CN115975819B - 一株糠醛耐受的里氏木霉突变菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株糠醛耐受的里氏木霉突变菌株及其应用，该菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.40402，保藏日期为2022年10月31号。为解除糠醛对微生物生长、发酵的抑制作用，本发明以完全可育的里氏木霉CBS系列菌株为出发菌株，通过两轮ARTP诱变筛选获得了耐受8mM糠醛的突变株DF20。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株糠醛耐受的里氏木霉突变菌株。
背景技术
丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)具有强大的蛋白合成分泌能力，是应用最广泛的木质纤维素降解酶工业生产菌种，将木质纤维素本身作为发酵碳源可有效降低里氏木霉的发酵成本，而且产生的复合酶液组成更有利于木质纤维素的降解。
木质纤维素因其结构的特殊性，在高值化利用过程中需要使用物理或化学的方法进行预处理，以增加酶对纤维素的可及性。然而，预处理过程中通常会产生一些有毒化合物，如乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛等，严重影响后期的酶解以及微生物发酵过程。
糠醛损伤DNA和细胞膜，抑制三羧酸循环和糖酵解等途径，是在微生物发酵过程中产生的主要抑制剂之一。如何解除木质纤维素水解过程产生的糠醛等有害成分对微生物发酵的抑制作用是木质纤维素高值化利用过程中亟待解决的关键问题之一。通过驯化，在不影响其酶产量的前提下，增加里氏木霉对糠醛类物质的耐受性，用于指导工业菌株的理性遗传改造才是解决这一问题的最佳选择。
发明内容
本发明的目的在于解除预处理后木质纤维素中的有害成分糠醛对微生物发酵的抑制作用，提供了一株糠醛耐受的里氏木霉突变菌株，可应用于工业生产中木质纤维素的高值化利用。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一株糠醛耐受的里氏木霉突变菌株，名称为DF20，其分类命名为Trichodermareesei，已于2022年10月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.40402，保藏地址为：中国北京，中国科学院微生物研究所。
上述里氏木霉(Trichoderma reesei)DF20的菌落及菌体特征如下：在PDA培养基上培养后观察，菌落呈广铺的棉絮状，绿色，不透明。
上述糠醛耐受的里氏木霉突变菌株是通过两轮ARTP(常压室温等离子体)诱变获得的，第一轮诱变得到了能耐受4mM糠醛的诱变株，第二轮诱变得到了能耐受8mM糠醛的诱变株DF20。
本发明所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)DF20的糠醛耐受性明显高于对照菌株。里氏木霉对照菌株对2mM以下的糠醛浓度不敏感，生长几乎不受影响，但是对4mM和8mM糠醛非常敏感，4mM以上的糠醛浓度使对照菌株的生长受到严重抑制。里氏木霉(Trichoderma reesei)DF20是通过两轮ARTP诱变而获得，第一轮诱变得到了能够耐受4mM糠醛的诱变株，第二轮诱变得到了能够耐受8mM糠醛的诱变株DF20，将里氏木霉的糠醛耐受性提高了4倍。
本发明所述CGMCC No.40402菌株能够用于在8mM糠醛条件下正常生长，且依旧具备分泌纤维素酶的能力，从而使木质纤维素的预处理更为简单，降低工业生产的成本。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为里氏木霉对照菌株CBS3糠醛耐受浓度摸索。
图2为里氏木霉对照菌株CBS3的ARTP诱变致死率曲线。
图3为里氏木霉糠醛耐受菌株的第一轮ARTP筛选。
图4为里氏木霉糠醛高抗菌株的第二轮ARTP筛选。
图5为里氏木霉糠醛高抗菌株DF20、对照菌株CBS3的滤纸酶活。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
里氏木霉(Trichoderma reesei)CBS3：里氏木霉(Trichoderma reesei)CBS999.97，由维也纳国家技术研究院的Monika Schmoll教授惠赠。
实施例1：培养基配制
PDA固体培养基：去皮马铃薯200g，在自来水中煮至泥状，过滤，取上清液加入20g葡萄糖，20g琼脂，自来水定容至1L，自然PH，121℃，0.1MPa，高温高压灭菌20min。
MM液体培养基：60g/L CaCl2·2H2O、60g/L MgSO4·7H2O各1mL，3.7g/L CoCl2·6H2O、5g/L FeSO4·7H2O、1.4g/L ZnSO4·7H2O、1.6g/L MnSO4·H2O各100μL，KH2PO4 1.5g，Glucose 2g，(NH4)2SO4 0.5g，定容到100mL。
MM+0.5mM糠醛液体培养基100mL：在MM培养基基础上加入5μL糠醛。
MM+1mM糠醛液体培养基100mL：在MM培养基基础上加入10μL糠醛。
MM+2mM糠醛液体培养基100mL：在MM培养基基础上加入20μL糠醛。
MM+4mM糠醛液体培养基100mL：在MM培养基基础上加入40μL糠醛。
MM+8mM糠醛液体培养基100mL：在MM培养基基础上加入80μL糠醛。
MM+T固体培养基：60g/L CaCl2·2H2O、60g/L MgSO4·7H2O各1mL，3.7g/L CoCl2·6H2O、5g/L FeSO4·7H2O、1.4g/L ZnSO4·7H2O、1.6g/L MnSO4·H2O各100μL，KH2PO4 1.5g，Glucose 2g，(NH4)2SO4 0.5g，琼脂粉2g，Triton X-100 100μL，定容到100mL。
MM+Avicel液体培养基：将MM液体培养基中的碳源添加为2％ Avicel(微晶纤维素)。
实施例2：糠醛作用浓度的摸索与确定
定向驯化采用的出发菌株为里氏木霉CBS3，首先对其进行了糠醛作用浓度的摸索与确定，具体步骤如下：
(1)将里氏木霉CBS3接种于PDA固体培养基，培养约7天。
(2)用无菌水将孢子洗下，用神奇滤布将菌丝和培养基残渣过滤去除。
(3)将孢子悬液转移至2mL离心管，用血球计数板计数。
(4)在24孔板中每孔加入2mL MM液体培养基后分别加入0mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、8mM糠醛。
(5)接种2*106个孢子于24孔板各孔中，高频振荡摇床220rpm，28℃培养。
糠醛作用浓度的摸索实验测试结果如图1所示。里氏木霉CBS3对2mM以下的糠醛浓度不敏感，生长几乎不受影响，但是对4mM和8mM糠醛非常敏感，4mM以上的糠醛浓度使里氏木霉CBS3的生长受到严重抑制。因此，确定MM+4mM糠醛培养基为第一轮筛选糠醛耐受性菌株的培养基。
实施例3：ARTP诱变致死率摸索
采用清华大学研制的常温常压等离子诱变仪进行里氏木霉CBS3的诱变。设定氦气为致突变剂，主要参数包括：电源P(P＝100W)，通气量G(G＝10L/min)，样品与发射源间距2mM。以上参数为不变量，以诱变时间为变量，改变诱变时间(0-600s)从而确定致死率。具体步骤如下：
(1)将里氏木霉CBS3接种于PDA固体培养基，培养约7天。
(2)用无菌水将孢子洗下，用神奇滤布将菌丝和培养基残渣过滤去除。
(3)将孢子悬液转移至2mL离心管，用血球计数板计数。
(4)将孢子悬液浓缩至107个/mL。
(5)吸取10μL孢子悬液均匀涂布于铜台。
(6)将铜台置于ARTP诱变仪中，设定氦气为致突变剂，电源功率100W，通气量10L/min，样品与发射源间距2mm，进行诱变。
(7)诱变完成后，迅速将铜台转移至含有990μL无菌水的1.5mL离心管中，涡旋振荡2min。
(8)用镊子取出铜台，将诱变后的孢子悬液梯度稀释至100个/mL，涂布1mL至MM+T固体平板。
(9)计算平板上长出的单克隆数目，从而得出每100个孢子中能够存活的孢子数目，用单克隆数目除以100即为该照射时间对应的致死率。
(10)以诱变时长为横坐标，致死率为纵坐标绘制致死率曲线。
糠醛致死率曲线如图2所示。结果显示，随着照射时间的增加，里氏木霉的致死率逐渐升高，当诱变时长达300s时，里氏木霉致死率达到90％，当诱变时长超过300s时，致死率接近100％。因此诱变育种处理时间选定为300s。
实施例4：里氏木霉糠醛耐受菌株的第一轮ARTP诱变筛选
定向驯化采用的出发菌株为里氏木霉CBS3，采用清华大学研制的常温常压等离子诱变仪进行诱变，设定氦气为致突变剂，主要参数包括：电源P(P＝100W)，通气量G(G＝10L/min)，样品与发射源间距2mM，诱变时间300s。具体步骤如下：
(1)将里氏木霉CBS3接种于PDA固体培养基，培养约7天。
(2)用无菌水将孢子洗下，用神奇滤布将菌丝和培养基残渣过滤去除。
(3)将孢子悬液转移至2mL离心管，用血球计数板计数。
(4)将孢子悬液浓缩至107个/mL。
(5)吸取10μL孢子悬液均匀涂布于铜台。
(6)将铜台置于ARTP诱变仪中，设定氦气为致突变剂，电源功率100W，通气量10L/min，样品与发射源间距2mm，时间300s，进行诱变。
(7)诱变完成后，迅速将铜台转移至含有990μL无菌水的1.5mL离心管中，涡旋振荡2min。
(8)将诱变后的孢子悬液梯度稀释至100个/mL，涂布1mL至MM+T固体平板。
(9)挑取单菌落于MM+4mM糠醛液体培养基，每个单菌落做两个重复，比较对照菌株CBS3和诱变候选菌的菌丝体生成的时间，选取菌丝体生成时间均短于对照菌株的诱变菌株，即为第一轮诱变筛选得到的耐4mM糠醛的里氏木霉突变抗性菌株。
结果显示，以里氏木霉CBS3为出发菌株的ARTP诱变初筛共获得7株在4mM糠醛条件下生长显著好于野生型的诱变株，CBS3-9，CBS3-16，CBS3-28，CBS3-77，CBS3-89，CBS3-109，CBS3-195，其中CBS3-16的筛选如图3。
将7株突变株接种于MM+4mM Furfural固体培养基上，28℃恒温培养。为保证诱变株糠醛耐受性遗传稳定，每隔24h用无菌注射器挑取菌丝尖端于新的MM+4mM Furfural固体培养基，进行传代培养。
实施例5：里氏木霉糠醛耐受菌株的第二轮ARTP诱变筛选
将实施例4中得到的里氏木霉突变抗性菌株连续传代5次后，选取其中性状遗传最稳定的突变株CBS3-16进行第二轮ARTP诱变并再次进行筛选及遗传稳定性测试。采用清华大学研制的常温常压等离子诱变仪进行诱变，设定氦气为致突变剂，主要参数包括：电源P(P＝100W)，通气量G(G＝10L/min)，样品与发射源间距2mM，诱变时间300s。具体步骤如下：
(1)将里氏木霉CBS3接种于PDA固体培养基，培养约7天。
(2)用无菌水将孢子洗下，用神奇滤布将菌丝和培养基残渣过滤去除。
(3)将孢子悬液转移至2mL离心管，用血球计数板计数。
(4)将孢子悬液浓缩至107个/mL。
(5)吸取10μL孢子悬液均匀涂布于铜台。
(6)将铜台置于ARTP诱变仪中，设定氦气为致突变剂，电源功率100W，通气量10L/min，样品与发射源间距2mm，时间300s，进行诱变。
(7)诱变完成后，迅速将铜台转移至含有990μL无菌水的1.5mL离心管中，涡旋振荡2min。
(8)将诱变后的孢子悬液梯度稀释至100个/mL，涂布1mL至MM+T固体平板。
(9)挑取单菌落于MM+8mM糠醛液体培养基，每个单菌落做两个重复，比较对照菌株CBS3和诱变候选菌的菌丝体生成的时间，选取菌丝体生成时间均短于对照菌株的诱变菌株，即为第二轮诱变筛选得到的耐8mM糠醛的里氏木霉突变抗性菌株。
结果显示，以CBS3-16为出发菌株的第二轮ARTP诱变筛选获得了在8mM糠醛条件下生长显著好于对照菌株CBS3的诱变突变CBS3-16-1,命名为DF20,筛选结果如图4所示。
实施例6：里氏木霉糠醛高抗菌株DF20与对照菌株CBS3的培养与发酵
将实施例5中筛选得到的里氏木霉突变抗性菌株DF20连续传代5次后，与对照菌株CBS3同时进行诱导发酵。具体步骤如下：
(1)将里氏木霉DF20、CBS接种于PDA固体培养基，培养约7天。
(2)用无菌水将孢子洗下，用神奇滤布将菌丝和培养基残渣过滤去除。
(3)将孢子悬液转移至2mL离心管，用血球计数板计数。
(4)将孢子悬液浓缩至108个/mL。
(5)将孢子悬液添加至50mL MM+Avicel液体培养基中，28℃，220rpm条件下诱导发酵144h。
(6)取1.5mL发酵液于EP管中，12000rpm转速下离心5min，取上清发酵液，4℃保存。
实施例7：里氏木霉糠醛高抗菌株DF20与对照菌株CBS3的滤纸酶活
对实施例6中以MM+Avicel液体培养基诱导发酵的发酵液进行滤纸酶活(Filterpaper Activity，FPA)的测定，具体步骤如下：
(1)将Whatman 1号滤纸剪成若干长6cm长，0.8cm宽的长方形小纸条，对折后折成M型。
(2)将M型滤纸条塞入具塞试管，并使其垂直立于底部，加入1.5mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，50℃水浴保温10min。
(3)加入0.5mL适当稀释的酶液(即实施例6中的发酵液)，并使管内溶液完全浸没滤纸，50℃水浴保温1h，迅速浸入冷水中降温。
(4)空白对照组在冷水降温后再加酶液，其余操作相同。另用5组浓度分别为0.0、0.25、0.5、0.75、1mg/mL葡萄糖标准溶液替换酶液，其他操作不变，用于标准曲线的制作。
(5)从具塞试管中吸取200μL反应液到离心管中，加入等体积的DNS试剂，混匀后100℃反应5min，迅速浸入冷水中冷却。
(6)吸取200μL反应液于酶标板，测定OD540处吸光度，计算出DF20、CBS3的滤纸酶活。
里氏木霉糠醛高抗菌株DF20与对照菌株CBS3的滤纸酶活如图5所示。滤纸酶活结果显示，与里氏木霉对照菌株CBS3相比，ARTP诱变筛选出的糠醛高抗菌株DF20依旧具备分泌纤维素酶的能力，展现出较大的工业生产应用潜力。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (5)
1.一株糠醛耐受的里氏木霉（Trichoderma reesei）DF20，保藏日期为2022年10月31日，保藏机构为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.40402，地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.根据权利要求1所述的糠醛耐受的里氏木霉（Trichoderma reesei）DF20，其特征在于：所述的糠醛耐受的里氏木霉（Trichoderma reesei）DF20具备8mM糠醛耐受性。
3.如权利要求1所述的糠醛耐受的里氏木霉（Trichoderma reesei）DF20在木质纤维素的降解中的应用。
4.木质纤维素降解方法，在木质纤维素中添加权利要求1所述的糠醛耐受的里氏木霉（Trichoderma reesei）DF20，并进行发酵。
5.如权利要求4所述的木质纤维素降解方法，其特征在于，是在MM培养基中添加木质纤维素和里氏木霉（Trichoderma reesei）DF20。
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