BRPI0616419B1

BRPI0616419B1 - Method for producing an l-aminoacid

Info

Publication number: BRPI0616419B1
Application number: BRPI0616419-6A
Authority: BR
Inventors: Iwatani Shintaro; Imaizumi Akira; Usuda Yoshihiro; Matsui Kazuhiko
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 2005-09-27
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2017-12-05
Also published as: US9644009B2; CN101273054B; JP2007117082A; US20090246835A1; CN101273054A; BRPI0616419A2

Abstract

método para produzir um l-aminoácido. um l-aminoácido é produzido cultivando-se um microorganismo da família enterobacteriaceae que tem a capacidade para produzir um l-aminoácido e que foi modificado de modo a aumentar a quantidade de expressão de um ou mais genes selecionados do gene evga, gene gade ou gene ydeo que codifica um fator de transcrição envolvido no sistema de dois componentes de regulon evgas em um meio para produzir e acumular um l-aminoácido no meio ou em células e coletar o l-aminoácido do meio ou células.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO” Campo Técnico A presente invenção diz respeito a um método para produzir um L-aminoácido usando um microorganismo e mais especificamente, a um método para produzir um L-aminoácido, tal como L-lisina, L-treonina, L-triptofano, etc. L-lisina, L-treonina e L-tríptofano são usados na indústria como aditivos de ração animal, ingredientes de alimento saudável e infusões de aminoácido.

Fundamentos da Técnica Para produzir uma substância alvo, tal como um L-aminoácido, etc., pela fermentação usando um microorganismo, existem métodos que usam um microorganismo do tipo selvagem (cepa do tipo selvagem), uma cepa auxotrófica derivada de uma cepa do tipo selvagem, uma cepa mutante de regulagem metabólica como um de vários tipos de cepas mutantes resistentes a medicamento derivadas de uma cepa do tipo selvagem, uma cepa que tem as características tanto da cepa auxotrófica quanto da cepa mutante de regulagem metabólica e assim por diante.

Em anos recentes, a tecnologia de DNA recombinante foi usada para produzir substâncias alvo pela fermentação. Por exemplo, a capacidade de um microorganismo para produzir um L-aminoácido foi melhorada realçando-se a expressão de um gene que codifica uma enzima da biossíntese de L-aminoácido (Patente U.S. 5168056, Patente U.S. 5776736) ou realçando-se o influxo da fonte de carbono para o sistema de biossíntese de L-aminoácido (Patente U.S. 5906925).

Como para o sistema de dois componentes EvgAS que foi descoberto em bactérias de Enterobacteriaceae, tais como Escherichia coli, etc., a função de EvgS, que é uma quinase sensor, é desconhecida, mas EvgA que é um fator de transcrição regulador de resposta, é conhecido regular a transcrição de muitos genes (Masuda, N. e Church, G. M., J. Bacteriol. 2002. 184(22): 6225-6234. Escherichia coli gene expressíon responsive to leveis of the response regulator EvgA.). Também é conhecido que o fator de transcrição EvgA positivamente regula a transcrição dos genes ydeO e gadE que codificam dois fatores de transcrição, YdeO e GadE e que YdeO positivamente regula a transcrição do gene gadE (Masuda, N. e Church, G. M, Mol. Microbiol. 2003. 48(3): 699-712. Regulatory network of acid resistence genes in Escherichia coli.', Ma, Z., Masuda, N. e Foster, J. W., J. Bacteriol. 2004.186(21): 7378-7389. CharacterizationofEvgAS-YdeO-GadE branched regulatory Circuit goveming glutamate-dependent acid resistence in Escherichia coli.). Entretanto, a produção de um aminoácido usando um microorganismo em que a expressão dos genes evgA, gadE ou ydeO foi aumentada não foi anteriormente relatada.

Divulgação da invenção Um objetivo da presente invenção é fornecer uma cepa bacteriana da família Enterobacteriaceae que seja capaz de produzir eficientemente um L-aminoácido e também fornecer um método para produzir eficientemente um L-aminoácido usando a cepa bacteriana.

Os inventores da presente invenção extensivamente estudaram de modo a resolver o problema mencionado acima, resultando na descoberta de que a capacidade produtora de L-aminoácido pode ser melhorada pela modificação de um microorganismo para aumentar a expressão de um ou mais do gene evgA, gene gadE ou gene ydeO. Estes genes codificam fatores de transcrição envolvidos no sistema de dois componentes der EvgAS. É um objetivo da presente invenção fornecer um método para produzir um L-aminoácido, que compreende cultivar em um meio uma bactéria da família Enterobacteriaceae que tenha uma capacidade para produzir um L-aminoácido e que foi modificado de modo a aumentar a expressão de um ou mais genes selecionados de gene evgA, gene gadE ou gene ydeO que codifica um fator de transcrição envolvido no sistema de dois componentes de EvgAS, que produz e acumula o L-aminoácido no meio e coletar o L-aminoácido do meio. É um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que a expressão do um ou mais genes foi aumentada aumentando-se o número de cópias de cada gene ou modificando a seqüência reguladora de expressão do dito gene. É um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que a quantidade de expressão do um ou mais genes foi aumentada pela modificação da bactéria de modo que a expressão de um gene evgS que codifica uma quinase sensor seja aumentada. É um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que o gene evgA é um DNA descrito nos seguintes (a)ou(b): (a) um DNA que compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQIDNO: 23, (b) um DNA que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 23 ou com uma sonda que pode ser preparada a partir da dita seqüência de nucleotídeo sob condições estringentes e que codifica uma proteína tendo atividade de fator de transcrição. É um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que o gene gadE é um DNA descrito nos seguintes (c) ou (d): (c) um DNA que compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQIDNO: 27, (d) um DNA que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 27 ou com uma sonda que pode ser preparada a partir da dita seqüência de nucleotídeo sob condições estringentes e que codifica uma proteína tendo atividade de fator de transcrição. É um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que o gene ydeO é um DNA descrito nos seguintes (e) ou (f): (e) um DNA que compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQIDNO: 29, (f) um DNA que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 29 ou com uma sonda que pode ser preparada a partir da dita seqüência de nucleotídeo sob condições estringentes e que codifica uma proteína tendo atividade de fator de transcrição. E um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que o gene evgS é um DNA descrito nos seguintes (g) ou (h): (g) um DNA que compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQIDNO: 25. (h) um DNA que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 25 ou com uma sonda que pode ser preparada a partir da dita seqüência de nucleotídeo sob condições estringentes e que codifica uma proteína tendo atividade de fosfotransferência. É um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que o gene evgA codifica uma proteína descrita nos seguintes (A) ou (B) (A) uma proteína que consiste da seqüência de aminoácido da SEQIDNO: 24, (B) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 24 incluindo substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou diversos resíduos de aminoácido e tem atividade de fator de transcrição. E um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que o gene gadE codifica uma proteína descrita nos seguintes (C) ou (D); (C) uma proteína que consiste da seqüência de aminoácido da SEQIDNO: 28. (D) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 28 incluindo substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou diversos resíduos de aminoácido e tem atividade de fator de transcrição. É um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que o gene ydeO codifica uma proteína descrita nos seguintes (E) ou (F): (E) uma proteína que consiste da seqüência de aminoácido da SEQIDNO: 30. (F) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 30 incluindo substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou diversos resíduos de aminoácido e tem atividade de fator de transcrição. É um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que o gene evgS codifica uma proteína descrita nos seguintes (G) ou (H): (G) uma proteína que consiste da seqüência de aminoácido da SEQIDNO: 26. (H) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 26 incluindo substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou diversos resíduos de aminoácido e tem atividade de fosfotransferase. É um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima em que a bactéria pertence à família Enterobacteriaceae selecionada do grupo que consiste dos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella e Serratia. É um outro objetivo da presente invenção fornecer o método como descrito acima em que o L-aminoácido é um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste de L-lísina, L-treonina e L-triptofano. Breve Descrição das Figuras A Figura 1 mostra a construção de vetor plasmídico pTSl, que tem uma origem de replicação sensível à temperatura.

Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas A seguir, a presente invenção será explicada em detalhes. 1.0 microorganismo da presente invenção O microorganismo da presente invenção é um microorganismo da família Enterobacteriaceae que tem uma capacidade para produzir um L-aminoácido e que foi modificado de modo a aumentar a expressão de um ou mais dos genes evgA, gadE ou ydeO, que codificam o fator de transcrição envolvido no sistema de dois componentes de regulon EvgAS. Aqui, “uma capacidade para produzir um L-aminoácido” significa uma capacidade para produzir um L-aminoácido e causa acúmulo do mesmo a um nível em que o mesmo pode ser coletado a partir de um meio ou as células do microorganismo quando o microorganismo da presente invenção é cultivado no meio. O microorganismo da presente invenção pode ter a capacidade para produzir L-aminoácidos múltiplos. O microorganismo pode inerentemente possuir a capacidade para produzir um L-aminoácido ou pode ser um microorganismo que foi modificado pela mutagênese ou técnicas de DNA recombinantes para comunicar a capacidade para produzir um L-aminoácido, como descrito abaixo.

Também, a frase “aumentar a expressão de um gene” significa que a transcrição e/ou tradução do gene são aumentadas. 0 tipo do L-aminoácido não é particularmente limitado. Os exemplos incluem aminoácidos básicos tais como L-lisina, L-omitina, L-arginina, L-hístidina e L-citrulina; L-arainoácidos alifáticos tais como L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina e glicina; L-amínoácidos que são ácidos hidroximonoaminocarboxílicos tais como L-treonina e L-serina; L-aminoácidos cíclicos tais como L-prolina; L-aminoácidos aromáticos tais como L-fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano; L-aminoácidos contendo enxofre tais como L-cisteína, L-cistina e L-metíonina; L-aminoácidos ácidos tais como L-ácido glutâmico e L-ácido aspártico; e amidas de L-aminoácido ácido tais como L-glutamina e L-asparagina, etc. Em particular, L-lisina, L-treonina e L-triptofano são preferidos. O microorganismo da presente invenção pode ser capaz de produzir dois ou mais aminoácidos. 1-1. Comunicar Capacidade produtora de L-aminoácido Os seguintes incluem uma descrição do método para comunicar capacidade produtora de L-aminoácido a um microorganismo, junto com exemplos de microorganismos comunicados com a capacidade produtora de L-aminoácido que pode ser usada na presente invenção, mas a invenção não é limitada a estes contanto que eles tenham uma capacidade produtora de L-aminoácido. O microorganismo que é usado na presente invenção não é particularmente limitado, contanto que o mesmo pertença à família Enterobacteriaceae, tal como os gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella, etc. e tenha uma capacidade produtora de L-aminoácido. Especificamente, qualquer microorganismo que pertença à família Enterobacteriaceae com a sua classificação descrita na base de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) pode ser usado (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srch mode=l&unlock). Como a cepa precursora da família Enterobacteriaceae que pode ser usada para derivar o microorganismo da presente invenção, é particularmente desejável usar bactérias que pertençam aos gêneros Escherichia, Enterobacter ou Pantoea. Não existe nenhuma cepa precursora particular das bactérias do gênero Escherichia que deva ser usada de modo a obter as bactérias da presente invenção, mas aquelas listadas em Neidhardt et al., podem ser usadas (Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Tabela 1. Em F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Segunda Edição, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Um exemplo é a Escherichia coli. Os exemplos específicos de Escherichia coli são Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), etc., que são protótipos derivados de cepas do tipo selvagem de Kl2.

Estes são disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). Estes são disponíveis através deste site da web da organização (ver http: /www.atcc.org) por intermédio do uso dos números de acesso dados para cada cepa bacteriana. Os números de acesso que correspondem a cada cepa bacteriana são dados no catálogo da American Type Culture Collection.

Os exemplos de bactérias do gênero Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans e Enterobacter aerogenes. Um exemplo de uma bactéria do gênero Pantoea inclui Pantoea ananatis. Em anos recentes, com base na análise de sequência de nucleotídeo 16S rRNA, Enterobacter agglomerans foi na ocasião reclassificado como Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis e Pantoea stewartü. Para a presente invenção, qualquer bactéria que pertença ao gênero Enterobacter ou Pantoea pode ser usada contanto que a bactéria seja classificada na família Enterobacteriaceae. Quando Pantoea ananatis é cruzado pelo engendramento genético, as cepas Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), AJ13356 (FERM BP-6615), AJ13601 (FERM BP-7207) ou qualquer derivado deste pode ser utilizado. Quando isoladas, estas cepas foram identificadas e depositadas como Enterobacter agglomerans. Como estabelecido acima, a análise pela seqüência de nucleotídeo 16S rRNA tem ocasionado a sua reclassifícação como Pantoea ananatis. O que segue é uma descrição de métodos para comunicar capacidade produtora de L-aminoácido aos microorganismos que pertencem à família Enterobacteriaceae e métodos para aumentar a capacidade produtora de L-aminoácido nestes microorganismos.

Para comunicar a capacidade para produzir um L-aminoácido, métodos convencionalmente utilizados no cruzamento das bactérias corineformes ou bactérias do gênero Escherichia (ver “Amino Acid Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), Ia Edição, publicado em 30 de maio de 1986, pp. 77-100) podem ser aplicados. Tais métodos incluem a aquisição de um mutante auxotrófíco, uma cepa resistente a análogo ou um mutante de regulagem metabólica ou construção de uma cepa recombinante tendo expressão realçada de uma enzima da biossíntese de L-aminoácido. Aqui, no cruzamento de uma bactéria que produz L-aminoácido, uma ou mais propriedades, tais como mutação auxotrófíca, resistência a análogo ou mutação de regulagem metabólica podem ser comunicadas. A expressão de uma ou mais enzimas da biossíntese de L-aminoácido pode ser realçada isoladamente ou em combinações de dois ou mais. Além disso, a técnica de comunicar propriedades tais como mutação auxotrófíca, resistência a análogo ou mutação de regulagem metabólica pode ser combinada com a técnica de realçar as enzimas de biossíntese.

Uma cepa auxotrófíca mutante, cepa resistente a análogo de L-aminoácido ou cepa mutante da regulagem metabólica com a capacidade para produzir um L-aminoácido podem ser obtidas submetendo-se uma cepa precursora ou cepa do tipo selvagem a um tratamento de mutação convencional, tal como a exposição aos raios X ou irradiação UV ou tratamento com um agente mutagênico tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou metano sulfonato de etila (EMS), etc., depois selecionar aqueles que exibem uma mutação autotrófica, resistência a análogo ou mutação de regulagem metabólica e que também tenha a capacidade para produzir um L-aminoácido.

Os seguintes são exemplos de bactérias que produzem L-lisina e seus métodos de construção.

Por exemplo, as bactérias que têm capacidade produtora de L-lisina incluem uma cepa resistente a análogo de L-lisina ou uma cepa mutante de regulagem metabólica. Os exemplos dos análogos de L-lisina incluem, mas não são limitados a oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-cisteína (AEC), γ-metil lisina, α-clorocaprolactama, etc. as cepas mutantes que têm resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidos submetendo-se as bactérias que pertencem ao gênero Escherichia a um tratamento de mutagênese artificial convencional. Os exemplos de bactérias que produzem L-lisina incluem a cepa AJ11442 da Escherichia coli (FERM BP-1543, NRRL B-12185; ver a JP56-18596A e Patente U.S. 4.346.170), cepa VL611 da Escherichia coli (EP1016710), etc. A cepa WC196 da Escherichia coli (ver a WO96/17930) também pode ser usada como uma bactéria produtora de L-lisina. A cepa WC196 foi cruzada comunicando-se resistência a AEC aos derivados da cepa W3110 de Escherichia coli K-12. Esta cepa foi chamada de Escherichia coli AJ13069 e foi depositada em 6 de dezembro de 1994 no National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (correntemente, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão) sob o Acesso N® FERM P-14690. Depois, a mesma foi convertida a um depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995 e dado o Acesso N- FERM BP-5252.

As bactérias que produzem L-lisina também podem ser construídas aumentando-se uma atividade enzimática biossintética da L-lisina. O aumento da atividade destas enzimas pode ser obtido aumentando-se o número de cópias de um gene que codifica a enzima nas células ou pela modificação de uma seqüência reguladora de expressão.

Os exemplos de genes que codificam enzimas da biossíntese de L-lisina incluem, mas não são limitados aos genes que codificam a diidrodipicolinato sintase (dapA), aspartoquinase (lysC), diidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato descarbonilase (lysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (WO96/40934, Patente U.S. 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) (60-87788A), aspartato aminotransferase (aspC) (JP6-102028)B, diaminopimelato epimerase (dapF) (JP2003-135066A), aspartato semialdeído desidrogenase (asd) (WOOO/61723) e outros genes que codificam enzimas do caminho da diaminopimelato; assim como um gene que codifica a homoaconitato hidratase (JP2000-157276A) e outros genes que codificam enzimas do caminho do aminoadipato.

Além disso, é conhecido que a diidrodipicolinato sintase (DDPS) e aspartoquinase (AK) do tipo selvagem são suprimidas pela inibição de retroalimentação pela L-lisina; portanto, quando dapA e lysC são usados, é preferível usar genes mutantes que codifiquem a diidrodipicolinato sintase e a aspartoquinase, respectivamente, que são resistentes à inibição pela retroalimentação pela L-lisina (EP 0733710, US5.932.453).

Os exemplos do DNA que codifica a diidrodipicolinato sintase mutante que é resistente à inibição da retroalimentação pela L-lisina incluem um DNA que codifica DDPS tendo uma seqüência de aminoácido em que o 118° resíduo de histidina é substituído com tirosina. (U.S. 5.661.012 e 6.040.160). Além disso, os exemplos do DNA que codifica um mutant AK que é resistente à inibição da retroalimentação pela L-lisina incluem ura DNA que codifica AK tendo a seqüência de aminoácido em que o resíduo de treonina 352 é substituído com isoleucina. (U.S. 5.661.012 e 6.040.160). Estes DNAs mutantes podem ser obtidos pela mutagênese direcionada ao sítio usando PCR ou semelhante. O que segue é um exemplo de uma técnica para comunicar uma capacidade produtora de L-lisina pela introdução de um gene que codifica uma enzima da biossíntese de L-lisina em um hospedeiro. Isto é, o DNA recombinante é preparado pela ligação de um fragmento de gene que codifica o gene da biossíntese de L-lisina com um vetor que funciona no microorganismo hospedeiro escolhido, preferivelmente um vetor de cópia múltipla e transformando o hospedeiro com o vetor recombinante. Devido à transformação, o número de cópia do gene que codifica a enzima da biossíntese da L-lisina na célula hospedeira aumenta, aumentando a expressão e conseqüentemente aumentando a atividade enzimática.

Os genes que codificam as enzimas da biossíntese de L-lisina não são particularmente especificados, contanto que eles possam ser expressados no microorganismo hospedeiro. Os exemplos incluem genes derivados de Escherichia coli e genes derivados do grupo corineforme de bactérias. Porque as seqüências de genoma inteiro de Escherichia coli e Corynebacterium glutamicum foram relatadas, é possível sintetizar iniciadores com base nas seqüências de nucleotídeo destes genes e obter estes genes pela PCR em que o DNA genômico de um microorganismo, tal como Escherichia coli K12, etc., é usado como o padrão.

De modo a clonar os genes, plasmídeos que replicam autonomamente na família Enterobacteriaceae podem ser usados. Os exemplos incluem pBR322, pTWV228 (Takara Bio Inc.), pMW119 (Nippon Gene Co., Ltd.), pUC19, pSTV29 (Takara Bio Inc.), RSF1010 (Gene, 75: 271-288 (1989)), etc. Além destes, um vetor de fago também pode ser usado.

Para ligar o gene alvo ao vetor acima mencionado, o vetor é digerido com uma enzima de restrição emparelhada no final do fragmento de DNA contendo o gene alvo. A ligação é usualmente conduzida com uma ligase tal como a T4 DNA ligase. Os genes alvos podem ser localizados nos vetores separados, respectivamente ou localizados no mesmo vetor. Os métodos usuais conhecidos por aqueles habilitados na técnica podem ser utilizados para digerir e ligar um DNA, assim como para preparar DNA genômico, realizar a PCR, preparar DNA plasmídico, transformação, planejar iniciadores de oligonucleotídeo, etc. Estes métodos são descritos em Sambrook, J. e Russell, D. W. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Terceira Edição. Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), etc. Qualquer método que alcance eficiência de transformação adequada pode ser utilizado para introduzir o DNA recombinante que foi preparado como descrito acima no microorganismo hospedeiro. Um exemplo inclui a eletroporação (Can. J. Microbiol. 43: 197-201 (1997)). Um exemplo de um plasmídeo preparado usando este método inclui o plasmídeo pCABD2 que produz Lys que contém os genes dapA, dapB e LysC (WO 01/53459). O realce da expressão de genes que codificam enzimas da biossíntese de L-lisina também pode ser obtido pela introdução de cópias múltiplas do gene alvo no DNA genômico de um microorganismo. Cópias múltiplas do gene alvo podem ser introduzidas no DNA genômico do microorganismo usando-se uma seqüência que esteja presente em cópias múltiplas no DNA genômico como um alvo na recombinação homóloga. Tal introdução específica de sítio de mutações com base na substituição de gene usando recombinação homóloga foi descrita. Um DNA linear ou um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura podem ser usados em tais métodos (Patente U.S. 6.303.383 e JP05-007491A). O DNA repetitivo e as repetições invertidas presentes nas extremidades de elementos reversíveis podem ser utilizados como seqüências que estão presentes em cópias múltiplas no DNA genômico. Um gene da biossíntese de L-lisina pode ser ligado em tandem com um gene que seja nativo para o genoma ou o mesmo pode ser introduzido em uma região não essencial no genoma ou uma região de gene em que a produção de L-lisina será melhorada pela deleção. Ou, como divulgado na Patente U.S. 5.595.889, o gene alvo também pode estar localizado em um transposon, que é depois transferido para introduzir cópias múltiplas no DNA genômico. Com cada um dos métodos, o número de cópias do gene alvo no transformante aumenta, de modo que a atividade enzimática da biossíntese de L-lisina aumenta.

Além da amplificação genética descrita acima, um aumento na atividade enzimática de biossíntese da L-lisina pode ser obtido substituindo-se uma seqüência reguladora de expressão do gene alvo tal como um promotor, etc., com um mais forte (ver a JP1-215280A). Por exemplo, promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor araBA, promotor PR de fago lambda, promotor PL, promotor tet, promotor T7, promotor φ10, etc., são conhecidos como promotores fortes. A substituição com estes promotores realça a expressão do gene alvo, aumentando assim a atividade enzimática. Os exemplos de promotores fortes e métodos para avaliar a força de promotores são descritos em Goldstein et al. (Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128, (1995) Prokaryotic promoters in biotechnology.), etc.

Um aumento na atividade da enzima alvo também pode ser obtido pela modificação de um elemento que esteja envolvido na regulagem da expressão do gene que codifica a enzima alvo, por exemplo, um operador ou repressor (Hamilton et al, J. Bacteriol. 171: 4617-4622 (1989)). Como divulgado na WO 00/18935, é possível substituir diversas bases na região promotora de um gene alvo para modificá-lo e reforçá-lo. Além disso, a substituição de diversos nucleotídeos no espaçador entre o sítio de ligação de ribossoma (RBS) e o códon de partida, particularmente na seqüência imediatamente a montante do códon de partida, é conhecido ter um efeito forte sobre a eficiência de tradução de mRNA. Portanto, estas regiões podem ser modificadas para aumentar a eficiência de transcrição. As regiões reguladoras de expressão do gene alvo tais como um promotor, etc., podem ser determinadas pelos vetores sonda de promotor e software de análise de gene tal como GENETYX (GENETYX CORPORATION), etc. A expressão do gene alvo pode ser aumentada pela substituição ou modificação destes promotores. A substituição das seqüêncías reguladoras de expressão podem ser conduzidas, por exemplo, da mesma maneira como na substituição de gene descrita acima utilizando plasmídeos sensíveis à temperatura. O método de integração Red-driven (W02005/010175) também pode ser usado.

Além disso, nas bactérias produtoras de L-aminoácido, a atividade de uma enzima que catalisa uma reação para produzir um composto outro que não o L-aminoácido alvo, que ramifica do caminho da biossíntese do L-aminoácido ou da atividade de uma enzima tem um efeito negativo sobre a síntese ou acúmulo do L-aminoácido, pode ser reduzida ou deletada. Na produção de L-lísina, tais enzimas incluem a homosserina desidrogenase (thrA), lisina descarboxilase (cadA, ldcC) e enzima málica (sfcA, b2463). As cepas com a dita atividade enzimática reduzida ou deficiente são divulgadas na WO 95/23864, WO96/17930, W02005/010175, etc.

Para reduzir ou deletar as atividades destas enzimas, um mutante que reduza ou delete a dita atividade da enzima em uma célula pode ser introduzido no gene da enzima mencionada acima no genoma, usando um método de mutagênese ou técnicas de combinação genética comuns. Este método para a introdução de um mutante pode ser obtido, por exemplo, pela deleção de um gene que codifica uma enzima no genoma pela recombinação genética ou pela modificação de uma seqüência reguladora de expressão tal como um promotor ou uma seqüência de Shine-Dalgamo (SD), etc. Isto também pode ser obtido pela introdução de uma substituição de aminoácido (mutação de sentido errado) ou códon de parada (mutação sem sentido) na região que codifica a enzima no genoma, pela introdução de uma mutação de mudança de matriz para adicionar ou deletar 1 a 2 bases ou pela deleção de uma parte do gene ou da região inteira (J. Biol. Chem. 272: 8611-8617 (1997)). Também, a atividade da enzima pode ser reduzida ou deletada pela construção de um gene que codifica a enzima mutante em que uma parte ou a região codificadora inteira foi deletada e depois substituindo o gene normal no genoma com o dito gene pela recombinação homóloga, etc. ou introduzindo um transposon ou elemento IS no dito gene. Os seguintes métodos podem ser usados para introduzir uma mutação que reduza ou delete a atividade da enzima mencionada acima pela recombinação genética. Um DNA isolado contendo o gene alvo é mutado de modo que o gene mutante resultante não produza uma enzima que funciona normalmente. Depois um microorganismo que pertence à família Enterobacteriaceae é transformado com o DNA contendo o gene mutado para causar a recombinação entre o gene mutado e o gene alvo no genoma. Assim, o gene alvo no genoma pode ser substituído com o gene mutado. Para a substituição de gene usando este tipo de recombinação homóloga, existem métodos que utilizam DNA linear, tal como o método chamado de “integração Red-driven” (Datsenko, K. A e Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 97: 6640-6645 (2000)), um método de combinar o método de integração Red-driven e o sistema excisivo de fago λ (Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)) (ver a W02005/010175), etc.; e existem métodos que utilizam um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (Patente U.S. 6.303.383; Patente U.S. 5.616.480). Tal introdução específica de sítio de mutações pela substituição de gene usando recombinação homóloga como descrito acima também pode ser realizada usando um plasmídeo que não tenha capacidade de replicação no hospedeiro escolhido. O método mencionado acima para aumentar a atividade da enzima que envolve a biossíntese de L-lisina e o método para diminuir a atividade da enzima pode ser igualmente usada no cruzamento de outra bactéria que produza L-aminoácido. O que segue é uma descrição de métodos para cruzar outras bactérias de L-aminoácido.

As bactérias que produzem L-triptofano preferivelmente usadas na presente invenção incluem bactérias em que a atividade de uma ou mais das seguintes enzimas antranilato sintase, fosfoglicerato desidrogenase ou triptofano sintase foi realçada. Visto que a antranilato sintase e fosfoglicerato desidrogenase ambas são submetidas à inibição da retroalimentação pelo L-triptofano e L-serina, as atividades destas enzimas podem ser aumentadas pela retenção da enzima mutante dessensibilizante. Por exemplo, é possível para se obter uma bactéria que tenha uma enzima dessensibilizante causando-se uma mutação do gene da antranilato sintase (trpE) e/ou do gene da fosfoglicerato desidrogenase (serA) para impedir a inibição de retroalimentação, depois introduzir o gene mutante em um microorganismo que pertença à família Enterobacteriaceae. (Patente U.S. 5.618.716, Patente U.S. 6.180.373) Um exemplo específico deste tipo de bactérias inclui um transformante obtido pela introdução de plasmídeo pGH5 tendo um serA mutante que codifica a fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada na SV164 da Escherichia coli que retém a antranilato sintase dessensibilizada (W094/08301). As cepas SV164 são obtidas pela introdução de um gene que codifica a antranilato sintase dessensibilizada em uma cepa deficiente em trpE da Escherichia coli KB862 (DSM7196) (Ver a W094/08031).

As bactérias transformadas com DNA recombinante contendo um operon de triptofano também são preferíveis. Um exemplo específico inclui Escherichia coli transformada com um operon de triptofano contendo um gene que codifica a antranilato sintase dessensibilizada (JP57-71397A, JP62-244382A, Patente U.S. 4.371.614). Além disso, é possível realçar ou comunicar uma capacidade para produzir L-triptofano realçando-se a expressão de um gene que codifica a triptofano sintase (trpBA). A triptofano sintase consiste de subunidades α e β que são codificadas por trpA e trpB, respectivamente. A seqüência de nucleotídeo de trpA é mostrada na SEQ ID NO: 13 e a seqüência de nucleotídeo de trpB é mostrada na SEQ ID NO: 15.

Uma cepa com repressor do operon de triptofano deficiente em trpR, e uma cepa com um trpR mutante também são preferíveis. (Patente U.S. 4.371.614, W02005/056776).

Uma outra bactéria que produz L-triptofano preferível é uma em que o operon (operon ace) da malato sintase, isocitrato liase, isocitrato desidrogenase/fosfatase seja estruturalmente expressada ou a expressão do dito operon foi realçada. Especificamente, é preferível que o promotor do operon ace não seja suprimido pelo repressor iclK ou que a supressão pela icíR. foi removida. Uma tal bactéria pode ser obtida pelo rompimento do gene iclR. ou modificação da seqüência reguladora de expressão do operon ace. O gene iclR de Escherichia coli é mostrado na SEQ ID NO: 5. Uma bactéria com expressão realçada do operon ace pode ser obtido pela ligação de um DNA contendo o operon ace a um promotor forte e introduzindo o DNA recombinante em células usando um plasmídeo ou pela recombinação homóloga ou amplificando o número de cópia do operon ace usando um transposon. Os genes contidos no operon ace incluem aceB, aceA e aceK. As seqüências de nucleotídeo de aceB, aceA e aceK são mostradas nas SEQ ID NOS: 9,7 e 11, respectivamente.

Os exemplos de bactérias que produzem L-triptofano incluem Escherichia coli AGX17 (pGX44) [NRRL B-12263], que é auxótrofa em L-fenilalanina e L-tirosina e AGX6 (pGX50) aroP [NRRL B-12264], que contêm o plasmídeo pGX50 contendo o operon de triptofano (ver a Patente U.S. 4.371.614, para ambos). Estas cepas são disponíveis da Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization Research (endereço: Peoria, Illinois 61604, USA). L-triptofano, L-fenilalanina e L-tirosina são todos aminoácidos aromáticos e compartilham o caminho da biossíntese comum. Os exemplos dos genes que codificam as enzimas de biossíntese para estes aminoácidos aromáticos incluem a desoxiarabino-heptulosonato fosfato sintase (aroG), 3-desidroquinato sintase (aroB), shiquimato desidratase, shiquimato quinase (aroL), 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (aroA) e corismato sintase (aroC) (EP763127). Portanto, copiando-se de forma múltipla o gene que codifica estas enzimas em um plasmídeo ou genoma, a capacidade de produzir aminoácido aromático pode ser melhorada. É conhecido que estes genes podem ser controlados por um repressor de tirosina (tyrR), de modo que a atividade da enzima de biossíntese de um aminoácido aromático também possa ser aumentada pela deleção do gene tyrR (Ver EP763127).

Os exemplos de bactérias que produzem L-fenilalanina incluem Escherichia coli AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197) que é deficiente em tyrA, tyrR e cepas com genes amplificados que codificam uma proteína que excreta fenilalanina tal como yddG e yedA (W003/044192; US2003/0148473A1).

As bactérias que produzem L-treonina usadas na presente patente são preferivelmente microorganismos que pertencem à família Enterobacteriaceae em que uma enzima da biossíntese de L-treonina foi realçada. Os exemplos de tais genes incluem genes que codificam a aspartoquinase III (lysC), aspartato-semialdeído desidrogenase (asd), aspartoquinase I (thrA incluído no operon thr), homosserina quinase (thrB) e treonina sintase (thrC). Mais do que dois destes genes podem ser introduzidos. O gene da biossíntese de L-treonina pode ser introduzido em uma bactéria do gênero Escherichia em que a degradação da treonina foi suprimida. Os exemplos de tais bactérias incluem a cepa TDH6 em que a atividade da desidrogenase da treonina foi deletada (Pat US N2 6.960.455) e assim por diante.

As atividades de algumas das enzimas do caminho da biossíntese de L-treonina são suprimidas pela L-treonina. Portanto, de modo a construir uma bactéria que produza L-treonina, é preferível modificar a enzima da biossíntese de L-treonina de modo que a enzima não seja submetida à inibição da retroalimentação pela L-treonina. Os genes thrA, thrB e thrC acima mencionados constituem um operon da treonina que contém uma estrutura atenuadora. A sua expressão é suprimida por esta atenuação. Além disso, a expressão do operon da treonina é inibido pela isoleucina e treonina presentes durante a cultura. A modificação do operon da treonina pode ser obtida pela remoção da seqüência líder na região de atenuação ou do atenuador. (Ver Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I. e Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194: 59-69 (1987); WO02/26993; W02005/049808).

Um promotor nativo está presente a montante do operon da treonina. O promotor pode ser substituído com um promotor não nativo (ver a WO 98/04715). Altemativamente, um operon da treonina pode ser construído de modo que a expressão do gene envolvido na biossíntese da treonina seja controlado por um repressor e um promotor de fago lambda (Ver a EP0593792). Também, para impedir a inibição de retroalimentação pela L-treonína, as bactérias do gênero Escherichia podem ser modificadas selecionando-se uma cepa resistente ao ácido a-amino-P-hidroxivalérico (AHV). É preferido que o número de cópia do operon da treonina que é modificado para impedir a inibição de retroalimentação pela L-treonina seja aumentado no hospedeiro ou seja ligado a um promotor forte de modo que a expressão do operon seja realçada. Além de amplificar o número de cópia usando um plasmídeo, o número de cópia pode ser aumentado pela introdução do operon da treonina no genoma usando um transposon, fago Mu, etc.

Para o gene da aspartoquinase III (lysC), é desejável usar um gene que seja modificado para impedir a inibição de retroalimentação pela L-lisina. Um gene lysC que foi modificado para impedir a inibição de retroalimentação pode ser obtido usando o método descrito na Patente U.S. 5.932.453. A parte da enzima da biossíntese de L-treonina, é desejável realçar um gene relacionado com o sistema glicolítico, ciclo TCA e cadeia respiratória, um gene que controle a expressão deste gene e um gene que induza a captação de açúcar. Os exemplos destes genes que são eficazes na produção de L-treonina incluem genes que codificam a transidrogenase (pntAB) (EP733712), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) (WO95/06114), gene da fosfoenolpiruvato sintase (pps) (EP877090) e um gene que codifique a piruvato carboxilase de uma bactéria coriniforme ou uma bactéria do gênero Bacillus (W099/18228, EP1092776).

Também é preferível realçar a expressão de um gene que comunique resistência à L-treonina e/ou um gene que comunique resistência à L-homosserina ou para comunicar a resistência à L-treonina e/ou resistência à L-homosserina ao hospedeiro. Os exemplos de tais genes incluem o gene rhtA (Res. Microbiol. 154:123-135 (2003)), o gene rhtB (EP0994190), o gene rhtC (EP1013765) e os genes yfiK e yeaS (EP1016710). Para os métodos de comunicar resistência à L-treonina ao hospedeiro, dirigir-se à EP0994190, W090/04636.

Um outro exemplo de uma bactéria que produz L-treonina é a cepa VKPM B-3996 da Escherichia coli (ver a Patente U.S. 5.175.107). Esta cepa VKPM B-3996 foi depositada em 7 de abril de 1987, sob o Acesso N2 VKPM B-3996, no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (endereço: Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd. 1). Além disso, a cepa VKPM B-3996 contém o plasmídeo pVIC40 (W090/04636), que foi obtido pela inserção de um gene da biossíntese da treonina (operon da treonina: thrABC) em um vetor plasmídico pAY32 de faixa de hospedeiro ampla que inclui um marcador resistente à estreptomicina (ver Chistorerdov, A. Y. e Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16,161-167 (1986)). O gene thrA no pVIC40 e a inibição de retroalimentação pela L-treonina da aspartoquinase L-homosserma desidrogenase I foi dessensibilizada.

Um outro exemplo preferível de bactérias que produzem L-treonina é a cepa VKPM B-5318 da Escherichia coli (ver a EP0593792). A cepa VKPM B-5318 foi depositada sob o Acesso Ns VKPM B-5318 na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (endereço: Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd. 1) em 3 de maio de 1990. Esta cepa VKPM B-5318 é não auxotrófíca para isoleucina e contém um DNA plasmídico recombinante construído de modo que o gene envolvido na biossíntese da treonina, isto é, o operon da treonina em que o atenuador e as regiões reguladoras transcricionais inerentes, foi deletado, está localizado a jusante do repressor Cl sensível à temperatura, promotor PR e o terminal N da proteína Cro do fago lambda e a expressão do gene envolvido na biossíntese da treonina é controlada pelo repressor e promotor.

Os exemplos de bactérias que produzem L-ácido glutâmico usado na presente invenção incluem um microorganismo que pertence à família Enterobacteriaceae que foi modificado para aumentar a expressão do gene que codifica uma enzima que está envolvida na biossíntese de L-ácído glutâmico. As enzimas envolvidas na biossíntese do L-ácido glutâmico incluem a glutamato desidrogenase (a seguir, também aludido como “GDH”), glutamina sintetase, glutamato sintase, isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase (a seguir, também aludido como “CS”), fosfoenolpiruvato carboxilase (a seguir, também aludido como “PEPC”), piruvato carboxilase, piruvato desidrogenase, piruvato quinase, fosfoenolpiruvato sintase, enolase, fosfoglicerolmutase, fosfoglicerato quinase, gliceraldeído-3-fosfate desidrogenase, triose fosfate isomerase, frutose-bisfosfato aldolase, fosfofrutoquinase, glicosefosfato isomerase, etc.

Destas enzimas, uma ou mais de CS, PEPC e GDH é preferível e todas as três são mais preferíveis.

Os exemplos de microorganismos que pertencem à família Enterobacteriaceae que foi modificada para realçar a expressão do gene da citrato sintase, gene da fosfoenolpiruvato carboxílase, e/ou gene da glutamato desidrogenase usando os métodos descritos acima são divulgados nas Patentes U.S. N- 6.197.559 & 6.331.419, EP0999282.

Além disso, os microorganismos que pertencem à família Enterobacteriaceae que foram modificados para aumentar a atividade de cada um ou de ambos de 6-fosfogliconato desidratase ou 2-ceto-3-desóxi-6-fosfogliconato aldolase também podem ser usados (EP1352966).

Como os microorganismos da família Enterobacteriaceae tendo a capacidade para produzir um L-ácido glutâmico, as bactérias em que a atividade de uma enzima que catalisa a reação para produzir um composto outro que não L-ácido glutâmico, que ramifica do caminho da biossíntese de L-ácido glutâmico, foi deletada ou reduzida também podem ser usadas. Os exemplos de tais enzimas incluem 2-oxoglutarato desidrogenase, isocitrato liase, fosfato acetiltransferase, acetato quinase, acetoidróxi ácido sintase, acetolactato sintase, formiato acetiltransferase, lactato desidrogenase, glutamato descarboxilase, 1-pírrolina desidrogenase, etc. Destas, é especialmente preferível reduzir ou deletar a atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase.

Os métodos para deletar ou reduzir a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenase em um microorganismo que pertença à família da Enterobacteriaceae são descritos na Patente U.S. 5.573.945, Patente U.S. 6.197.559 e Patente U.S. 6.331.419. Especificamente, os exemplos de microorganismos que pertencem à família Enterobacteriaceae em que a atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase foi deletada ou reduzida incluem os seguintes: Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207) Klebsiella plcmticola cepa AJ13410 (FERM BP-6617) Escherichia coli AJ12949 (FERM BP-4881) Os exemplos de uma bactéria que produz L-histidina preferida para o uso na presente invenção incluem Escherichia coli FERM P-5038 e FERM P-5048. Estas cepas contém um vetor que contém informação genética envolvida na biossíntese de L-histidina (JP56-005099A). Os outros exemplos incluem uma cepa bacteriana que foi transformada com o gene da exportação de aminoácido Rht (EP1016710) e Escherichia coli 80 que foi feita resistente ao sulfaguanidina, D, L-l,2,4-triazol-3-alanÍna e estreptomicina (VKPM B-7270, Publicação de Patente Russa N2 2119536), etc.

Os microorganismos em que a expressão do gene que codifica uma enzima do caminho da biossíntese de L-histidina podem ser usados. Os exemplos de tais genes incluem os genes que codificam a ATP fosforribosiltransferase (hisG), o gene da fosfombosil AMP cicloidrolase (hisl), fosforribosil-ATP pirofosfoidrolase (hisIE), fosforribosilformimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), gene da amidotransferase (hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase (hisB) e gene da histidinol desidrogenase (hisD), etc.

As bactérias que produzem L-cisteína preferidas da presente invenção incluem bactérias em que a atividade da cistationina β-liase foi reduzida (JP2003-169668A) e as bactérias do gênero Escherichia que retêm a serina acetiltransferase, mas com inibição de retroalimentação reduzida ou eliminada pela L-cisteína (JP11-155571 A).

As bactérias que produzem L-prolina preferidas da presente invenção incluem Escherichia coli 702 (VKPMB-8011) que é resistente à 3,4-desidroxiprolina e azetidino-2-carboxilato e a cepa 702 ilvA (cepa VKPMB-8012) que é deficiente em ilvA e é derivado da cepa 702 (JP2002-300874A).

Os exemplos de bactérias que produzem L-arginina incluem cepas mutantes de Escherichia coli que são resistentes a a- metilmetionina, p-fluorofenilalanina, D-arginina, arginina ácido hidroxâmico, S-(2-aminoetil)-cisteína, a-metileserina, β-2-tienÍlalanina ou sulfaguanidina (ver a JP56-106598A), etc. A cepa 237 da Escherichia coli é uma bactéria que produz L-arginina que tem um mutante que é resistente à inibição da retroalimentação pela L-arginina e que retém a N-acetil glutamato sintase altamente ativa e também é uma cepa produtora de L-arginina preferível (Pedido de Patente Russo N® 2000117677). Esta cepa, de número VKPM B-7925, foi depositada com a Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika em 10 de abril de 2000 e convertida a um depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001. A cepa 382 da Escherichia coli, que é um derivado da cepa 237 e é uma bactéria que produz L-arginina com capacidade de assimilação de ácido acético melhorada, também pode ser usada (JP2002-017342A). A cepa 382 Escherichia coli, de número VKPM B-7926, foi depositada com a Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) em 10 de abril de 2000.

Também, como os microorganismos tendo capacidade produtora de L-arginina, microorganismos com uma expressão melhorada de um gene que codifica uma enzima envolvida na bíossíntese de L-arginina pode ser usada. Os exemplos de enzimas da biossíntese de L-arginina são um ou mais de N-acetil glutamato sintase (argA), N-acetil-glutamil-fosfato redutase (argC), omitina acetiltransferase (argJ), N-acetil glutamato quinase (argB), acetil omitina transaminase (argD), acetil omitina desacetilase (argE), omitina carbamoil transferase (argF), argininossuccinato sintase (argG), argininossuccinato liase (argH) e carbamoil fosfato sintase (carAB). Depois de cada nome de enzima, o nome do gene que a codifica é dado em parêntese. É desejável utilizar uma mutação do gene da N-acetil glutamato sintase (argA) em que a inibição da retroalimentação de L-arginina foi removida pela substituição da seqüência de aminoácido que corresponde às posições de 15 a 19 no tipo selvagem (EP1170361).

As bactérias que produzem L-leucina que podem ser usadas incluem uma bactéria do gênero Escherichia coli em que a transaminase de aminoácido de cadeia ramificada codificada pelo gene ilvE foi inativada e a atividade da transaminase de aminoácido aromático codificada pelo gene tyrB foi realçada (EP1375655A), a cepa H-9068 de Escherichia coli (ATCC21530) que é resistente à 4-azaleucina ou 5,5,5-trifluoroleucina, a cepa H-9070 da Escherichia coli (FERM BP-4704), a cepa H-9072 da Escherichia coli (FERM BP-4706) (Patente U.S. 5.744.331), uma cepa da Escherichia coli em que a inibição da retroalimentação de isopropilmalato sintase pela L-leucina foi dessensíbilizada (EP1067191), a cepa AJ11478 da Escherichia coli que é resistente à β-2 tienilalanina e β-hidroxileucina (Patente U.S. 5.763.231) e assim por diante.

As bactérias que produzem L-isoleucina incluem uma cepa mutante de Escherichia coli resistente a 6-dimetil aminopurina (JP5-304969A), a cepa mutante de Escherichia coli resistente ao hidroxamato de L-isoleucina (JP5-130882A), a cepa mutante de Escherichia coli resistente à tiaisoleucina (JP5-130882A), a cepa mutante Escherichia coli resistente a DL-etionina (JP5-130882A) e a cepa mutante resistente a hidroxamato de arginina (JP5-130882A). Os exemplos das bactérias Escherichia recombinantes são aqueles em que o genes que codificam as enzimas da biossíntese de L-isoleucina, treonina desaminase ou acetoidróxi ácido sintase foram fortalecidos pela transformação com um plasmídeo (JP2-458A, JP2-42988A, JP8-47397), etc.

Os exemplos de bactérias que produzem L-valina incluem a cepa VL1970 de Escherichia coli (Patente U.S. 5.658.766), etc. Os exemplos de bactérias que produzem L-valina incluem ainda um mutante que requer ácido lipóico para o seu crescimento e/ou carece de LT-ATPase (WO96/06926) e uma bactéria do gênero Escherichia transformada com um fragmento de DNA contendo o operon ilvGMEDA e que expressa pelo menos os genes ilvG, ilvM, ilvE e ilvD. Visto que a expressão do operon ilvGMEDA é regulado (atenuado) pela L-valina e/ou L-isoleucina e/ou L-leucina, é desejável que a região requerida para a atenuação seja removida ou mutada de modo a remover a supressão da expressão pela L-valina (Patente U.S. 5.998.178). Também é desejável que o operon ilvGMEDA não expresse uma atividade de treonina desaminase codificada pelo gene ilvA. Escherichia coli VL1970, tendo a mutação ileS17 em que a atenuação foi removida como descrito acima, foi depositada como Acesso N2 VKPM B-4411 na GNIIgenetika (Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) Depositary, GNIIgenetika) (endereço: 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscou, Rússia). À parte de um gene que codifica uma enzima de biossíntese inerente, um gene que está envolvido na captação de açúcar, metabolismo de açúcar (sistema glicolítico) e metabolismo de energia pode ser realçado na bactéria que produz L-aminoácido usado na presente invenção.

Os exemplos dos genes envolvidos no metabolismo de açúcar são genes que codificam as enzimas glicolíticas ou proteínas que captam açúcar, tais como genes que codificam a glicose-6-fosfato isomerase (pgi; W001/02542), fosfoenolpiruvato sintase (pps; EP877090), fosfoglicomutase (pgm; W003/04598), frutose-bisfosfato aldolase (fba; W003/04664), piruvato quinase (pykF; W003/008609), transaldolase (talB; W003/008611), fumarase (fum; WOO1/02545), fosfoenolpiruvato sintase (pps; EP877090), os sistemas de captação da sacarose não PTS (esc; EP149911) e genes que assimilam sacarose (operon scrAB; W090/04636).

Os exemplos dos genes envolvidos no metabolismo de energia incluem o gene da transidrogenase (pntAB; Patente U.S. 5.830.716) e a gene oxidase de citocromo tipo bo (cyoABCD; EP1070376) 0 microorganismo da presente invenção pode ser obtido pela modificação de um microorganismo que tem a capacidade para produzir um L-aminoácido, como descrito acima, de modo a aumentar a expressão de um ou mais genes selecionados do gene evgA, gene gadE ou gene ydeO, que são genes que codificam o fator de transcrição envolvido no sistema de dois componentes de EvgAS. A capacidade para produzir a substância alvo pode ser comunicada depois da modificação para aumentar a quantidade de expressão do gene evgA, gene gadE ou gene ydeO. Um aumento na expressão do gene evgA, gene gadE ou gene ydeO pode ser um aumento na expressão do gene evgA, gene gadE ou gene ydeO endógeno através da modificação da região reguladora de expressão, incluindo a modificação de promotor, como descrito mais tarde; ou este pode ser um aumento do número de cópia do gene evgA, gene gadE ou gene ydeO através da introdução de um plasmídeo contendo o gene evgA, gene gadE ou gene ydeO ou a amplificação destes genes no cromossoma da bactéria e assim por diante. Além disso, uma combinação destas técnicas pode ser utilizada.

O “sistema de dois componentes de EvgAS” na presente invenção significa um caminho que ativa fatores de transcrição por intermédio da regulagem de EvgA-EvgA histidina-aspartate fosforelay. Mais especificamente, a proteína EvgS (SEQ ID NO: 26), que é uma quinase sensora, autofosforila o resíduo de histidina da dita proteína e depois transfere o grupo fosfato para resíduos de aspartato específicos para a proteína EvgA (SEQ ID NO: 24), que é um regulador de resposta e fator de transcrição. O fator de transcrição regulador de resposta EvgA é ativado por esta fosforilação para regular a transcrição de muitos genes assim como para ativar a transcrição do gene ydeO (SEQ ID NO: 29) que codifica a proteína do fator de transcrição YdeO (SEQ Π) NO: 30) e/ou do gene gadE (SEQ ID NO: 27) que codifica a proteína do fator de transcrição GadE (SEQ ID NO: 28) (J. Bacteriol. 184: 6225-6234, 2002; Mol. Microbiol. 48: 699-712, 2003). A proteína YdeO também ativa a transcrição do gene gadE. Como um resultado da transcrição do gene gadE que é ativada pela proteína EvgA e proteína YdeO ativadas, a expressão da proteína GadE aumenta e como um fator de transcrição positivo, a mesma amplifica a transcrição de outros genes (Microbiology. 150: 61-72, 2004; J Bacteriol. 186: 7378-89, 2004). Portanto, “o fator de transcrição envolvido no regulador de dois componentes EvgAS” na presente invenção refere-se à proteína EvgA, proteína GadE ou proteína YdeO.

Aqui, na presente invenção, “quinase sensora” é uma proteína que desempenha o papel de sensibilizar um fator ambiental como um ligando, fosforrilando os seus próprios resíduos de hístidína usando ATP e depois liberando este grupo fosfato a um regulador de resposta. Na presente invenção, “regulador de resposta” é uma proteína que desempenha o papel de transportar a informação dentro das células depois de serem ativadas por intermédio da recepção da fosforilação no aspartato específico da quinase sensora; e em muitos casos, é um fator de transcrição. A melhora na expressão do gene que codifica a proteína EvgA, proteína GadE ou proteína YdeO (a seguir, gene evgA, gadE ou ydeO) quando da sua comparação com a cepa precursora, por exemplo, uma cepa do tipo selvagem ou cepa não modificada, pode ser confirmada comparando-se a quantidade de mRNA com aquela na cepa do tipo selvagem ou não modificada. A hibridização de Northern e Transcriptase Reversa-PCR (RT-PCR) podem ser usados para confirmar a quantidade de expressão. (Sambrook, J. e Russell, D. W. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Terceira Edição. Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)). O grau de aumento na atividade enzimática não é limitado contanto que a atividade seja aumentada quando comparada com aquela na cepa do tipo selvagem ou não modificada, mas é desejável, por exemplo, que a mesma seja 1,5 ou mais vezes, preferivelmente 2 ou mais vezes ou mais preferivelmente 3 ou mais vezes aquela da cepa do tipo selvagem ou não modificada. Um aumento na atividade enzimática pode ser confirmada se a quantidade da proteína alvo for aumentada em relação àquela da cepa não modificada ou do tipo selvagem. Isto pode ser detectado, por exemplo, pela Western blot usando um anticorpo. (Sambrook, J. e Russell, D. W. Molecular Cloning A Laboratoiy Manual/Terceira Edição. Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)). O “fator de transcrição” na presente invenção significa um fator de transcrição de um gene em que a expressão é controlada pelo regulador de dois componentes EvgSA e corresponde à proteína EvgA, proteína GadE e proteína YdeO. A proteína EvgA, proteína GadE e proteína YdeO positivamente regulam a transcrição do gene que codifica várias enzimas metabólicas que estão sob o controle do regulador de dois componentes EvgSA. Por exemplo, a transcrição do gene gnd que codifica a 6-fosfogliconato desidrogenase (GND) ou o gene purA que codifica a adenilossuccinato sintase é ativada pelo fator de transcrição do regulador de dois componentes EvgSA. Isto é, melhorando-se a quantidade produzida da proteína EvgA, proteína GadE ou proteína YdeO comparado com a cepa do tipo selvagem ou cepa não modificada, a quantidade de transcrição do gene cuja expressão é controlada pelo aumento do regulador de dois componentes EvgAS. A atividade do fator de transcrição pode ser medida usando o ensaio de mudança da mobilidade eletroforética para medir a ligação com DNA ou uma medição in vitro da atividade de transcrição (Sambrook, J. e Russell, D. W. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Terceira Edição. Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)). O gene evgA da presente invenção é de uma bactéria do gênero Escherichia e seu homólogo. Por exemplo, o gene evgA de Escherichia coli é um gene (SEQID NO: 23) que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 24. (Acesso do Genbank N2 ΝΪΜ16870 [gi: 16130301]).

Os homólogos do gene evgA são derivados de outros microorganismos, que têm uma alta similaridade na estrutura para o gene evgA de uma bactéria do gênero Escherichia e que melhora a capacidade para produzir L-aminoácido e exibem atividade de fator de transcrição quando introduzidos no hospedeiro. Os exemplos de homólogos de evgA são os genes evgA dos gêneros Salmonella, Shigella e Yersinia, etc. registrados no GenBank. Além disso, com base na homologia com os genes dados nos exemplos acima, os genes evgA podem ser clonados a partir das bactérias corineformes, tais como Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium lactofermentum, etc.; as bactérias do gênero Pseudomonas, tais como Pseudomonas aeruginosa, etc.; bactérias do gênero Mycobacterium, tais como Mycobacterium tuberculosis, etc.; e bactérias do gênero Bacillus. Aquelas com nomes de gene diferentes são aceitáveis contanto que sejam altamente homólogas com a evgA das bactérias do gênero Escherichia. Por exemplo, homólogos de gene evgA incluem um gene que pode ser clonado usando os oligonucleotídeos sintéticos das SEQID NOS: 17 e 18.

As sequências de nucleotídeo homólogas do gene evgA podem ser obtidas pesquisando-se quanto a um gene com alta homologia a partir de uma base de dados conhecida, com base na informação de seqüência mencionada acima. A homologia das seqüências de aminoácido e das seqüência de nucleotídeo pode ser determinada usando, por exemplo, o algoritmo BLAST de Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 5873 (1993)) ou FASTA (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Com base neste algoritmo BLAST, programas chamados BLASTN ou BLASTX foram desenvolvidos (ver http: //www.ncbi. nih.gov/BLAST/). O gene gadE da presente invenção significa o gene gadE das bactérias do gênero Escherichia e seus homólogos. Um exemplo de gene gadE de Escherichia coli inclui o gene (SEQ ID NO: 27) que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 28. (Acesso do Genbank Nfi NP_417969 [gi: 16131384]).

Os homólogos do gene gadE são, como com os homólogos do gene evgA descritos acima, genes que são derivados de outros microorganismos, que têm alta similaridade na estrutura do gene gadE de um bactéria do gênero Escherichia e que melhora a capacidade para produzir L-aminoácido e exibe a atividade do fator de transcrição quando introduzido no hospedeiro. Os homólogos do gene gadE incluem um gene que pode ser clonado usando os oligonucleotídeos sintéticos das SEQ ID NOS: 19 e 20. O gene ydeO da presente invenção significa o gene ydeO de uma bactéria do gênero Escherichia e seus homólogos. Um exemplo de gene ydeO de Escherichia coli inclui um gene (SEQ DD NO: 27) que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 28. (Acesso do Genbank N2 NP_417969 [gi: 16131384]).

Os homólogos do gene ydeO são, como com os homólogos do gene ydeO descritos acima, genes que são derivados de outros microorganismos, que têm alta similaridade na estrutura para o gene ydeO de uma bactéria do gênero Escherichia e que melhora a capacidade para produzir L-aminoácido e exibe atividade de fator de transcrição quando introduzido no hospedeiro. Os homólogos do gene ydeO incluem um gene que pode ser clonado usando os oligonucleotídeos sintéticos das SEQ ID NOS: 21 e 22. O gene evgA, gene gadE ou gene ydeO usados na presente invenção não são limitados ao gene do tipo selvagem; e contanto que a fimção da proteína por estes codificada, isto é, a atividade de fator de transcrição, não seja comunicada, o mesmo também pode ser um mutante ou um produto geneticamente modificado que codifica uma proteína tendo uma seqüência incluindo substituições, deleções, inserções, adições de um ou diversos aminoácido ou semelhante, em uma ou múltiplas posições na seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 24, 28 ou 30. Aqui, o termo “diversas” difere dependendo da posição dos resíduos de aminoácido na estereoestrutura da proteína ou do tipo do aminoácido; especificamente, o mesmo significa de 1 a 20, preferivelmente de 1 a 10 e mais preferivelmente de 1 a 5. As substituições, deleções, inserções ou adições acima de um ou de diversos aminoácidos são mutações conservativas que preservam a atividade de fator de transcrição. Uma mutação conservativa é uma mutação em que a substituição ocorre mutuamente entre Phe, Trp, Tyr, se o sítio de substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, Ile, Vai, se o sítio de substituição for um aminoácido hidrofóbico; entre Gin, Asn, se for um aminoácido polar; entre Lys, Arg, His, se for um aminoácido básico; entre Asp, Glu, se for um aminoácido ácido; e entre Ser, Thr, se for um aminoácido tendo um grupo hidroxila. As mutações conservativas típicas são substituições conservativas. Os exemplos específicos de substituições que são consideradas como sendo conservativas incluem: substituição de Ala com Ser ou Thr; substituição de Arg com Gin, His ou Lys; substituição de Asn com Glu, Gin, Lys, His ou Asp; substituição de Asp com Asn, Glu ou Gin; substituição de Cys com Ser ou Ala; substituição de Gin com Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg; substituição de Glu com Gly, Asn, Gin, Lys ou Asp; substituição de Gly com Pro; substituição de His com Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr; substituição de Ile com Leu, Met, Vai ou Phe; substituição de Leu com Ile, Met, Vai ou Phe; substituição de Lys com Asn, Glu, Gin, His ou Arg; substituição de Met com Ile, Leu, Vai ou Phe; substituição de Phe com Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu; substituição de Ser com Thr ou Ala; substituição de Thr com Ser ou Ala; substituição de Trp com Phe ou Tyr; substituição de Tyr com His, Phe ou Trp; e substituição de Vai com Met, Ile ou Leu. Substituições, deleções, inserções, adições ou inversões e outros dos aminoácidos descritos acima incluem mutações de ocorrência natural (mutante ou variante) dependendo das diferenças nas espécies ou diferenças individuais de microorganismos que retém os genes evgA, gadE e ydeO. Tais genes podem ser obtidos pela modificação das seqüências de nucleotídeo mostradas nas SEQ ED NOS: 23, 25 e 29 usando, por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio, de modo que o resíduo de aminoácido específico de sítio na proteína codificada inclui substituições, deleções, inserções ou adições.

Além disso, como os genes evgA, gadE ou ydeO, uma seqüência que codifica uma proteína que é um fator de transcrição e que tem pelo menos 80 %, preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % ou ainda mais preferivelmente pelo menos 97 % de homologia com as seqüências de aminoácido inteiras das SEQ NOS. 26, 30 ou 32. Também, os genes evgA, gadE ou ydeO em que códons são substituídos com outros códons equivalentes que são mais facilmente utilizados pelo hospedeiro no qual estes genes são respectivamente introduzidos. Do mesmo modo, contanto que o produto de gene evgA, gadE ou ydeO mantenha a função do fator de transcrição, o seu terminal N ou terminal C pode ser estendido ou removido. Por exemplo, o comprimento da extensão ou remoção pode ser de 50 ou menos, preferivelmente 20 ou menos, mais preferivelmente 10 ou menos e ainda mais preferivelmente 5 ou menos resíduos de aminoácido. Mais especificamente, um gene que codifica uma proteína tendo uma extensão ou remoção de 50 a 5 aminoácidos das SEQ ID NOS: 24, 18 ou 30 do terminal N, uma extensão ou remoção de 50 a 5 aminoácidos do terminal C pode ser usado.

Também, as variantes dos genes podem ser obtidas pelos seguintes tratamentos de mutação convencionais. Um dos métodos de tratamento de mutação é a mutação in vitro dos genes evgA, gadE ou ydeO, usando hidroxilamina, etc. Um outro método utiliza ultravioleta ou um agente mutacional normalmente usado no tratamento de mutação, tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou Sulfonato de Etil Metila (EMS) para tratar um microorganismo tendo o dito gene, por exemplo, uma bactéria do gênero Escherichia. Se estes genes codificam ou não uma proteína que tem atividade de fator de transcrição pode ser confirmado, por exemplo, pela expressão destes genes nas células apropriadas e investigando se a atividade de fator de transcrição está presente.

Os genes evgA, gadE ou ydeO também podem ser um DNA que hibridiza sob condições estringentes com uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo das SEQ ID NOs: 23, 27 ou 29, respectivamente ou com uma sonda preparada a partir destas sequências e que codifica proteínas tendo atividade transcricional. Aqui, o termo “condições estringentes” referem-se às condições sob as quais os chamados híbridos específicos são formados e os híbridos não específicos não são formados. Embora seja difícil expressar claramente tais condições em números, estas podem ser exemplificadas como condições sob as quais fragmentos altamente homólogos de DNA, por exemplo, DNAs tendo homologia não menor do que 70 %, hibridiza entre si e DNAs tendo homologia mais baixas do que acima não hibridizam entre si. Altemativamente, condições estringentes são exemplificadas pelas condições em que a lavagem é realizada uma vez ou preferivelmente duas a três vezes com condições de lavagem típicas de hibridização de Southern usuais, isto é, em uma temperatura e concentração salina que corresponda a 60° C, 1 x SSC, 0,1 % de SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS e mais preferivelmente, 68° C, 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS.

Como uma sonda, uma seqüência de nucleotídeo das SEQ ID NOs: 23, 27 ou 29 ou uma parte destas seqüências também pode ser usada. Uma tal sonda pode ser preparada utilizando a PCR em que um fragmento de DNA contendo uma destas seqüências de nucleotídeo é usada como o padrão, com um oligonucleotídeo preparado com base na seqüência de nucleotídeo das SEQ ID NOs: 23, 27 ou 29 como o iniciador. Por exemplo, quando um fragmento de DNA de um comprimento de cerca de 300 pares de base é usado como a sonda, as condições de lavagem para a hibridização são de 50° C, 2 x SSC e 0,1% de SDS.

Uma modificação para realçar a expressão dos genes evgA, gadE ou ydeO pode ser feita pela utilização, por exemplo, de uma técnica de combinação genética para aumentar o número de cópias do gene na célula. Por exemplo, um fragmento de DNA contendo os genes evgA, gadE ou ydeO é ligado com um vetor, preferivelmente um vetor do tipo de cópia múltipla, que funcione no microorganismo hospedeiro para preparar o DNA recombinante, que é depois introduzido no microorganismo para transformá-lo.

Quando os genes evgA, gadE ou ydeO de Escherichia coli são usados, estes genes podem ser obtidos pela PCR (PCR: reação da polimerase de cadeia; ver White, T. J. et al, Trends Genet. 5,185 (1989)) em que o DNA genômico de Escherichia coli é usado como o padrão e usando um iniciador preparado com base na sequência de nucleotídeo das SEQID NOs: 22, 27 ou 29, por exemplo, os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOs: 17 e 18 para o gene evgA, os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOs: 19 e 20 para o gene gadE ou os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOs: 21 e 22 para o gene ydeO. Os genes evgA, gadE e ydeO de outros microorganismos que pertencem à família Enterobacteriaceae também podem ser obtidos a partir dos genes evgA, gadE e ydeO conhecidos naqueles microorganismos ou os genes evgA, gadE e ydeO nos microorganismos de outras espécies ou o DNA genômico ou biblioteca de DNA genômico de microorganismos, usando PCR em que o oligonucleotídeo preparado com base em outra informação de seqüência do fator de transcrição é usado como o iniciador ou o método de hibridização em que o oligonucleotídeo preparado com base na informação de seqüência mencionada acima é usada como a sonda. Incidentalmente, o DNA genômico pode ser preparado a partir dos microorganismos doadores de DNA. Por exemplo, o método de Saito e Miura, etc., (ver H. Saito e K. Miura, Bíochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Seibutsu Kogaku Jikkensho [Bioengineering Experiments], editado pela Society of Bíotechnology, Japão, ρρ. 97-98, Baifukan, 1992), pode ser usado.

Em seguida, o DNA recombinante é preparado pela ligação do gene evgA, gadE ou ydeO amplificado pela PCR com um vetor de DNA capaz de funcionar nas células do microorganismo hospedeiro. Um vetor que pode funcionar nas células de um microorganismo hospedeiro é um vetor que é autonomamente replicável nas células do microorganismo hospedeiro. Os exemplos de vetores autonomamente replicáveis em células de Escherichia coli incluem pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG e pACYC são disponíveis da Takara Bio Inc.), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW é disponível da Nippon Gene Co., Ltd.), pSTV29 (disponível da Takara Bio Inc.), etc. O DNA recombinante preparado como descrito acima pode ser introduzido em um microorganismo de acordo com qualquer um dos métodos de transformação que foram relatados até agora. Por exemplo, um método é para aumentar a permeabilidade do DNA pelo tratamento das bactérias receptoras com cloreto de cálcio, como relatado com respeito à Escherichia coli K-12 (Mandei, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)). Um outro método é introduzir o DNA depois de preparar as células competentes a partir das células na fase de crescimento, como relatado com respeito ao Bacillus subtilis (Duncan, C. H., Wilson, G. A. e Young, F. E., Gene, 1,153 (1977)). Também, um outro método que pode ser aplicado é um em que o microorganismo receptor de DNA, como conhecido em relação ao Bacillus subtilis, actinomicetes e leveduras, é mudado nos estados de protoplasto ou esferoplasto que podem facilmente captar o DNA recombinante, que é depois introduzido no hospedeiro (Chang, S. e Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. e Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. e Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75 1929(1978)). O número de cópias dos genes evgA, gadE ou ydeO pode ser aumentado pela integração de cópias múltiplas dos genes evgA, gadE ou ydeO como descrito acima em um DNA genômico do microorganismo. A introdução de cópias múltiplas dos genes evgA, gadE ou ydeO no DNA genômico do microorganismo é realizada pela recombinação homóloga, usando uma seqüência, da qual cópias múltiplas estão presentes no DNA genômico, como o alvo. O DNA repetitivo e as repetições invertidas presentes nas extremidades de elementos reversíveis podem ser usados como uma seqüência que existe em um DNA cromossômico em cópias múltiplas. Também, estes genes podem ser ligados em tandem, com os genes evgA, gadE ou ydeO que existem no genoma ou incorporados em cópias múltiplas em genes desnecessários no genoma. Estes genes podem ser introduzidos usando um vetor sensível à temperatura ou vetor de integração.

Como divulgado na JP2-109985A, também é possível incorporar os genes evgA, gadE ou ydeO em um transposon e transferí-los de modo que cópias múltiplas dos genes sejam integradas no DNA cromossômico. A integração dos genes evgA, gadE ou ydeO no genoma pode ser confirmado pela hibridização de Southern usando uma sonda tendo uma parte dos genes evgA, gadE ou ydeO. À parte de aumentar o número de cópia do gene descrito acima, a expressão dos genes evgA, gadE ou ydeO também pode ser realçada utilizando os métodos descritos na WOOO/18935, por exemplo, substituindo a seqüência reguladora de expressão tal como um promotor dos genes evgA, gadE ou ydeO, etc., no DNA genômico ou plasmídeo com um mais forte, aproximando das regiões -35, -10 de cada um dos genes para a seqüência de consenso, amplificando um regulador que pode realçar a expressão dos genes evgA, gadE ou ydeO e deletando ou enfraquecendo um regulador que diminuiría a expressão dos genes evgA, gadE ou ydeO. Por exemplo, o promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor araBA, promotor PR de fago lambda, promotor PL, promotor tet, promotor T7, promotor <plO, etc., são todos conhecidos como promotores fortes. Também é possível introduzir uma substituição de nucleotídeo, etc., na região promotora ou região SD dos genes evgA, gadE ou ydeO de modo a aumentar a força do promotor. Os exemplos de métodos para avaliar a força de promotores e exemplos de promotores fortes são descritos em artigos por Goldstein et al (Prokaryotic promotors in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1,105-128 (1995)), etc. Além disso, a substituição de diversos nucleotídeos na região espaçadora entre o sítio de ligação de ribossoma (RBS) e o códon de partida, particularmente na seqüência imediatamente a montante de um códon de partida, é conhecido ter um efeito forte sobre a eficiência de tradução de mRNA. A região reguladora de expressão tal como promotor etc. dos genes evgA, gadE ou ydeO, pode ser identificada por um vetor promotor-sonda e software de análise de gene tal como GEMETYX, etc. A expressão dos genes evgA, gadE ou ydeO pode ser realçada pelas substituições ou modificações destes promotores. A substituição das seqüências reguladoras de expressão pode ser conduzida, por exemplo, utilizando plasmídeos sensíveis à temperatura ou o método de integração Red-driven (W02005/010175).

Uma mutação que aumenta a transcrição de um gene cuja expressão é regulada pelos genes evgA, gadE ou ydeO também pode ser introduzida nos genes evgA, gadE ou ydeO. Os exemplos de mutações que aumentam a atividade da proteína codificada pelos genes evgA, gadE ou ydeO são uma mutação da seqüência promotora, que aumenta a quantidade de transcrição dos genes evgA, gadE ou ydeO e uma mutação dentro da região codificada do gene, que aumenta a atividade específica da transcrição. A proteína codificada pelos genes evgA, gadE ou ydeO é ativada pela EvgS de histidina quinase. Portanto, um microorganismo da presente invenção pode ser um em que a quantidade de expressão dos genes evgA, gadE ou ydeO foi aumentada aumentando-se a quantidade de expressão do gene evgS que codifica EvgS. Aqui, o gene evgS da presente invenção significa um gene evgS de uma bactéria do gênero Escherichia e seus homólogos. Por exemplo, o gene evgS de Escherichia coli é exemplificado por um gene (SEQID NO: 25) que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 26. (Acesso do Genbank N2 NP_417969 [gi: 16131384]).

Os homólogos do gene evgS significam genes que são derivados de outros microorganismos, que têm alta similaridade em estrutura ao gene evgS de uma bactéria do gênero Escherichia e que melhoram a capacidade para produzir L-aminoácido e exibem atividade de fator de transcrição quando introduzidos no hospedeiro. Os exemplos de homólogos de evgS incluem genes de evgS dos gêneros Salmonella, Shigella e Yersinia registrados no GenBank. Além disso, com base na homologia com os genes dados nos exemplos acima, os genes evgS podem ser clonados a partir de bactérias corineformes, tais como Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium lactofermentum, etc.; bactérias do gênero Pseudomonas, tais como Pseudomonas aeruginosa, etc.; bactérias do gênero Mycobacterium, tais como Mycobacterium tuberculosis, etc.; e bactérias do gênero Bacillus. Aquelas com nomes de gene diferentes são aceitáveis contanto que elas sejam altamente homólogas com o evgS das bactérias do gênero Escherichia. Por exemplo, na Escherichia coli, o gene evgS forma um operon com o gene evgA e pode ser obtido junto com o gene evgA por uma PCR usando os oligonucleotídeos sintéticos das SEQ ID NOs: 17 e 18. Com outros microorganismos, é esperado que estes genes podem ser obtidos do mesmo modo usando os oligonucleotídeos das SEQ ID NOs: 17 e 18. O gene evgS usado na presente invenção não é limitado a um gene do tipo selvagem; e contanto que a função da proteína, isto é, a atividade de fator de transcrição, não seja prejudicada, também pode ser um mutante ou uma variante artificialmente modificada que codifica uma proteína que tem uma seqüência incluindo uma ou diversas substituições, deleções, inserções, adições de aminoácido ou semelhante em uma ou múltiplas posições na seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 26, isto é, uma proteína que tem mutação conservativa. Os termos “diversas” e “mutação conservativa” são os mesmos como aqueles descritos acima com respeito ao gene evgA, gene gadE e gene ydeO. O aumento da quantidade de expressão de evgS pode ser realizado usando o mesmo método usado para aumentar a quantidade de expressão dos genes evgA, gadE e ydeO como descrito acima. O aumento da quantidade de expressão dos genes evgA, gadE ou ydeO pode ser realizado usando um dos meios mencionados acima para todos os genes ou um meio diferente para cada gene. 2. Método para produzir L-aminoácido O método para produzir L-aminoácido da presente invenção compreende cultivar o microorganismo da presente invenção em um meio, produzir e acumular o L-aminoácido no dito meio ou nas células do microorganismo e coletar o L-aminoácido do dito meio ou das células.

Um meio convencionalmente usado na fermentação e produção de L-aminoácido usando microorganismos pode ser usado na presente invenção. Isto é, um meio comum contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, íons inorgânicos e outros componentes orgânicos como necessário pode ser usado. As fontes de carbono incluem um açúcar tal como glicose, sacarose, lactose, galactose, frutose, uma amido hidrolisase, etc., um álcool tal como glicerol, sorbitol, etc., um ácido orgânico tal como ácido fumárico, ácido cítrico, ácido succínico, etc. Destes, glicose, frutose e sacarose podem ser preferivelmente usados. As fontes de nitrogênio incluem um sal de amônio inorgânico tal como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, etc., um nitrogênio orgânico tal como um hidrolisado de soja, etc., gás amônia, água amoniacal, etc. Como a fonte de micronutriente orgânico, é preferível que uma quantidade apropriada das substâncias requeridas, tais como vitamina Bl, L-homosserina, etc. ou extrato de levedura, etc estão no meio. Além destes, de acordo com a necessidade, quantidades pequenas de fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íons ferro, íons manganês, etc., podem ser adicionadas. O meio usado na presente invenção pode ser um meio natural ou sintético contanto que o mesmo contenha uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, íons inorgânicos, e, como necessário, outros micronutrientes orgânico.

Um aminoácido que melhora o crescimento de um microorganismo ou produtividade da substância alvo pode ser adicionado ao meio. Por exemplo, é preferível que a L-treonina, L-homosserina ou L-isoleucina é adicionado para a fermentação de L-lisina. A L-isoleucina, L-lisina, L-ácido glutâmico ou L-homosserina é adicionado para a fermentação de L-treonina e L-fenilalanina ou L-tirosina ou semelhante é adicionado para a fermentação de L-triptofano. A concentração de L-aminoácido adicionado está em tomo de 0,01 a 10 g/L. É recomendado que o cultivo seja realizado sob condições aeróbicas por 1 a 7 dias em uma temperatura de cultura de 24° C a 37° C, com um pH durante a cultura de 5 a 9. Para ajustar o pH, uma substância ácida ácido ou alcalina, inorgânica ou orgânica e gás amônia e outros pode ser usada. Os L-amínoácidos podem ser coletados do caldo de fermentação usando uma combinação de um método de resina de troca iônica convencional, método de precipitação e outros métodos conhecidos. Se o L-aminoácido acumula dentro das células, as células podem ser rompidas pela ultrassonificação, etc. Depois, os fragmentos celulares podem ser removidos pela separação centrífuga para se obter o sobrenadante, a partir do qual o L-aminoácido pode ser recoletado usando um método de resina de troca iônica, etc.

Exemplos A presente invenção será explicada mais especificamente abaixo com referência aos seguintes Exemplos não limitantes.

Exemplo de referência 1: Construção de bactérias que produzem L-triptofano 1-1. Introdução do gene serA O gene da fosfoglicerato desidrogenase (serA) existe no plasmídeo pGH5 (W09408031) e foi inserido no genoma de uma bactéria usando transposon Mud. O plasmídeo pCE1134 (JP2-109985A) que contém MudII1734 foi digerido com BamHI para remover um fragmento de DNA contendo o operon lac e os terminais foram enfraquecidos na extremidade e um ligador Smal foi inserido. Este plasmídeo foi redigerido com Smal e auto fechado para formar um plasmídeo circular e chamado de pMull34. Um fragmento de DNA contendo serA foi excisado a partir do plasmídeo pGH5 pela divagem com Seal e Sall e os terminais do fragmento foram enfraquecidos nas extremidades. Depois o fragmento foi inserido no sítio Smal do pMull34 mencionado acima. Assim, o plasmídeo pMudserA que contém Mud no qual o gene serA derivado de pGH5 foi inserido (chamado MudserA) foi construído.

Usando a cepa bacteriana SV164 que produz L-triptofano (W09408031) tendo a antranilato sintase dessensibilizada como uma bactéria receptora, a cepa bacteriana LI em que MudserA foi transferido no genoma foi obtido, de acordo com um método comum usando-se a aquisição da resistência de canamicina como um índice. A partir dos resultados de um experimento de hibridização de Southern, foi inferido que houve apenas uma localização onde o MudserA foi inserido na cepa Ll. Também, com a clonagem de um fragmento de DNA genômico contendo MudserA pela PCR e a determinação de sua seqüência de nucleotídeo, foi determinado que a inserção foi na posição N° 240, 950 no genoma da E. coli K-12 (Acesso do Genbank N° U00096). 1-2. Introdução do operon trp Em seguida, o número de cópia do operon trp foi aumentado pela inserção do operon trp no genoma usando um transposon. Do operon genes trp foram excisados a partir do plasmídeo pGXlOO. pGXlOO foi construído pela inserção em um plasmídeo pBR313 de um fragmento de DNA derivado da cepa MTR#2 da E. coli (Patente U.S. 4.371,614) tendo um gene trpE dessensibilizada. Um fragmento de DNA contendo o operon trp de aprox. 7,6 kb pode ser excisado do plasmídeo pela divagem com Xhol e Smal. Um fragmento de DNA contendo o operon trp foi excisado de pGXlOO pela divagem com Xhol e Smal e os terminais do fragmento foram enfraquecidos na extremidade. Depois, o fragmento foi inserido no sítio Smal do pCEl 134 mencionado acima. O mesmo fragmento de DNA contendo o operon trp também pode ser clonado diretamente do DNA genômico da cepa MTR#2 da E. coli, utilizando a PCR, usando iniciadores das SEQID NOS: 1 e 2 mostrados na listagem de seqüência. Como descrito acima, o plasmídeo pMudtrpG’ lac que contém Mud no qual os genes do operon trp derivados da cepa MTR#2 foram inseridos (chamado de MudtrpG’ lac) foi construído.

Antes de aumentar o número de cópia de MudtrpG’ lac pela inserção de MudtrpG’ lac no genoma, a deficiência na assimilação de lactose foi comunicada à cepa hospedeira com o propósito de usar a complementação da capacidade de assimilação de lactose como o marcador de seleção para a cepa. O gene ilvG da bactéria que produz L-treonina VKPM B-3996 (Patente U.S. 5.175.107) foi transduzida em PI na cepa LI para comunicar resistência à L-valina à cepa LI (Ver a W02005/103228). A transdução PI foi conduzida de acordo com um método comum, os transdutantes foram espalhados em um meio M9 mínimo (4 g/L de glicose, 12,8 g/L de Na2HP04*7H20, 3 g/L de KH2P04, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4C1, 5 mM de MgS04, 0,1 mM de CaCl2, 1 mg/L de tiamina, 20 mg/1 de L-Phe, 20 mg/L de L-Tyr, 20 mg/L de L-Met, 3 mg/L de piridoxina, 20 mg/L de L-Val, 20 mg/L de tetraciclina) e uma colônia resistente a Vai foi obtido e chamado de LI ValR. lacZ98::TnlO foi transduzido em PI no LI ValR da cepa ΜΕ8581 (HfrH (valS<—uxuAB):lacZ98::TnlO relAl thi-1, depositada com a National Institute of Genetícs) de acordo com um método comum, com a resistência à tetraciclina derivada de TnlO como o indicador. A cepa obtida foi deficiente na assimilação da lactose, como esperado. Em seguida, de modo a obter uma cepa com capacidade de assimilar lactose deficiente, mas sem TnlO, uma cepa 14-1-lac-tets sensível à tetraciclina foi obtida a partir das cepas transduzidas através do método de replica. A capacidade de assimilar lactose foi ainda deficiente na cepa 14-1-lac-tets. Quando da confirmação da situação TnlO da dita cepa pela hibridização de Southern, nenhuma faixa híbridizando com o gene tet foi detectada, mas uma faixa hibridizando com a região IS 10 de TnlO foi detectada, por meio da qual acreditou-se que IS 10 permanece no gene lacZ.

Usando pMudtrpG’ lac, com a cepa 14-1-lac-tets como a bactéria receptora, a cepa bacteriana N2 202 em que MudtrpG’ lac foi transferido no genoma foi obtida, de acordo com um método comum, com a complementação da capacidade de assimilar lactose como o indicador. Se o transposon inserido ou o gene no transposon tende a declinar gradualmente da cepa inserida no transposon, uma subcultura pode ser realizada em um meio nutriente para selecionar uma cepa bacteriana que estavelmente retém a resistência à canamicina, capacidade de assimilar lactose, etc. Como um resultado da hibridização de Southern, foi inferido que houve apenas uma localização onde MudtrpG’ lac foi inserido na cepa N2 202. Também, com a clonagem de um fragmento de DNA genômico contendo MudtrpG’ lac pela PCR e a determinação da sua seqüência de nucleotídeo, foi determinado que a inserção foi na posição Na 530.249 no genoma K-12 da E. coli (Acesso do Genbank N2 U00096).

Em seguida, os genes scrK, scrY, scrA, scrB e scrR envolvidos nas características que assimilam sacarose foram introduzidas na N2 202 pela transdução PI e a cepa bacteriana resultante foi designada N2 202 scr (ver a W090/04636). 1-3. Construção de um plasmídeo para romper iclR. O fragmento iclR foi amplificado utilizando uma PCR usando Pirobest DNA Polimerase (Takara Shuzo) de acordo com o manual de instruções anexo. Para a reação de PCR, oligonucleotídeos das SEQ ID NOS: 3 e 4 foram usados como os iniciadores, com o genoma de W3110 extraído usando um Kit RNA/DNA maxi (QIAGEN) como o padrão. Depois da PCR, o fragmento de DNA amplificado foi purificado usando Wizard PCR Preps (Promega). O fragmento de DNA purificado foi digerido com endonucleases de restrição EcoRI e HindIII (Takara Shuzo), depois passaram pelo tratamento com fenol clorofórmio e precipitação com etanol para se obter DNA purificado. Este fragmento e pUC18 (Takara Shuzo), que foi digerido com as mesmas enzimas e depois purificado, foram ligados usando o Kit DNA ligation Ver.2 (Takara Shuzo). Com esta solução de reação de ligação, as células competentes JM109 (Takara Shuzo) foram transformadas, que foram depois espalhadas sobre uma placa de LB ágar contendo 50 pg/ml de ampicilina (Amp) (Meiji Seika) (placa de LB+Amp) e as colônias foram selecionadas a 37° C. As colônias foram cultivadas em um tubo de teste usando um meio LB contendo 50 pg/ml de Amp a 37° C e o plasmídeo foi extraído usando o extrator de plasmídeo automático PI-50 (Kurabo). O plasmídeo pUCic/R obtido foi digerido com endonuclease de restrição Eco065I (Takara Shuzo) e foi enfraquecido na extremidade e ligado usando um kit BKL (Takara Shuzo). Com a solução de reação de ligação, JM109 foi transformada e as colônias foram selecionadas como descrito acima e o plasmídeo foi extraído. O plasmídeo obtido foi digerido com EcoRI e HindIII e depois purificado e ligado com o plasmídeo sensível à temperatura pTSl, que foi digerido com as mesmas enzimas e purificado. pTSl foi obtido substituindo-se um fragmento PstI-HindIII de pMAN031 (ver J. Bacteriol. 162, 1196-1202 (1985), A Figura 1) com um fragmento PstI- HindlII de pBR322 (Takara Shuzo). Com a solução de reação de ligação, JM109 foi transformada e as colônias foram selecionadas na placa de LB+Amp a 30° C. As colônias foram cultivadas a 30° C em um tubo de teste usando o meio LB contendo 50 pg/ml de Amp e o plasmídeo foi extraído como descrito acima. O plasmídeo que gera um fragmento com um comprimento esperado pela digestão com EcoRI e HindlII foi designado como o plasmídeo de rompimento de iclR pTSA/c/R.

1-4. Obtenção e uma cepa rompida em iclR

Ns202scr foi transformada com pTSAzc/R e as colônias foram selecionadas na placa de LB+Amp a 30° C. Depois que a cultura líquida foi realizada durante a noite a 30° C, a cultura foi diluída em 10'3 e espalhada sobre a placa de LB+Amp e as colônias foram selecionadas a 42° C. Especificamente, a cultura foi espalhada sobre a placa de LB+Amp e cultivada a 30° C, as células que cobriram 1/8 da placa foram colocadas em suspensão em um meio LB de 2 ml e cultivadas com agitação por 4 a 5 horas a 42° C. As células diluídas em 10’5 foram espalhadas sobre a placa de LB e as colônias foram obtidas, das quais algumas centenas de colônias foram espalhadas sobre a placa LB e placa LB+Amp, respectivamente e seu crescimento foi confirmado, pelo que a sensibilidade e resistência a Amp foram confirmadas. As cepas sensíveis a Amp foram examinadas pela PRC de colônia usando os oligonucleotídeos das SEQ ID NOS: 3 e 4 como os iniciadores. Como um resultado, uma cepa em que um fragmento amplificado não pôde ser cortado com Eco065I foi obtido como a cepa deficiente em iclR (N- 202A/c/R).

Exemplo 1: Construção de um plasmídeo para realçar os genes evgAS, gadE e ydeOs 1-1. Construção de um plasmídeo para realçar os genes evgA e evgS A seqüência de nucleotídeo inteira do genoma de Escherichia coli (cepa K-12 da Escherichia coli) já foi relatada (Science, 277,1453-1474 (1997)) e é conhecido que evgAS forma uma estrutura de operon. Com base nas seqüências de nucleotídeo dos genes evgAS (Acessos do Genbank N~ AAC75428 e AAC75429) que foram relatados no relato acima, um oligonucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 17 tendo um sítio HindIII como um iniciador 5’ e um oligonucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 18 tendo um sítio EcoRI como um iniciador 3’ foram sintetizados. Usando estes iniciadores, a PCR foi realizada com o DNA genômico da cepa W3110 da Escherichia coli como o padrão e o produto amplificado foi tratado com endonucleases de restrição HindIII e EcoRI para se obter um fragmento contendo os genes evgAS. O produto de PCR purificado foi ligado ao vetor pMW118 (Nippon Gene Co., Ltd.) que foi digerido com HindIII e EcoRI, construindo assim o plasmídeo pMW-evgAS para amplificar o operon evgAS. 1-2. Construção de um plasmídeo para realçar gadE A seqüência de nucleotídeo inteira do genoma de Escherichia coli (cepaK-12 da Escherichia coli) já foi relatada (Science, 277, 1453-1474 (1997)). Com base na seqüência de nucleotídeo do gene gadE (Acesso do Genbank N- AAC76537) que foi relatado no relato acima, um oligonucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 19 tendo um sítio BamHI como um iniciador 5’ e um oligonucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 20 tendo um sítio HindU como um iniciador 3’ foram sintetizados. Usando estes iniciadores, a PCR foi realizada com o DNA genômico da cepa W3110 de Escherichia coli como o padrão e o produto amplificado foi tratado com endonucleases de restrição HindIII e BamHI para se obter um fragmento contendo o gene gadE. O produto de PCR purificado foi ligado ao vetor pMW118 (Nippon Gene Co., Ltd.), que foi digerido com HindIII e BamHI, construindo assim o plasmídeo pMW-gadE para amplificar gadE.

1-3. Construção de um plasmídeo para realçar ydeO A seqüência de nucleotídeo inteira do genoma de Escherichia coli (cepa K-12 da Escherichia coli) já foi relatada (Science, 277, 1453-1474 (1997)). Com base na seqüência de nucleotídeo do gene ydeO (Acesso do Genbank N° AAC74572) que foi relatada no relato acima, um oligonucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 21 tendo um sítio HindlII como um iniciador 5’ e um oligonucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 22 tendo um sítio EcoRI como um iniciador 3’ foram sintetizados. Usando estes iniciadores, a PCR foi realizada com o DNA genômico da cepa W3110 de Escherichia coli como o padrão e o produto amplificado foi tratado com endonucleases de restrição HindlII e EcoRI para se obter um fragmento contendo o gene ydeO. O produto de PCR purificado foi ligado ao vetor pMW118 (Nippon Gene Co., Ltd.), que foi digerido com HindlII e EcoRI, construindo assim o plasmídeo pMW-ydeO para amplificar ydeO.

Exemplo 2: Efeito da amplificação dos genes evgAS, ydeO e gadE em uma cepa que produz L-triptofano de uma bactéria do gênero Escherichia A cepa que produz L-triptofano N~ 202A/c/R construída no Exemplo de referência 1 foi transformada com o plasmídeo pMW-gadE que amplifica gadE, o plasmídeo pMW-evgAS que amplifica evgAS e o plasmídeo pMW-ydeO que amplifica ydeO criados no Exemplo 1, obtendo assim cepas resistentes à ampicilina. Depois de confirmar que estes plasmídeos foram introduzidos, uma cepa na qual o plasmídeo pMW-gadE que amplifica gadE foi introduzido foi designada a cepa Na202A/c/R/gadE; uma cepa na qual o plasmídeo pMW-evgAS que amplifica evgAS foi introduzido foi designada a cepa Ns202A/c/R/evgAS; e uma cepa na qual o plasmídeo pMW-ydeO que amplifica ydeO foi introduzido foi designada a cepa N°202A/c/R/ydeO. O evgAS, ydeO ou gadE pode ser amplificado da mesma maneira usando bactérias conhecidas que produzem L-triptofano outro que não a cepa N2202A/c/R.

As cepas criadas como acima foram cultivadas em um meio LB contendo 50 mg/L de ampicilina a 37° C até que a OD600 tomou-se aprox. 0,6. Depois, um volume igual de solução a 40 % de glicerol foi adicionado ao caldo de cultura e agitado, depois quantidades apropriadas foram dispensadas e armazenadas a -80° C para fabricar o estoque de glicerol.

Depois de fundir o estoque de glicerol destas cepas, 100 ml de cada uma foram homogeneamente espalhados sobre uma placa L contendo 50 mg/L de ampicilina e a placa foi incubada a 37° C por 24 horas. Aprox. 1/8 das células na placa foi inoculado em um meio de fermentação de 20 ml com 50 ml de ampicilina em um frasco de Sakaguchi de 500 ml e cultivadas a 37° C por 48 horas usando um incubador de agitação recíproca. Depois da cultura, a quantidade de L-triptofano que acumulou no meio foi medida usando um analisador de aminoácido L-8500 (Hitachi). A composição do meio usada para a cultura foi como segue.

Meio que produz L-triptofano: Glicose 40 g/L

(NH4)2S04 15 g/L

KH2P04 1,5 g/L

MgS04-7H20 0,3 g/L

FeS04-7H20 0,01 g/L

MnS04-7H20 0,01 g/L

Extrato de levedura 2,0 g/L

Tiamina HC1 0,005 g/L

Piridoxina 0,03 g/L

L-Met 0,05 g/L

L-Phe 0,1 g/L

L-Tyr 0,1 g/L

CaC03 30 g/L

Ajustado ao pH 7,0 com KOH, autoclavado a 120° C por 20 min. A glicose e MgS04-7H20 foram misturados e esterilizados separadamente de outros componentes. O CaC03 foi adicionado depois da esterilização por calor seco. A OD600 e o acúmulo de L-triptofano na 48a hora são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1: Efeito da amplificação de evgAS, ydeO e gadE sobre as Trp-bactérias que produzem N-202A/c/R

Nfi202Az'c/R/evgAS, N2202Azc/R/ydeO e Na202Azc/R/gadE, que são as cepas amplificadas dos genes evgAS» ydeO e gadE» cada uma indicou um aumento no acúmulo de L-triptofano comparada com o controle N-202Azc/R.

Exemplo 3: Efeito da amplificação de evgAS, ydeO e gadE em uma cepa que produz L-treonina de uma bactéria do gênero Escherichia A cepa VKPM B-5318 de Escherichia coli (ver a EP0593792) foi usada como uma cepa que produz L-treonina de uma bactéria do gênero Escherichia A cepa VKPM B-5318 foi transformada com o plasmídeo pMW-gadE que amplifica gadE, plasmídeo pMW-evgAS que amplifica evgAS e o plasmídeo pMW-ydeO que amplifica ydeO construídos no Exemplo 1, obtendo assim as cepas resistentes à ampicilina. Depois confirmando que estes plasmídeos foram introduzidos, uma cepa na qual o plasmídeo pMW-gadE que amplifica gadE foi introduzido foi designada a cepa B5318/gadE; uma cepa na qual o plasmídeo pMW-evgAS que amplifica evgAS foi introduzido foi designada a cepa B5318/evgAS; e uma cepa na qual o plasmídeo pMW-ydeO que amplifica ydeO foi introduzido foi designada a cepa B5318/ydeO. evgAS, ydeO ou gadE podem ser amplificados da mesma maneira usando bactérias conhecidas que produzem L-treonina outras que não da cepa VKPM B-5318.

As cepas criadas como acima foram cultivadas em um meio LB contendo 50 mg/L de ampicilina a 37° C até que a OD600 tomou-se aprox. 0,6. Depois, um volume igual de 40 % de solução de glicerol foi adicionado ao caldo de cultura e agitados, depois quantidades apropriadas foram dispensadas e armazenadas a -80° C para fabricar o estoque de glicerol.

Depois de fundir o estoque de glicerol destas cepas, 100 ml de cada uma foram homogeneamente espalhados sobre uma placa L contendo 50 mg/L de ampicilina e a placa foi incubada a 37° C por 24 horas. Aprox. 1/8 das células na placa foi inoculado em um meio de fermentação de 20 ml descrito abaixo com 50 ml de ampicilina em um frasco de Sakaguchi de 500 ml e cultivados a 37° C por 48 horas usando um incubador de agitação recíproca. Depois da cultura, a quantidade de L-treonina que acumulou no meio foi medida usando um analisador de aminoácido L-8500 (Hitachi). A composição do meio usado para a cultura foi como segue.

Meio que produz L-treonina: Glicose 40g/L

(NH4)2S04 16g/L

KH2P04 l,0g/L

MgS04*7H20 l,0g/L

FeS04-7H20 0,01g/L

MnS04-7H20 0,01g/L

Extrato de levedura 2,0g/L

CaC03 (Farmacopéia Japonesa) 30g/L

Ajustado ao pH 7,0 com KOH, autoclavado a 120° C por 20 min. Glicose e MgS04-7H20 foram misturados e esterilizados separadamente. CaC03 foi adicionado depois da esterilização por calor seco. A OD600 e o acúmulo de L-treonina na 48a hora são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2: Efeito da amplificação de evgAS, ydeO e gadE sobre B5318/evgAS, B5318/ydeO e B5318/gadE, que são as cepas amplificadas do gene evgAS, ydeO e gadE, cada uma indicou um aumento no acúmulo de L-treonina comparado com o controle VKPM B-5318.

Exemplo 4: Construção de uma Bactéria produtora de L-lisina 4-1. Construção de uma cepa em que os genes cadA e ldcC que codificam a lisina descarboxilase foram rompidos Primeiro, uma cepa não produtora de lisina descarboxilase foi construída. As isozimas da lisina descarboxilase são codificadas pelo gene cadA (Acesso do Genbank N2 NP J18555. SEQID NO: 31) e pelo gene ldcC (Acesso do Genbank N2 NPJ14728. SEQ ID NO: 33) (ver a WO96/17930). A cepa WC196 (ver a WO96/17930), que é uma cepa resistente a AEC (S-(2-aminoetÍl)-císteína), foi usada como a cepa precursora para a cepa produtora de L-lisina de Escherichia coli.

Os genes cadA e ldcC que codificam a lisina descarboxilase foram deletados usando um método chamado de “integração Red-driven”, que foi inicialmente desenvolvido pela Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 97. 6640-6645 (2000)) e um sistema de excisão de fago λ (J. Bacteriol. 184. 5200-5203 (2002)). De acordo com o método da “integração Red-driven”, é possível construir uma cepa rompida no gene em uma única etapa, utilizando um produto de PCR obtido usando-se como iniciadores sintéticos oligonucleotídeos para os quais uma parte do gene alvo foi designado no terminal 5’ e uma parte do gene resistente a antibiótico foi designada ao terminal 3’. Além disso, em combinação com o sistema de excisão de fago λ, o gene resistente a antibiótico integrado na cepa rompida no gene pode ser removida (JP2005-058227A).

4-2. Rompimento do gene cadA O plasmídeo pMW118-attL-Cm-attR (W02005/010175) foi usado como o padrão de PCR. pMW118-attL-Cm-attR é um plasmídeo em que os genes attL e attR, que são os sítios de ligação do fago λ e do gene cat, que é um gene resistente a antibiótico, foi inserido no pMW118 (Takara Bio Inc.) na ordem de attL-cat-attR. A PCR foi conduzida usando como iniciadores os oligonucleotídeos sintéticos mostrados nas SEQ ID NOS: 35 e 36, em que cada um ou os iniciadores têm uma seqüência que corresponde a cada uma das extremidades de attL e attR na extremidade 3’ e tem uma seqüência que corresponde a uma parte do gene cadA alvo na extremidade 5’. O produto de PCR foi purificado com gel de agarose, depois introduzido pela eletroporação a uma cepa WC196 de Escherichia coli contendo um plasmídeo pKD46, que tem capacidade de replicação sensível à temperatura. O plasmídeo pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 97. 6640-6645 (2000)) contém os fragmentos de DNA do fago λ de um total de 2154 bases, que incluem os genes (genes γ, β, exo) que codificam a Red recombinase no sistema de recombinação homóloga de λ Red controlado pelo promotor ParaB induzido pela arabinose (GenBank/EMBL Acesso N° J02459,31088th - 33241st).

As células competentes para a eletroporação foram preparadas como segue. Isto é, uma cepa WC196 da Escherichia coli cultivada durante a noite a 30° C em um meio LB contendo 100 mg/L de ampicilina foi diluído 100 vezes em 5 ml de um meio SOB contendo ampicilina (20 mg/L) e L-arabinose (1 mM) (Molecular Cloning: Lab Manual 2a edição, Sambrook, J., et ai, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). A suspensão diluída foi aerada a 30° C até que a OD600 atingisse aprox. 0,6 e depois a suspensão foi concentrada 100 vezes e lavada três vezes com glicerol a 10 % para prepará-la para o uso na eletroporação. A eletroporação foi realizada usando 70 μΐ de células competentes e aprox. 100 ng de produto de PCR. 1 ml de meio SOC (Molecular Cloning: Lab Manual 2a edição, Sambrook, J., et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) foi adicionado às células após a eletroporação e cultivadas a 37° C por 2,5 horas, depois cultivadas em um meio de placa de L-ágar contendo Cm (cloranfenicol) (25 mg/L) a 37° C, selecionando assim o recombinante resistente a Cm. Em seguida, para remover o plasmídeo pKD46, o recombinante foi subcultivado duas vezes em um meio L-ágar contendo Cm a 42° C, a resistência à ampicilina da colônia obtida foi testada e uma cepa sensível à ampicilina da qual o pKD46 foi omitido foi obtido. A deleção do gene cadA no mutante identificado pelo gene resistente ao cloranfenicol foi confirmado usando a PCR. A cepa deficiente a cadA obtida foi designada a cepa WC196AcadA::att-cat.

Em seguida, para remover o gene att-cat introduzido no gene cadA, um plasmídeo auxiliar, pMW-intxis-ts (W02005/010175) foi usado. pMW-intxís-ts é um plasmídeo que contém um gene que codifica a fago λ integrase (Int) e um gene que codifica a excisíonase (Xis).

As células competentes da cepa WC196AcadA::att-cat obtidas como descrito acima foram preparadas usando um método comum e foram transformadas com plasmídeo auxiliar pMW-intxis-ts, cultivado em um meio de placa de L-ágar contendo 50 mg/L de ampicilina a 30° C, selecionando assim a cepa resistente à ampicilina.

Em seguida, para remover o plasmídeo pMW-intxis-ts, o transformante resistente à ampicilina foi subcultivado duas vezes em um meio de L-ágar a 42° C, a resistência à ampicilina e a resistência ao cloranfenicol da colônia obtida foram testadas e uma cepa sensível à cloranfenicol e ampicilina da qual o att-cat e pMW-intxis-ts foram removidos foi obtida. Esta cepa foi designada WC196AcadA.

4-3. Rompimento do gene ldcC na cepa WC196AcadA 0 gene ldcC na cepa WC196AcadA foi deletado de acordo com a técnica descrita acima, usando os iniciadores das SEQ ID NOS: 37 e 38, como os iniciadores de rompimento de ldcC. Assim, WC196AcadAAldcC, que é uma cepa de cadA, rompida no ldcC, foi obtida.

Exemplo 5: Efeito da amplificação de evgAS em uma Cepa produtora de L-lisina de uma bactéria do gênero Escherichia 5-1. Introdução de plasmídeo que produz Usina na cepa WC196AcadAAldcC

De acordo com um método comum, a cepa WC196AcadAAldcC foi transformada com plasmídeo que produz lisina pCABl que contêm a genes dapA, dapB e lysC (WOO1/53459), para se obter a cepa WC196ÁcadAAldcC/pCABl (WC196LC/pCABl). A cepa WC196LC/pCABl foi transformada com o plasmídeo pMW-evgAS que amplifica evgAS, criada no Exemplo 1, obtendo assim uma cepa resistente à ampicilina. Depois de confirmar que o plasmídeo prescrito foi introduzido, a cepa introduzida com o plasmídeo pMW-evgAS que amplifica evgAS foi designada a cepa WC196LC/pCABl/evgAS. O evgAS pode ser amplificado da mesma maneira usando bactérias que produzem L-lisina conhecido outras que não a cepa WC196LC/pCABl.

As cepas criadas como acima foram cultivadas em um meio LB contendo 25 ml de estreptomicina e 50 mg/L de ampicilina a 37° C até que a OD600 tomou-se aprox. 0,6. Depois, um volume igual de solução de glicerol a 40 % foi adicionado ao caldo de cultura e agitados, depois quantidades apropriadas foram dispensadas e armazenadas a -80° C para fabricar o estoque de glicerol. 5-2. Cultura que produz lisina Depois de fundir o estoque de glicerol destas cepas, 100 ml de cada uma foram homogeneamente espalhados sobre uma placa L contendo 50 mg/L de ampicilina e a placa foi incubada a 37° C por 24 horas. Aprox. 1/8 das células na placa obtida foi inoculada em um meio de fermentação de 20 ml descrito abaixo com 50 ml de ampicilina em um frasco de Sakaguchi de 500 ml e cultivadas a 37° C por 48 horas usando agitação recíproca. Depois da cultura, a quantidade de L-lisina que acumulou no meio foi medida usando um analisador Biotech AS210 (Sakura Seiki). A composição do meio usado para a cultura foi como segue.

Meio que produz L-lisina: Ajustado ao pH 7,0 com KOH, autoclavado a 120° C por 20 min. Glicose e MgSO^HjO foram misturados e esterilizados separadamente. CaCCh foi adicionado depois da esterilização por calor seco. A OD600 e o acúmulo de L-lisina na 48a hora são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3: Efeito da amplificação de evgAS sobre a bactéria que produz lisina WC196LC/pCABl __________________________ A WC196LC/pCABl/evgAS, que é a cepa amplificada no gene evgAS, indicou um aumento significante no acúmulo de L-lisina comparado com o controle WC196LC/pCABl.

Exemplo 6: Efeito da amplificação de gadE sobre uma Cepa produtora de L-lisina de uma bactéria do gênero Escherichia 6-1. Construção de uma cepa produtora de L-lisina em que o gene gadE foi realçada Um fragmento de gene gadE foi excisado do plasmídeo pMW-gadE contendo o gene gadE da cepa W3110 da Escherichia coli criada no Exemplo 1 e o fragmento foi ligado com o vetor pUC18 (Takara Shuzo) digerido com HindIII e BamHI, construindo assim o plasmídeo pUC-gadE que amplifica gadE. A cepa WC196LC/pCABl foi transformada com o pUC-gadE mencionado acima» obtendo assim uma cepa resistente à ampicilina. Depois de confirmar que o plasmídeo prescrito foi introduzido, uma cepa na qual o plasmídeo pUC-gadE que amplifica gadE foi introduzido foi designado a cepa WC196LC/pC AB1 /pUC-gadE. evgAS, ydeO ou gadE podem ser amplificados da mesma maneira usando bactérias que produzem L-lisina conhecidas outras que não WC196LC/pCABl. A amplificação também pode ser realizada em qualquer combinação dos genes evgAS, ydeO ou gadE.

As cepas criadas como acima foram cultivadas em um meio LB contendo 25 mg/L de estreptomicina e 50 mg/L de ampicilina a 37° C até que a OD600 atingisse 0,6. Depois, um volume igual de uma solução de glicerol a 40 % foi adicionado ao caldo de cultura e agitados, depois quantidades apropriadas foram dispensadas e armazenadas a -80° C para fabricar o estoque de glicerol. 6-2. Cultura que produz lisina Depois de fundir o estoque de glicerol destas cepas, 100 ml de cada uma foram homogeneamente espalhados sobre uma placa L contendo 25 mg/L de estreptomicina e 50 mg/L de ampicilina e a placa foi incubada a 37° C por 24 horas. Aprox. 1/8 das células na placa obtida foi inoculado em um meio de fermentação de 20 ml descrito abaixo com 25 mg/L de estreptomicina e 50 ml de ampicilina em um frasco de Sakaguchi de 500 ml e cultivados a 37° C por 48 horas usando um incubador de agitação recíproca. Depois da cultura, a quantidade de L-lisina que acumulou no meio foi medida usando um analisador Biotech AS210 (Sakura Seiki). A composição do meio usado para a cultura foi como segue.

Meio que produz L-lisina: CaCCL (F armacopéia Japonesa) 3 0 g/L

Ajustado ao pH 7,0 com KOH, autoclavado a 120° C por 20 min. A glicose e MgS04*7H20 foram misturado e esterilizado separadamente. O CaCCb foi adicionado depois da esterilização por calor seco. A OD600 e a L-lisina acumulada na 48a hora são mostradas na Tabela 4.

Tabela 4: Efeito da amplificação de gadE na bactéria que produz lisina WC196LC/pCABl em cultura de glicose e cultura de ffutose A cepa WC196LC/pCABl/pUCgadE amplificada pelo gene gadE indicou um aumento no acúmulo de L-lisina tanto em uma cultura de glicose quanto cultura de frutose comparado com o controle WC196LC/pCABl, em particular, um aumento significante no acúmulo de L-lisina na cultura de frutose.

Aplicabilidade Industrial Usando-se o microorganismo da presente invenção, é possível produzir eficientemente um L-aminoácido, especificamente, L-lisina, L-treonina e L-triptofano pela fermentação.

Explicação da Listagem de Seqüência SEQID NO: 1: iniciador para amplificar o operon trp SEQ ID NO: 2: iniciador para amplificar o operon trp SEQ ID NO: 3: iniciador para amplificar o gene icIR SEQ ID NO: 4: iniciador para amplificar o gene icIR SEQ ID NO: 5: seqüência de nucleotídeo do gene icIR SEQ ID NO: 6: seqüência de um aminoácido codificado pelo gene icIR

SEQ ID NO: 7: seqüência de nucleotídeo do gene aceA SEQ ID NO: 8: seqüência de um aminoácido codificado pelo gene aceA

SEQ ID NO: 9: seqüência de nucleotídeo do gene aceB SEQ ID NO: 10: seqüência de um aminoácido codificado pelo gene aceB

SEQ ID NO: 11: seqüência de nucleotídeo do gene aceK SEQ ID NO: 12: seqüência de um aminoácido codificado pelo gene aceK

SEQ ID NO: 13: seqüência de nucleotídeo do gene trpA SEQ ID NO: 14: seqüência de um aminoácido codificado pelo gene trpA

SEQ ID NO: 15: seqüência de nucleotídeo do gene trpB SEQ ID NO: 16: seqüência de um aminoácido codificado pelo gene trpB

SEQ ID NO: 17: iniciador para amplificar o operon evgAS SEQ ID NO: 18: iniciador para amplificar o operon evgAS

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para produzir um L-aminoãcido, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar em um meio uma bactéria da família Enterobacteriaceae que tenha uma capacidade para produzir um L-aminoácido e que foi modificada de modo a aumentar a quantidade de expressão de um gene selecionado do grupo que consiste em gene evgA, gene gadE, gene ydeO, em que os ditos genes codificam fatores de transcrição envolvidos no sistema de dois componentes de regulon EvgAS, e coletar o L-amínoãcido do meio, em que a expressão do gene é aumentada por (a) ou (b): (a) aumento do número de cópias do gene; (b) modificação da bactéria de modo que a expressão de um gene evgS que codifica uma quinase sensora seja aumentada pelo aumento do número de cópias do gene evgS, em que a bactéria pertence ao gênero Escherichia, e em que o L-aminoácido é selecionado a partir do grupo consistindo em L-lisina, L-treonina e L-triptofano.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene evgA é um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o gene gadE é um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 27.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o gene ydeO é um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:29.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o gene evgS é um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos de SEQID NO:25.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Escherichia coli.