori 2B.361U2/1; (b) separar os sobrenadantes de cada cultura das linhagens T. reesei RUT C30 e Ά. awamori 2B.361U2/1; (c) concentrar e reunir os sobrenadantes contendo as ditas enzimas celulases e enzimas acessórias para obtenção da mistura de enzimas e (d) opcionalmente, secar a suspensão para obter a mistura de enzimas seca.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo fato de que dita separação dos sobrenadantes realizada na etapa (b) é feita por microfiltração.

7. Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo fato de que dita concentração dos sobrenadantes realizada na etapa (c) é feita por ultrafiltração.

8. Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo fato de que dita secagem realizada na etapa (d) é feita por um processo selecionado do grupo consistindo de liofilização e spray drying.

9. Processo de produção de álcool a partir de biomassa caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) pré-tratamento do material lignocelulósico; (b) hidrólise enzimática do material pré-tratado na etapa (a) com uma composição como definida na reivindicação 1 ou 2; e (c) fermentação alcoólica da glicose obtida na etapa (b) para obtenção de álcool.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo fato de o pré-tratamento do material lignocelulósico ser feito por explosão a vapor.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de dito pré-tratamento ser opcionalmente antecedido por uma etapa de compostagem seguida de explosão a vapor.

12. Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo fato de dito pré-tratamento incluir uma operação de lavagem do material lignocelulósico explodido antes da hidrólise enzimática.

13. Uso da composição de enzimas definida na reivindicação 1 ou 2 caracterizado pelo fato de dita composição ser usada na hidrólise enzimática de material lignocelulósico.